معلومة

ما هي ميزة ELISA غير المباشرة على المباشرة؟

ما هي ميزة ELISA غير المباشرة على المباشرة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أعتقد أن الإجابة تتعلق بشكل غير مباشر بإعطاء خطأ أقل بسبب الانتقائية ولكن كيف يحدث ذلك بالضبط؟


أنت على صواب ، فإن ميزة انتقائية ELISA غير المباشرة أو الشطيرة تأتي من حقيقة أنه يتم استخدام اثنين من الأجسام المضادة - واحد إلى إلتقاط الحليلة ، والآخر يكشف هو - هي.

فيما يلي توضيح كلاسيكي لكيفية عمل هذا النوع من ELISA. أولا ([1]) ، يتم تغليف الجسم المضاد الملتقط على اللوحة ويتم ربطه عبر واحد من عدد من أنواع الكيمياء المختلفة. ثم يتم غسل اللوحة (يحدث هذا بين جميع الخطوات).[2]، يتم إضافة المادة التحليلية ، أحيانًا في محلول متجانس (أي بروتين مؤتلف نقي) ، وفي أوقات أخرى في مصفوفة مثل المصل ، أو محلول الخلية ، وما إلى ذلك. النوعية بالنسبة للتحليل - دعنا نقول أنه يربط الحلقة الخاطئة مرة واحدة في 1000.[3]تمت إضافة الجسم المضاد للكشف ، ولنفترض أن له نفس الخصوصية البالغة 1/1000. أخيرا،[4]يضاف الجسم المضاد الثانوي (مع الإنزيم المرتبط به) ، و[5]يتم إضافة ركيزة الإنزيم ، لإنتاج اللون أو ناتج الضوء.

من ويكيميديا

إذا أردنا استخدام ELISA المباشر ، فإن معدل الخطأ سيكون 1/1000. ومع ذلك ، من خلال الجمع اثنين الأجسام المضادة ، معدل الخطأ لدينا الآن 1000 مرة أدنى - 1 في 1 مليون. نظرًا لأن كلا الجسمين المضادين مطلوبان للارتباط بشكل صحيح من أجل الحصول على إشارة ، فإن هذا يجعل النتائج أكثر موثوقية.


غالبًا ما لا يكون بالضرورة سؤالًا عن مزايا مقابل عيوب ، ولكنه سؤال تحدده الكواشف المتاحة وما هو السؤال الذي يتم طرحه. على سبيل المثال ، إذا كنت تطور اختبارًا لاستجابة الجسم المضاد لمستضد بعد التحصين ، فمن المحتمل أنك تستخدم بروتوكولًا مثل هذا:

  1. طلاء الألواح مع مستضد مهم (افترض كتلة / غسل حسب الاقتضاء من الآن فصاعدًا)
  2. إضافة مصل مخفف من حيوانات الاختبار
  3. أضف جسمًا مضادًا ثانويًا محددًا لهذا الحيوان / الموضوع

    • يجب استخدام الجسم المضاد الثانوي المسمى لأن الجسم المضاد الخاص بالحيوان لم يتم تمييزه (بالطبع).

إذا كنت تقوم بصنع الجسم المضاد الخاص بك في المختبر وقمت بذلك قبل أن تقوم بإجراء ELISA المباشر وغير المباشر للتحقق من أنك قد قمت بتسمية الجسم المضاد ولتحديد جودة الملصق. افترض أنك صنعت جسمًا مضادًا للفأر معالجًا بيوتينيليًا.

قم بعمل ELISA مباشر واحد (لتقدير الملصق): 1. غلف بمضاد مستهدف 2. أضف سلسلة تخفيف من الجسم المضاد - البيوتين 3. أضف الفوسفاتاز القلوي الستربتافادين للكشف

مادة ELISA ثانية غير مباشرة (لتقدير حجم الجسم المضاد): 1. تغطيتها بمستضد مستهدف 2. إضافة سلسلة تخفيف من الجسم المضاد - البيوتين 3. إضافة الجسم المضاد للفأر المكوّن من البيوتين 4. إضافة الستربتافادين الفوسفاتيز القلوي للكشف

أنت الآن تعرف مقدار الأجسام المضادة (من ELISA غير المباشر) التي ستمنحك مقدار الإشارة (من ELISA المباشر) مقابل الكميات المعروفة من مستضد الطلاء الخاص بك.

مرة واحدة قد يكون لديك بالفعل خيار إجراء اختبار مباشر أو غير مباشر عندما يكون لديك جميع الكواشف التي تحتاجها ، ولكنك تحتاج إلى تضخيم الإشارة بشكل كافٍ لاكتشاف الكميات المنخفضة. في هذه الحالة ، تحتوي ELISA المباشر على ملصق واحد فقط لجسم مضاد ، في حين أن الدخول مع ثانوي (مثل السلسلة المضادة للثقل) يمكن أن يؤدي إلى العديد من الأجسام المضادة التي تستحق التسمية لكل هدف.

لدى Thermo صفحة جميلة في هذا الشأن.


أنا أتفق مع الإجابات الأخرى ، والفرق الأكبر هو في الواقع الخصوصية. إن ELISA غير المباشر هو بالفعل أكثر تحديدًا ، ولكن أيضًا لسبب لم يتم وصفه هنا حتى الآن: استخدام ELISA غير المباشر يعني أن صفيحتك مغطاة بالجسم المضاد الأساسي. نظرًا لأن هذا AB الأساسي متصل بسطح البئر بسلسلته الثقيلة ، فإن السلاسل الخفيفة 2 (= الأجزاء التي تربط المستضدات ، في هذه الحالة ABs الثانوية) متاحة لربط AB الثانوي. هذا يعني أن كل 1 من AB الأساسي لديه القدرة على ربط 2 ABs ثانوي ، وبالتالي زيادة الإشارة المحددة بشكل كبير.


مزايا SPR على ELISA

كانت ELISA ، التي تعني مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، المعيار الذهبي للقياس الكمي والكشف عن الأجسام المضادة والببتيدات والبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى على مدار الخمسين عامًا الماضية. هناك ثلاثة أنواع رئيسية من اختبارات ELISA: المباشرة وغير المباشرة والساندويتش. تعتمد كل هذه الأساليب على تفاعل ثانوي يولد إشارة قابلة للقياس ليتم اكتشافها إما بواسطة قارئ لوحة الامتصاص القياسي أو مقياس الطيف الضوئي أو مقياس التألق أو مقياس اللمعان. المزايا الرئيسية لـ ELISA هي الحساسية العالية والنوعية. خذ اختبار ELISA القياسي للشطيرة ، على سبيل المثال. يسمح استخدام كيمياء أفيدين أو ستربتافيدين بأنزيمات متعددة (مثل بيروكسيداز الفجل) مرتبطة بالجسم المضاد للكشف ، مما يؤدي إلى تضخيم إشارة للجزيء الحيوي محل الاهتمام. ومع ذلك ، فإن شطيرة ELISA لها العيوب التالية:

خطوات غسيل واحتضان طويلة - تستغرق من ساعات إلى أيام للحصول على النتائج

تحتاج إلى اختيار التقاط الأجسام المضادة واكتشافها بحكمة لمنع التفاعل التبادلي

الحاجة إلى تسميات أو إنزيمات وركائز للكشف غير المباشر

لا يوفر بيانات حركية - له خاصية اكتشاف نقطة النهاية

قد يغسل أي تفاعلات ذات صلة منخفضة التقارب

من ناحية أخرى ، يعد رنين البلازمون السطحي (SPR) تقنية كشف ضوئي لها نفس الحساسية والنوعية [1-3] التي يمكنها معالجة هذه المشكلات. ستسلط هذه المدونة الضوء على المزايا الرئيسية لتكنولوجيا SPR (الشكل 1) على الساندويتش ELISA (الشكل 2).

شكل 1 . مخططات تجربة SPR.

الصورة 2 . مخططات تجربة ELISA.


خدمات أطقم إليسا المخصصة

ما هي إليسا؟ مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) هي تقنية كيميائية حيوية تُستخدم للكشف عن وجود مستضد معين أو جسم مضاد في عينة. حافظت ELISA على شعبيتها لأكثر من 40 عامًا بسبب خصوصيتها العالية وحساسيتها وموثوقيتها وخصائصها # 8211 التي يستشهد بها العملاء باستمرار لاستخدام الطريقة.

خدمات ELISA وعملية الاختبار

خدمات ELISA وطرق الاختبار

إليسا المباشر

يستخدم الإصدار المباشر من اختبار ELISA أجسامًا مضادة وحيدة النسيلة لاختبار مستضد معين. يستخدم هذا النوع من اختبار ELISA بشكل أساسي في تلطيخ الأنسجة والخلايا المناعي.

يتم إجراء ELISA المباشر ، عند مقارنته بأشكال أخرى من اختبار ELISA ، بسرعة لأنه يتم استخدام جسم مضاد واحد فقط. يمكن استخدام هذا الاختبار لاختبار تفاعلات معينة من الأجسام المضادة إلى مستضد ، ويساعد على تجنب المضاعفات الناتجة عن التفاعل المتبادل بين الأجسام المضادة الأخرى. سلبيات يجب تسمية الجسم المضاد الأساسي بشكل فردي ، مما قد يستغرق وقتًا طويلاً وشاقًا عند إجراء تجارب متعددة. أيضًا ، لا يتم تضخيم الإشارة في ELISA المباشر ، مقارنة بالنهج غير المباشر ، والذي يمكن أن يكون عيبًا في بعض التطبيقات التي تتضمن اكتشاف تحليلات التتبع.

اختبار ELISA غير المباشر

تستخدم طريقة الكشف غير المباشر جسمًا مضادًا ثانويًا مُسمى للكشف وهو الشكل الأكثر شيوعًا لـ ELISA. الجسم المضاد الثانوي له خصوصية للجسم المضاد الأولي. في شطيرة ELISA ، من الأهمية بمكان أن يكون الجسم المضاد الثانوي محددًا لاكتشاف الجسم المضاد الأولي فقط (وليس الجسم المضاد الملتقط) أو لن يكون الاختبار محددًا لمولد الضد. بشكل عام ، يتم تحقيق ذلك عن طريق استخدام الأجسام المضادة الملتقطة والأولية من أنواع مضيفة مختلفة (على سبيل المثال ، الفئران IgG والأرنب IgG ، على التوالي). بالنسبة لفحوصات الساندويتش ، من المفيد استخدام الأجسام المضادة الثانوية التي تم امتصاصها بشكل متقاطع لإزالة أي أجسام مضادة لها صلة بالجسم المضاد الملتقط. أقوى تنسيق اختبار ELISA هو مقايسة شطيرة. يسمى هذا النوع من مقايسة الالتقاط بمقايسة "شطيرة" لأن المادة التحليلية المراد قياسها مرتبطة بين اثنين من الأجسام المضادة الأولية - الجسم المضاد الملتقط والجسم المضاد للكشف. يتم استخدام تنسيق الشطيرة لأنه حساس وقوي.

اختبار ELISA التنافسي

يتم استخدام ELISA التنافسي لقياس المستضد باستخدام طريقة المنافسة. باختصار ، يتم تحضين المستضد الحر والجسم المضاد لتكوين مركب مستضد - جسم مضاد ثم يضاف المركب إلى سطح مطلي بالمستضد في لوحة الفحص. يتم غسل معقد الأجسام المضادة - المستضد غير المرتبط قبل إضافة الجسم المضاد الثانوي المرتبط بالإنزيم ضد الجسم المضاد الأولي. ثم يتم إضافة الركيزة ويتم تحديد تركيز المستضد لاحقًا من خلال قوة الإشارة الناتجة عن تفاعل الركيزة الإنزيمية. في هذا الاختبار ، يتنافس الجسم المضاد الثانوي المرتبط بالإنزيم مع مستضد العينة ، المرتبط بالجسم المضاد الأولي.

خدمتنا

مع فريق ELISA المحترف وأحدث المعدات ، ستوفر لك KareBay ™ Biochem خدمة بأعلى جودة. من السهل العمل معنا. ترسل لنا عيناتك ، ونعيد إليك نتائج الاختبار.

كيف تبدأ

يرجى الاتصال بنا مع طلبات خدمات ELISA الخاصة بك على [email protected] وسوف نقوم بالرد مع عرض أسعار مفصل في أقرب وقت ممكن. تستغرق هذه العملية عادةً ما بين 24 و 48 ساعة وسيتضمن عرض الأسعار السعر المقدر بالإضافة إلى الوقت اللازم لإكمال المشروع. يتم التعامل مع جميع الاستفسارات والمشاريع اللاحقة بسرية تامة وسيتم دعمها باتفاقية سرية إذا رغبت في ذلك.

يوفر KareBay TM للعلماء والأطباء مجموعة واسعة من منتجات التكنولوجيا الحيوية ومستلزمات المختبرات العلمية للبحوث الكيميائية وتحليل العمليات الحياتية. تشمل قدرات KareBay الواسعة تسويق الكواشف والأطقم ، وتصنيع منتجات التكنولوجيا الحيوية ، وتقديم خدمات الأبحاث التعاقدية للمنظمات في جميع أنحاء العالم. تمكن العديد من مختبراتنا ومكاتبنا وشركائنا التجاريين العالميين KareBay من توسيع منتجاتها وخدماتها إلى قاعدة عملائها في جميع أنحاء العالم.

تُستخدم منتجاتنا في الأبحاث والمختبرات وأغراض التقييم الأخرى. هم ليسوا للاستخدام البشري.


أربعة أنواع من إليسا

ELISA ، اختصار لفحص الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، هو طريقة ناضجة للغاية لاكتشاف الأهداف المختلفة. تتمثل إحدى ميزات ELISA في أنها سريعة وسهلة التنفيذ ، لذلك غالبًا ما تستخدم لأغراض التشخيص والبحث.

كما يوحي اسمها ، تتضمن ELISA استخدام الإنزيمات والربط المحدد للأجسام المضادة والمستضد. وفقًا لكيفية عملها ، يمكن تقسيم ELISA إلى أربعة أنواع رئيسية: مباشر ، وغير مباشر ، وساندويتش ، وتنافسي. دعونا نراهم واحدا تلو الآخر.

في ELISA المباشر ، يتم استخدام الجسم المضاد الأولي المسمى بالإنزيم فقط ، مما يعني أنه لا توجد حاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية. يرتبط الجسم المضاد الأولي المسمى بالإنزيم "بشكل مباشر" بالهدف (المستضد) المثبت باللوحة (السطح الصلب). بعد ذلك ، يتفاعل الإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الأولي مع ركائزه لإنتاج إشارة مرئية يمكن قياسها. بهذه الطريقة ، يتم الكشف عن مستضد الاهتمام.

في ELISA غير المباشر ، يتم استخدام كل من الجسم المضاد الأولي والجسم المضاد الثانوي. لكن في هذه الحالة ، لا يُصنَّف الجسم المضاد الأولي بإنزيم. بدلاً من ذلك ، يتم تمييز الجسم المضاد الثانوي بإنزيم.

يرتبط الجسم المضاد الأولي بالمستضد المثبت في اللوحة ، ثم يرتبط الجسم المضاد الثانوي المسمى بالإنزيم بالجسم المضاد الأولي. أخيرًا ، يتفاعل الإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الثانوي مع ركائزه لإنتاج إشارة مرئية يمكن قياسها.

في ELISA المباشر وغير المباشر ، يكون المستضد هو الذي يجمد في اللوحة. ومع ذلك ، في شطيرة ELISA ، فإن الجسم المضاد هو الذي يجمد في الصفيحة ، ويسمى هذا الجسم المضاد بالتقاط الجسم المضاد. بالإضافة إلى التقاط الجسم المضاد ، يتضمن ELISA السندويش أيضًا استخدام الأجسام المضادة للكشف ، والتي تشمل بشكل عام الجسم المضاد للكشف الأولي غير المعين والجسم المضاد للكشف الثانوي المسمى بالإنزيم.

أولاً ، يرتبط مولد الضد المعني بجسم مضاد الالتقاط المثبت في اللوحة. ثانيًا ، يرتبط الجسم المضاد للكشف الأولي بالمستضد. ثالثًا ، يرتبط الجسم المضاد للكشف الثانوي بالجسم المضاد للكشف الأولي ، ثم يتفاعل الإنزيم مع ركيزته لإنتاج إشارة مرئية يمكن قياسها.

مزيد من التفاصيل حول بروتوكول ELISA المباشر ، وبروتوكول ELISA غير المباشر ، وبروتوكول ساندويتش ELISA ، يرجى التحقق منه هنا.

بالمقارنة مع أنواع ELISA الثلاثة المذكورة أعلاه ، فإن ELISA التنافسي معقد نسبيًا لأنه يتضمن استخدام مستضد مثبط ، لذلك تُعرف ELISA التنافسي أيضًا باسم تثبيط ELISA. في الواقع ، يمكن تكييف كل من الأشكال الثلاثة ، المباشرة وغير المباشرة والشطيرية ، مع التنسيق التنافسي. في ELISA التنافسي ، يتنافس مستضد المثبط ومولد الضد المعني على الارتباط بالجسم المضاد الأولي. هنا إجراء تنافسي ELISA:

أولاً ، يتم تحضين الجسم المضاد الأولي غير المُسمى بالعينة التي تحتوي على مولد الضد المعني ، مما يؤدي إلى تكوين معقد الأجسام المضادة للمستضد (Ag-Ab). في هذه الخطوة ، يكون الجسم المضاد مفرطًا مقارنة بالمستضد ، لذلك توجد أجسام مضادة حرة متبقية.

ثانيًا ، يضاف خليط Ag-Ab إلى اللوحة المطلية بمولد الضد المثبط الذي يمكنه أيضًا الارتباط بالجسم المضاد الأساسي. يرتبط الجسم المضاد الأولي الحر الموجود في الخليط بمولد الضد المثبط على اللوحة ، بينما لا ترتبط معقدات Ag-Ab في الخليط وبالتالي يتم غسلها.

ثالثًا ، يُضاف الجسم المضاد الثانوي المسمى بالإنزيم إلى اللوحة ويرتبط بالجسم المضاد الأولي المرتبط بمولد الضد المثبط على اللوحة.

أخيرًا ، تتم إضافة ركيزة للتفاعل مع الإنزيم وتنبعث منها إشارة مرئية للكشف عنها.

من خلال هذا الإجراء ، قد تجد أن الإشارة النهائية مرتبطة عكسياً بكمية المستضد محل الاهتمام في العينة ، مما يعني أنه كلما زاد عدد المستضد في العينة ، كانت الإشارة النهائية أضعف. وذلك لأن الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بعينة المستضد سيتم غسلها ، بينما سيتم التقاط الأجسام المضادة الأولية الحرة المتبقية بواسطة مستضد المثبط المثبت في اللوحة ويتم قياسه عن طريق تفاعل إنزيمي.

تعتمد ELISA التنافسي الموصوف هنا على التقاط الجسم المضاد ، حيث يتم طلاء اللوحة بمولد الضد. هناك نوع آخر من ELISA التنافسي الذي يعتمد على التقاط المستضد ، حيث يتم طلاء اللوحة بجسم مضاد غير مرمز. علاوة على ذلك ، تستخدم ELISA التنافسي بشكل عام جسمًا مضادًا مُصنّفًا للكشف ، ولكن في بعض الأحيان تستخدم مستضدًا موسومًا بدلاً من الجسم المضاد المسمى.

مقارنة بين ELISA المباشر وغير المباشر والساندويش والتنافسي

الآن نحن نعرف كيف تعمل الأنواع الأربعة الأكثر شيوعًا من ELISA ، ولكن كيف تختار النوع المناسب لتجربتك؟ للعثور على الإجابة ، تحتاج إلى فهم مزايا وعيوب كل نوع من أنواع ELISA.

الجدول 1. مزايا وعيوب كل نوع من أنواع ELISA

  1. بروتوكول بسيط وموفر للوقت وموفر للكواشف.
  2. لا يوجد تفاعل تبادلي من جسم مضاد ثانوي.
  1. خلفية عالية.
  2. لا يوجد تضخيم للإشارة ، حيث يتم استخدام جسم مضاد أولي فقط وليس هناك حاجة إلى جسم مضاد ثانوي.
  3. مرونة منخفضة ، حيث يجب تسمية الجسم المضاد الأساسي.
  1. تضخيم الإشارة ، حيث يمكن استخدام واحد أو أكثر من الأجسام المضادة الثانوية للارتباط بالجسم المضاد الأساسي.
  2. مرونة عالية ، حيث يمكن استخدام نفس الجسم المضاد الثانوي للعديد من الأجسام المضادة الأولية.
  1. بروتوكول معقد مقارنة مع ELISA المباشر.
  2. تفاعل متصالب من جسم مضاد ثانوي.
  1. مرونة عالية.
  2. حساسية عالية.
  3. خصوصية عالية ، حيث ترتبط الأجسام المضادة المختلفة بنفس المستضد للكشف عنها.
  1. يجب أن يكون المستضد محل الاهتمام كبيرًا بما يكفي بحيث يمكن لجسمين مختلفين من الأجسام المضادة الارتباط به عند حواتم مختلفة.
  2. يصعب أحيانًا العثور على جسمين مضادين مختلفين يتعرفان على حواتم مختلفة على المستضد محل الاهتمام ويتعاونان جيدًا في شكل شطيرة.
  1. مرونة عالية.
  2. حساسية عالية.
  3. الأفضل لاكتشاف المستضدات الصغيرة ، حتى عندما تكون موجودة بتركيزات منخفضة.
  1. بروتوكول معقد نسبيًا.
  2. يحتاج إلى استخدام مثبط مستضد.

بالإضافة إلى أنواع ELISA الأربعة الأكثر شيوعًا المذكورة أعلاه ، هناك أنواع أخرى من ELISA تساعد في تلبية المتطلبات المختلفة للتجارب. فيما يلي مثالان:

يستخدم ELISPOT ، وهو اختصار للمقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم ، لقياس تواتر خلايا إفراز البروتين على مستوى الخلية المفردة. التقنية التي يستخدمها ELISPOT تشبه إلى حد بعيد تقنية الساندويتش ELISA.

يتم استخدام ELISA داخل الخلية لقياس مستويات البروتين المستهدف داخل الخلايا المثبتة على اللوحة. كما أنه ينطوي على استخدام التقنية المستخدمة بواسطة الساندويتش ELISA.

أولاً ، يتم تثبيت الخلايا على اللوحة ويتم نفاذها. بعد ذلك ، يضاف الجسم المضاد الأولي للتفاعل مع البروتين المستهدف داخل الخلايا. أخيرًا ، يُضاف جسم مضاد ثانوي مُصنَّف للتفاعل مع الجسم المضاد الأولي. بهذه الطريقة ، يتم الكشف عن البروتين المستهدف داخل الخلايا.

ELISA الكمي والنوعي

على أساس ما إذا كان يمكن لـ ELISA تحديد مستوى الجزيء المستهدف ، يمكن تقسيم ELISA إلى نوعين ، نوعي وكمي. توفر ELISA النوعي نتيجة إيجابية أو سلبية بسيطة لعينة ، بينما تعكس ELISA الكمي تركيز الجزيء المستهدف في عينة عبر منحنى قياسي. لذلك ، إذا كنت تريد تحديد مستوى الجزيء المستهدف ، فاختر ELISA الكمي.

يتم استخدام ELISA لأغراض التشخيص والبحث. تشمل الأمراض التي تم اكتشافها بواسطة ELISA فيروس نقص المناعة البشرية ، والتهاب الكبد B ، والإنفلونزا ، وفقر الدم الانحلالي ، ومرض لايم ، وحساسية الطعام ، وما إلى ذلك. يوجد حاليًا عدد كبير من مجموعات ELISA التي توفرها الشركات المصنعة في جميع أنحاء العالم. لكن بعض مجموعات ELISA تستخدم فقط في البحث ولا يمكن استخدامها في التشخيص. Cusabio هي إحدى الشركات المصنعة التي تقدم مجموعات ELISA للاستخدام البحثي. كيف تختار مجموعة ELISA المناسبة لبحثك؟ يرجى قراءة هذا المقال: 11 نصيحة لاختيار مجموعة ELISA المناسبة لك.

يمكنك أيضًا تطوير ELISA الخاص بك إذا لم تكن هناك مجموعات ELISA متاحة تجاريًا لبحثك. أثناء تطوير ELISA ، يكون اختيار الجسم المضاد ذا أهمية حاسمة. يجب أن تؤخذ في الاعتبار العديد من العوامل مثل تقارب وخصوصية وعيار الجسم المضاد.

إلى جانب ذلك ، إليك بعض المشكلات الشائعة لـ ELISA من أجلك ، ونأمل أن يساعدك ذلك.


الفوائد الرئيسية للكشف غير المباشر

على الرغم من أن طريقة الكشف المباشر أصبحت أكثر شيوعًا للتألق المناعي (IF) وتجارب قياس التدفق الخلوي ، لا تزال طريقة الكشف غير المباشر هي الخيار المفضل للعديد من التطبيقات الأخرى. في الاكتشاف المباشر ، يكون الجسم المضاد الأولي المسمى مسؤولاً عن كل من ارتباط واكتشاف مولد الضد محل الاهتمام. في الاكتشاف غير المباشر ، يتم تقسيم هذه العملية إلى خطوتين متميزتين على الأقل - (1) يشكل الجسم المضاد الأولي غير المقترن معقدًا مع مولد الضد ، (2) الجسم المضاد الثانوي المسمى ، الذي يتفاعل مع المنطقة الثابتة للجسم المضاد الأولي ، يسهل عملية الكشف .

تم الكشف عن HAI-1 في أقسام سرطان الرئة البشرية المضمنة بالبارافين باستخدام الماعز المضاد للإنسان-1 جسم مضاد متعدد النسيلة منقى من مستضد المجال الخارجي (كتالوج # AF1048) يليه الجسم المضاد للبوليمر IgG VisUCyte HRP المضاد للماعز (الكتالوج # VC004). كانت الأنسجة ملطخة بـ DAB (بني) وتم تصبغها بالهيماتوكسيلين (أزرق).

حساسية محسنة
أحد الأسباب الرئيسية لاستخدام الطريقة غير المباشرة هو زيادة الحد الأدنى للكشف. نظرًا لأن اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة الثانوية ذات العلامات قادرة على ربط جسم مضاد أولي واحد ، فإن النتيجة هي تضخيم الإشارة وزيادة في حساسية الفحص. هذا مهم بشكل خاص لمستضدات الوفرة المنخفضة التي قد تتطلب خطوات إضافية لتضخيم الإشارة لتوليد إشارة ملموسة على تلطيخ الخلفية. أحد الخيارات لتضخيم الإشارة باستخدام الكشف الكروموجيني هو جسم مضاد ثانوي مترافق من البوليمر HRP حيث ترتبط جزيئات HRP المتعددة بكل جسم مضاد ثانوي. تعرف على المزيد حول طرق تضخيم الإشارة من صفحة الكشف عن المدينة العالمية للخدمات الإنسانية.

مزيد من المرونة
باستخدام الطريقة غير المباشرة ، لا يتم تقييد الباحثين عن طريق مجموعة الأجسام المضادة الأولية المترافقة المتاحة تجاريًا ولا يقتصرون على استخدام ملصق معين للتجربة. بدلاً من القلق بشأن اختيار أفضل تسمية ، على سبيل المثال FITC أو PE ، بالنسبة للجسم المضاد الأولي ، يمكن إقران الجسم المضاد الأولي بأجسام مضادة ثانوية مترافقة مختلفة من نفس النوع. يمكنك أيضًا الانتقال بسهولة من قياس الألوان إلى اختبار الفلورسنت عند العمل مع جسم مضاد أولي غير مقترن.

تقدم دراسة مستضد جديد أو استخدام جسم مضاد جديد عددًا من الأشياء المجهولة مثل وفرة المستضد والربط الناجح للمستضد بالجسم المضاد. قد تكون طريقة الاكتشاف غير المباشرة نقطة انطلاق أكثر ملاءمة لتصميمك التجريبي. قد يحتوي مختبرك بالفعل على مخزون من الكواشف الثانوية المترافقة التي يمكنك استخدامها للاختبار الأولي.

تعمل الأجسام المضادة الثانوية المقترنة على إثراء اكتشاف الجزيئات المستهدفة ذات الوفرة المنخفضة وتسمح بحرية أكبر في اختيار كواشف الكشف. نوفوس بيولوجيكالز لديها قائمة واسعة من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة المتاحة لاحتياجات الكشف غير المباشرة الخاصة بك.


مزايا وعيوب ELISA

مزايا

  • حساسية وخصوصية عالية: من الشائع أن تكتشف ELISA المستضدات على مستوى البيكوجرام بطريقة محددة للغاية بسبب استخدام الأجسام المضادة.
  • إنتاجية عالية: تتوفر مجموعات ELISA التجارية عادةً في شكل لوحة 96 بئر. ولكن يمكن تكييف الفحص بسهولة مع 384 لوحة جيدة.
  • سهل التنفيذ: البروتوكولات سهلة المتابعة وتتضمن القليل من الوقت العملي.
  • الكمية: يمكن أن تحدد تركيز المستضد في العينة.
  • إمكانية اختبار أنواع مختلفة من العينات: المصل والبلازما والمستخلصات الخلوية والأنسجة والبول واللعاب وغيرها.

سلبيات

  • قراءات مؤقتة: يعتمد الاكتشاف على تفاعلات الإنزيم / الركيزة ، وبالتالي يجب الحصول على قراءات في فترة زمنية قصيرة.
  • معلومات مستضد محدودة: معلومات محدودة بكمية أو وجود المستضد في العينة.

ما هي ميزة ELISA غير المباشرة على المباشرة؟ - مادة الاحياء

بمجرد فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام ونقلها إلى غشاء النشاف ، يمكن إجراء النشاف الغربي في خطوة واحدة أو خطوتين.

مباشر - طريقة خطوة واحدة

في طريقة الكشف المباشر (الشكل 1 (أ)) ، يتم استخدام جسم مضاد أولي مترافق مباشرة مع إنزيم مراسل أو صبغة الفلورسنت للكشف عن مستضد البروتين على غشاء النشاف بعد خطوة حضانة واحدة. على الرغم من أن طريقة الخطوة الواحدة هذه أسرع ، إلا أنها لا تستخدم على نطاق واسع. يوضح الشكل 1 (ب) إحدى مشكلات الاقتران المباشر للجسم المضاد الأولي ، حيث يمكن لجزيء المراسل أن يسد منطقة ارتباط مولد الضد بالجسم المضاد الأولي ، مما يمنع التعرف الجيد على مولد الضد ويؤدي إلى انخفاض الحساسية. قد تعوض الأولية الزائدة عن هذا التأثير ولكنها قد تؤدي إلى ضعف التكاثر وزيادة الخلفية.

غير مباشر - طريقة من خطوتين

تتجنب طريقة الكشف غير المباشرة المكونة من خطوتين للنشاف الغربي مثل هذا التداخل مع اكتشاف المستضد. يشكل الجسم المضاد الأولي غير المسمى معقدًا مع ارتباط مولد الضد بغشاء البقعة. بعد الغسيل ، يتم تحضين البقعة بجسم مضاد ثانوي مترافق مع الإنزيم المراسل أو حامل الفلور. ترتبط الأجسام المضادة الثانوية المتعددة بالحواتم الموجودة على الجسم المضاد الأولي ، مما يؤدي إلى إنشاء معقد مُصنَّف للأجسام المضادة للمستضد (الشكل 1 (ج)). على الرغم من أن الطريقة غير المباشرة تتطلب خطوة غسيل وحضانة أخرى ، إلا أنها تقدم مزايا عديدة على الطريقة المباشرة ، بما في ذلك تضخيم الإشارة والمرونة.

الشكل 1: (أ) يرتبط الجسم المضاد الأولي المترافق مباشرة بمستضد مرتبط بالغشاء. (ب) يرتبط الجسم المضاد الأولي المترافق مباشرة بشكل سيئ بمستضد مرتبط بالغشاء ، حيث يمكن أن يتحد إنزيم المراسل أو الفلوروفور في منطقة ربط مولد الضد ويقلل من تقارب الجسم المضاد مع هدفه. استخدام ثانوي يزيل هذا. (ج) الطريقة غير المباشرة - ترتبط الأجسام المضادة الثانوية المتعددة المقترنة بجسم مضاد أولي غير مقترن.

تم تفصيل مزايا وعيوب طرق الكشف المباشرة وغير المباشرة في الجدول أدناه. تنطبق على النشاف الغربي ولكنها قد تكون ذات صلة أيضًا بتقنيات أخرى ، مثل IHC / ICC و ELISA وقياس التدفق الخلوي.

الجدول 1: مزايا وعيوب طرق النشاف الغربية المباشرة وغير المباشرة.

طريقة الكشف المباشر طريقة الكشف غير المباشر
سلبيات مزايا سلبيات مزايا
زمن يستغرق تصنيف الأجسام المضادة الأولية الفردية وقتًا طويلاً. تعني خطوة حضانة واحدة أن طرق الاكتشاف المباشر يمكن أن تكون سريعة. إضافة الجسم المضاد الثانوي يتطلب خطوات إضافية. يعمل العديد من المرتبات الثانية ذات العلامات التجارية الموثوقة والمتاحة تجاريًا على تقليل خطوات التحسين التي تستغرق وقتًا طويلاً.
المرونة والتوافر عدد الأجسام المضادة الأولية المقترنة محدود. تقدم الأجسام المضادة الثانوية مجموعة واسعة من الخيارات المترافقة وخصائص الأجسام المضادة.
حساسية قد تظهر الإشارة من الطريقة المباشرة أضعف من الطريقة غير المباشرة. تضخيم الإشارة - يمكن لكل جسم مضاد أولي أن يستوعب العديد من الأجسام المضادة الثانوية ، مما يزيد من عدد الجزيئات المتاحة لإنتاج إشارة.
نشاط المناعة قد تكون الأجسام المضادة الأولية قد قللت من نشاط المناعة بسبب التداخل المقترن مع ارتباط مولد الضد. يتم الحفاظ على النشاط المناعي للجسم المضاد الأولي ، ويتم توفير الإشارة بواسطة الثانوي المترافق.
كلفة قد تكون الأجسام المضادة الأولية المقترنة باهظة الثمن ، وقد تكون هناك حاجة إلى المزيد من الأجسام المضادة لمواجهة فقدان الحساسية. يمكن استخدام جسم مضاد ثانوي لاكتشاف أي جسم مضاد أولي يتم تربيته في نفس النوع المضيف ، مما يقلل التكلفة.
خيارات تحسين الإشارة قد يكون تركيز العينة مطلوبًا للبروتينات منخفضة الوفرة قبل التحميل. يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية لتحسين الإشارة بعدة طرق.

ألبرتس ب وآخرون (1994) البيولوجيا الجزيئية للخلية. 3rd Ed. الصحافة جارلاند. لندن


ما هو الاليزا التنافسي؟

يقيس ELISA التنافسي تركيز المستضد في عينة من خلال الكشف عن تداخل الإشارة. هنا ، يستخدم الفحص مثبط مستضد. ومن ثم ، فهو نوع من ELISA تثبيط. خلال هذا الإجراء ، تتنافس المستضدات الموجودة في العينة مع مولد الضد المرجعي المحدد للارتباط بكمية محددة من الجسم المضاد المسمى. علاوة على ذلك ، يبدأ هذا الإجراء مع احتضان العينة ، مع وجود كمية زائدة من الجسم المضاد المسمى. أيضًا ، يجب أن يكون المستضد المرجعي مطليًا مسبقًا على لوحة فحص بئر متعددة. ثم يجب إضافة خليط العينة إلى لوحة الفحص التي تحتوي على المستضد المرجعي. سوف ترتبط الأجسام المضادة الحرة بالمستضد المرجعي اعتمادًا على كمية المستضد في العينة. وبالتالي ، في حالة وجود المزيد من عينة المستضد ، سيتم اكتشاف مستضد مرجعي أقل. وبالتالي ، فإنه يخلق إشارة أضعف.

الشكل 01: إليسا

في المقابل ، عندما تحتوي العينة على كمية أقل من المستضد ، فإن المزيد والمزيد من المستضد المرجعي سيشغل الأجسام المضادة ويعطي إشارة قوية. نظرًا لأن ELISA التنافسي يعطي إشارة أقوى عندما تحتوي العينة على كمية منخفضة من المستضدات ، فإن ELISA التنافسي هو اختبار حساس للغاية ، حتى بالنسبة للعينات التي تحتوي على عدد صغير من المستضدات.

في بعض مجموعات ELISA التنافسية ، يتم استخدام مستضد مرمز بدلاً من الجسم المضاد المسمى. هنا ، سيتنافس المستضد المسمى وعينة المستضد للارتباط بالجسم المضاد الأولي. وبالمثل ، عندما تكون كمية المستضد في العينة منخفضة ، فإن كمية المستضد المسمى الذي يرتبط بالأجسام المضادة سيكون أعلى ويخلق إشارة أقوى.


بروتوكول التألق المناعي (بروتوكول IF)

التألق المناعي هو أحد الأساليب المستخدمة على نطاق واسع في علم الأحياء والطب الحديث ، وقد تم تطويره بواسطة Coons et al. (1950) ، وهو مزيج من تقنية التألق المناعي والتكنولوجيا المورفولوجية لتطوير الخلايا الفلورية المناعية (أو الأنسجة). تطور تكنولوجيا المقايسة المناعية الفلورية بسرعة كبيرة في السنوات الأخيرة ، خاصة في مجال الدراسات الطبية والبيولوجية والبيئية ، وهي تستخدم على نطاق واسع في تحديد هرمونات الغدد الصماء وعوامل النمو والبروتينات والأحماض النووية والناقلات العصبية والمستقبلات في الجسم الحي المخدرات والمصادر المعدية ، وما إلى ذلك ، تم تطوير هذه الموضوعات. وبحسب الكشف عن العينات المختلفة يمكن تقسيمها إلى ثلاث فئات رئيسية.
هناك نوعان مختلفان من مقايسة التألق المناعي والتي تشمل مقايسة التألق المناعي غير المباشرة ومقايسة التألق المناعي المباشر ، بالنسبة لمقايسة التألق المناعي غير المباشر ، يشمل البروتوكول بشكل أساسي تحضير الأنسجة أو الخلية ، وتثبيت الأنسجة أو الخلية ، وحجب المصل ، واحتضان الأجسام المضادة الأولية ، وحضانة الجسم المضاد الثاني الملحوظ ، والتلطيخ ، والنتيجة. حكم وتصوير. لمقايسة التألق المناعي المباشر ، لا يوجد سوى جسم مضاد أولي ملحوظ تم تحضينه بدون جسم مضاد ثان والخطوات الأخرى متشابهة.
لمقايسة التألق المناعي المباشر ، تم تحضير الأجسام المضادة الفلورية المحددة من خلال توليفة من الأجسام المضادة المحددة والفلورسين. إنها الطريقة الأسهل والأسرع لفحص مستضد الخلية أو الأنسجة. هذه الطريقة محددة للغاية وتستخدم بشكل شائع في فحص خزعة الكلى ومسببات الأمراض. عيبه هو أن الجسم المضاد الفلوري يمكنه فحص نوع واحد فقط من المستضد ، وهو أقل حساسية. لمقايسة التألق المناعي غير المباشر ، والأجسام المضادة المحددة ضد المستضد المقابل ، والجسم المضاد المسمى بالفلورسين (الأجسام المضادة IgG الفلورية المضادة المحددة) والجسم المضاد الأولي
على الرغم من أن الخطوات الأساسية والمبادئ الأساسية للفلورة المناعية هي نفسها ، ولكن بسبب الظروف المحددة ليست هي نفسها ، فإن خطوات التشغيل التفصيلية لكل مختبر لن تكون متطابقة تمامًا. على سبيل المثال ، سيكون استخدام المحلول والسائل الثابت وسائل تخفيف الجسم المضاد مختلفًا قليلاً. هنا لإعطاء طريقة أكثر شيوعًا ، يمكن أن يعتمد الاستخدام التفصيلي للعملية على خطوات التعديل والتغيير ، وفي النهاية تحديد الطريقة الأنسب لك.

التألق المناعي غير المباشر / IF

1. تحضير الأنسجة أو الخلايا المزروعة
2. تجهيز قسم الأنسجة أو غطاء الخلايا
3. غسل العينات مرتين مع برنامج تلفزيوني
4. إصلاح الأقواس مع 4٪ بارافورمالدهي في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ملاحظة: Paraformaldehye سامة ، تستخدم فقط في غطاء الدخان)
5. مثبت نضح ، شطف مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما
6. نفاذية العينات مع 0.1-0.5٪ triton x-100 في PBS لمدة 10 دقائق (ملاحظة: النفاذية مطلوبة فقط عندما يحتاج الجسم المضاد إلى الوصول إلى داخل الخلايا لاكتشاف البروتين. وتشمل هذه البروتينات داخل الخلايا وبروتينات الغشاء التي لها حلقمات في المنطقة السيتوبلازمية.
7. نضح تريتون x-100 ، اشطف مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما
8. احتضان العينات في 10٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة
9. نضح مصل الماعز ، واحتضان المقاطع بالأجسام المضادة الأولية بتخفيف مناسب في برنامج تلفزيوني طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو ساعة عند 37 درجة مئوية (يجب تأكيد الحالة المثلى في معمل مختلف)
10. شطف ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما
11. احتضان العينات بجسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروكروم بتخفيف مناسب في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية في الظلام (يجب تأكيد الحالة المثلى في أماكن مختلفة)
12. شطف ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الظلام
13. احتضان العينات مع 1 ميكروغرام / مل DAPI
14. تركيب العينات مع قطرة من وسط تصاعد

التألق المناعي المباشر / IF

1. تحضير الأنسجة أو الخلايا المزروعة
2. تجهيز قسم الأنسجة أو غطاء الخلايا
3. غسل العينات مرتين مع برنامج تلفزيوني
4. إصلاح الأقواس مع 4٪ بارافورمالدهي في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ملاحظة: Paraformaldehye سامة ، تستخدم فقط في غطاء الدخان)
5. مثبت نضح ، شطف مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما
6. نفاذية العينات مع 0.1-0.5٪ triton x-100 في PBS لمدة 10 دقائق (ملاحظة: النفاذية مطلوبة فقط عندما يحتاج الجسم المضاد إلى الوصول إلى داخل الخلايا لاكتشاف البروتين. وتشمل هذه البروتينات داخل الخلايا وبروتينات الغشاء التي لها حلقمات في المنطقة السيتوبلازمية.
7. نضح تريتون x-100 ، اشطف مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما
8. احتضان العينات في 10٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة
9. نضح مصل الماعز ، واحتضان المقاطع بجسم مضاد أولي مترافق بالفلوروكروم بتخفيف مناسب في برنامج تلفزيوني طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (يجب تأكيد الحالة المثلى في مختبر مختلف)
10. شطف ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الظلام
11. احتضان العينات مع 1 ميكروغرام / مل DAPI
12. تركيب العينات مع قطرة من وسط التركيب


فحوصات ELISA: غير مباشرة ، ساندويتش ، وتنافسية

المصدر: ويتني سوانسون 1،2 ، فرانسيس ف. سجاستاد 2،3 ، وتوماس س.جريفث 1،2،3،4
1 قسم جراحة المسالك البولية ، جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا 55455
2 مركز علم المناعة ، جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا 55455
3 برنامج الدراسات العليا في علم الأحياء الدقيقة والمناعة وبيولوجيا السرطان ، جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا 55455
4 مركز السرطان الماسوني ، جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا 55455

كثيرًا ما يتم استخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لقياس وجود و / أو تركيز مستضد أو جسم مضاد أو ببتيد أو بروتين أو هرمون أو جزيء حيوي آخر في عينة بيولوجية. إنه حساس للغاية ، قادر على اكتشاف تركيزات منخفضة من المستضد. تُعزى حساسية ELISA إلى قدرتها على اكتشاف التفاعلات بين معقد واحد لجسم مضاد للمستضد (1). علاوة على ذلك ، فإن تضمين جسم مضاد خاص بمولد مضاد مترافق بالإنزيم يسمح بتحويل ركيزة عديمة اللون إلى منتج كروموجين أو فلورسنت يمكن اكتشافه وتحديد كميته بسهولة بواسطة قارئ لوحة. عند مقارنتها بالقيم المتولدة عن كميات معايرة لمولد ضد معروف موضع اهتمام ، يمكن تحديد تركيز نفس المستضد في العينات التجريبية. تم تكييف بروتوكولات ELISA المختلفة لقياس تركيزات المستضد في مجموعة متنوعة من العينات التجريبية ، ولكن لديهم جميعًا نفس المفهوم الأساسي (2). يعتمد اختيار نوع ELISA المطلوب إجراؤه ، غير المباشر ، أو الساندويش ، أو التنافسي ، على عدد من العوامل ، بما في ذلك مدى تعقيد العينات المراد اختبارها والأجسام المضادة الخاصة بالمستضد المتاحة للاستخدام. كثيرًا ما يتم استخدام ELISA غير المباشر لتحديد نتيجة الاستجابة المناعية ، مثل قياس تركيز الجسم المضاد في العينة. تعتبر الساندويتش ELISA هي الأنسب لتحليل العينات المعقدة ، مثل طاف زراعة الأنسجة أو محللات الأنسجة ، حيث يكون التحليلي ، أو المستضد محل الاهتمام ، جزءًا من عينة مختلطة. أخيرًا ، غالبًا ما يتم استخدام ELISA التنافسي عندما يكون هناك جسم مضاد واحد متاح للكشف عن مولد الضد محل الاهتمام. تعتبر ELISA التنافسية مفيدة أيضًا في الكشف عن مستضد صغير مع حاتمة واحدة فقط من الجسم المضاد لا يمكنها استيعاب اثنين من الأجسام المضادة المختلفة بسبب العائق الفراغي. سيصف البروتوكول الإجراءات الأساسية لمقايسات ELISA غير المباشرة والساندويتش والتنافسية.

يشيع استخدام مقايسة ELISA غير المباشرة لقياس كمية الأجسام المضادة في مصل الدم أو في المادة الطافية لثقافة الورم الهجين. الإجراء العام لمقايسة ELISA غير المباشر هو:

  1. تغطية الآبار بالمستضدات
  2. إضافة مصل أو مستنبت الورم الهجين يحتوي على جسم مضاد (أساسي أو جسم مضاد 1 & # 176)
  3. احتضان واغسل
  4. أضف الأجسام المضادة الثانوية (أو 2 & # 176) الإنزيم المترافق
  5. احتضان وغسل
  6. أضف الركيزة

يختلف اختبار ELISA الشطري عن مقايسة ELISA غير المباشرة في أن الطريقة لا تتضمن طلاء الألواح بمولد ضد منقى. بدلاً من ذلك ، يتم استخدام الجسم المضاد & # 34capture & # 34 لتغطية آبار اللوحة. يكون المستضد & # 34 محاطًا & # 34 بين الجسم المضاد الذي تم التقاطه وجسم مضاد ثانٍ & # 34 & # 34 الكشف عن الإنزيم - حيث يكون كلا الجسمين المضادين محددًا لنفس المستضد ، ولكن في حلقات مختلفة (3). من خلال الارتباط بمركب الجسم المضاد / المستضد الملتقط ، يظل الجسم المضاد للكشف في اللوحة. يمكن استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو المضاد متعدد النسيلة كأجسام مضادة للالتقاط والكشف. الميزة الرئيسية لشطيرة ELISA هي أنه لا يلزم تنقية العينة قبل التحليل. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون الفحص حساسًا جدًا (4). العديد من مجموعات ELISA المتاحة تجاريًا من مجموعة متنوعة من الشطائر وتستخدم أزواجًا متطابقة تم اختبارها من الأجسام المضادة. الإجراء العام لمقايسة ELISA شطيرة هو:

  1. تغطية الآبار مع التقاط الجسم المضاد
  2. أضف عينات اختبار تحتوي على مستضد
  3. احتضان وغسل
  4. إضافة الجسم المضاد للكشف عن الإنزيم المترافق.
  5. احتضان وغسل
  6. أضف الركيزة

تأتي معظم مجموعات ELISA الشطيرة المتاحة تجارياً مع أجسام مضادة للكشف عن الإنزيم المترافق. في الحالات التي لا يتوفر فيها الجسم المضاد للكشف عن الإنزيم المترافق ، يمكن استخدام جسم مضاد ثانوي مترافق بالإنزيم خاص بالجسم المضاد للكشف. يؤدي الإنزيم الموجود على الجسم المضاد الثانوي نفس الدور ، وهو تحويل الركيزة عديمة اللون إلى منتج كروموجين أو فلورسنت. يرغب الجسم المضاد المرتبط بالإنزيم الثانوي المذكور أعلاه في استخدامه في & # 34 محليًا & # 34 شطيرة ELISA التي طورها باحث قام بتوليد الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة به ، على سبيل المثال. أحد العوائق لاستخدام الجسم المضاد الثانوي المترافق بالإنزيم هو التأكد من أنه يرتبط فقط بالجسم المضاد للكشف ، وليس الجسم المضاد الملتصق باللوحة. سيؤدي ذلك إلى منتج قابل للقياس في جميع الآبار ، بغض النظر عن وجود أو عدم وجود مستضد أو جسم مضاد للكشف.

أخيرًا ، يتم استخدام اختبار ELISA التنافسي للكشف عن المستضدات القابلة للذوبان. إنه سهل التنفيذ ، ولكنه مناسب فقط عندما يكون المستضد المنقى متاحًا بكمية كبيرة نسبيًا. الإجراء العام لمقايسة ELISA التنافسي هو:

  1. تغطية الآبار بالمستضد
  2. احتضان وغسل
  3. احتضان عينة الاختبار مع الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالإنزيم
  4. أضف الخليط جيدًا
  5. احتضان وغسل أي جسم مضاد أولي غير مرتبط بالإنزيم
  6. أضف الركيزة

تأتي المنافسة & # 34 & # 34 في هذا الاختبار من حقيقة أن المزيد من المستضدات في عينة الاختبار المستخدمة في الخطوة 3 ستؤدي إلى تقليل الأجسام المضادة المتاحة للارتباط بطبقة المستضد البئر. وبالتالي ، فإن شدة المنتج الكروموجينيك / الفلوروجينيك في البئر في نهاية الفحص ترتبط عكسيًا بكمية المستضد الموجودة في عينة الاختبار.

أحد المكونات الرئيسية في أي نوع من أنواع ELISA هو المعايير المُعايرة للتركيزات المعروفة التي تسمح للمستخدم بتحديد تركيز المستضد الموجود في عينات الاختبار. عادة ، يتم تخصيص سلسلة من الآبار لإنشاء منحنى قياسي ، حيث يتم إضافة الكميات المعروفة من البروتين المؤتلف المنقى إلى الآبار بكميات متناقصة. عندما تتم معالجة هذه الآبار في نفس الوقت مع عينات الاختبار ، يمكن للمستخدم بعد ذلك الحصول على مجموعة مرجعية من قيم الامتصاص التي تم الحصول عليها من قارئ الصفيحة الدقيقة لتركيزات البروتين المعروفة لتتماشى مع قيم الامتصاص لعينات الاختبار. يمكن للمستخدم بعد ذلك حساب منحنى قياسي يمكن من خلاله مقارنة عينات الاختبار لتحديد كمية البروتين محل الاهتمام الموجود. يمكن أن يحدد المنحنى القياسي أيضًا درجة دقة عملية التخفيف التي يقوم بها المستخدم.

أخيرًا ، تستدعي الخطوة الأخيرة في كل نوع من أنواع ELISA المذكورة أعلاه إضافة ركيزة. ترتبط درجة تحويل الركيزة إلى منتج ارتباطًا مباشرًا بكمية الإنزيم الموجودة في البئر. يعتبر بيروكسيديز الفجل (HRP) والفوسفاتاز القلوي (AP) من أكثر الإنزيمات شيوعًا المرتبطة بالأجسام المضادة. كما هو متوقع ، هناك عدد من الركائز المتاحة خاصة إما بالإنزيم الذي ينتج منتجًا كروموجينيًا أو فلورسنت. علاوة على ذلك ، تتوفر ركائز في مجموعة من الحساسيات التي يمكن أن تزيد من الحساسية الكلية للمقايسة. يجب على المستخدم أيضًا أن يأخذ في الاعتبار نوع الأجهزة المتاحة لقراءة اللوحة في نهاية التجربة عند اختيار نوع الركيزة المراد استخدامها ، جنبًا إلى جنب مع الجسم المضاد المرتبط بالإنزيم المقابل.

تشتمل الركائز الكروموجينية المستخدمة بشكل شائع لـ HRP على 2،2 & # 39-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid] -diammonium salt (ABTS) و 3،3 & # 39،5،5 & # 39-tetramethylbenzidine (TMB) ، بينما ص-فوسفات النيتروفينيل (PNPP) يستخدم في AP. تنتج ABTS و TMB منتجات تفاعل ذات لون أخضر وأزرق قابلة للذوبان في الماء ، على التوالي. يتميز منتج ABTS الأخضر بقممتين رئيسيتين للامتصاص ، 410 و 650 نانومتر ، بينما يتم اكتشاف منتج TMB الأزرق بشكل أفضل عند 370 و 652 نانومتر. تتغير ألوان ABTS و TMB إلى اللون الأصفر عند إضافة محلول التوقف الحمضي ، والذي يمكن قراءته بشكل أفضل عند 450 نانومتر. تطوير الألوان لـ ABTS بطيء ، في حين أنه سريع لـ TMB. TMB أكثر حساسية من ABTS ، وقد ينتج عنه إشارة خلفية أعلى إذا استمر التفاعل الأنزيمي لفترة طويلة. ينتج PNPP منتجًا أصفر قابل للذوبان في الماء بعد تحويل AP يمتص الضوء عند 405 نانومتر.

إجراء

1. ELISA غير المباشر

إن ELISA غير المباشر هو الذي يتم فيه التعرف على الجسم المضاد الأولي الخاص بالمستضد بواسطة جسم مضاد ثانوي مترافق. البروتوكول التالي هو مثال على طريقة ELISA غير المباشرة ، حيث يتم اختبار عينات المصل من الفئران المصابة بفيروس الأنفلونزا A (IAV) لوجود الأجسام المضادة IgG الخاصة بـ IAV. تتمثل إحدى نقاط القوة في هذا المثال في أنه يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية المختلفة التي تتعرف على جميع الأنماط المتماثلة للأجسام المضادة أو الأنماط المتماثلة المحددة (على سبيل المثال ، IgG).

مستضد طلاء على صفيحة ميكروسكوبية

  1. قم بتغطية آبار صفيحة ELISA ذات 96 بئر مع مستضد منقى عن طريق الماصات 50 & # 181 لتر من المستضد المنقى (2 مجم / مل من فيروس الإنفلونزا A / PR / 8 المنقى في 0.05M Tris-HCl المخزن المؤقت (pH 9.5)) في كل بئر من الطبق.
  2. قم بتغطية اللوح بغطاء لاصق واحتضانه طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية للسماح للمستضد بالالتصاق باللوحة.
  3. عند اكتمال الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.
  1. قم بحظر مواقع ربط البروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 & # 181L منعًا مؤقتًا ، ويستخدم 5 ٪ من مصل الحمير في 1X PBS هنا ، لكل بئر. تشتمل كواشف الحجب البديلة على 5٪ حليب جاف خالي الدسم أو BSA في PBS أو مصل طبيعي من حيوان تم فيه تكوين الجسم المضاد الثانوي.
  2. احتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر عن طريق النقر على اللوحة ثم اغسل اللوحة باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين -20.

الحضانة مع الجسم المضاد الأساسي

  1. قم بإعداد تخفيف متسلسل لعينة المصل ، التي تحتوي على الجسم المضاد الأولي ، للحصول على نطاق تخفيف من 1 إلى 204،800 ، باستخدام 1X PBS. للقيام بذلك ، قم أولاً بتخفيف المصل 1: 12.5 ثم قم بإجراء تخفيف 4X (نطاق التخفيف - 1: 12.5 إلى 1: 204،800).
  2. أضف 100 & # 181L من عينات المصل المخفف تسلسليًا إلى الآبار.
  3. تغطية لوحة مع غطاء لاصق ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة.
  4. بعد الحضانة ، نفض الغبار على اللوحة فوق بالوعة ويغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين -20.

الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي

  1. أضف 100 & # 181L من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالإنزيم ، بيروكسيديز الفجل ، الحمير المترافق مع HRP الثانوي في هذه التجربة ، إلى كل بئر.
  2. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد الحضانة ، نفض الغبار عن اللوحة فوق الحوض ثم اغسل اللوحة باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين -20.
  1. أضف 100 & # 181L من ركيزة المؤشر (3،3 & # 39،5،5 & # 39-tetramethylbenzidine (TMB)) بتركيز 1 مجم / مل لكل بئر.
  2. احتضان اللوحة مع الركيزة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 & # 181L 2N حامض الكبريتيك (H.2وبالتالي4).
    في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول التوقف ، اقرأ اللوحة باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية عند 405 نانومتر لتحديد امتصاص الآبار.

2. ساندويتش إليسا

في إصدار ELISA هذا ، تكون العينة التجريبية & # 34 محشوة & # 34 بين جسم مضاد للالتقاط غير المقترن وجسم مضاد للكشف المترافق ، وكلاهما خاص بنفس البروتين ولكن في حلقات مختلفة. في مثال ELISA التالي ، تم تحديد تركيز TNF البشري & # 945 في عينة غير معروفة باستخدام منحنى قياسي ناتج من التخفيف التسلسلي 2.5X لمعيار معروف ، مؤتلف بشري TNF & # 945 (ينص على تركيز 75 بيكوغرام / مل).

طلاء الجسم المضاد لالتقاط صفيحة ميكروسكوبية

  1. قم بتغطية آبار صفيحة ELISA ذات 96 بئرًا بجسم مضاد للالتقاط المنقى عن طريق إضافة 100 & # 181L من الأجسام المضادة الملتقطة (نطاق 1-10 & # 181g / mL) لكل بئر من اللوحة.
  2. لوحة تغطية بغطاء لوح لاصق واحتضانها طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء من اللوحة عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.
  1. قم بإغلاق مواقع الارتباط المتبقية بالبروتين في الآبار المطلية بالأجسام المضادة عن طريق إضافة 200 & # 181L محلول مانع ، و 5٪ حليب جاف خالي الدسم يحتوي على PBS ، إلى الآبار.
  2. احتضان ما لا يقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر عن طريق النقر على اللوحة ثم اغسل اللوحة باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين -20.

أضف عينات اختبار تحتوي على مستضد

  1. أضف 100 & # 181L من عينة الاختبار إلى الآبار. ختم اللوح بغطاء لاصق.
  2. احتضان لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض ثم اغسل الآبار بـ 200 & # 181L 1X PBS التي تحتوي على 1 ٪ توين -20.

إضافة الجسم المضاد للكشف عن الإنزيم المترافق

  1. أضف 100 & # 181L من الأجسام المضادة للكشف عن الإنزيم المترافق إلى الآبار بتركيز مُحسَّن مسبقًا.
  2. ختم اللوح بغطاء لاصق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
  3. قم بإزالة الجسم المضاد للكشف غير المنضم عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض وغسل الآبار باستخدام 200 & # 181L 1X PBS التي تحتوي على 1٪ توين -20.
  1. أضف 100 & # 181L من ركيزة المؤشر بتركيز 1 مجم / مل. أي جسم مضاد للكشف عن الإنزيم المترافق سيحول الركيزة إلى إشارة يمكن اكتشافها.
  2. احتضان اللوحة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد 5-10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 & # 181L 2N H2وبالتالي4 على الآبار. في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف ، اقرأ اللوحة باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية لتحديد امتصاص الآبار.

3. اليزا التنافسية

تختلف خطوات ELISA التنافسي عن تلك المستخدمة في ELISA غير المباشر والساندويتش ، مع الاختلاف الرئيسي هو خطوة الربط التنافسي بين مستضد العينة ومستضد & # 34add-in & # 34. يتم تحضين عينة المستضد مع الجسم المضاد الأولي غير المسمى. يتم بعد ذلك إضافة معقدات الأجسام المضادة - المستضد إلى لوحة ELISA ، والتي تم تغطيتها مسبقًا بنفس المستضد. بعد فترة الحضانة ، يتم غسل أي جسم مضاد غير منضم. هناك علاقة عكسية بين كمية الجسم المضاد الحر المتاح لربط مولد الضد في البئر وكمية المستضد في العينة الأصلية. على سبيل المثال ، قد تحتوي عينة تحتوي على مستضد وفير على المزيد من معقدات الأجسام المضادة الأولية للمستضد ، مما يترك القليل من الجسم المضاد غير المرتبط بصفيحة ELISA. ثم يتم إضافة جسم مضاد ثانوي مترافق بالإنزيم خاص بالجسم المضاد الأولي إلى الآبار ، متبوعًا بالركيزة.

مستضد طلاء على صفيحة ميكروسكوبية

  1. قم بتغطية آبار صفيحة ELISA ذات 96 بئر مع 100 & # 956L من المستضد المنقى بتركيز 1-10 & # 956 جم / مل.
  2. لوحة تغطية بغطاء لوح لاصق واحتضان اللوحة طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول المستضد غير المنضم من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.
  1. قم بإغلاق مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 & # 956L من المخزن المؤقت للحظر لكل بئر ، والذي يمكن أن يكون إما حليب جاف خالي الدسم بنسبة 5٪ أو BSA في PBS.
  2. احتضان اللوحة لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 & # 176 درجة مئوية.

عينة الحضانة (مستضد) مع الجسم المضاد الأولي

  1. أثناء سد الآبار ، قم بإعداد خليط المستضد والأجسام المضادة عن طريق خلط مستضد عينة 150 & # 956 لتر و 150 & # 956 لترًا من الجسم المضاد الأولي لكل بئر في الفحص.
  2. احتضان هذا الخليط لمدة 1 ساعة عند 37 & # 176 درجة مئوية.

أضف خليط المستضد والأجسام المضادة إلى البئر

  1. الآن ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.
  2. ثم اغسل الآبار بـ 1X PBS التي تحتوي على توين -20.
  3. أضف 100 & # 956L من خليط عينة الأجسام المضادة الأولية للمستضد.
  4. احتضان اللوحة في 37 & # 176 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. قم بإزالة خليط العينة عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.
  6. بعد ذلك ، اغسل الآبار بـ 1X PBS تحتوي على 1٪ توين -20 لإزالة أي جسم مضاد غير منضم.

أضف الجسم المضاد الثانوي

  1. أضف 100 & # 956L من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالإنزيم ، والذي هو في هذه الحالة جسم مضاد مترافق مع AP ، إلى كل بئر.
  2. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة عند 37 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، اغسل اللوحة مع 1X PBS التي تحتوي على 1٪ توين -20.
  1. أضف 100 & # 956L من محلول الركيزة إلى كل بئر.
  2. انتظر لمدة 5-10 دقائق.
  3. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 & # 956L 2N حامض الكبريتيك إلى الآبار. بعد ذلك ، قم بقياس الامتصاصية في قارئ صفيحة ميكروسكوبية في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف

الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم ، أو ELISA هو اختبار كمي شديد الحساسية يستخدم عادة لقياس تركيز مادة تحليلية مثل السيتوكينات والأجسام المضادة في عينة بيولوجية. يتضمن المبدأ العام لهذا الاختبار ثلاث خطوات: البدء بالتقاط ، أو تثبيت ، المادة التحليلية المستهدفة على لوحة ميكروية ، متبوعة باكتشاف التحليل بواسطة بروتينات الكشف الخاصة بالهدف ، وأخيرًا ، تفاعل الإنزيم ، حيث يكون الإنزيم المترافق يحول ركائزه إلى منتج ملون. استنادًا إلى طرق مختلفة للالتقاط والكشف ، يمكن أن تكون ELISA من أربعة أنواع: مباشرة ، وغير مباشرة ، وشطيرة ، وتنافسية.

بالنسبة إلى ELISA المباشر ، يتم ربط المستضد المستهدف أولاً باللوحة ، ثم يتم اكتشافه بواسطة جسم مضاد محدد للكشف. تستخدم هذه الطريقة بشكل شائع لفحص الأجسام المضادة لمستضد معين. يتم استخدام ELISA غير المباشر للكشف عن الأجسام المضادة في عينة من أجل تحديد الاستجابات المناعية. يتم طلاء اللوحة أولاً بمولد ضد التقاط محدد ، والذي يعمل على شل حركة الجسم المضاد المستهدف ، ثم يتم اكتشاف مركب الجسم المضاد هذا باستخدام جسم مضاد ثان.

في حالة الساندويتش ELISA ، يكون التحليلة المستهدفة عبارة عن مستضد ، يتم التقاطه على اللوحة باستخدام جسم مضاد للالتقاط ثم يتم اكتشافه بواسطة الجسم المضاد للكشف ، وبالتالي تكوين شطيرة جسم مضاد - مستضد - جسم مضاد. هذه الطريقة مفيدة لقياس تركيز مستضد في عينة مختلطة.

يتم استخدام ELISA التنافسي عندما يتوفر جسم مضاد واحد فقط لمولد الضد المستهدف. يتم طلاء اللوحة أولاً بالمستضد المنقى. وفي الوقت نفسه ، يتم تحضين العينة المحتوية على المستضد مسبقًا مع الجسم المضاد ثم إضافتها إلى اللوحة ، للسماح لأي جزيئات جسم مضاد حرة بالارتباط بالمستضد المعطّل. كلما زادت الإشارة من اللوحة ، انخفض تركيز المستضد في العينة. في جميع أنواع ELISA الأربعة ، المباشرة وغير المباشرة والساندويتش والتنافسية ، يكون الجسم المضاد للكشف إما مترافقًا بشكل مباشر مع الإنزيم أو يمكن ربطه بشكل غير مباشر من خلال جسم مضاد أو بروتين آخر.

الإنزيمات المستخدمة بشكل شائع للتفاعل هي بيروكسيداز الفجل أو الفوسفاتيز القلوي مع ركائزهما الخاصة ، وكلاهما ينتج منتجًا ملونًا قابلًا للذوبان يمكن قياسه وتحديد كميته باستخدام قارئ لوحة. في هذا الفيديو ، ستلاحظ كيفية إجراء ELISA غير المباشر ، و sandwich ELISA ، و ELISA التنافسي ، متبوعًا بأمثلة عن القياس الكمي للتحليل المستهدف من طرق ELISA غير المباشرة وطريقة الساندويتش.

ستوضح التجربة الأولى كيفية استخدام ELISA غير المباشر لتحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا في المصل المأخوذ من الفئران المصابة بالإنفلونزا.

للبدء ، أضف 50 ميكرولتر من المستضد المنقى - في هذه الحالة ، 2 ملليغرام لكل مليلتر من فيروس A / PR / 8 Influenza A المنقى - إلى كل بئر من صفيحة ELISA ذات 96 بئر. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوح بغطاء لاصق واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح للمستضد بالالتصاق باللوحة. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. بعد ذلك ، قم بحظر مواقع ربط البروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر- هنا ، 5٪ من مصل الحمير في 1X PBS- لكل بئر. اترك الطبق ليحتضن لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر ثم اغسل اللوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. حرك اللوح فوق الحوض مرة أخرى لإزالة الغسل.

بعد ذلك ، قم بإعداد عينات الاختبار عن طريق إضافة 460 ميكرولتر من PBS إلى أنبوب جديد ، ثم إضافة 40 ميكرولتر من المصل لعمل تخفيف 1 إلى 12.5. ثم أضف 300 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب الثاني ، ثم أضف 100 ميكرولتر من التخفيف الأول. استمر في نطاق التخفيف التسلسلي هذا حتى الحصول على عينة نهائية بتخفيف من 1 إلى 204،800. أضف عينات المصل المخفف بشكل متسلسل في ثلاث نسخ إلى الآبار. غطي الصفيحة بغطاء لاصق واحتضنيها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة في الحوض ثم غسل اللوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. مرة أخرى ، حركي اللوح لإزالة الغسل.

الآن ، أضف 100 ميكرولتر من جسم مضاد ثانوي مترافق بالإنزيم ، والذي في هذه التجربة عبارة عن بيروكسيداز الفجل ، أو HRP ، مضاد للفأر مترافق ثانوي ، إلى كل بئر. احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ونفض الغبار لوحة لإزالة أي سائل فائض. اغسل اللوح باستخدام 1X PBS يحتوي على 1٪ توين -20 ثم ضع 100 ميكرولتر من ركيزة المؤشر بتركيز واحد مليغرام لكل مليلتر على كل بئر. احتضان اللوحة مع الركيزة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في هذا المثال ، عديم اللون 3،3 & # 39، 5،5 & # 39 - tetramethylbenzidine ، أو TMB ، تتحول الركيزة إلى اللون الأزرق عند وجود HRP. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 ميكرولتر من حامض الكبريتيك 2N. ستتحول العينات إلى اللون الأصفر.

في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف ، أدخل اللوحة في قارئ الصفيحة الدقيقة واقرأ اللوحة بالطول الموجي المناسب للركيزة لتحديد امتصاص الآبار.

لبدء شطيرة ELISA ، يجب أن تكون اللوحة مغطاة بجسم مضاد للالتقاط المنقى. للقيام بذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الملتقط بتركيز في نطاق 1-10 ميكروغرام لكل مليلتر ، إلى كل بئر من صفيحة ELISA ذات 96 بئر. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوح بغطاء لوح لاصق ثم احتضان اللوحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.

الآن ، قم بإغلاق مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المغلفة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 5٪ حليب جاف خالي الدسم إلى الآبار. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر ، ثم اغسل الآبار باستخدام برنامج تلفزيوني 1 X يحتوي على 1٪ توين -20. قم بإزالة الغسل عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. الآن ، أضف 100 ميكرولتر من عينة الاختبار إلى الآبار ، وأغلق اللوح بغطاء لاصق ، ثم احضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض ثم اغسل الآبار بـ 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. حرك اللوحة فوق الحوض لإزالة الغسل ثم أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف عن الإنزيم المترافق إلى الآبار.

ختم اللوح بغطاء لاصق. اترك الطبق ليحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة الجسم المضاد للكشف غير المنضم عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض وغسل الآبار بـ 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1٪ توين -20. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة المؤشر بتركيز 1 ملليغرام لكل مليلتر ، واحتضان اللوحة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الإنزيمي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من حامض الكبريتيك 2N إلى الآبار ثم اقرأ اللوحة في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف في قارئ الصفيحة الدقيقة.

لإجراء اختبار ELISA تنافسي ، قم أولاً بتغطية آبار لوحة ELISA ذات 96 بئرًا بـ 100 ميكرولتر من مستضد منقى بتركيز 1-10 ميكروغرام لكل مليلتر. قم بتغطية اللوحة بغطاء لوحة لاصقة ثم احتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول المستضد غير المنضم من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.

بعد ذلك ، قم بإغلاق مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المحلول المنظم لكل بئر- هنا ، 5٪ حليب جاف خالي الدسم في PBS. احتضان اللوحة لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أثناء سد الآبار ، قم بإعداد خليط الجسم المضاد في أنبوب 1.5 مليلتر بإضافة 150 ميكرولتر من عينة المستضد إلى 150 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي لكل بئر في الفحص. احتضان هذا الخليط لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. الآن ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. بعد ذلك ، اغسل الآبار بـ 1X PBS تحتوي على Tween 20 ثم أضف 100 ميكرولتر من عينة المستضد - خليط الجسم المضاد الأولي.

اترك الطبق ليحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة خليط العينة عن طريق تحريك اللوحة فوق حوض ثم اغسل الآبار باستخدام برنامج تلفزيوني 1X يحتوي على 1٪ توين -20 لإزالة أي جسم مضاد غير منضم. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالإنزيم إلى كل بئر واحتضان اللوحة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.بعد ذلك ، اغسل اللوحة بـ 1X PBS تحتوي على 1٪ توين -20 ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. انتظر لمدة 5-10 دقائق. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الإنزيمي بإضافة 100 ميكرولتر من حامض الكبريتيك 2N ثم قم بقياس الامتصاص في قارئ الصفيحة الدقيقة خلال 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف.

لمقايسة ELISA شبه الكمي غير المباشرة ، تم تحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا A في العينات المخففة تسلسليًا من مصل الفئران المصابة بالإنفلونزا من خلال قراءة امتصاص كل بئر عند 405 نانومتر في قارئ لوحة. يتم تصدير هذه البيانات الأولية إلى ورقة انتشار لأغراض الحساب. في هذه التجربة ، تم تكرار عينات المصل المخفف تسلسليًا ، والتي تتراوح من 1 - 12.5 ، إلى 1 - 204.800 ، في ثلاث نسخ.

لتحليل البيانات ، يتم حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لكل مجموعة من النسخ الثلاث عن طريق إضافة جميع القيم لكل تخفيف وقسمة المجموع على 3. بمجرد تحديد المتوسط ​​لكل مجموعة من النسخ الثلاث ، يتم رسم متوسط ​​قراءات OD450 مقابل التخفيفات المتسلسلة. تنخفض قراءات OD مع تخفيف المصل ، مما يشير إلى وجود أجسام مضادة أقل في العينات المخففة. في السندويتش الكمي ELISA ، تمت إضافة التخفيفات من المعيار المعروف ، في هذه الحالة إعادة تركيب TNFalpha البشرية ، إلى لوحة 96 بئر وقراءتها مع العينات غير المعروفة.

لإنشاء المنحنى القياسي ، تم حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لكل مجموعة من قراءات التركيزات المعروفة. بعد ذلك ، تم رسم متوسط ​​قيمة الامتصاص على المحور الصادي ، مقابل تركيزات البروتين المعروفة على المحور السيني. تتم إضافة أفضل منحنى ملائم عبر النقاط في الرسم البياني.

بمجرد إنشاء المنحنى القياسي ، يمكن تحديد كمية بروتين TNFalpha في عينة الاختبار عن طريق حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لعينة الاختبار أولاً. في هذا المثال ، أعطت عينات الاختبار قراءات OD450 لـ 0.636 و 0. 681. إضافة هذه القيم وقسمة المجموع على 2 يعطي متوسط ​​0.659. من المحور y على الرسم البياني للمنحنى القياسي ، قم بتمديد الخط الأفقي من قيمة الامتصاص هذه إلى المنحنى القياسي. عند نقطة التقاطع ، قم بتمديد خط عمودي إلى المحور السيني واقرأ التركيز المقابل الذي يتوافق ، في عينة الاختبار هذه ، مع تركيز TNFalpha البالغ 38.72 بيكوغرام لكل مليلتر.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

نتائج

في المثال التالي من ELISA غير المباشر ، تم تحديد وجود IgG الخاص بفيروس الأنفلونزا A (IAV) في مصل الفئران المصابة بـ IAV. أصيبت الفئران C57Bl / 6 بفيروس الأنفلونزا A (A / PR / 8 10 5 PFU في 100 & # 181L PBS i.p.) وتم جمع المصل بعد 28 يومًا. لتقدير كمية IgG الخاصة بـ IAV في المصل ، تم طلاء 96 لوحة ELISA المنقى بفيروس A / PR / 8 Influenza A (50 & # 181L / بئر 2 مجم / مل من فيروس PBS) طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية . تم حظر الألواح المطلية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع 5 ٪ من مصل الحمير الطبيعي في برنامج تلفزيوني ، تليها حضانة مع عينات مصل مخففة من الفئران التي تعاني من تحدي IAV طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية. تم تخفيف المصل مبدئيًا بنسبة 1: 12.5 ، متبوعًا بتخفيف 1: 4 (نطاق التخفيف - 1: 12.5 إلى 1: 204.800). بعد الغسيل ، تم تحضين الأطباق باستخدام الفوسفاتيز القلوي (AP) - مترافق مع IgG مضاد للفأر على شكل حمار لمدة ساعة واحدة. تم غسل الأطباق ، ثم ص- تمت إضافة فوسفات النيتروفينيل (PNPP 1 مجم / مل ، 100 & # 181 لتر / بئر). يتحول حل PNPP عديم اللون إلى اللون الأصفر عند وجود AP. بعد 5-10 دقائق ، تم إيقاف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 & # 181 لتر / بئر 2N H2وبالتالي4. تمت قراءة اللوحة على قارئ صفيحة ميكروسكوبية عند 405 نانومتر. النتائج التي تم الحصول عليها موضحة في الجدول 1 والشكل 1.

عينة آبار التطوير التنظيمي405 يقصد
المصل 1:12.5 أ 1 2.163 2.194
ب 1 2.214
C1 2.204
مصل 1:50 أ 1 1.712 1.894
ب 1 2.345
C1 1.624
مصل 1: 200 أ 1 1.437 1.541
ب 1 1.73
C1 1.456
مصل 1: 800 أ 1 1.036 0.957
ب 1 0.912
C1 0.923
مصل 1:3200 أ 1 0.579 0.48
ب 1 0.431
C1 0.429
مصل 1: 12800 أ 1 0.296 0.281
ب 1 0.312
C1 0.236
مصل 1: 51200 أ 1 0.308 0.283
ب 1 0.299
C1 0.243
مصل 1: 204800 أ 1 0.315 0.303
ب 1 0.298
C1 0.297

الجدول 1: بيانات مقايسة ELISA غير المباشرة. التخفيفات المصلية (من 1: 12.5 إلى 1: 204،800) ، من الفئران المصابة بفيروس الأنفلونزا A (IAV) التي تحتوي على قيم IgG الخاصة بـ IAV ، والكثافة البصرية (OD) (405 نانومتر) ومتوسط ​​OD405 القيم.


الشكل 1: مخطط مبعثر مقايسة ELISA غير المباشر من متوسط ​​التطوير التنظيمي405 القيم (+ S.D) والتخفيف في المصل (من 1: 12.5 إلى 1: 204.800) ، لفيروس الأنفلونزا A (IAV) - IgG المحدد في مصل الفئران المصابة بـ IAV. OD405 يمكن أن ترتبط القيم عكسياً بتخفيف المصل.

في المثال التالي لشطيرة ELISA ، تمت إضافة تخفيف 1: 2.5 لمعايير TNF & # 945 البشرية المؤتلفة (بدءًا من تركيز 75 بيكوغرام / مل) إلى الآبار المشار إليها في لوحة مسطحة القاع 96 بئر. أدت هذه المعايير إلى تغيير مماثل بمقدار 2.5 ضعف في قراءات الامتصاص.

عينة التركيز (pg / mL) آبار قيم قيمة متوسط رجوع حساب التركيز متوسط
المعيار 1 75 أ 1 1.187 1.169 76.376 75.01
أ 2 1.152 73.644
المعيار 2 30 ب 1 0.534 0.52 30.827 29.962
B2 0.506 29.098
المعيار 3 12 C1 0.23 0.217 12.838 12.105
C2 0.204 11.372
المعيار 4 4.8 D1 0.09 0.084 5.055 4.726
د 2 0.078 4.398
المعيار 5 1.92 ه 1 0.033 0.031 1.941 1.86
ه 2 0.03 1.778
المعيار 6 0.768 F1 0.009 0.011 0.626 0.764
F2 0.014 0.901
المعيار 7 0.307 ش 1 0.002 0.004 0.238 0.377
G2 0.007 0.516

الجدول 2: بيانات المنحنى القياسي لـ TNF & # 945 Sandwich ELISA. أ 1: 2.5 تخفيف لمعايير TNF البشري المؤتلف & # 945 (75 إلى 0.3 بيكوغرام / مل) ، قيم OD (450 نانومتر) ، يعني OD450 القيم وحسابات التركيز الخلفي ومتوسطاتها.


الشكل 2: المنحنى القياسي لـ TNF & # 945 ساندويتش ELISA. تم تحليل تخفيف 1: 2.5 لمعايير TNF & # 945 البشري المؤتلف (75 إلى 0.3 بيكوغرام / مل) باستخدام ساندويتش ELISA.450 يمكن أن ترتبط القيم ارتباطًا مباشرًا بتركيزات التخفيف القياسية. تم تحديد كمية بروتين TNF & # 945 في عينة الاختبار باستخدام المنحنى القياسي ، والذي يتوافق مع تركيز 38.72 بيكوغرام / مل.

بمجرد إنشاء المنحنى القياسي ، تم تحديد كمية بروتين TNF & # 945 في عينة الاختبار. في مثال شطيرة ELISA هذا ، أعطت عينات الاختبار OD450 قراءة 0.636 و 0.681 والتي تعطي متوسط ​​0.6585. عند رسم قراءة OD450 على الرسم البياني أعلاه ، فإن هذا يتوافق مع تركيز TNF & # 945 البالغ 38.72 بيكوغرام / مل.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

التطبيقات والملخص

كما هو موضح ، تندرج مجموعة من المقايسات المناعية (مع اختلاف طفيف في البروتوكولات) ضمن عائلة تقنية ELISA. يعتمد تحديد إصدار ELISA الذي يجب استخدامه على عدد من العوامل ، بما في ذلك ما هو المستضد الذي يتم اكتشافه ، والجسم المضاد أحادي النسيلة المتاح لمولد ضد معين ، والحساسية المرغوبة للمقايسة (5). بعض نقاط القوة والضعف في ELISAs المختلفة الموصوفة هنا هي:

إليسا نقاط القوة نقاط الضعف
غير مباشر 1) حساسية عالية بسبب حقيقة أن العديد من الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالإنزيم يمكن أن ترتبط بالجسم المضاد الأساسي 1) قد تحدث إشارة خلفية عالية لأن طلاء المستضد الذي يهم اللوحة ليس محددًا (أي أن جميع البروتينات في العينة ستغطي اللوحة)
2) يمكن التعرف على العديد من الأجسام المضادة الأولية المختلفة بواسطة جسم مضاد ثانوي واحد مترافق مع إنزيم ، مما يمنح المستخدم المرونة في استخدام نفس الجسم المضاد الثانوي المترافق مع الإنزيم في العديد من ELISA المختلفة (بغض النظر عن المستضد الذي يتم اكتشافه)
3) أفضل خيار عندما يتوفر فقط جسم مضاد واحد لمولد الضد المعني
ساندويتش 1) يزيد استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالتقاط واكتشاف المستضد من حساسية ونوعية المقايسة (مقارنةً بـ ELISA غير المباشر) 1) قد يكون تحسين تركيزات التقاط الأجسام المضادة وحيدة النسيلة واكتشافها أمرًا صعبًا (خاصة بالنسبة للمجموعات غير التجارية)
2) أفضل خيار للكشف عن بروتين كبير بحلقات متعددة (مثل السيتوكين)
تنافسي 1) يمكن استخدام عينات غير نقية 1) يتطلب كمية كبيرة من مستضد عالي النقاء لاستخدامه في طلاء الصفيحة
2) حساسية أقل لتأثيرات تخفيف الكاشف
3) مثالي للكشف عن الجزيئات الصغيرة (مثل الناشبة)

الجدول 3: ملخص. ملخص لنقاط القوة والضعف في تقنيات ELISA المختلفة.

في حين أن تقنية ELISA بسيطة ومفيدة ، إلا أن هناك بعض العيوب في أي ELISA. أحدهما هو عدم التيقن من كمية البروتين محل الاهتمام في عينات الاختبار. إذا كانت الكمية عالية جدًا أو منخفضة جدًا ، فقد تقع قيم الامتصاص التي حصل عليها قارئ الصفيحة الدقيقة أعلى أو أقل من حدود المنحنى القياسي ، على التوالي. هذا سيجعل من الصعب تحديد كمية البروتين الموجودة في عينات الاختبار بدقة. إذا كانت القيم عالية جدًا ، يمكن تخفيف عينة الاختبار قبل إضافتها إلى آبار اللوحة. ثم يلزم تعديل القيم النهائية وفقًا لمعامل التخفيف. كما ذكرنا ، تتطلب الأطقم محلية الصنع غالبًا تحسينًا دقيقًا لتركيزات الجسم المضاد المستخدمة لإنتاج نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

مراجع

  1. بورستمان ، ت. وكيسيج إس تي. تقنيات المقايسة المناعية الإنزيمية. نظرة عامة. مجلة الطرق المناعية.150 (1-2), 5-21 (1992).
  2. سليمان أيدين. تاريخ قصير ومبادئ وأنواع ELISA وخبرتنا المعملية مع تحليلات الببتيد / البروتين باستخدام ELISA. الببتيدات, 72, 4-15 (2015).
  3. غان. S.D and Patel K. R. Enzyme Immunoassay and Enzyme-linked Immunosorbent Assay. مجلة الأمراض الجلدية الاستقصائية, 133 (9), 1-3 (2013).
  4. Kohl و T. O. و Ascoli C.A. مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم المناعي للأجسام المضادة. بروتوكولات كولد سبرينج هاربور, 1 (6), (2017).
  5. ساكاموتو ، إس ، بوتالون ، دبليو ، فيمولمانكانج ، إس ، فولشاروين ، دبليو ، شوياما ، واي ، تاناكا ، إتش ، وموريموتو إس. مجلة الأدوية الطبيعية, 72 (1), 32-42 (2018).

كشف الدرجات

يرجى ملاحظة أن جميع الترجمات يتم إنشاؤها تلقائيًا.

الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم ، أو ELISA هو اختبار كمي شديد الحساسية يستخدم عادة لقياس تركيز مادة تحليلية مثل السيتوكينات والأجسام المضادة في عينة بيولوجية. يتضمن المبدأ العام لهذا الاختبار ثلاث خطوات: البدء بالتقاط ، أو تثبيت ، المادة التحليلية المستهدفة على لوحة ميكروية ، متبوعة باكتشاف التحليل بواسطة بروتينات الكشف الخاصة بالهدف ، وأخيرًا ، تفاعل الإنزيم ، حيث يكون الإنزيم المترافق يحول ركائزه إلى منتج ملون. استنادًا إلى طرق مختلفة للالتقاط والكشف ، يمكن أن تكون ELISA من أربعة أنواع: مباشرة ، وغير مباشرة ، وشطيرة ، وتنافسية.

بالنسبة إلى ELISA المباشر ، يتم ربط المستضد المستهدف أولاً باللوحة ، ثم يتم اكتشافه بواسطة جسم مضاد محدد للكشف. تستخدم هذه الطريقة بشكل شائع لفحص الأجسام المضادة لمستضد معين. يتم استخدام ELISA غير المباشر للكشف عن الأجسام المضادة في عينة من أجل تحديد الاستجابات المناعية. يتم طلاء اللوحة أولاً بمولد ضد التقاط محدد ، والذي يعمل على شل حركة الجسم المضاد المستهدف ، ثم يتم اكتشاف مركب الجسم المضاد هذا باستخدام جسم مضاد ثان.

في حالة الساندويتش ELISA ، يكون التحليلة المستهدفة عبارة عن مستضد ، يتم التقاطه على اللوحة باستخدام جسم مضاد للالتقاط ثم يتم اكتشافه بواسطة الجسم المضاد للكشف ، وبالتالي تكوين شطيرة جسم مضاد - مستضد - جسم مضاد. هذه الطريقة مفيدة لقياس تركيز مستضد في عينة مختلطة.

يتم استخدام ELISA التنافسي عندما يتوفر جسم مضاد واحد فقط لمولد الضد المستهدف. يتم طلاء اللوحة أولاً بالمستضد المنقى. وفي الوقت نفسه ، يتم تحضين العينة المحتوية على المستضد مسبقًا مع الجسم المضاد ثم إضافتها إلى اللوحة ، للسماح لأي جزيئات جسم مضاد حرة بالارتباط بالمستضد المعطّل. كلما زادت الإشارة من اللوحة ، انخفض تركيز المستضد في العينة. في جميع أنواع ELISA الأربعة ، المباشرة وغير المباشرة والساندويتش والتنافسية ، يكون الجسم المضاد للكشف إما مترافقًا بشكل مباشر مع الإنزيم أو يمكن ربطه بشكل غير مباشر من خلال جسم مضاد أو بروتين آخر.

الإنزيمات المستخدمة بشكل شائع للتفاعل هي بيروكسيداز الفجل أو الفوسفاتيز القلوي مع ركائزهما الخاصة ، وكلاهما ينتج منتجًا ملونًا قابلًا للذوبان يمكن قياسه وتحديد كميته باستخدام قارئ لوحة. في هذا الفيديو ، ستلاحظ كيفية إجراء ELISA غير المباشر ، و sandwich ELISA ، و ELISA التنافسي ، متبوعًا بأمثلة عن القياس الكمي للتحليل المستهدف من طرق ELISA غير المباشرة وطريقة الساندويتش.

ستوضح التجربة الأولى كيفية استخدام ELISA غير المباشر لتحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا في المصل المأخوذ من الفئران المصابة بالإنفلونزا.

للبدء ، أضف 50 ميكرولتر من المستضد المنقى - في هذه الحالة ، 2 ملليغرام لكل مليلتر من فيروس A / PR / 8 Influenza A المنقى - إلى كل بئر من صفيحة ELISA ذات 96 بئر. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوح بغطاء لاصق واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح للمستضد بالالتصاق باللوحة. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. بعد ذلك ، قم بحظر مواقع ربط البروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر- هنا ، 5٪ من مصل الحمير في 1X PBS- لكل بئر. اترك الطبق ليحتضن لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر ثم اغسل اللوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. حرك اللوح فوق الحوض مرة أخرى لإزالة الغسل.

بعد ذلك ، قم بإعداد عينات الاختبار عن طريق إضافة 460 ميكرولتر من PBS إلى أنبوب جديد ، ثم إضافة 40 ميكرولتر من المصل لعمل تخفيف 1 إلى 12.5. ثم أضف 300 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب الثاني ، ثم أضف 100 ميكرولتر من التخفيف الأول. استمر في نطاق التخفيف التسلسلي هذا حتى الحصول على عينة نهائية بتخفيف من 1 إلى 204،800. أضف عينات المصل المخفف بشكل متسلسل في ثلاث نسخ إلى الآبار. غطي الصفيحة بغطاء لاصق واحتضنيها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة في الحوض ثم غسل اللوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. مرة أخرى ، حركي اللوح لإزالة الغسل.

الآن ، أضف 100 ميكرولتر من جسم مضاد ثانوي مترافق بالإنزيم ، والذي في هذه التجربة عبارة عن بيروكسيداز الفجل ، أو HRP ، مضاد للفأر مترافق ثانوي ، إلى كل بئر. احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ونفض الغبار لوحة لإزالة أي سائل فائض. اغسل اللوح باستخدام 1X PBS يحتوي على 1٪ توين -20 ثم ضع 100 ميكرولتر من ركيزة المؤشر بتركيز واحد مليغرام لكل مليلتر على كل بئر. احتضان اللوحة مع الركيزة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في هذا المثال ، يتحول لون الركيزة عديم اللون 3،3 '، 5،5' - tetramethylbenzidine ، أو TMB ، إلى اللون الأزرق عند وجود HRP. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 ميكرولتر من حامض الكبريتيك 2N. ستتحول العينات إلى اللون الأصفر.

في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف ، أدخل اللوحة في قارئ الصفيحة الدقيقة واقرأ اللوحة بالطول الموجي المناسب للركيزة لتحديد امتصاص الآبار.

لبدء شطيرة ELISA ، يجب أن تكون اللوحة مغطاة بجسم مضاد للالتقاط المنقى. للقيام بذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الملتقط بتركيز في نطاق 1-10 ميكروغرام لكل مليلتر ، إلى كل بئر من صفيحة ELISA ذات 96 بئر. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوح بغطاء لوح لاصق ثم احتضان اللوحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.

الآن ، قم بإغلاق مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المغلفة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 5٪ حليب جاف خالي الدسم إلى الآبار. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر ، ثم اغسل الآبار باستخدام برنامج تلفزيوني 1 X يحتوي على 1٪ توين -20. قم بإزالة الغسل عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. الآن ، أضف 100 ميكرولتر من عينة الاختبار إلى الآبار ، وأغلق اللوح بغطاء لاصق ، ثم احضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض ثم اغسل الآبار بـ 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. حرك اللوحة فوق الحوض لإزالة الغسل ثم أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف عن الإنزيم المترافق إلى الآبار.

ختم اللوح بغطاء لاصق. اترك الطبق ليحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة الجسم المضاد للكشف غير المنضم عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض وغسل الآبار بـ 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1٪ توين -20. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة المؤشر بتركيز 1 ملليغرام لكل مليلتر ، واحتضان اللوحة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الإنزيمي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من حامض الكبريتيك 2N إلى الآبار ثم اقرأ اللوحة في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف في قارئ الصفيحة الدقيقة.

لإجراء اختبار ELISA تنافسي ، قم أولاً بتغطية آبار لوحة ELISA ذات 96 بئرًا بـ 100 ميكرولتر من مستضد منقى بتركيز 1-10 ميكروغرام لكل مليلتر. قم بتغطية اللوحة بغطاء لوحة لاصقة ثم احتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول المستضد غير المنضم من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.

بعد ذلك ، قم بإغلاق مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المحلول المنظم لكل بئر- هنا ، 5٪ حليب جاف خالي الدسم في PBS. احتضان اللوحة لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أثناء سد الآبار ، قم بإعداد خليط الجسم المضاد في أنبوب 1.5 مليلتر بإضافة 150 ميكرولتر من عينة المستضد إلى 150 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي لكل بئر في الفحص. احتضان هذا الخليط لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. الآن ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. بعد ذلك ، اغسل الآبار بـ 1X PBS تحتوي على Tween 20 ثم أضف 100 ميكرولتر من عينة المستضد - خليط الجسم المضاد الأولي.

اترك الطبق ليحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة خليط العينة عن طريق تحريك اللوحة فوق حوض ثم اغسل الآبار باستخدام برنامج تلفزيوني 1X يحتوي على 1٪ توين -20 لإزالة أي جسم مضاد غير منضم. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالإنزيم إلى كل بئر واحتضان اللوحة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل اللوحة بـ 1X PBS تحتوي على 1٪ توين -20 ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. انتظر لمدة 5-10 دقائق. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الإنزيمي بإضافة 100 ميكرولتر من حامض الكبريتيك 2N ثم قم بقياس الامتصاص في قارئ الصفيحة الدقيقة خلال 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف.

لمقايسة ELISA شبه الكمي غير المباشرة ، تم تحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا A في العينات المخففة تسلسليًا من مصل الفئران المصابة بالإنفلونزا من خلال قراءة امتصاص كل بئر عند 405 نانومتر في قارئ لوحة. يتم تصدير هذه البيانات الأولية إلى ورقة انتشار لأغراض الحساب. في هذه التجربة ، تم تكرار عينات المصل المخفف تسلسليًا ، والتي تتراوح من 1 - 12.5 ، إلى 1 - 204.800 ، في ثلاث نسخ.

لتحليل البيانات ، يتم حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لكل مجموعة من ثلاث نسخ عن طريق إضافة جميع القيم لكل تخفيف وقسمة المجموع على 3.بمجرد تحديد متوسط ​​كل مجموعة من ثلاث نسخ ، يتم رسم متوسط ​​قراءات OD450 مقابل التخفيفات التسلسلية. تنخفض قراءات OD مع تخفيف المصل ، مما يشير إلى وجود أجسام مضادة أقل في العينات المخففة. في السندويتش الكمي ELISA ، تمت إضافة التخفيفات من المعيار المعروف ، في هذه الحالة إعادة تركيب TNFalpha البشرية ، إلى لوحة 96 بئر وقراءتها مع العينات غير المعروفة.

لإنشاء المنحنى القياسي ، تم حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لكل مجموعة من قراءات التركيزات المعروفة. بعد ذلك ، تم رسم متوسط ​​قيمة الامتصاص على المحور الصادي ، مقابل تركيزات البروتين المعروفة على المحور السيني. تتم إضافة أفضل منحنى ملائم عبر النقاط في الرسم البياني.

بمجرد إنشاء المنحنى القياسي ، يمكن تحديد كمية بروتين TNFalpha في عينة الاختبار عن طريق حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لعينة الاختبار أولاً. في هذا المثال ، أعطت عينات الاختبار قراءات OD450 لـ 0.636 و 0. 681. إضافة هذه القيم وقسمة المجموع على 2 يعطي متوسط ​​0.659. من المحور y على الرسم البياني للمنحنى القياسي ، قم بتمديد الخط الأفقي من قيمة الامتصاص هذه إلى المنحنى القياسي. عند نقطة التقاطع ، قم بتمديد خط عمودي إلى المحور السيني واقرأ التركيز المقابل الذي يتوافق ، في عينة الاختبار هذه ، مع تركيز TNFalpha البالغ 38.72 بيكوغرام لكل مليلتر.


شاهد الفيديو: بث مباشر فري فاير:تيم كود و صعود للقراند ماستر+اختبار دخول كلانFBIبث مباشر فري فاير-لايف فري فاير (ديسمبر 2022).