معلومة

إنشاء ناقلات T

إنشاء ناقلات T


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أعمل على استنساخ TA لأول مرة وأحتاج إلى تحويل بعض العمود الفقري البلازميد الموجود إلى متجهات T. أنا أستخدم جزء Klenow (3 '-> 5' exo-) إلى dA-tail إدخالاتي. هل هناك أي سبب يمنعني من استخدام جزء Klenow هذا لتصميم متجهاتي باستخدام تفاعل مماثل تم إعداده؟ شكرا مقدما على أي فكرة!


أنا شخصياً سأستخدم بوليميراز DNA Taq لتعليق إدخالاتي ، خاصةً إذا كنت تقوم بتضخيم الإدخال. إنه يترك حرف A متدليًا في نهاية جميع الأمبليكونات محليًا. كل ما عليك فعله هنا هو إضافة بعض Taq في نهاية التفاعل والاحتضان لمدة 15 دقيقة عند 72 $ ^ Circ $C ، ستعمل في أي مخزن مؤقت لـ PCR والعديد من مخازن إنزيم التقييد أيضًا.

بشكل عام ، تكون المتجهات هي التي لها تراكب T ، ولكن هذا إرث عندما كان Taq هو البوليميريز الوحيد الموجود تقريبًا ، لذلك لا يوجد سبب يمنعك من الحصول على إدراج مع T والمتجه مع A.

كملاحظة عامة ، غالبًا ما يكون من الأسهل هذه الأيام (وأرخص (عندما تضع في الاعتبار تكلفة وقتك وما إلى ذلك) + أسرع) شراء ناقل استنساخ TA مناسب مصنوع مسبقًا ، فهي موثوقة للغاية ويجب أن تعمل في كل مرة ، وهو ليس بالضرورة شيئًا يمكنك قوله عن المنتجات المنزلية.

خيار آخر ، إذا كان يناسب سير العمل الخاص بك ، هو إضافة مواقع تقييد إلى الاشعال الخاص بك وتضخيم الإدخال بواسطة PCR. يمكنك بعد ذلك هضم الإدخال المتضخم والمتجه باستخدام إنزيم التقييد المختار والحصول على استنساخ اتجاهي (حيث يتم إدخال الإدخال دائمًا في نفس الاتجاه ، وهو مفيد بشكل خاص لتعبير البروتين). يتيح لك هذا أيضًا القيام بأشياء مثل إدراج علامات قصيرة (مثل FLAG و HA و V5) وإجراء تعديلات على الإطار وحتى تعديل نهايات التسلسل.


ناقل PRESAT: ناقل T غير متماثل للفحص عالي الإنتاجية لنطاقات البروتين القابل للذوبان للبروتينات الهيكلية

قسم الفيزياء الحيوية الجزيئية ، كلية الدراسات العليا للعلوم المتكاملة ، جامعة مدينة يوكوهاما ، 1-7-29 سوهيروتشو ، تسورومي ، يوكوهاما ، كاناغاوا 230-0045 ، اليابان فاكس: 81-45-508-7361.

كلية الدراسات العليا للعلوم المتكاملة ، جامعة مدينة يوكوهاما ، يوكوهاما ، كاناغاوا 230-0045 ، اليابان

كلية الدراسات العليا للعلوم والهندسة ، جامعة إهيم ، ماتسوياما ، إهيمه 790-8577 ، اليابان

كلية الدراسات العليا للعلوم المتكاملة ، جامعة مدينة يوكوهاما ، يوكوهاما ، كاناغاوا 230-0045 ، اليابان

كلية الدراسات العليا للعلوم المتكاملة ، جامعة مدينة يوكوهاما ، يوكوهاما ، كاناغاوا 230-0045 ، اليابان

كلية الدراسات العليا للعلوم المتكاملة ، جامعة مدينة يوكوهاما ، يوكوهاما ، كاناغاوا 230-0045 ، اليابان

قسم الفيزياء الحيوية الجزيئية ، كلية الدراسات العليا للعلوم المتكاملة ، جامعة مدينة يوكوهاما ، 1-7-29 سوهيروتشو ، تسورومي ، يوكوهاما ، كاناغاوا 230-0045 ، اليابان فاكس: 81-45-508-7361.

الملخص

يتم وصف طريقة سريعة أحادية الاتجاه لاستنساخ شظايا (كدنا) التي تم تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أي ناقل تعبير بروتين اندماج. تعتمد الطريقة ، المسماة استنساخ PRESAT-vector ، على تقنية T-vector التي لا تتطلب تقييد نوكلياز داخلي هضم لمنتج PCR. بعد ذلك ، طبقنا طريقة اختيار ORF جديدة لمنتجات البلازميد المربوطة. تتضمن هذه الخطوة الثانية علاج نوكلياز مقيد يقضي على البلازميدات التي تحتوي على ORF في الاتجاه الخاطئ قبل التحول إلى المضيف البكتيري لمزيد من دراسات التعبير عن البروتين. لتحقيق هذا الاختيار ، قمنا بتخصيص تسلسل 5′ لبادئ PCR "الخلفي" المقابل للنهاية C للبروتين المراد التعبير عنه. كانت المستعمرات تؤوي فقط المنتجات المربوطة بالاتجاه المطلوب بكفاءة تصل إلى 90٪. يتم تطبيق هذه الطريقة على نظام تعبير اندماج GST ، وتم اختبار نظام HTS للبروتينات القابلة للذوبان من مكتبة التعبير.

اسم الملف وصف
Goda_Supp.pdf277.9 كيلوبايت المواد التكميلية الإلكترونية (ESM) لـ Goda et al. (2003) بعنوان "ناقل PRESAT. ناقل T غير المتماثل لفحص الإنتاجية العالية لمجالات البروتين القابلة للذوبان من أجل البروتينات الهيكلية ".

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


تتميز IMC بالقدرة على إجراء عمليات تجربة الاستنساخ على الكمبيوتر. في هذه الحالة ، البيانات الخاصة غير ضرورية ومن الممكن استنساخ بيانات تسلسل الحمض النووي التي يمكن الحصول عليها من قاعدة بيانات عامة مثل GenBank أو EMBL كما هي. للاستنساخ ، يمكن إجراء عملية هضم إنزيم التقييد ، وتصميم تمهيدي PCR ، وتضخيم PCR ، والربط دون تغيير التسلسل المشروح. يتم إخراج جميع منتجات الاستنساخ الناتجة بتنسيق GenBank / EMBL. نظرًا لأنه يتم لصق معلومات Primer وتخزينها في تسلسل DNA ، فهي مفيدة أيضًا لإدارة Primer.

إنها وظيفة استنساخ يمكنها بالفعل قطع / ربط.

في تجربة استنساخ السيليكو ممكن.

سوف يساعدك على فهم تجارب البيولوجيا الجزيئية غير المرئية. يمكن استخدامه لمساعدة ومحاكاة تجارب البيولوجيا الجزيئية.

يمكنك بناء ناقل تعسفي / بلازميد.

سنقوم بإدراج إنزيمات التقييد المثلى لفحص إدراج Vector ونحاكي نتائج الرحلان الكهربائي للهلام.

  • علاج إنزيم التقييد (خريطة إنزيم التقييد ، توليد شظية هضم إنزيم التقييد ، قائمة مرشح إنزيم التقييد الأمثل لفحص الإدخال ، أخرى)
  • تصميم PCR التمهيدي ،
  • تصميم تمهيدي لتجنب ميزات محددة ،
  • تكرار PCR (بما في ذلك الشرح) ،
  • تصميم تمهيدي دفعة لتضخيم جميع الجينات ،
  • إدارة الربط التمهيدي ، الربط الذاتي ،
  • التحقق من توافق شكل نهاية الجزء الأساسي
  • إنشاء خريطة بلازميد (إدراج وظيفة نفخ المنطقة) (مراسلات نمط التخطيط)
  • وصف إضافة موقع التعرف على إنزيم التقييد لاستنساخ نهاية الحمض النووي مع شرح توضيحي
  • تفتيت طرفي للحمض النووي ، الفسفرة (نزع الفسفرة
  • استخراج المنطقة التعسفي للتسلسل الأساسي المشروح

الفئات الفرعية

الاستنساخ في السيليكو 1

باستخدام IMC في وظيفة استنساخ السيليكو ، يمكن تجربة الاستنساخ المستمر على جهاز الكمبيوتر أو جهاز Mac.

يمكن أن يتم هضم تسلسل الحمض النووي الجيني باستخدام إنزيم التقييد ، والهلام الكهربائي للجزء ، والربط بالناقل المفتوح ، وما إلى ذلك على التوالي.

إنزيم التقييد 12

باستخدام وظيفة إنزيم التقييد لـ IMC ، إذا تمت إضافة التعليق التوضيحي (الميزة) إلى تسلسل قاعدة الحمض النووي الأصلي ، فيمكن تجزئته مع الاحتفاظ بالتعليق التوضيحي.

إذا تم تقسيم إحدى السمات بواسطة إنزيم تقييد ، فإن ميزتها نفسها موروثة ، ولكن في بعض الحالات ، قد يتم تغيير مفتاح الميزة تلقائيًا.

يتم الاحتفاظ بالشكل النهائي لشظايا الإنزيم المقيد المهضوم بشكل صحيح. من خلال القيام بذلك ، نتحقق مما إذا كان الربط ممكنًا عند إجراء الربط بين القطع.

في الإشريكية القولونية ، يمكن التحقق مما إذا كان موقع المثيلة يؤثر على هضم إنزيم التقييد.

من الممكن أيضًا تسجيل إنزيمات التقييد المستخدمة بشكل متكرر كمجموعة.

من الممكن أيضًا تسجيل إنزيمات التقييد المقدمة حديثًا أو حذف إنزيمات التقييد التي لم تعد مستخدمة.

إدارة إنزيم التقييد

  • اختيار مجموعة جزئية ،
  • التصفية حسب النوع
    • تمييز عدد القواعد المعترف بها
    • باليندروميك
    • التمييز بين النهايات الناعمة والبارزة
    • حضور / غياب DAM / DCM
    • الاختلاف حسب عدد نقاط القطع

    وظيفة البحث عن موقع التعرف على إنزيم التقييد

    • اختيار منطقة البحث ،
    • البحث في موقع التعرف ،
    • عرض قائمة مواقع التعرف ،
    • عرض خريطة التقييد ،
    • البحث الجماعي من متواليات متعددة

    تصميم التمهيدي 14

    IMC لديها العديد من طرق تصميم PCR Primer.

    القدرة على سحب تسلسل النوكليوتيدات ببساطة على حارة التسلسل وتسجيله كتمهيدي

    القدرة على تصميم الميزات في حارة الميزة والبادئات لتضخيم داخل وخارج المنطقة المحددة

    • تصميم تمهيدي لتضخيم المنتجات المضمنة ، بما في ذلك الميزات المحددة لممرات الميزات
    • تصميم تمهيدي لتضخيم المنتج الذي يحتوي على أو يحتوي على المنطقة الجينومية المحددة لحارة الميزة

    وظيفة تصميم البادئات التي تضخم عددًا كبيرًا من المناطق في وقت واحد (مع وظيفة التصميم المتكرر: إنها وظيفة لتكرار التصميم حتى لا توجد منطقة لا يمكن تصميمها)

    • دفعة تصميم PCR Primer Design Batch PCR تمهيدي لتضخيم جميع الميزات باستخدام مفتاح الميزة المحدد على الجينوم
    • الجينوم الكامل الذي يغطي PCR Primer Design تصميم PCR التمهيدي الذي يتداخل فيه منتج PCR تمامًا مع الجينوم الكامل أو منطقة الجينوم الكبيرة مع تداخل منتج PCR
    • تصميم التمهيدي التسلسلي: تصميم التمهيدي التسلسلي لتسلسل أجزاء الحمض النووي التي لا يمكن تغطيتها بسلك واحد من جهاز التسلسل الشعري
      المرجعي

    فيما يلي وظيفة لتصميم مجموعة من البادئات لاستنساخ أجزاء متعددة من الحمض النووي مرة واحدة ، مثل تصميم مجموعة الجينات. من التصميم إلى الاستنساخ ، يمكنك تحميل المنتجات المستنسخة في IMC.

    • تصميم In-Fusion الإصدار 1: وظيفة تصميم أولية لاستنساخ In-Fusion
    • In-Fusion Design & Build الإصدار 2: وظيفة التصميم التمهيدي لاستنساخ In-Fusion
    • In-Fusion Design & Build Ver. 3: القدرة على تصميم وبناء مجموعات الجينات عن طريق إسقاط شظايا الحمض النووي لإدخالها في متواليات ناقلات
    • تصميم وبناء مجموعة الجينات الدفعية: القدرة على تصميم وبناء العديد من مجموعات الجينات عن طريق استبدال مجموعات الجينات التي تشكل الكتلة
    • تصميم وبناء اندماجي: القدرة على الجمع بين التصميم وبناء جزء يشكل كتلة جينية

    تفاعل PCR 1

    في وظيفة PCR لـ IMC ، يتم البحث في موقع التمهيد لمجموعة التمهيدي المسجلة من تسلسل قاعدة الجينوم. إذا كان كلا البادئين يحتويان على موقع فتيل على الجينوم ، فإن PCR يضخم المنطقة المحصورة بين البادئات.

    في هذه الحالة ، يمكن جعل الأدينين يبرز بقاعدة واحدة. يتم استخدامه لاستنساخ TA.

    يتم توريث التعليق التوضيحي أيضًا في منتج PCR المضخم عندما يتم شرح تسلسل الحمض النووي للقالب (الميزة).

    من الممكن أيضًا إجراء PCR على تسلسلات DNA متعددة القوالب.

    ربط 3

    • يعتبر الربط تجربة أساسية لإجراء الاستنساخ الجزيئي. تجمع IMC بين متواليات النيوكليوتيدات المختلفة بما في ذلك متواليات النيوكليوتيدات المشروحة مع بعضها البعض بنفس الطريقة كما في تجارب الاستنساخ الفعلية لتوليد المنتجات. نجحت جميع التعليقات التوضيحية بشكل صحيح أيضًا على منتجات الربط ويمكن تحليل منتجاتها باستخدام العديد من وظائف IMC بالإضافة إلى التسلسل الأساسي الأصلي.
    • إذا كانت التسلسلات الطرفية تتطابق بشكل مكمل مع بعضها البعض ، فقم بربطها في تسلسل أساسي واحد.
    • يمكن ربط ما يصل إلى 5 أجزاء مجزأة.
    • يمكنك إنشاء جميع سلاسل الربط الممكنة.
      • في الإصدار 7.24 وما بعده ، يتم احتساب التسلسل التكميلي الكامل لمنتج الربط كمنتج منفصل.
      • يعرض أيضًا نمط الرحلان الكهربائي للهلام عند استخدام إنزيمات التقييد هذه.

      • يمكن تحليل التسلسل الأساسي الذي تم إنشاؤه كمنتج ربط بنفس طريقة تحليل التسلسل الأساسي الأصلي.
      • بالنسبة للتسلسلات المشقوقة من إنزيم التقييد على IMC ، يتم إنشاء مفاتيح ومؤهلات خاصة تشير إلى حالة المحطة الطرفية.

      جسر كونتيجس 0

      عندما يتم البحث عن سلسلة من منتجات PCR عن مجموعة متواليات contig وجسور منتج PCR بين كونتيجين ، اجمع contigs في تسلسل واحد.

      خريطة البلازميد 1

      لإنشاء خريطة Plasmid ، يرجى الاطلاع على Plasmid Map Viewer.

      الرحلان الكهربائي للهلام 0

      عندما يتم هضم تسلسل الحمض النووي وتجزئته باستخدام إنزيم التقييد ، عند إجراء تضخيم PCR ، يمكن عرض الربط كنتيجة للرحلان الكهربائي للهلام لتلك المنتجات.

      تعديل نهاية الجزء 0

      يمكنك تعديل نهايات تسلسل أجزاء الحمض النووي.

      وظائف تعديل المحطة التي توفرها حالياً IMC هي كما يلي.

      المعالجة البيولوجية الجزيئية

      • Blunting (blunting بواسطة T4 DNA Polymerase ، blunting بواسطة Mung Bean Nuclease)
      • الفسفرة
      • نزع الفسفرة
      • Adenine overhang على منتج PCR

      العلاج البيولوجي غير الجزيئي

      • إنتاج تسلسل مع الثايمين البارز (T-Vector)
      • إرفاق تسلسل التعرف على إنزيم التقييد

      ابحث عن مجموعة RE لإدراج الاختيار 0

      إذا تم شق طرفي جزء الحمض النووي المراد إدخاله بنفس إنزيمات التقييد أو كان لهما نهايات حادة بالربط وما إلى ذلك ، فإن مرشح إنزيم التقييد الأمثل لعرض اتجاه الإدخال يُشار إليه بواسطة مخطط الرحلان الكهربائي للهلام.

      إعادة التركيب المتماثل 0

      في وظيفة تصميم الجينوم ، تم تصميم ذراع التماثل لإعادة التركيب المتماثل من المنطقة ليتم إعادة تجميعها بشكل متجانس وتسلسل الإدخال.

      تُستخدم هذه الوظيفة لإعادة تجميع تسلسل الإدراج مع ذراع التماثل المصمم في الجينوم.

      الاستنساخ الزائف 0

      بغض النظر عن البيولوجيا الجزيئية ، معالجة التسلسل الأساسي عن طريق التلاعب بالمعلومات


      نتائج

      تصميم المتجهات

      لقد أنشأنا مجموعة من الحمض النووي تمثل العناصر التنظيمية التي يتم دمجها مع البلازميدات المانحة والمقبلة. تم تصغير حجم عناصر الحمض النووي هذه لتحسين كفاءة تعداء العدوى. تم تقديم علامات مختارة لتوليد خطوط الخلايا المستقرة ، وتم توحيد الوصلات بين العناصر التنظيمية للاستنساخ الاختياري عالي الإنتاجية وإعادة الاستخدام الفعال لأشرطة التعبير الموجودة. يتكون بناء بلازميد التعبير متعدد الجينات من ثلاث خطوات بسيطة فقط (الشكل 1). أولاً ، تم تجميع ثماني شظايا في خطوة واحدة لبلازميد متقبل أو مانح. هذه الخطوة مطلوبة فقط عندما يتم بناء متجه تعبير بميزات جديدة تمامًا (على سبيل المثال ، مُروج أو علامة جديدة). يتم تقديم نظرة عامة مفصلة على البناء ، بالإضافة إلى المتجهات المتاحة حاليًا ، في الأشكال التكميلية S1 و S2 و S3. ثانيًا ، تم إدخال الجين المعني عن طريق طريقة استنساخ مفضلة في المتقبل أو المتبرع ، مما أدى إلى ناقل تعبير لبروتين واحد. يمكن بسهولة نقل أشرطة التعبير الموجودة من النواقل المستندة إلى pcDNA أو pEGFP بواسطة PCR باستخدام بادئات قياسية (الشكل التكميلي S4). أخيرًا ، تم استخدام إعادة التركيب بوساطة Cre في المختبر لتجميع نواقل المانحين والمستقبلات في بلازميد متعدد التعبيرات ، متبوعًا بالتحول إلى بكتريا قولونية واختيار المزيج المناسب من المضادات الحيوية. حاليًا ، أنشأنا ثمانية نواقل مانحة بأربعة جينات مقاومة للمضادات الحيوية مستقلة. يمكن دمجها مع ناقل متقبل واحد ينتج عنه بلازميد مع ما يصل إلى خمسة أشرطة تعبير (الشكل التكميلي S5). يمكن تمديد مجموعة البلازميد هذه بسهولة إعلان ليب عن طريق إدخال المزيد من علامات مقاومة المضادات الحيوية. يمكن إدخال أشرطة تعبير إضافية في كل متجه مانح باستخدام موقع فريد من نوعه I-CeuI للنووكلياز الداخلي في المنطقة الخاصة (الشكل التكميلي S6).

      (أ) تم إنشاء مكتبة من العناصر التنظيمية المتوافقة. تشير الأسطر المتعددة للجزء إلى الاختلافات المتاحة. (ب) يتم إنشاء البلازميدات المانحة والمقبلة من هذه المجموعة من العناصر التنظيمية. (ج) يتم إدخال الجينات ذات الأهمية في ناقل المتبرع أو المستقبِل ، مما يؤدي إلى نواقل التعبير للجينات المرغوبة. (د) يتم دمج واحد إلى أربعة نواقل مانحة في ناقل متقبل واحد في خطوة واحدة أو في عملية تكرارية. (ه) يتم اختيار البلازميدات بالمضادات الحيوية المناسبة والتحقق منها عن طريق تقييد الهضم. (F) ثم يتم استخدام البلازميدات لنقل خلايا الثدييات. شريط مقياس ، 50 ميكرومتر.

      تعبير متجانس لخمسة بروتينات من بلازميد واحد

      للتحقق من صحة نظامنا ، قمنا بمقارنة خلايا HEK293 المنقولة بشكل عابر باستخدام بلازميد MultiLabel الذي يشفر خمسة بروتينات فلورية مع خلايا تم نقلها بشكل مشترك مع ناقلات التعبير الأبوي الفردية. أدى ترنسفكأيشن المشترك إلى خليط غير متجانس من الخلايا ، بما في ذلك العديد من الخلايا التي تفتقر إلى التعبير عن بروتين واحد أو عدة بروتينات (الشكل 2 أ). في المقابل ، عبّرت الخلايا المنقولة عن طريق MultiLabel بكفاءة عن جميع البروتينات الفلورية الخمسة بمستويات مماثلة (الشكل 2 ب). كشف التحديد الكمي لمستويات التعبير على مستوى الخلية الواحدة عن وجود علاقة ثابتة بين مستويات التعبير للبروتينات الفردية (الشكل التكميلي S7).

      (أ) تم نقل خلايا HEK293 بشكل عابر بمزيج من خمسة بلازميدات ، كل منها يحتوي على شريط تعبير لبروتين فلورسنت واحد أو (ب) بلازميد MultiLabel واحد يحتوي على خمسة أشرطة تعبير لبروتينات الفلورسنت. انظر أيضًا الشكل التكميلي S7 للحصول على أمثلة مع أشرطة التعبير 2 و 3 و 4 ، بالإضافة إلى القياس الكمي لمستويات التعبير. (ج) توليد خطوط خلوية مستقرة. تم نقل خلايا PAE باستخدام بلازميد خطي يحتوي على خمسة أشرطة تعبير للعلامات الخلوية ثم تم اختيارها باستخدام G418. EBFP2-Nuc / EBFP2 مع إشارة توطين نووي mTFP1-FYVE / mTFP1 مع مجال ربط PI-3-P FYVE EYFP-Tubulin / EYFP مدمج في tubulin Mito-dsRed / dsRed مع توطين الميتوكوندريا Plum-PLCδ-PH / Plum fused to مجال تجانس pleckstrin الملزم PI-4،5-P2 لـ PLCδ. يعرض الفيلم التكميلي 1 فيلم بفاصل زمني لخط الخلية هذا. أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر.

      توليد خطوط خلوية مستقرة

      لقد أنشأنا البلازميدات المستقبلة التي تحتوي على شريط Flp-In للتكامل القائم على إعادة التركيب في جينومات الثدييات وجين مقاومة G418 للاختيار من أجل التكامل العشوائي (انظر الشكل التكميلي S3). يسمح نظام Flp-In بالتكامل القائم على إعادة التركيب لنسخة واحدة من الجينات المحورة في موضع محدد 9 (يتم توزيعها بواسطة Invitrogen). لذلك فإن هذا النظام مفيد جدًا لاختبار سلسلة من الطفرات في اختبار بيولوجي للخلية. حدث تكامل فعال قائم على FRT في خلايا Flp-In باستخدام تركيبات MultiLabel دائرية أصغر من 15 كيلو بايت. لتكامل بلازميدات MultiLabel الأكبر حجمًا ، قمنا بتقسيم بنية متعددة الجينات عن طريق الشق في موقع فريد من نوعه للنوكلياز الداخلي (I-SceI في pSI-AKR7 و AAL6 الشكل التكميلي S3). فقط تعداء هذه البلازميدات الخطية هي التي سمحت بتوليد خطوط خلوية تعبر في نفس الوقت عن عدة جينات منقولة (الشكل 2 ج). الفيلم التكميلي 1 هو فيلم بفاصل زمني لخط الخلية هذا يعبر عن خمس علامات دون خلوية بعلامات الفلورسنت (EBFP2-Nuc و mTFP1-FYVE و EYFP-Tubulin و Mito-dsRed و Plum-PLCδ-PH). لتعظيم فعالية التكامل ، أنشأنا بعد ذلك ناقلًا متقبلًا (pSI-AKR8) مع اثنين من علامات الاختيار حقيقية النواة. يؤدي هضم التجميع على أساس pSI-AKR8 مع I-SceI إلى جزء خطي بعلامات اختيار في كلا الطرفين (الشكل التكميلي S8). فقط الخلايا التي تدمج الجزء بأكمله مع جميع أشرطة التعبير وعلامات المقاومة المحيطة بها هي التي ستنجو من التحديد مع G418 و zeocin.

      التحليل البيوكيميائي للخلايا المنقولة بشكل عابر

      كانت كفاءة ترنسفكأيشن لبناء 21 كيلو بايت يشفر خمسة بروتينات فلورية تقريبًا 20٪ في خلايا HEK293 و1-5٪ في خلايا البطانة الأبهرية أو خلايا COS. كانت مستويات التعبير من 20-25 كيلوبايت ترميز التركيبات على سبيل المثال مستقبلات التيروزين كينازات والبروتينات المرتبطة بها كافية للتحليل الكيميائي الحيوي. ثم كنا مهتمين بمعرفة ما إذا كانت نسب التعبير متطابقة بالنسبة للتركيبات المستقبلة والمانحة 1 والمانحة 2 والمقبولة والمانحة 2 والمانحة 1. قارنا مستويات التعبير النسبي لـ SNX5 – SNX1 – EGFR (1.0 / 1.4 / 0.3) ببناء SNX5 – EGFR – SNX1 (1.0 / 1.5 / 0.3). وبالمثل ، أظهرت مقارنة SNX5 – SNX2 – EGFR (1.0 / 1.2 / 0.7) مع الخلايا المنقولة SNX5 – EGFR – SNX2 (1.0 / 1.2 / 0.8) نسب تعبير مماثلة لجميع البروتينات (الشكل 3). لذلك فإن تسلسل التجميع ليس مهمًا للتعبير.

      تقوم جميع التركيبات بتشفير myc-SNX5 (متقبل في جميع التركيبات الأربعة) و EGFR (Donor1) و myc-SNX1 أو myc-SNX2 (مانح 2). يتم ترتيب أشرطة التعبير في التسلسل التالي: SNX5 – SNX1 – EGFR (الممر 2) ، SNX5 – EGFR – SNX1 (الممر 3) ، SNX5 – SNX2 – EGFR (الخط 4) و SNX5 – EGFR – SNX2 (الممر 5). تم تحميل Lysates من الخلايا غير المنقولة على الممر 1. كفاءة تعداء الخلايا كافية للتحليل الكيميائي الحيوي عن طريق النشاف الغربي. لا يؤثر الترتيب المختلف لشريط التعبير (SNX5 – SNX1 – EGFR مقابل SNX5 – EGFR – SNX1) على مستويات التعبير النسبي. يتم عرض الأوزان الجزيئية بالكيلو دالتون.

      تظهر الخلايا التي تعبر عن بروتينات متعددة فسيولوجيا طبيعية

      أخيرًا ، قمنا بالتحقق من صحة نظام MultiLabel في اختبار بيولوجي للخلية باستخدام مجموعة من البلازميدات التي تشفر أجهزة الاستشعار ذات العلامات الفلورية. تعبر مستشعرات Rab عن GTPases الصغيرة Rab5 و Rab4 و Rab11 أو Rab5 و Rab4 و Rab7. ترتبط هذه البروتينات بحويصلات مختلفة في الحيز الداخلي 10. يتعرف مستشعر الفوسفوينوزيتيد (PI) على PI-3-P (مجال FYVE) و PI-4،5-P2 (PLCδ-PH) و PI-3،4،5-P3 (BTK-PH) 11. تم نقل خلايا COS ، التي تعبر بشكل داخلي عن مستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) ، بشكل عابر باستخدام تركيبات المستشعرات هذه ثم تحفيزها باستخدام EGF المسمى بالفلوريسنت (EGF-Alexa647). بعد عشرين دقيقة من تحفيز الخلايا باستخدام EGF-Alexa647 ، تم توطين EGFR مع PI-3-P و Rab5 و Rab4 ، مما يدل على أن المستقبل قد تم استيعابها كما هو متوقع. لوحظ توطين طفيف مع Rab11 (إعادة تدوير الإندوسومات). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت الكشكشة الغشائية البلازمية المستحثة بـ EGF إيجابية لـ PI-3،4،5-P3 (الشكل 4 أ ، ب). يظهر في الشكل 4 ج سلسلة الفاصل الزمني لخلية COS المحفزة بـ EGF المنقولة باستخدام mCitrine-Rab5 و mCherry-Rab7 و mTFP1-Rab4. تم توطين EGFR في البداية بشكل حصري مع Rab5 (الإندوسومات المبكرة) ولاحقًا مع Rab5 و Rab7 (الإندوسومات المتأخرة). تم العثور على EGF بشكل أساسي داخل الحويصلات ، بينما تم العثور على بروتينات Rab على غشاء الحويصلات. في كثير من الأحيان ، كانت الأجزاء الفرعية فقط من الحويصلات إيجابية لبروتينات راب. تشير هذه النتائج إلى أن الفسيولوجيا الطبيعية للخلايا لم تتأثر عندما تم التعبير عن هذه المستشعرات في وقت واحد.

      تم نقل خلايا COS بشكل عابر باستخدام ترميز بناء (أ) ثلاثة بروتينات مختلفة مرتبطة بالفوسفوينوزيتيد أو (ب) ثلاثة بروتينات راب مختلفة ثم تحفيزها باستخدام EGF-Alexa647 لمدة 20 دقيقة. في هذه المرحلة الزمنية ، شارك EGFR في الترجمة مع مجال FYVE المرتبط بـ PI-3-P (الأسهم) في الإندوسومات المبكرة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت الكشكشة التي يسببها EGF في غشاء البلازما موجبة لـ PI-3،4،5-P3 (BTK-PH) و PI-4،5-P2 (PLCδ-PH) (رؤوس الأسهم). في الخلايا التي تعبر عن مستشعر Rab ، تم توطين EGFR بشكل أساسي مع Rab5 و Rab4 (الأسهم). (ج) تم نقل خلايا COS بشكل عابر باستخدام ترميز بلازميد MultiLabel mCitrine-Rab5 و mTFP1-Rab4 و mCherry-Rab7. تم تحفيز الخلايا باستخدام EGF-Alexa647 ومراقبتها لمدة 45 دقيقة. كما هو متوقع ، تم العثور على EGF في حويصلات إيجابية Rab5 بعد الإضافة بوقت قصير (تي=8/تي= 16 ، سهام). في وقت لاحق ، تم العثور عليه أيضًا في حويصلات إيجابية Rab7 (رؤوس سهام). أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر (أ, ب) 5 ميكرومتر (ج).


      وظيفة

      • يمكن عرض ملفات متعددة بالتوازي.
      • يتوافق مع ملف تنسيق ABI ، SCF.
      • يتم عرضها في نافذة منفصلة منفصلة عن خريطة المعالم الرئيسية.
      • يمكن تغيير حجم نافذة عارض تتبع شكل الموجة.
      • يمكنك التغيير عن طريق سحب موضع العرض لكل شكل موجة.
      • يمكنك تغيير ارتفاع إطار عرض شكل الموجة.
      • يمكنك تغيير لون الشاشة حسب القاعدة.
      • يمكن تمرير كل شكل موجة أفقيًا بشكل مستقل.
      • إذا تمت محاذاة موضع كل شكل موجي تتبع ، فيمكنك التمرير المتشابك بشكل جانبي.
      • يمكنك تغيير عرض شكل الموجة وارتفاعه بحرية باستخدام شريط التمرير.
      • يمكنك البحث عن مواقع التعرف على إنزيمات التقييد وتمييز التسلسلات بعد البحث.
      • يمكنك أيضًا البدء من نتيجة تنفيذ Trace Mapping.

      الوسم والتلوين 0

      نافذة الوصف 2

      نافذة الوصف هي نافذة لإدخال وتحرير القيم في مؤهل الميزة.

      تم إطلاقها بالنقر بزر الماوس الأيمن على الميزة ويمكنك تعديل جميع المؤهلات لهذه الميزة.

      تغيير موضع الميزة.

      قم بتغيير مفتاح الميزة الذي تنتمي إليه الميزة.

      عارض ملف تسلسل الأحماض الأمينية 2

      هذا عارض يعرض ملفات تعريف مثل البنية الثانوية لتسلسل الأحماض الأمينية بالتوازي. من الممكن تصميم وعرض ملف التعريف الكلي وعرض الزخارف وما إلى ذلك.

      عارض المحاذاة المتعددة 1

      عارض المحاذاة المتعددة هو نافذة لعرض المحاذاة المتعددة لتسلسل الحمض النووي وتسلسل الأحماض الأمينية.

      يمكن تشغيل عارض المحاذاة المتعددة من مربع حوار نتائج بحث التماثل وما إلى ذلك.


      PGP-B2E ، ناقل ربط TA / TB متوافق مع إعادة الارتباط لاستنساخ الجينات السريع وغير المكلف

      يعد استنساخ الحمض النووي الخطوة الأساسية لمختلف مجالات علوم الحياة ، وقد تم بذل العديد من الجهود لتبسيط هذا الإجراء. في هذه الدراسة ، أبلغنا عن اثنين من البلازميدات للأغراض العامة (pGP) ، pGP-XB2E و pGP-B2E ، لبناء سريع وفعال من حيث التكلفة للنسخ الأساسية. ال Bciالسادس و X سمتم تصميم مواقع الانقسام I في pGP-XB2E لاختبار كفاءة خطية البلازميد. يتمتع البلازميد بكفاءة خطية أفضل باستخدام BciVI الذي يمكنه هضم 2 ميكروغرام بلازميد بالكامل تقريبًا في 10 دقائق مع عُشر تركيز الإنزيم الموصى به فقط. من أجل زيادة تحسين pGP-XB2E ، تم إزالة البلازميد الجديد ، pGP-B2E ، X سمأنا تم تصميم موقع الانقسام. هذا المتجه ذو كفاءة عالية في استنساخ منتجات PCR حتى 1812 نقطة أساس ، وكان عدد المستعمرات حوالي خمسة أضعاف عدد pGP-XB2E. بالإضافة إلى استنساخ TA ، يمكن ربط منتجات PCR غير الحادة مع T المنتهية في التمهيدي بشكل إيجابي بـ T-vector pGP-B2E بدون معالجة A-tailing (استنساخ السل). علاوة على ذلك ، كمتجه دخول ، كان pGP-B2E متوافقًا أيضًا مع تفاعل إعادة تركيب البوابة بدون طفرات تغيير الإطارات. بشكل عام ، يوفر هذا المتجه طريقة عالمية وسريعة وفعالة من حيث التكلفة للاستنساخ الجزيئي الأساسي.

      هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


      Todd، A. E.، Orengo، C.A & amp Thornton، J.M. تطور الوظيفة في عائلات البروتين الفائقة ، من منظور هيكلي. جيه مول. بيول. 307, 1113–1143 (2001).

      Gerlt، J.A & amp Babbitt، P.C. الأنزيمات الفائقة المتنوعة ميكانيكيًا: أهمية الكيمياء في تطور الحفز. بالعملة. رأي. تشيم. بيول. 2, 607–612 (1998).

      فريدمان ، د.ر. & مارمورشتاين ، ر. هيكل وآلية إنزيمات أسيتيل ترانسفيراز البروتين غير هيستون. FEBS J. 280, 5570–5581 (2013).

      Lombard، V.، Golaconda Ramulu، H.، Drula، E.، Coutinho، P. M. & amp Henrissat، B. قاعدة بيانات الإنزيمات النشطة للكربوهيدرات (CAZy) في 2013. الدقة الأحماض النووية. 42، D490-D495 (2014).

      لي ، ت. وآخرون. توصيف وتوقع مواقع أسيتيل محددة ليسين (ك) - أسيتيل ترانسفيراز. مول. زنزانة. البروتيوميات. 11، M111.011080 (2012).

      ليم ، إ. وآخرون. تطور التعرف على الركيزة عبر عائلة متعددة الجينات من الجليكوزيل ترانسفيرازات في A.داء الكلب. علم الجليكوبيولوجيا 13, 139–145 (2003).

      مودولو ، إل في وآخرون. نهج علم الجينوم الوظيفي للجليكوزيل الفلافونويد (iso) في البقوليات النموذجية ميديكاغو truncatula. مصنع مول. بيول. 64, 499–518 (2007).

      Lairson، L. L.، Henrissat، B.، Davies، G. J. & amp Withers، S.G Glycosyltransferases: الهياكل والوظائف والآليات. Annu. القس Biochem. 77, 521–555 (2008).

      Cartwright، A. M.، Lim، E.-K.، Kleanthous، C. & amp Bowles، D.J. تحليل حركي للجلوكوزيل النوعي عن طريق اثنين من الجليكوزيل ترانسفيراز من Arabidopsis thaliana: تبادل المجال لتقديم أنشطة جديدة. J. بيول. تشيم. 283, 15724–15731 (2008).

      Todd، A. E.، Orengo، C.A & amp Thornton، J.M. اللدونة لمواقع الإنزيم النشطة. اتجاهات. بيوتشيم. علوم. 27, 419–426 (2002).

      تقدم جلوستر ، T. M. في فهم glycosyltransferases من منظور هيكلي. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 28, 131–141 (2014).

      Harper، K.C & amp Sigman، M. S. توقع وتحسين أداء المحفز غير المتماثل باستخدام مبادئ التصميم التجريبي والمعلمات الفراغية. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 108, 2179–2183 (2011).

      إنزيمات Kries و H. و Blomberg و R. & amp Hilvert و D. De novo عن طريق التصميم الحسابي. بالعملة. رأي. تشيم. بيول. 17, 221–228 (2013).

      Yang ، M. ، Brazier ، M. ، Edwards ، R. & amp Davis ، B.G. كيمبيوتشيم 6, 346–357 (2005).

      فلينت ، جيه وآخرون. التشريح الهيكلي والفحص عالي الإنتاجية لسينثيز مانوسيل جلسرات. نات. هيكل. مول. بيول. 12, 608–614 (2005).

      Yang ، M. ، Davies ، G.J & amp Davis ، B.G. محفز glycosynthase لتخليق جليكوسيدات الفلافونويد. انجيو. تشيم. كثافة العمليات إيدن إنجل. 46, 3885–3888 (2007).

      باكوس ، ك.م وآخرون. استخدام نظائر طرهالوز غير الطبيعية كمراسل لـ السل الفطري. نات. تشيم. بيول. 7, 228–235 (2011).

      أوفن ، دبليو وآخرون. يكشف هيكل فلافونويد غلوكوزيل ترانسفيراز أساس تعديل المنتج الطبيعي للنبات. EMBO J. 25, 1396–1405 (2006).

      برازير هيكس ، إم وآخرون. توصيف وهندسة إنزيم N- و O-glucosyltransferase ثنائي الوظيفة المتضمن في التمثيل الغذائي للأجانب الحيوية في النباتات. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 104, 20238–20243 (2007).

      ماكليود ، إم سي وآخرون. استكشاف الفضاء الكيميائي باستخدام مكتبات مستوحاة من القلويات. نات. تشيم. 6, 133–140 (2014).

      Li ، Y. ، Baldauf ، S. ، Lim ، E.K & amp Bowles ، D.J. التحليل الوراثي لعائلة UDP-glycosyltransferase متعددة الجينات نبات الأرابيدوبسيس thaliana. J. بيول. تشيم. 276, 4338–4343 (2001).

      بريمان ، إل ، فريدمان ، جيه إتش ، أولشين ، آر إيه أند ستون ، سي جيه. شجرة التصنيف والانحدارs (Wadsworth & amp Brooks، Monterey، CA، 1984).

      Kotera، M.، Goto، S. & amp Kanehisa، M. التحليل الجينومي والأيضي التنبئي لتوحيد بيانات الإنزيم. وجهة نظر. علوم. 1, 24–32 (2014).

      Sánchez-Rodríguez، A. et al. نهج قائم على الشبكة لتحديد فئات الركيزة من الجليكوزيل ترانسفيرازات البكتيرية. علم الجينوم BMC 15, 349 (2014).

      Smith، T.F & amp Waterman، M. S. تحديد التكرارات الجزيئية الشائعة اللاحقة. جيه مول. بيول. 147, 195–197 (1981).

      شاو ، هـ وآخرون. الهياكل البلورية لترانسفيراز ترايتيربين / فلافونويد جليكوزيلترانسفيراز متعدد الوظائف من ميديكاغو truncatula. الخلية النباتية 17, 3141–3154 (2005).

      مودولو ، إل في وآخرون. تكشف الهياكل البلورية لـ glycosyltransferase UGT78G1 عن الأساس الجزيئي للارتباط بالجليكوزيل وإزالة الجليكوزيل من (iso) الفلافونويد. جيه مول. بيول. 392, 1292–1302 (2009).

      يانغ ، م وآخرون. فحص اتساع نطاق ماكرولايد جليكوزيل ترانسفيرازات: إعادة التشكيل في المختبر لمضاد حيوي من البوليكيتيد يخلق امتصاصًا بكتيريًا نشطًا ويعزز الفاعلية. جيه. تشيم. شركة 127, 9336–9337 (2005).

      Venturelli، S. et al. ريسفيراترول كمثبط لـ HDAC يغير حالة الأستلة لبروتينات هيستون [المصححة] في خلايا الورم الأرومي الكبدي المشتق من الإنسان. بلوس واحد 8، e73097 (2013).

      كجاير ، ت.ن. وآخرون. يقلل ريسفيراترول من مستويات سلائف الأندروجين المنتشرة ولكن ليس له تأثير على مستويات هرمون التستوستيرون أو ثنائي هيدروتستوستيرون أو مستويات PSA أو حجم البروستاتا: تجربة عشوائية لمدة 4 أشهر في الرجال في منتصف العمر. البروستات 75, 1255–1263 (2015).

      تيرنر ، آر إس وآخرون. تجربة عشوائية مزدوجة التعمية مضبوطة بالغفل من ريسفيراترول لمرض الزهايمر. علم الأعصاب 85, 1383–1391 (2015).

      Tomé-Carneiro، J. et al. ريسفيراترول والتجارب السريرية: مفترق الطرق من الدراسات المختبرية إلى الأدلة البشرية. بالعملة. فارم. ديس. 19, 6064–6093 (2013).

      باندي ، آر بي وآخرون. التخليق الحيوي الأنزيمي لمشتقات الجلوكوزيد وريسفيراترول الجديدة. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 80, 7235–7243 (2014).

      Weis، M.، Lim، E.-K.، Bruce، N. & amp Bowles، D. انجيو. تشيم. كثافة العمليات إد. إنجل. 45, 3534–3538 (2006).

      بيرنز ، جيه ، يوكوتا ، ت. ، أشيهارا ، إتش ، لين ، إم إي & أمبير كروزر ، أ.الأغذية النباتية والمصادر العشبية للريسفيراترول. J. أجريك. طعام. تشيم. 50, 3337–3340 (2002).

      هايد ، ل.الأمينوكومارين: التخليق الحيوي وعلم الأحياء. نات. همز. اعادة عد. 26, 1241–1250 (2009).

      بينيف ، سي وآخرون. الهياكل البلورية لاثنين من الأشكال الإسوية لبيروفوسفوريلاز بشريين في مجمعات مع UDPGlc (Gal) NAc: دور الإدخال المقسم بدلاً من ذلك في تجميع إنزيم القلة القلبية وبنية الموقع النشط. EMBO J. 20, 6191–6202 (2001).

      أونليجيل ، يو إم وآخرون. هيكل بلوري للأشعة السينية للأرنب N-acetylglucosaminyltransferase I: آلية تحفيزية وعائلة بروتينية جديدة. EMBO J. 19, 5269–5280 (2000).

      التنبؤ بوظيفة البروتين: المشاكل والمزالق. بالعملة. بروتوك. المعلوماتية الحيوية 51, 12.1 –4.12.8 (2015).

      Tyagi، S. & amp Pleiss، J. التنميط البيوكيميائي في السيليكو: التنبؤ بخصائص الركيزة لعائلات الإنزيم الكبيرة. J. Biotechnol. 124, 108–116 (2006).

      تشاو ، إس وآخرون. اكتشاف إنزيمات جديدة ومسارات استقلابية باستخدام البنية وسياق الجينوم. طبيعة سجية 502, 698–702 (2013).

      Nembri، S.، Grisoni، F.، Consonni، V. & amp Todeschini، R. كثافة العمليات جيه مول. علوم. 17، E914 (2016).

      Dong، D.، Ako، R.، Hu، M. & amp Wu، B. فهم انتقائية الركيزة لـ UDP-glucuronosyltransferases البشرية من خلال نمذجة QSAR وتحليل الإنزيمات المتماثلة. Xenobiotica 42, 808–820 (2012).

      وانج ، تي ، يوان ، إكس إس ، وو ، إم- بي ، لين ، ج. & أمبير يانغ ، L.-R. تقدم QSAR متعدد الأبعاد لاكتشاف الأدوية الجديدة: إلى أين نتجه؟ رأي الخبراء. اكتشاف المخدرات. 12, 769–784 (2017).

      لو ، ف.آخرون. DrugBank 4.0: إلقاء ضوء جديد على استقلاب الدواء. الدقة الأحماض النووية. 42، D1091-D1097 (2014).

      Udayakumar ، M. وآخرون. PMDB: قاعدة بيانات التمثيل الغذائي للنبات: نهج أيضي. ميد. تشيم. الدقة. 21, 47–52 (2012).

      شميد ، جيه ، هيدر ، دي ، ويندل ، إن جيه ، سبيرل ، إن آند سيبر ، ف. ترانسفيرازات الجليكوزيل البكتيرية: تحديات وفرص لفئة إنزيم شديدة التنوع نحو تصميم المنتجات الطبيعية. أمام. ميكروبيول. 7, 182 (2016).

      Osmani, S. A., Bak, S. & Møller, B. L. Substrate specificity of plant UDP-dependent glycosyltransferases predicted from crystal structures and homology modeling. كيمياء النبات 70, 325–347 (2009).

      Davies, G. J., Planas, A. & Rovira, C. Conformational analyses of the reaction coordinate of glycosidases. Acc. تشيم. الدقة. 45, 308–316 (2012).

      Newton, M. S. et al. Structural and functional innovations in the real-time evolution of new (βα)8 barrel enzymes. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 114, 4727–4732 (2017).

      Roy, A., Kucukural, A. & Zhang, Y. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. نات. بروتوك. 5, 725–738 (2010).

      Mackenzie, P. I. et al. Nomenclature update for the mammalian UDP glycosyltransferase (UGT) gene superfamily. Pharmacogenet. علم الجينوم 15, 677–685 (2005).

      Lim, E.-K. وآخرون. Identification of glucosyltransferase genes involved in sinapate metabolism and lignin synthesis in Arabidopsis. J. بيول. تشيم. 276, 4344–4349 (2001).

      Berthold, M. R. et al. في Data Anal., Mach. Learn.Appl.: Proc. 31st Annu. أسيوط. Gesellschaft für Klassifikation e.V., Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 7 مارس9, 2007 (eds. Preisach, C. et al.) 319–326 (Springer, Berlin, 2008).

      Sauer, W. H. B. & Schwarz, M. K. Molecular shape diversity of combinatorial libraries: a prerequisite for broad bioactivity. J. كيم. Inf. حاسوب. علوم. 43, 987–1003 (2003).

      Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. & Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. الدقة الأحماض النووية. 25, 4876–4882 (1997).

      Sievers, F. et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. مول. النظام. بيول. 7, 539 (2011).

      Rice, P., Longden, I. & Bleasby, A. EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. اتجاهات الجينات. 16, 276–277 (2000).

      Johnson, S. C. Hierarchical clustering schemes. Psychometrika 32, 241–254 (1967).

      Kohavi, R. A study of cross-validation and bootstrap for accuracy estimation and model selection. في IJCAI’95 Proc. 14th Int. Joint Conf. ارتيف. شركة انتل. المجلد. 2, 1137–1143 (Morgan Kaufmann, San Francisco, 1995).

      Matthews, B. W. Comparison of the predicted and observed secondary structure of T4 phage lysozyme. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 405, 442–451 (1975).

      Pearson, W. R. Selecting the right similarity-scoring matrix. بالعملة. بروتوك. المعلوماتية الحيوية 43, 5.1–3.5.9 (2013).

      Emsley، P.، Lohkamp، B.، Scott، W.G & amp Cowtan، K. ميزات وتطوير Coot. اكتا Crystallogr. د بيول. بلوريلوجر. 66, 486–501 (2010).

      Learmonth, D. A. Novel convenient synthesis of the 3‐O‐β‐D‐ and 4′‐O β‐D‐glucopyranosides of trans‐resveratrol. موالفة. كومون. 34, 1565–1575 (2004).


      الملخص

      Virus-induced gene silencing (VIGS) showed several advantages to identify gene functions such as short experimental cycle, more broad hosts, etc. In this study, the feasibility and efficiency of employing Barley stripe mosaic virus (BSMV)-based VIGS system to evaluate Fusarium head blight (FHB) resistance were explored in wheat. With variable conditions tested, it showed that the maximal silencing efficiency 78% on spike was obtained when the recombinant BSMV was inoculated on flag leaf at flagging stage. However, the plant may reduce its own immunity to FHB when inoculated with BSMV. To induce this impact, different Fusarium graminearum strains were tested and SF06-1 strain was selected for FHB resistance evaluation. Using this system, TaAOC, TaAOS, و TaOPR3 involved in jasmonic acid (JA) signaling pathway were identified to positively regulate FHB resistance, which was underpinned by the results when silencing TaAOS in wheat by stable transgenic plants.


      محتويات

      Like most artificial neural networks, SOMs operate in two modes: training and mapping. "Training" builds the map using input examples (a competitive process, also called vector quantization), while "mapping" automatically classifies a new input vector.

      The visible part of a self-organizing map is the map space, which consists of components called nodes or neurons. The map space is defined beforehand, usually as a finite two-dimensional region where nodes are arranged in a regular hexagonal or rectangular grid. [8] Each node is associated with a "weight" vector, which is a position in the input space that is, it has the same dimension as each input vector. While nodes in the map space stay fixed, training consists in moving weight vectors toward the input data (reducing a distance metric) without spoiling the topology induced from the map space. Thus, the self-organizing map describes a mapping from a higher-dimensional input space to a lower-dimensional map space. Once trained, the map can classify a vector from the input space by finding the node with the closest (smallest distance metric) weight vector to the input space vector.

      The goal of learning in the self-organizing map is to cause different parts of the network to respond similarly to certain input patterns. This is partly motivated by how visual, auditory or other sensory information is handled in separate parts of the cerebral cortex in the human brain. [9]

      The weights of the neurons are initialized either to small random values or sampled evenly from the subspace spanned by the two largest principal component eigenvectors. With the latter alternative, learning is much faster because the initial weights already give a good approximation of SOM weights. [10]

      The network must be fed a large number of example vectors that represent, as close as possible, the kinds of vectors expected during mapping. The examples are usually administered several times as iterations.

      The training utilizes competitive learning. When a training example is fed to the network, its Euclidean distance to all weight vectors is computed. The neuron whose weight vector is most similar to the input is called the best matching unit (BMU). The weights of the BMU and neurons close to it in the SOM grid are adjusted towards the input vector. The magnitude of the change decreases with time and with the grid-distance from the BMU. The update formula for a neuron v with weight vector دبليوالخامس(ق) هو

      where s is the step index, t an index into the training sample, u is the index of the BMU for the input vector د(t), α(s) is a monotonically decreasing learning coefficient Θ(u, v, s) is the neighborhood function which gives the distance between the neuron u and the neuron v in step s. [11] Depending on the implementations, t can scan the training data set systematically (t is 0, 1, 2. T-1, then repeat, T being the training sample's size), be randomly drawn from the data set (bootstrap sampling), or implement some other sampling method (such as jackknifing).

      The neighborhood function Θ(u, v, s) (also called function of lateral interaction) depends on the grid-distance between the BMU (neuron ش) and neuron الخامس. In the simplest form, it is 1 for all neurons close enough to BMU and 0 for others, but the Gaussian and mexican-hat [12] functions are common choices, too. Regardless of the functional form, the neighborhood function shrinks with time. [9] At the beginning when the neighborhood is broad, the self-organizing takes place on the global scale. When the neighborhood has shrunk to just a couple of neurons, the weights are converging to local estimates. In some implementations, the learning coefficient α and the neighborhood function Θ decrease steadily with increasing s, in others (in particular those where t scans the training data set) they decrease in step-wise fashion, once every T steps.

      This process is repeated for each input vector for a (usually large) number of cycles λ. The network winds up associating output nodes with groups or patterns in the input data set. If these patterns can be named, the names can be attached to the associated nodes in the trained net.

      During mapping, there will be one single الفوز neuron: the neuron whose weight vector lies closest to the input vector. This can be simply determined by calculating the Euclidean distance between input vector and weight vector.

      While representing input data as vectors has been emphasized in this article, any kind of object which can be represented digitally, which has an appropriate distance measure associated with it, and in which the necessary operations for training are possible can be used to construct a self-organizing map. This includes matrices, continuous functions or even other self-organizing maps.

      Variables Edit

      These are the variables needed, with vectors in bold,

      تحرير الخوارزمية

      1. Randomize the node weight vectors in a map
      2. Randomly pick an input vector D ( t ) (t)>
      3. Traverse each node in the map
        1. Use the Euclidean distance formula to find the similarity between the input vector and the map's node's weight vector
        2. Track the node that produces the smallest distance (this node is the best matching unit, BMU)
        1. W v ( s + 1 ) = W v ( s ) + θ ( u , v , s ) ⋅ α ( s ) ⋅ ( D ( t ) − W v ( s ) ) (s+1)=W_(s)+ heta (u,v,s)cdot alpha (s)cdot (D(t)-W_(s))>
        1. Randomize the map's nodes' weight vectors
        2. Traverse each input vector in the input data set
          1. Traverse each node in the map
            1. Use the Euclidean distance formula to find the similarity between the input vector and the map's node's weight vector
            2. Track the node that produces the smallest distance (this node is the best matching unit, BMU)
            1. W v ( s + 1 ) = W v ( s ) + θ ( u , v , s ) ⋅ α ( s ) ⋅ ( D ( t ) − W v ( s ) ) (s+1)=W_(s)+ heta (u,v,s)cdot alpha (s)cdot (D(t)-W_(s))>

            SOM Initialization Edit

            Selection of a good initial approximation is a well-known problem for all iterative methods of learning neural networks. Kohonen [13] used random initiation of SOM weights. Recently, principal component initialization, in which initial map weights are chosen from the space of the first principal components, has become popular due to the exact reproducibility of the results. [14]

            Careful comparison of the random initiation approach to principal component initialization for one-dimensional SOM (models of principal curves) demonstrated that the advantages of principal component SOM initialization are not universal. The best initialization method depends on the geometry of the specific dataset. Principal component initialization is preferable (in dimension one) if the principal curve approximating the dataset can be univalently and linearly projected on the first principal component (quasilinear sets). For nonlinear datasets, however, random initiation performs better. [15]

            Fisher's Iris Flower Data Edit

            Consider an ن×م array of nodes, each of which contains a weight vector and is aware of its location in the array. Each weight vector is of the same dimension as the node's input vector. The weights may initially be set to random values.

            Now we need input to feed the map. Colors can be represented by their red, green, and blue components. Consequently, we will represent colors as vectors in the unit cube of the free vector space over ℝ generated by the basis:

            R = <255, 0, 0> G = <0, 255, 0> B = <0, 0, 255>

            compares the results of training on the data sets [Note 1]

            threeColors = [255, 0, 0], [0, 255, 0], [0, 0, 255] eightColors = [0, 0, 0], [255, 0, 0], [0, 255, 0], [0, 0, 255], [255, 255, 0], [0, 255, 255], [255, 0, 255], [255, 255, 255]

            and the original images. Note the striking resemblance between the two.

            Similarly, after training a 40×40 grid of neurons for 250 iterations with a learning rate of 0.1 on Fisher's Iris, the map can already detect the main differences between species.

            There are two ways to interpret a SOM. Because in the training phase weights of the whole neighborhood are moved in the same direction, similar items tend to excite adjacent neurons. Therefore, SOM forms a semantic map where similar samples are mapped close together and dissimilar ones apart. This may be visualized by a U-Matrix (Euclidean distance between weight vectors of neighboring cells) of the SOM. [5] [6] [17]

            The other way is to think of neuronal weights as pointers to the input space. They form a discrete approximation of the distribution of training samples. More neurons point to regions with high training sample concentration and fewer where the samples are scarce.

            SOM may be considered a nonlinear generalization of Principal components analysis (PCA). [18] It has been shown, using both artificial and real geophysical data, that SOM has many advantages [19] [20] over the conventional feature extraction methods such as Empirical Orthogonal Functions (EOF) or PCA.

            Originally, SOM was not formulated as a solution to an optimisation problem. Nevertheless, there have been several attempts to modify the definition of SOM and to formulate an optimisation problem which gives similar results. [21] For example, Elastic maps use the mechanical metaphor of elasticity to approximate principal manifolds: [22] the analogy is an elastic membrane and plate.


            Tips and FAQ

            If you are not concerned with transformation efficiency (such as when you have a tube of plasmid DNA and just need to transform bacteria so that you can grow up more of the plasmid) you can save a lot of time by shortening or skipping many steps and will still get enough colonies for your next step. Remember that each of these shortcuts will reduce the efficiency of the transformation, so when higher efficiency is needed follow the complete protocol.

            • Thaw the competent cells in your hand instead of on ice
            • Reduce step 4 from 20 - 30 mins to 2 mins on ice before heat-shock

            Shorten or skip the outgrowth (for Ampicillin resistance it is ok to completely skip the outgrowth, for the other antibiotics it is a good idea to outgrow for at least 20-30 mins)

            Chemically competent cells are fast and easy to use, but are less efficient at taking up larger plasmids. If you need to transform large plasmids, it is a good idea to use electro-competent cells. Instead of relying on the heat-shock to cause the cells to take up the DNA, an electro-magnetic field is applied to the cell/DNA mixture to induce membrane permeability. To do this you will need to have access to an electroporator and the appropriate cuvettes. Follow the manufacturer's instructions for each.

            Check that you are plating on an LB Agar plate containing the correct antibiotic. The resistance gene on your plasmid must match the antibiotic on the plate. You should also add a positive control (many companies include a positive control plasmid with their competent cells) to ensure that your transformation procedure is working.

            Although it may be counter-intuitive, you will often get higher transformation efficiencies with less DNA, especially when using highly competent cells. If you used 100-1000 ng of total DNA in a ligation you will often get more colonies if you use 1 μl of a 1:5 or 1:10 dilution rather than 1 μl directly.


            شاهد الفيديو: آلية عمل آبار النفط و إستخراجه من باطن الأرض ومنشآته (ديسمبر 2022).