معلومة

نوع مختلف من التمهيدي M13

نوع مختلف من التمهيدي M13


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أبحث عن مواد أولية عالمية M13. لقد وجدت نسخة مختلفة. على سبيل المثال :

  • M13 (-21) إلى الأمام TGTAAAACGACGGCCAGT
  • M13 (-40) جتتكككاجتكاكجاك

ما معنى (-21) و (-40)


يعود هذا إلى الثمانينيات عندما تم استنساخ هذه المواد الأولية M13 لأول مرة.

Heidecker G، Messing J، Gronenborn B. 1980. أساس متعدد الاستخدامات لتسلسل الحمض النووي في نظام الاستنساخ M13mp2. الجين 10 (1): 69-73.

في هذه الورقة ، ناقشوا بناء التمهيدي لتسلسل متجه الملتهمة M13mp2. يحرر EcoRI / AluI Digest جزءًا من 92 نقطة أساس من جزء من أوبرون اللاكتات. يحتوي هذا الجزء على ما يسمى الآن M13 forward -21 و -40 الاشعال. لا أعرف من أطلق لأول مرة على هذه البادئات ، لكن ، بالعد من مركز متناظر EcoRI ، أعتقد أنه من الواضح من أين جاءت هذه الأسماء:


نوع مختلف من التمهيدي M13 - علم الأحياء

ملخص المقال:

يتم تعريف الطفرات على أنها التغيير في المعلومات الجينية للكائن الحي بطريقة مستقرة عن طريق استخدام المطفرات الفيزيائية والكيميائية. تم تطويره بواسطة شارلوت أورباخ. كانت أول عالمة تدرس تأثير المطفرات الكيميائية.

تم استخدام هذا على الفور كأداة وراثية للحث على الطفرات بطرق محددة والتي يمكن استخدامها بدورها لتحديد النمط الظاهري للكائن الحي ، ووظيفة الجينات وحتى النيوكليوتيدات.

هناك أنواع مختلفة من الطفرات مثل

3. الطفرات الإدراجية
& الثور التوقيع الموسومة Mutageneis
& الثور فيروس الطفرات الإدراج

4. الطفرات PCR
والطفرات الموجهة من موقع الثور
& الثور الطفرات غير متطابقة
والثور 5 'إضافة على الطفرات
& الثور الكاسيت الطفرات

1. الطفرات الموجهة

يتم تعريف الطفرات الموجهة بأنها التغيير في ترميز الأحماض الأمينية على مستوى الحمض النووي. تساعد البنية ثلاثية الأبعاد المميزة للبروتين باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية والإجراءات التحليلية الأخرى في تحديد الأحماض الأمينية للبروتين التي يجب تغييرها لتحقيق خاصية معينة. ومع ذلك ، قد لا يكون هذا ممكنًا بالنسبة لمعظم البروتينات ، وبالتالي يتم استخدام استراتيجية التجربة والخطأ لإجراء تغييرات في النيوكليوتيدات لإحداث تغيير معين في البروتين. ثم يتم اختبار البروتين المشفر لمعرفة التغيير المطلوب في البروتين.

الأنواع المختلفة من الطفرات الموجهة هي:

أ. قليل النوكليوتيد الموجه الطفرات مع الحمض النووي M13

ب. يوجه قليل النوكليوتيد الطفرات باستخدام DNA البلازميد.

ج. PCR تضخيم قليل النوكليوتيد الموجه للطفرات

مزايا :
- معدلات الطفرات عالية
- يمكن إحداث جميع الطفرات
- يمكن إجراء تحقيق منهجي ومفصل للطفرة المستهدفة.

تُعرف الطفرات العشوائية أيضًا بالتطور الموجه أو التكاثر الجزيئي. في هذا الجين لا يتغير على وجه التحديد عند مستوى واحد أو أكثر من مستويات الكودون لإنتاج مزيج من الجينات الطافرة والتي بدورها يمكن تحديدها وفحصها بحثًا عن الجينات ذات النشاط التحفيزي المرغوب. التمهيدي قليل النوكليوتيد عبارة عن مجموعة غير متجانسة من متواليات الحمض النووي لإنتاج سلسلة من الطفرات في الجزء المحدد من الجين المستهدف.

المزايا: دور الأحماض الأمينية في عمل البروتين غير مطلوب.
نظرًا لإنتاج مجموعة من المسوخ في هذه العملية ، فقد يتم إنشاء بعض البروتينات المفيدة والمفيدة

3. الطفرات المغزلية:

يتم إنتاج الطفرات الإدراجية عن طريق إدخال قاعدة واحدة أو أكثر ويمكن إنتاجها
1. الطريقة الطبيعية
2. بوساطة فيروس أو ترانسبوسون (علامة مميزة للطفرات) أو
3. بشكل مصطنع في المختبر لغرض البحث

أ. الطفرات المميزة المميزة: يستخدم لدراسة وظيفة الجينات باستخدام الينقولات. يتم إجراء الينقولات مثل Drosophila melanogaster P -Element للتكامل بشكل عشوائي في جينوم الكائن الحي. يتم بعد ذلك فحص الطفرات بحثًا عن أي نمط ظاهري غير عادي. تم العثور على أي نمط ظاهري من هذا القبيل يشير إلى أن الينقولات قد تسبب في تعطيل النمط الظاهري المرتبط بذلك الجين. نظرًا لأن تسلسل الينقولات معروف ، يمكن تسلسل الجينوم بأكمله لتحديد الجين أو يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الجين المحدد.

ب. طفرات إدخال الفيروس: ينتج عن فيروس مختص بالتكاثر ، يقوم الفيروس بإدخال الجين الورمي الفيروسي بالقرب من جين myc الخلوي الذي يتم إيقاف تشغيله بشكل عام في الخلية وعند تشغيله يدفع الخلية إلى G1 من دورة الخلية مما يسمح حتى للجين الفيروسي بالتكاثر. ينتج بعد عدة تكاثر في موقع الجين الفيروسي. يسبب فيروس ابيضاض الطيور المرض باستخدام الطفرات التدميرية.

مزايا:
- يمكن أن تنتج طفرات يمكن تتبعها بسهولة.
- يمكن أن تنتج عددًا كبيرًا من المسوخ بتكلفة منخفضة وسرعة عالية

تستخدم لتغيير تسلسل النوكليوتيدات للحمض النووي ويمكن استخدام الطريقة لتعديل الأحماض الأمينية لاختبار وظيفة المجالات في البروتين ولتقييم وظيفة المحفز.

الطرق المختلفة لإدخال الطفرات في تفاعل البوليميراز المتسلسل هي:
أ. الطفرات الموجهة من الموقع: كما يوحي الاسم ، فإنها تُحدث طفرة في موقع معين على خيط الحمض النووي. يتم تغيير البادئات المستخدمة في واحد أو أكثر من النيوكليوتيدات.

ب. الطفرات غير المتطابقة: يستخدم مع التركيز على حمض أموني واحد ويفيد في التحقق من الطفرة الخاطئة في جين معروف للمرض أو في تحديد وظيفة حمض أميني معين في البروتين.

ج. يتم إنتاج 5'Add On Mutagenesis عن طريق إضافة تسلسل جديد أو مجموعة كيميائية إلى النهاية 5 لمنتج PCR. يتم إنتاج البادئات بطريقة معينة

- 3 'نهاية التمهيدي تتطابق مع تسلسل منتج PCR.
- 5 'تحتوي على تسلسل الرواية
- موقع تقييد مناسب
- إضافة تسلسل وظيفي (تسلسل المحفز)
- نيوكليوتيد معدل يحتوي على مجموعة مصنفة أو معالجة بيوتين أو فلوروفور

د. طفرات الكاسيت: تُستخدم لإدخال طفرات متعددة في تسلسل الحمض النووي. باستخدام الحمض النووي غير الحاد في موقع الطفرة ، يتم إنشاء تكرار طرفي مباشر مكون من 3 أزواج أساسية. المتحول.

مزايا:
تعتبر الطرق القائمة على PCR مفيدة في دراسة طفرات معينة في الحمض النووي والتي بدورها مفيدة في دراسة الجوانب المختلفة لوظيفة البروتين.

محددات
- يصعب نسخ الحمض النووي المتحول لأن الخلية المختصة التي سيتم استخدامها باهظة الثمن.
- الفحص شاق.
- يتطلب تسلسل لتأكيد الطفرة.
- مطلوب بادئات محددة.

حول المؤلف / معلومات إضافية:

إخلاء مسؤولية هام: جميع المقالات الموجودة على هذا الموقع هي معلومات عامة فقط وليست نصيحة احترافية أو خبراء. لا نتحمل أي مسؤولية عن صحة أو صحة المعلومات الواردة في هذه المقالة ، أو أي خسارة أو إصابة ناتجة عن ذلك. نحن لا نصادق على هذه المقالات ، ولسنا تابعين لمؤلفي هذه المقالات ولسنا مسؤولين عن محتواها. يرجى الاطلاع على قسم إخلاء المسؤولية للحصول على الشروط الكاملة.


رنين البلازمون السطحي: نعمة للتشخيص الفيروسي

SPR على أساس M13 Bacteriophage

تم استخدام Bacteriophage M13 مؤخرًا كمواد نانوية وظيفية في التطبيقات الكهربائية والكيميائية والبصرية نظرًا لخصائصها غير السامة والتجميع الذاتي والربط المحددة. هذه الميزات تجعل عاثية M13 مرشحًا محتملاً كمستقبل لتحويل الإشارات البيوكيميائية والبيولوجية الضوئية إلى إشارة كهربائية أو بصرية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التلاعب بخصائص سطح العاثية M13 عن طريق الهندسة الوراثية. كيم وآخرون. (2016) وصف مستشعر SPR جديد قائم على العاثيات وحساس للغاية وانتقائي. يستخدم هذا المستشعر عاثيات M13 المُجمَّعة ذاتيًا والمُعدلة وراثيًا. يعد التجميع الذاتي مفيدًا على الطباعة الحجرية الضوئية المعقدة أو الاقتران الكيميائي من حيث البساطة. تم تحسين الحساسية بشكل أكبر من خلال دمج مصفوفة موصل المستقبل (جهاز لربط المكونات الإلكترونية باستخدام مصفوفة من الآثار الموصلة المستقلة ولكن القابلة للتوصيل البيني) في اتجاهات محددة لتقليل خطأ القياس (كيم وآخرون., 2016 ).


أساليب

تصميم التمهيدي

يجب أن تستهدف المواد الأولية المطبقة في تحليل محتوى القناة الهضمية للحيوانات المفترسة بشكل مثالي التسلسلات القصيرة من الحمض النووي متعدد النسخ بسبب الطبيعة المتدهورة للتسلسلات المشتقة من الفريسة [13 ، 16 ، 17 ، 36]. لذلك غالبًا ما يستخدم الحمض النووي الريبوزومي كهدف لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في دراسات النظام الغذائي لأن جينات الحمض النووي الريبوزي (rDNA) تتكرر جنبًا إلى جنب بأعداد نسخ عالية ويتم حفظها بدرجة عالية داخل الأنواع [37]. لقد صممنا بادئات PCR `` عالمية '' تضخم منطقة قصيرة ولكنها متغيرة إلى حد ما من 28S rDNA من جميع حقيقيات النوى التي تم اختبارها. لقد صممنا أيضًا ثلاثة مواد أولية مانعة للالتصاق بـ Euphausia superba تضخيم التسلسل بواسطة الاشعال العالمي. يتم إعطاء الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1 وتظهر متماشية مع تسلسل الكريل في الشكل 2.

الاشعال. منطقة 203 نقطة أساس من Euphausia superba يوضح تسلسل 28S موقع مختلف الاشعال المطبقة في هذه الدراسة.

التمهيدي المانع ، 'Short28SR-blkKrill3'c3' متداخل مع الطرف 3 'من التمهيدي العالمي العكسي ، ولكنه امتد إلى تسلسل خاص بالكريل وتم تعديله باستخدام مباعد C3 في الطرف 3' (الشكل 2). لقد احتجنا إلى تعديل تم تصنيعه بنسبة 100٪ (أي لم يكن هناك oligos مفقودًا) وكان مستقرًا (أي لا يوجد تدهور أو إزالة إنزيمية للتعديل بعد التوليف). حتى لو كانت نسبة صغيرة فقط من بادئات الحجب تقوم بتضخيم الحمض النووي للمفترس نتيجة عدم وجود تعديل 3 ، فإن هذا سيجعل الإجراء غير عملي. فاصل C3 (3 هيدروكربونات) CPG هو تعديل تمهيدي قياسي متاح من معظم موردي قليلات النوكليوتيدات المخصصة. إضافة هذا التعديل إلى الطرف 3'من قليل النوكليوتيد يمنع الاستطالة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل دون التأثير بشكل ملحوظ على خصائص التلدين. نظرًا لأنه يتم تصنيع oligos من اتجاه 3 إلى 5 ، سيتم تعديل جميع الجزيئات باستخدام التعديل 3. تعديل 3'- نهاية مع مجموعة الفوسفات (كما اختارها Liles وآخرون. [35]) ، إستر الفوسفات ، أو استخدام رابط 3'-3 'مقلوب من شأنه أيضًا منع الاستطالة. ومع ذلك ، قد تؤدي التفاعلات الجانبية أثناء نزع الحماية من قليل النوكليوتيد أو الشوائب الأنزيمية إلى تحرير مجموعة 3'-hydroxyl إلى حد صغير ، وهذه الطرق ليست فعالة في منع فواصل C3 CPG [38 ، 39].

نظرًا لأن العثور على موقع ربط مناسب لطبقة التمهيدي الخاصة بالأنواع بجوار موقع الربط الخاص بالبادئة الشاملة غالبًا ما يكون أمرًا صعبًا ، فإن التمهيدي الخاص بالكريل ، وهو Short28SF-DPO-blkKrill يتداخل مع النهاية 3 من التمهيدي العالمي الأمامي وله طبقة داخلية تم أيضًا تصميم تعديل خمسة جزيئات deoxyinosine (dI) بالإضافة إلى تعديل فاصل C3 (الشكل 2). غالبًا ما لا تعمل قليل النوكليوتيدات التقليدية الطويلة جدًا. بشكل عام ، نادرًا ما تستخدم البادئات الأطول من 25 قاعدة نظرًا لأن Tms الخاصة بها يمكن أن تزيد عن 70 درجة مئوية ، وهي نسبة عالية جدًا لدورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الفعال [40]. غالبًا ما تولد البادئات الطويلة أيضًا العديد من النطاقات غير المحددة الناتجة عن التلدين غير المحدد. يحتوي قليل النوكليوتيد الأولي المزدوج (DPO) [41] على منطقتين تحضير منفصلتين متصلتين بواسطة رابط بولي ديوكسيينوساين. لا تعاني DPOs من قيود Tm العالية لأن الرابط يفترض بنية تشبه الفقاعة مما ينتج عنه جزأين أوليين بخصائص تلدين مميزة. علاوة على ذلك ، فإن البنية الشبيهة بالفقاعات للرابط تمنع بشكل فعال تكوين بنية دبابيس الشعر التمهيدي [41].

تم تصميم كل من الاشعال الحجب Short28SR-blkKrill3'c3 و Short28SF-DPO-blkKrill لمنع تلدين النسخة غير المعدلة من التمهيدي العالمي على تسلسلات الكريل. علاوة على ذلك ، تم اختبار تمهيدي منع محدد ثالث من الكريل يقع بين اثنين من البادئات العالمية (الشكل 2). كان هذا بمثابة "توقف استطالة" التمهيدي ([42] الشكل 1) وكان به أيضًا فاصل C3 في نهايته 3.

أخذ العينات واستخراج الحمض النووي

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الجيني من عينات محفوظة بالإيثانول من اللافقاريات البحرية في أنتاركتيكا أو أنواع الطحالب المستزرعة (الجدول 2).

تم جمع الكريل خلال رحلتين بحريتين في مياه القطب الجنوبي الشرقية باستخدام RSV أورورا أوستراليس. تمت الرحلة البحرية الأولى خلال فصل الخريف في أستراليا والثانية في أواخر فصل الشتاء في أستراليا (الجدول 2). تم جمع الكريل باستخدام شبكة Midwater Trawl-8 المستطيلة بواسطة جر مزدوج مائل قياسي من السطح حتى 200 متر أو عن طريق السحب المستهدف على أعماق مستهدفة تبلغ 100 متر أو 16-60 مترًا (الجدول 2). تم الحفاظ على سرعة السفينة أثناء السحب الصافي عند 2 عقدة. مباشرة بعد الالتقاط ، تم وضع الكريل في مرطبانات تحتوي على 80٪ من الإيثانول على النحو الموصى به من قبل Passmore et al. [26].

بعد 1-6 أشهر تخزين الكريل معدة (مقدمة) من الكريل المغسول بالإيثانول تم تشريحها تحت مجهر تشريح في أطباق بتري المعقمة باستخدام ملقط معقم باللهب. تم الحرص على عدم اتصال المعدة بأي أجزاء خارجية من الهيكل الخارجي للكريل. تم بعد ذلك شطف المعدة لفترة وجيزة بالإيثانول الطازج ووضعها في أنبوب إيبندورف الخالي من الحمض النووي المعقم ومملوء بمخزن ATL (Qiagen). تم تجانس العينة باستخدام مدقة بلاستيكية معقمة قبل استخلاص الحمض النووي.

تم استخراج جميع الحمض النووي باستخدام مجموعة DNeasy Blood & amp Tissue (Qiagen) باتباع تعليمات الشركة المصنعة للأنسجة الحيوانية وتم تحديد إجمالي إنتاجية الحمض النووي وجودة الاستخراج النهائي (100 ميكرولتر) باستخدام Picofluor 8000-004 (تصاميم تيرنر) والعينات الملطخة بالكمية -iT PicoGreen ds كاشف DNA (مجسات جزيئية).

اختبار البادئات الحاصرة

لتقييم كفاءة الأنواع المختلفة والكميات المختلفة من البادئات الحاصرة ، تم إنشاء مخاليط rDNA الاصطناعية. تم إجراء أول تضخيم PCR على الكريل و بيراميموناس الحمض النووي مع الاشعال 28S rDNA العالمي Short28SF و Short28SR (الجدول 1) مثل تفاعلات 25 ميكرولتر مع 0.25 ميكرولتر من كل قليل (10 ميكرومتر) ، 0.25 ميكرولتر dNTP ، 2.5 ميكرولتر 10 × ، 0.1 ميكرولتر بلاتين طق بوليميراز DNA عالي الدقة (Invitrogen) 5 U. ميكرولتر -1 ، 1 ميكرولتر ملغ 2+ و 5 ميكرولتر DNA (

تم بعد ذلك استنساخ منتجات PCR باستخدام الخلايا المختصة بنظام الاستنساخ TOPO TA (Invitrogen). تم فحص المتحولات باستخدام اختيار أزرق / أبيض على LB-agar المحتوي على X-Gal و 10 مجم. مل -1 أمبيسلين أو كاناميسين. تم اختيار المستعمرات البيضاء أو الزرقاء الفاتحة لعزل البلازميد ، وأعيد احتضانها طوال الليل في وسط LB الذي يحتوي على المضادات الحيوية والبلازميدات ثم تم استخلاصها باستخدام مجموعة استخراج Ultraclean miniplasmid (Mo Bio ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم خطي البلازميدات باستخدام هند إنزيم التقييد III والمحصول الكمي باستخدام Picofluor 8000-004 (تصاميم تيرنر) والعينات الملطخة باستخدام كاشف DNA Quant-iT PicoGreen ds (مجسات جزيئية).

وهكذا تم خلط العينات لاحتواء 100 ضعف وفائض 1000 مرة من rDNAs المستهدفة (krill 28SrDNA) مقارنة مع rDNAs غير المستهدفة (بيراميموناس ص). تم استخدام عينة تحتوي فقط على DNA الكريل كعنصر تحكم.

تم إجراء التضخيم باستخدام الاشعال الحجب كتفاعلات 25 ميكرولتر مع 0.25 ميكرولتر من كل من الاشعال العالمي 28S rDNA Short28SF (10 ميكرومتر) و Short28SR (10 ميكرومتر) ، 0.25 ميكرولتر dNTP ، 2.5 ميكرولتر 10 × ، 0.1 ميكرولتر بلاتين طق بوليميراز DNA عالي الدقة (Invitrogen) 5 U. ميليلتر -1 ، 1 ميكرولتر ملغ 2+ وكمية متغيرة من عرقلة التمهيدي و rDNA. كانت ظروف ركوب الدراجات الحرارية PCR: دقيقتان عند 94 درجة مئوية و 40 دورة من 10 ثوانٍ عند 94 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 59 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 68 درجة مئوية ، وأخيراً 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.

تم تقييم كفاءة الحجب عن طريق تحليل الأجزاء الخاصة بمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات العلامات الفلورية. يفصل تحليل الشظايا مزيجًا من شظايا الحمض النووي وفقًا لأحجامها وهو أكثر حساسية بكثير من الرحلان الكهربائي للهلام القياسي. تم إجراء التحليل على محلل جيني أبلايد سيستمز 3130 xl الكهربائي الشعري (CE) وتم تحليل النتائج باستخدام برنامج Peak Scanner 1.0 (النظم الحيوية التطبيقية).

تضخيم PCR للحمض النووي للفريسة من معدة الكريل

بعد تحديد خليط البادئة الأكثر فاعلية ، تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على عزلات معدة الكريل. تم تحضير PCRs باستخدام معدات ومواد استهلاكية معقمة بالأشعة فوق البنفسجية وتم دائمًا تشغيل عناصر التحكم السلبية (بدون قالب) جنبًا إلى جنب مع العينات. تم إجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل على محرك MJ Research DNA محرك التدرج (مكافئ Chromo 4) وتم إجراء التسلسل على محلل DNA 3730 xl (Applied Biosystems). تم فحص منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام الاغاروز 1.3٪ ملطخ بصبغة هلام DNA SYBR® Safe DNA (Invitrogen). تم قطع الأشرطة المرئية وتنقيتها باستخدام أعمدة الدوران المستخرجة من Bio-Rad Quantum Prep Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction.

تمت إعادة احتضان منتجات PCR بعد ذلك لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية مع حجم تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على 2 ميكرولتر 10 × ، 1 ميكرولتر Mg 2+ ، 0.2 ميكرولتر Biotaq TM DNA Polymerase (Bioline) و 0.2 ميكرولتر dNTP لإضافة 3 أدينينات واستنساخ باستخدام الخلايا المختصة بنظام الاستنساخ TOPO TA (Invitrogen). تم اختيار المحولات من أجل PCR وتم إجراء التضخيم باستخدام الاشعال TOPO_F و TOPO_R مثل تفاعلات 25 ميكرولتر مع 0.25 ميكرولتر من كل oligo (10 ميكرومتر) ، 0.25 ميكرولتر dNTP ، 2.5 ميكرولتر 10 × ، 0.1 ميكرولتر من البلاتين طق بوليميراز DNA عالي الدقة (Invitrogen) 5 U. ميكرولتر -1 و 1 ميكرولتر ملغ 2+. كانت ظروف ركوب الدراجات الحرارية PCR: دقيقتان عند 94 درجة مئوية و 40 دورة من 10 ثوانٍ عند 94 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 65 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 68 درجة مئوية ، وأخيراً 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.

تم إنشاء التسلسلات من منتجات PCR هذه باستخدام التمهيدي الأمامي M13 وتفاعلات التسلسل BigDye Terminator v3.1 (ABI).

تم إجراء التضخيم لتسلسل الأنواع غير المتوفرة في GenBank على أنها تفاعلات 25 ميكرولتر مع 0.25 ميكرولتر من كل من الاشعال العالمي 28S rDNA Short28SseqF و Short28SseqR (10 ميكرومتر) (الجدول 1) المصممة لتغطية مساحة أكبر من الاشعال Short28SF / Short28SR ، بما في ذلك مواقع الربط التمهيدي ، 0.25 ميكرولتر dNTP ، 2.5 ميكرولتر 10 × ، 0.1 ميكرولتر من البلاتين طق بوليميراز DNA عالي الدقة (Invitrogen) 5 U. ميكرولتر -1 و 1 ميكرولتر ملغ 2+. لم يتم تعديل ظروف التدوير الحراري لـ PCR باستثناء زيادة خطوة الاستطالة إلى 60 ثانية.

تحديد الاستنساخ

تم تحديد الحيوانات المستنسخة مبدئيًا من خلال إيجاد أقرب تطابق لها في قاعدة بيانات GenBank باستخدام خوارزمية BLASTN [43]. تمت محاذاة جميع التسلسلات (المستنسخات وأقرب التطابقات) في MEGA 4 [44] وتم إنشاء شجرة تشابه باستخدام مسافات Tamura-Nei [45] وخوارزمية التطور الأدنى مع معالجة الفجوة عن طريق الحذف الزوجي.


أنواع مختلفة من تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على أساس التدوير الحراري (خطوات التسخين والتبريد)

تستخدم تقنيات التدوير الحراري دورة درجة الحرارة لدفع الدورات المتكررة لتخليق الحمض النووي.

Multiplex PCR

Multiplex PCR هو نوع من تقنية PCR الذي يسمح بتضخيم العديد من المتواليات المستهدفة في نفس الوقت في نفس خليط التفاعل.

يتضمن خليط التفاعل الفردي مجموعات من أزواج التمهيدي لأهداف مختلفة من الحمض النووي. يقلل من استهلاك الكواشف PCR، وفي الوقت نفسه ، يفرض قيودًا على المواد الأولية المستخدمة.

للعمل بشكل صحيح ضمن تفاعل واحد ، يجب تحسين مجموعات من البادئات. يجب أن يكون لديهم درجات حرارة صلبة متشابهة وأن ينتجوا أمبليكونات بأحجام مختلفة لتشكيل نطاقات رحلان كهربي متميزة لتحليل PCR المتبع.

متداخلة PCR

يستخدم PCR المتداخل لزيادة خصوصية تضخيم الحمض النووي مما يقلل من المنتجات غير المحددة.

تستخدم هذه التقنية مجموعتين من البادئات.

المجموعة الأولى تسمح بتفاعل البلمرة المتسلسل الأول. يعمل ناتج هذا التفاعل كمصدر للحمض النووي المستهدف إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني باستخدام المجموعة الثانية من البادئات.

بدء PCR سريعًا

يعمل هذا النوع من تفاعل البلمرة المتسلسل على تقليل التضخيم غير المحدد أثناء مراحل الإعداد الأولية.

تحافظ تقنية بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الساخن على بوليميراز الحمض النووي في حالة غير نشطة عند درجات حرارة أقل من درجة حرارة التلدين.

يمنع هذا التعديل التضخيم أثناء إعداد التفاعل عندما ترتبط البادئات بتسلسلات الحمض النووي ذات التماثل المنخفض.

نوعان مختلفان من هذه التقنية هما بدء التشغيل الساخن PCR ميكانيكيًا وغير ميكانيكي.

بدء التشغيل الميكانيكي الساخن PCR يتم إجراؤها عن طريق تسخين خليط التفاعل إلى درجة حرارة انصهار الحمض النووي قبل إضافة بوليميريز Taq.

بدء التشغيل الساخن غير الميكانيكي PCR يستخدم أنظمة إنزيمات متخصصة تمنع تنشيط بوليميراز الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة.

Touchdown PCR

Touchdown PCR هي تقنية أخرى لتقليل التضخيم غير المحدد.

يتم تحقيق ذلك عن طريق رفع درجة حرارة التلدين فوق درجة حرارة انصهار المواد الأولية المستخدمة في الدورات الأولية وخفضها في الدورات اللاحقة.

تساعد درجات الحرارة المرتفعة خلال الدورات الأولية الاشعال على الارتباط بقوالب الحمض النووي بخصوصية أكبر بينما تسمح درجات الحرارة المنخفضة بتضخيم أكثر كفاءة من الأمبليكون المنتجة.

تفاعل Ligase المتسلسل (LCR)

يستخدم هذا النوع من تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل أربعة بادئات لتضخيم الحمض النووي (اثنان من البادئات لكل خيط من هدف الحمض النووي).

تعتبر بادئات تفاعل Ligase المتسلسل أطول بكثير من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل المعتادة ومصممة لتغطية التسلسل بأكمله ليتم تضخيمه.

أثناء خطوة التلدين الأولى ، يتم غلق البادئات بواسطة ليجاز DNA القابل للحرارة.

ينتج عن هذا جزء بطول الطول الإجمالي لكل زوج من البادئات التي تعمل كقوالب DNA للدورات اللاحقة.

الميزة الرئيسية لتفاعل Ligase المتسلسل هي أن طفرة أحادية النقطة بالقرب من التقاطع في القالب الأصلي DNA يمكن أن تمنع التفاعل وغياب المنتج يمكن أن يكون مؤشرًا على الطفرات.

PCR الكمي (qPCR)

تعتمد كمية المنتج التي يتم تصنيعها خلال عدد محدد من دورات تفاعل البلمرة المتسلسل على عدد جزيئات الحمض النووي الموجودة في خليط البداية. يتيح ذلك استخدام PCR لتحديد عدد جزيئات الحمض النووي الموجودة في المستخلص.

في PCR الكمي ، تتم مقارنة كمية المنتج المركب أثناء اختبار PCR بالكميات التي تم تصنيعها أثناء PCRs مع الكميات المعروفة من بدء DNA.

الوقت الحقيقي PCR

اليوم ، يتم إجراء القياس الكمي بواسطة PCR في الوقت الفعلي - وهو تعديل لتقنية PCR القياسية التي يتم فيها قياس توليف المنتج بمرور الوقت.

في كثير من الأحيان يتم استخدام هذه الطريقة لقياس كميات الحمض النووي الريبي.

على سبيل المثال لتحديد التعبير عن جين معين في الخلايا السرطانية. تسمح هذه الطريقة بمراقبة تطور السرطان.

النسخ العكسي PCR

لتنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل حيث يكون الحمض النووي الريبي هو مادة البداية ، تستخدم هذه الطريقة النسخ العكسية ، وهي عملية تسمى RT – PCR (تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخة العكسية).

الخطوة الأولى في هذه الطريقة هي تحويل جزيئات الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي التكميلي أحادي السلسلة (كدنا). بعد هذه الخطوة ، تستمر التجربة كما هو الحال في التقنية القياسية.

بعض البوليميرات المقاومة للحرارة ، مثل Tth ، لها نشاط النسخ العكسي تحت ظروف عازلة معينة وقادرة على عمل نسخ DNA من كل من جزيئات RNA و DNA.

TaqMan PCR

TaqMan PCR هي واحدة من تقنيات PCR في الوقت الحقيقي.

إنه يستخدم مسبار قليل النوكليوتيد وهو مكمل لتسلسل داخلي داخل الخيوط المضخمة.

لديها مجموعة الفلورسنت في أحد طرفيها وتروى في نهاية أخرى. طالما بقي كل من الفلوروفور والمخمر داخل مسبار قليل النوكليوتيد ، فلن ينبعث أي مضان.

أثناء تضخيم الحمض النووي ، سيرتبط مسبار قليل النوكليوتيد والبادئات بالخيوط المركبة حديثًا. سوف يدمر البوليميراز المسبار بسبب نشاط نوكلياز خارجي 5 → 3 ويطلق الفلوروفور.

تتناسب شدة التألق مع كمية المنتج المتولد.

تجميع PCR

تم تطوير تجميع PCR أو Polymerase Cycling Assembly لإنتاج متواليات حمض نووي طويلة جديدة.

يتمثل الاختلاف الرئيسي عن تفاعل البلمرة المتسلسل التقليدي في طول وكمية البادئات.

لتجميع قليل النوكليوتيد الاصطناعي ، يتم إجراء تجميع PCR على مواد أولية طويلة تصل إلى 50 نيوكليوتيد. تحتوي هذه البادئات على أجزاء متداخلة قصيرة وتتناوب بين الاتجاهين المعسسين والمضاد للمعنى الذي يغطي التسلسل المستهدف بأكمله.

خلال الدورات المتتالية ، يتم تهجين البادئات بواسطة مقاطع تكميلية ثم يزيد البوليميراز من طول الأجزاء لإنتاج تسلسل الحمض النووي الطويل النهائي.

عادةً ما يتبع مرحلة التجميع تفاعل سلسلة بوليميراز منتظم مع بادئات نهائية لزيادة كمية المنتج النهائي.


3 التصنيف الرئيسي للناقلات (مع رسم بياني)

النقطة المهمة هي ما نستهدفه من الجينات التي تهمنا - نسخها المتعددة أو منتجها البروتيني.

اعتمادًا على هذه المعايير ، فإن vec & shytors من النوعين التاليين:

1. نواقل الاستنساخ:

نحن نستخدم vec & shytor الاستنساخ عندما يكون هدفنا هو الحصول على نسخ عددية وخجولة (نسخ) من الجينات التي تهمنا (ومن هنا جاءت تسمية نواقل الاستنساخ). تستخدم هذه في الغالب في بناء مكتبات الجينات. يمكن استخدام عدد من الكائنات الحية كمصادر لناقلات الاستنساخ.

يتم تكوين بعضها صناعياً ، كما في حالة الكروموسومات الاصطناعية للخميرة والكروموسومات الاصطناعية للبكتيريا والبكتيريا ، بينما يتم أخذ البعض الآخر من البكتيريا والبكتيريا والحجج. في جميع الحالات ، يجب تعديل الناقل وراثيًا من أجل استيعاب الحمض النووي الغريب وإيقافه عن طريق إنشاء موقع in & shysertion حيث يتناسب الحمض النووي الجديد ويغلف. مثال: نواقل استنساخ PUC ، ناقلات استنساخ pBR322 ، إلخ.

2. متجهات التعبير أو بناء التعبير:

نحن نستخدم ناقل تعبير عندما يكون هدفنا هو الحصول على منتج البروتين وخيول الجين الذي يهمنا. للحصول على pro & shytein ، نحتاج إلى السماح بالتعبير عن الجين الذي يهمنا (ومن هنا جاء اسم expres & shysion vector) من خلال استخدام عمليات النسخ والترجمة.

بصرف النظر عن تسلسلات الحمض النووي الثلاثة التي تمت مناقشتها أعلاه (أصل النسخ المتماثل ، والعلامات المختارة ومواقع الاستنساخ المتعددة) ، فإن نواقل التعبير لها بعض الخصائص الإضافية الخاصة والخجل أيضًا.

أ. محفز بكتيري ، مثل محفز لاك. يسبق المروج موقع التقييد حيث يتم إدخال الحمض النووي الأجنبي ، مما يسمح بتنظيم نسخ التسلسل الأجنبي عن طريق إضافة المواد التي تحفز المؤيد والشيموتير.

ب. تسلسل الحمض النووي الذي ، عندما ينتقل إلى الحمض النووي الريبي ، ينتج موقع ربط الريبوسوم بدائية النواة.

ج. بدء النسخ وتسلسل الإنهاء بدائية النواة.

د. التسلسلات التي تتحكم في بدء النسخ ، مثل الجينات المنظمة والمشغلين.

في بعض أنواع نواقل التعبير التي تُستخدم على وجه التحديد بالاقتران مع المضيف البكتيري (مثل الإشريكية القولونية) ، لا يكون موقع الاستنساخ المتعدد متاخمًا مباشرة لتسلسل الربط الريبو والخداع ، ولكن بدلاً من ذلك يسبقه ترميز تسلسلي خاص لعديد ببتيد بكتيري.

أثناء استخدام هذا النوع من نواقل expres و shysion ، يتم إدخال الجين المعني بعد الجين الخاص بالببتيد البكتيري. وبهذه الطريقة ندمج إطارين للقراءة ، منتجين جينًا هجينًا يبدأ بالجين البكتيري ويتقدم دون انقطاع في أكواد الجين الذي يهمنا.

وبالتالي ، فإن منتج التعبير الجيني هو بروتين هجين ، محتال على عديد الببتيد البكتيري القصير المندمج في النهاية الأمينية من عديد الببتيد المستهدف. تتكون سلسلة البولي ببتيد الهجينة هذه من نوعين مختلفين من عديد الببتيدات تسمى بروتين الاندماج.

فيما يلي أسباب دمج بروتين الاندماج قبل الجين الذي يهمنا:

(أ) قد يؤدي وجود الببتيد البكتيري في بداية بروتين الاندماج إلى استقرار الجزيء ويمنعه من التآكل والتحلل بواسطة الخلية المضيفة. على النقيض من ذلك ، غالبًا ما يتم تدمير polypeptides for & shyeign التي تفتقر إلى شريحة بكتيرية وخجول.

(ب) قد يعمل البولي ببتيد البكتيري كببتيد سيج & شينال ، مسؤول عن نقل البروتين المستهدف إلى موقع معين حيث يتم جمعها. على سبيل المثال & shyample ، إذا كانت الببتيدات البكتيرية مشتقة من بروتين يتم تصديره بواسطة الخلية (على سبيل المثال منتجات جينات ompA) ، فسيتم ببساطة نقل البولي ببتيد المستهدف لدينا خارج الخلية المضيفة مباشرةً إلى وسائط الاستنبات من حيث يمكن جمعها. .

(ج) قد يساعد عديد الببتيد البكتيري أيضًا في تنقية البولي ببتيد المستهدف بواسطة تقنيات تنقية مختلفة مثل كروماتوغرافيا التقارب.

تصنيف المتجهات # 2.

على أساس الخلية المضيفة المستخدمة:

بعد بناء الحمض النووي المؤتلف يمكن إدخاله في خلية مضيفة. لذلك الاعتماد على الخلية المضيفة والخجل ، يتم تصميم وبناء النواقل. يجب أن تكون جميع أجزاء المتجهات متوافقة وظيفيًا مع المضيف. على سبيل المثال ، إذا كنا نصنع ناقلًا لمضيف بكتيري ، فيجب أن يكون له أصل مناسب للنسخ المتماثل والذي سيكون وظيفيًا في خلية bac & shyterial.

بناءً على هذا الأساس ، يتم تصنيف المتجهات على أنها:

1. نواقل البكتيريا:

هذه هي أصل بكتيري spe & shycial للتكاثر وعلامات اختيار مقاومة للمضادات الحيوية. تدعم البكالوريا والشيتيرية أنواعًا مختلفة من النواقل ، على سبيل المثال نواقل البلازميد ، نواقل العاثيات ، الكوسميدات ، الفازميدات ، الفاجيميدات ، إلخ.

لديهم أصل خاص من النسخ المتماثل يسمى تسلسل النسخ المتماثل الذاتي (ARS) ، على سبيل المثال ، نواقل البلازميد التكاثرية للخميرة (YRp) إلخ.

3. نواقل الحيوانات:

هذه النواقل مطلوبة في التكنولوجيا الحيوية لتخليق البروتين المؤتلف من الجينات التي لم يتم التعبير عنها بشكل صحيح عند استنساخها في E. coli أو الخميرة ، ويتم البحث عن طرق الاستنساخ في البشر من قبل علماء الأحياء السريرية في Mo & shylecular الذين يحاولون ابتكار تقنيات للعلاج الجيني ، في الذي يعالج المرض عن طريق إدخال جين مستنسخ في المريض ، على سبيل المثال ، P-element ، SV40 ، إلخ.

أصبح إنتاج النباتات المعدلة وراثيًا ممكنًا بسبب الاستخدام الناجح للنباتات النباتية والقصيرة. على سبيل المثال ، Ti-plasmid ، Ri-plasmid إلخ.

تصنيف المتجهات # 3.

على أساس الطبيعة الخلوية للخلية المضيفة:

على هذا الأساس ، تكون النواقل من نوعين:

1. ناقلات بدائية النواة:

هذا يشمل جميع نواقل الخلايا البكتيرية.

يتألف هذا من جميع ناقلات الخميرة والخلايا الحيوانية والنباتية.

النواقل بدائية النواة (النواقل البكتيرية):

تحتاج خلية الإشريكية القولونية التي تُستخدم بشكل متكرر كمضيف بدائية النواة إلى أنواع معينة من vec & shytors التي تم تصميمها وفقًا لذلك لتعمل في السيتوبلازم. النواقل القائمة على البلازميد والقائمة على العاثيات هي أكثر نواقل بدائية النواة شيوعًا. تشمل نواقل بدائية النواة نواقل مشتقة من البلازميد ، وناقلات مشتقة من العاثيات ، وناقلات phagemid ، وناقلات بلازميد ، وناقلات fosmid.

يتم تفكيكها على النحو التالي:

هذه هي النواقل الأكثر شيوعًا للخلايا المضيفة بدائية النواة. البكتيريا قادرة على إخراج الجينات الأجنبية الموجودة في البلازميدات وضغطها (الشكل 4.13). البلازميدات عبارة عن جزيئات DNA صغيرة دائرية مزدوجة الشريطة تفتقر إلى الغلاف البروتيني الموجود بشكل طبيعي في السيتوبلازم للعديد من سلالات البكتيريا.

بعض الأمثلة على البلازميدات التي تحدث بشكل طبيعي هي بلازميدات Ti ، عوامل F ، عوامل R ، Co / E1 بلازميد ، إلخ. البلازما والشيميدات مستقلة عن كروموسوم الخلية البكتيرية وتتراوح في الحجم من 1000 إلى 200000 زوج قاعدي. باستخدام الإنزيمات والريبوسومات السبعينيات التي تحتويها الخلايا البكتيرية ، يمكن تكرار الحمض النووي الموجود في البلازميدات والتعبير عنه.

تستفيد الخلايا البكتيرية من خجل البلازميدات ، والتي غالبًا ما تحمل الجينات التي تعبر عن البروتينات القادرة على منح المضادات الحيوية وإعادة المقاومة. هذه أيضًا تحمي البكتيريا عن طريق حمل الجينات وخجلها لمقاومة المعادن الثقيلة السامة ، مثل الزئبق أو الرصاص أو الكادميوم.

بالإضافة إلى ذلك ، تحمل بعض البكتيريا بلازميدات تمتلك جينات تمكِّن البكتيريا من تفكيك مبيداتها ومبيداتها ، وبعض المواد الكيميائية الصناعية ، أو مكونات البترول. العلاقة بين البكتريا والبلازميدات هي علاقة تعايش جواني تستفيد كل من البكتيريا والبلازميدات من الترتيب المتبادل. تمتلك البلازميدات أيضًا رقم نسخ مميز.

كلما زاد عدد النسخ ، زاد عدد البلازميدات indi & shyvidual في الخلية البكتيرية المضيفة. في حالة وجود المزيد من نسخ البلازميد ، سيتم تصنيع المزيد من البروتين بسبب العدد الأكبر من نسخ الجينات التي يحملها البلازميد. يلعب عدد النسخ والخشوع دورًا في مظهر النمط الظاهري وتضخم الجين. على سبيل المثال ، كلما زاد عدد الشرطيين والخجل من الجين المقاوم للمضادات الحيوية ، زادت مقاومة المضاد الحيوي.

من المهم جدًا ملاحظة أن البلازميدات التي تحدث بشكل طبيعي ولا تحتوي على جميع الخصائص والخجل الضرورية التي يتطلبها جزيء الحمض النووي ليكون بمثابة ناقل مربح. نتيجة لذلك ، يتم استخراج وتعديل البلازميدات natu & shyral عن طريق إدخال مقاطع DNA مناسبة ويتم تكوين جزيء DNA متجه متجه وغير مكتمل.

تُشتق نواقل استنساخ البلازميد من البلازما والشيميدات البكتيرية وهي الأكثر استخدامًا وتنوعًا وسهولة التلاعب بها.

فيما يلي أنواع مختلفة من نواقل البلازميد:

كان هذا هو أول ناقل بلازميد يستخدم على نطاق واسع لغرض بناء. يبلغ حجم pBR322 صغيرًا نسبيًا يبلغ 4363 نقطة أساس. هذا مهم لأن كفاءة التحويل تتناسب عكسيًا مع الحجم وفوق 10 كيلوبايت منخفضة جدًا.

وبالتالي ، يوجد & # 8216room & # 8217 في pBR322 لإدخال ستة كيلو بايت على الأقل. يحتوي هذا المتجه أيضًا على رقم نسخة مرتفع جدًا (

15 نسخة لكل خلية) ، والتي يمكن زيادتها 200 ضعف عن طريق العلاج بمثبط تخليق البروتين - تضخيم الكلورامفينيكول.

تسميات pBR 322:

يمكن أن تكون تسمية & # 8216pBR 322 & # 8217 تحت & shystood مع التفسير التالي:

1. & # 8216p & # 8217 يشير إلى البلازميد

2. & # 8216BR & # 8217 يحدد Bo-Liver و Rodriguez ، الباحثان اللذان طوراه

3. & # 8216322 & # 8217 يميز تلك البلازميدات عن غيرها (مثل pBR 325 ، pBR 327 ، إلخ) المطورة في نفس المختبر.

بناء pBR322:

1. أصل النسخ المتماثل:

إنه يحمل شظية وخجلًا من البلازميد pMB1 الذي يعمل كأساس وخجول لتكرار الحمض النووي وبالتالي يضمن تكاثر الناقل.

وهو يحمل جينين من الجينات المقاومة للمضادات والشيبيوتيك - الأمبيسيلين والتتراسيكلين.

يحمل عددًا من مواقع التقييد الفريدة. يقع بعضها في أحد جينات مقاومة المضادات الحيوية (على سبيل المثال ، توجد مواقع Pst I و Pvu I و Sac I في Ampr و BamHI و Hind III في Tetr). يؤدي الاستنساخ في أحد هذه المواقع إلى تعطيل الجين مما يسمح بتمييز المؤتلفات واللمعات عن المواد غير المؤتلفة المعروفة باسم التعطيل التدخلي.

حسب النسب نحن نفهم أصل pBR322. pBR322 ليس بلازميدًا طبيعيًا. يتم تصنيعها باتباع خطوات cer & shytain الموضحة في (الشكل 4.15). من المهم ملاحظة أن pBR322 يشتمل على DNA مشتق من ثلاثة بلازميدات مختلفة تحدث بشكل طبيعي وخجول.

تم إعادة تكوين جين amp R في الأصل على البلازميد R1 (وهو بلازميد مقاوم للمضادات الحيوية يحدث بشكل طبيعي وخجول في الإشريكية القولونية) ، وهو مشتق من R6-5 (وهو بلازميد مقاوم للمضادات الحيوية الثانية) وأصل النسخة المتماثلة والبطيئة مشتق من pMB1 ، والذي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالبلازميد المنتج للكوليسين ColE1.

الانتقاء المؤتلف مع pBR322 & # 8211 المقطعي تعطيل الجين المقاوم للمضادات الحيوية.

عندما نقدم الحمض النووي المؤتلف (ناقل + جين مهم) في الخلية المضيفة (من خلال عملية تسمى التحول والخلايا المضيفة التي تأخذ الحمض النووي المؤتلف تسمى الخلايا المضيفة المحولة) ، يتعين علينا فحص المجتمع المضيف بأكمله في من أجل اختيار الخلايا المحولة (ذات الحمض النووي المترابط واللامع) من الخلايا غير المحولة (بدون الحمض النووي المؤتلف).

كل ناقل لديه آلية مرتبطة به لهذا الفحص.

سنناقش هنا ما هي الآلية التي يتبعها متجه pBR322 في هذا الصدد. يحتوي pBR322 على العديد من مواقع التقييد الفريدة التي يمكن استخدامها لفتح vec & shytor قبل إدخال جزء جديد من الحمض النووي. BamHl ، على سبيل المثال ، يقطع pBR322 في موضع واحد فقط ، داخل مجموعة الجينات التي ترمز لمقاومة التتراسيكلين.

لم يعد جزيء pBR322 المؤتلف ، الذي يحمل قطعة إضافية من الحمض النووي في موقع BamHl ، قادرًا على منح مقاومة التتراسيكلين على مضيفه ، حيث أن أحد الجينات الضرورية الآن يتفكك ويخجل بواسطة الحمض النووي المُدخَل. لا تزال الخلايا التي تحتوي على جزيء pBR322 المؤتلف مقاومة للأمبيسيلين ، لكنها حساسة للتيترا والشيسايكلين (amp R tef s).

يتم إجراء فحص pBR322 re & shycombinants بالطريقة التالية. بعد التحول ، يتم طلاء الخلايا على وسط الأمبيسيلين وتحتضنها حتى تظهر كولو و shynies [الشكل. 4.16 (أ)].

كل هذه المستعمرات عبارة عن مستعمرات متحولة (تذكر أن الخلايا غير المحولة هي الأمبيرات وبالتالي لا تنتج مستعمرات على الوسط الانتقائي) ، ولكن فقط عدد قليل من جزيئات pBR322 المؤتلفة والمحتوية: معظمها يسيطر على البلازميد الطبيعي المربوط ذاتيًا. لتعريف المؤتلفات وتحويلها ، يتم طلاء المستعمرات على وسط أجار يحتوي على تترا وشيكلين [الشكل. 4.16 (ب)].

بعد الحضانة ، تنمو بعض المستعمرات الأصلية ، لكن البعض الآخر لا ينمو [الشكل. 4.16 (ج)]. تتكون تلك التي تنمو بالفعل من خلايا تحمل pBR322 الطبيعي بدون إدخال DNA ، وبالتالي ، مجموعة جينية وظيفية مقاومة للتيت والشيراسيكلين (amp R tet R).

المستعمرات التي لا تنمو على أجار التتراسيكلين هي مواد مؤتلفة (amp R tef s) بمجرد معرفة مواقعها ، يمكن استعادة عينات لمزيد من الدراسة من لوحة أجار الأمبيسلين الأصلية.

يستخدم على نطاق واسع كناقل للاستنساخ. بالإضافة إلى ذلك ، فقد تم استخدامه على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة النسخ والترجمة بدائية النواة.

مزايا pBR322:

4.4 كيلو بايت) يتيح سهولة التنقية والتلاعب والتلاعب.

2. اثنين من العلامات القابلة للتحديد (amp و tet) al & shylow اختيار سهل للحمض النووي المؤتلف.

3. يمكن تضخيمه حتى 1000-3000 نسخة لكل خلية عندما يتم إعاقة تخليق البروتين عن طريق تطبيق الكلورامفينيكول.

عيوب pBR322:

1. لديها قدرة عالية على الحركة أنا. ه يمكن أن ينتقل إلى خلية أخرى في وجود بلازميد اقتران مثل عامل F. تعد منطقة nic-bom (bom = أساس التنقل) لـ pBR322 مسؤولة عن هذه الميزة. نتيجة لذلك ، قد يضيع الناقل في مجموعة من الخلايا المضيفة المختلطة.

2. هناك قيود في حجم الجين الذي يمكن أن يستوعبه.

3. لا يوجد رقم نسخة مرتفع جدًا كما هو متوقع من ناقل جيد.

4.على الرغم من أن التثبيط الداخلي لجين مقاوم للمضادات الحيوية يوفر وسيلة فعالة ومحدودة لتحديد هوية المؤتلف ، إلا أن الطريقة أصبحت غير مريحة بسبب الحاجة إلى إجراء فحصين ، أحدهما بالمضاد الحيوي الذي يختار للتشكيلات ، متبوعًا بالشاشة الثانية ، بعد الطلاء المتماثل ، مع an & shytibiotic الذي يميز المؤتلفات.

هذا يجعل عملية الفحص تستغرق وقتًا طويلاً وشاقة.

تم اشتقاق ناقل آخر pBR327 من pBR322 ، عن طريق حذف النيوكليوتيدات بين 1427 و 2516. يتم حذف هذه النيوكليوتيدات لتقليل حجم الناقل ولإزالة التسلسلات اللامعة التي كان من المعروف أنها تتداخل مع تعبير الحمض النووي المستنسخ في الخلايا حقيقية النواة. لا يزال pBR327 يحتوي على جينات لإعادة المقاومة ضد اثنين من المضادات الحيوية (التتراسيكلين والأمبيسلين).

يتبع pBR327 اثنين من الإعلانات والخيارات على pBR322:

1. يحتوي pBR327 على عدد نسخ مرتفع (30-45 شرطيًا وخجولًا لكل خلية).

يتم الحصول على pUC عن طريق تعديل ناقل pBR322. نواقل pUC أصغر من pBR322 من كونها فقط

2.7 كيلوبايت. لكن نسبيًا لديهم عدد نسخ مرتفع. ينتج عن طفرة داخل أصل النسخ المتماثل 500 إلى 600 نسخة من البلازميد لكل خلية دون تضخيم.

تسمية نواقل pUC:

يمكن فهم تسمية & # 8216pUC & # 8217 بالتفسير التالي:

1. & # 8216p & # 8217 يشير إلى البلازميد.

2. & # 8216UC & # 8217 تعني جامعة كاليفورنيا حيث تم تطويرها لأول مرة بواسطة J. Mess & shying et al.

نرى أيضًا العديد من الأرقام بعد ذلك مثل pUC8 و pUC18 و pUC19 وما إلى ذلك. إنها مجرد سلسلة من pUC وقد تم تسميتها فقط للانفصال عن بعضها البعض.

بناء ناقلات PUC:

1. أصل النسخ المتماثل: مشتق من أصل تكرار pBR322. تم تعديل ColE1origin لتكرار pBR322 عن طريق إجراء طفرة صدفة بحيث تحتوي كل خلية E. coli المتحولة على 500-600 نسخة من البلازميد.

2. محدد التحديد: يحتوي على جين مقاوم للأمبيسيل والشيلين. يمكن أن تنمو الخلايا المضيفة المحولة على وسائط تحتوي على الأمبيسلين بينما تموت الخلايا غير المحولة.

3. lac Z & # 8217 الجين الذي يحتوي على MCS.

4. تم دمج lac Z & # 8217 في رموز المتجهات هذه لأنزيم بيتا جالاكتوزيداز الذي يعمل على ركيزة كروموجينية تسمى X-gal (موجودة في وسط الثقافة البكتيرية). إن التعبير عن جين lac Z & # 8217 موجود في مركب آخر موجود في نفس الوسائط يسمى Iso-propyl-thiogalactoside (IPTG).

عندما يحدث تفاعل الركيزة الإنزيمية ، يتم تحويل X- gal من الأبيض إلى الأزرق com & shypound. الآن يحتوي جين lac Z & # 8217 نفسه على MCS. ومن ثم ، عندما يتم إدخال الجين المعني في جين lac Z & # 8217 ، فإنه يفشل في ترميز بيتا غالاكتوزيداز ، وبالتالي في هذه الحالة لا يتم تحويل الركيزة (X-gal) إلى أي لون آخر. يسمى هذا النوع من الفحص بالشاشة الزرقاء والبيضاء والخجل.

نسب نواقل pUC:

أثناء بناء PUC ، فإن الواسم الوحيد القابل للانعكاس الذي يتم الاحتفاظ به خارج pBR322 هو الجين المقاوم للأمبيسيلين. ولكن تتم إزالة كل MCS من amp R عن طريق إجراء طفرات صدفة. يتم أيضًا تعديل أصل ColE1 للنسخ المتماثل بنفس العملية بحيث يمكنه تنفيذ عملية النسخ المتماثل والنسخ بسلاسة مرارًا وتكرارًا مما يؤدي في النهاية إلى زيادة رقم نسخة المتجه.

إلى جانب ذلك ، يتم أيضًا إدخال ترميز تسلسلي lac Z & # 8217 لـ beta galactosidase. وبالمثل بعد ذلك من خلال مؤيدة وطفرة الصدفة ، قمنا بإنشاء MCS ضمن تسلسل lac Z & # 8217 (الشكل 4.19).

فحص الخلايا المضيفة المتحولة لنا ونواقل pUC الخجولة:

بعد تحويل الخلايا المضيفة نقوم بفحصها لتحديد الخلايا المحولة من الخلايا غير المحولة. pUC8 [الشكل. 4.20 (a)] ، الذي يحمل جين مقاومة الأمبيسلين وجين يسمى lac Z & # 8217 ، والذي يرمز إلى جزء من إنزيم بيتا غالاكتوزيداز.

يتضمن الاستنساخ باستخدام pUC8 تعطيل إدخال الجين lac Z & # 8217 ، مع تحديد المؤتلفات بسبب عدم قدرتها على تصنيع بيتا جالاكتوزيداز [الشكل. 4.20 (ب)].

Beta-Galactosidase هي واحدة من سلسلة الإنزيمات المشاركة في تكسير اللاكتوز إلى الجلوكوز بالإضافة إلى الجالاكتوز. عادة ما يتم ترميزه بواسطة الجين lac Z الموجود في كروموسوم الإشريكية القولونية. تحتوي بعض سلالات الإشريكية القولونية على جين modi & shyfied lac Z ، وهو جين يفتقر إلى الجزء المعاد اختزاله إلى lac Z & # 8217 والترميز لجزء a-peptide من beta-galactosidase [الشكل. 4.21 (أ)].

يمكن لهذه المسوخات تصنيع الإنزيم فقط عندما تؤوي بلازميد ، مثل pUC8 ، الذي يحمل الجزء المفقود من الجين lac Z & # 8217.

تتضمن تجربة الاستنساخ باستخدام pUC8 اختيار المواد المتحولة على أجار الأمبيسيلين متبوعًا بفحص نشاط بيتا جالاكتوزيداز و shytivity لتحديد المواد المؤتلفة. الخلايا التي تؤوي بلازميد pUC العادي هي ampR وقادرة على تصنيع بيتا جالاكتوزيداز [الشكل. 4.21 (أ)] المؤتلفات هي أيضًا ampR ولكنها لا تخجل لصنع بيتا جالاكتوزيداز [الشكل. 4.21 (ب)].

في الواقع ، يعد فحص وجود أو غياب بيتا جالاكتوزيداز أمرًا سهلاً للغاية. بدلاً من فحص اللاكتوز الذي يتم تقسيمه إلى جلوكوز وجالاكتوز ، نقوم باختبار تفاعل وتفاعل مختلف قليلاً يتم تحفيزه أيضًا بواسطة beta-galactosi & shydase.

يتضمن ذلك نظير لاكتوز يسمى X-gal (5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-بيتا-د- جالاكتوبيرانوسيد) والذي يتم تكسيره بواسطة بيتا جالاكتوزيداز إلى منتج ملون باللون الأزرق الغامق.

إذا تمت إضافة X-gal (بالإضافة إلى محفز en & shyzyme مثل Iso-pro-pylthiogalactoside ، IPTG) إلى الأجار ، جنبًا إلى جنب مع الأمبيسيلين ، فإن المستعمرات غير المؤتلفة ، التي تصنع الخلايا منها بيتا جالاكتوزيداز ، سيتم تلوينها باللون الأزرق ، في حين أن المواد المؤتلفة ذات الجين المعطل lac Z & # 8217 وغير قادرة على تكوين p-galactosidase ، ستكون بيضاء.

يتم تلخيص هذا النظام ، الذي يسمى اختيار Lac ، في [الشكل. 4.21 (ب)]. لاحظ أنه يتم اختبار مقاومة الأمبيسلين ووجود أو عدم وجود p-galactosidase على لوحة أجار واحدة. وبالتالي ، يتم تنفيذ كل من الشاشة والخجول معًا وليس هناك حاجة لخطوة طلاء النسخ المتماثلة التي تستغرق وقتًا طويلاً والتي تكون ضرورية مع plas & shymids مثل pBR322.

استخدامات نواقل pUC:

يمكن استخدام نواقل pUC على حد سواء كاستنساخ vec و shytor وناقل التعبير. عند استخدامه كمتجه تعبير ، يتم تعديل تسلسله قليلاً لتلبية المتطلبات الضرورية.

مزايا نواقل pUC:

تقدم نواقل pUC الميزات والأشكال الرئيسية التالية على ناقلات pBR322:

(أ) عدد نسخ مرتفع من 500-600 نسخة لكل خلية.

(ب) اختيار سهل وخطوة واحدة.

(ج) يتم تجميع مواقع التقييد الفريدة المستخدمة في الاستنساخ والخجل داخل MCS. يسمح هذا باستنساخ جزء من الحمض النووي له نهايتان لزجتان مختلفتان.

عيوب pUC:

لا يمكن أن تستوعب جينًا مهمًا أكبر من 15 كيلو بايت.

هذه تشبه الكوسميدات ولكنها تعتمد على البكتيرية إف بلازميد. إن استنساخ vec & shytor محدود ، حيث يمكن للمضيف (عادةً E. coli) أن يحتوي على جزيء fosmid واحد. Fosmids هي 40 كيلو بايت من الحمض النووي الجيني العشوائي. يتم تحضير مكتبة Fosmid من جينوم الكائن المستهدف ويتم استنساخه في ناقل fosmid.

يوفر عدد النسخ المنخفضة & shyber ثباتًا أعلى من cosmids عدد النسخ العالية المقارنة. قد يكون نظام Fosmid مفيدًا لبناء مكتبات مستقرة من الجينومات المعقدة.

نواقل مشتقة من البكتيريا:

العاثيات ، أو العاثيات كما هي معروفة وغير معروفة ، هي فيروسات تصيب البكتيريا على وجه التحديد وتثبطها. مثل جميع الفيروسات ، فإن العاثيات بسيطة للغاية في التركيب ، وتتكون فقط من جزيء DNA (أو أحيانًا حمض الريبونوكلييك (RNA)) الذي يحمل عددًا من الجينات ، بما في ذلك العديد من الجينات لتكاثر العاثية ، ومغطاة بطبقة واقية أو قفيصة مكونة من البروتين جزيئات (الشكل 4.22).

النمط العام للعدوى ، والذي هو نفسه لجميع أنواع العاثيات ، هو عملية من ثلاث خطوات:

1. يلتصق جسيم الملتهمة بالخارج للبكتيريا ويحقن كرومو الحمض النووي الخاص بها في الخلية.

2. يتم تكرار جزيء الحمض النووي للعاثية ، عادةً بواسطة إنزيمات الملتهمة النوعية المشفرة بواسطة الجينات الموجودة على كروموسوم العاثية.

3. جينات الملتهمة الأخرى التوليف المباشر لمكونات pro & shytein للقفيصة ، وجزيئات الملتهمة الجديدة يتم تجميعها وإطلاقها من البكتيريا.

مع بعض أنواع العاثيات ، تكتمل دورة العدوى بأكملها بسرعة كبيرة ، ربما في أقل من 20 دقيقة. يسمى هذا النوع من العدوى السريعة بالدورة اللايتية ، حيث يرتبط إطلاق جزيئات الأس الهيدروجيني والخجول الجديدة بتحلل الخلية البكتيرية.

السمة المميزة لدورة العدوى اللايتية هي أن إعادة الحمض النووي للعاثية وإعادة التدوير يتبعها على الفور تخليق بروتينات القفيصة ، ولا يتم أبدًا الحفاظ على جزيء الحمض النووي للعاثية في حالة مستقرة في الخلية المضيفة. على النقيض من الدورة اللايتية ، تتميز العدوى اللايسوجينية بشبكية وظهور جزيء دنا الملتهمة في البكتيريا المضيفة ، ربما لعدة آلاف من الانقسامات الخلوية.

كان فريد بلاتر وزملاؤه أول من طوروا العاثية كناقلات.

فيما يلي أنواع مختلفة من نواقل البلازميد:

أولاً: نواقل البكتيريا M13:

عائلة النواقل M13 مشتقة من bac & shyteriophage M13. هذا هو نوع خاص بالذكور (يصيب بكتيريا E. coli التي تحتوي على f. pili) ، الملتهمة الخيطية اللايسوجينية مع جينوم DNA أحادي الجديلة دائري يبلغ طوله حوالي 6،407 نقطة أساس (6.4 كيلو بايت). مرة واحدة داخل الخلية المضيفة ، يعمل الحمض النووي أحادي الجديلة لعثة M13 كقالب لتخليق وخلع الخيط التكميلي ، مما ينتج عنه DNA مزدوج الشريطة طبيعي [الشكل. 4.23 (أ)].

لا يتم إدخال هذا الجزيء في الجينوم البكتيري والشيري ، ولكنه يتكاثر بدلاً من ذلك حتى توجد أكثر من 100 نسخة في الخلية [الشكل. 4.23 (ب)]. عندما تنقسم البكتيريا ، تتلقى كل خلية ابنة نسخًا من جينوم الملتهمة ، والتي تستمر في التكاثر ، وبالتالي تحافظ على أعدادها الإجمالية لكل خلية.

كما هو مبين في [الشكل 4.23 (ج)] ، يتم تجميع وإطلاق جزيئات الملتهمة الجديدة باستمرار ، ويتم إنتاج حوالي 1000 درجة حموضة وخجولة جديدة خلال كل جيل من الخلايا المصابة.

جاذبية M13 كناقل استنساخ:

العديد من ميزات M13 تجعل هذه العاثية جذابة وغير جذابة كأساس لناقل الاستنساخ. حجم الجينوم أقل من 10 كيلو بايت ، وهو ضمن النطاق المرغوب فيه للناقل المحتمل. بالإضافة إلى ذلك ، يتصرف الشكل التكراري مزدوج الشريطة (RF) لجينوم M13 إلى حد كبير مثل البلازميد ، ويمكن معالجته على هذا النحو للأغراض التجريبية.

يتم تحضيره بسهولة من مزرعة خلايا الإشريكية القولونية المصابة ويمكن إعادة إدخاله عن طريق تعداء. الأهم من ذلك ، يمكن الحصول على الجينات المستنسخة باستخدام vec & shytor المستندة إلى M13 في شكل DNA أحادي الجديلة. تعد النسخة أحادية الجديلة من الجينات المستنسخة مفيدة للعديد من التقنيات ، لا سيما تسلسل الحمض النووي والطفرات والخجل في المختبر.

يعد استخدام ناقل M13 طريقة سهلة وموثوقة وخجولة للحصول على DNA أحادي الجديلة لهذا النوع من العمل.

بناء ناقلات M13:

تتمثل الخطوة الأولى في بناء ناقل M13 clon & shying vector في إدخال جين lac Z & # 8217 في التسلسل بين الجينات. يؤدي هذا إلى ظهور M13 mp1 الذي يشكل لويحات زرقاء على X-gal agar (الشكل 4.25 (أ)) لا يتقدم M13 mp1 بأي موقع تقييد للوحدة في جين lac Z & # 8217.

ومع ذلك ، فإنه يحتوي على تسلسل سداسي النوكليوتيد GGATTC بالقرب من بداية الجين. إن تغيير النوكليوتيدات الفردي (باستخدام الطفرات والخجل في المختبر) من شأنه أن يجعل GAATTC ، وهو موقع EcoR1.

ينتج عن هذا تكوين M13 mp2. يحتوي M13 mp2 على جين lac Z & # 8217 تم تغييره قليلاً ، لكن إنزيم beta-galactosidase pro والمغلف بواسطة الخلايا المصابة بـ M13 mp2 لا يزال يعمل بشكل مثالي. M13 mp2 هو أبسط متجه M13. يمكن إدخال شظايا الحمض النووي ذات النهايات اللاصقة ECoR1 في موقع الاستنساخ ويتم تمييز المواد المؤتلفة على أنها لويحات واضحة على أجار X-gal.

نذهب لمزيد من التعديلات على M13 mp2 مما أدى إلى إنتاج متجه M13 آخر يسمى M13 mp7. في توليد M13 mp7 ، أولاً وقبل كل شيء ، نقوم بتصنيع أولي قصير و shygonucleotide يسمى poly-linker والذي يتكون من سلسلة من مواقع التقييد وله نهايات لاصقة EcoR1. يتم إدخال poly-linker هذا في موقع EcoRI لـ M13 mp2 لتوليد M13mp7.

يوفر هذا poly-linker أيضًا ما يصل إلى أربعة مواقع استنساخ ممكنة (ECoRI و BamHl و SaiI و PstI) إلى المتجه الجديد. من المهم جدًا ملاحظة أن poly-linker مصمم بحيث لا يعطل جين lac Z & # 8217 تمامًا: يتم الحفاظ على إطار قراءة وخجول في جميع أنحاء poly-linker ، وإنزيم بيتا غالاكتوزيداز الوظيفي ، على الرغم من تغييره لا يزال ينتج.

فحص الخلايا المضيفة المتحولة لنا ونواقل البكتيريا M13 الخجولة:

يؤدي إدخال الحمض النووي الجديد بشكل ثابت تقريبًا إلى إنتاج بيتا جالاكتوزيداز. لذا فإن اللويحات المؤتلفة واضحة على أجار X-gal. يتغير الأمر بشكل لامع ، إذا تم إعادة إدخال رابط البولي ، وتم إصلاح M13mp7 الأصلي ، فستنتج لويحات زرقاء.

استخدامات نواقل البكتيريا M13:

لفترة طويلة ، كان أهم تطبيق لـ M13 clon & shying هو تحديد تسلسل الحمض النووي بواسطة طريقة Sanger ، والتي تسمى أيضًا طريقة dideoxy أو طريقة إنهاء السلسلة. هذا يعتمد على تخليق الحمض النووي في وجود مثبطات إنهاء السلسلة ، 2 & # 8242 ، 3 & # 8242- ثنائي ديوكسينوكليوزيد ثلاثي الفوسفات (ddNTPs). تعد هذه الطريقة الآن أداة قياسية للغاية في علم الأحياء الجزيئي.

2. متجهات عرض Phage:

أحد الاستخدامات الهامة للعاثية الخيطية هو في أنظمة عرض العاثيات والخجل. هنا ، يتم إدخال تسلسلات الترميز في أحد جينات بروتين الغلاف. والنتيجة هي أن العاثية يتم إنشاؤها باستخدام شكل هجين من هذا البروتين ، وهو عبارة عن اندماج تسلسل البروتين الطبيعي ومنتج البروتين الخاص بالسلسلة المدرجة والخجل (بافتراض أن التسلسل المُدرج له نفس إطار القراءة مثل جين بروتين الغلاف).

يتم إفراز العاثيات من الخلية ، مع هذه المادة الإضافية & # 8216 المعروضة & # 8217 في الخارج. تستخدم نواقل العرض هذه العديد من الاستخدامات ، على سبيل المثال ، في مكتبات الفرز عن طريق التحريك وإنتاج اللقاح.

تستخدم بعض بروتوكولات الطفرات الموجهة بالموقع أيضًا الحمض النووي أحادي السلسلة ، والذي يمكن الحصول عليه من خلال نواقل تعتمد على العاثيات الخيطية. الحمض النووي أحادي الجديلة مفيد أيضًا بشكل خاص في توليد مجسات لتحليل RNA و shysis.

يمكن تحضير مجسات سريعة وخطيرة لنصوص الحمض النووي الريبي من أي من خيطي الحمض النووي. التطبيقات الأخيرة خارجة عن نطاق هذا الكتاب ، ولكن يمكن الحصول على المزيد من المعلومات والتلوين من كتيبات المختبرات المتخصصة.

مزايا ناقل البكتيريا M13:

1. مزايا أكثر من Lambda Phage Vec & shytor:

M13 هو مثال على الملتهمة الخيطية ويختلف تمامًا في الهيكل واللف عن لامدا. علاوة على ذلك ، فإن جزيء الحمض النووي M13 أصغر بكثير من جينوم لامدا ، حيث يبلغ طوله 6407 نواة وشيوتيدات فقط. إنه دائري وغير خجول لأنه يتكون بالكامل من DNA أحادي الجديلة.

يعني الحجم الأصغر لجزيء الحمض النووي M13 أن لديه مساحة لجينات أقل من جينوم لامدا. هذا ممكن لأن قفيصة M13 هي سلبيات ومختلطة من نسخ متعددة من ثلاثة بروتينات فقط (تتطلب ثلاثة جينات فقط) ، في حين أن تركيب هيكل رأس وذيل لامدا يتضمن أكثر من 15 بروتينًا مختلفًا وخجولًا.

بالإضافة إلى ذلك ، يتبع M13 دورة إصابة أبسط من دورة لامدا ، ولا يحتاج إلى جينات لإدخالها في جينوم المضيف. يحدث حقن جزيء الحمض النووي M13 في خلية الإشريكية القولونية عبر القضيب ، وهو الهيكل الذي يربط خليتين أثناء الاقتران الجنسي.

النواقل المستندة إلى M13 هي أنها تحتوي على نفس شظايا poly-linker و alpha-peptide مثل سلسلة pUC ويمكن اختيار المؤتلف بواسطة اختبار اللون الأزرق ← الأبيض. كما أن حجم الجينوم أقل من 10 كيلو بايت وبالتالي يسهل التعامل معه.

عيوب البكتيريا M13 vec & shytors:

فيما يلي عيوب نواقل البكتريا والشيريوفاج M13:

1. لا يمكن استنساخ الجين الذي يهم أكثر من 2 كيلوبايت.

2. لديها إنتاجية منخفضة من الحمض النووي.

3. تنتج العاثية العديد من السموم بتركيز عالٍ.

II. ناقلات لامدا فج:

هذا ناقل مستخدَم على نطاق واسع لاستنساخ قطع كبيرة جدًا من الجينات.

Lambda هي مثال نموذجي على لاقمات الرأس والذيل. المادة الوراثية هي DNA الموجود في هيكل الرأس متعدد السطوح ويعمل الذيل على ربط العاثية بالسطح البكتيري وحقن الحمض النووي في الخلية. يبلغ حجم جزيء lambda DNA 49 كيلو بايت.

إنها مرحلة معتدلة ويمكن أن تؤدي إلى دورات تحليلية وليسوجينية. تُعرف مواقع وهويات معظم الجينات على جزيء DNA lambda (الشكل 4.28).

يمكن أن يكون للعاثية Lambda أشكال خطية ودائرية من الحمض النووي. الجزيء الموضح في (الشكل 4.28) خطي ، وله نهايتان حرتان ، ويمثل الحمض النووي الموجود في رأس الملتهمة. يتكون هذا الجزيء الخطي من خيطين متشابهين وخجولين من الحمض النووي ، واتفاق قاعدة مقترنة وخجول لقواعد واتسون-كريك. 4.30 (أ)].

إن الخيطين الفرديين متكاملان ، وبالتالي يمكن أن يتزاوج أحدهما مع الآخر لتشكيل جزيء دائري مزدوج السلسلة تمامًا [الشكل. 4.30 (ب)]. غالبًا ما يشار إلى خيوط مفردة Comple & shymentary باسم & # 8216 sticky & # 8217 نهايات أو نهايات متماسكة ، لأن الاقتران الأساسي بينهما يمكن & # 8216 stick & # 8217 معًا طرفي جزيء DNA (أو نهايات جزيئين DNA مختلفين).

تسمى نهايات لامدا المتماسكة مواقع كوس وتلعب دورين متميزين خلال دورة لامدا في & الخجل. أولاً ، تسمح لجزيء الحمض النووي الخطي الذي يتم حقنه في الخلية بالتدرج والتحلل ، وهو شرط أساسي ضروري لإدخاله في الجينوم البكتيري (الشكل 4.29).

يختلف الدور الثاني لمواقع cos إلى حد ما ، ويأتي دوره بعد استئصال المؤيد ph & shyage من جينوم المضيف. في هذه المرحلة ، يتم إنتاج عدد كبير من جزيئات DNA lambda الجديدة بواسطة آلية الدائرة المتدحرجة للتكرار [الشكل. 4.30 (ج)] ، حيث يتم دحرجة خيط DNA مستمر من جزيء القالب. والنتيجة هي كاتينان يتكون من سلسلة من جينومات A الخطية المرتبطة ببعضها البعض في مواقع cos.

يتمثل دور مواقع كوس الآن في العمل كتسلسلات التعرف على نوكلياز داخلي يشق الكاتينين في مواقع كوس ، وينتج جينومات لامدا فردية. هذا نوكلياز ، الذي هو نتاج الجين أ في جزيء الحمض النووي لامدا وخجله ، يخلق النهايات اللاصقة المفردة ، ويعمل أيضًا مع البروتينات الأخرى لتجميع كل جينوم لامدا في هيكل رأس فج.

تتعرف عمليات الانقسام والتعبئة على مواقع cos وتسلسلات الحمض النووي على جانبيها فقط. Chang & sh تجاه هيكل المناطق الداخلية لجينوم lambda ، على سبيل المثال ، عن طريق إدخال جينات جديدة ليس له أي تأثير على هذه الأحداث طالما أن الطول الإجمالي للجينوم A لا يتغير بشكل كبير.

المشكلات المرتبطة بعاثيات لامدا المتساقطة والخطيرة بشكل طبيعي لاستخدامها كناقلات استنساخ وخجولة:

يجب حل مشكلتين قبل تطوير نواقل الاستنساخ القائمة على لامدا:

1. يمكن زيادة حجم جزيء lambda بحوالي 5٪ فقط ، وهو ما يمثل الإعلان عن 3 كيلوبايت فقط من الحمض النووي الجديد. إذا كان الحجم الإجمالي للجزيء أكثر من 52 كيلو بايت ، فلا يمكن تعبئته في هيكل رأس لامدا ولا تتشكل الملتهمات المعدية والصفائح المعدية.هذا يحد بشدة من حجم جزء الحمض النووي الذي يمكن إدخاله في lambda vec & shytor غير المعدل.

2. إن جينوم لامدا كبير جدًا لدرجة أنه يحتوي على أكثر من تسلسل التعرف على كل نوكلياز داخلي محدد تقريبًا. لا يمكن استخدام التقييد لشق جزيء لامدا الطبيعي بطريقة تسمح بإدخال حمض نووي جديد ، لأن الجزيئات سيتم تقطيعها إلى عدة أجزاء صغيرة من غير المرجح أن تُصلح جينوم لامدا حيويًا على ريليجا آند شيتيون.

وبسبب هذه الأسباب ، لا يمكن استخدام الحمض النووي لعاثيات لامدا التي تحدث بشكل طبيعي كناقل للاستنساخ. لحل هذه المشكلة ، نقوم بتعديل جينوم lambda & # 8217s وجعله مناسبًا ليكون ناقلًا ناجحًا.

حل المشكلات:

من البحث وجد أنه يمكن إزالة جزء كبير في المنطقة الوسطى من جزيء DNA lambda دون التأثير على قدرة العاثية على إصابة خلايا الإشريكية القولونية. تؤدي إزالة هذه المنطقة غير الخجولة بين الموضعين 20 و 35 على الخريطة إلى تقليل حجم جينوم لامدا بما يصل إلى 15 كيلو بايت.

وهذا يوفر مساحة لما يصل إلى 18 كيلو بايت من الحمض النووي الجديد الذي يمكن إضافته إليه لتكوين جزيء مؤتلف.

هذه الجينات غير الأساسية التي تمت إزالتها بهذه الطريقة تشارك في تكامل واستئصال Lambda pro-phage من كروموسوم الإشريكية القولونية. وبالتالي ، فإن جينوم لامدا المحذوف هو غير مسبب للتحلل ويمكن أن يتبع فقط دورة infec & shytion lytic. هذا في حد ذاته أمر مرغوب فيه للناقلات المستنسخة والخجولة لأنه يعني أنه يمكننا الحصول على لويحات (بنية مرئية تتشكل داخل انسداد الخلية ، مثل الثقافات البكتيرية داخل بعض وسط المغذيات).

يمكننا إزالة مواقع التقييد غير الضرورية عن طريق إجراء الطفرات في المختبر. على سبيل المثال ، يمكن تغيير موقع ECoRI ، GAATTC ، إلى GGATTC ، والذي لا يتعرف عليه الإنزيم.

أنواع نواقل لامدا:

هناك نوعان من نواقل استنساخ لامدا.

(أ) متجهات إدراج Lambda:

في هذه الحالة ، تم حذف جزء كبير من re & shygion غير الضروري ، وربط الذراعين معًا. يقوم ناقل الإدخال بوضع وإغفاء موقع تقييد فريد واحد على الأقل يمكن إدخال حمض نووي جديد فيه. يعتمد حجم جزء الحمض النووي الذي يمكن أن يحمله ناقل مستقل وشفاف على مدى حذف المنطقة غير الأساسية ، على سبيل المثال lambda-gtl0 ، lambda- ZAP11.

(ب) ناقلات استبدال Lambda:

تحتوي هذه النواقل على موقعين للتعرف على نوكليازات التقييد. تحيط هذه المواقع بجزء من DNA يتم استبداله بالحمض النووي المراد استنساخه [الشكل 4.34 (أ)]. غالبًا ما يحمل الجزء القابل للاستبدال (أو جزء الحشو) مواقع تقييد إضافية يمكن استخدامها لتقطيعها إلى قطع صغيرة بحيث يكون من غير المرجح إعادة إدخالها أثناء تجربة الاستنساخ.

تم تصميم نواقل الاستبدال والخلل بشكل عام لحمل قطع كبيرة من الحمض النووي أكثر مما يمكن أن تتعامل معه نواقل الدمج والتشكيل ، على سبيل المثال ، lambda- EMBL ، lambda-GEMll ، إلخ.

تجارب الاستنساخ مع نواقل lambda inser & shytion أو الاستبدال:

يمكن إجراء تجربة استنساخ مع ناقل لامدا باتباع الطريقة المماثلة التي اتبعناها لناقل البلازميد - يتم هضم جزيئات DNA lambda باستخدام إنزيم نوكلياز مقيد مناسب وخجول ، ويضاف الجين المعني ، ويتم ربط الخليط والنتيجة الناتجة يتم إدخال الحمض النووي المؤتلف في الخلية المضيفة للإشريكية القولونية (من خلال عملية تسمى trans & shyfection) [الشكل. 4.35 (أ)].

يتطلب هذا النوع من التجارب أن يكون المتجه في شكله الدائري ، مع ربط الهيدروجين لمواقع جيب التمام ببعضها البعض.

عملية تعداء التي تتطلب جزيء DNA دائري لامدا ليست فعالة بشكل خاص و shylarly. للحصول على عدد أكبر من المؤتلفات ، يمكننا إدخال بعض التنقية والخداع في جينوم لامدا. في هذا الصدد ، يمكننا تفضيل الشكل الخطي للمتجه. عندما يتم هضم الشكل الخطي للناقل باستخدام نوكلياز مقيد ذي صلة ، يتم تحرير الذراعين الأيسر والأيمن كشظايا وخجول منفصلة.

يمكن بناء الحمض النووي المؤتلف عن طريق مزج الجين الذي يهمنا مع أذرع ناقل [الشكل. 4.35 (ب)]. ينتج عن الربط العديد من الترتيبات الجزيئية ، بما في ذلك catenae & # 8217s التي تضم الذراع الأيسر والحمض النووي والذراع الأيمن تتكرر عدة مرات. يمكن استخدام مادة ph & shyage المؤتلفة الناتجة في أنبوب الاختبار لإصابة ثقافة الإشريكية القولونية.

تصور عدوى الملتهمة بعد عملية تعداء:

يتبع دخول الحمض النووي المؤتلف في الخلية المضيفة دورة التحلل التي تؤدي في النهاية إلى تحلل الخلية المضيفة. يمكن أن توجد الخلية المضيفة المتحللة على وسط أجار على شكل لويحات على حديقة من البكتيريا. كل لوحة عبارة عن منطقة تطهير يتم إنتاجها حيث تقوم العاثيات بتحليل الخلية وتنتقل لإصابة البكتيريا المجاورة.

فحص الخلايا المضيفة المتحولة لنا ونواقل لامدا العاثية الخجولة:

يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الطرق للتمييز بين اللويحات المؤتلفة من اللويحات غير المؤتلفة.

الطرق هي كما يلي:

(أ) التعطيل التدخلي لجين Lac Z & # 8217 الذي يحمله ناقل Lambda Phage:

يؤدي إدخال الجين الذي يهمنا في جين lac Z & # 8217 إلى تعطيل تخليق بيتا- غالاكتوزيداز. تتميز المواد المؤتلفة بطبقة الخلايا على أجار X-gal حيث تكون الصفائح المؤتلفة واضحة بينما تكون الصفائح غير المؤتلفة زرقاء اللون.

(ب) التعطيل التدخلي لجين Lambda Cl:

العديد من نواقل استنساخ لامدا لها موقع تقييد في جين cl. يؤدي التعطيل التدخلي لجين cl إلى حدوث تغيير مرئي في مورفولوجيا البلاك. تظهر اللويحات الطبيعية عكرة (ضبابية) في حين أن اللويحات المتشابكة والخجولة مع جين cl المتقطع تكون واضحة.

(ج) التحديد باستخدام Spi Phenotype:

P2 ph & shyage هو أحد أقارب لاقمات لامدا ، ولا يمكن أن تصيب لاقمات لامدا خلايا الإشريكية القولونية التي لديها بالفعل فجوة P2 متكاملة في جينومها. ونتيجة لذلك ، يُقال إن فجوة لامدا هي Spi- + (حساسة لـ P2 pro-phage in & shyfection). تم تصميم بعض نواقل استنساخ lambda بحيث يؤدي إدخال حمض نووي جديد إلى حدوث تغيير من Spi- + إلى Spi- & # 8211 ، مما يخجل المؤتلف من إصابة الخلايا التي تحمل P2 pro-phages.

تستخدم هذه الخلايا كمضيف لتجارب الاستنساخ مع هذه النواقل. في هذه الحالة ، تكون المواد المؤتلفة هي Spi- ، لذا فهي قادرة على تكوين لويحات.

(د) التحديد على أساس حجم Lambda Ge & shynome:

نحن نعلم هذا منذ البداية والخجل أن أي جين مهم أقل من 37 كيلو بايت أو أكثر من 52 كيلو بايت لا يمكن تعبئته في رأس فجى لامدا. تم إنشاء العديد من نواقل lambda عن طريق حذف أجزاء كبيرة من جزيء DNA lambda وبالتالي يكون طولها أقل من 37 كيلو بايت.

لا يمكن تعبئتها إلا في جسيمات فاجية ناضجة بعد إدخال الجين الذي يهمنا. هذا يجعل الحجم الإجمالي للجينوم يصل إلى 37 كيلو بايت أو أكثر. ومن ثم ، مع هذه النواقل ، لا يمكن التكاثر إلا من خلال العاثيات المتراصة واللامعة.

استخدامات نواقل الجراثيم لامدا:

الاستخدام الرئيسي لجميع النواقل القائمة على لامدا هو استنساخ شظايا الحمض النووي التي تكون طويلة جدًا بحيث لا يمكن التعامل معها بواسطة نواقل البلازميد أو M13. يمكن أن يحمل ناقل الاستبدال والخجل مثل lambda-EMBL4 ما يصل إلى 20 كيلو بايت من الجين الذي يهمنا. هذا com & shypares مع حجم إدخال أقصى يبلغ حوالي 8 كيلو بايت تقريبًا لجميع البلازميدات وأقل من 3 كيلو بايت لمتجهات M13.

مزايا Bacteriophage Lambda Vec & shytors

فيما يلي مزايا lambda vec & shytors:

1. تخزين جسيمات الملتهمة أسهل بكثير نسبيًا من تخزين النواقل القائمة على البلازميد.

2. العمر الافتراضي لجزيئات الملتهمة لانهائي.

3. يعتبر ترنسفكأيشن من الإشريكية القولونية أسهل بكثير مع جزيئات الملتهمة.

عيوب نواقل الجراثيم لامدا:

إذا كنت قد عزلت استنساخًا ، فعادةً ما يكون من الصعب جدًا عزل كميات كبيرة من الحمض النووي. في الممارسة العملية ، هناك العديد من المشاكل التي لا تحدث مع البلازميدات. لا يوجد حتى الآن بروتوكول سريع وموثوق به لإنتاج الحمض النووي لامدا النظيف جدًا.

أنجح طريقة هي استخدام أعمدة تبادل الأنيون. المشكلة الأكثر شيوعًا هي أن المستحضر يحتوي على الأوساخ التي تجعل المزيد من المعالجة ، مثل الهضم والتقييد ، صعبًا أو مستحيلًا.

حتى في نواقل الاستبدال ، يتكون ما يقرب من ثلثي الحمض النووي من تسلسلات ناقلات. إذا أمكن ، يجب استنساخ المقاطع التي تهمك باستخدام البلازميدات. يمكن لبنوك LambdaZAP توفير العمل ، لأن أجزاء البلازميد مقطوعة في الجسم الحي ، جنبًا إلى جنب مع إدخال الحمض النووي. هذه العملية عالية الكفاءة ، ولا تتطلب سوى خطوات عمل قليلة نسبيًا ، وتستمر من يوم إلى يومين فقط.

إنه النوع الأكثر تعقيدًا من المتجهات القائمة على لامدا. الكوسميدات هي الهجينة بين جزيء DNA phage و plas & shymid البكتيرية. يركز تصميمهم على حقيقة أن الإنزيمات التي تغلف جزيء DNA lambda و shyecule في طبقة بروتين الملتهمة تحتاج فقط إلى مواقع cos لكي تعمل.

بناء ناقلات كونية:

الكوسميد هو في الأساس بلازميد يحمل موقع cos. كما يحتاج أيضًا إلى علامة اختيار ، مثل الجين المقاوم للأمبيسيلين ، وأصل البلازميد للتكرار. من المهم ملاحظة أنه نظرًا لأن كوزميد يفتقر إلى جميع جينات لامدا ، فإن at لا ينتج لويحات. وبدلاً من ذلك ، تتشكل المستعمرات على الوسائط الانتقائية تمامًا كما هو الحال مع نواقل البلازميد.

تجربة الاستنساخ مع ناقلات Cosmid:

يتم تنفيذ هذا على النحو التالي. يتم فتح cosmid ويتم إدخال موقع تقييده الفريد وجين اهتمامنا. عادة ما يتم إنتاج هذه الشظايا عن طريق الهضم الجزئي مع نوكلياز مقيد ، حيث ينتج عن الهضم الكلي بشكل شبه دائم شظايا صغيرة جدًا بحيث لا يمكن استنساخها باستخدام كوسميد.

يتم إجراء الربط بحيث يتم تشكيل الكاتينانات. ثم تُستخدم لاقمات لامدا هذه لإصابة ثقافة الإشريكية القولونية. جميع المستعمرات عبارة عن مستعمرات مؤتلفة حيث لا يمكن تغليف عاثيات لامدا غير المؤتلفة في رأس عاثية لامدا.

استخدامات ناقلات Cosmid:

تُستخدم الكوسميدات لبناء مكتبات جينومية من حقيقيات النوى حيث يمكن استخدامها لاستنساخ أجزاء كبيرة من الحمض النووي.

مزايا الكوسميدات:

فيما يلي مزايا نواقل كوزميد:

1. يمكن استخدام هذه الجينات لاستنساخ جينات inter & shyest حتى 40 كيلو بايت.

2. نظرًا لأن فجوة لامدا ستدخل الحمض النووي المستقر والشيبينانت في الخلية المضيفة ، لا يتم تنفيذ خطوة إضافية لإدخال الحمض النووي المؤتلف في الخلية المضيفة.

3. تم العثور على طريقة سهلة للفحص.

على الرغم من أن نواقل M13 مفيدة جدًا لإنتاج نسخ مفردة من الجينات المستنسخة ، إلا أن لها عيبًا واحدًا. هناك حد لحجم جزء الحمض النووي الذي يمكن استنساخه باستخدام ناقل M13 ، حيث يُنظر إلى 1500 نقطة أساس بشكل عام على أنها سعة maxi & shymum.

للتغلب على هذه المشكلة ، تم إنشاء عدد من النواقل الجديدة وهي الهجينة للبلازميدات وناقلات M13. نسميها phagemids (& # 8216phage & # 8217 من M13 البكتيريا و & # 8216mid & # 8217 من البلازميد).

بناء ناقل Phagemid:

يحتوي phagemid النموذجي على الأجزاء التالية:

1. أصل Phage M13 للنسخ المتماثل.

2. جزء من جين lac Z & # 8217 مدفوعًا بـ lac pro و shymoter.

3. موقع استنساخ متعدد (MCS) مع جين lac Z & # 8217.

4. متواليات المحفز Phage T7 و T3 التي تحيط بتسلسلات MCS.

5. أصل ColE1 من النسخ المتماثل.

يمكن تكرار البلازميدات التي تحمل أصل تكرار M13 بالإضافة إلى الأصل التقليدي لتخليق dsDNA إما على شكل dsDNA من الأخير أو كدنا أحادي السلسلة من أصل M13. يتطلب النسخ المتماثل من أصل M13 توفير pro & shyteins المناسب (مثل بروتين الجين II) من الملتهمة المساعدة التي تتكاثر أيضًا داخل الخلية.

يولد النسخ المتماثل دنا أحادي الجديلة يمكن بعد ذلك تعبئته في معاطف الملتهمة. أمثلة على phagemids هي ناقلات pUC118 و 119 و 120.

يتم نسخها كبلازميدات حتى يتم إصابة الخلية التي تحتويها بشكل مشترك بالعاثة المساعدة ، مثل M13K07 ، والتي توفر البروتينات لتخليق وتعبئة الحمض النووي أحادي الجديلة. M13K07 عبارة عن فجوة M13 تم تعديلها ، والأكثر تأثيرًا وخجلًا من خلال دمج أصل تكرار البلازميد.

يسمح النسخ المتماثل من هذا الأصل للعاثية المساعدة بأن تكون موجودة في عدد نسخ مرتفع لكل خلية ، وبالتالي ، لتدعيم الكميات الأكبر من البروتينات المطلوبة لتكرار جزيء phagemid وتغليفه.

يحتوي M13K07 أيضًا على جين مقاومة كاناميسين للسماح بالاختيار والتحويل لوجود العاثية المساعدة. (بالطبع ، من الممكن أن يتم تغليف الملتهمة المساعدة M13K07 أيضًا ، ولكن من الناحية العملية ، تم العثور على جزيئات phagemid المعبأة في زيادة 100 ضعف على الملتهمة المساعدة.)

مثال آخر على هذه النواقل هو سلسلة pBluescript ، مثل pBluescriptIIKSÞ ، كما هو موضح في الشكل 4.39. هذه السلسلة من البلازميدات المحتوية على الخيوط ، بالإضافة إلى الميزات التي تم وصفها بالفعل ، محفزات من عاثيات الإشريكية القولونية T3 أو T7 ، والتي تكون مفيدة للتعبير عن التسلسلات المستنسخة.

استخدامات ناقلات Phagemid:

هذا المتجه هو متجه متعدد الأغراض حيث يمكن أن يعمل على النحو التالي:

مزايا ناقلات Phagemid:

الميزة الرئيسية لنظام phagemid هي أنه يمكن استخدامه لتوفير مادة مفردة أو مزدوجة الجديلة دون أي إعادة استنساخ.

Phasmids هي حقا بلازميدات مع جينات الملتهمة. هذه عبارة عن دنا خطي مزدوج الاتجاه تكون نهاياته عبارة عن مقاطع لامدا تحتوي على جميع الجينات المطلوبة للعدوى اللايتية والتي يكون الجزء الأوسط منها خطيًا. كل من وظائف لامدا والنسخ المتماثل للبلازميد سليمة.

ولا تحمل نواقل البلازميد رابط لامدا وموقع خجول. بمجرد دخول خلية الإشريكية القولونية ، يمكن أن يتكاثر الطور والشيميد مثل العاثية ويشكل اللويحات بالطريقة العادية. ومع ذلك ، إذا كان المتجه يحتوي على الجين الذي يشفر مثبط لامدا ، فإن البلازميد يتكاثر كبلازميد وليس كعاثية.

اعتمادًا على عمل أو عدم عمل بروتين cl (مشفر بواسطة القامع) ، يمكن أن يتكاثر Phasemid كبلازميد (cl-Protein inactive) أو فج عندما يكون cl-protein نشطًا. يمكن أن يكون نشاط بروتين cl غير نشط عن طريق تنمية ثقافة الإشريكية القولونية عند 40 درجة مئوية.

يمكن استخدام البلازميدات بعدة طرق. على سبيل المثال ، يمكن استنساخ الحمض النووي في ناقل البلازميد بطريقة تقليدية ومن ثم يمكن رفع البلازميد المؤتلف على الملتهمة. من السهل تخزين البلازميدات ، فهي تتمتع بعمر افتراضي غير محدود بشكل فعال ، كما أن فحص العاثيات بواسطة التهجين الجزيئي والتشتيت يعطي نتائج أنظف من فحص مستعمرات البكالوريا والمستعمرات الخجولة.

يتم إجراء معظم تجارب الاستنساخ باستخدام الإشريكية القولونية كمضيف ، وتتوفر أكبر مجموعة متنوعة من نواقل الاستنساخ لهذا الكائن الحي. تحظى الإشريكية القولونية بشعبية خاصة عندما يكون الهدف من تجربة الاستنساخ هو دراسة السمات الأساسية للبيولوجيا الجزيئية مثل بنية الجين ووظيفته. ومع ذلك ، في بعض الظروف قد يكون من المرغوب فيه استخدام مضيف مختلف وخجول لتجربة استنساخ الجينات.

ولكن عندما يكون الهدف من تجربة RDT ليس فقط دراسة الجين ولكن استخدام الاستنساخ للخداع والتحكم أو تحسين تخليق منتج ميتا وشيبوليك (على سبيل المثال ، هرمون مثل hypophyll و shylin) ، أو تغيير خصائص العضو والخجل (على سبيل المثال ، لإدخال مقاومة مبيدات الأعشاب في نبات المحاصيل) ، ثم نأخذ خلية مضيفة أكثر تقدمًا وقادرة على تلبية مستوى متقدم من التمثيل الغذائي.

نتيجة لهذا ، في كثير من الأحيان نعتبر ناقلات حقيقية النواة لتجارب الاستنساخ لدينا. نواقل الخميرة والحيوانات والنباتات تعتبر ناقلات حقيقية النواة.

الخميرة (Saccharomyces cerevisiae) هي واحدة من أهم الكائنات الحية في التكنولوجيا الحيوية و shyogy. دورها مهم جدًا أيضًا في التخمير وصنع الخبز. تم استخدام الخميرة ككائن حي مضيف لإنتاج المستحضرات الصيدلانية المهمة من الجينات المستنسخة. تم تحفيز تطوير نواقل استنساخ الخميرة بشكل كبير من خلال اكتشاف البلازميد الموجود في معظم سلالات S. cerevisiae.

تم تصميم نواقل الخميرة المختلفة ، بمجرد تأكيد قدرة الخميرة وفائدتها. كل منهم لديه ثلاث سمات مشتركة.

1. تحتوي جميعها على مواقع مستهدفة فريدة لعدد من نوكليازات التقييد.

2. كل منهم يمكن أن يتكاثر في الإشريكية القولونية في كثير من الأحيان برقم نسخة مرتفع.

3. كل منهم يستخدم علامات يمكن استخدامها لاختيار الخمائر المؤتلفة ، على سبيل المثال ، Hi53 ، leo2 ، trpl و ura3.

أنواع نواقل الخميرة:

يمكن تقسيم جميع نواقل الخميرة إلى ثلاثة أنواع:

1. نواقل استنساخ الخميرة (أو نواقل بلازميد الخميرة)

2. نواقل التعبير الخميرة

3. كروموسومات الخميرة الاصطناعية (YAC)

نواقل استنساخ الخميرة (أو نواقل الخميرة البلازميدية):

تُستخدم هذه النواقل لاستنساخ (عمل عدة نسخ مكررة) الجين الذي يهمنا في الخلية المضيفة للخميرة. تم تصميم جميع نواقل الاستنساخ من 2fx بلازميد وهو البلازميد الطبيعي الموجود في خلية الخميرة.

هم من الأنواع التالية:

1. الخميرة بلازميدات Episomal (YEps):

يبلغ طوله 6318 نقطة أساس وله رقم نسخة 70-200. معظم YEps عبارة عن مكوك vec & shytors (يمكن استخدامها كناقلات في كل من المضيفات بدائية النواة والمضيفات حقيقية النواة) وبالتالي تم تصميمها بشكل متفق وخجل. مثال على YEps هو Yep13.

تتكون من الأجزاء التالية:

(أ) أصل النسخ المتماثل مشتق من 2m plas & shymid.

(ب) أمبير R ومنطقة tet R من pBR322. تعد منطقة العلامة القابلة للتحديد مفيدة لفحص الخلايا المضيفة المؤتلفة عند استخدام المتجه في خلية بدائية النواة.

(ج) منطقة LEU2 المشتقة من كروموسوم الخميرة ويمكن استخدامها كقائمة قابلة للتحديد عند استخدام الناقل في خلية حقيقية النواة وخجولة. LEU2 ، الذي يرمز إلى بيتا إيزو بروبيل مالات ديهيدروجينيز ، أحد الإنزيمات المشاركة في تحويل حمض البيروفيك إلى لوسين.

من المهم جدًا ملاحظة أنه عندما نأخذ خلايا الخميرة لـ YEps ، فعلينا أن نأخذ فقط خميرة leu2 التي يجب أن تكون طفرات auxo & shytrophic بها جين LEU2 غير وظيفي.

لا تستطيع خلايا مضيف الخميرة leu2-yeast توليف وتحجيم لوسين الأحماض الأمينية ويمكنها البقاء على قيد الحياة ، فقط إذا تم توفير هذا الحمض الأميني كمغذٍ وخجول في وسط النمو [الشكل. 4.41 (أ)]. يعد Se & shylection ممكنًا لأن الخلايا المضيفة المتحولة تحتوي على نسخة من YEp (تحتوي على جين LEU2) وهي قادرة تمامًا على النمو في غياب الأحماض الأمينية.

في تجربة الاستنساخ ، تم طلاء الخلايا Eire على وسيط ضئيل للغاية ، والذي لا يحتوي على أحماض أمينية مضافة. فقط الخلايا المحولة هي القادرة على البقاء على قيد الحياة وتشكيل المستعمرات [الشكل. 4.41 (ب)].

قد يتم إدخال YEp في chro & shymosome الخميرة من خلال عملية إعادة التركيب المتماثل والتألق بين جين البلازميد LEU2 وجين الخميرة LEU2. قد يظل البلازميد متكاملاً ، أو قد يؤدي حدث إعادة التركيب اللاحق إلى استئصاله مرة أخرى.

2. بلازميدات الخميرة التكاملية (YIps):

هذه هي في الأساس سيارة بلازميدات بكتيرية وتخجل من جين الخميرة. مثال على ذلك YIp5 ، وهو pBR322 مع إدخال جين URA3.

3. البلازميدات المكررة الخميرة (YRps):

هذه قادرة على التكاثر كبلازميدات مستقلة لأنها تحمل تسلسل DNA chromo & shysomal الذي يتضمن ori & shygin من النسخ المتماثل. مثال على ذلك هو YRp7.

نواقل التعبير الخميرة:

يتم استخدام هذه النواقل عندما يكون هدفنا هو التخلص من الجين الذي يهمنا في خلية الخميرة. سوف تستخدم نواقل تعبير الخميرة متواليات المحفز والمنهي بالإضافة إلى الجين المعني. بصرف النظر عن هذه ، لدينا علامات وراثية مثل جين الفلور الأخضر والبروتين الخفيف (GFP) لتتبع موقع البروتين بعد تخليقه الحيوي.

فيما يلي بعض الأمثلة:

ناقل تعبير خميرة عالي النسخ يحمل جين aminoglycoside phosphotransferase للاختيار في الخميرة باستخدام G418. يتم التعبير عن الإدخالات من مروج TEF القوي.

ناقل التعبير الخميرة ذو النسخ المنخفض الذي يحمل جين أمينوغليكوزيد فسفوتانسفيراز للاختيار في الخميرة باستخدام G418. يتم التعبير عن الإدخالات من مروج CYC1 الضعيف.

ناقل تعبير الخميرة للبروتينات المفرزة. يقود مروج TEF1 القوي التعبير التأسيسي لـ cDNA المدمج في تسلسل القائد السابق للمحترفين لعامل التزاوج ألفا لضمان إفراز منتج البروتين في الوسط.

الخميرة الكروموسومات الاصطناعية:

كروموسومات الخميرة الاصطناعية (YACs) عبارة عن تركيبات خطية اصطناعية مزدوجة الشريطة تحتوي على العناصر اللازمة للنسخ المتماثلة والتشكيل ككروموسومات مستقلة في الخميرة. انظر الكروموسومات الاصطناعية لمزيد من التفاصيل.

فيما يلي بعض الأمثلة على ناقلات الحيوانات:

Baculovirus في الحشرات و shyfects. هذا الفيروس هو على شكل قضيب بجينوم مزدوج تقطعت به السبل. أثناء العدوى العادية ، ينتج الفيروس البكتيري أجسامًا شمولية نووية تتكون من جزيئات فيروسية مضمنة في بروتين أماه وشايتريكس.

تسمى مصفوفة البروتين هذه polyhedrin وهي تمثل 70٪ من إجمالي pro & shytein المشفر بواسطة الفيروس. لا يمكن التلاعب الجيني والانعزال عن الحمض النووي الفيروسي لأنه يحتوي على حمض نووي كبير جدًا به العديد من مواقع التقييد والتخلص من إنزيم واحد.

ومن ثم ، يتم استنساخ الجين المعني في ناقل نقل إعادة التركيب الصغير ونقله إلى سلالات خلايا الحشرات جنبًا إلى جنب مع النوع البري للفيروس في الخلية. يحدث إعادة التركيب المتماثل والخجول بين جين متعدد الهيدرين وجيننا بين الجين والأكثر خجلاً.

وبالتالي ، فإن الجين الذي يهمنا سيتم نقله ونقله من ناقل البلازميد إلى النوع البري من الفيروس وسيتم نقل جين متعدد الهيدرين من الفيروس على البلازما والشيميد.

هذا شيء يشبه رد فعل الإزاحة. لن يؤثر هذا الإزاحة للجين على تكاثر الفيروس ، حيث إن جين متعدد الهيدرين غير مطلوب للاسترداد والتكاثر. يتكاثر فيروس إعادة التركيب في الخلايا ويولد لويحات مميزة (بدون أجسام متضمنة).

ولا يزرع الفيروس في سلالة الحشرات من Spodopterafrugiperda. يتم التعبير عن الجين المعني أثناء الإصابة ويمكن تحقيق عوائد عالية جدًا من البروتين في الوقت الذي تتحلل فيه الخلية.

2. ناقل فيروس الورم الحليمي البقري:

يسبب فيروس الورم الحليمي Bo & shyvine (BPV) الثآليل (تكاثر الظهارة غير المنضبط) في الماشية.

يصيب BPV عادة الخلايا الظهارية الحرشفية المتباينة والمغلفة.

يحتوي BPV على بروتين قفيصة يحيط بحمض نووي دائري مزدوج الشريطة بحجم 79 كيلو بايت. 69٪ من هذا الجينوم مهم للوظيفة الفيروسية ، بينما يمكن استبدال 31٪ من الجينوم بأي تسلسل دنا غريب مثل الجين الذي يهمنا.

يتم إنشاء BPV المؤتلف عن طريق ربط الجين الذي يهمنا وناقل BPV (69 ٪) على البلازميد pBR 322 ، وبالتالي توليد ناقل المكوك الذي يحتوي على موقع ori البلازمي وتسلسل تكرار الفيروس. تتكاثر هذه النواقل المكوكية في خلايا الإشريكية القولونية أولاً ثم تتحول إلى خط خلية الفأر.

الميزة الرئيسية لـ BPV هي توليد خط خلوي دائم. نظرًا لعدم قتل الخلايا المصابة ، يتم العثور على عدد ثابت من البلازميد حتى عندما يكون الإدخال كبيرًا الحجم. يعد اختيار النمل المحول أمرًا سهلاً للغاية لأنها تشكل كومة من الخلايا على الطبقة الأحادية المنقولة من الخلايا المسماة & # 8220 التركيز & # 8221.

ثم يتم اختيار الخلايا المحولة من خلال وجود الجين الواسم الذي هو في الغالب ترميز الجين Neomy & shycin phospho transferase للمقاومة ضد G418. مثال على هذا النوع من المتجهات هو p3.7LDL.

3. المتجهات القائمة على الفيروسات SV40:

SV 40 هو فيروس كروي مع cir مزدوج الشريطة وحمض نووي شبكي بحجم 5.2 كيلو بايت. يحتوي البروتين الفيروسي على ثلاثة بروتينات مشفرة فيروسية. VP1 هو البروتين الرئيسي الموجود في الكابسيد بحجم 47000 كيلو دالتون. يوجد أيضًا اثنان من pro & shyteins VP2 و VP3.

يرتبط الحمض النووي للفيروس ببروتينات الهستونات الأربعة (H4 و H2A و H2B و H3). يمكن تقسيم الحمض النووي الفيروسي إلى خمسة أجزاء دقيقة لترميز خمسة بروتينات مختلفة صغيرة T ، كبيرة T ، VP1 ، VP2 و VP3. تتداخل منطقة تشفير VP1 مع VP2 و VP3 في إطار قراءة ترجمة مختلف. يصيب فيروس SV 40 خطوط خلايا الكلى للقرد.

ينتقل الفيروس إلى النواة ويصبح غير مصقول. ثم يتم ترجمة كلا الجينين T الموجودان بالقرب من الأصل في اتجاه عقارب الساعة. يعتبر T pro & shytein الكبير مهمًا لتكرار الحمض النووي للفيروسات ويبدأ بعد ترجمة البروتين T الكبير.

يبدأ النسخ المتماثل من الأصل ويكون ثنائي الاتجاه. وينتهي عندما يلتقي اثنان من شوكات النسخ المتماثل. يتم تخليق حوالي 105 جزيء من الحمض النووي على الوجهين وخللها في كل خلية. جنبا إلى جنب مع تكرار الحمض النووي ، يتم تصنيع البروتينات VP1 و VP2 و VP3.

ثم يحدث تغليف الحمض النووي لتشكيل فيريونات جديدة ، والتي يتم إطلاقها عن طريق تحليل الخلية. يمكن أيضًا بدء العملية برمتها عن طريق تعداء باستخدام DNA SV 40 العاري. يتم إنشاء نواقل SV 40 سيمي & شيلر لنواقل الملتهمة. تتم إزالة أجزاء من الجينوم الفيروسي واستبدالها بأجزاء أخرى من الحمض النووي. هناك ثلاثة أنواع من مركبات SV 40 لكل منها ميزة أو عيب واضح فيما بينها.

(أ) ناقلات التحويل السلبي SV40:

هذه النواقل لا تتكاثر ولا تؤيد وتندمج فيريونات ، ولكنها ببساطة تدمج أجزاء الحمض النووي في الحمض النووي الخلوي. تقوم هذه الخلايا المحولة بتكرار الحمض النووي الجديد كجزء لا يتجزأ من جينوماتها. هذه البلازميدات هي أيضًا نواقل مكوكية وتتضمن علامات انتقائية مثل فيروس الهربس أو ثيميدين كيناز أو الجينات الجديدة.

بصرف النظر عن العلامات الانتقائية ، فهي تشمل إشارات منظم النسخ ومواقع تعدد الأدينيل.

(ب) ناقلات مجاري الهواء SV40:

هذه vec & shytors قادرة على التكاثر والتعبئة والخجل في جزيئات virion. تحتوي تحويلات vec & shytors على جزء من 300 نقطة أساس والتي تعمل كأصل للنسخ المتماثل وتوفر sig & shynals التنظيمي النسخي لتوليف mRNAs.

هذا النوع من المتجهات يأخذ حجم إدخال من 3.9 إلى 4.5 كيلو بايت. لا تحتوي هذه البلازميدات على الجينات التي ترمز إلى VP1 و VP2 و VP3. نظرًا لعدم إمكانية إضافة DNA إلى SV 40 DNA دون إزالة أي DNA من الجينوم ، ولإضافة الإدخال ، تتم إزالة DNA الجينوم غير المطلوب.

يتم توفير وظائف الحمض النووي المفقودة من خلال عمليات الحذف هذه باستخدام فيروس مساعد أو عن طريق إدخال الجينات المحذوفة SV 40 في الحمض النووي المضيف. عادةً ما يتم نقل نواقل SV 40 المؤتلفة (عادةً ما تتكون من DNA لتسلسل in & shyterest وتكرار وجين لترميز VP1 و VP2 و VP3) إلى خط خلية cos.

خط خلية كوس هو خط خلية الكلى من كلية القرد الأخضر الأفريقي. يحتوي على جين T-protein المدمج في الجينوم. لذلك عندما يتم نقل الناقل إلى هذه الخلايا ، يتم إنتاج جزيئات الفيريون بمساعدة الفيروس المساعد.

(ج) ناقلات البلازميد SV40:

تتكاثر هذه النواقل في خط خلية القرد ولكنها ليست معبأة مثل virions. عادةً ما تحتوي هذه النواقل على أصل سلسة التكاثر والخداع وجين البروتين T الأكبر ولكنها لا تحتوي على جينات VP1 و VP2 و VP3. إنها نواقل مكوكية ، ولديها القدرة على التكاثر في كل من E. coli وخط خلية القرد.

تم تطوير نواقل الاستنساخ للنباتات العليا في الثمانينيات وأدى استخدامها إلى المحاصيل المعدلة وراثيًا (GM) التي أصبحت في العنوان الرئيسي اليوم.

سنقوم بفحص تفاصيل نباتات نباتية ورقية والتعديل الوراثي للمحاصيل. هنا ننظر إلى نواقل الاستنساخ وكيفية استخدامها.

تم استخدام ثلاثة أنواع من أنظمة الاستنساخ والنبات بدرجات متفاوتة من النجاح مع النباتات العليا:

1. نواقل تعتمد على البلازما والشيميدات الموجودة بشكل طبيعي في الجراثيم (على سبيل المثال ، Ti plasmids من A. tumifaciens و Ri plasmid من A. rhizogens).

2. النقل الجيني المباشر باستخدام أنواع مختلفة من DNA البلازميد. (على سبيل المثال ، استخدام البلازميدات فائقة الالتفاف).

3. النواقل القائمة على فيروسات النبات (على سبيل المثال ، ناقلات فيروسات Caulimo وناقلات فيروسات الجوزاء).

نواقل المكوك:

نواقل المكوك هي تلك التي يمكن أن تتكاثر في نوعين مختلفين غير مرتبطين. تم تصميم المفاعلات المكوكية للتكاثر في خلايا من نوعين ، حيث تحتوي على أصلين للتكاثر ، أحدهما مناسب لكل نوع بالإضافة إلى الجينات المطلوبة للتكرار ولا توفرها الخلية المضيفة ، أي أنها مكتفية ذاتيًا مع عملية تكرارها.

نواقل المكوك من الأنواع التالية:

1. حقيقيات النوى & # 8211 بدائية النواة Vec & shytors:

النواقل التي يمكن أن تتكاثر في حقيقيات النوى وبدائيات النوى. على سبيل المثال ، يمكن أن تتكاثر YEp vec & shytors في الخميرة (الفطريات) وكذلك في E. coli (البكتيريا).

2. بدائية النواة & # 8211 بدائية النواة Vec & shytors:

النواقل التي يمكن نشرها في خليتين مضيفتين بدائية النواة غير مرتبطين ، على سبيل المثال ، يمكن أن تنتشر ناقلات RSF1010 في البكتيريا وكذلك في اللولبيات.

السمات المشتركة لهذه المركبات vec & shytors أو ناقلات حقيقية النواة هي كما يلي:

(أ) تكون قادرة على التكاثر في نوعين أو أكثر من العوائل بما في ذلك الخلايا بدائية النواة والخلايا حقيقية النواة.

(ب) تتكاثر بشكل مستقل ، أو تندمج في جينوم المضيف وتتكرر عندما تتكاثر الخلية المضيفة.

(ج) تستخدم هذه النواقل بشكل شائع لنقل الجينات من كائن حي إلى آخر.

يتسبب وجود أصلين من النسخ المتماثل في بعض الأوقات في حدوث مشكلات خاصة ، حيث يكون جزء من أصل النسخ المتماثل لنوع واحد غير مرتبط تمامًا بالآخر ويتعارض مع التكرار والخجل من مضيف آخر. ومن ثم ، في المكوك vec & shytor يجب إدخال أنواع مختلفة من أصول النسخ وفحصها قبل التجربة.

الكروموسومات الاصطناعية:

الكروموسومات الاصطناعية هي جزيئات DNA ذات بنية معروفة ومختلة صناعياً ، والتي يتم تجميعها في المختبر (في المختبر & shytory) من تسلسلات DNA محددة تعمل مثل الكروموسوم الطبيعي. الكروموسومات الاصطناعية و shysomes هي نواقل دائرية أو خطية يتم الحفاظ عليها بثبات ، عادة ، 1-2 نسخة لكل خلية.

إنها ضخمة الحجم مقارنة بالناقلات الأخرى ولكن يمكنها استنساخ أجزاء كبيرة جدًا من الكروموسومات (حتى كروموسوم كامل). قبل رؤية أنواع مختلفة من الكروموسومات والكروموسومات الاصطناعية ، يمكن رؤية المكونات الرئيسية الثلاثة للكروموسومات حقيقية النواة والتي تعتبر ضرورية لصيانتها المستقرة داخل الخلية.

1. السنترومير المطلوب لتوزيع الكروموسوم بشكل صحيح على الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية.

2. تيلوميران ، الهياكل الموجودة في نهايات الكروموسوم ، والتي تكون ضرورية لتكرار النهايات بشكل صحيح بالترتيب والتي تمنع أيضًا الكروموسوم والخداع من أن يتم قضمهما بعيدًا عن طريق exonu & shycleases.

3. أصل التضاعف ، وهي المواضع على طول الكروموسوم التي يبدأ عندها تكاثر الحمض النووي ، على غرار أصل تكرار البلازميد.

بمجرد أن نحدد التركيب الكروموسومي لكائن حقيقي النواة (مثل hu & shymans والخميرة) ، عندها يمكننا عزل المكونات الرئيسية لكروموسوماتها وضمها معًا لتشكيل كروموسومات اصطناعية وخبيثة. ثم في هذا الكروموسوم الاصطناعي يمكننا إدخال الجين الذي يهمنا والذي يمكن استنساخه لاحقًا في خليته الخاصة.

Fol & shylowing هي أنواع الكروموسومات الاصطناعية:

أ.الكروموسومات الاصطناعية الخميرة (YAC):

يمكن اعتبار YAC ككروموسوم فني وخجول وظيفي ، لأنه يشتمل على ثلاثة متواليات spe & shycific DNA التي تمكنه من propa & shygate من خلية خميرة واحدة إلى نسلها:

إن التيلومير الموجود في نهاية كل كروموسوم ، يحفز ويحول الحمض النووي الخطي من التحلل بواسطة نوكلياز.

السنترومير وهو موقع التعلق بألياف المغزل الانقسامي ، & # 8220 يسحب & # 8221 نسخة واحدة من كل كروموسوم du & shyplicated في كل خلية ابنة جديدة.

3. أصل النسخ المتماثل (أو):

تسلسلات أصل النسخ المتماثل والتي هي عبارة عن تسلسلات DNA محددة تسمح لآلية تكرار الحمض النووي بالتجمع على الحمض النووي والتحرك في شوكات النسخ المتماثل.

علامات قابلة للتحديد تسمح بعزل سهل لخلايا الخميرة التي تناولت كروموسومًا صناعيًا.

موقع التعرف على اثنين من en & shyzymes EcoRI و BamHl.

تجربة الاستنساخ باستخدام متجه YAC:

1. يتم الحصول على شظايا كبيرة من الحمض النووي عن طريق السيارة وتخجل من عملية الهضم المقيدة باستخدام EcoRI.

2. يتم هضم YAC بواسطة اثنين من إنزيمات التقييد EcoRI و Bam HI.

3. يتحد هذان العنصران في مواقع EcoRI ويرتبطان تساهميًا بواسطة DNA ligase.

4. يتم إنتاج ناقلات YAC المؤتلفة ، كروموسوم الخميرة المصطنعة و shycial مع إدخال الحمض النووي الجيني. يمكن استخدام هذا المتجه لإصابة خلايا الخميرة وتوليد عدد غير محدود من النسخ.

1. يمكن استخدام YAC لدراسة جوانب مختلفة من بنية وسلوك الكروموسومات على سبيل المثال ، لفحص الفصل بين الكروموسومات أثناء الانقسام الاختزالي.

2. يمكن لنظام الاستنساخ YAC أن يأخذ إدخال DNA أكبر من l00kb. ونتيجة لذلك ، يمكن استخدامها لدراسة وظائف وأنماط التعبير عن الجينات التي كانت في السابق صعبة التحليل بواسطة تقنيات الحمض النووي المترابط واللامع.

3. يمكن نشر YACs في خلايا الثدييات ، مما يتيح إجراء التحليل الوظيفي في الكائن الحي الذي يقيم فيه الجين بشكل طبيعي. وبالتالي من خلال استخدامها يمكننا التعرف على الشكل الحقيقي للتعبير الجيني في ظروف الجسم الحي.

4. الكروموسومات الاصطناعية الخميرة مفيدة جدا في إنتاج مكتبات الجينات. يمكن أن تأخذ نواقل الإشريكية القولونية إدراج DNA maxi و shymum حتى 300 كيلوبايت. نتيجة لهذا ، هناك حاجة إلى حوالي 30000 نسخة لمكتبة الجينات البشرية إذا استخدمناها كناقل استنساخ.

ومع ذلك ، يتم استخدام نواقل YAC بشكل روتيني لاستنساخ شظايا 600 كيلو بايت ، وأنواع خاصة قادرة على التعامل مع الحمض النووي بطول يصل إلى 1400 كيلو بايت ، وهذا الأخير يخفض حجم مكتبة الجينات البشرية إلى 6500 نسخة فقط.

في بعض الأحيان ، يُنظر إلى YAC مع مشكلة عدم استقرار الإدخال ، ويعاد ترتيب الحمض النووي المستنسخ في بعض الأحيان عن طريق إعادة التركيب الجزيئي. ومع ذلك ، كانت YACs ذات قيمة هائلة في توفير قطع طويلة من الحمض النووي المستنسخ لاستخدامها في مشاريع تسلسل الحمض النووي واسعة النطاق. مثال على YAC هو pYAC3.

2. الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BAC):

الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs) هي نواقل استنساخ تعتمد على بلازميدات كروموسومية إضافية للإشريكية القولونية ، تسمى عامل F أو عامل الخصوبة. تمكن هذه النواقل من بناء الكروموسومات الاصطناعية ، والتي يمكن استنساخها في الإشريكية القولونية.

هذا المتجه مفيد لاستنساخ أجزاء الحمض النووي حتى 350 كيلو بايت ، ولكن يمكن التعامل معه مثل نواقل البلازميد البكتيرية العادية ، وهو مفيد جدًا لتسلسل امتدادات كبيرة من الحمض النووي الصبغي.

مثل أي ناقل آخر ، تحتوي BACs على متواليات ori مشتقة من عامل E. coli plasmid F ، ومواقع استنساخ متعددة (MCS) لها مواقع تقييد فريدة ، وعلامات اختيار مناسبة. تم استنساخ جينومات العديد من فيروسات الحمض النووي الكبيرة و RNA vi & shyruses على أنها BACs. يشار إلى هذه الخدع والإحالات باسم & # 8220 الحيوانات المستنسخة المعدية & # 8221 ، نظرًا لأن ترنسفكأيشن من BAC في الخلايا المضيفة كافٍ لبدء العدوى الفيروسية.

جعلت الخاصية المعدية لهذه BACs دراسة العديد من الفيروسات مثل فيروسات الهربس وفيروسات الجدري وفيروسات كورونا أكثر وضوحا. يتم الآن استخدام BACs إلى حد كبير في نمذجة الأمراض الوراثية ، غالبًا جنبًا إلى جنب مع الفئران المعدلة وراثيًا.

تم استخدام BACs في هذا المجال حيث قد يكون للجينات المعقدة العديد من التسلسلات التنظيمية في بداية تسلسل الترميز ، بما في ذلك متواليات المروج المختلفة التي ستحكم مستوى التعبير الجيني & # 8217s. تم استخدام BACs إلى حد ما من النجاح مع الفئران عند دراسة الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر ومرض # 8217s والخجل أو كما في حالة اختلال الصيغة الصبغية المرتبط بمتلازمة داون & # 8217.

أمثلة على BAC هي pBACe3.6 ، pBeloBAC11 وما إلى ذلك.

3. الكروموسومات الاصطناعية البشرية (HAC):

الكروموسوم الاصطناعي البشري (HAC) هو كروموسوم مصغر يتم إنشاؤه بطريقة صناعية وخلاقة في الخلايا البشرية. أي أنه بدلاً من 46 كروموسومًا ، يمكن أن تحتوي الخلية على 47 كروموسومًا مع كون رقم 47 صغيرًا جدًا ، وحوالي 6-10 قواعد ميجا في الحجم ، وقادرة على حمل جينات جديدة أدخلها باحثون بشريون.

نحن نتخلى عن أنظمة التكرار الذاتي والعزل الخاصة به ، يمكن لـ HAC أن يتصرف ككرو وجسيموسوم مستقر ومستقل عن الكروموسوم والخلايا الخبيثة للخلايا المضيفة.

العناصر الأساسية لصيانة الكروموسوم ونقله هي المناطق الثلاث التالية:

1. & # 8220 أصل النسخ المتماثل & # 8221 الذي يبدأ منه du & shyplication للحمض النووي ،

2. ال & # 8220centromere ، & # 8221 الذي يعمل في الفصل المناسب للكروموسوم أثناء انقسام الخلية ، و

3. & # 8220 telomere، & # 8221 الذي يحمي نهايات الكروموسومات الخطية.

وهي مفيدة في دراسات التعبير كنواقل لنقل الجينات وهي أدوات لوظيفة الكروموسوم البشري eluci & shydating. تنمو في خلايا HT1080 ، وهي مستقرة من الناحية الانقسامية والخلوية الوراثية لمدة تصل إلى ستة أشهر.

4. كروموسوم اصطناعي مشتق من Plemid (PAC):

هذه هي بنيات الحمض النووي المستمدة من DNA لجراثيم PI. يمكن أن تحمل كميات كبيرة (حوالي 100-300 كيلو قاعدة) من التسلسلات الأخرى لمجموعة متنوعة من أغراض الهندسة الحيوية. إنه أحد أنواع النواقل المستخدمة لاستنساخ شظايا الحمض النووي (100- إلى 300 كيلو بايت متوسط ​​حجم الإدخال ، 150 كيلو بايت) في خلايا الإشريكية القولونية.


معلومات الكاتب

العنوان الحالي: قسم الكيمياء الصيدلية ، كلية الصيدلة ، الجامعة البريطانية في مصر ، الشروق ، مصر

الانتماءات

قسم الكيمياء ، جامعة ألبرتا ، إدمونتون ، ألبرتا ، كندا

ميرات سوجيترا ، سوسميتا ساركار ، ياسمين ماغيرا ، إميلي رودريغيز ، إريك ج كاربنتر ، شوريا سيث ، دانيال فيرير فينالز ، نيكولاس ج.بينيت ، ريفاثي ريدي ، أميرة خليل ، شياو تشاو شيوي ، مايكل آر بيل ، رويكسيانج بليك زينج ، جاستن ج. بيلي ، تود إل لوري ، ماثيو إس ماكولي وأمبير راتمير ديردا

قسم الكيمياء ، جامعة كالجاري ، كالغاري ، ألبرتا ، كندا

بينغ تشانغ وأمبير تشانغ تشون لينغ

قسم الطب الجزيئي ، معهد سكريبس للأبحاث ، لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

كوروين نيكولات وأمبير جيمس سي بولسون

معهد الكيمياء البيولوجية ، Academia Sinica ، Nangang ، تايبيه ، تايوان

معهد علوم الكيمياء الحيوية ، جامعة تايوان الوطنية ، دان ، تايبيه ، تايوان

قسم الأحياء الدقيقة الطبية والمناعة ، جامعة ألبرتا ، إدمونتون ، ألبرتا ، كندا

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

ن. شيدت وتميزت بجميع مكتبات وبلازميدات LiGA MS، S. Sarkar، J.M.، D.F.V. و R.R. عزل الحيوانات المستنسخة من الملتهمة وإجراء تعديلات على الملتهمة بواسطة الجليكان ، وتحليل MALDI ، وتجارب ربط البروتين والفحوصات المخبرية. أجرى MS و ER و JM و R.D. فحوصات تستند إلى الخلية MSM. وأجرى ساركار تجارب على الحيوانات. وأجرى R.D. تحليلًا إحصائيًا أجرى S. Seth تحليلًا مخصصًا لبيانات CFG العامة T.L.L.، P.Z.، C.-C.L.، C.N.، J.J.B. و جي سي بي. ساهمت الكواشف الاصطناعية الجليكان A.K. و M.R.B. مستضدات اصطناعية شيدت لرفع وتمييز مضاد غالF4 التي أنتجها S. Sarkar. X.X. و R.B.Z. مستضدات شيدت لإدماجها في LiGA. R.D. و MS كتب المخطوطة R.D.، MSM، T.L.L. و جي سي بي. حرر المخطوطة النهائية وساهم بمدخلات فكرية واستراتيجية. وافقت كل من الكتاب المخطوط النهائي.

المؤلف المراسل


الأكثر شيوعا استخدام PCR

  • PCR بسيط
  • متداخلة PCR
  • q- PRC (PCR الكمي) أو PCR في الوقت الحقيقي
  • RT & # 8211 PCR (النسخ العكسي PCR)
  • Multiplex PCR

PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل)

تضمن تفاعل البلمرة المتسلسل مكونًا أساسيًا

DNTPs

إجراء PCR

يتم استخراج الحمض النووي الجينومي باستخدام المخزن المؤقت CTAB ويستخدم إيبندورف لجمع عينة. في eppendrof الحمض النووي المستخرج وجميع المكونات المذكورة أعلاه تضاف وتوضع في PCR. يتم تضمين ثلاث خطوات في تفاعل البلمرة المتسلسل.
أول الحمض النووي الجينومي تفسد الطبيعة. فصل الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل. في الخطوة التالية ، اربط Primers بالتسلسل التكميلي وفي الخطوة الأخيرة يتم تشكيل النسخ.

في كل دورة PCR ، يتم الحفاظ على درجة الحرارة. في الخطوة الأولى 94-98 درجة. الثانية الخطوة 37-60 درجة. والخطوة النهائية حوالي 78 درجة.

متداخلة PCR

متداخلة PCR هو تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل تم تصميمه لتحسين الخصوصية. يقلل من الربط غير المحدد للمنتجات. استخدمت متداخلة PCR مجموعتين من الاشعال. واحد مستخدم في التفاعل الأول لتفاعل البلمرة المتسلسل والثاني مستخدم في ناتج التفاعل الأول لتضخيم الغرض

إجراء متداخلة PCR

في الخطوة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل ، يتم تضخيم الحمض النووي المستهدف باستخدام المجموعة الأولى من البادئات. يتم تضخيم ناتج الخطوة الأولى بواسطة المجموعة الثانية من البادئات. تعتبر المجموعة الثانية من البادئات مكملة لمنتج الخطوة الأولى. الغرض من استخدام مجموعتين من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل هو تقليل تلوث المنتج وتحسين خصوصيته.

مصدر صورة PCR المتداخلة: ويكيبيديا

PCR الكمي

يسمى PCR الكمي أيضًا PCR في الوقت الحقيقي. تقنية حساسة للغاية وقادرة على التكاثر. يمكن استخدام هذه التقنية كميا ومعنويا.

مبدأ PCR في الوقت الحقيقي

إنه المبدأ الأساسي الذي يشارك في التدوير الحراري. جهاز التدوير الحراري عبارة عن أداة مرتبطة بـ PCR تسهل تفاعل الدورة الحرارية. الطريقة الشائعة للكشف التي يتم استخدامها هي الصبغة الفلورية الخضراء Cyber ​​والتي يتم إدراجها مع الحمض النووي. الطريقة الثانية هي استخدام مجسات رجل طق من الفلورسنت المسمى. هذه عملية معملية. تتكون هذه العملية من التضخيم بواسطة نواتج التفاعل الكمي لكل عينة في كل دورة.

مزايا الوقت الحقيقي PCR

  • الكشف السريع عن عدوى الفيروسات مثل HCV و HBV باستخدام ميرنا
  • محدد للغاية للاستخدام
  • حساسية عالية
  • قابلة للتكرار
  • تقليل التلوث
  • أعط نتيجة القياس الكمي
  • عملية مدفوعة بالبرمجيات

Multiplex PCR

يتم تضخيم العديد من تسلسل الحمض النووي الجيني في خطوة واحدة من تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم استخدام مواد أولية متعددة وبوليميراز DNA مع جهاز التدوير الحراري. إن بوليميراز الدنا هو بوساطة الحرارة. البرايمر التي يتم استخدامها. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن مسببات الأمراض المختلفة في تفاعل واحد. لتصميم Multiplex PCR من الاشعال مختلفة.

أنواع Multiplex PCR

قالب واحد PCR

لتضخيم تسلسل محدد لقالب الحمض النووي ، يستخدم هذا النوع قالبًا واحدًا مع عدة بادئات أمامية وعكسية.

متعدد القوالب PCR

يتم استخدام قوالب متعددة مع العديد من البادئات الأمامية والخلفية ضمن تفاعل واحد من إبندورف.

الاشعال من Multiplex PCR

البادئات التي تستخدم في تصميم متعدد الإرسال PCR بطول قصير حوالي 18-22 زوجًا قاعديًا.

مزايا Multiplex PCR

تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي

يستخدم PCR النسخ العكسي لتوليف (كدنا) من الحمض النووي الريبي. يُشار إلى هذا أيضًا باسم RT-PCR

لكنه يختلف عن الوقت الحقيقي لمسألة البحث. وهذا ما يسمى q PCR.

مبدأ النسخ العكسي PCR

الخطوة الأولى لتشكيل [كدنا] من الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي. في الخطوة التالية تضخيم هذا [كدنا] باستخدام PCR. وتحول cDNA أحادي الجديلة إلى DNA مزدوج الخيط. النقطة الرئيسية في هذا الإجراء برمته هي تنقية mRNA في حالة حدوث mRNA ، وليس التلوث المنقى. يتضمن ذلك طريقة من خطوة واحدة أو خطوتين.

في طريقة الخطوة الواحدة ، حدث تحويل (كدنا) والتضخيم في أنبوب رد فعل واحد وفي طريقة خطوتين (كدنا) والتضخيم يستمر في أنابيب مختلفة. تعتبر الطريقة المكونة من خطوتين أكثر ملاءمة من طريقة الخطوة الواحدة

إجراء RT-PCR

  • استخراج الحمض النووي الريبي
  • تمت إضافة المواد المستخرجة إلى خليط التفاعل (بما في ذلك النسخ العكسي ، والبادئات الأولية ، والمواد المستهدفة والنيوكليوتيدات)
  • تستخدم مواد أولية لتصلب حبلا الحمض النووي الريبي إذا كان الهدف موجودًا
  • النسخ العكسي يحول mRNA إلى [كدنا]
  • تمد البرايمر هذا الخيط
  • ظلت درجة الحرارة 90 درجة لتفسد خيوط الحمض النووي / الحمض النووي الريبي.
  • خفضت درجة الحرارة لتصلب (كدنا) الذي تم تشكيله حديثًا.
  • يتم تصنيع الحمض النووي الجديد بواسطة إنزيم البوليميراز.
  • يتم تشكيل العديد من النسخ من خلال دورات متعددة.

تطبيق RT-PCR

  • تستخدم للكشف عن الأمراض الوراثية
  • الأكثر شيوعًا للكشف عن عدوى فيروس الحمض النووي الريبي عن طريق تحويله إلى (كدنا).
  • استخدام التنميط الجيني
  • قد يعتمد التشخيص الجزيئي في المستقبل على RNA ويمكن استخدام RT-PCR في السنوات القادمة.

كيف تعرف أن البلازميد المستخرج هو بالفعل بلازميد الفائدة؟ - (يناير / 17/2015)

مرحبًا بالجميع ، لدي مشكلة في تحولي. عندما قمت باختيار المضادات الحيوية ، أظهر كل من المحولات (كولاي بالبلازميد ذي الأهمية) والتحكم (بدون البلازميد) نموًا.

التقطت بضع مستعمرات من لوحة المحولات على أي حال ونمت في مرق مع 100 ميكروغرام / مل من الإريثروميسين بين عشية وضحاها. ثم استخرجت البلازميد وقمت بتشغيل هلام الاغاروز وأظهرت النتائج تماسكًا حول bp المماثل للبلازميد المعني.

نظرًا لأن اختيار المضاد الحيوي فشل (أشك في أن تركيز المضاد الحيوي منخفض جدًا) ، فلا يمكنني التأكد تمامًا من نجاح تحول البلازميد. & # 160

إذن سؤالي هو ، بناءً على نتائج agarose ، هل يمكنني التأكد من أن البلازميد المستخرج هو بالفعل البلازميد الذي أريده؟ أو هل يمكن أن يكون هو البلازميد الموجود بشكل طبيعي في سلالة e.coli w3110IQ بدلاً من ذلك؟

الرجاء ، إذا كان لدى أي شخص أي فكرة ، يرجى النصيحة. شكرا.

إجابة سريعة على السؤال الرئيسي ، لن أخوض في جميع أعمال اختيار المضادات الحيوية هنا في هذا الوقت:

1. يمكنك تسلسل البلازميد.

2. إذا كان لديك تسلسل DNA البلازميد ، فيمكنك تصميم هضمات تقييدية تمنحك نطاقات حجم فريدة ومتوقعة.

نظرًا لأحجام البلازميد المعتادة ، يتم استخدام التقييد مع العديد من RE ومقارنة أنماط التقييد والأحجام مع الأحجام المتوقعة أو PCR منطقة خاصة بالبلازميد / المتجه. & # 160

لم أسمع أبدًا ببلازميد "طبيعي" يظهر في مخزون خلية مختص ، ولكن على أي حال ، يجب أن تتأكد من أن البلازميد الخاص بك سليم قبل الشروع في العمل. & # 160

تحتاج إلى العثور على ما اشتق منه البلازميد ، سيكون للتسلسل بعض التشابه.

لم يتم العثور على تعيين المتجه هذا في أي مكان على Google. لكن لا يمكنك العمل مع ناقل غير معروف تمامًا. اسأل الشخص الذي أعطاه لك أو ابحث عن اقتباسات عنه (ربما تحت اسم مختلف) ، حتى المتجهات القديمة بدون تسلسل كامل لها على الأقل خريطة تقييد. & # 160

لن أعمل مع ناقل لا أعرف شيئًا عنه على الإطلاق ، فهذا يمثل مشكلة كبيرة على العديد من المستويات.

آخر مرة كنت أعمل فيها مع شخص ما بلازميد ، حصلت على أنماط تقييد مختلفة عن التسلسل المتوقع ، وفي النهاية تم العثور على المتجه المعاد تجميعه منذ بضع سنوات ، دون أن يلاحظ أحد ، فقط لأنه لم يقم أحد بفحصه. التسلسل الذي أرسلوه لم يكن مناسبًا.
لذا ، إذا كنت تقدر عملك ، فقط ارفض العمل بالبلازميد إلا إذا أعطاك أحدهم معلومات عنه.

في غضون ذلك ، يمكنك استخدام معلومات احتياطية على جزء من التسلسل لتصميم منتج PCR للتحقق منه. هل يحتوي المتجه على نوع من الإدخال المحدد الذي تعرفه؟ يمكنك استخدام التمهيدي في إدراج المعرفة وبعض التمهيدي على مواقع المتجهات المعتادة - المروج التمهيدي ، M13 & # 160primers ، أي شيء للتحقق من إدخالك في العمود الفقري للناقل.

ولكن كما قلت ، إذا كان من المفترض أن يكون للناقل بعض الميزات الأخرى غير مقاومة المضادات الحيوية ، فلا يمكنك التأكد من أنها تحتوي عليها جميعًا بشكل جيد ، إلا إذا قمت بوضع عدة قيود على الأقل.

لا أشك فيك يا ميج ، لكن هل أنت متأكد من أن الاسم ليس pCAGGs .. هذا هو العمود الفقري البلازميدي الأكثر شيوعًا. على أي حال ، وإلا كنت سأستمع إلى ما قاله تروف.


معمل: التناضح عبر غشاء شبه منفذ

التنافذ هو انتشار الماء من تركيز عالٍ إلى تركيز منخفض. عندما تشرب الماء ، يكون تركيز الماء في خلاياك أقل من تركيز الماء في الجهاز الهضمي. لذلك يتدفق الماء عبر غشاء الخلية (من التركيز العالي إلى التركيز المنخفض) لخلاياك لترطيبك. العطش هو طريقة أجسامنا للحفاظ على توازن الماء الأسموزي. في هذا التوازن ، يدخل الماء إلى الخلية في الأساس بنفس معدل خروجها من الخلية ، ويقال إن الخلية موجودة في مساوي التوتر الدولة (الشكل 5 ب). إذا كنت تشرب الكثير من الماء ، فإن تركيز الماء يكون أعلى بكثير على السطح الخارجي لخلاياك ويدخل إلى الخلية مما يؤدي إلى تمددها ، ويقال إنه في نقص الضغط الدولة (الشكل 5 ج). هذا أمر نادر الحدوث عند البشر ، ولكنه يحدث بشكل أكثر شيوعًا في الرياضيين الذين يمارسون رياضة التحمل الذين يستهلكون كمية من الماء أكثر مما يحتاجه الجسم للحفاظ على التوازن التناضحي. يمكن أن يخرج الماء أيضًا من الخلية بكميات أكبر من الماء الذي يدخله ، مما يؤدي إلى تقلصها في حالة تعرف باسم a مفرط التوتر الدولة (الشكل 5 أ). نرى هذا في النباتات التي لم تحصل على سقي كافٍ. عندما يحدث هذا ، ينتقل الماء من التركيز العالي داخل الخلية إلى التركيزات الأقل خارج الخلية. يؤدي هذا إلى تقلص خلايا النبات وذبول النبات.

الظروف التناضحية للخلايا. أ) إذا فقدت الخلايا كمية من الماء أكثر مما تمتصه ، فإنها تكون في حالة فرط التوتر. ب) الخلايا التي تحافظ على التوازن التناضحي تكون متساوية التوتر. ج) إذا كان هناك تركيز أعلى من الماء خارج الخلية ، فسوف تمتص الخلية كمية من الماء أكثر مما تطلقه ، مما يؤدي إلى حالة نقص التوتر.


شاهد الفيديو: ش4 سباق المفاريد الصيفي التمهيدي السادس صباح 21-7-2018 (ديسمبر 2022).