معلومة

حد الاستبعاد ونفاذية الغشاء الخارجي

حد الاستبعاد ونفاذية الغشاء الخارجي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

وفقًا لهذا الكتاب المدرسي:

P aeruginosa ، على سبيل المثال ، وهو شديد المقاومة للعوامل المضادة للبكتيريا ، يكون الغشاء الخارجي أقل نفاذاً بمئة مرة من غشاء E coli. [صفحة رقم 27]

ثم في نفس الصفحة:

تتميز بورينات الأنواع المختلفة بحدود استبعاد مختلفة ، تتراوح من الأوزان الجزيئية من حوالي 600 في E coli و S typhimurium إلى أكثر من 3000 في P aeruginosa.

كيف يمكن أن يكون للمتصورة الزنجارية نفاذية أقل من الإشريكية القولونية ، إذا كان حد استبعادها أكبر من الإشريكية القولونية؟


محاولتي:

هذا المصدر يدعي أن

يوفر OprF الغشاء الخارجي لـ P. aeruginosa بحد استبعاد يبلغ 500 Da.

هذه (500 Da.) قريبة من تلك الخاصة بـ E. coli 600 Da. فكيف تكون مقاومتها للخارج؟


دفع الظرف البكتيري

4.2.4 حويصلات الغشاء الخارجي والأشباح البكتيرية

حويصلات الغشاء الخارجي (OMVs) والأشباح البكتيرية (BGs) هي مشتقات لا خلوية من الغلاف سالب الجرام الذي يحتوي على البروتينات المعبر عنها سطح الخلية الأم [77-79]. تتكون OMVs من حويصلات بيلاميلار مشتقة من الغشاء الخارجي ، قطرها 50-250 نانومتر ، والتي يتم تطويرها باستمرار عن طريق نمو البكتيريا سالبة الجرام [77]. تم تحقيق عرض سطح فعال على OMVs من خلال دمج بروتينات الركاب في بكتريا قولونية توكسين ClyA ، الذي يتركز على هذه الهياكل أثناء تكون الحويصلة [80]. OMVs لها فائدة خاصة كوسائل توصيل لقاح لأنها مستقرة أثناء التخزين لفترات طويلة [81] ، ومولدة للمناعة بشدة (بفضل العديد من مكونات تحفيز المناعة في OM التي تحتفظ بها هذه الحويصلات) ، ولكنها لا تقدم نفس مخاطر السلامة البيئية مثل الخلايا السليمة لأنهم غير قادرين على التكاثر (انظر الإطار 4.1) [82-84].

على النقيض من ذلك ، فإن BGs عبارة عن مظاريف بكتيرية كاملة سالبة الجرام يتم إنتاجها من خلال التعبير غير المتجانسة لجين التحلل المشتق من البكتيريا ه (الشكل 4.2). عند التعبير ، يُدرج البروتين E في IM عبر الطرف N الخاص به ، بينما ينتقل المجال الطرفي C عبر IM (الشكل 4.2A) ويتكامل في OM (الشكل 4.2B) ، مما يؤدي إلى اندماج الغشاءين. يؤدي قلة قلة البروتين E إلى تكوين "نفق تحلل" (الشكل 4.2C) ، يتم من خلاله إطلاق السيتوبلازم خارج الخلية. ومع ذلك ، نظرًا للطبيعة الخاضعة للرقابة للحدث التحليلي والختم الفعال بين IM و OM ، يتم الحفاظ على مورفولوجيا غلاف الخلية ومحتوى محيط الخلية [78]. الأكثر شيوعًا ، يتم تحقيق تثبيت البروتينات الأجنبية على BGs من خلال اندماج الركاب ببروتين الغشاء الخارجي ، OmpA. أخيرًا ، مثل OMVs ، BGs هي وسائل ممتازة لإيصال اللقاح بسبب خصائصها المناعية القوية وعدم القدرة على التكرار [85،86].

الشكل 4.2. تمثيل تخطيطي لتحلل البروتين الناجم عن E وتوليد BG. (أ) يُدرج المجال الطرفي N للبروتين E في IM وينتقل الطرف C إلى البلازم المحيط. (ب) يتم دمج المحطة C في OM للحث على الاندماج مع IM. (ج) أخيرًا ، يقلة البروتين E لتشكيل نفق التحلل.

مصدر: مقتبس من Langemann et al. [78].


حدود ونفاذية الغشاء الخارجي - علم الأحياء

مجلة علم البكتيريا ، أغسطس 1992 ، ص. 5196-5203

0021-9193 / 92 / 165196-08 $ 02.00 / 0 حقوق النشر © 1992 ، الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة

إعادة التقييم ، باستخدام الخلايا السليمة ، لحد الاستبعاد ودور Porin OprF في نفاذية الغشاء الخارجي Pseudomonas aeruginosa ، فرانسيس بيليدو ، ونانسي إل.مارتن ، وريتشارد جيه. سينيل ، وروبرت إي دبليو هانكوك *

قسم الأحياء الدقيقة ، جامعة كولومبيا البريطانية ، 300-6174 شارع الجامعة ، فانكوفر ، بنيتيش كولومبيا ، كندا تم استلام V6T 1Z3 في 25 مارس 1992 / تم قبوله في 9 يونيو 1992

توصلت الدراسات السابقة التي استخدمت طرق إعادة تشكيل الغشاء النموذجي إلى استنتاجات مختلفة فيما يتعلق بحد الاستبعاد للغشاء الخارجي لـ Pseudomonas aeruginosa وما إذا كان OprF هو البروتين الرئيسي لتشكيل القناة في الغشاء الخارجي. في هذه الدراسة ، تم استنساخ جزء Sall 6.2 كيلو بايت ، يشفر فقط اثنين من الإنزيمات السيتوبلازمية ، a-galactosidase وهيدرولاز السكروز ، ونفاذية رافينوز الغشاء الداخلي ، خلف مروج تول المحرض على m-toluate من ناقل pNM185 لإنشاء البلازميد pFB71. سلالات P. aeruginosa التي تؤوي pFB71 ، عند نموها باستخدام محفز ، أنتجت كلا الإنزيمات المشفرة بواسطة الملحق واكتسبت القدرة على النمو على السكاريد ميليبيوز ورافينوز ثلاثي السكاريد. كان معدل النمو يعتمد على تركيز وحجم السكاريد وانخفض من ثلاثة إلى خمسة أضعاف بسبب عدم وجود OprF ، كما تم فحصه من خلال قياس النمو على الميلبيوز والرافينوز لمشتق إدخال Q متماثل المنشأ ، H636 (pFB71) ). بتركيزات عالية ، يمكن أن يمر ثنائي وثلاثي ورباعي السكاريد عبر الغشاء الخارجي لتحلل البلازموليز P. الزنجارية ، كما تم قياسه عن طريق تشتت الضوء وتأكيده بواسطة المجهر الإلكتروني. كانت حركية المعدل الأولي لتغيرات تشتت الضوء تعتمد على حجم السكاريد المستخدم. علاوة على ذلك ، كانت معدلات التغيير في تشتت الضوء بسبب امتصاص رافينوز و stachyose عبر الغشاء الخارجي للسلالة H636 خمسة أضعاف أو أكثر من الأصل H103 الذي يحتوي على OprF. تتوافق هذه البيانات مع دراسات الغشاء النموذجية التي تُظهر أن OprF هو أكثر المواد الإباحية السائدة للمركبات الأكبر من السكاريد في P. الزنجارية وتشير إلى أن حد الاستبعاد لهذا البورين والغشاء الخارجي أكبر من حجم رباعي السكاريد. بالإضافة إلى ذلك ، أكدت هذه البيانات وجود بورينات أخرى ذات وظيفة سائدة في امتصاص أحادي السكاريد ووظيفة ثانوية في امتصاص السكريات الأكبر.

الأغشية الخارجية للبكتيريا سالبة الجرام مثل Pseudomonas aeruginosa هي حواجز نفاذية مثقبة بقنوات مملوءة بالماء والتي تحدد حد الاستبعاد الحجمي للمركبات المحبة للماء (9 ، 22). تتكون هذه القنوات من فئة من بروتينات الغشاء تسمى porins (9 ، 22). تم عزل بروتين بورين F ​​(الذي أعيد تسميته لاحقًا بـ OprF) من P. aeruginosa وإعادة تكوينه في الجسيمات الشحمية وعرضها في فحوصات التوازن (التي لم يُنظر فيها إلى معدل النفاذية) لتشكيل قنوات يمكن نفاذها إلى dextrans بأقطار تصل إلى 2 نانومتر. (11). في المقابل ، وجد أن Escherichia coli و Salmonella typhimurium تحت نفس الظروف يمتلكان بورينات استبعدت tetrasaccharides (قطر ، 1.17 نانومتر) (11 ، 16). يبدو أن البيانات الخاصة بـ P. aeruginosa porin OprF تتعارض في البداية مع البيانات التي تشير إلى أن هذه البكتيريا تتمتع بدرجة عالية من المقاومة الجوهرية للمضادات الحيوية مقارنة بـ E. coli و S. typhimuium (11) بالإضافة إلى البيانات اللاحقة التي تظهر أن P. aeruginosa نفاذية منخفضة للغشاء الخارجي (2 ، 17 ، 37). نظرًا لأن OprF كان بروتينًا وفيرًا في P. aeruginosa ، فقد اقترح أنه على الرغم من حد استبعاد القناة الكبير ، فإن OprF يعمل بشكل سيئ في امتصاص الركائز مثل المضادات الحيوية (5 ، 11). تم تقديم النتائج المتسقة مع هذا الاقتراح من خلال دراسات الغشاء النموذجي للطبقة المزدوجة للدهون السوداء (5) وتورم الجسيم الشحمي (19 ، 38). تم اقتراح فرضيتين منفصلتين لشرح الأداء الضعيف لقنوات OprF. كانت هذه تغايرية جزيئية ، مع جزيئات OprF الفردية *

تمتلك إما قنوات كبيرة (تردد 99٪) (32) ، والهندسة المحددة لقنوات OprF (19). منذ عام 1986 ، أنتج Nakae والمتعاونون معه سلسلة من الأوراق التي خلصت إلى أن الغشاء الخارجي P. aeruginosa يمنع امتصاص السكريات حتى (8 ، 33-36) ، وأن OprF ليس بورين (8 ، 36) ، وأن بورينات P. aeruginosa عبارة عن ثلاثة بروتينات تسمى C و D و E (36). تضمنت المنهجيات التي تم استخدامها للوصول إلى هذه الاستنتاجات كل من منهجيات تضخم الجسيمات الشحمية (8 ، 35 ، 36) وتجارب تحلل البلازما (25 ، 26). على الرغم من أن كل من هذه الدراسات قد تم انتقادها على وجه التحديد على أساس منهجية معيبة (18 ، 19 ، 27) ، إلا أنه من المزعج أن نفس التقنية ، أي تورم الجسيمات الشحمية ، في أيدي مجموعتين مختلفتين ، يمكن أن تؤدي إلى مثل هذا الاختلاف. النتائج (36 ، 38). بالإضافة إلى ذلك ، فإن السلالات التي تعاني من نقص OprF الناتجة عن الوسائل الكيميائية (8 ، 17) أو الوراثية الجزيئية (30) لم يكن لها أي تغيير أو تغيرات طفيفة في حساسية المضادات الحيوية ، وبالتالي فشلت في دعم الاستنتاج القائل بأن OprF هو بروتين بورين الرئيسي لـ P. aeruginosa . من ناحية أخرى ، تم اقتراح هذا النقص في التغيير في قابلية المضادات الحيوية بسبب التغيرات الجوهرية في نفاذية الخلايا وشكلها وخصائص نموها الناتجة عن دور OprF في

الغشاء الخارجي وهيكل الخلية (8 ، 31). لذلك ، قررنا إعادة فحص هذه المشكلة باستخدام البروتوكولات التجريبية في الجسم الحي للقضاء على القطع الأثرية المحتملة التي تسببها دراسات غشاء النموذج. تشير النتائج التي تم الحصول عليها إلى أن الغشاء الخارجي P. aeruginosa يسمح بالتخلل إلى جزيئات السكر كبيرة مثل raffinose (a trisaccharide) أو

stachyose (رباعي السكاريد) ويقترح كذلك أن OprF

المؤلف المراسل. 5196

هي القناة الرئيسية ولكنها ليست بالضرورة القناة الوحيدة المشاركة في امتصاص هذه السكريات. المواد والطرق: السلالات البكتيرية والبلازميدات وظروف النمو. تم استخدام سلالة P. aeruginosa PAO1 سلالة H103 (30) كسلالة من النوع البري تحتوي على OprF. كان P. aeruginosa H636 أحد مشتقات oprF :: fQ للسلالة H103 التي تم إنشاؤها عن طريق استبدال الجين بجين oprF متحور جزئيًا (30). تم استخدام E. coli DH5a F '[F' end41 hsdRl7 (rK- mK +) supE44 thi-1 recAl gyrA96 reAl X- + 80dlacZAM15 A (lacZYA argF) U169] (30) للاستنساخ الأولي ، بينما تم استخدام E. coli SM10 (28) ) ، الذي يحتوي على بلازميد RP1 متحور مدمج في الكروموسوم ، للتزاوج ثنائي الوالدين للبلازميدات من الإشريكية القولونية إلى P. aeruginosa. E. coli DS25-91 (lacY melB metB rpsL raf؟) (3) التي تحتوي على استخدام رافينوز ، 130 كيلو بايت في البوصة البلازميد pRSD2-1 مع طفرة تأسيسية تم الحصول عليها من R. Schmitt (Lehrstuhl fuir Genetik ، Universitat Regensburg ، Regensburg ، ألمانيا ). تم تسلسل جزء سالي بحجم 6.2 كيلوبايت من pRSD2-1 (rafR [RafC] Tra + InI) بالكامل (رقم انضمام GenBank ، M27273) وتبين أنه يشفر ثلاثة جينات هيكلية فقط ، rafA (oagalactosidase) ، rafB (نفاذية رافينوز الغشاء الداخلي) ، و rafD (هيدرولاز السكروز) ، وجين مبتور ، طوف (جين مثبط) (3). تم استئصال هذا الجزء من pRSD2-1 وإدخاله في موقع SalI لمتجه التعبير المنظم m-toluate- أو البنزوات pNM185 (Kmr Smr pmTOL mob 'tra +) (15) لإنشاء pFB71. لإنشاء موقع SalT فريد في البلازميد pNM185 ، يجب إدخال محول EcoRI-SalI في موقع EcoRI الفريد لهذا البلازميد. تم استخدام Plasmid pFB71 لتحويل E. coli SM10 ، مع اختيار علامات مقاومة المضادات الحيوية الخاصة بالبلازميد والنمو على رافينوز ، ثم نقله إلى السلالتين H103 و H636 عن طريق الاقتران ، باستخدام وظيفة الغوغاء المشفرة على النواقل (3 ، 7) و إدراج جينات tra في كروموسوم SM10 (28). نمت السلالات بشكل روتيني على وسط مرق Luria (0.8 ٪ Bacto Tryptone ، 0.5 ٪ مستخلص الخميرة) ، تحتوي على 150 مللي مولار كلوريد الصوديوم ، وتم ترسيخها عند الاقتضاء مع 2 ٪ (وزن / حجم) باكتو أجار (30). بالنسبة للتجارب التي اشتملت على النمو على مصادر كربونية محددة ، نمت سلالات الإشريكية القولونية على وسط أدنى AB (6) بينما نمت سلالات P. aeruginosa على وسط أدنى BM2 (2). بالنسبة لتجارب النمو ، تمت زراعة البكتيريا التي نمت إلى الطور الأسي المتوسط ​​على وسط ضئيل باستخدام غلوكونات (P. aeruginosa) أو الجلسرين (E. coli) كمصدر للكربون ، تمت زراعتها بنسبة 1 في 50 في وسط طازج مُدفأ مسبقًا يحتوي على المستويات المحددة من السكريات ونمت باستخدام يهتز عند 37 درجة مئوية. تم أخذ عينات (1 مل لكل منها) على فترات منتظمة لـ A6. قياسات. لقياس النمو Km (أي تركيز مصدر الكربون الذي ينتج عنه نصف معدل النمو الأقصى) ، تم رسم المعادلات المتبادلة لمعدلات النمو الأولية مقابل التبادلات لتركيزات السكريد لإعطاء خطوط ذات معامل ارتباط r يتجاوز 0.92 (يجب الإشارة إلى أن هذه البيانات تعكس تغلغل الغشاء الخارجي فقط إذا كان هذا الحدث يحد من معدل النمو ، كما هو موضح في المراجع 20 و 37 وما دون). تم حساب قيم Growth Km من التقاطع على المحور الإحداثي (-l / Km). تم الحصول على رافينوز ومليبيوز (نقي> 99.5٪) من شركة سيجما للكيماويات (سانت لويس ، ميزوري). تم الكشف عن عدم وجود تلوث كبير بواسطة السكريات الأصغر من خلال عدم قدرة سلالات P. aeruginosa و E. coli على النمو على مستويات عالية من هذه السكريات ما لم تكن تحتوي على البلازميد.

pFB71. تجارب تشتت الضوء. نمت الخلايا في وسط BM2

PSEUDOMONAS AERUGINOSA PORIN

التي تحتوي على 10 ملي غلوكونات تم جمعها بالطرد المركزي عند 3000 × جم وتم تعليقها برفق في محلول 10 ملي مولار (حمض مورفولين بروبان سلفونيك) (درجة الحموضة 6.5) يحتوي على 5 ملي مولار من تركيزات MgCl و 300 ميكرومتر من مجموعة متنوعة من السكريات. تم إجراء قياسات تشتيت الضوء عن طريق وضع 1 مل من الخلايا في حامل الكوفيت لمقياس الطيف الضوئي Perkin-Elmer 650-1OS مع ضبط أطوال موجات الانبعاث والإثارة عند 600 نانومتر وعرض الشق عند 2 نانومتر. تم تسجيل تشتت الضوء في الوحدات التعسفية بشكل مستمر لمدة تصل إلى 60 دقيقة. المجهر الإلكتروني. تم تحضين الخلايا في 300 ميكرومتر من الجلوكوز أو الميلبيوز أو رافينوز أو ستاكشيوز مع وبدون 10 ملي مولار من KCN لمدة 30 دقيقة ، وبعد ذلك تمت إضافة الجلوتارالدهيد إلى تركيز نهائي قدره 2.5٪. كشفت التجارب الضابطة أن KCN لم يؤثر على معدل تحلل البلازما ، كما يتضح من تجارب تشتت الضوء. بعد 3 ساعات ، تم غسل الخلايا وتثبيتها في 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعتين ، وتجفيفها في سلسلة إيثانول (25 ، 50 ، 80 ، 95 ، 100٪) ، ثم دمجها في Araldite. تم قطع المقاطع الرقيقة باستخدام Reichert Ultramicrotome OM U4 Ultracut ، وتم جمعها على شبكات نحاسية مغلفة بالكربون ، وملطخة بخلات اليورانيل وسيترات الرصاص. تم فحص جميع العينات باستخدام مجهر إلكتروني ناقل الحركة Zeiss EM 10C يعمل عند 60 كيلو فولت. فحوصات الإنزيم. تم تحديد مستويات هيدرولاز السكروز وأنشطة a-galactosidase في الخلايا التي نمت بشكل كبير في الوسط الأدنى المناسب (الجدول 1) مع أو بدون محفز (0.1 و 5 ملي مول تولوات للإشريكية القولونية و P. aeruginosa ، على التوالي). تم تحضير المستخلصات الخام عن طريق صوتنة الخلايا ثلاث مرات لمدة 30 ثانية عند 0 درجة مئوية باستخدام مسبار صغير من أداة تفكيك الصوت فيشر (نموذج 300) عند مستوى إنتاج نسبي يبلغ 35٪. تم قياس أنشطة هيدروليز السكروز و a-galactosidase كما هو موصوف في مكان آخر (24 ، 25). النتائج والمناقشة النمو على رافينوز. اقترح Woodruff و Hancock (30 ، 31) سابقًا أن العيوب الهيكلية الرئيسية في الغشاء الخارجي P. aeruginosa ، الناتجة عن فقدان OprF في السلالة H636 :: Q ، حالت دون الاستنتاجات النهائية بشأن دور OprF في حساسية المضادات الحيوية. تم اقتراح العديد من المضادات الحيوية ، بما في ذلك 13 لاكتام ، لتكون قادرة على المرور عبر الغشاء الخارجي باستخدام مسارات nonporin (10) والتي يمكن أن تعوض جزئيًا عن فقدان مسار البورن (30). ومع ذلك ، فقد استنتجنا أن السكريات قليلة السكاريد المحبة للماء لن تكون قادرة على المرور عبر الغشاء الخارجي باستخدام مسارات nonporin. وهكذا ، إذا كان OprF هو حقًا الخزان الرئيسي لـ P. aeruginosa ، فينبغي أن يتسبب خسارته في حدوث تغيير في نمو Km للسكريات. لسوء الحظ ، فإن P. aeruginosa غير قادر على النمو على أي سكريات أكبر من السكاريد الأحادي ، وهي نتيجة يمكن أن تعكس حد استبعاد أحادي السكاريد للغشاء الخارجي ، على النحو الذي اقترحه Yoneyama et al. (33 ، 34) ، أو يمكن أن يعكس نقص الإنزيمات المناسبة. لذلك ، حاولنا توفير القدرات الأيضية المناسبة عن طريق استنساخ عامل استخدام رافينوز من E. coli plasmid pRSD2-1 إلى P. aeruginosa. تم استنساخ جزء SalI سعة 6.2 كيلو بايت بشكل كامل ويحتوي على جزء فقط من المكثف المشفر بالـ rafR بالإضافة إلى الجينات لاثنين من الإنزيمات السيتوبلازمية ، cx-galactosidase وهيدرولاز السكروز ، ونفاذية غشاء داخلي واحد متكامل (7). في الأصل تم استنساخ الجزء في ناقل التعبير pVDtac (6) خلف مروج tac في pFB15 البلازميد. على الرغم من أنه تم الحصول على نتائج مماثلة لتلك الموصوفة أدناه (كما تمت مراجعتها بإيجاز في المرجع 4) ، فإن التعبير الضعيف لـ tac

الجدول 1. أنشطة هيدرولاز السكروز و a-galactosidase لكل من E. coli DH5a (pFB71) و P. aeruginosa H103 (pFB71) و H636 (pFB71) نشاط a-Galactosidase (، تحرر أومول ofp-nitrophenol / دقيقة / مجم من البروتين) C

نشاط هيدرولاز السكروز

(1tmol من الجلوكوز المحررة / دقيقة / ملغ من البروتين)

كونترولد ميليبيوز رافينوز

1.6 ± 0.4 3.5 ± 0.4 4.9 ± 0.1 5.1 ± 0.9 2.6 ± 0.5 4.1 ± 0.6 9.3 ± 0.8 8.9 ± 0.2 3.3 ± 0.3 4.5 ± 0.4 8.8 ± 0.6 9.5 ± 0.8 جرام تحتوي ثقافات E. coli DH5a (pFB71) على 0.1 ملي مولار متر- toluate كمحفز. تحتوي مزارع P. الزنجارية H103 (pFB71) و H636 (pFB71) على 5 ملي مولار تولوات

كمحفز ، نظرًا لأن 0.1 ملي مولار تولوات فشلت في إحداث مستويات يمكن اكتشافها من أي إنزيم. بالنسبة للإشريكية القولونية DH5a (pFB71) ، كان 5 ملي مولار تولوات سامًا. كانت تركيزات مصادر الكربون المستخدمة 50 ملي غلوكونات ، جلسرين ، ميليبيوز أو 100 ملي رافينوز. يعني ± الانحرافات المعيارية لثلاث فحوصات مستقلة لنشاط معين معبرًا عنها بالميكرومولات من الجلوكوز المحررة في الدقيقة لكل مليغرام من البروتين عند 3 درجات مئوية. نظرًا لأن المقتطفات المستخدمة جميعها تحتوي على جلوكوز مشتق من الخلايا ، فقد تم طرح تركيزات الخلفية (تقريبًا 30 إلى 40 ٪ من الأرقام المعطاة) في الثقافات الخالية من البلازميد أو غير المستحثة. C تعني ± الانحرافات المعيارية لثلاث فحوصات لنشاط معين معبرًا عنها بالميكرومولات من p-nitrophenol المحررة في الدقيقة لكل مليغرام من البروتين عند 37 درجة مئوية. تم قياس أنشطة a-Galactosidase بعد النمو على الغلوكونات ، حيث كان هذا هو مصدر الكربون الضبط المستخدم في تجارب النمو. ومع ذلك ، تداخل الغلوكونات مع فحوصات هيدرولاز السكروز ، لذلك تم إجراء ذلك بعد النمو في الجلسرين (E. coli) أو السكسينات (P. aeruginosa).

المحفز في P. aeruginosa في المتوسط ​​الأدنى (14) أدى إلى نمو بطيء جدًا على السكريات وأزمنة تأخير طويلة (10 إلى 24 ساعة). لذلك ، قمنا بإعادة تشكيل جزء SalI سعة 6.2 كيلو بايت الموصوف أعلاه خلف مروج تول المحرض على m-toluate في البلازميد pNM185. سمح البلازميد الناتج pFB71 لـ E. coil DHSa بالتعبير عن a-galactosidase وهيدرولاز السكروز في ظل ظروف محرضة (الجدول 1) والنمو على رافينوز (الجدول 2). بعد نقل البلازميد pFB71 إلى P. aeruginosa H103 ، تم إحداث مستويات كبيرة من كل من هيدرولاز السكروز و ot-galactosidase عندما نمت هذه السلالة في سكسينات أو غلوكونات مع إضافة 5 ملي مولار تولوات (الجدول 1). فشلت المستويات المنخفضة من تولوات (أي 0.1 ملم) في إحداث هذه الإنزيمات المشفرة بالبلازميد. اكتسبت السلالة H103 المحتوية على البلازميد القدرة على النمو على ثنائي السكريات ميليبيوز ورافينوز (الشكل 1) ، في حين أن السلالة H103 التي تفتقر إلى البلازميد (الشكل 1) أو السلالة H103 المحتوية على ناقل pNM185 (البيانات غير معروضة) لم تفعل ذلك. في المقابل ، لم يؤثر البلازميد pFB71 على النمو في الغلوكونات (الشكل 1). تمشيا مع هذه الملاحظات ، سلالة H103 (pFB71) التي تنمو على رافينوز أو ميليبيوز في وجود 5 ملي مولار تولوات ، كمحفز ، أنتجت مستويات عالية من كل من هيدرولاز السكروز و a-galactosidase (الجدول 1). إن اكتساب قدرة H103 (pFB71) على النمو على الميلبيوز والرافينوز يعني ضمناً أن كل من السكريات الثنائية والتريسكاريد يمكن أن تمر عبر الغشاء الخارجي ، لأن الإدخال في pFB71 يحتوي فقط على نفاذية غشاء داخلي واثنين من الإنزيمات السيتوبلازمية. تمشيا مع هذا التفسير ، لم نتمكن من تحديد أي أنشطة إنزيمية في طليعة الخلية. علاوة على ذلك ، عند تركيزات ثابتة من السكريات (50 ملي مولار) ، سلالة H103 (pFB71) الجدول 2. النمو Km على مصادر الكربون المختلفة لمصدر سلالات E. coli و P. aeruginosa

غلوكونات ميليبيوز رافينوز

نما بشكل أسرع على الميليبيوز ثنائي السكاريد مقارنةً بالرافينوز ثلاثي السكاريد (الشكل 1) ، وهو اكتشاف تم تفسيره على أنه ناتج جزئيًا عن أحجام هذه السكريات بالنسبة إلى أحجام قنوات بورين في الغشاء الخارجي. لاختبار دور OprF في نقل السكر ، تم إدخال البلازميد pFB71 في سلالة H636 ، وهي عبارة عن طفرة إدخال Qt تعاني من نقص OprF في سلالة H103. H636 (pFB71) ، الذي نما في وجود 5 ملي مولار تولوات كمحفز ، أعرب عن مستويات هيدرولاز السكروز و a-galactosidase التي لا يمكن تمييزها عن تلك الموجودة في سلالة H103 (pFB71) (الجدول 1). نمت السلالة H636 (pFB71) بنفس معدل سلالة H103 (pFB71) على وسط غلوكونات ضئيل على مدى 50 ضعفًا من تركيزات الغلوكونات (انظر الشكل 3). هذا يشير إلى أن البورنات الأخرى غير OprF كانت سائدة في مرور الغلوكونات عبر الغشاء الخارجي. في المقابل ، نما H636 (pFB71) بشكل أبطأ من H103 (pFB71) على كل من رافينوز (الشكل 2 و 3) والميليبيوز (الشكل 3). في تركيزات الحد من معدل النمو ، كان معدل نمو متحولة OprF 20 ٪ فقط (للرافينوز) إلى 33 ٪ (للمليبيوز) من السلالة الأم المحتوية على OprF ، و

كم النمو. المعرّف في المرجع 20 ، هو تركيز مصدر الكربون الذي أدى إلى معدل نمو أقصى قدره 50٪ ، مأخوذ من نتائج مثل تلك الموضحة في الشكل 3. ب بسبب التأثير السام على نمو P. aenrginosa لتركيزات رافينوز> 200 مم ، لم يكن من الممكن تحديد معدل النمو بدقة في هذه الحالة ، حيث لم تتوفر سوى ثلاث نقاط مرجعية (الشكل 3).

الوقت (ساعات) FIG. 1. نمو P. الزنجارية H103 مع (خطوط صلبة) أو بدون (خطوط مكسورة) استخدام رافينوز بلازميد pFB71. ركائز النمو (عند 50 ملي مولار) كانت غلوكونات (دوائر) ، ميليبيوز (مثلثات) ، ورافينوز (مربعات).

PSEUDOMONAS AERUGINOSA PORIN

0.1 R_Q) 0 20 40 60 80100120140

الوقت (ساعات) FIG. 2. نمو السلالة H103 (pFB71) (الخط الصلب) و oprF :: fl mutant H636 (pFB71) (الخط المكسور) على 100 ملي رافينوز.

كانت هذه الفروق ذات دلالة إحصائية (P 3MB Sizes 0 Downloads 0 Views


مجالات موضوع ASJC Scopus

  • APA
  • مؤلف
  • BIBTEX
  • هارفارد
  • اساسي
  • RIS
  • فانكوفر

في: مجلة علم الجراثيم ، المجلد. 136 ، رقم 1 ، 01/12/1978 ، ص. 381-390.

مخرجات البحث: المساهمة في المجلة ›المقال› مراجعة الأقران

T1 - الأغشية الخارجية للبكتيريا سالبة الجرام. التاسع عشر. العزلة عن Pseudomonas aeruginosa PAO1 واستخدامها في إعادة تشكيل وتحديد حاجز النفاذية

N2 - تم ابتكار طريقة لفصل الأغشية الخارجية والداخلية لـ P. aeruginosa PAO1 في غياب إضافة حمض إيثيلين أمينيتتراسيتيك. تنتج الطريقة جزأين خارجيين من الغشاء يظهران نفس نمط البروتين على هلام الصوديوم دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد الكهربائي ، لكنهما يختلفان بشكل كبير في محتوياتهما النسبية من الدهون الفسفورية. أحد كسور الغشاء الخارجي وجزء الغشاء الداخلي أقل من 4٪ ملوث تبادليًا ، كما يتضح من محتوى علامات الغشاء الداخلي والخارجي النموذجية. يحتوي الغشاء الخارجي على أربعة نطاقات بروتينية رئيسية بأوزان جزيئية واضحة تبلغ 37000 و 35000 و 21000 و 17000. كانت الحويصلات المعاد تكوينها من عديدات السكاريد الدهنية والفوسفوليبيد غير منفذة لجميع السكريات الموجودة في الحويصلات أثناء تكوين الحويصلة. عندما احتوت الحويصلات على بروتينات غشائية خارجية ، احتفظت تمامًا فقط بتلك السكريات التي يزيد وزنها الجزيئي عن 9000 ، مما يشير إلى أن حد استبعاد الغشاء الخارجي للسكريات الزنجارية أكبر بكثير من الشكل (500 إلى 600 دالتون) الذي تم الحصول عليه من أجل بعض البكتيريا المعوية. تمت مناقشة المزايا والعيوب المحتملة لامتلاك غشاء خارجي مع حد أعلى من الاستبعاد للمواد المحبة للماء.

AB - تم ابتكار طريقة لفصل الأغشية الخارجية والداخلية لـ P. aeruginosa PAO1 في غياب إضافة حمض إيثيلين أمينيتتراسيتيك. تنتج الطريقة جزأين خارجيين من الغشاء يظهران نفس نمط البروتين على هلام الصوديوم دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد الكهربائي ، لكنهما يختلفان بشكل كبير في محتوياتهما النسبية من الدهون الفسفورية. أحد هذه الكسور الغشائية الخارجية وجزء الغشاء الداخلي أقل من 4٪ ملوث تبادليًا ، كما يُحكم عليه من خلال محتوى علامات الغشاء الداخلي والخارجي النموذجية. يحتوي الغشاء الخارجي على أربعة نطاقات بروتينية رئيسية بأوزان جزيئية واضحة تبلغ 37000 و 35000 و 21000 و 17000. كانت الحويصلات المعاد تكوينها من عديدات السكاريد الدهنية والفوسفوليبيد غير منفذة لجميع السكريات الموجودة في الحويصلات أثناء تكوين الحويصلة. عندما احتوت الحويصلات على بروتينات غشائية خارجية ، احتفظت تمامًا فقط بتلك السكريات التي يزيد وزنها الجزيئي عن 9000 ، مما يشير إلى أن حد استبعاد الغشاء الخارجي للسكريات الزنجارية أكبر بكثير من الشكل (500 إلى 600 دالتون) الذي تم الحصول عليه من أجل بعض البكتيريا المعوية. تمت مناقشة المزايا والعيوب المحتملة لامتلاك غشاء خارجي مع حد أعلى من الاستبعاد للمواد المحبة للماء.


مناقشة

الجزء الأكثر إثارة للاهتمام في بنية CymA هو الطرف N ، والذي يشكل عنصرًا متحركًا يمكنه التحرك داخل وخارج قناة التجويف. ما هو دور الطرف N ، بالنظر إلى أن بياناتنا تشير إلى أنه يمكن الاستغناء عنها لربط الركيزة (الشكل 6)؟ من خلال تقييد القناة ، من المحتمل أن تحافظ بقايا N-terminal 15 على نفاذية OM ، والتي قد يتم اختراقها بخلاف ذلك. تم العثور على عناصر الانقباض المكونة من حلقات خارج الخلية التي تطوي إلى الداخل لتقليل القطر الفعال للبرميل في قنوات OM المكونة من 16 أو أكثر من خيوط مثل OmpF (الشكل S1) (1). تميل هذه الحلقات إلى أن تكون مستقرة جدًا لأنها تقوم بالعديد من التفاعلات مع الأسطح الداخلية للبرميل أو مع الحلقات الأخرى. في حالة CymA ، يتم إدخال مقطع قصير نسبيًا (الطرف N) في القناة من الجانب المحيطي ويتفاعل مع جدار البرميل. لاكتساب نظرة ثاقبة لطاقة هذا التفاعل ، أجرينا إمكانات أحادية البعد لحساب القوة المتوسطة للنهاية N في CymA من النوع البري باستخدام metadynamics (14). تظهر النتيجة أن موضع الطرف N في البلورة يتوافق مع الحد الأدنى من الطاقة الحرة (الشكل S8). علاوة على ذلك ، فإن حركة الطرف N إلى الفضاء المحيط بالبلازما تتطلب اجتياز العديد من حواجز الطاقة. وبالتالي ، لإنشاء قناة مفتوحة ، يجب إزعاج تفاعلات الطرف N مع البرميل. بالنظر إلى حقيقة أن عددًا محدودًا فقط من المخلفات الطرفية N تتفاعل مع جدار البرميل (الشكل 3ب) ، نقترح أن تحرك ركيزة القرص المضغوط التي تتحرك لأسفل من موقع الدخول يمكن أن توفر القوة الدافعة لفتح القناة ، ربما عن طريق إشراك المخلفات الحمضية لجدار القناة التي تتفاعل مع البقايا المهمة Arg5 (الشكل 8). لذلك يمكن اعتبار CymA قناة انتشار OM ذات بوابات ليجند. ستكون هناك حاجة إلى تجارب مستقبلية ومحاكاة ديناميكية جزيئية أكثر تفصيلاً للحصول على نظرة ثاقبة لآلية إزاحة الطرف N بواسطة الأقراص المدمجة وما إذا كان بإمكان الجزيئات الأخرى فتح القناة.

نموذج تخطيطي لنقل السيكلودكسترين بواسطة CymA. (أنا) يقع الطرف N لـ CymA (أرجواني) داخل تجويف البرميل. يتفاعل Arg5 في الطرف N (+) مع مجموعات الكربوكسيل من بقايا حمض الجلوتاميك (-) في جدار القناة. (ثانيا) بعد التقاط الركيزة من موقع الدخول ، يدور جزيء القرص المضغوط لخفض تقاربها للقناة وينتشر أكثر. يتم طرد الطرف N من البرميل بسبب اضطراب تفاعلات الطرف N مع جدار البرميل. (ثالثا) عند طرد الطرف N ، ينتشر جزيء CD في الفضاء المحيط بالبلازما.

ملفات تعريف الطاقة المجانية أحادية البعد (PMF) الخاصة بالمحطة N على طول محور القناة المحددة باستخدام metadynamics جيدة التقسية (14) المطبقة في PLUMED 2 (30). يتم تعريف مسافة إحداثيات التفاعل على أنها فرق COM (مركز الكتلة) بين الطرف N (Cα ذرات المخلفات 1-13) والبرميل (C.α ذرات المخلفات 26-324) على طول محور القناة. يتم عرض ثلاث لقطات تمثيلية من البروتين ، بما في ذلك الحالة المتبلورة للنهاية N المقابلة لأدنى حالة طاقة.

تم تحديد قنوات انتشار OM التي تسمح بتغلغل جزيئات أكبر من حد استبعاد حجم OM سابقًا. ومع ذلك ، في جميع الحالات ، تحتوي الركائز على هياكل تسمح لها بالمرور عبر القناة بطريقة خطية ، على سبيل المثال ، ممر سكاريد مالتوليغو. بكتريا قولونية لامب (11). تُظهر دراستنا الآن أن الجزيئات الضخمة مثل الأقراص المضغوطة يمكنها أيضًا دخول الخلايا بكفاءة من خلال قنوات انتشار OM. ثم يطرح هذا السؤال عن سبب إنفاق الخلايا للطاقة المشتقة من PMF لأخذ ركائز ضخمة عبر ناقلات تعتمد على TonB. كما يوضح CymA ، فإن حجم الركيزة ليس هو العامل الحاسم الذي يستلزم النقل النشط. بدلاً من ذلك ، من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى ربط الركيزة بإحكام شديد لأنها نادرة و / أو قيمة. مطلوب مدخلات الطاقة الخارجية لتوليد التغييرات المطابقة الكبيرة اللازمة لإطلاق الركيزة. في حالة TBDTs ، يقترن إطلاق الركيزة بتشكيل قناة عابرة في الفضاء المحيط بالبلازما. على النقيض من ذلك ، من المحتمل أن يتم إزاحة مجال انقباض N-terminal المحمول لـ CymA بواسطة الركيزة الواردة ، مما يوفر طريقة أنيقة للخلايا لتتناول ركائز ضخمة دون المساس بحاجز نفاذية OM.


الاستنتاجات

باختصار ، يمكن القول أن الصورة بالأبيض والأسود لمسام الغشاء الخارجي - من البكتيريا إلى الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء - كما هو الحال عمومًا ، يجب ملء مسام الانتشار غير الانتقائية المفتوحة بالألوان: تحتفظ الأغشية الخارجية بإمكانية التحكم الخشن في عملية التمثيل الغذائي من خلال وجود بروتينات محددة منظمة لتشكيل القنوات. بالرغم ان في المختبر التجارب على تأثير تغيرات الجهد مفيدة في دراسة القنوات الأيونية ، مثل هذه الأنظمة المعاد تشكيلها تقدم تبسيطًا مفرطًا لما يحدث بالفعل في الخلية. لكن، في الجسم الحي يبدو أن المواد المذابة والمستقلبات والعوامل البروتينية هي المسؤولة عن بوابات القناة - إيذانا ببدء أو كبح المواد المذابة عن طريق الضغط على زر الاتصال بالبوابة. يظهر نموذج عملي للنقل عبر الأغشية الخارجية في الشكل 1.


أساليب

زراعة الخلايا

موس العضلات نمت خلايا سرطان الغدة الثديية (4 T1) عند 37 درجة مئوية 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون ، في وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المكملة بـ 10 ٪ حجم / حجم من مصل الأبقار الجنينية ، و 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (ثيرموفيشر). تم حصاد الخلايا باستخدام 0.5 مل / 10 سم 2 التربسين بالطرد المركزي عند 180 × جم ، وغسلها بمحلول ملحي الفوسفات (PBS) ، وتم عدها باستخدام NucleoCounter® NC-100 ™ (مقياس كيميائي ، كوبنهاغن) باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تم تثبيت الخلايا في 40 مل من 4٪ وزن / حجم من الفورمالين المخزن لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة (RT).

ظروف النمو البكتيرية

الإشريكية. القولونية تمت زراعة K12 MG1655 الذي يحمل بلازميد P16Lux [39] هوائيًا عند 37 درجة مئوية إلى OD600 من 0.8 في وسط Luria-Bertani (LB) مع 300 ميكروغرام / مل من الإريثروميسين ويتم حصاده بالطرد المركزي عند 3000 xg ، لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، معلق إلى 2X تركيز في 4٪ وزن / حجم الفورمالين المخزن لمدة 24 ساعة عند RT.

عد الخلايا البكتيرية الثابتة

تم حساب معلقات الخلايا البكتيرية باتباع تعليمات مجموعة العد البكتيري (Invitrogen). In brief, after fixation, a 10% aliquot was taken from this suspension and serially diluted (100X) with filtered sterilised 0.15 M NaCl solution to obtain a cell density of approximately 1 × 10 6 cells in 989 μl of NaCl. Bacterial cells were stained with 1 μl of Syto® BC and 10 μl (1X 10 6 ) of counting beads were added to the suspension. Cells were counted in an LSR II Flow Cytometer (BD Biosciences, NJ, USA). The acquisition trigger was set to side scatter and set to 800.

Membrane permeabilisation assay

After fixation, 8 × 10 7 4 T1 cells were harvested at 180 x g for 10 min, washed once with 20 ml of Tris Buffer Saline (TBS) (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6), and suspended to a final density of 2.5 × 10 6 cells per ml in TBS. Similarly, 5 × 10 9 بكتريا قولونية cells, were harvested at 300 x g for 10 min, washed once with 20 ml of TBS and suspended to a final density of 2.5 × 10 7 cell per ml in TBS. 500 μl of the cell suspensions were aliquoted into 1.5 ml tubes and treated with a permeabilisation agent. Permeabilisation agents tested were: Triton X-100 (0.1% v/v), Tween-20 (0.2% v/v), Saponin (from Quillaia bark) (0.1% w/v) (S4521), Digitonin (D141) (0.5% w/v). All were acquired from Sigma-Aldrich. Concentrations used were derived from several protocols [6].

The cells were permeabilised for 25 min, at 25 °C, shaking at 500 rpm. Permeabilised cells were washed once with TBS (centrifugation speeds as above) and blocked on ice with TBS + 1% w/v Bovine Serum Albumin (BSA) for 30 min. Blocked cells were exposed to 0.75 μg of Cyanine-5 (Cy5) or Phycoerythrin (PE) labelled Streptavidin (SAv-Cy5, MW = 60 KDa or SAv-PE, MW = 360 KDa) (Biolegend, CA, USA) for 30 min at 25 °C, shaking at 280 rpm. Cells were washed with 1 ml of 0.15 M NaCl solution and resuspended in 350 μl of the same solution for analysis. Bacterial cells were also labelled with 1 μl of Syto® BC (Invitrogen) for 5 min and analysed by flow cytometry in a BD LSRII. 4 T1 cells were identified and gated based on their Forward/Side scatter and بكتريا قولونية cells were detected using the 488–1 (Fluorescein isothiocyanate - FITC), 525/50 filter for Syto® BC and gated using the side scatter. Cy5 positive cells were detected with the red 670/14 filter. PE positive cells were detected with the yellow/green 780/60 filter. For each experimental replicate, 3 × 10,000 events were recorded for 4 T1 cells and 3 × 100,000 for bacteria.

DNase screening

A screen to identify the DNase with the highest DNA depleting activity in a reaction buffer containing Qb-Saponin was performed. DNases tested were as follows: Recombinant DNase I [1-2 U, 1 μl] (Sigma-Aldrich), Turbo DNase [2 U, 1 μl] (Thermo-Fisher), Molysis DNase [2 μl] (Molzyme GmbH & Co, Bremen, Germany), RQ1 DNase [20 U, 20 μl] (Promega), Benzonase [75 U, 0.3 μl] (Sigma-Aldrich). 5 × 10 6 4 T1 cells, FF for 48 h were treated with 0.2% w/v Qb-Saponin and the DNases tested. Reactions were set in reaction buffers provided or suggested by the supplier for 20 min at 37 °C. The reaction was stopped by either: the addition of Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) for Benzonase, the supplied reaction Stop Buffer, or by incubating at 75 °C (DNAse I). Cells were then subject to DNA purification with the QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). DNA yield was measured with Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen). All reactions were performed in triplicate. A no-DNAse control was included. This was incubated under the same conditions with buffer supplied for DNAse I, but without the nuclease.

Quillaja bark Saponin titration

Different w/v concentrations (0.1, 0.25, 0.5, 1%) were tested in 1 × 10 6 E. coli cells that were fixed, washed, permeabilised, blocked and imaged as described for membrane permeabilisation assay.

DNA depletion assay

Cells were fixed, washed and permeabilised as described for the membrane permeabilisation assay. 2.5 × 10 5 4 T1 or 2.5 × 10 6 بكتريا قولونية cells were permeabilised, blocked with 500 μl of 1% w/v BSA in TBS+ MgCl2 (20 mM Tris-HCL, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, pH 8) for 30 min on ice. Blocked cells were treated with 1.5 μl (≥ 375 units) of Benzonase nuclease (Sigma-Aldrich) for 30 min at 37 °C, shaking at 360 rpm. Treatment was stopped by the addition of 100 mM EDTA. The cells were washed once with TBS and suspended in 0.15 M NaCl, where they were stained with 10 μM CytoPhase Violet (Biolegend) for 1 h at RT, shaking at 200 rpm in the dark. Bacterial cells were labelled with 100 μM of BacLight red (Invitrogen) for 15 min at RT, shaking at 200 rpm and analysed by flow cytometry. 4 T1 cells were identified and gated based on their Forward/Side scatter and بكتريا قولونية cells were detected using the 561 laser (Yellow/Green) 660/20 filter for BacLight red and gated using the side scatter. CytoPhase+ cells were detected with the 355 (UV) laser and 450/50 filter.

Confirmation of host depletion (HD) strategy

The efficacy of the combined treatment was verified by qPCR in DNA purified from a mixed cell suspension, consisting of 1 × 10 7 بكتريا قولونية cells and 1 × 10 4 4 T1 cells. Cells were incubated for 30 min at 37 °C, shaking at 360 rpm in TBS or the optimised HD buffer (0.2%w/v Qb-saponin, in TBS + MgCl2 (20 mM Tris-HCL, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2), pH 8) with or without 500 U of Benzonase. The treated cells were then processed for DNA purification following instructions of the QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN) and the purified DNA analysed by qPCR.

Quantitative PCR (qPCR)

Reactions were prepared using LUNA Universal qPCR master mix (NEB, USA) and 0.25 μM of each primer (Table 1). The thermal profile included an initial denaturation of 1 min at 95 °C, followed by 40 cycles of denaturation at 95 °C × 10 s, annealing for 15 s at the temperature specified by NEB’s annealing temperature (Ta) calculator for Hot Start Taq, followed by 20–40 s of extension at 68 °C. For each assay, a 5-point standard curve was made from log10 dilutions of gene blocks corresponding to species-specific genetic regions (Table 1), using an initial concentration of 10 7 copies. Primers and gene-blocks were acquired from IDT (Coralville, USA). Efficiency between 95 and 105% and R-square values > 0.995 were deemed as acceptable. All samples were run in triplicate.

Statistical analyses

Flow cytometry data was exported and analysed in FlowJo (BD, UK) and raw data exported to R. All statistical testing and visualisation were performed in the R environment (v3.6.3). Tests of normality were performed using the Shapiro-Wilk test. Tests of means were performed using paired samples T-Tests and Wilcoxon Signed Rank Tests as appropriate. The false discovery rate was controlled using the Bonferroni procedure. Data visualisation was performed using GGplot2 package (v3.2.1).


Structural basis for maintenance of bacterial outer membrane lipid asymmetry

The Gram-negative bacterial outer membrane (OM) is a unique bilayer that forms an efficient permeation barrier to protect the cell from noxious compounds 1 , 2 . The defining characteristic of the OM is lipid asymmetry, with phospholipids comprising the inner leaflet and lipopolysaccharides comprising the outer leaflet 1,2,3 . This asymmetry is maintained by the Mla pathway, a six-component system that is widespread in Gram-negative bacteria and is thought to mediate retrograde transport of misplaced phospholipids from the outer leaflet of the OM to the cytoplasmic membrane 4 . The OM lipoprotein MlaA performs the first step in this process via an unknown mechanism that does not require external energy input. Here we show, using X-ray crystallography, molecular dynamics simulations and in vitro and in vivo functional assays, that MlaA is a monomeric α-helical OM protein that functions as a phospholipid translocation channel, forming a

20-Å-thick doughnut embedded in the inner leaflet of the OM with a central, amphipathic pore. This architecture prevents access of inner leaflet phospholipids to the pore, but allows outer leaflet phospholipids to bind to a pronounced ridge surrounding the channel, followed by diffusion towards the periplasmic space. Enterobacterial MlaA proteins form stable complexes with OmpF/C 5,6 , but the porins do not appear to play an active role in phospholipid transport. MlaA represents a lipid transport protein that selectively removes outer leaflet phospholipids to help maintain the essential barrier function of the bacterial OM.

Three systems are known to maintain OM lipid asymmetry: the OM phospholipase A2 PldA 7 , the lipopolysaccharide (LPS) palmitoyl transferase PagP 8 and the Mla (maintenance of outer membrane lipid asymmetry) system. Only the Mla system maintains asymmetry directly via phospholipid extraction, while PldA and PagP both generate lysophospholipids in the outer leaflet that still require removal. The Mla system is conserved in Gram-negative bacteria and plant chloroplasts 9,10 , consisting of the inner membrane (IM) ABC transporter MlaBDEF, the periplasmic protein MlaC and the OM lipoprotein MlaA 4,6,11 . Phenotypes from defects in the Mla system are mild under laboratory conditions and require small-molecule OM stressors such as SDS/EDTA or antibiotics 4,5,6,11 . However, MlaA has been identified as a virulence factor in various bacteria 12,13,14,15 . In addition, the Mla system was recently shown to regulate outer membrane vesicle formation 16 . The deleterious effects of Mla knockouts probably result from phospholipid accumulation in the OM outer leaflet, forming bilayer patches that are portals for entry of lipophilic small molecules 17 . So far, structural information on Mla components is available only for MlaC and MlaD 5 . MlaC probably accepts a phospholipid from MlaA and shuttles it to the ABC transporter for ATP-dependent plasma membrane insertion 5 . MlaA is the most enigmatic Mla component, particularly since its identity as a periplasmically exposed lipoprotein appears hard to reconcile with its proposed activity on outer leaflet phospholipids.


Specific callose enzymes modulate plasmodesmal callose levels

Key genes that regulate callose levels specifically at plasmodesmata include members of the A. thaliana β-1,3-glucanase, AtBG_ppap (Levy et al., 2007) and PdBGs، وكذلك A. thaliana callose synthase (CalS) family, encoded by CalS10/GSL8/CHORUS, CalS3/GSL12, CalS1/GSL6 أو CalS8/GSL4. الطفرات في PdBG1 أو PdBG2 genes increase callose accumulation and perturb normal lateral root formation (Benitez-Alfonso et al., 2013). في cals10 mutants, callose deposition at the cell plate is abolished, causing seedling lethality and pleiotropic phenotypes that range from defects in cell division and guard cell patterning, to alterations in phototropic response and plasmodesmal permeability (Guseman et al., 2010 Han et al., 2014). Gain-of-function mutations in CalS3 increase callose levels and alter root development (Vatén et al., 2011). Mutations in CalS1 abolish the hyperaccumulation of callose induced by salicylic acid or pathogenic bacterial infection, while those in CalS8 eliminate the callose deposition induced by mechanical wounding or reactive oxygen species. بالإضافة إلى، cals8 mutants show an increase in basal plasmodesmal permeability compared to that found in wild-type plants (Cui and Lee, 2016). These data, together with the observations on additional proteins that are found at plasmodesmata (see below, Box 2 and poster), suggest that a network of callose-regulating factors control the permeability of plasmodesmal channels.

Receptor-like protein kinases that are important for controlling growth and developmental processes are partially associated with plasmodesmata (see poster). For example, the receptor-like kinase STRUBBELIG (SUB) and C2-domain-containing receptor-like protein QUIRKY (QKY) interact at plasmodesmata, which is thought to promote movement of unidentified intercellular factors needed for tissue morphogenesis (Vaddepalli et al., 2014). Similarly, the receptor kinases ARABIDOPSIS CRINKLY 4 (ACR4) and CLAVATA 1 (CLV1) interact at plasmodesmata in the root meristem to restrict root meristematic activity to only a few designated cells (Stahl et al., 2013).

A number of transcription factors move from cell to cell through plasmodesmata, including those that play important roles in cell type specification (see poster). KNOTTED 1 (KN1) moves from inner shoot apical meristem (SAM) tissue layers into overlying layers to establish meristematic cell identity and maintain the stemness of this tissue (Kim et al., 2002). LEAFY moves from the outermost SAM layer into inner layers to control the differentiation of vegetative cells into floral meristem cells (Sessions et al., 2000). WUSCHEL (WUS) moves from the SAM-organizing center into the central zone, where it maintains stem cell fate and number (Yadav et al., 2011). CAPRICE (CPC) is expressed in all non-hair root epidermal cells, but moves into the cells that will become root hairs to promote their differentiation (Kurata et al., 2005). SHORT ROOT (SHR) moves from root stele into neighboring endodermal cells to promote differentiation of the ground tissues (Nakajima et al., 2001). Signaling molecules that move through plasmodesmata also include those involved in defense signal propagation (see poster). For example, the lipid transfer protein AZELAIC ACID INDUCED 1 (AZI1) not only interacts with the plasmodesmal regulators PDLP5 and PDLP1, but also triggers systemic acquired resistance (SAR) in response to pathogen exposure. This in turn leads to symplasmic transport of the SAR signaling molecules azelaic acid (AzA) and glycerol-3-phosphate (G3P) (Lim et al., 2016). Another lipid transfer protein, DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1 (DIR1), has been found to move symplasmically into systemic tissue (Champigny et al., 2013). Taken together, these factors exemplify the variety of cellular signaling events that employ plasmodesmal communication.


Transport Across the Membrane

جميع المواد التي تتحرك عبر الغشاء تفعل ذلك بإحدى طريقتين عامتين ، يتم تصنيفهما بناءً على ما إذا كانت الطاقة مطلوبة أم لا. Passive (non-energy requiring) transport is the movement of substances across the membrane without the expenditure of cellular energy. During this type of transport, materials move by simple diffusion or by facilitated diffusion through the membrane, down their concentration gradient. يمر الماء عبر الغشاء في عملية انتشار تسمى التناضح. Osmosis is the diffusion of water through a semi-permeable membrane down its concentration gradient. It occurs when there is an imbalance of solutes outside of a cell versus inside the cell. The solution that has the higher concentration of solutes is said to be hypertonic and the solution that has the lower concentration of solutes is said to be hypotonic. Water molecules will diffuse out of the hypotonic solution and into the hypertonic solution (unless acted upon by hydrostatic forces).

الشكل ( PageIndex <1> ): التنافذ: Osmosis is the diffusion of water through a semipermeable membrane down its concentration gradient. إذا كان الغشاء منفذاً للماء ، وإن لم يكن مذابًا ، فإن الماء سيعادل تركيزه عن طريق الانتشار إلى جانب تركيز الماء المنخفض (وبالتالي جانب تركيز الذائبة الأعلى). في الدورق الموجود على اليسار ، يكون المحلول الموجود على الجانب الأيمن من الغشاء مفرط التوتر.

In contrast to passive transport, active (energy-requiring) transport is the movement of substances across the membrane using energy from adenosine triphosphate (ATP). The energy is expended to assist material movement across the membrane in a direction against their concentration gradient. قد يحدث النقل النشط بمساعدة مضخات البروتين أو من خلال استخدام الحويصلات. Another form of this type of transport is endocytosis, where a cell envelopes extracellular materials using its cell membrane. The opposite process is known as exocytosis. This is where a cell exports material using vesicular transport.


شاهد الفيديو: Inside the Cell Membrane (شهر نوفمبر 2022).