معلومة

5.3: تقنيات قياس Bing - علم الأحياء

5.3: تقنيات قياس Bing - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

التحليلات التجريبية للالتزام

غالبًا ما يكون من المهم تحديد Kd لمجمع ML ، نظرًا لهذا العدد وتركيزات M و L في النظام ، يمكننا التنبؤ بما إذا كان M مرتبطًا أم لا تحت ظروف فسيولوجية. مرة أخرى ، هذا مهم لأن M ملزم أو إرادة حرة تحكم نشاطه. الحيلة في تحديد Kd هي تحديد ML و L عند التوازن. كيف يمكننا التفريق بين الخالي من الترابط المربوط؟ التقنيات التالية تسمح بهذا التمييز.

التقنيات التي تتطلب فصل الالتزام عن الأراضي الحرة -

يجب توخي الحذر لضمان عدم تغيير توازن M + L <==> ML أثناء تقنية الفصل.

- كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي - أضف M إلى تركيز معين من L. ثم أزل الخليط على عمود ترشيح هلامي ، مع التصفية التتابعية باستخدام الترابط الحر بنفس التركيز. سيتم إزالة مجمع ML أولاً ويمكن قياسه. إذا قمت بقياس الترابط الحر الخارج من العمود ، فسيكون ثابتًا بعد مزيلات ML باستثناء غمس واحد بالقرب من المكان الذي سيتم فيه إزالة L الحرة إذا تمت إزالة العمود بدون L الحرة في محلول المخزن المؤقت. يمثل هذا الانخفاض مقدار الترابط المرتبط بـ M.


- الترشيح الغشائي - أضف M إلى L المشع إشعاعيًا ، وقم بالتوازن ، ثم قم بالتصفية من خلال مرشح يربط M و ML. على سبيل المثال ، غشاء النيتروسليلوز يربط البروتينات بشكل لا رجعة فيه. تحديد كمية العلامة الإشعاعية L على الغشاء والتي تساوي [ML].


- الترسيب - أضف عامل ترسيب مثل كبريتات الأمونيوم ، الذي يترسب البروتينات وبالتالي كلا M و ML. تحديد كمية ML.

التقنيات التي لا تتطلب فصل الحدود عن الأراضي الحرة

- غسيل الكلى المتزن - ضع M في كيس غسيل الكلى وقم بغسيل الكلى مقابل محلول يحتوي على يجند يمكن تحديد تركيزه باستخدام تقنيات النظائر المشعة أو التحليل الطيفي. عند التوازن ، حدد L الحر بأخذ عينات من المحلول المحيط بالكيس. من خلال توازن الكتلة ، حدد مقدار الترابط المرتبط ، والذي يعطي ML في 1: 1 قياس العناصر المتكافئ. كرر في العديد من تركيزات يجند مختلفة

- التحليل الطيفي - ابحث عن يجند يتغير أطياف امتصاصه أو مضانه عند ارتباطه بـ M.

- قياس مسعر المعايرة متساوي الحرارة (ITC) - في مركز التجارة الدولية ، يتم حقن محلول عالي التركيز من المادة التحليلية (يجند) في خلية تحتوي على محلول شريك ملزم (عادةً جزيء ضخم مثل البروتين والحمض النووي والحويصلة).

الشكل: خلايا مسعر المعايرة الحرارية المتساوية

عند الارتباط ، يتم إطلاق الحرارة (تفاعل طارد للحرارة) أو يتم امتصاصها ، مما يتسبب في تغيرات طفيفة في درجة الحرارة في خلية العينة مقارنة بالخلايا المرجعية التي تحتوي فقط على محلول عازل. تقيس المزدوجات الحرارية الحساسة فرق درجة الحرارة (DT1) بين العينة والخلايا المرجعية وتطبق تيارًا للحفاظ على الفرق عند قيمة ثابتة. يتم إجراء حقن متعددة حتى يتم تشبع الجزيئات الكبيرة بالرابط. يتناسب تغيير المحتوى الحراري بشكل مباشر مع كمية الترابط المرتبط في كل حقنة ، لذا فإن الإشارة المرصودة تخفف مع مرور الوقت. يجب تصحيح التغير الفعلي في المحتوى الحراري الملحوظ من أجل التغيير في المحتوى الحراري عند التخفيف البسيط للرابط إلى محلول عازل وحده ، ويتم تحديده في تجربة منفصلة. يجب أن تكون التغييرات في المحتوى الحراري التي لوحظت بعد تشبع الجزيء الكبير بالرابط هي نفسها المحتوى الحراري لتخفيف اللجند. منحنى ملزم يظهر تغير المحتوى الحراري كدالة للنسبة المولية للرابط إلى شريك الربط (Lo / Mo إذا Lo >> Mo) ثم يتم تحليله رياضيًا لتحديد Kd والقياس المتكافئ للربط.

الشكل: بيانات قياس السعرات الحرارية النموذجية وتحليلها

المرجع: http://www.microcalorimetry.com/index.php؟id=312

يجب أن يكون واضحًا في المثال أعلاه ، أن التفاعل الملزم طارد للحرارة. ولكن لماذا الرسم البياني لنسبة ΔH مقابل النسبة المولية لـ Lo / Mo sigmoidal (على شكل s) وليس الزائدية؟ يأتي أحد الأدلة من حقيقة أن النسبة المولية للليغند (المعايرة) إلى الجزيء الكبير تتركز حول 1 ، كما هو موضح أعلاه ، عندما لا تكون Lo >> Mo ، قد لا يكون الرسم البياني قطعيًا. توضح الرسوم البيانية أدناه مثالًا محددًا لـ Kd و Ho التي يتم حسابها من بيانات قياس المسعرات المعايرة بالتحليل الحجمي. سوف يسلطون الضوء على سبب كون الرسم البياني لـ ΔH مقابل النسبة المولية لـ Lo / Mo هو السيني.

مثال محدد يوضح هذه الأفكار. تم وضع نسخ قابلة للذوبان من بروتين الغشاء الفيروسي لفيروس نقص المناعة البشرية ، gp 120 ، 4 ميكرومتر ، في خلية قياس السعرات الحرارية ، وتم وضع شكل قابل للذوبان من الربيطة الطبيعية ، CD4 ، وهو بروتين مستقبل غشائي من الخلايا التائية المساعدة ، حقنة ومعايرتها في خلية (Myszka وآخرون 2000). تم تحديد التغييرات / الحقن في المحتوى الحراري وتم تحويل البيانات وتناسبها مع معادلة توضح ΔH "تم تطبيعه مع عدد مولات يجند (CH4) المحقون في كل خطوة". يعتبر الخط المناسب للبيانات الموجودة في تلك اللوحة هو أفضل خط ملائم بافتراض وجود مقياس متكافئ 1: 1 لـ CD4 ("ligand") إلى gp 120 ("الجزيء الكبير") و Kd = 190 نانومتر. يرجى ملاحظة أن المنحنى سيني وليس زائدي.

الشكل: تحديد مقياس معايرة المعايرة من Kd و DH لتفاعل gp120 و CD4

لاحظ أنه يمكن تحديد القياس المتكافئ للربط (n) و KD و ΔHo في تجربة واحدة. من قيمة ΔHo و KD والعلاقة ΔGo = -RTlnKeq = RTlnKD = ΔHo - TΔ لذلك ، يمكن حساب قيم Go و Δ So. لا حاجة لفصل الالتزام عن الحر. تم حساب تغييرات المحتوى الحراري عند الارتباط لتكون -62 كيلو كالوري / مول.

باستخدام معادلات الربط القياسية (5 و 7 و 10 أعلاه) لحساب L و ML مجانًا بتراكيز مختلفة من Lo ونسب R = Lo / Mo ، يمكن اشتقاق سلسلة من المؤامرات. تم عرض اثنين في وقت سابق في قسم الفصل هذا لتوضيح الاختلافات في Y مقابل L و Y مقابل Lo عندما لا تكون Lo >> Mo. وهي معروضة مرة أخرى أدناه:

الشكل: Y vs L و Y vs Lo عندما لا تكون Lo >> Mo

بعد ذلك ، تم عمل مخطط ML مقابل R (= [Lo] / [Mo] (أدناه ، اللوحة A1 اليمنى). يظهر هذا المنحنى زائديًا ولكن له نفس الشكل مثل الرسم البياني Y مقابل Lo أعلاه (على اليمين). ولكن إذا كان يتم رسم كمية الترابط المرتبطة في كل حقنة (محسوبة بطرح [ML] للحقن i + 1 من [ML] للحقن i) مقابل R (= [Lo] / [Mo]) ، منحنى سيني (أدناه ، اللوحة A2 ، يسار) ، والذي يشبه الرسم البياني الأنسب لتحديد المحتوى الحراري أعلاه تجريبيًا. يظهر التغير النسبي في المحتوى الحراري لكل حقنة باللون الأحمر. لاحظ أن الرسم البياني في A2 يظهر فعليًا القيمة السالبة لمقدار الترابط المرتبط لكل حقنة ، اجعل الرسم البياني يبدو على الرسم البياني الذي يوضح تتبع قياس المسعر المعايرة الفعلية والملاءمة أعلاه.

الشكل: منحنيات ملزمة تشرح بيانات قياس معايرة السيني للمعايرة السينية لـ gp120 و CD4


رنين سطح البلازمون

هناك تقنية جديدة لقياس الارتباط تسمى رنين البلازمون السطحي (SPR) باستخدام شريحة مستشعر تتكون من طبقة 50 نانومتر من الذهب على سطح زجاجي. ثم يتم إضافة مصفوفة الكربوهيدرات إلى سطح الذهب. يتم إرفاق جزيء ضخم إلى مصفوفة CHO من خلال الكيمياء التساهمية التي تحتوي على موقع ربط ليجند. يجب ألا يتم التشويش على موقع الربط على الجزيء الكبير إلى حد كبير. يتدفق سائل يحتوي على مادة الترابط على سطح الربط.

يتكون نظام الكشف من شعاع ضوئي يمر عبر منشور أعلى الطبقة الزجاجية. ينعكس الضوء تمامًا ، لكن عنصرًا آخر من الموجة يسمى الموجة الزائلة ، يمر إلى الطبقة الذهبية ، حيث يمكنه إثارة إلكترونات Au. إذا تم اختيار الطول الموجي والزاوية الصحيحين ، يتم إنتاج موجة طنين من الإلكترونات المثارة (رنين مأكل) على سطح الذهب ، مما يقلل من الكثافة الكلية للموجة المنعكسة. زاوية SPR حساسة للطبقات المرتبطة بالذهب. يكفي ارتباط وتفكك الترابط لتغيير زاوية SPR ، كما هو موضح في الشكل أدناه. (علم ، 295 ، ص 2103 (2002))

التين: رنين سطح البلازمون

الرسوم المتحركة: الموجة الفائضة SPR

يمكن لهذه التقنية التمييز بين الارتباط / التفكك السريع والبطيء للروابط (كما ينعكس في معدلات التشغيل والإيقاف) واستخدامها لتحديد قيم Kd (من خلال قياس كمية رابطة الترابط عند تركيز إجمالي معين من الترابط أو بشكل غير مباشر من خلال تحديد كليهما كون وكوف.

قاعدة البيانات الملزمة: قاعدة بيانات لتقارب الارتباط المقاس ، مع التركيز بشكل أساسي على تفاعلات البروتين التي تعتبر أهدافًا للأدوية مع جزيئات صغيرة شبيهة بالعقاقير

PDBBind-CN: مجموعة شاملة من بيانات تقارب الربط المقاسة تجريبياً لجميع أنواع المجمعات الجزيئية الحيوية المودعة في بنك بيانات البروتين (PDB).

تقاربات ملزمة شديدة

تم الإبلاغ مؤخرًا عن تفاعل ارتباط ضيق بشكل لا يصدق لربط Cu1 + ببروتين CueR من E. Coli. عادةً ما يتم الاحتفاظ بأيونات Cu1 + بتركيز منخفض جدًا في الخلايا كآلية لمنع السمية. ومع ذلك ، فإن بعض الإنزيمات تتطلب النحاس. يجب أن تكون أيونات النحاس الحرة موجودة في الخلية للسماح بالارتباط بالمواقع المناسبة في البروتينات. كيف يتم تنظيم هذه المخاوف المتنافسة في الخلية؟ يبلغ إجمالي تركيز النحاس في E. Coli حوالي 10 ميكرومتر (10000 نانومتر) ، والذي ، نظرًا لصغر حجم البكتيريا ، يمثل حوالي 10000 أيون نحاسي لكل خلية.

طورت الخلايا العديد من الآليات للتحكم في أيونات النحاس وتوصيلها. يمكن توصيل أيونات النحاس إلى البروتينات المستهدفة عن طريق مرافقي النحاس (نظائر بروتينات المرافقة التي توجه عملية طي البروتين). يبدو أن CueR في E. Coli ينظم التعبير الناجم عن النحاس للجينات المشاركة في الكيمياء الحيوية للنحاس (بما في ذلك الإنزيم الذي يؤكسد Cu1 + إلى Cu2 + وهو أقل سمية). أحد الجينات المعينة التي يتم تنظيمها هو COPA. يزيد CueR من نسخ copA في وجود أيونات Cu و Ag و Au (معدن العملات المعدنية). Changela et al. طور اختبارًا في المختبر يحدد مدى التعبير عن الجينات الخاضعة للتنظيم CueR ، تحت مجموعة متنوعة من أنواع وتركيزات الأيونات. في الاختبار ، تمت إضافة CueR المنقى إلى بنية الجينات التي تحتوي على المروج (قسم من الحمض النووي على الفور في بداية موقع بدء الجين حيث يرتبط RNA polymerase) لـ copA. في البداية ، اكتشفوا أن النسخ كان دائمًا حتى في وجود الليجند ، الجلوتاثيون ، الذي يربط Cu1 + بشدة ويجب أن يحافظ على مستويات Cu1 + المجانية منخفضة جدًا. لقد تحولوا إلى منسق ربط أكثر إحكامًا ، وهو السيانيد (CN-) ، لتقليل مستويات Cu1 + إلى مستويات أقل. أوقفت المستويات العالية للغاية من CN- (مليمولار) التنشيط النسخي ، ولكن إذا تمت إضافة Cu1 + إضافي ، فقد تبع ذلك التنشيط ، مما يشير إلى أن ارتباط النحاس بالبروتين كان قابلاً للعكس. عند 1 ملي مولار CN- ، زاد النسخ مع إضافة أيونات النحاس حتى تركيز إجمالي Cu1 + يبلغ 60 ميكرومتر. في ظل هذه الظروف ، كانت تركيزات Cu1 + أقل بكثير. نظرًا لوجود تركيزات CN- المستخدمة ، حدث التنشيط نصف الأقصى عند تركيز TOTAL Cu1 + 0.7 ميكرومتر. لوحظ تنشيط مماثل بواسطة Ag1 + و Au1 + ، ولكن ليس بواسطة Zn و Hg أيونات ، مما يدل على خصوصية الكاتيونات أحادية التكافؤ على الكاتيونات ثنائية التكافؤ.

بمعرفة pKa لـ HCN ، ثوابت الاستقرار لـ Cu1 +: مركبات CN- ، وتركيزات CN- ، أنتج Changela et al سلسلة من الحلول المخزنة مؤقتًا في Cu1 + المجاني الذي يمتد من 10-18 إلى 10-23 M (درجة الحموضة 8.0). (على سبيل المثال ، سجل ثابت الربط β ، logβ ، لـ Cu1 + + 2CN- <==> [Cu (CN) 2] - هو 21.7. لقد قمت بحل مشاكل مثل هذه التي تتضمن توازنًا مرتبطًا إذا كنت قد أخذت كيمياء تحليلية .) كان تركيز Cu1 + الحر عند التنشيط نصف الأقصى لنسخ مراسل الجينات ، وهو مقياس لثابت التفكك Kd ، حوالي 1 × 10-21 م (زيبتومولار)! افترض الآن أن حجم محتويات خلية E. Coli هو 1.5 × 10-15 لتر. إذا كان هناك أيون واحد فقط من Cu1 + في الخلية ، فسيكون تركيزها 10-9 م. وتشير القيم إلى أن هناك لا يوجد أيونات Cu1 + مجانية في الخلية ، وأن أيون واحد فقط من النحاس + 1 في الخلية يكفي لضمان ارتباطه بـ CueR والتفعيل النسخي اللاحق لـ copA.

جمول:تم تحديث شكل Cu (I) من E. Coli Cuer ، منظم تدفق نحاسي Jmol14 (جافا) | JSMol (HTML5)

من الضروري للبقاء على قيد الحياة أن تحصل الخلايا البكتيرية على المعدن المناسب للبروتينات المعدنية. توضح مراجعة حديثة أجراها والدرون وروبنسون كيف. تمتلك الخلية العديد من الآليات لتقييد مواقع الربط المحددة حتى تتمكن المعادن من الوصول إلى البروتينات الصحيحة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب مراعاة الترتيب الطبيعي لاستقرار معقدات المعادن الانتقالية عند فهم الصلات المعدنية. يتم توفير هذا الاستقرار من خلال سلسلة Irving - William الموضحة أدناه (جنبًا إلى جنب مع أيونات المعادن من المجموعة 2A). الاتجاه يوازي حجم الموجبة (الانتقال من الأكبر إلى الأصغر):

Mn2 + Zn2 + (الربط الأكثر إحكامًا)

  • تسمح قدرة البروتين على تغيير شكله على ارتباط الترابط معادن مختلفة بالارتباط. على سبيل المثال ، يزداد الطلب على البكتيريا الزرقاء على النحاس والمنغنيز. يُسمح للمنغنيز بالارتباط أولاً ثم يُطوى البروتين ويصبح المنغنيز محاصرًا داخل البروتين. هذا المعدن غير المستقر للغاية الآن لا يمكن استبداله بالنحاس ، والذي عادة ما ينافس Mn2 + للموقع.
  • تساعد ناقلات المعادن في تنظيم عدد أيونات كل معدن في الخلية. أجهزة استشعار المعادن تحت سيطرة ناقلات المعادن هذه ، مما ينظم التعبير الجيني. بمجرد أن يكون لمعدن معين تركيز كافٍ للربط ، تستهدف المستشعرات المعدنية mRNA لقمع جينات معينة ووقف النسخ
  • يمكن أيضًا تنشيط إنزيم آخر لتصدير المعدن. من خلال تقييد تركيزات المعادن المتنافسة ، تظل مواقع الربط المعدني الأضعف متاحة
  • يمكن أن تساعد المستشعرات المعدنية أيضًا في تنظيم نوع البروتين الذي تستخدمه بعض المعادن بناءً على المتاح. على سبيل المثال ، تقوم الإشريكية القولونية بتحويل عملية التمثيل الغذائي لتقليل عدد البروتينات التي تتطلب الحديد والتي يتم التعبير عنها عندما يكون الحديد أقل وفرة
  • يتم توفير المعادن من خلال مسارات متعددة (في حالة عدم وجود إنزيم معين) ، ويتم "نقلها" إلى البروتين الصحيح من خلال العديد من تفاعلات تبادل الترابط.
  • تربط بعض الإنزيمات معادن معينة تسبب تغيرات توافقية تفضيلية. ومن ثم ، إذا جاء معدن يرتبط بشكل أكثر إحكامًا ولكن لا يفضله الإنزيم ، فلن يؤدي إلى تحفيز الإنزيم لأنه يرتبط بطريقة مختلفة

الأساس الجزيئي للتفاعلات عالية التقارب

ما الذي يميز الارتباط العالي والمنخفض على المستوى الجزيئي؟ هل التفاعلات عالية التقارب لها الكثير من روابط H داخل الجزيئية ، أو جسور الملح ، أو تفاعلات فان دير فال ، أو التفاعلات الكارهة للماء أكثر أهمية؟ في الآونة الأخيرة ، تم تحديد الهياكل البلورية لمجموعة متنوعة من معقدات البروتين والأجسام المضادة من أجل دراسة أساس نضج تقارب جزيئات الجسم المضاد. من المعروف جيدًا أن الأجسام المضادة التي يتم إنتاجها عند التعرض لجزيء غريب (مستضد) تكون في البداية ذات ألفة أقل من الأجسام المضادة التي يتم إطلاقها لاحقًا في الاستجابة المناعية. يمكن إنتاج عدد لا يُصدق من الأجسام المضادة المختلفة بواسطة الخلايا البائية المنتجة للأجسام المضادة بسبب الآليات الجينية (الجمع بين مناطق مختلفة مختلفة من جينات الجسم المضاد من خلال التضفير ، والتضفير غير الدقيق ، والطفرات المفرطة للنيوكليوتيدات الحرجة في جينات مناطق ربط مولد الضد للأجسام المضادة). يتم اختيار استنساخ الخلايا المنتجة للأجسام المضادة ذات الألفة العالية من خلال الارتباط والتوسع النسيلي لهذه الخلايا. درس الباحثون التركيب البلوري لأربعة أجسام مضادة مختلفة مرتبطة بالموقع نفسه (الحاتمة) على بروتين ليزوزيم مستضد البروتين. ارتبطت زيادة التقارب مع زيادة مساحة السطح القطبية المدفونة وليس مع زيادة أعداد روابط H أو جسور الملح.

الجدول: خصائص الجسم المضاد: مجمعات Hen Egg ليسوزيم (HEL)

الجسم المضادH26-HELH63-HELH10-HELH8-HEL
Kd (نانومتر)7.143.600.3130.200
التفاعلات بين الجزيئات
سندات H.24252023
اتصالات VDW159144134153
جسور الملح1111

المساحة المدفونة

ΔASURF (A2)1,8121,8251,8241,872
ΔASURF قطبي (A2)1,1491,1011,0751,052
ΔASURF-apolar (A2)663724749820

لي ، واي. وآخرون. الطبيعة: علم الأحياء الإنشائي. 6 ، ص 484 (2003)

لا تزال التفاعلات الكهروستاتيكية بين الجزيئات البيولوجية تفاعلات مهمة للغاية ، على الرغم من أننا قد نعتبرها غير محددة. شاهد تفاعل بروتينات ربط الحمض النووي مع المجالات الإيجابية مع polyanion السالب ، DNA. ستكون المواجهة الأولية إلكتروستاتيكية في الأصل ومن الواضح أنها مهمة لاستهداف البروتينات إلى الحمض النووي حيث قد تحدث تفاعلات محددة إضافية.

في مثال مشابه (Yeung ، T et al.) ، تم الإبلاغ مؤخرًا عن أن البروتينات المشحونة بشكل إيجابي معتدل يتم توجيهها إلى الجذور والليزوزوم من خلال التفاعلات مع فوسفاتيديل سيرين الغشائي سالب الشحنة (PS) ، في حين أن البروتينات المشحونة بشكل إيجابي أكثر تستهدف السطح الداخلي للـ غشاء البلازما ، المخصب في PS ومشتقات الفوسفاتيديل إينوزيتول الفوسفورية (PIP2 ، PIP3) ، كما هو موضح أدناه.

الشكل: الدهون الفوسفورية سالبة الشحنة في الأغشية البيولوجية

لدراسة هذا ، استخدموا مجال C2 من اللاكتاديرين (Lact-C2) من الحليب الذي يربط PS في وجود الكالسيوم. تم ربط مجال C2 تساهميًا بالبروتين الفلوري الأخضر ، وهو بروتين يحتوي على فلوروفور داخلي يتكون من ثلاثة أحماض أمينية (Ser65 - Tyr66 - Gly67) والتي تدور تلقائيًا عند الطي لإنتاج فلوروفور ينبعث منه الضوء الأخضر. تم إدخال جين اندماج من Lact-C2 و GFP في النوع البري (WT) والخميرة الطافرة التي تفتقر إلى PS. كان مرتبطًا بالنشرة الداخلية في خلايا WT والحويصلات الداخلية والجسيمية ، ولكنه وجد منتشرًا من خلال السيتوبلازم في الخلايا الطافرة. وصنعوا أيضًا مجسات كاتيونية بذيول فارنيسيل مثبتة والتي يمكن أن تثبت المجسات القابلة للذوبان في الأغشية. تم تجنيد المجسات الأكثر شحنة موجبة في النشرة الداخلية لغشاء البلازما ، بينما تم تجنيد المجسات الأقل شحنة للحويصلات الداخلية. يتكهن المؤلفون بأن PS على طبقات الأغشية السيتوبلازمية يمكن أن تستهدف بروتينات تحويل الإشارة إلى هذه المناطق.

الأجسام المضادة ذات التقارب اللانهائي. شمورا وآخرون PNAS. 98 ، الصفحة 8480 (1998)

لرسو السفن

الأساليب الكمية الموصوفة أعلاه لا توضح آلية الربط. تم تطوير برامج الكمبيوتر التي تسمح بإرساء يجند (جزيء صغير أو حتى بروتين آخر) لبروتين آخر. يمكن نمذجة الإرساء التلقائي للروابط المرنة للبروتينات باستخدام Autodock. يحتوي AutoDock على البرامج التالية:

  1. يقوم AutoDock بإرساء الرابط إلى مجموعة من الشبكات التي تصف البروتين المستهدف ؛

  2. تقوم AutoGrid بحساب هذه الشبكات مسبقًا ؛

  3. يقوم AutoTors بإعداد الروابط التي سيتم التعامل معها على أنها قابلة للتدوير في الترابط.

شبكة لرسو السفن الجزيئية

يمكن أيضًا استخدام محاكاة الديناميكيات الجزيئية لدراسة عمليات الربط وفك الارتباط الفعلية.

الزنزانة المزدحمة

يتم إجراء معظم دراسات الارتباط في المختبر بتركيزات مخففة لكل من الجزيء الكبير والليغند.هل هذه الظروف لامعة بالظروف داخل الزنزانة؟ الجواب لا! الخلايا مزدحمة للغاية بالعضيات ، والمجمعات الجزيئية ، ومكونات الهيكل الخلوي التي توفر بنية داخلية للخلية ، وما إلى ذلك. تم تقدير التركيز الكلي للجزيء الكبير في الخلية بما يصل إلى 400 جم / 1 لتر = 400 جم / 1000 مل = 0.4 جم / مل = 400 مجم / مل. حاول إذابة بروتين قابل للذوبان في الماء مثل الألبومين لتلك التركيزات! من 5 إلى 40 ٪ من الحجم الخلوي بأكمله مشغول بجزيئات كبيرة ، وفي النطاق العلوي ، توجد مساحة صغيرة جدًا للجزيئات الكبيرة الأخرى.


حاسبة الانحراف المعياري

يرجى تقديم أرقام مفصولة بفاصلة لحساب الانحراف المعياري والتباين والمتوسط ​​والمجموع وهامش الخطأ.

الانحراف المعياري في الإحصاء ، ويُشار إليه عادةً بـ σ، هو مقياس للتباين أو التشتت (يشير إلى مدى التوزيع للتمدد أو الضغط) بين القيم في مجموعة من البيانات. كلما انخفض الانحراف المعياري ، كلما اقتربت نقاط البيانات من المتوسط ​​(أو القيمة المتوقعة) ، & مو. على العكس من ذلك ، يشير الانحراف المعياري الأعلى إلى نطاق أوسع من القيم. على غرار المفاهيم الرياضية والإحصائية الأخرى ، هناك العديد من المواقف المختلفة التي يمكن فيها استخدام الانحراف المعياري ، وبالتالي العديد من المعادلات المختلفة. بالإضافة إلى التعبير عن التباين السكاني ، غالبًا ما يستخدم الانحراف المعياري أيضًا لقياس النتائج الإحصائية مثل هامش الخطأ. عند استخدامه بهذه الطريقة ، غالبًا ما يطلق على الانحراف المعياري الخطأ المعياري للمتوسط ​​، أو الخطأ المعياري للتقدير فيما يتعلق بالمتوسط. تحسب الآلة الحاسبة أعلاه الانحراف المعياري للمجتمع وعينة الانحراف المعياري ، بالإضافة إلى تقديرات فاصل الثقة التقريبية.

الانحراف المعياري السكان

الانحراف المعياري للمحتوى ، التعريف القياسي لـ σ، عندما يمكن قياس المحتوى بالكامل ، وهو الجذر التربيعي للتباين في مجموعة بيانات معينة. في الحالات التي يمكن فيها أخذ عينات لكل فرد من السكان ، يمكن استخدام المعادلة التالية للعثور على الانحراف المعياري للمجموعة بأكملها:

بالنسبة لأولئك الذين ليسوا على دراية بالتدوين الجمعي ، قد تبدو المعادلة أعلاه شاقة ، ولكن عند معالجتها من خلال مكوناتها الفردية ، فإن هذا الجمع ليس معقدًا بشكل خاص. ال أنا = 1 في التجميع يشير إلى مؤشر البداية ، أي لمجموعة البيانات 1 ، 3 ، 4 ، 7 ، 8 ، أنا = 1 سيكون 1 ، أنا = 2 سيكون 3 ، وهكذا. ومن ثم فإن تدوين الجمع يعني ببساطة تنفيذ عملية (xأنا - & مو 2) على كل قيمة من خلال ن، وهي في هذه الحالة 5 نظرًا لوجود 5 قيم في مجموعة البيانات هذه.

مثال: & مو = (1 + 3 + 4 + 7 + 8) / 5 = 4.6
& # 963 = & جذر [(1 - 4.6) 2 + (3 - 4.6) 2 +. + (8 - 4.6) 2)] / 5
& # 963 = & جذر (12.96 + 2.56 + 0.36 + 5.76 + 11.56) / 5 = 2.577

الانحراف المعياري للعينة

في كثير من الحالات ، لا يمكن أخذ عينة من كل فرد داخل مجتمع ما ، مما يتطلب تعديل المعادلة أعلاه بحيث يمكن قياس الانحراف المعياري من خلال عينة عشوائية من المجتمع محل الدراسة. مقدر مشترك ل σ هو الانحراف المعياري للعينة ، ويُشار إليه عادةً بـ س. من الجدير بالذكر أن هناك العديد من المعادلات المختلفة لحساب الانحراف المعياري للعينة لأنه على عكس متوسط ​​العينة ، لا يحتوي الانحراف المعياري للعينة على أي مقدر واحد غير متحيز وفعال وله أقصى احتمال. المعادلة الواردة أدناه هي "نموذج الانحراف المعياري المصحح". إنها نسخة مصححة من المعادلة التي تم الحصول عليها من تعديل معادلة الانحراف المعياري للمجتمع باستخدام حجم العينة كحجم السكان ، مما يزيل بعض التحيز في المعادلة. ومع ذلك ، فإن التقدير غير المتحيز للانحراف المعياري ينطوي على قدر كبير من الأهمية ويختلف باختلاف التوزيع. على هذا النحو ، فإن "الانحراف المعياري للعينة المصححة" هو المقدر الأكثر استخدامًا للانحراف المعياري للمجتمع ، ويشار إليه عمومًا على أنه ببساطة "الانحراف المعياري للعينة". إنه تقدير أفضل بكثير من نسخته غير المصححة ، ولكن لا يزال لديه تحيز كبير لأحجام العينات الصغيرة (N <10).

راجع قسم "الانحراف المعياري للمجموعة" للحصول على مثال حول كيفية التعامل مع عمليات الجمع. المعادلة هي نفسها بشكل أساسي باستثناء المصطلح N-1 في معادلة انحراف العينة المصححة ، واستخدام قيم العينة.

تطبيقات الانحراف المعياري

يستخدم الانحراف المعياري على نطاق واسع في الإعدادات التجريبية والصناعية لاختبار النماذج مقابل بيانات العالم الحقيقي. مثال على ذلك في التطبيقات الصناعية هو مراقبة الجودة لبعض المنتجات. يمكن استخدام الانحراف المعياري لحساب الحد الأدنى والحد الأقصى للقيمة التي يجب أن تقع ضمنها بعض جوانب المنتج في نسبة مئوية عالية من الوقت. في الحالات التي تقع فيها القيم خارج النطاق المحسوب ، قد يكون من الضروري إجراء تغييرات على عملية الإنتاج لضمان مراقبة الجودة.

يستخدم الانحراف المعياري أيضًا في الطقس لتحديد الاختلافات في المناخ الإقليمي. تخيل مدينتين ، واحدة على الساحل وأخرى عميقة في الداخل ، لهما نفس متوسط ​​درجة الحرارة 75 درجة فهرنهايت. في حين أن هذا قد يدفع إلى الاعتقاد بأن درجات الحرارة في هاتين المدينتين هي نفسها تقريبًا ، يمكن إخفاء الواقع إذا تم معالجة المتوسط ​​فقط وتجاهل الانحراف المعياري. تميل المدن الساحلية إلى الحصول على درجات حرارة أكثر استقرارًا بسبب التنظيم من قبل المسطحات المائية الكبيرة ، نظرًا لأن المياه تتمتع بسعة حرارية أعلى من الأرض بشكل أساسي ، وهذا يجعل المياه أقل عرضة للتغيرات في درجات الحرارة ، وتظل المناطق الساحلية أكثر دفئًا في الشتاء وأكثر برودة. في الصيف بسبب كمية الطاقة المطلوبة لتغيير درجة حرارة الماء. ومن ثم ، في حين أن المدينة الساحلية قد تتراوح درجات الحرارة فيها بين 60 درجة فهرنهايت و 85 درجة فهرنهايت خلال فترة زمنية معينة لتؤدي إلى متوسط ​​75 درجة فهرنهايت ، يمكن أن يكون للمدينة الداخلية درجات حرارة تتراوح من 30 درجة فهرنهايت إلى 110 درجة فهرنهايت للحصول على نفس المتوسط.

المجال الآخر الذي يستخدم فيه الانحراف المعياري إلى حد كبير هو التمويل ، حيث يستخدم غالبًا لقياس المخاطر المرتبطة بتقلبات الأسعار لبعض الأصول أو محفظة الأصول. يوفر استخدام الانحراف المعياري في هذه الحالات تقديرًا لعدم التأكد من العوائد المستقبلية على استثمار معين. على سبيل المثال ، عند مقارنة المخزون A الذي يبلغ متوسط ​​عائده 7٪ مع انحراف معياري 10٪ مقابل المخزون B ، والذي له نفس متوسط ​​العائد ولكن بانحراف معياري بنسبة 50٪ ، فمن الواضح أن المخزون الأول سيكون الخيار الأكثر أمانًا ، نظرًا لأن الانحراف المعياري للمخزون B أكبر بكثير ، لنفس العائد بالضبط. هذا لا يعني أن السهم A هو بالتأكيد خيار استثمار أفضل في هذا السيناريو ، لأن الانحراف المعياري يمكن أن يحرف المتوسط ​​في أي من الاتجاهين. في حين أن السهم أ لديه احتمال أعلى بمتوسط ​​عائد أقرب إلى 7٪ ، يمكن أن يوفر المخزون ب عائدًا (أو خسارة) أكبر بكثير.

هذه ليست سوى أمثلة قليلة لكيفية استخدام المرء للانحراف المعياري ، ولكن يوجد المزيد منها. بشكل عام ، يعد حساب الانحراف المعياري ذا قيمة في أي وقت يكون مطلوبًا فيه لمعرفة مدى البعد عن المتوسط ​​الذي يمكن أن تكون عليه القيمة النموذجية من التوزيع.


لأن الحساب لا يتطلب سوى الطول والوزن ، فإن مؤشر كتلة الجسم أداة غير مكلفة وسهلة. لمعرفة المعادلة بناءً على الكيلوجرامات والمتر أو الجنيهات والبوصة ، قم بزيارة كيف يتم حساب مؤشر كتلة الجسم؟

تشمل الطرق الأخرى لقياس دهون الجسم قياسات سمك ثنية الجلد (باستخدام الفرجار) ، والوزن تحت الماء ، والمعاوقة الكهربائية الحيوية ، وقياس امتصاص الأشعة السينية ثنائي الطاقة (DXA) ، والتخفيف النظيري 1،2،3. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب ليست متاحة دائمًا بسهولة ، وهي إما باهظة الثمن أو تحتاج إلى إجرائها من قبل موظفين مدربين تدريباً عالياً. علاوة على ذلك ، قد يكون من الصعب توحيد العديد من هذه الأساليب عبر المراقبين أو الآلات ، مما يعقد المقارنات عبر الدراسات والفترات الزمنية.


مساعدة في الكسور

الكسور

/ لإدخال جزء من النموذج 3/4. انقر فوق رقم ثم انقر فوق شريط الكسر ، ثم انقر فوق رقم آخر.

& # 8596 يمكنك استخدام زر مسافة الكسر لإنشاء رقم بالشكل 5 3/4. أدخل رقمًا ، ثم انقر فوق مساحة الكسر ، وانقر فوق رقم آخر ، ثم انقر فوق زر شريط الكسر ، وأخيرًا أدخل رقمًا آخر.

يعمل زر التنسيق العشري DEC FRA وزر تنسيق الكسر كزوج. عند اختيار أحدهما يتم إيقاف تشغيل الآخر.
يتم استخدام زر التنسيق العشري لجميع الأعمال العشرية. أيضًا لتغيير جزء من الشكل 3/4 إلى الرقم العشري 0.75 ، أو كسر من الشكل 7/4 أو رقم مختلط من الشكل 1 3/4 إلى الرقم العشري 1.75. انقر فوق زر التنسيق العشري ، وأدخل كسرًا أو رقمًا مختلطًا ، ثم انقر فوق يساوي. إذا كان الكسر أو الرقم المختلط جزءًا فقط من الحساب ، فاحذف النقر فوق يساوي واستمر في الحساب لكل معتاد. أي 3/4 DEC × 6 =.
يستخدم زر تنسيق الكسر للعمل مع جميع الكسور. أيضًا لتغيير رقم عشري من الشكل 0.5 إلى كسر 1/2 ، أو تغيير رقم عشري من الشكل 1.75 إلى رقم مختلط بالصيغة 1 3/4 أو إلى كسر 7/4 ، أو كسر من الصورة 7 / 4 إلى العدد الكسري 1 3/4. انقر فوق زر تنسيق الكسر ، وأدخل رقمًا عشريًا ، وانقر فوق يساوي ، ثم انقر فوق نموذج كسر ثم انقر فوق يساوي. إذا كان الكسر العشري جزءًا من عملية حسابية ، فتجاهل النقر فوق يساوي وتابع الحساب.

أ ب / ج أ + ب / ج زر الكسر المناسب وزر الكسر غير المناسب يعملان كزوج. عند اختيار أحدهما يتم إيقاف تشغيل الآخر.
يستخدم زر الكسر الصحيح لتغيير رقم من الشكل 9/5 إلى الشكل 1 4/5. الكسر المناسب هو كسر حيث يكون البسط (الرقم العلوي) أقل من المقام (الرقم السفلي).
يستخدم زر الكسر غير المناسب لتغيير رقم من الشكل 1 4/5 إلى الشكل 9/5. الكسر غير الفعلي هو كسر حيث البسط (الرقم العلوي أكبر من أو يساوي المقام (الرقم السفلي).


أنواع تقنيات تصوير الدماغ

تسمح تقنيات تصوير الدماغ للأطباء والباحثين بمشاهدة النشاط أو المشاكل داخل دماغ الإنسان ، دون جراحة أعصاب باضعة. هناك عدد من تقنيات التصوير الآمنة والمقبولة المستخدمة اليوم في منشآت البحث والمستشفيات في جميع أنحاء العالم.

التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي هو تقنية لقياس نشاط الدماغ. إنه يعمل عن طريق الكشف عن التغيرات في أكسجة الدم وتدفقه التي تحدث استجابة للنشاط العصبي - عندما تكون منطقة الدماغ أكثر نشاطًا تستهلك المزيد من الأكسجين ولتلبية هذا الطلب المتزايد ، يزداد تدفق الدم إلى المنطقة النشطة. يمكن استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي لإنتاج خرائط تنشيط توضح أجزاء الدماغ التي تشارك في عملية عقلية معينة.

يقوم التصوير المقطعي المحوسب (CT) ببناء صورة للدماغ بناءً على الامتصاص التفاضلي للأشعة السينية. أثناء الفحص بالتصوير المقطعي المحوسب ، يقع الموضوع على طاولة تنزلق داخل وخارج جهاز أسطواني أجوف. يركب مصدر الأشعة السينية على حلقة حول داخل الأنبوب ، مع توجيه شعاعها إلى رأس الأشخاص. بعد المرور عبر الرأس ، يتم أخذ عينات الشعاع بواسطة أحد أجهزة الكشف العديدة التي تبطن الآلة ومحيط rsquos. تعتمد الصور التي يتم التقاطها باستخدام الأشعة السينية على امتصاص الشعاع بواسطة الأنسجة التي تمر من خلالها. تمتص العظام والأنسجة الصلبة الأشعة السينية جيدًا ، ويمتص الهواء والماء القليل جدًا والأنسجة الرخوة في مكان ما بينهما. وبالتالي ، تكشف فحوصات التصوير المقطعي المحوسب الملامح الإجمالية للدماغ ولكنها لا تحل بنيته جيدًا.

يستخدم التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) كميات ضئيلة من المواد المشعة قصيرة العمر لرسم خريطة للعمليات الوظيفية في الدماغ. عندما تخضع المادة للاضمحلال الإشعاعي ، ينبعث البوزيترون ، والذي يمكن التقاطه بواسطة الكاشف. ترتبط مناطق النشاط الإشعاعي العالي بنشاط الدماغ.

تخطيط كهربية الدماغ (EEG) هو قياس النشاط الكهربائي للدماغ عن طريق التسجيل من الأقطاب الكهربائية الموضوعة على فروة الرأس. تُعرف الآثار الناتجة باسم مخطط كهربية الدماغ (EEG) وتمثل إشارة كهربائية من عدد كبير من الخلايا العصبية.

كثيرًا ما يستخدم مخطط كهربية الدماغ في التجريب لأن العملية غير جراحية لموضوع البحث. إن مخطط كهربية الدماغ قادر على اكتشاف التغيرات في النشاط الكهربائي في الدماغ على مستوى ملي ثانية. إنها إحدى التقنيات القليلة المتاحة التي تتمتع بمثل هذه الدقة الزمنية العالية.

تخطيط الدماغ المغناطيسي (MEG) هو تقنية تصوير تستخدم لقياس المجالات المغناطيسية التي ينتجها النشاط الكهربائي في الدماغ عبر أجهزة حساسة للغاية تعرف باسم الحبار. تستخدم هذه القياسات بشكل شائع في كل من الإعدادات البحثية والسريرية. هناك العديد من الاستخدامات لـ MEG ، بما في ذلك مساعدة الجراحين في تحديد موقع علم الأمراض ، ومساعدة الباحثين في تحديد وظيفة أجزاء مختلفة من الدماغ ، والارتجاع العصبي ، وغيرها.

يعد التحليل الطيفي القريب من الأشعة تحت الحمراء تقنية بصرية لقياس أكسجة الدم في الدماغ. إنه يعمل عن طريق تسليط الضوء في الجزء القريب من الأشعة تحت الحمراء من الطيف (700-900 نانومتر) عبر الجمجمة واكتشاف مقدار الضوء المعاد تخفيفه. يعتمد مقدار الضوء الذي يتم تخفيفه على أكسجة الدم ، وبالتالي يمكن أن توفر NIRS مقياسًا غير مباشر لنشاط الدماغ.


الفحص المجهري لنقل طاقة الرنين الفلوري (FRET)

يعد الموقع الدقيق وطبيعة التفاعلات بين أنواع جزيئية معينة في الخلايا الحية ذا أهمية كبيرة في العديد من مجالات البحث البيولوجي ، ولكن غالبًا ما يتم إعاقة التحقيقات بسبب الدقة المحدودة للأدوات المستخدمة لفحص هذه الظواهر. يتيح الفحص المجهري ذو المجال العريض التقليدي توطين الجزيئات ذات العلامات الفلورية ضمن حدود الدقة المكانية البصرية المحددة بواسطة معيار رايلي ، حوالي 200 نانومتر (0.2 ميكرومتر). ومع ذلك ، من أجل فهم التفاعلات الفيزيائية بين شركاء البروتين المشاركين في عملية جزيئية حيوية نموذجية ، يجب تحديد القرب النسبي للجزيئات بدقة أكبر مما تسمح به طرق التصوير الضوئي التقليدية المحدودة الانعراج. تقنية نقل طاقة الرنين الفلوري (يشار إليها بشكل أكثر شيوعًا بالاختصار أقلق) ، عند تطبيقه على الفحص المجهري البصري ، يسمح بتحديد النهج بين جزيئين ضمن عدة نانومترات (انظر الشكل 1) ، وهي مسافة قريبة بما يكفي لحدوث التفاعلات الجزيئية.

تعتمد تقنيات الفحص المجهري الفلورية النموذجية على امتصاص الفلوروفور للضوء عند طول موجي واحد (إثارة) ، متبوعًا بالانبعاث اللاحق للفلورة الثانوية بطول موجي أطول. غالبًا ما يتم فصل أطوال موجات الإثارة والانبعاثات عن بعضها بعشرات إلى مئات النانومترات. إن توسيم المكونات الخلوية ، مثل النوى ، والميتوكوندريا ، والهيكل الخلوي ، وجهاز جولجي ، والأغشية ، مع الفلوروفورات المحددة يتيح توطينها داخل المستحضرات الثابتة والمعيشية. من خلال وضع العلامات في وقت واحد على العديد من الهياكل الخلوية الفرعية ذات الفلوروفورات الفردية التي لها أطياف الإثارة والانبعاثات المنفصلة ، يمكن استخدام مجموعات مرشح التألق المتخصصة لفحص قرب الجزيئات المسمى داخل خلية واحدة أو قسم الأنسجة. باستخدام هذه التقنية ، يبدو أن الجزيئات الأقرب من بعضها البعض من حد الاستبانة الضوئية متزامنة ، وهذا القرب المكاني الواضح يعني أن الارتباط الجزيئي ممكن. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، فإن دقة المجهر الطبيعي المحدود الانعراج غير كافية لتحديد ما إذا كان التفاعل بين الجزيئات الحيوية يحدث بالفعل. نقل طاقة الرنين الفلوري هو عملية يتم من خلالها نقل الطاقة بدون إشعاع من حالة مثارة الفلوروفور إلى حامل صبغ ثانٍ على مقربة. نظرًا لأن النطاق الذي يمكن أن يحدث فيه نقل الطاقة يقتصر على ما يقرب من 10 نانومتر (100 أنجستروم) ، وكفاءة النقل حساسة للغاية لمسافة الفصل بين الفلوروفور ، يمكن أن تكون قياسات نقل طاقة الرنين أداة قيمة لسبر التفاعلات الجزيئية .

تتضمن آلية نقل طاقة الرنين الفلوري أ جهات مانحة فلوروفور في حالة إلكترونية مثارة ، والتي قد تنقل طاقة الإثارة إلى مكان قريب متقبل chromophore بطريقة غير إشعاعية من خلال تفاعلات ثنائية القطب طويلة المدى. تعتمد النظرية الداعمة لنقل الطاقة على مفهوم معالجة الفلوروفور المتحمس باعتباره ثنائي القطب المتذبذب الذي يمكن أن يخضع لتبادل الطاقة مع ثنائي القطب الثاني له تردد رنين مماثل. في هذا الصدد ، يعتبر نقل طاقة الرنين مماثلاً لسلوك المذبذبات المقترنة ، مثل زوج من الشوكات الرنانة التي تهتز بنفس التردد. في المقابل ، يتطلب نقل الطاقة الإشعاعية انبعاث الفوتون وإعادة امتصاصه ويعتمد على الأبعاد الفيزيائية والخصائص البصرية للعينة ، بالإضافة إلى هندسة الحاوية ومسارات واجهة الموجة. على عكس الآليات الإشعاعية ، يمكن أن ينتج عن نقل طاقة الرنين قدرًا كبيرًا من المعلومات الهيكلية المتعلقة بزوج المتبرع والمقبول.

لا يعتبر نقل طاقة الرنين حساسًا لغلاف المذيب المحيط بالفلوروفور ، وبالتالي ، ينتج معلومات جزيئية فريدة لتلك التي كشفت عنها الأحداث المعتمدة على المذيبات ، مثل التبريد بالفلور ، تفاعلات الحالة المثارة ، استرخاء المذيبات ، أو القياسات متباينة الخواص. التأثير الرئيسي للمذيبات على الفلور المتورط في نقل طاقة الرنين هو التأثير على الخصائص الطيفية للمانح والمستقبل. يحدث نقل الطاقة غير الإشعاعي على مسافات أطول بكثير من تأثيرات المذيبات قصيرة المدى ، والطبيعة العازلة للمكونات (المذيب والجزيء الكبير للمضيف) المتوضعة بين الفلوروفور المتضمنة لها تأثير ضئيل للغاية على فعالية نقل طاقة الرنين ، والتي تعتمد بشكل أساسي على المسافة بين المتبرع والمقبل الفلوروفور.

لا يتم التوسط في ظاهرة نقل طاقة الرنين الفلوري عن طريق انبعاث الفوتون ، وعلاوة على ذلك ، لا تتطلب حتى أن يكون حامل اللون متلألئًا. ومع ذلك ، في معظم التطبيقات ، يكون كل من المتبرع والمقبول مضيئًا ، ويتجلى حدوث نقل الطاقة من خلال إخماد مضان المتبرع وتقليل عمر التألق ، مصحوبًا أيضًا بزيادة في انبعاث الفلورة المستقبلة. تختلف كفاءة عملية نقل الطاقة بما يتناسب مع القوة السادسة العكسية للمسافة التي تفصل بين جزيئات المتبرع والمستقبل. وبالتالي ، يمكن استخدام قياسات الحنق على أنها فعالة المسطرة الجزيئية لتحديد المسافات بين الجزيئات الحيوية التي تحمل علامة الفلوروكروم المتبرع والمقبول المناسب عندما تكون في حدود 10 نانومتر من بعضها البعض.

يعرض الشكل 1 مثالًا افتراضيًا على نقل طاقة الرنين الفلوري بين اثنين من الفلوروكروميات متصلين بطرفين متقابلين من نفس البروتين الجزيئي. ، بعيدًا جدًا عن حدوث نقل طاقة الرنين داخل الجزيء بين الفلوروكرومات. ومع ذلك ، عندما يتم حث البروتين على الخضوع لتغيير توافقي (الشكل 1 (ب)) ، يتم تقريب الفلوروكروميتين معًا ويمكنهما الآن المشاركة في التفاعلات الجزيئية FRET.في الشكل ، يُشار إلى إثارة الفلوروكروم المتبرع من خلال توهج أزرق حول الجزيء العطري ثلاثي النواة الأصفر ، في حين يتم تمثيل انبعاث المستقبل المقابل (الشكل 1 (ب)) بتوهج أخضر يحيط بالفلوروكروم الحلقي غير المتجانس الثاني على اليمين - جانب من البروتين. غالبًا ما تُستخدم قياسات نقل الطاقة لتقدير المسافات بين المواقع على جزيء ضخم وتأثيرات التغييرات المطابقة على هذه المسافات. في هذا النوع من التجارب ، يتم استخدام درجة نقل الطاقة لحساب المسافة بين المتبرع والمستقبل والحصول على معلومات هيكلية حول الجزيء الكبير.

على الرغم من استخدام نقل طاقة الرنين الفلوري في كثير من الأحيان للتحقيق في التعديلات الهيكلية والوظيفية بين الجزيئات وداخل الجزيئات في البروتينات والدهون ، فإن العائق الرئيسي أمام تنفيذ تقنيات الفحص المجهري FRET في الخلايا الحية كان عدم وجود طرق مناسبة لوضع العلامات على بروتينات محددة داخل الخلايا مع الفلوروفور المناسب . استنساخ قنديل البحر بروتين الفلوريسنت الأخضر (GFP) وتعبيرها في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا أصبح مفتاحًا حاسمًا لتطوير علامات لكل من التعبير الجيني وتوطين البروتين الهيكلي في الخلايا الحية. تم تطوير العديد من متغيرات الطفرات الطيفية المتميزة للبروتين ، بما في ذلك البروتين الفلوري الذي ينبعث منه الضوء الأزرق (بروتين الفلورسنت الأزرق, BFP). يتم فصل كل من أطياف الإثارة والانبعاث لطفرات GFP و BFP بشكل كافٍ في الطول الموجي لتكون متوافقة مع نهج FRET. يوضح الشكل 2 استراتيجية الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين باستخدام نقل طاقة الرنين الفلوري والبروتينات الفلورية الطافرة. إذا كان هناك بروتينان ، أحدهما مُسمى بـ BFP (المتبرع) والآخر بـ GFP (المستقبِل) ، يتفاعل جسديًا ، عندئذٍ ستلاحظ زيادة الشدة عند الحد الأقصى للانبعاثات المستقبلة (510 نانومتر) عندما يكون المعقد متحمسًا عند أقصى طول موجي للامتصاص (380 نانومتر) من المتبرع. يؤدي فشل البروتينات في تكوين معقد إلى عدم انبعاث مضان متقبل (GFP).

إلى جانب التقدم في الليزر النبضي ، والبصريات المجهرية ، وتكنولوجيا التصوير المعتمدة على الكمبيوتر ، فإن تطوير تقنيات وضع العلامات التي يكون فيها الفلور المتبرع والمقبول جزءًا من الجزيئات الحيوية نفسها قد مكّن من تصور تفاعلات البروتين الديناميكية داخل الخلايا الحية. بالإضافة إلى التحقيق في تفاعلات شركاء البروتين ، تتضمن التطبيقات الحديثة لنقل طاقة الرنين الفلوري دراسات لنشاط الأنزيم البروتيني ، والتعديلات في إمكانات جهد الغشاء ، واستقلاب الكالسيوم ، وتوصيل فحوصات الفحص عالية الإنتاجية ، مثل القياس الكمي للتعبير الجيني في خلايا حية وحيدة.

مبادئ نقل طاقة الرنين الفلوري

عملية نقل طاقة الرنين (ريت) يمكن أن يحدث عندما ينقل حامل الفلور المتبرع في حالة مثارة إلكترونيًا طاقة الإثارة الخاصة به إلى حامل اللون القريب ، المتقبل. من حيث المبدأ ، إذا تداخل طيف الانبعاث الفلوري للجزيء المانح مع طيف الامتصاص لجزيء المستقبل ، وكان الاثنان ضمن نصف قطر مكاني أدنى ، يمكن للمانح نقل طاقة الإثارة مباشرة إلى المستقبل من خلال جزيئات ثنائية القطب طويلة المدى. اقتران. وصفت النظرية التي اقترحها ثيودور فورستر في أواخر الأربعينيات في البداية التفاعلات الجزيئية المتضمنة في نقل طاقة الرنين ، كما طور فورستر أيضًا معادلة رسمية تحدد العلاقة بين معدل النقل والمسافة بين الكروموفور والخصائص الطيفية للكروموفورات المعنية.

إن نقل طاقة الرنين هو عملية ميكانيكية كمومية غير إشعاعية لا تتطلب تصادمًا ولا تنطوي على إنتاج حرارة. عندما يحدث نقل الطاقة ، فإن الجزيء المستقبِل يروي تألق الجزيء المانح ، وإذا كان المستقبِل هو نفسه فلوروكروم ، فزاد أو حساس لوحظ انبعاث مضان (انظر الشكل 3). يمكن ملاحظة هذه الظاهرة عن طريق إثارة عينة تحتوي على كل من الجزيئات المانحة والمستقبلية مع ضوء أطوال موجية تقابل الحد الأقصى لامتصاص الفلوروفور المتبرع ، واكتشاف الضوء المنبعث عند الأطوال الموجية المتمركزة بالقرب من الحد الأقصى للانبعاث للمستقبل. طريقة الكشف البديلة ، التي تنمو بسرعة في شعبيتها ، هي قياس عمر التألق للفلوروفور المتبرع في وجود وغياب المتقبل.

يظهر في الشكل 3 مخطط جابلونسكي يوضح التحولات المزدوجة المتضمنة بين انبعاث المتبرع وامتصاص المستقبِل في نقل طاقة الرنين الفلوري. يتم تمثيل انتقالات الامتصاص والانبعاث بواسطة أسهم رأسية مستقيمة (خضراء وحمراء ، على التوالي) ، بينما يتم الإشارة إلى الاسترخاء الاهتزازي بواسطة أسهم صفراء متموجة. يتم رسم التحولات المقترنة بخطوط متقطعة تشير إلى موضعها الصحيح في مخطط جابلونسكي إذا كانت قد نشأت من التحولات الإلكترونية بوساطة الفوتون. في وجود متقبل مناسب ، يمكن أن ينقل الفلوروفور المتبرع طاقة الحالة المثارة مباشرة إلى المستقبل دون إصدار فوتون (موضح بسهم أزرق في الشكل 3). انبعاث الفلورة المحسّسة الناتجة لها خصائص مشابهة لطيف الانبعاث للمستقبل.

يجب استيفاء العديد من المعايير من أجل حدوث نقل طاقة الرنين. بالإضافة إلى أطياف الانبعاث والامتصاص المتداخلة للجزيئات المانحة والمقبلة ، يجب وضع الفلوروفوريين المعنيين في نطاق من 1 إلى 10 نانومتر من بعضهما البعض. كما هو موضح في المعادلات المشتقة من Förster (ونوقش أدناه) ، تقل كفاءة نقل الطاقة بين الجزيئات المانحة والمستقبلية باعتبارها القوة السادسة للمسافة التي تفصل بين الاثنين. وبالتالي ، فإن قدرة الفلوروفور المانح على نقل طاقة الإثارة الخاصة به إلى المستقبل عن طريق التفاعل غير الإشعاعي تتناقص بشكل حاد مع زيادة المسافة بين الجزيئات ، مما يحد من ظاهرة الحنق إلى أقصى نصف قطر للفصل بين المتبرعين والمتقبلين يبلغ حوالي 10 نانومتر. على مسافات أقل من 1 نانومتر ، هناك عدة طرق أخرى للطاقة و / أو نقل الإلكترون ممكنة. الاعتماد على المسافة لعملية نقل طاقة الرنين هو الأساس الأساسي لفائدتها في التحقيق في التفاعلات الجزيئية. في دراسات الخلايا الحية التي تتضمن الجزيئات الموصوفة بالمتبرع والمستقبل الفلوريس ، سيحدث نقل طاقة الرنين فقط بين الجزيئات القريبة بما يكفي للتفاعل بيولوجيًا مع بعضها البعض.

هناك مطلب إضافي لنقل طاقة الرنين وهو أن عمر التألق للجزيء المانح يجب أن يكون لمدة كافية للسماح بحدوث الحدث. كلا المعدل (ك (T)) والكفاءة (ه (ت)) من نقل الطاقة يرتبط ارتباطًا مباشرًا بعمر الفلوروفور المتبرع في وجود وغياب المتقبل. وفقًا لنظرية فورستر ، والتي تم التحقق منها تجريبيًا ، يتم إعطاء معدل نقل الطاقة من خلال المعادلة:

أين ص (0) هل مسافة حرجة فورستر, τ (د) هي عمر المتبرع في غياب المتقبل ، و ص هي المسافة التي تفصل بين المتبرعين والمتقبلين للكروموفور. مسافة فورستر الحرجة (ص (0)) يُعرَّف على أنه نصف قطر الفصل بين المتلقي والمتبرع الذي يساوي معدل التحويل فيه معدل تسوس المتبرع (إزالة الإثارة) في حالة عدم وجود متقبل. بمعنى آخر ، عندما يكون نصف قطر المتبرع والمقبول (ص) يساوي مسافة Förster ، فإن كفاءة التحويل تكون 50 بالمائة. في نصف قطر الفصل هذا ، يتم نقل نصف طاقة إثارة المتبرع إلى المستقبل عن طريق نقل طاقة الرنين ، بينما يتبدد النصف الآخر من خلال مجموعة من جميع العمليات المتاحة الأخرى ، بما في ذلك انبعاث التألق.

من الناحية المفاهيمية ، فإن مسافة Förster الحرجة هي أقصى طول للفصل بين الجزيئات المانحة والمستقبلية والتي يظل نقل طاقة الرنين تحتها. تقع قيمة المسافة الحرجة عادةً في نطاق من 2 إلى 6 نانومتر ، وهو أمر يعتمد على ترتيب العديد من الأبعاد الجزيئية للبروتين. بالإضافة إلى ذلك ، يتوافق نطاق المسافة الحرج أيضًا مع العديد من الأبعاد الأخرى المهمة بيولوجيًا ، مثل سماكة غشاء الخلية والمسافة الفاصلة بين المواقع على البروتينات التي تحتوي على وحدات فرعية متعددة. قيمة ال ص (0) (بالنانومتر) يمكن حسابها من التعبير التالي:

بحيث κ-مربع هو عامل يصف الاتجاه النسبي في الفضاء بين ثنائيات أقطاب المتبرع والمقبول ، ي (λ) هو جزء لا يتجزأ من التداخل في منطقة الانبعاث وأطياف الامتصاصية للمانح (مع الطول الموجي المعبر عنه بالنانومتر) ، η يمثل معامل الانكسار للوسط ، و س (د) هو العائد الكمي للمانح.

كفاءة نقل الطاقة ، ه (ت)، هو مقياس لكسر الفوتونات التي يمتصها المتبرع والتي يتم نقلها إلى المستقبل ، ويرتبط بمسافة الفصل بين المتبرع والمتقبل ، صبالمعادلة:

و ه (ت) يتم تقييمه على النحو التالي:

أين τ (DA) هو عمر المتبرع في وجود المتقبل و τ (د) هي عمر المتبرع في غياب المتقبل. لذلك ، من خلال قياس عمر المتبرع الفلوري في وجود وغياب متقبل (وهو ما يدل على مدى إخماد المتبرع بسبب المستقبِل) ، من الممكن تحديد المسافة الفاصلة بين الجزيئات المانحة والمقبلة. في العديد من التقنيات المطبقة بشكل شائع ، يتم تحديد كفاءة نقل الطاقة من خلال قياسات الحالة الثابتة لشدة التألق المتوسط ​​النسبي للمانحين في وجود وغياب المتقبل (وليس عن طريق قياس العمر).

باختصار ، يعتمد معدل نقل الطاقة على مدى التداخل الطيفي بين انبعاث المتبرع وأطياف امتصاص المتقبل (انظر الشكل 4) ، والعائد الكمي للمانح ، والتوجه النسبي للمانح والمقبول لحظات ثنائية القطب ، و المسافة التي تفصل بين الجزيئات المانحة والمستقبلية. سيؤثر أي حدث أو عملية تؤثر على المسافة بين المتبرع والمستقبل على معدل نقل طاقة الرنين ، وبالتالي السماح بتحديد الظاهرة ، بشرط أن يتم التحكم في القطع الأثرية أو القضاء عليها.

يظهر في الشكل 4 أطياف الامتصاص والانبعاث لبروتين الفلورسنت السماوي (CFP، المتبرع) والبروتين الأحمر الفلوري (طلب تقديم العروض أو DSRed، المتقبل) عند مقارنتها بتطبيقها المحتمل كزوج نقل طاقة رنين مضان. يتم توضيح أطياف الامتصاص لكل من الببتيدات البيولوجية على شكل منحنيات حمراء ، بينما يتم تقديم أطياف الانبعاث على شكل منحنيات زرقاء. يتم تمثيل منطقة التداخل بين أطياف الانبعاث والامتصاص للمانح بمنطقة رمادية بالقرب من قاعدة المنحنيات. كلما زاد التداخل الطيفي للجزيئات أكثر من اللازم ، تُعرف هذه الظاهرة باسم نزيف طيفي أو عبور يحدث حيث يتم الكشف عن إشارة من المستقبل المتحمس (الناشئة عن إضاءة الإثارة للمتبرع) وانبعاث المتبرع في قناة الانبعاث المستقبلة. والنتيجة هي إشارة خلفية عالية يجب استخلاصها من انبعاث مضان متقبل ضعيف.

تنطبق النظرية الأساسية لنقل الطاقة غير الإشعاعي بشكل مباشر على زوج متلقي-مانح مفصول بمسافة ثابتة ، وفي هذه الحالة يكون معدل نقل الطاقة دالة لمسافة فورستر ، ص (0)، والتي بدورها تعتمد على κ-مربع ، ي (λ), η، و س (د). إذا كانت هذه العوامل معروفة ، يمكن حساب المسافة بين المتبرع والمقبل. هناك حاجة إلى صيغ أكثر تعقيدًا لوصف مواقف مثل حاملات الكروموفورات المتعددة المستقبلة وتوزيعات المسافة. معروض في الجدول 1 عبارة عن سلسلة من مسافات فورستر الحرجة المقاسة تجريبياً ، والتي تم التأكد منها من التداخل الطيفي للعديد من أزواج الفلوروفور التي تقبل المتبرعين. نظرًا لأن المتغير يشمل العائد الكمي المتبرع ودرجة التداخل الطيفي ، وكلاهما يعتمد على الظروف البيئية المحلية ، يجب تحديد قيم مسافة Förster في ظل ظروف تجريبية مماثلة لتلك المستخدمة للتحقيق في نقل طاقة الرنين.

يُعرف معامل الانكسار لوسط نقل الطاقة عمومًا من تركيبة المذيب ، أو يمكن تقديره لجزيء كبير معين ، ويُؤخذ عادةً على أنه 1.4 في محلول مائي. يتم تحديد العائد الكمي للمانح من خلال المقارنة مع الفلوروفورات القياسية ذات العائد الكمي المعروف. لأن س (د) يظهر باعتباره الجذر السادس في حساب ص (0)، أخطاء صغيرة أو شكوك في قيمة س (د) ليس لها تأثير كبير على حساب مسافة فورستر. أيضًا بسبب اعتماد الجذر السادس ، ص (0) لا تتأثر إلى حد كبير بالاختلافات في ي (λ)، ولكن لا يزال يجب تقييم التكامل المتداخل لكل زوج من المتبرعين والمقبولين. بشكل عام ، ينتج عن درجات التداخل الأعلى بين طيف الانبعاث المتبرع وطيف الامتصاص المستقبلي قيم مسافة حرجة أكبر لـ Förster.

مسافة Förster الحرجة لأزواج المتبرعين والمقبولين المشتركين لـ RET
جهات مانحة مقبول مسافة فورستر (نانومتر)
تريبتوفان دانسيل 2.1
إيدانس (1) DDPM (2) 2.5 - 2.9
BFP DsRFP 3.1 - 3.3
دانسيل FITC 3.3 - 4.1
دانسيل أوكتاديسيلرودامين 4.3
CFP GFP 4.7 - 4.9
CF (3) تكساس ريد 5.1
فلوريسئين رباعي ميثيل رودامين 4.9 - 5.5
Cy3 Cy5 & GT5.0
GFP YFP 5.5 - 5.7
بوديبي فلوريدا (4) بوديبي فلوريدا (4) 5.7
رودامين 6G المسرطنة 6.1
FITC يوزين ثيوسيميكاربازيد 6.1 - 6.4
ب- فيكواريثرين Cy5 7.2
Cy5 Cy5.5 & GT8.0

(1) 5- (2-iodoacetylaminoethyl) أمينونافثالين -1-حمض السلفونيك
(2) N- (4-dimethylamino-3،5-dinitrophenyl) مالييميد
(3) carboxyfluorescein succinimidyl ester
(4) 4،4-difluoro-4-bora-3a، 4a-diaza-s-indacene

الجدول 1

عدم اليقين في تقييم عامل التوجه (κ-squared) على نطاق واسع في الأدبيات ، وعلى الرغم من الأدلة التجريبية على أن نظرية فورستر صالحة وقابلة للتطبيق على قياس المسافة ، فقد ظل هذا المتغير مثيرًا للجدل إلى حد ما. من المهم أن ندرك أن مسافات فورستر تُعطى عادةً للقيمة المفترضة κ-مربع ، وعادة ما تكون القيمة المتوسطة ديناميكيًا 2/3 (0.67). تنتج هذه القيمة المفترضة من التوزيع العشوائي لتوجيه المتبرع والمقبول عن طريق الانتشار الدوراني قبل نقل الطاقة. يعتمد عامل التوجيه على التوجهات النسبية في الفضاء لثنائي أقطاب الانبعاث المانح وثنائي أقطاب الامتصاص المستقبلي ، ويمكن أن يتراوح من صفر إلى 4. تتوافق القيمة 1 مع ثنائيات أقطاب انتقالية متوازية ، بينما تنتج القيمة 4 من ثنائيات أقطاب كلاهما متوازي وخطي.

نظرًا لعلاقة الجذر السادس بمسافة فورستر ، فإن التباين في عامل الاتجاه من 1 إلى 4 ينتج عنه تغيير بنسبة 26 بالمائة فقط في المسافة المحسوبة ، ويكون الحد الأقصى للخطأ ممكنًا بنسبة 35 بالمائة عندما تكون القيمة المفترضة عادةً 0.67 مطبق. ينتج أخطر خطأ محتمل إذا كانت ثنائيات الأقطاب متعامدة تمامًا مع بعضها البعض وما يقابلها κ- تصبح القيمة المربعة مساوية للصفر. تم استخدام العديد من التقنيات للتعامل مع عدم اليقين ، بما في ذلك افتراض وجود مجموعة من التوجهات الثابتة ولا تتغير خلال عمر الحالة المثارة للفلوروفور. يمكن أن تسمح قياسات تباين الخواص الفلورية للمانح والمقبول بتحديد حدود κالاختلاف المربع. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الفلوروفور مع استقطاب التألق المنخفض (بسبب الانبعاث من عدة انتقالات متداخلة) يقلل من عدم اليقين في عامل التوجيه. تحديد القيم المحتملة لـ κ-المربع بهذه الطريقة يقلل الخطأ المحتمل في حساب المسافة إلى ربما 10 بالمائة.

في كثير من الحالات ، يصعب تحديد عامل التوجيه ، إن لم يكن مستحيلًا ، وغالبًا ما تُعتبر القيمة الدقيقة للمتغير مشكلة لا يمكن التغلب عليها. ومع ذلك ، تشير بعض الأدلة إلى وجود قيود على أهمية العامل في حسابات تحويل طاقة الرنين. تدعم المقارنة بين مسافات المتبرع والمقبول باستخدام التحليل الطيفي لنقل طاقة الرنين وتقنيات حيود الأشعة السينية إلى حد كبير صحة افتراض قيمة 0.67 للعامل (على النحو الذي اقترحته نظرية فورستر) ، على الأقل بالنسبة للببتيدات الصغيرة والبروتينات. يوجد المزيد من عدم اليقين بالنسبة للبروتينات الأكبر حجمًا. يعد استخدام هذه القيمة لعامل التوجيه صالحًا في ظل افتراض أن كلا من تحقيقات المانحين والمقبولين يتمتعون بحرية الخضوع لحركة متناحرة غير مقيدة. يتم الحصول على مزيد من التبرير من الأدلة التجريبية على أنه بالنسبة للفلوروفورات المرتبطة برابطة مفردة أو مزدوجة للجزيئات الكبيرة ، تميل الحركات القطعية للمتبرع والمقبول إلى اتجاهات عشوائية ديناميكية.

بالنسبة للكرومات الفلورية المرتبطة بشكل غير محكم ، يجب أن تتيح الحركة الدورانية الحرة حول الروابط المفردة استخدام قيمة اتجاه متوسطة ، ولكن من المحتمل ألا تحدث الحركة غير المقيدة للجزيئات المرتبطة بمواقع الارتباط المتعددة. من ناحية أخرى ، القيم القصوى للصفر و 4 من أجل κ- المربع يتطلب استقطابًا مضانًا كاملًا للمانح والمقبول ، وهي حالة من غير المرجح أن تتحقق. تم تقديم حسابات إحصائية من قبل بعض الباحثين الذين يجادلون بمسافات توزيع المتبرعين والمقبولين وتوجهاتهم تحدد متوسط ​​المسافة المرصودة. شريطة أن يكون هناك بعض التوزيع في المسافة المرصودة (وهذا لا يقتصر على كون المتبرع والمقبول قريبين جدًا من ص (0)) ، يمكن الحصول على متوسط ​​المسافة بين الفلوروفور بشكل موثوق وعدم اليقين بسبب عامل التوجيه الذي تم تقييمه.

اعتماد عامل التوجه (κ-مربع) على الاتجاهات النسبية لثنائي أقطاب الانبعاث المانح وثنائي أقطاب الامتصاص المستقبلي (كما هو موضح في الشكل 5) تعطى المعادلة:

2 = (cos θT - 3cos θDcos θA) 2 = (sin D sin θAcos Φ - 2cos θDcos θA) 2

أين θ (T) هي الزاوية بين ثنائي أقطاب انتقال الانبعاث للمانح وثنائي أقطاب انتقال الامتصاص للمستقبل ، θ (د) و θ (أ) هي الزوايا بين هذه ثنائيات الأقطاب والناقل الذي يربط بين المتبرع والمقبل ، و Φ هي الزاوية بين المستويات التي تحتوي على ثنائيات أقطاب انتقالية.

تعد كفاءة نقل الطاقة أكثر حساسية لتغييرات المسافة عندما يقترب طول فصل المانحين والمتقبل من مسافة فورستر (ص (0)) للجزيئين. يوضح الشكل 6 العلاقة الأسية بين كفاءة النقل والمسافة التي تفصل بين المتبرع والمقبول. تزداد الكفاءة بسرعة إلى 100 بالمائة حيث تقل مسافة الفصل أدناه ص (0)، وعلى العكس من ذلك ، ينخفض ​​إلى الصفر عندما ص أكبر من ص (0). نظرًا للاعتماد القوي (القدرة السادسة) على كفاءة النقل على المسافة ، فإن قياسات مسافة الفصل بين المتبرع والمقبول يمكن الاعتماد عليها فقط عندما يقع نصف قطر المتبرع والمقبول ضمن مسافة Förster بمعامل اثنين. متي ص ما يقرب من 50 في المئة من ص (0)، فإن كفاءة نقل الطاقة بالرنين قريبة من الحد الأقصى ولا يمكن تحديد المسافات الأقصر بشكل موثوق. عندما تتجاوز مسافة المتلقي المانح ص (0) بقيمة 50 بالمائة ، يكون ميل المنحنى ضحلًا جدًا بحيث لا يتم حل مسافات الفصل الأطول.

تكمن الأهمية العملية لمعرفة مسافة Förster الحرجة في أن القيمة توفر دليلاً لنطاق مسافات الفصل التي يمكن تحديدها بواسطة FRET لزوج معين من المسابير (انظر الجدول 1). نظرًا لأن قياس نقل الطاقة حساس جدًا لتغير المسافة عندما تكون مسافات المتبرع والمستقبل قريبة من مسافة Förster ، فإن الأبعاد التقريبية للتفاعل الجزيئي المستهدف هي العامل الأكثر أهمية في اختيار زوج صبغة الفلورسنت. العوامل الأخرى التي يجب أخذها في الاعتبار ، اعتمادًا على ما إذا كانت قياسات الحالة المستقرة أو التي تم حلها بالوقت يتم إجراؤها ، تشمل الاستقرار الكيميائي ، والعائد الكمي ، وأعمار اضمحلال الفلوروفور. نظرًا لعدم وجود مرجع داخلي للمسافة لتقنيات نقل طاقة الرنين الفلورية الشائعة ، فإن المسافات المحسوبة عن طريق قياس كفاءات النقل ترتبط بمسافة فورستر ، والتي يتم اشتقاقها من البيانات الطيفية المقاسة على أزواج المتبرعين والمقبولين.

تعتبر ظاهرة نقل طاقة الرنين بواسطة آلية فورستر معقدة في بعض الجوانب ، ولكنها بسيطة ويمكن الاعتماد عليها في تأثيرها الناتج. يمكن التنبؤ بدقة بمسافات فورستر من الخصائص الطيفية للمانح والمقبول ، وبما أنه لم يتم تحديد أي استثناءات للنظرية حتى الآن ، يمكن افتراض أن نقل طاقة الرنين يحدث تحت أي ظروف تضع زوج الجزيء المتلقي للمانح على مقربة شديدة. ينشأ التعقيد في النظرية التي تصف النقل ثنائي القطب ، ليس بسبب آلية النقل نفسها ، ولكن بسبب حدوث توزيعات المسافة (بما في ذلك التوزيعات غير العشوائية) ، وانتشار الجزيئات المانحة والمستقبلية. عندما يتم اتخاذ خطوات لمتوسط ​​الاعتماد على المسافة لنقل الطاقة عبر مجموعة من الأشكال الهندسية والأطر الزمنية ، فإن FRET هي تقنية موثوقة لدراسة التوزيعات المكانية بين الجزيئات المتفاعلة.

تطبيق تقنيات الحنق في الفحص المجهري البصري

تختلف المعلمات التكوينية المجهرية لتحقيقات نقل طاقة الرنين الفلوري مع متطلبات الفلوروفور والعينة ووضع (أوضاع) التصوير ، ولكن يمكن تعديل أي مجهر قائم أو مقلوب تقريبًا من أجل الفحص المجهري FRET (انظر الشكل 7). بشكل عام ، يجب أن يكون المجهر مزودًا بنظام كاميرا CCD مبرد ومكثف عالي الدقة (12 بت) مقترنًا بمرشحات التداخل عالية الجودة التي تحتوي على مستويات منخفضة من الحديث المتبادل (الحد الأدنى لمستوى الحجب) ومناطق ممر النطاق تتوافق بشكل وثيق مع أطياف الفلوروفور. تحدد حساسية الكاشف مدى ضيق ممر نطاق المرشح ولا يزال يتيح الحصول على البيانات للمضي قدمًا بسرعات مقبولة مع حد أدنى من ضوضاء التسييل الطيفي. في معظم الحالات ، يجب استخدام مرآة مفردة ثنائية اللون مقترنة بعجلات أو منزلقات لمرشح الانبعاث والإثارة للحصول على صور لتقليل التحولات في الصورة أو التخلص منها.

يعاني مجهر وايدفيلد الفلوري من انبعاث فلوروفور ينشأ أعلى وأسفل المستوى البؤري لإنتاج صور ذات إشارة خارجة عن التركيز بشكل كبير تقلل التباين وتؤدي إلى تدهور الصورة. تتفاقم هذه المشكلة في الفحص المجهري FRET بسبب مستويات الإشارة المنخفضة بطبيعتها الناتجة عن نقل طاقة الرنين. يمكن أن تقترن تقنيات التفكيك الرقمي بالتقسيم البصري من أجل تقليل أو إزالة الإشارات بعيدًا عن المستوى البؤري ، ولكن العملية مكثفة من الناحية الحسابية وقد لا تكون سريعة بما يكفي للعديد من تجارب التصوير الديناميكي. يمكن تطبيق تقنيات المسح بالليزر المتحد البؤر على الفحص المجهري FRET لإنتاج تحسن كبير في الدقة الجانبية ، مع تمكين جمع المقاطع الضوئية التسلسلية على فترات تقترب من الوقت الحقيقي. العيب الرئيسي في الفحص المجهري متحد البؤر هو تقييد أطوال موجات الإثارة لخطوط الليزر القياسية المتاحة لنظام معين ، مما يقيد اختيار المتبرعين بالفلور وأزواج المستقبلين في تجارب نقل طاقة الرنين. يمكن أيضًا استخدام الإثارة متعددة الفوتونات بالاقتران مع تقنيات الحنق وهي أقل ضررًا للخلايا بسبب أطوال موجات الإثارة الأطول المعنية. بالإضافة إلى ذلك ، من غير المرجح أن تحدث المصنوعات الفلورية الذاتية والتبييض الضوئي للعينة داخل خاصية حجم الإثارة المقيدة التي تتميز بها الإثارة متعددة الفوتونات.

ويرد في الشكل 7 تكوين مجهر نموذجي قادر على مراقبة الخلايا الحية في الثقافة المزروعة بالعديد من أشكال تصوير نقل طاقة الرنين الفلوري. باستخدام حقل مشرق قياسي أو تباين طوري أو تباين تداخل تفاضلي (مدينة دبي للإنترنت) إضاءة. لاحظ أنه يمكن استخدام تقنيتي تعزيز التباين الأخيرين جنبًا إلى جنب مع التألق للكشف عن الموقع المكاني للفلور داخل العمارة الخلوية. يتم توصيل نظام كاميرا CCD قياسي مبرد من Peltier برأس مجهر ثلاثي العينيات من أجل مضان واسع النطاق والتقاط صورة حقل مشرق.

تجرى تجارب نقل طاقة الرنين مع الأطياف المتعددة باستخدام إضاءة المجال الواسع (مصباح التفريغ القوسي) أو مرفق متحد البؤر للمسح في الوقت الحقيقي مزودًا بنظام قرص Nipkow عالي السرعة. يتم أولاً ترشيح شعاع ليزر الأرجون والكريبتون من خلال جهاز طول موجي قابل للانضغاط السمعي البصري لتحديد أطوال موجات الإثارة المحددة قبل تمريرها إلى رأس المسح المتحد البؤر. يتم جمع الصور باستخدام كاميرتي CCD عالية الدقة ومكثفة من الجيل الثالث لقراءة قنوات منفصلة وملفوفة إلى كمبيوتر مضيف. مسح العينة في الجانب (x و ذ) ومحوري (ض) تسمح الطائرات بجمع المقاطع البصرية لإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد. تتوافق مجموعة متنوعة من برامج معالجة الصور مع تكوين المجهر المصور.

بناءً على المبادئ الأساسية للظاهرة ، يجب مراعاة عدد من النقاط العملية المهمة عند إجراء قياسات نقل طاقة الرنين الفلوري باستخدام المجهر الضوئي:

  • يجب التحكم عن كثب في تركيزات المتبرع والمقبلات الفلورية. تحدث أعلى احتمالية إحصائية لتحقيق نقل طاقة الرنين الفلوري عندما يحيط عدد من الجزيئات المستقبلة بجزيء مانح واحد.
  • يجب التخلص من التبييض الضوئي لأن الأداة يمكن أن تغير النسبة الجزيئية من المانح إلى المستقبل ، وبالتالي ، القيمة المقاسة لعملية نقل طاقة الرنين.
  • يجب أن يكون طيف الانبعاث الفلوري للمانح وطيف الامتصاص المستقبلي منطقة تداخل كبيرة.
  • يجب أن يكون هناك حد أدنى من الإثارة المباشرة للمستقبل في منطقة الطول الموجي المستخدمة لإثارة المتبرع. أحد المصادر الشائعة للخطأ في قياسات الفحص المجهري للحالة المستقرة هو اكتشاف انبعاثات المانحين باستخدام مجموعات مرشح متقبل.
  • يجب أن تتطابق أطوال موجات الانبعاث لكل من المتبرع والمستقبل مع أقصى مدى حساسية للكاشف.
  • يجب أن يكون لأطياف الامتصاص والانبعاثات المتبرع بها حد أدنى من التداخل من أجل تقليل إمكانية النقل الذاتي من المانح إلى المتبرع.
  • يجب أن يكون الجزيء المانح متوهجًا وأن يظهر عمرًا طويلاً بدرجة كافية حتى يحدث نقل طاقة الرنين.
  • يجب أن يُظهر المانح تباينًا منخفضًا في الاستقطاب لتقليل عدم اليقين في قيمة عامل التوجيه (المربع). يتم استيفاء هذا المطلب من قبل الجهات المانحة التي تنتج انبعاثاتها من العديد من انتقالات الإثارة المتداخلة.
  • عند استخدام تقنيات وضع العلامات على الأجسام المضادة ، لا ينبغي تغيير الكواشف المقترنة بالكرومات الفلورية المتبرعة والمقبلة في نشاطها البيولوجي. سيؤثر أي انخفاض في النشاط بشكل خطير على صلاحية قياسات نقل طاقة الرنين الناتجة.
  • نظرًا لأن نقل طاقة الرنين الفلوري يتطلب أن يكون للجزيئات المانحة والمقبلة المحاذاة ثنائية القطب المناسبة ويتم وضعها في حدود 10 نانومتر من بعضها البعض ، يجب مراعاة البنية الثلاثية للكواشف التي ترتبط بها الجزيئات. على سبيل المثال ، عندما يمكن ربط جزيئات متلقي المانح بمواقع هيكلية مختلفة (مثل الكربوكسي أو الطرف الأميني) على البروتين ، فمن الممكن ألا تتم ملاحظة FRET على الرغم من تفاعل البروتينات ، لأن جزيئات المتبرع والمستقبل تقع على طرفي نقيض من الجزيئات المتفاعلة.
  • يجب تحليل الخلايا الحية الموصوفة بطفرات البروتين الفلوري الأخضر لتحقيقات FRET باستخدام التقنيات المناعية التقليدية للتحقق من أن البروتين الموسوم يتبنى نفس الموطن والخصائص داخل الخلايا مثل نظيره الأصلي.

من أجل أن توفر ظاهرة نقل طاقة الرنين بالرنين بيانات ذات مغزى كأداة في الفحص المجهري البصري ، يجب تحسين كل من معلمات إعداد العينات والتصوير. يعد اختيار تحقيقات المتبرع والمقبول المناسب والطريقة التي يتم استخدامها بها كعلامات جزيئية تحديًا كبيرًا. بالإضافة إلى ذلك ، بمجرد توضيح استراتيجية وضع العلامات التي تسمح بنقل الطاقة ، يمكن استخدام مجموعة واسعة من التقنيات لإجراء القياس نفسه. يتم إجراء غالبية الفحوصات المجهري الكمي عن طريق قياس شدة انبعاث التألق. عادةً ما يتم تحقيق الكشف المستند إلى شدة التألق عن طريق مراقبة التغيرات في الكميات النسبية لشدة الانبعاث عند طولين موجيين يقابلان المتبرعين والمقبلين للكروموفور. عندما تكون الظروف مناسبة لنقل طاقة الرنين الفلوري ، تحدث زيادة في انبعاث المستقبِل (I ل)) مصحوبًا بانخفاض مصاحب في انبعاثات المانحين (هوية شخصية)) الشدة.

على الرغم من أن التغيير في كثافة الانبعاث النسبية لأي من المانحين أو المستقبلين يمكن اعتباره مؤشرا على نقل طاقة الرنين ، فإن النهج المعتاد هو استخدام نسبة القيمتين ، أنا (أ) / أنا (د)، كمقياس للحنق. تعتمد قيمة النسبة على متوسط ​​المسافة بين أزواج المتبرعين والمقبولين وهي غير حساسة للاختلافات في طول المسار والحجم الذي يتم الوصول إليه بواسطة شعاع الضوء المثير. أي حالة عينة تؤدي إلى تغيير في المسافة النسبية بين الأزواج الجزيئية ينتج عنها تغيير في نسبة انبعاث المتبرع والمستقبل. وبالتالي ، يمكن ملاحظة FRET في المجهر عن طريق الإثارة التفضيلية للفلوروفور المتبرع والكشف عن زيادة انبعاث متقبل الفلوروفور المتفاعل ، مصحوبًا بانخفاض في مضان المانحين الناتج عن التبريد بسبب نقل الطاقة. يُطلق على قياس FRET الذي يستخدم نهج مراقبة الكثافة حالة مستقرة تصوير نقل طاقة الرنين الفلوري.

يتم اختيار مجسات المتبرع والمقبول المناسب على أساس خصائص امتصاصها وانبعاثها الطيفي. لتحقيق أقصى قدر من نقل طاقة الرنين ، يجب أن يتداخل طيف الانبعاث المتبرع بشكل كبير مع طيف الامتصاص للمستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون هناك حد أدنى من الإثارة المباشرة للمستقبل الفلوري عند الحد الأقصى لإثارة المتبرع ، ويجب ألا يكون هناك تداخل كبير في الانبعاث بين المتبرع والمقبول في منطقة الطول الموجي التي يحدث عندها انبعاث المستقبِل. في الممارسة العملية ، قد يكون من الصعب تحديد أزواج المتبرعين والمقبولين التي تفي بهذه المتطلبات. غالبًا ما يكون الموقف معقدًا بسبب حقيقة أن مجموعات المرشحات الفلورية المتاحة تجاريًا ليست فعالة تمامًا في تمرير الأطوال الموجية المرغوبة فقط ، وقد يتم إرسال نسبة صغيرة من الضوء خارج نطاق مرور التصميم. ما لم يتم استخدام أنظمة التعبير المتميزة والمضبوطة بشكل جيد ، فقد يكون من الصعب تحديد التركيز الدقيق للمانحين والمقبلين للفلور. قد تكون هناك حاجة أيضًا إلى تصحيحات إضافية للتألق الذاتي والتبييض الضوئي وإضاءة الخلفية.

يوضح الشكل 8 تحقيقًا نموذجيًا حول ارتباط البروتين بالبروتين داخل الخلايا في ثقافة الخلية الحية للأحداث المرتبطة بالاستماتة ، وهي عملية فيزيائية للموت الخلوي ناتجة عن سلسلة معقدة من التفاعلات المتسلسلة. يمكن تصنيف منتجات الجينات المشاركة مباشرة في سلسلة الأحداث عن طريق الاندماج لأعضاء مناسبين من عائلة البروتين الفلوري (في هذه الحالة ، BFP و GFP) للتعبير المشترك في نفس الخلية من أجل التحقيق في ارتباطات محددة بواسطة FRET. تتفاعل البروتينات المتضمنة في موت الخلايا المبرمج داخل الميتوكوندريا وتظهر انخفاضًا تدريجيًا في الارتباط مع استمرار موت الخلية المبرمج. وبالتالي ، فإن صورة انبعاث المتبرعين (الشكل 8 (أ)) تحتوي فقط على مضان من البروتينات المسمى BFP ، بينما يوضح ملف تعريف انبعاث المستقبِل المقابل (الشكل 9 (ب)) الإشارات بسبب البروتينات المسمى بـ GFP (وبعض المساهمة من انبعاث المانحين). مرشح الحنق (الشكل 8 (ج)) ، كما هو موضح أدناه ، يكشف عن تألق مشتق من نقل طاقة الرنين بين البروتينين

من بين العوامل التي قد تؤثر على دقة قياسات نقل طاقة الرنين الفلوري بشكل عام ، العديد منها خاص جدًا بالمجهر الضوئي. الهدف الأساسي في تحقيقات الفحص المجهري هو الحصول على صور عالية الدقة ، وهذا يتطلب اهتمامًا خاصًا بجودة وأداء المرشحات الضوئية المستخدمة للتمييز الطيفي بين أطوال موجات الامتصاص والانبعاث للمانح والمقبول. من أجل تعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء (دون التأثير بشكل ضار على العينة أو العملية قيد التحقيق) ، من الضروري الموازنة بعناية بين شدة ووقت التعرض لضوء الإثارة مع تركيز المتبرع والمستقبل الفلوري والكاشف نجاعة. إذا كان تركيز الفلوروفورات المتبرع بها مفرطًا ، يمكن أن يحدث التبريد الذاتي ، مما يؤثر على دقة قياسات الحنق. يعد التبييض الضوئي مشكلة مع جميع مركبات الفلور ، ويمكن أن يؤثر على نسبة المتبرع والمتقبل ، مما يؤدي إلى تغيير قياسات التألق. يمكن أن تؤدي شدة الإضاءة الزائدة أيضًا إلى إتلاف العينات ، خاصة تلك التي تحتوي على خلايا أو أنسجة حية.

تقنية تعرف باسم photobleaching المتبرع لنقل الطاقة بالرنين الفلوري (pbFRET) ، الذي يستغل عملية التبييض الضوئي لقياس الحنق ، غالبًا ما يتم تطبيقه في دراسة العينات الثابتة. بناءً على تحليل البكسل بالبكسل ، تم تطبيق الطريقة لقياس علاقات القرب بين بروتينات سطح الخلية المسمى بأجسام مضادة أحادية النسيلة مترافقة مع الفلوروفور. تأسس Photobleaching FRET على النظرية القائلة بأن الفلوروفور حساس للتلف الضوئي فقط عندما يتم رفعه إلى حالة الإثارة. إحصائيًا ، توجد نسبة صغيرة فقط من الجزيئات في حالة الإثارة في أي وقت ، وبالتالي ، فإن الفلوروفورات ذات عمر التألق الأطول لديها احتمالية أكبر للمعاناة من التلف الضوئي وتظهر معدل أعلى من التبييض الضوئي.

أثبتت الأدلة التجريبية التي تدعم هذا المفهوم أن وقت التبييض الضوئي للفلوروفور يختلف عكسيًا مع عمر الحالة المتحمسة. يقلل حدوث نقل طاقة الرنين من عمر التألق للجزيء المانح ، مما يحميه بشكل فعال من التبييض الضوئي. تستند حسابات pbFRET إلى انخفاض معدل التبييض الضوئي للمانحين بالنسبة إلى ذلك الذي تم قياسه للمتبرع في غياب نقل طاقة الرنين. يتطلب قياس التبييض الضوئي في دراسات FRET إطارًا زمنيًا طويلًا نسبيًا ، وبالتالي فهو أكثر قابلية للتطبيق على عينات الخلايا الثابتة التي لا تكون فيها البيانات الزمنية مهمة والتأثير على وظيفة الخلية من التبييض الضوئي ليس مشكلة. في بعض النواحي ، تكون تقنية التبييض الضوئي للمانحين أقل تعقيدًا من قياس الانبعاث الحساس ، على الرغم من ملاءمة ثوابت الوقت لمنحنيات التبييض الضوئي التي تتضمن مكونات متعددة يمثل بعض الصعوبات الإضافية.

يمكن أيضًا تحديد كفاءة نقل الطاقة من خلال قبول photobleaching التقنيات ، التي يتم فيها قياس التغيير في تبريد انبعاث المانحين من خلال مقارنة القيمة قبل وبعد التبييض الضوئي الانتقائي للجزيء المستقبِل. يتميز تحليل التغيير في شدة التألق للمانحين في مناطق العينة نفسها ، قبل إزالة المستقبِل وبعده ، بميزة تتطلب إعداد عينة واحدة فقط ، ويرتبط بشكل مباشر بكفاءة نقل الطاقة بكل من مضان المتبرع والمقبول.

يتطلب القياس الدقيق لنقل طاقة الرنين الفلوري في المجهر تعويضًا لجميع مصادر الخطأ المحتملة. تم تطوير تقنية مباشرة لتصحيح الكشف عن مضان المتبرع باستخدام مرشح الانبعاث المستقبلي والفلورة المستقبلة مع مرشح انبعاث المتبرع (بسبب التقاطع أو النزف الطيفي). تصحح الطريقة أيضًا لاعتماد FRET على تركيزات المتبرع والمقبول للفلور. تستخدم استراتيجية القياس ، التي تتطلب حدًا أدنى من المعلومات الطيفية ، مجموعة من ثلاث مجموعات من المرشحات ويمكن تنفيذها بسهولة. تم تصميم مجموعات عوامل التصفية المانحة و FRET والمقبول لعزل ثلاث إشارات محددة وتعظيمها: مضان المتبرع ، مضان متقبل منسوب إلى FRET ، ومضان متقبل متحمس مباشرة ، على التوالي. في الممارسة العملية ، يتم فحص ثلاث عينات مختلفة ، تحتوي على متبرع فقط ، ومستقبل فقط ، وكلا المتبرع والمقبول مع كل مجموعة من مجموعات المرشحات الثلاث ، ويتم معالجة البيانات الناتجة حسابيًا لتصحيح التقاطع وللتغيرات غير المنضبطة في تركيزات المتبرعين المتلقين.

معروض في الشكل 9 رسوم توضيحية تخطيطية للتقاطع (النزف الطيفي) والتداخل المتبادل للتصفية ، وهما مشكلتان مهمتان يجب التغلب عليهما من أجل تحقيق نتائج كمية في تجارب نقل طاقة الرنين الفلوري. يتجلى التقاطع أو النزف من خلال تداخل طيف الانبعاث الفلوري للمانح مع منطقة ممر النطاق لمرشح تداخل الانبعاث المستقبلي في الشكل 9 ، مما يؤدي إلى إرسال إشارة انبعاث من المانحين (أطوال موجية غير مرغوب فيها) عبر مرشح الانبعاث. في المقابل ، يصف الحديث المتبادل للمرشح الحد الأدنى لمستوى التوهين (المنع) عبر نطاق معين من مرشحين موضوعين معًا في سلسلة ، ويكون مصدر قلق عند مطابقة الإثارة ومرشحات الانبعاث لمجموعات التألق. غالبًا ما يتم تضمين المرايا ثنائية اللون في تقييم الحديث المتبادل لتركيبات مرشح التألق. على الرغم من أنه نادرًا ما يتم وضع اثنين من مرشحات الانبعاث في مسار الضوء في نفس الوقت ، يتم رسم الأطياف معًا في الشكل 9 لتوضيح كلا المفهومين في وقت واحد. لاحظ أن طيفي المرشح (المنحنيات الزرقاء والحمراء) يمثلان نفاذية الضوء بواسطة مرشحات التداخل ، في حين أن منحنى الانبعاث المانح (الأخضر) هو مخطط للكثافة مقابل طول الموجة.

تتطلب العوامل الإضافية ، التي يمكن أن تؤدي إلى أخطاء كبيرة ، تصحيحًا أيضًا عند استخدام تقنيات قياس الحنق المستقر.علاوة على ذلك ، من المستحسن التحكم الدقيق في تركيزات المتبرع والمقبول بالفلور. يمكن تجنب قرارات تركيز الفلوروفور جزئيًا من خلال تطبيق وقت حلها قياسات التألق ، والتي توفر طريقة للحصول على متوسط ​​العمر دون معرفة دقيقة بتركيزات المانحين. تتيح هذه التقنية التحديد الكمي لمسافات الفصل بين المتبرعين والمقبولين ، وتستند إلى قياسات عمر المتبرع في وجود المتقبل وغيابه. يوضح قياس اضمحلال شدة التألق كدالة للوقت ديناميكيات الانبعاث لجزيء الحالة المثارة ، وبالتالي ، يمكن الحصول على معلومات أكثر تفصيلاً حول طبيعة تفاعل المتبرع والمتقبل. توضح المخططات الرسومية لاضمحلال الكثافة تفاصيل متوسط ​​الوقت لعملية تسوس التألق (انظر الشكل 10 (أ)) ، والتي لم يتم حلها عند استخدام تقنيات الحالة الثابتة. قد تتوافق القياسات التي تشير إلى نفس القيمة لمتوسط ​​العمر ، عند تسجيلها على أنها شدة حالة ثابتة تم تطبيعها مع الامتصاص ، مع أشكال مختلفة من منحنى الانحلال في مخططات البيانات التي تم حلها بمرور الوقت ، مما يشير إلى الاختلافات في العمليات بين الجزيئات المعنية.

عمر التألق (τ) من الفلوروفور هو الوقت المميز لوجود الجزيء في الحالة المثارة قبل العودة إلى الحالة الأساسية. تمثيل تسوس التألق في شكل أسي واحد مبسط بعد نبضة قصيرة من ضوء الإثارة ، شدة التألق كدالة للوقت (ر) بواسطة المعادلة:

أين أنا (0) هي شدة انبعاث الفلورة الأولية مباشرة بعد نبضة ضوء الإثارة ، و هو - هي) هي شدة التألق المقاسة في الوقت المناسب ر. عمر التألق (τ) على أنه الوقت اللازم لانحلال الشدة 1 / هـ من قيمته الأولية (حوالي 37 بالمائة من أنا (0) الشكل 10 (أ)) ، وهو مقلوب معدل ثابت لاضمحلال التألق من الحالة المثارة إلى الحالة الأرضية.

تتمثل الميزة الإجمالية الأساسية لقياسات الحنق المستقرة مقابل الوقت المستقر في أنه يمكن تعيين مسافات الفصل بين المتبرعين والمقبولين بدقة كمية أكبر. ينتج عن هذا جزئيًا أن عمر الفلورسنت لا يعتمد على الكثافة أو التركيز المحلي ، ولا يتأثر إلى حد كبير بالتبييض الضوئي للفلوروفورات. ومع ذلك ، فإن الأعمار الفلورية حساسة للغاية لبيئة الفلوروفور ، وحتى الجزيئات ذات الأطياف المماثلة قد تعرض عمرًا متميزًا في ظل ظروف بيئية مختلفة. نظرًا لأن التشتت لا يؤثر على عمر حاملي الفلور ، يمكن أن توفر قياسات تباين العمر معلومات مرتبطة بشكل خاص بالعمليات الجزيئية المحلية.

يخضع عمر الفلوروفور للتعديل من خلال العديد من المتغيرات في البيئة الدقيقة المحلية ، بما في ذلك عوامل مثل الكراهية للماء ، وتركيز الأكسجين ، والقوة الأيونية لمكونات الوسائط الأخرى ، والارتباط بالجزيئات الكبيرة ، والقرب من الجزيئات المستقبلة التي يمكن أن تستنفد الحالة المثارة بواسطة نقل طاقة الرنين. إنها ميزة عملية مهمة أن قياسات العمر يمكن أن تكون بمثابة مؤشرات مطلقة للتفاعلات الجزيئية ، وتكون مستقلة عن تركيز الفلوروفور.

يتم تصنيف طريقتين عامتين تستخدمان بشكل شائع لقياس عمر الفلورسنت على أنهما المجال الزمني (نابض، انظر الشكل 10 (أ)) و مجال التردد (يُطلق عليه أيضًا حل المرحلة الشكل 10 (ب)) الطرق. تستخدم قياسات العمر في المجال الزمني مصادر ضوء الإثارة النبضية ، ويتم الحصول على عمر الفلورسنت عن طريق القياس المباشر لإشارة الانبعاث أو عن طريق الكشف عن عد الفوتون. يستخدم نهج مجال التردد التعديل الجيبي لمصدر ضوء الإثارة (يتم الحصول عليه من أنظمة الليزر النبضية أو المعدلة) ، ويتم تحديد العمر من تحول الطور وعمق إزالة التشكيل لإشارة انبعاث التألق. كل من هذه الأساليب للتصوير مدى الحياة مضان له مزايا وعيوب محددة ، وكلاهما تم تطبيقه على نطاق واسع في الفحص المجهري واسع النطاق ، متحد البؤر ، ومتعدد الفوتون.

يتضح في الشكل 10 مخططات تخطيطية تمثل تقنيات المجال الزمني ومجال التردد لتحديد عمر التألق. في نهج المجال الزمني (الشكل 10 (أ)) ، يتم تحفيز العينة بنبضة قصيرة من ضوء الليزر لها مدة أقصر بكثير من عمر الأنواع المثارة ، ويتم قياس ملف تعريف الانحلال الأسي كدالة للوقت. عادةً ما يكون تسوس الإسفار وظيفة أحادية الأسي لفلوروفور واحد ، ولكن يمكن أن يظهر طابعًا أكثر تعقيدًا بكثير إذا كان للحالة المثارة العديد من مسارات الاسترخاء المتاحة في البيئة. يتم استخدام الضوء المعدل جيبيًا من ليزر الموجة المستمرة المقترن بمغير صوتي بصري لإثارة الفلوروفور في تجارب مجال التردد (الشكل 10 (ب)). يتم تعديل انبعاث التألق الناتج بشكل جيبي بنفس تردد الإثارة ، ولكنه يكون مصحوبًا بتحول طور وتقليل في عمق التشكيل. في حالة الاضمحلال الأسي الفردي ، يمكن حساب عمر التألق عن طريق تحديد درجة انزياح الطور (φ) ، أو نسبة التعديل (م) ، باستخدام المعادلات الواردة في الشكل 10 (ب). إذا كانت القيمتان متطابقتين ، فإن اضمحلال التألق يتكون حقًا من دالة أسية واحدة. عندما يكون هناك أكثر من نوع فلورسنت واحد (أو أن فلوروفور واحد يواجه بيئة معقدة) ، يجب تقييم تحول الطور وأعمار التعديل على نطاق واسع من الترددات.

تعتمد تقنية المجال الزمني لقياس عمر التألق بشكل أساسي على حساب الفوتون الفردي وتتطلب نظام كشف بدقة زمنية كافية لجمع ما يقرب من 100 بالمائة من الفوتونات الناتجة عن كل نبضة إثارة. على الرغم من أن تقنيات حل الطور أقل تطلبًا نسبيًا من الأداء ، إلا أنها ليست حساسة بشكل عام مثل نهج عد الفوتون. عندما يتم استخدام تعديل الطور لحل الأعمار المعقدة متعددة الفلوروفورات ، يمكن أن تكون أوقات التعرض الطويلة لإضاءة الإثارة الضارة مفرطة في بعض العينات ، وقد لا توفر أيضًا دقة زمنية كافية لعمليات الخلايا الحية. تعتمد التقنية المفضلة على كل من المعلومات المطلوبة من التحقيق ونوع العينة التي تتم دراستها.

أثبتت قياسات عمر الإسفار أنها مؤشر حساس لـ FRET ، ولها مزايا خاصة في دراسات الخلايا الحية بسبب استقلالية قياسات العمر على عوامل مثل التركيز وطول مسار الضوء ، والتي يصعب التحكم فيها في العينات الحية. تكمن الميزة الأساسية لإجراء دراسات FRET عن طريق قياس عمر التألق في حقيقة أنه من الممكن التمييز بين نقل الطاقة حتى بين أزواج المتبرعين والمتلقين مع أطياف الانبعاث المماثلة. عندما يتم قياس عمر التألق مباشرة (على عكس استخدام قيم الحالة الثابتة) ، يكون تحديد FRET ممكنًا دون التدمير الضوئي للمتبرع أو الفلوروفورات المستقبلة. لأن FRET يقلل من عمر التألق للجزيء المانح من خلال نقل الطاقة إلى المستقبل ، مقارنة مباشرة بعمر المتبرع في وجود المتقبل (τ (DA)) لذلك في حالة عدم وجود المتقبل (τ (د)) ، تمكن من حساب قيمة كفاءة FRET (ه (ت)) لكل بكسل صورة.

اعتمادًا على التقنية ، تتطلب قياسات عمر التألق أن تتعرض العينة إما لنبضات متكررة عالية التردد من ضوء الإثارة ، أو لضوء مُعدَّل جيبيًا مستمرًا. في الدراسات التي أجريت على الخلايا الحية ، يجب دائمًا تقييم تأثير الإضاءة عالية الكثافة. بغض النظر عن الطريقة ، يجب تحديد العمر المرجعي للمتبرع بدون متقبل في ظل ظروف تجريبية مماثلة لتلك الخاصة بقياس المتبرع والمتقبل. تتمثل إحدى وسائل تحقيق ذلك بعينة واحدة في قياس عمر المتبرع فقط بعد تدمير التبييض الضوئي للمستقبل بعد تجربة نقل الطاقة.

في التحقيقات البيولوجية ، فإن أكثر التطبيقات شيوعًا لنقل طاقة الرنين الفلوري هي قياس المسافات بين موقعين على جزيء ضخم (عادةً بروتين أو حمض نووي) أو فحص في الجسم الحي التفاعل بين الكيانات الجزيئية الحيوية. يمكن تصنيف البروتينات باستخدام الفلوروكرومات الاصطناعية أو الفلوروفورات المناعية لتكون بمثابة المتبرع والمقبول ، ولكن التقدم في جينات البروتين الفلوري تمكن الباحثين الآن من تسمية البروتينات المستهدفة المحددة بمجموعة متنوعة من الفلوروفورات البيولوجية التي لها خصائص طيفية مختلفة. في كثير من الحالات ، يتم استخدام التربتوفان من الأحماض الأمينية كمتبرع جوهري فلوروفور ، والذي يمكن أن يقترن بأي عدد من المسابير الخارجية التي تعمل كمستقبل.

إذا تم تصنيف الجزيئات الكبيرة بمانح ومقبول واحد ، ولم يتم تغيير المسافة بين الفلوروكروميين خلال فترة حياة الحالة المثارة للمانح ، فيمكن تحديد المسافة بين المجسات من خلال كفاءة نقل الطاقة من خلال قياسات الحالة المستقرة ، كما تمت مناقشته فوق. في الحالات التي تتقلب فيها المسافة بين المتبرع والمستقبل حول منحنى التوزيع ، مثل تجمعات البروتين ، أو الأغشية ، أو الأحماض النووية أحادية السلسلة ، أو البروتينات غير المطوية (انظر السيناريوهات المعروضة في الشكل 11) ، لا يزال من الممكن استخدام FRET لدراسة ظواهر ، ولكن يفضل قياس العمر المحسوم بالوقت. تم توضيح العديد من التطبيقات البيولوجية التي تقع في كلتا الحالتين في الشكل 11 ، بما في ذلك التغييرات التوافقية ، والتفكك أو التحلل المائي ، واندماج الحويصلات الدهنية الشبيهة بالغشاء ، وتفاعلات مستقبلات الترابط.

على الرغم من توفر طرق مختلفة لقياس نقل طاقة الرنين الفلوري في المجهر الضوئي ، إلا أن أيا منها لا تخلو من عيوب. تتطلب بعض التقنيات أدوات أكثر تفصيلاً وتكلفة ، بينما يعتمد البعض الآخر على افتراضات يجب التحقق من صحتها بعناية. بعض الأساليب مناسبة للعينات الثابتة ، ولكن لا يمكن تطبيقها على أنظمة الخلايا الحية ، بينما يجب أن تتضمن الطرق الأخرى حسابات تصحيحية مهمة أو خوارزميات تحليل البيانات. ومع ذلك ، فمن المؤكد أن تحليل FRET يظهر وعدًا كبيرًا لمزيد من التطوير في فائدة ومجال التطبيقات البيولوجية. حدثت تحسينات كبيرة في الأجهزة في السنوات الأخيرة ، لا سيما فيما يتعلق بتقنيات حل الوقت.

قياسات عمر الإسفار التي تم إنجازها فقط بصعوبة بالغة في الماضي يتم دعمها الآن بواسطة تقنيات البيكو ثانية والنانو ثانية الناضجة. أنتج التقدم في تطوير مسبار الفلورسنت جزيئات أصغر وأكثر استقرارًا بآليات جديدة للارتباط بالأهداف البيولوجية. تم تطوير الفلوروفور أيضًا مع مجموعة واسعة من فترات حياة الحالة الجوهرية المثارة ، ويتم بذل جهد كبير لتطوير تنوع أكبر في الاختلافات الجينية للبروتينات الفلورية. فئات جديدة تمامًا من المواد الفلورية ، العديد منها أصغر من الفلوروفورات السابقة وتسمح بتقييم التفاعلات الجزيئية على مسافات فصل أقل ، تعد بتحسين تعدد استخدامات وضع العلامات وتؤدي إلى تطبيقات جديدة لتقنية FRET.

المؤلفون المساهمون

بريان هيرمان و فيكتوريا إي سينترونز فروليش - قسم البيولوجيا الخلوية والهيكلية ، مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس ، 7703 فلويد كيرل درايف ، سان أنطونيو ، تكساس 78229.

جوزيف ر - مركز التحليل الطيفي الفلوري ، قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية ، جامعة ميريلاند ومعهد التكنولوجيا الحيوية بجامعة ميريلاند (UMBI) ، 725 شارع ويست لومبارد ، بالتيمور ، ماريلاند 21201.

توماس جيه فيلرز و مايكل دبليو ديفيدسون - مختبر المجال المغناطيسي الوطني العالي ، 1800 East Paul Dirac Dr. ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي ، فلوريدا ، 32310.


  • 21 فبراير 2021 - يتم تخزين واستدعاء وحدات المسافة المحددة عند زيارتك القادمة
  • 6 يوليو 2020 - خيار جديد لتصدير رابط إلى المسار. وجدت داخل قسم خيارات التصدير
  • 2 حزيران (يونيو) 2019 - الخطأ الذي تم إصلاحه بمخرج العدادات لا يعمل
  • 29 مايو 2019 - تطبيق الخرائط المنشورة
  • 20 مايو 2019 - إصلاح الخلل في متصفح IE
  • 9 مايو 2019 - تم حل مشكلة عدم إعادة تعيين المسافة إلى الصفر عند النقر على زر مسح الخريطة
  • 14 سبتمبر 2017 - يتم عرض المسافة الآن على الخريطة أثناء وضع ملء الشاشة
  • 4 أغسطس 2017 - تم تحديث محدد الوحدات. تمت إضافة وحدات القدم
  • 24 يوليو 2017 - تم نقل خيار ملء الشاشة إلى الخريطة. وجدت الآن في الزاوية اليمنى العليا
  • 4 يوليو 2017 - تم حل المشكلة مع تصدير CSV و XLSX
  • 29 يناير 2017 - خيار إظهار مخطط الارتفاع وتصدير ملف CSV لبيانات الارتفاع على طول الطريق
  • 25 نوفمبر 2016 - تصدير KML لإظهار الدبابيس في كل عقدة على طول المسار
  • 23 نوفمبر 2016 - تمت إضافة خيار تنزيل KML و CSV و XLSX
  • 19 يوليو 2016 - إصلاحات الأخطاء مع كيفية تغيير وضع النقل والوقت المقدر للسفر إذا تم تغيير الوحدات
  • 5 يوليو 2016 - تمت إضافة العدادات كوحدة للمسافة
  • 25 يونيو 2016 - تتغير وحدات سرعة السفر اعتمادًا على وحدات المسافة
  • 20 يونيو 2016 - تم حل مشكلة قياس الأيام التي تعرض ضعف القيمة الفعلية
  • 24 مارس 2016 - يمكن الآن إضافة نقاط الطريق في منتصف الطريق. يمكن أيضًا حذف النقاط عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن
  • 25 يناير 2016 - يمكن الآن إدخال السرعة يدويًا
  • 28 ديسمبر 2015 - تمت إضافة خيار للتغيير بين الدقائق والساعات والأيام لتقدير وقت السفر
  • 24 يونيو 2014 - تمت إضافة خيار Snap To Roads
  • 24 مارس 2014 - تمت إضافة خيار التحريك إلى موقعي
  • 11 كانون الثاني (يناير) 2012 - تم تطبيق Google Maps API V3. تمت إضافة خيار ملء الشاشة
  • 12 أكتوبر 2010 - تُظهر العلامات الآن خطوط الطول والعرض الخاصة بها عندما تحوم فوقها
  • 15 أكتوبر 2009 - تمت إضافة وقت السفر الناتج
  • 12 أكتوبر 2009 - تمت إضافة خيار خريطة التضاريس
  • 20 فبراير 2008 - تجديد التصميم الآن بعلامات قابلة للسحب
  • الأول من نوفمبر 2007 - تمت إضافة مربع نص البحث السريع
  • 19 أكتوبر 2007 - تم إضافة الياردات الآن كوحدة قياس
  • 9 أكتوبر 2007 - تمت إضافة الأميال البحرية كوحدة قياس
  • 5 سبتمبر 2007 - تم تحديث النص الوصفي
  • 28 يونيو 2007 - تم إنشاء الصفحة

إذا كنت تحاول قياس المسافة بين مدينتين ، فمن المحتمل أن تكون أداة "المسافة بين مدينتين" أكثر ملاءمة لاحتياجاتك.


ما هو ضغط الدم؟

ضغط الدم هو قوة ضغط الدم على جدران الشرايين أثناء انقباض القلب واسترخائه. في كل مرة ينبض فيها القلب ، يضخ الدم في الشرايين ، مما يؤدي إلى ارتفاع ضغط الدم مع انقباض القلب. عندما يرتاح القلب ، ينخفض ​​ضغط الدم.

يتم تسجيل رقمين عند قياس ضغط الدم. يشير الرقم الأعلى ، أو الضغط الانقباضي ، إلى الضغط داخل الشريان عندما ينقبض القلب ويضخ الدم عبر الجسم. يشير الرقم الأقل ، أو الضغط الانبساطي ، إلى الضغط داخل الشريان عندما يكون القلب في حالة راحة ويمتلئ بالدم. يتم تسجيل كل من الضغط الانقباضي والضغط الانبساطي كـ "مم زئبق" (ملليمتر من الزئبق). يمثل هذا التسجيل مدى ارتفاع عمود الزئبق في جهاز ضغط الدم اليدوي القديم (يسمى مقياس ضغط الدم الزئبقي أو مقياس ضغط الدم) الذي يرتفع بسبب ضغط الدم. اليوم ، من المرجح أن يستخدم مكتب طبيبك قرصًا بسيطًا لهذا القياس.

يؤدي ارتفاع ضغط الدم أو ارتفاع ضغط الدم بشكل مباشر إلى زيادة خطر الإصابة بالنوبات القلبية وفشل القلب والسكتة الدماغية. مع ارتفاع ضغط الدم ، قد تزداد مقاومة الشرايين لتدفق الدم ، مما يجعل القلب يضخ بقوة أكبر لتدوير الدم.

يصنف ضغط الدم على أنه ضغط دم طبيعي أو مرتفع أو المرحلة الأولى أو الثانية من ارتفاع ضغط الدم:

طبيعي ضغط الدم الانقباضي أقل من 120 والانبساطي أقل من 80 (120/80)

مرتفع ضغط الدم الانقباضي من 120 إلى 129 و الانبساطي أقل من 80

المرحلة 1 ارتفاع ضغط الدم الانقباضي هو 130 إلى 139 أو الانبساطي بين 80 إلى 89

المرحلة الثانية يحدث ارتفاع ضغط الدم عندما يكون الانقباضي 140 أو أعلى أو الانبساطي 90 أو أعلى

يجب استخدام هذه الأرقام كدليل فقط. لا يعتبر قياس ضغط الدم الفردي الأعلى من المعتاد بالضرورة مؤشرًا على وجود مشكلة. سيرغب طبيبك في رؤية قياسات متعددة لضغط الدم على مدار عدة أيام أو أسابيع قبل إجراء تشخيص لارتفاع ضغط الدم وبدء العلاج. اسأل مقدم الخدمة الخاص بك عن موعد الاتصال به أو بها إذا كانت قراءات ضغط الدم لديك ليست ضمن النطاق الطبيعي.


دليل المستخدم - جمع العينات وتحضيرها

يتطلب تحديد المجهول: المادة ، وأداة الطحن ، وحامل العينة.

  • احصل على بضعة أعشار جرام (أو أكثر) من المادة ، نقيًا قدر الإمكان
  • طحن العينة إلى مسحوق ناعم ، عادة في سائل لتقليل إحداث إجهاد إضافي (طاقة السطح) التي يمكن أن تعوض مواضع الذروة ، وللتوجيه العشوائي. مسحوق أقل من

  • تشويه موحد على شريحة زجاجية ، مع ضمان سطح علوي مسطح
  • حزمة في حاوية عينة
  • يرش على شريط لاصق مزدوج

نصائح وتقنيات القياس

القياس المناسب للمكونات مهم لنجاح الطهي والخبز. يمكن أن تتأثر بعض الأطعمة بشكل كبير بسبب الكثير أو القليل جدًا من مكونات معينة ، مثل الملح وصودا الخبز ومسحوق الخبز والمكونات الساخنة أو الحارة ، مثل الفلفل الحار. ستساعد المعلومات التالية في ضمان قياس مكوناتك بشكل صحيح.

هناك عدة أنواع مختلفة من أدوات القياس المستخدمة لقياس المكونات بشكل صحيح. يتم سرد الأنواع الأكثر شيوعًا من أجهزة القياس أدناه مع وصف موجز لكل منها.

ملاعق القياس: تتكون بشكل عام من 4 ملاعق على الأقل ، وهي مصنوعة من البلاستيك أو المعدن. تستخدم ملاعق القياس لقياس كميات صغيرة من المكونات الجافة والسائلة. من المفيد أن يكون لديك مجموعتان بحيث يمكن استخدام إحداهما للمكونات الجافة والأخرى للمكونات السائلة. هذا يلغي الحاجة إلى غسل وتجفيف الملاعق بعد استخدامها مع المكونات السائلة وقبل استخدامها مع المكون الجاف التالي.

مجموعة من 4 ستتضمن المقاييس الأساسية لـ ملعقة صغيرة ، ونصف ملعقة صغيرة ، وملعقة صغيرة ، وملعقة كبيرة. تتوفر أيضًا مجموعات تشتمل على 1/8 ملعقة صغيرة ونصف ملعقة صغيرة ونصف ملعقة كبيرة.

يوجد أيضًا ملعقة قياس من النوع القابل للتعديل لا تشبه ملاعق القياس النموذجية. وهي عبارة عن حاوية طويلة مشقوقة بها شريط منزلق مع "سدادة" للتحكم في المقدار المحدد من القياس المطلوب.


أكواب القياس الجافة: أكواب فردية بلاستيكية أو معدنية بأحجام مختلفة تستخدم لقياس فردي. تتوفر أيضًا أكواب قياس قابلة للتعديل. يحتوي الكوب على شريط منزلق يمكن تعديله بحيث يمكن للكوب قياس كميات مختلفة. تُستخدم أكواب القياس المتدرجة والقابلة للتعديل لقياس المكونات الجافة ، مثل الدقيق والسكر والشوفان والأرز والمكونات الصلبة ، مثل السمن وزبدة الفول السوداني.

توجد الأكواب ذات القياس الفردي بشكل عام متداخلة في مجموعة متدرجة من 1/3 كوب و 1/3 كوب و 1 / كوب و 1 كوب.قد تجد أيضًا بعض المجموعات التي تشمل 1/8 كوب و 2/3 كوب و / أو نصف كوب. يتم استخدامها لقياس المكونات الجافة ، مثل الدقيق والسكر والشوفان والأرز والمكونات الصلبة ، مثل السمن وزبدة الفول السوداني.


تتوفر أيضًا أكواب قياس قابلة للتعديل. نوع واحد من الكوب القابل للتعديل به شريط منزلق يمكن تعديله بحيث يمكن للكوب قياس كميات مختلفة. تستخدم أكواب القياس القابلة للتعديل لقياس المكونات الجافة والصلبة.


كوب قياس نوع الأسطوانة الموضح هنا هو كوب آخر قابل للتعديل مفيد لقياس المواد الصلبة ، مثل السمن وزبدة الفول السوداني. يتم ضبط الأنبوب على المكان المناسب بالكمية المطلوبة ثم يملأ بالمكون. ثم يتم استخلاص المكون بسهولة عن طريق دفع الأنبوب لإخراج المكونات من الكوب.

أكواب قياس السوائل: حاويات زجاجية أو بلاستيكية شفافة مزودة بفوهة صب ومقبض. وهي متوفرة بشكل عام في أحجام 1 كوب ، 2 كوب ، 4 أكواب و 8 أكواب ، والتي لها قياسات متدرجة على الجانب.

يتم تحديد القياس الكامل لكوب قياس السائل من حافة الكوب للمساعدة في منع انسكاب محتوى الكوب عندما يكون بقياسه الكامل. يساعد الفوهة الموجودة على الكوب في سكب المحتوى عند إضافته إلى مكونات أخرى.

تتوفر أيضًا أكواب قياس بزاوية ، وهي مصممة لتوفير مستويات يمكن رؤيتها بسهولة بحيث يمكن رؤية الكميات المقاسة بسهولة بالنظر إما إلى أسفل الكوب أو عن طريق عرض المستويات المقاسة على جانب الكوب.

الموازين: تستخدم الموازين أو الموازين الزنبركية لقياس وزن المكونات. ستكون موازين التوازن أكثر دقة من موازين الزنبرك.


سيؤدي استخدام الميزان إلى قياس المكونات بدقة أكبر من قياسها بالحجم. الموازين متوفرة في النماذج اليدوية والرقمية.

مجارف التقسيم: مجارف متوفرة بأنواع ميكانيكية وغير ميكانيكية تستخدم للقياس والتقسيم والتشكيل. تعتبر مجارف القياس من الأدوات الشعبية التي يستخدمها الطهاة المحترفون. وهي متوفرة بأحجام متعددة ومرقمة حسب حجمها. كلما زاد الرقم ، قل الحجم.

تتوفر أحجام مغرفة التقسيم
حجم المغرفة ملعقة كبيرة. أوقية السوائل.
#30 2 1
#24 2 3/4 1 1/2
#20 3 1 3/4
#16 4 2
#12 5 2 1/2
#10 6 3
#8 8 4
#6 10 5

المجارف سهلة الاستخدام لقياس الأجزاء المتساوية عند صنع الأطعمة مثل البسكويت والمافن وكرات اللحم. يمكن استخدام رقم 16 لملف تعريف ارتباط متوسط ​​الحجم حيث يتم استخدام رقم 30 أو رقم 24 لملف تعريف ارتباط صغير. يمكن استخدام A # 16 لصنع كرات اللحم و # 6 لتقسيم اللحم للحصول على فطيرة. استخدام مغرفة للقياس ليس ضروريًا ، ولكن إذا كان لديك حجم مناسب لطعام تصنعه بشكل متكرر ، فقد يكون ذلك بمثابة توفير مفيد للوقت.

أوعية الخلط: أوعية بلاستيكية أو زجاجية أو معدنية بأشكال مختلفة يمكن وضع المكونات فيها وقياسها وخلطها.

تتوفر أيضًا أكواب قياس زجاجية وبلاستيكية كبيرة بما يكفي لاستخدامها كأوعية للخلط. تتراوح سعة الكوب من 8 إلى 12 كوبًا وتشبه أكواب قياس السوائل من حيث أنها تحتوي على صنبور ومقبض وقياس العلامات أسفل الجانب. تعمل بشكل جيد للوظائف الكبيرة ويمكن استخدامها لخلط وصب العجين ، مثل الفطيرة أو عجينة الوافل.

استخدم أكواب قياس جافة متدرجة فردية لقياس كميات كبيرة من المكونات الجافة والصلبة وقياس الملاعق لقياس الكميات الصغيرة.

الوزن مقابل الحجم: إذا كانت الوصفة توفر قياسًا للحجم والوزن ، فاستخدم مقياس المطبخ وقياس المكون بالوزن للحصول على الكمية الأكثر دقة. يمكن أن يكون هناك اختلاف في مقدار المكون الجاف ، مثل الدقيق ، الموجود بالفعل في جهاز القياس. يتأثر ذلك بطريقة إضافته إلى كوب القياس ومقدار ضغط المكون. تعتبر الرطوبة أيضًا عاملاً في وزن المكون الجاف. سيؤدي استخدام مقياس لوزن المكون إلى القضاء على التباين وتوفير قياس أكثر دقة. نظرًا لأن الدقيق عمومًا مكون رئيسي في العديد من الوصفات وأنواع الدقيق المختلفة لا تزن نفس الوزن ، فمن المهم أن تكون دقيقًا قدر الإمكان في قياسه.

وزن الطحين - 1 كوب
(أوزان تقريبية)

طرق قياس المكونات الجافة والصلبة: تقاس المكونات حتى حافة كوب القياس أو الملعقة. المبينة أدناه هي الطرق التي يجب استخدامها لبعض المكونات الشائعة المقاسة باستخدام أكواب وملاعق قياس متدرجة.

طحين ، سكر ، صودا خبز ، بيكنج بودر ، كاكاو

أضف ما يكفي من المكونات الجافة بحيث تتكدس فوق الجزء العلوي من كوب القياس عن طريق ملعقة خفيفة من المكونات في الكوب. قد يكون من المفيد تقليب المكونات الجافة ، مثل الدقيق والسكر البودرة وصودا الخبز ومسحوق الخبز لتهوية المكونات وإزالة أي كتل قد تكونت. لا تهز ، أو تنقر ، أو تحزم المكون في الكوب. في حالة القياس بالملاعق ، اسكب المكونات أو اغرفها في الملعقة.


باستخدام الحافة الخلفية للسكين أو أي شيء آخر ذي حواف مستقيمة ، قم بمحاذاة المكون عن طريق تمرير الحافة المستقيمة على طول حافة الكوب أو الملعقة لدفع المكون الزائد بعيدًا.

الشوفان ودقيق الذرة وفتات الخبز والحبوب

أضف هذه الأنواع من المكونات المجففة إلى كوب قياس عن طريق سكبه في الكوب حتى يمتلئ جيدًا ثم قم بتسوية المكونات باستخدام حافة مستقيمة ، مثل الحافة الخلفية للسكين.

الجبن المبشور والأرز وجوز الهند والمكسرات المقطعة ورقائق الخبز وغيرها من المكونات الجافة الضخمة

يجب أن تُسكب المكونات الجافة السائبة ، مثل الجبن المبشور والمكسرات وجوز الهند ، في كوب القياس.

عندما يمتلئ الكوب بما يكفي ، اربت على المكونات برفق واستخدم أصابعك لتسوية المحتويات. لا تحزم المكونات.

السكر البني والسمن

يجب سكب السكر البني والسمن (والدهون الصلبة الأخرى) بملعقة في جهاز القياس وتعبئتهما بإحكام لإزالة أي جيوب هوائية. بعد تعبئتها بإحكام ، يمكن تسويتها بحافة مستقيمة ، مثل الحافة الخلفية للسكين.



عند إزالته من كوب القياس ، سيتم تشكيل السكر البني على شكل الكوب إذا تم تعبئته بشكل صحيح.

زبدة أو سمن في شكل عصا

الزبدة والمارجرين في شكل عصا لها قياسات معلمة على غلافها ، مما يجعلها مريحة للغاية لقياس الكمية المطلوبة. يمكنك ببساطة قطع الكمية المطلوبة وفقًا للعلامات الموجودة على العصا. يتم تمييزها بشكل عام في ملاعق كبيرة. عود واحد يساوي 8 ملاعق كبيرة أو نصف كوب. نصف عود يساوي 4 ملاعق كبيرة أو نصف كوب و 1 ملعقة كبيرة (1/8 عود) يساوي 3 ملاعق صغيرة.

استخدم أكواب قياس بلاستيكية أو زجاجية شفافة ، مع فوهات صب ، لقياس كميات كبيرة من السوائل والمكونات اللاصقة وملاعق القياس لقياس الكميات الصغيرة من هذه المكونات.

المكونات السائلة

صب المكون السائل في كوب القياس حتى تصل إلى القياس المطلوب.

عند التحقق لمعرفة ما إذا كان المكون في المستوى المطلوب ، اجعل كوب القياس يجلس على سطح مستوٍ ومستوٍ وانحني لأسفل لعرض القياس على مستوى العين. لا ترفع الكوب إلى مستوى العين لأن الكوب قد لا يكون مستويًا عند المشاهدة وقد يؤدي إلى قراءة غير دقيقة.
عند استخدام ملاعق القياس ، امسك الملعقة بشكل مسطح واسكب المكون في الملعقة حتى تصل إلى الحافة العلوية للملعقة.

المكونات اللزجة

عند قياس المكونات اللزجة ، مثل الجيلي والعسل ودبس السكر والشراب ، قم بتغطية كوب القياس برفق بالزيت النباتي أو رشه بزيت الطهي. سيسمح الزيت للمكونات اللزجة بالانزلاق بسهولة. إذا كانت الوصفة تتطلب زيتًا ، يمكنك قياس الزيت قبل المكونات اللاصقة ثم استخدام نفس الكوب ، دون غسله ، لقياس المكون اللزج.

يمكن أيضًا المساعدة في إزالة المكونات اللزجة باستخدام أكواب أو ملاعق قياس معدنية وملءها بالماء المغلي لبضع دقائق ثم صب المكونات فيها. سيسمح المعدن الساخن للمكونات اللزجة بالتسرب بسهولة.

في بعض الأحيان تستدعي الوصفة كمية ليست قياسًا قياسيًا ، مثل القرص ، أو الشرطة ، أو الوصفة ، أو النحافة أو التراكم. قد تكون القياسات من هذا النوع مربكة فيما يتعلق بالكمية المحددة للاستخدام. قد تساعد الأوصاف أدناه عند طلب هذه القياسات في الوصفة.

قرصة - قياس يستخدم على المكونات الجافة وهو المقدار الذي يمكنك ضغطه بين إصبعك السبابة والإبهام. إنها أقل من اندفاعة وتعادل حوالي 1/16 ملعقة صغيرة.

داش - كمية صغيرة من المكون تعادل أكثر من 1/16 ملعقة صغيرة ولكن أقل من 1/8 ملعقة صغيرة عند قياس المكونات الجافة. الشرطة المستخدمة لقياس المكونات السائلة تساوي حوالي 3 قطرات.

Jigger - قياس يعادل 3 ملاعق كبيرة أو 1 أونصة سائلة.

ضئيل - يشير القياس الضئيل إلى أنه يجب عليك استخدام أقل قليلاً من القياس الفعلي.

التكديس - مصطلح يستخدم عند قياس المكونات الجافة ، ويشير إلى أنه يجب إضافة مكونات كافية في المقياس بحيث تتراكم فوق حافة كوب القياس أو الملعقة.


شاهد الفيديو: المحاضرة الثانية لعلم الاحياء الدقيقة الجزء 1 (شهر نوفمبر 2022).