معلومة

تحليل الاقتران الإحصائي (SCA) لتحديد المخلفات المشتركة: استخدام ICA

تحليل الاقتران الإحصائي (SCA) لتحديد المخلفات المشتركة: استخدام ICA


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد بدأنا في تجربة صندوق أدوات SCA Matlab (أحدث إصدار) تم تنزيله من موقع Dr. يتضمن حساب SCA تحديد المكونات المستقلة (IC) للتباين الموضعي من خلال تطبيق خوارزمية "Infomax" على عدد قليل من رموز eigenmodes العليا (التي تم الحصول عليها من مصفوفة الارتباط الموضعي). هنا ، لاحظنا أن الناتج (أوزان متجهية IC) يبدو أنه يعتمد على الرقم. من أعلى رموز eigenmodes المختارة كمدخلات (أي عند اختيار المعلمة kmax). إذا كان هذا هو الحال بالفعل ، فهل هناك بعض "قاعدة العمل" لاختيار kmax على النحو الأمثل (على سبيل المثال ، بناءً على عدد الرموز الذاتية المهمة التي تظهر)؟ نظرًا لأن هذا لم يتم توضيحه بشكل واضح في البرامج التعليمية (على الأقل بالنسبة لي) ، فقد فكرت في تجربة حظي هنا.

سأقدر حقًا بعض الإرشادات / المؤشرات من مستخدمي SCA. شكرا جزيلا!


تحسين النشاط التحفيزي لـ isopentenyl phosphate kinase من خلال تحليل التطور المشترك للبروتين

أصبح التصميم المنطقي للبروتين أكثر شيوعًا في هندسة البروتين مع الاستفادة من البيانات البيولوجية الضخمة. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة تصميم منطقي قادرة على تحديد الطفرات المرغوبة من خلال تحليل التطور المشترك لتسلسل البروتين. استخدمنا هذا النهج لتطوير كيناز فوسفات الأيزوبنتنيل البدائي الذي يمكنه تحويل كحول ثنائي ميثيل الأليل (DMA) إلى سلائف للأيزوبرينويدات. من خلال تصميم طفرات 9 نقاط ، قمنا بتحسين الأنشطة التحفيزية لـ IPK حوالي 8 أضعاف في المختبر. بعد إدخال المسوخ الأمثل لـ IPK في الهندسة بكتريا قولونية سلالة لإنتاج الكاروتينات بيتا ، وجدنا أن إنتاج بيتا كاروتينات أظهر زيادة 97٪ على سلالة البداية. يمكن استخدام عملية تحسين الإنزيم المعروضة هنا لتحسين الأنشطة التحفيزية للأنزيمات الأخرى.


مقدمة

المستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) هي أكبر فئة من مستقبلات البروتين الغشائي المتكامل في الجينوم البشري. في حين أن هذه المستقبلات تشترك في طية سباعية محفوظة وتتفاعل مع عدد محدود من البروتينات داخل الخلايا ، فإن التعرف خارج الخلية على مجموعة متنوعة من الإشارات ينتج عنه نتائج فسيولوجية متنوعة. 1 ، 2 تم تحديد تجميع القلة القلبية من الناحية الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية ، وتشير هذه الدراسات بالاقتران مع النمذجة إلى أنها متورطة في نضج المستقبلات والاستيعاب ويمكن أن تكون مهمة في تصميم الأدوية الجديدة التي تعمل على هذه الفئة من المستقبلات. 3 & # x02013 7 نتج عن العقد الماضي هياكل GPCR جديدة تحسن بشكل كبير من فهم كيفية ربط هذه المستقبلات بجزيئات الإشارة الخاصة بها ، والتغيير عند التنشيط ، والارتباط ببروتينات G. 8 مجال بحث نشط يتضمن معالجة التجانس والتغاير وعلاقته بتنشيط المستقبلات والدور الذي تلعبه هذه الرابطة في التأشير. يتضمن هذا توصيف المحددات الجزيئية لهذه الواجهات.

تنظم مستقبلات الكيموكين هجرة الخلايا عن طريق الكشف عن الكيميائيات خارج الخلية ، السيتوكينات التي تحفز الانجذاب الكيميائي ، والمتورطة في علم وظائف الأعضاء الصحي والممرض ، وعلى الأخص الأمراض البشرية مثل السرطان والإيدز. 9 بالإضافة إلى كونه معدلًا رئيسيًا لنقل الإشارة ، فإن CXCR4 ومستقبل CC Chemokine 5 المرتبط ، CCR5 ، متورطان أيضًا في عملية الدخول الفيروسي HIV-1. يمكن أن تكون الكيموكينات وظيفية مثل المونومرات أو أوليغومرات الرتبة الأعلى لتنشيط هجرة الخلايا ، مما يشير إلى أن القياس المتكافئ لهذه الروابط ومستقبلاتها تلعب دورًا في التنظيم الوظيفي. 10 يتناقض السطح البيني CXCR4 dimer الذي تم تحديده مؤخرًا ، كما لوحظ في علم البلورات ، مع واجهات Rhodopsin المحددة مسبقًا ، والتي تم قبولها لتكون نموذجًا لعائلة المستقبل الفائقة. 8 يوضح الشكل 1 السطح البيني الخافت ، الذي لوحظ في جميع الهياكل البلورية الخمسة لـ CXCR4 ، بما في ذلك الوهم الليزوزيم T4 المستخدم لتثبيت التبلور. تشير هذه الهياكل البلورية إلى آلية تعديل محتملة وهدف واجهة البروتين والبروتين # x02013 لتطوير أداة البيولوجيا الكيميائية واكتشاف العقاقير القائمة على الهيكل.

لوحظ اتجاه باهت للهيكل البلوري. واحد من خمسة متجانسات ذات بنية بلورية متشابهة (PDB 3ODU). يتم تلوين الخطوط والتمثيل الكرتوني للهيكل الثانوي وفقًا لرقم الحلزون عبر الغشاء (H1-H7) ، مع تحديد الغشاء الافتراضي بحد أفقي أزرق. مناطق الحلقة داخل الخلايا وخارج الخلية ملونة باللون الأسود ، و T4 انصهار الليزوزيم (T4L) باللون الرمادي. تظهر وجهات النظر داخل الخلايا وخارج الخلية بتوجهات مخطط لها (أسفل) ، لإظهار المواضع النسبية للحلزونات لبعضها البعض على جانبي الغشاء.

في هذه الدراسة ، حددنا بقايا مهمة من الناحية الهيكلية والتطورية من أجل تجانس CXCR4. تم الجمع بين طريقتين للتحقق من صحة الاتجاهات الملحوظة من الناحية البلورية وتوصيف ديناميكيات هذه التفاعلات الجزيئية. أولاً ، تم تحديد المخلفات المهمة التي تتطور بطريقة مرتبطة ، وتعيينها إلى الواجهة التي تمت ملاحظتها في جميع هياكل cocrystal الخمسة لـ CXCR4. تدعم هذه النتائج الفرضية القائلة بأن هذه الواجهة وثيقة الصلة بيولوجيًا. ثم تم استخدام علاقات التطور المشترك لوزن الشبكات ، المبنية من أخذ العينات الديناميكي لمركب homodimer ، لتحديد وحدات البقايا المتصلة مكانيًا والتي تطورت معًا بطريقة ذات دلالة إحصائية بين مستقبلات الكيمياء المتجانسة. كشف تحليلنا عن وحدة واحدة تتكون من 11 وحدة بنائية (T117 3.33 ، Y121 3.37 ، L125 3.41 ، I162 4.51 ، A164 4.53 ، L165 4.54 ، L166 4.55 ، L167 4.56 ، I169 4.58 ، V206 5.45 ، و L210 5.49). تشكل هذه البقايا منطقة مركزية على الجزء الخارجي من حزمة TM عند تقاطع الحلزونات 3 و 4 و 5. فهي ليست حيوية من الناحية الهيكلية فحسب ، بل إنها مرتبطة أيضًا تطوريًا بعملية التجانس. تتطابق المخلفات أيضًا مع النقاط الساخنة المحتملة من رسم خرائط المذيبات الحسابية ، ويمكن متابعتها في جهد تصميم دواء قائم على الهيكل. يتم تقديم النتائج المهمة التي تهم مجتمع مستقبلات الكيموكين ، بالإضافة إلى المنهجية التي يمكن توسيعها لتشمل الأنظمة المستهدفة الأخرى في هذه المقالة.


مناقشة.

لقد أظهرنا قدرة DCA على التعرف على أزواج المخلفات عالية الدقة في عائلات المجال التي قد تكون قد تطورت معًا وبالتالي فهي تمثل القرب المادي في الطية ثلاثية الأبعاد للمجال. لقد أجرينا تقييمًا شاملاً لهذه القدرات لعدد كبير من العائلات وهياكل PDB الفردية. وجدنا أن DCA ليس فقط قادرًا على تحديد جهات الاتصال داخل النطاق ولكن أيضًا أزواج المخلفات بين المجالات التي تشكل جزءًا من واجهات oligomerization. على الرغم من أننا ركزنا على البروتينات البكتيرية ، يمكن تطبيق هذه المنهجية على العدد المتزايد باستمرار من متواليات حقيقية النواة. تشير نتائجنا الأولية إلى أن أداء mfDCA محفوظ للبروتينات غير البكتيرية. يتمثل أحد التطبيقات المحتملة في تحديد واجهات التفاعل لأجهزة homodimers التي يمكن أن تساعد في النهاية في التنبؤ بالبنية المعقدة ، على سبيل المثال ، الحالات في الشكل 3 و الملحق SI، الشكل S7. قد تفتح نتائجنا طرقًا غير مستكشفة للبحث يمكن من أجلها تقدير خرائط جهات الاتصال الكاملة واستخدامها كبيانات إدخال لتحديد بنية بروتين de novo ، وهو أمر مثير للاهتمام بشكل خاص في حالة جهات الاتصال بين المجالات في البروتينات متعددة المجالات. في النهاية ، يمكن استخدام هذه المنهجية مع أزواج من البروتينات بدلاً من البروتينات الفردية لتحديد التفاعلات المحتملة بين البروتين والبروتين. تم تقديم مثال على هذا النهج في المرجع. في الشكل 16 ، ومع ذلك ، فإن الصيغة الرياضية الحالية للطريقة وكذلك تنفيذها الحسابي تسمح بإجراء تحليل على نطاق أوسع بكثير.

على الرغم من دقة الإشارة المستخرجة ، لا يُتوقع من mfDCA استخراج جميع المعلومات البيولوجية الموجودة في ارتباطات الزوج. يمكن توضيح هذه الفكرة من خلال مقارنة نتائج mfDCA بنتائج تحليل الاقتران الإحصائي (SCA) ، التي طورتها Lockless و Ranganathan (5) وتستخدم لتحديد "قطاعات البروتين المشتركة" (41). لقد طبقنا mfDCA على بيانات المرجع. 41 لعائلة بروتين التربسين (سيرين بروتياز) ، حيث حددت SCA ثلاثة قطاعات تتعلق بالوظائف المختلفة للبروتين ، والتي تغطي ما يقرب من 30 ٪ من جميع المخلفات. يؤدي mfDCA إلى معدل TP 83.3٪ لأعلى 30 تنبؤًا بالاتصال (PDB ID 3TGI المرجع 42) - أي إلى أداء مشابه لعائلات البروتين الأخرى التي تم تحليلها هنا. من بين 25 زوجًا من جهات الاتصال الحقيقية الناتجة ، تم العثور على ثمانية فقط ضمن القطاعات المحددة. من بينها ، ثلاثة روابط ثنائي كبريتيد (C42∶C58 ، C136∶C201 ، C191∶C220) واثنان آخران داخل ثالوث محفز حاسم للنشاط التحفيزي لعائلة البروتين (H57∶S195 ، D102∶S195). يتم توزيع جهات الاتصال الـ 17 الحقيقية الأخرى التي تنبأ بها mfDCA على حظيرة البروتين ، دون علاقة واضحة بالقطاعات (انظر الملحق SI، الجدول S4). يمكن إرجاع الاختلاف في التنبؤ إلى الاختلافات في الأساليب الحسابية: يستخدم SCA التجميع لتحديد مجموعات أكبر من مواقع (القطاعات) المشتركة ، بينما يستخدم DCA نمذجة الانتروبيا القصوى لاستخراج أزواج من المخلفات المقترنة مباشرة. وهكذا ، تستخرج الخوارزميتان معلومات مختلفة ، وفي كلتا الحالتين ، معلومات مهمة بيولوجيًا. لا يزال تطوير تقنيات توحد SCA و DCA يمثل تحديًا مستقبليًا ، واستخراج المزيد من المعلومات ذات التطور المشترك من المحاذاة متعددة التسلسلات.


المواد والأساليب

استجابة موقف في العربية الفصحى للاضطرابات

بعد Lockless و Ranganathan (1999) ، حددنا ، لكل منصب أنا في MSA ، "طاقة حرة" إحصائية:

أين كيلو ت* هو مقياس طاقة تعسفي (حددناه بـ 10 في حساباتنا) ، إلMSA هو طول التسلسلات في MSA بما في ذلك الفجوات ، و أنا = 1, 2, 3,…︁, إلMSA. عدد أنواع الأحماض الأمينية التي تظهر مرة واحدة على الأقل أنا يكون جأنا (بمعنى آخر.، جأنا ≤ 20) و صx هو متوسط ​​تواتر نوع الأحماض الأمينية x في MSA. الطاقة الحرة الإحصائية هي القيمة الزائدة لـ Δجيأنا متي صأنا x ينحرف عن صx. حسبنا صأنا x استخدام

أين نأنا x هو عدد التسلسلات في MSA مع الأحماض الأمينية x في الموضع أنا، و نأنا هو العدد الإجمالي للتسلسلات في MSA التي تحتوي على واحد من 20 نوعًا من الأحماض الأمينية في الموضع أنا، لهذا السبب نأنا = ∑ 20 س = 1ن س أنا.

يختلف إجراءنا عن الإجراء المستخدم من قبل Lockless و Ranganathan في جانبين مهمين: (1) بدلاً من دالة الكثافة ذات الحدين (Lockless and Ranganathan 1999) لتوزيع نوع الأحماض الأمينية x في موضع عشوائي في MSA ، نستخدم التردد النموذجي لـ x في MSA. (2) نستخدم تواتر كل نوع من 20 نوعًا من الأحماض الأمينية في MSA المحدد بدلاً من قاعدة بيانات SWISS-PROT بأكملها (Appel et al. 1994). مع إجراءنا ، الطاقة الحرة Δجيأنا في المعادلة 1 هو امتداد مباشر للإنتروبيا التسلسلية المألوفة

يفضل استخدام توزيع الأحماض الأمينية النموذجية لكل عائلة بروتينية ، بدلاً من مجموعة ترددات عامة وربما غير صحيحة في بعض الأحيان. على سبيل المثال ، تحتوي الحالة الأصلية لـ BPTI على ثلاثة روابط ثنائي كبريتيد تتشكل بين ستة بقايا سيستين (من إجمالي 56 موضعًا في السلسلة). لذلك ، بالنسبة لعائلة BPTI ، فإن تكرار العثور على CYS هو ∼ 12 ٪ ، وهو أكبر بكثير من تردد 1 ٪ (Creighton 1993) الموجود في تسلسل بروتين عشوائي. وبالتالي ، يتم حساب الاعتماد على السياق تلقائيًا في إجراءاتنا.

بالنسبة إلى MSA معين ، نقوم ببناء مجموعات فرعية من المحاذاة الكاملة التي نحتفظ فيها فقط بالتسلسلات التي تحتوي على نوع واحد فقط من الأحماض الأمينية في الموضع ي، وهذا هو ، في المجموعة الفرعية صأنا x = 1 من أجل x. دعونا نفترض أنه لأسباب وظيفية وهيكلية ، المواقف أنا و ي مقترنة ، أي الاستبدالات في أنا سيؤثر ي. إذا كانت هذه هي الحالة ، فإننا نتوقع أن يؤدي الضغط التطوري ، في ظل القيود الوظيفية ، إلى تغيير مرتبط في نوع الأحماض الأمينية عند أنا في المحاذاة المقيدة (المجموعة الفرعية من MSA الأصلي). بمعنى آخر ، فإن البقايا الموجودة في أنا و ي قد "تتواصل" في سياق الوظيفة أو عند الارتباط بالروابط. مقياس الارتباط بين موقعين في MSA هو تغيير الطاقة الإحصائية الحرة عند أنا نتيجة لاضطراب في ي:

أين ن x أنا ، ر هو عدد التسلسلات في MSA المقيد التي تحتوي على حمض أميني x في أنا, نأنا ، ر هو العدد الإجمالي للتسلسلات في MSA المقيد التي لها نوع صالح من الأحماض الأمينية في الموضع أنا، و نأنا ، ر = ∑x = 1 20 ن x أنا ، ر. يتبع ذلك ΔΔجياي جاي = 0 لكل من الوضع المحفوظ تمامًا (صأنا x = 1) وللموقف حيث توجد جميع الأحماض الأمينية بتردداتها المتوسطة في MSA (صأنا x = صx).

نقدم أدناه أمثلة لإظهار أن هناك علاقة شبه كاملة بين ΔΔجياي جاي تم الحصول عليها من خلال طريقتنا وطريقة Lockless و Ranganathan. كما هو مذكور أعلاه ، فإن طريقتنا هي امتداد لطريقة الانتروبيا التسلسلية المستخدمة لاستنتاج حفظ الأحماض الأمينية في MSA. تدعم صياغتنا لـ SCA اكتشاف Fodor and Aldrich (2004a) بأن تنبؤات طريقة SCA تشبه تلك التي تم الحصول عليها من إنتروبيا التسلسل وحدها. على عكس طريقة SCE ، يتضمن نهج SCA حساب متوسط ​​الاحتمالات صأنا ، ر x و صأنا x على التسلسلات. يمكن لمثل هذا المتوسط ​​في بعض الأحيان أن يحجب الارتباطات الحقيقية.

يجب أن يخضع حجم الارتباطات الفرعية لنظرية الحد المركزي

في تنفيذ الإجراء ، من الأهمية بمكان اختيار الحجم الأمثل للمحاذاة الفرعية ، بينما تم سابقًا (Suel et al. 2003) اختيار حجم المحاذاة الفرعية بشكل تعسفي بناءً على الحجج البديهية فقط. تم اختيار عدة مجموعات فرعية تحتوي كل منها على جزء صغير من العدد الإجمالي للتسلسلات في MSA. لكل مجموعة ، ΔΔجياي جاي يتم حساب قيم عدد قليل (عادة حوالي خمسة) مواضع أقل حفظًا. تم اختيار حجم المحاذاة الفرعية بحيث تكون 〈ΔΔجيأنا〉 = ∑ ن ي = 1 ΔΔجياي جاي ∼ 0 ، حيث تشير أقواس الزاوية إلى متوسط ​​فوق نس التسلسلات في المحاذاة الفرعية.

نحن نناشد الميكانيكا الإحصائية في اختيار حجم الاصطفافات الفرعية التي تحتوي عليها ص = fNMSA التسلسلات. عدد المحاذاة للثابت F يكون . للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية ، يجب أن تكون الخصائص العامة للالتحالفات الفرعية مشابهة لـ MSA الأصلي. قياسا على الميكانيكا الإحصائية ، نقترح أن تكون أصغر قيمة لـ F يتم اختياره بحيث يتم إطاعة قانون الأعداد الكبيرة. على وجه الخصوص ، نختار F بحيث يتم استيفاء المعايير التالية:

أين ، δF هو عرض توزيع λ، و نس هو عدد التسلسلات في المحاذاة الفرعية. من الناحية التشغيلية ، المعيار الثاني (مكافئ 7) صالح ، بشرط أن يفي التباين في المحاذاة الفرعية

أين ن و ن هي عدد التسلسلات في المحاذاة الفرعية مع F1 و F2، على التوالى. ميزة استخدام معاييرنا (مكافئ. 6 ، 7) هي أن F يتم اختياره تلقائيًا من MSA وحده دون الحاجة إلى حساب ΔΔجياي جاي. يمكن أن يؤدي عدم استيفاء هذه المعايير إلى نتائج زائفة في تطبيق SCA.

إجراءات التجميع وإجراءات التشابه

المصفوفة جي، التي تكون عناصرها ΔΔجياي جاي قيم لعائلة بروتينية ، تمثل استجابة المواقف أنا في MSA لجميع الاضطرابات المسموح بها في الموقع ي شريطة أن تستوفي الاضطرابات معايير القبول المذكورة أعلاه. تتوافق صفوف المصفوفة مع المواضع في MSA والأعمدة للاضطرابات. هدفنا هو تحديد شبكة (شبكات) المواقف التي تتغير بطريقة مترابطة بشكل موثوق بدءًا من هذه المصفوفة. تحقيقًا لهذه الغاية ، استخدمنا التجميع ثنائي الاتجاه المقترن (CTWC) الذي تم تطويره لتحليل بيانات DNA-microarray (Getz وآخرون ، 2000). الفكرة الأساسية هي تنفيذ جولات أولية متتالية من العنقود الفائق البارامغناطيسي (SPC) (Blatt et al. 1996). في كل خطوة ، يتم استخراج المصفوفة الفرعية التي تحتوي على مواضع واضطرابات تتجمع معًا في التكرار السابق بإشارات كبيرة.

أحد المكونات المهمة في تقنية SPC هو اختيار مقياس التشابه بين زوج من الإدخالات التي سيتم تجميعها. في سياق تجميع المواقف في MSA ، هناك خياران طبيعيان على الأقل لمقاييس التشابه ، (1) المسافة الإقليدية و (2) معامل ارتباط بيرسون. فيما يلي ، نقدم الأساس المنطقي والتفاصيل لاستخدام هذه التدابير. جمع ΔΔجياي جاي القيم (مع ي متفاوتة من 1 إلى إلMSA مع إلMSA يمثل العدد الإجمالي للمواقف ، بما في ذلك الفجوات ، للمحاذاة) لموضع معين أنا في MSA يمكن اعتباره ناقل مع إلMSA المكونات ، = <>جيأنا1،… ︁، ΔΔجي>. لذلك درجة التشابه بين موقعين أنا و ك يمكن تمثيلها من خلال المسافة الإقليدية بين المتجهين المقابل ، أي ،

لكل MSA انتشار بمقادير ΔΔجياي جاي القيم (على سبيل المثال ، من 0.01 إلى ∼ 10). وهكذا ، بالنسبة لزوج من عناصر المصفوفة الصغيرة ، دik سيكون صغيراً حتى لو كان المتجهان غير متشابهين. من ناحية أخرى ، لاثنين من الوظائف ذات الصلة أنا و ك مع كبيرجياي جاي القيم ، فإن الاختلاف في أي من مكوناتها يمكن أن يؤدي إلى حجم كبير دik القيمة التي لا تعكس التشابه الحقيقي بينهما. مواقف صغيرة ΔΔجياي جاي القيم ليست ذات أهمية كبيرة لأنها لا تظهر في الأساس أي استجابة للتغييرات في المواقف الأخرى في العربية الفصحى.

لتصحيح النتائج التي يُحتمل أن تكون زائفة المشار إليها أعلاه ، نستخدم البروتوكول التالي: (1) نقوم بإزالة الإدخالات (المواضع) التي لا تظهر فعليًا أي استجابة للغالبية العظمى من الاضطرابات. (2) نقوم بقياس ΔΔجياي جاي القيم بحيث يتم تضمين فئات قليلة فقط من عناصر المصفوفة في التحليل. إلى حد كبير ، لا تعتمد النتائج على الحدود الدقيقة المستخدمة في تصنيف ΔΔجياي جاي. (3) إن دik يتم تطبيع القيم بشكل مناسب. إذا كانت جميعها أو جميعها باستثناء واحد منهاجياي جاي القيم هي & lt1.0 ، ثم الصف المقابل للموضع أنا يتم حذفه من مصفوفة بيانات الإدخال. تحجيم ΔΔجياي جاي يتم تحقيق القيم من خلال تخصيصها لاثنين أو ثلاثة مداخل مميزة. على سبيل المثال ، كل ΔΔ الصغيرةجياي جاي القيم (أي ΔΔجياي جاي & lt 1.0) دون تغيير ، في حين أن المتوسط ​​ΔΔجياي جاي القيم (أي 1.0 ≤ ΔΔجياي جاي & lt 2.0) قيمة αأنا والباقي (كبير) ΔΔجياي جاي يتم تعيين القيم على قيمة α2 مثل هذا α1 ∼ 10 × كحد أقصىاي جاي<>جياي جاي)> و α1 & lt α2. نحن نطبيع دik استخدام

أين ‖أنا‖ هو معيار المتجه أنا. ال SEik تعتبر صغيرة بالنسبة لأزواج المتجهات التي تحتوي على مكونات ذات قيم متشابهة ، وهي مستقلة عن الحجم الفعلي للمكونات الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأنه يتم التخلص من المواقف التي تظهر استجابة منخفضة أو معدومة لغالبية الاضطرابات ، فهي صغيرة SEik تشير القيمة إلى أن الموضعين يظهران استجابات كبيرة لنفس مجموعة الاضطرابات.

مقياس التشابه الثاني الذي يمكن استخدامه هو معامل ارتباط بيرسون

أين هو المتوسط ​​ΔΔجياي جاي قيمة للموقف أنا و

هو التباين. تمامًا كما هو الحال مع مقياس تشابه المسافة الإقليدية ، صik صغير لموقفين مع ردود قليلة أو معدومة لغالبية الاضطرابات. قبل الحساب صik، نحن نقضي على كل هذه المواقف. الإجراء المستخدم هو نفسه كما هو موضح أعلاه. لموقفين مترابطين تمامًا (غير مترابطين) ، صik = 1 (−1) ، بينما بالنسبة للمواضع غير المرتبطة ، صik = 0. لأن قياس المسافة الإقليدية (SEik) له قيم صغيرة لموضعين مترابطين ونريد أن نكون قادرين على استخدام مقياسي التشابه بالتبادل ، فقد استبدلنا صik مع

أين |صik| هي القيمة المطلقة لـ صik. لذلك ، كلاهما SEik و SPik هي صفر عندما يكون الموضعان مترابطين تمامًا.

مقياس التشابه الإقليدي SEik هو الأنسب عندما يكون الفرد ΔΔجياي جاي لا يتم توزيع القيم على نطاق واسع ، أي عندما تكون أكبر ΔΔجياي جاي القيمة ∼ 3.0. في مثل هذه الحالة ، تكون استجابات كل موقف في المحاذاة للاضطرابات المختلفة متشابهة في الحجم. لذلك ، يتم استخدام معامل ارتباط بيرسون SPik من شأنه أن يؤدي إلى تجميع غالبية المواقف. من ناحية أخرى ، فإن استخدام ملف SEik ويسمح لنا إعادة قياس الإدخالات المصاحبة للتمييز بين المواقف ، وبالتالي يتبين أن عددًا قليلاً فقط من المواقف يتم تجميعها بعد تطبيق إجراء CTWC. ويترتب على ذلك أن مقياس التشابه بيرسون هو الأنسب لـ MSA حيث يوجد توزيع واسع في حجم استجابات المواقف للاضطرابات.


أساليب

تحليل الاقتران الإحصائي (SCA)

تم الحصول على تسلسل عائلة ptRNase الفائقة باستخدام PSI-BLAST 25 التكراري (قطع القيمة الإلكترونية 0.0001 وما مجموعه تسع تكرارات للتقارب) مقابل قاعدة البيانات غير الزائدة عن الحاجة (nr) مع الأبقار RNase A كاستعلام. تم اقتطاع مواضع التسلسل إلى بنية RNase A البقري (PDB 7RSA). تم إجراء محاذاة تسلسل متعددة باستخدام ClustalO 26. تم استخدام مجموعة بيانات التسلسل الناتجة ، والتي تتكون من 1922 تسلسلًا و 124 موضعًا ، لتعريف القطاع باستخدام SCA. تم إجراء SCA باستخدام تطبيق python لحزمة البرامج (pySCA 6.0) (http: //systems.swmed.edu-/rr_lab/sca.html). تم استخدام البرنامج النصي annotate_MSA للتعليق على المعلومات التصنيفية باستخدام الأداة المساعدة NCBI Entrez 27. تم أيضًا شرح التسلسلات استنادًا إلى الأنواع الفرعية لـ RNase من رؤوس ملفات التسلسل وتم وضعها في الفئات التالية باستخدام الكلمات الرئيسية المستخدمة للتعليقات التوضيحية المحددة بين قوسين: RNase 1 (البنكرياس) ، RNase 2/3 (الحمضات ، غير الإفرازي) ، RNase 4 ( Ribonuclease 4) و RNase 5 (Angiogenin) و RNase 6 (Ribonuclease K6) و RNase 7 (Ribonuclease 7) و RNase 8 (Ribonuclease 8) و RNases 9-13 (غير نشط). التسلسلات التي لم تندرج ضمن الفئات المذكورة أعلاه لم يتم شرحها بناءً على تجميع الأنواع الفرعية. تم إجراء المعالجة المسبقة للمحاذاة باستخدام البرنامج النصي scaProcessMSA لإزالة التتابعات ذات الفجوات (& gt20 ٪ فجوات) وتلك التي لها هويات أعلى وأدنى من الحد الأدنى. تم الاحتفاظ بإجمالي 1296 تسلسلًا و 109 موضعًا بعد خطوة المعالجة المسبقة. تم إجراء الحسابات الأساسية وتعريف القطاع باستخدام البرامج النصية scaCore و scaSectorID. تم إجراء جميع الحسابات اللاحقة وفقًا للوثائق المصاحبة لحزمة البرامج.

يبني الحمض النووي والتعبير والتنقية

تم تحديد تسلسل الحمض النووي لـ RNase A و RNase 3 البشري (Eosinophil Cationic Protein) الإشريكية القولونية كودون محسن ، ومستنسخ فرعي إلى نديأنا/هندناقل التعبير المهضوم III pET22b (+) (EMD Biosciences ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على تسلسل الحمض النووي لـ RNase البشري 2 (المشتق من الحمضات - السموم العصبية) ، RNase 4 و RNase 5 (Angiogenin) من UniProt ، الإشريكية القولونية كودون محسن ، ومستنسخ فرعي إلى نديأنا/هندناقل التعبير المهضوم III pJexpress411 / 414 (DNA2.0 ، مينلو بارك ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). بالنسبة لتجارب الرنين المغناطيسي النووي ، تم تحضير 15 عينة تحمل علامة N عن طريق النمو بكتريا قولونية BL21 (DE3) في وسط M9 الأدنى مكملًا بالأحماض الأمينية غير الأساسية (Life Technologies ، Burlington ، ON ، كندا) ، المعادن ، الجلوكوز ، و 15 أسيتات الأمونيوم التي تحمل علامة N (Sigma-Aldrich ، Oakville ، ON ، كندا). تم التعبير عن الإنزيمات كهيئات متضمنة وتنقيتها كما وصفها Gagné وآخرون. 20. تم تحديد تركيز البروتين باستخدام معاملات الانقراض البالغة 9.440 م -1 سم -1 (RNase A) ، 17.460 م -1 سم -1 (RNases 2 & amp 3) ، 11960 م -1 سم -1 (RNase 4) و 11835 م -1 سم −1 (RNase 5). تم حساب معاملات الانقراض باستخدام ExPASy ProtParam. تم الحصول على درجة نقاء & gt95٪ لجميع البروتينات ، بناءً على هلام SDS-PAGE وتحليل الرنين المغناطيسي النووي.

تجارب معايرة الرنين المغناطيسي النووي

تم إجراء جميع تجارب معايرة الرنين المغناطيسي النووي في أسيتات الصوديوم 15 ملي مولار عند درجة الحموضة 5.0. تمت مراقبة الأس الهيدروجيني بعناية خلال التجارب وأعيد تعديله باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك ، عند الضرورة. أعيد تكوين روابط النوكليوتيدات المفردة 3′-UMP (Chemical Impex Intl Inc. ، Wood Dale ، IL) و 5′-AMP (BioBasic Inc. ، Markham ، ON ، كندا) في نفس المخزن المؤقت للبروتين. تم الحصول على تجارب HSQC المحسنة للحساسية H- 15 N عند 800 ميجاهرتز (18.8 تسلا) باستخدام عروض طيفية (نقاط) تبلغ 1600 هرتز (256) و 7000 هرتز (8192) في ر 1 و ر 2 أبعاد ، على التوالي. تم فحص حركيات الربط من خلال معايرة كل ليجند بنسب إنزيم / يجند مولارية من 0 ، 0.174 ، 0.393 ، 0.691 ، 1.31 ، 2.71 ، 6 و 12. تم حساب فروق التحول الكيميائي (Δδ) على أنها الفرق بين اللايجند الحر والرابطي- الأشكال المقيدة من RNase A البقري وفقًا للمعادلة التالية 28:

تم تحديد الفاصل لـ كمجموع متوسط ​​اضطراب التحول الكيميائي على جميع رنين الأحماض الأمينية وتم حساب الانحراف المعياري ليكون 0.105 و 0.112 لـ 5′-AMP و 3′-UMP ، على التوالي.

15 N Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) تجارب الاسترخاء NMR

تم إجراء جميع تجارب الرنين المغناطيسي النووي في مرفق الرنين المغناطيسي النووي في كيبيك / شرق كندا (QANUC) في فاريان (Agilent) 500 (11.7 T) و 800 (18.8 T) MHz مطياف NMR المجهزة بمجسات باردة ثلاثية الرنين وتدرجات المجال النبضي. أعيد تكوين جميع البروتينات بتركيز 0.4-0.6 ملي مولار في 15 ملي مولار من أسيتات الصوديوم عند درجة حموضة 5.0 مع 10٪ د2O. تم جمع أطياف ثنائية الأبعاد متداخلة بطريقة زمنية ثابتة مع τ cp تأخيرات تكرار CPMG تبلغ 0.625 و 0.714 (× 2) و 1.0 و 1.25 و 1.67 و 2.0 و 2.50 (× 2) و 3.33 و 5.0 و 10 مللي ثانية ، باستخدام فترة استرخاء كلية تبلغ 40 مللي ثانية. تمت معالجة جميع أطياف الرنين المغناطيسي النووي باستخدام NMRPipe 29 ، نصوص CPMG الداخلية وتحليلها باستخدام Sparky 30. تم إجراء تحليلات النماذج والمخلفات العالمية عن طريق تركيب بيانات تشتت CPMG 500 و 800 ميجاهرتز إلى معادلة CPMG أحادية الكم كاملة 31 باستخدام GraphPad Prism 5.


مناقشة

باختصار ، نوضح أن تحليل التسلسل وحده لعائلة المرافقة الجزيئية Hsp70 / 110 يحدد مجموعة من المخلفات المتطوّرة المشتركة ، وهو قطاع مسؤول عن الوظيفة الأساسية لبروتينات Hsp70 - اقتران خيفي بين مواقع وظيفية بعيدة في موقعين. مجالات البروتين المتميزة. حسب التقارير السابقة (Lockless and Ranganathan، 1999 Socolich وآخرون، 2005 الحلبي وآخرون، 2009) ، فإن القطاع متناثر ، بحيث يشارك جزء صغير فقط من إجمالي الأحماض الأمينية في البروتين ، ومتجاور جسديًا ، بحيث يتم توصيل موقع ربط ATP على مجال ربط النوكليوتيدات بموقع ربط الركيزة على مجال ربط الركيزة من خلال شبكة مستمرة من الأحماض الأمينية المتفاعلة. يوفر تحديد القطاع أساسًا واضحًا لتوجيه التجارب الجديدة نحو فهم أكثر اكتمالاً للآلية والاختلاف التطوري للتباين في هذه البروتينات. على سبيل المثال ، تستخدم Hsp70s مرافقين مشاركين متنوعين في الوظائف التي يساعدها الفريق والعديد من المناصب القطاعية التي تظهر كسطح خيفي للتخصيص بين المجالات في Hsp70s لها أيضًا وظيفة في ربط المجال J وتحفيز ATPase بوساطة J (Gassler وآخرون، 1998 سوه وآخرون، 1998 Vogel وآخرون، 2006 جيانغ وآخرون, 2007 ).

يضيف هذا العمل اكتشافًا جديدًا مهمًا فيما يتعلق بمفهوم قطاعات البروتين. أظهر العمل السابق أن العديد من القطاعات شبه المستقلة ممكنة ضمن مجال بروتين واحد ، يساهم كل منها في جانب مختلف من الوظيفة (حلبي وآخرون، 2009). هنا ، نظهر أن قطاعًا واحدًا يمكن أن يوجد أيضًا لربط مجالين مختلفين من البروتين غير المتماثل وظيفيًا. تؤكد هذه النتيجة على النقطة القائلة بأن القطاعات يتم تعريفها ببساطة على أنها وحدات اختيار ، بغض النظر عن التسلسل الهرمي للتنظيم الهيكلي. هناك احتمال مثير للاهتمام يتبع ذلك وهو أن القطاعات يمكن أن تنضم ماديًا وتتطور بشكل مشترك عبر واجهات البروتين والبروتين من أجل التوسط في اقتران الأنشطة بين البروتينات - جوهر إرسال الإشارات والتنظيم الخيفي. في الواقع ، تم استخدام هذه الفكرة مؤخرًا لتصميم بروتين خيفي اصطناعي ثنائي النطاق (Lee وآخرون، 2008) ، وتم استخدام مفهوم مشابه لرسم خريطة للمناطق المشاركة في التحكم في خصوصية أنظمة الإشارات البكتيرية المكونة من عنصرين (Skerker وآخرون، 2008). سيكون من المثير للاهتمام إجراء مزيد من الاختبار لفكرة أن التفاعل بين قطاعات البروتين هو عملية قد يتطور من خلالها التماثل بين البروتينات.


نص رئيسي

يتطلب التنظيم الخيفي عملًا تعاونيًا للعديد من الأحماض الأمينية لربط الأحماض الأمينية المتوضعة عن بُعد وظيفيًا. نتيجة لذلك ، من الصعب فهم كيف يمكن أن يتطور التباين من خلال عملية التباين والاختيار التدريجي. ومع ذلك ، فإن أعضاء عائلة البروتين غالبًا ما يظهرون آليات تنظيمية متنوعة ، مما يشير إلى أنه على الرغم من التعاون الجزيئي المعقد المطلوب ، فإن التباين يتطور بسهولة (1). يأتي التفسير المحتمل لكيفية حدوث ذلك من خطوط عمل منفصلة تشير إلى قدرة كامنة على التنظيم في مجموعة متنوعة من الأسطح في البروتينات. على سبيل المثال ، من الممكن هندسة محولات تفاضلية اصطناعية من خلال إدخال المجال في مواقع سطحية معينة (2–6) ، والشاشات بحثًا عن الجزيئات الصغيرة التي تعدل وظيفة البروتين تحدد أحيانًا المواقع التنظيمية الخيفية المشفرة (7, 8). بالإضافة إلى ذلك ، يشير التحليل التجريبي للتنظيم في تقويم العظام لخمائر MAP kinase Fus3 إلى أن القدرة على التنظيم الخيفي كانت موجودة قبل وقت طويل من تطور الآلية التنظيمية (9). مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن البروتينات لها بنية داخلية تكون فيها بعض المواقع على سطح البروتين "مسبقة التوصيل" وظيفيًا لتوفير التحكم في مواقع البروتين النشطة (10). تم اقتراح هذا التوصيل المسبق ليس نتيجة الحاجة إلى التنظيم ، ولكن ببساطة من الحاجة إلى أن تكون البروتينات قابلة للتطور (11). وبالتالي ، قد يرقى الحصول على تنظيم جديد إلى إشراك أو تنشيط شبكات خيفية موجودة مسبقًا ، وهو طريق لتطور التنظيم الذي يتماشى مع الاختلاف التدريجي والاختيار.

نموذج ممتاز لاختبار هذا الاقتراح هو كينازات البروتين حقيقية النواة (EPKs) ، وهي عائلة بروتينية تنوعت للتحكم في مجموعة واسعة من أنشطة الإشارات الخلوية. تحفز EPKs نقل مجموعة الفوسفات من أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) إلى بقايا Ser / Thr / Tyr لبروتين الركيزة ، وهو تفاعل يخضع للتنظيم بواسطة آليات مختلفة في العديد من المناطق السطحية في أعضاء عائلة كيناز (الشكل .1) ، بما في ذلك تفاعلات البروتين ، والتثبيط التلقائي ، و dimerization ، والتعديل بعد الترجمة (12). في الآونة الأخيرة ، اقترح فيريل وزملاؤه فكرة لتطوير إحدى هذه الآليات - تنظيم الفسفور - حيث تنظم فسفرة بقايا سطح Ser / Thr / Tyr نشاط البروتين. نظرًا لأن الفسفرة تقدم شحنة سالبة ، فإن الفكرة هي أن تنظيم الفسفور قد يتطور ببساطة عن طريق تحور بقايا مشحونة سالبة مقترنة مسبقًا (Asp / Glu) إلى بقايا فسفورية (Ser / Thr / Tyr) (13). وبالتالي ، يمكن تحويل الشحنة السالبة التأسيسية في موقع خيفي كامن إلى شحنة سالبة منظمة بطريقة تدريجية محتملة (14).

أ. صورة شجرية غير مقيدة للنسب البشري توضح تنوع عائلة EPK والعائلات الفرعية. يتم سرد أفراد الأسرة الفرعية مع الطفرات الوظيفية الموضحة في الشكل 4 ج والمضمنة في الجدول التكميلي 7. TK: tyrosine kinase TKL: TK-like STE: STE7 / 11/20 CK1: Casein Kinase 1 AGC: بروتين كيناز A / G / C CAMK: Calmodulin kinase CMGC: كيناز معتمد على cyclin (CDK) / بروتين كيناز منشط ميتوجين (MAPK) / glycogen synthase kinase (GSK) / كيناز يشبه CDK (CLK).

ب. المواقع التنظيمية الخيفية من كينازات متنوعة تم تعيينها لهيكل تمثيلي واحد - خميرة CDK Pho85 (PDB: 2PK9 ، تظهر كسطح مملوء بالفضاء). تم تحديد الأسطح التنظيمية من خلال المحاذاة الهيكلية للكيناز ذي الأهمية لـ Pho85 جميع مواضع Pho85 داخل 4 درجات من سطح التفاعل ملونة. الترميز اللوني هو نفسه كما في (أ). يوضح هذا التعيين أن التنظيم يحدث في مواقع متنوعة هيكليًا عبر بنية كيناز.

لاختبار هذه الفكرة تجريبيًا ، استخدمنا الخميرة النموذجية CMGC kinase Kss1 كنموذج (انظر النص التكميلي للحصول على خلفية Kss1 الممتدة). Kss1 هو متماثل لـ ERK البشري ويشارك في مسارات تحويل الإشارة التي تنظم نمو خيط الخميرة واستجابة التزاوج (15-18). يمكن رصد نشاط Kss1 كميًا في خلايا الخميرة الحية من خلال قدرته على تنشيط مراسلي النسخ الفلوريسنت لاستجابة فرمون التزاوج في غياب نظيره ، Fus3 (الشكل 2 أ). لقد أجرينا مسحًا غير متحيز للألانين لجميع بقايا Asp / Glu البالغ عددها 40 على سطح Kss1 لتحديد المواضع المقترنة وظيفيًا بنشاط كيناز. لقد قمنا بدمج المسوخ 40 Kss1 الناتج باعتباره النسخة الوحيدة من Kss1 في جينوم الخميرة ، وتم وضع علامة عليه في الطرف C مع حلقة 3 × FLAG (الجدولان التكميليان 1 و 2). لاختبار نشاطهم ، قمنا باختبار تحريض المستجيب للفرمون AGA1pr- مراسل YFP في أربعة تركيزات من فرمون التزاوج عامل ألفا (αF) عن طريق قياس التدفق الخلوي. على الرغم من أن جميع المسوخات حافظت على مستويات التعبير الشبيه بالنوع البري ، فقد تغيرت تسع طفرات في الجسم الحي نشاط كيناز (الشكل 2 ب ، ج ، الشكل التكميلي 1 أ). تم تحديد ثلاثة من هذه المواقف على أنها طفرات Kss1 ذات تأثير وظيفي في الدراسات السابقة (D117 ، D156 ، D321 ، الجدول التكميلي 3) (19, 20). على الرغم من إثرائها في النصف N-terminal من تسلسل Kss1 الأساسي ، إلا أن هذه الطفرات التسعة تحدث في مواقع موزعة على نطاق واسع على التركيب الذري Kss1 - بما يتوافق مع فكرة أن بعض المواقع السطحية موصلة مسبقًا بشكل انتقائي للتأثير على وظيفة الموقع النشط.

أ. مستويات التعبير لجميع طفرات Kss1 الأربعين التي تم فيها تحور كل موضع سطح حمضي إلى ألانين ، جنبًا إلى جنب مع WT و kss1Δ ضوابط الخلية. تم تمييز Kss1 (وجميع المسوخات) بـ 3xFLAG وتمت مراقبة مستوى التعبير بواسطة لطخة مناعية مضادة لـ FLAG. تمت مراقبة البروتين الكلي المحمل في كل ممر بجسم مضاد لـ Pgk1. يتم تجميع الطفرات في فئات مرتبطة بقطاعات وليست مرتبطة بقطاع ، كما تمت مناقشته لاحقًا في النص. تظهر جميع طفرات الألانين مستويات تعبير مشابهة لـ WT.

ب. لزيادة نشاط PKA ، تم التعبير عن Ras2 (G19V) النشط بشكل أساسي من مروج تم تنشيطه بما يتناسب مع تركيز استراديول في الوسائط. تمت مراقبة النمو في مرحلة السجل عن طريق قياس OD600 مع مرور الوقت في الخلايا المعالجة بالتركيزات المحددة من استراديول والمخططة بالنسبة للخلايا التي لا تحتوي على استراديول. أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري لثلاث ثقافات مستقلة. بناءً على هذه البيانات ، اخترنا استخدام 20 نانومتر استراديول لجميع التجارب لأن هذا هو أعلى تركيز لم يؤد إلى تثبيط النمو.ج. تم التعبير عن توطين YFP-Ras2 من المروج الداخلي الخاص به و YFP-Ras2 (G19V) معبراً عنه بتركيزين من استراديول ، مما يُظهر تعبيرًا مفرطًا كبيرًا عند 20 نانومتر ولكن توطين غشاء البلازما المناسب.د. رسم تخطيطي لاستراتيجية الطفرات لإدخال موقع فسفرة PKA وظيفي في موضع سطح مشحون سالبًا مقترنًا متباينًا (دائرة حمراء بعلامة "-"). أولاً ، يتم إدخال اثنين من بقايا Arg المتتالية عن طريق الطفرة (RRx) في الموضعين 2 و 3 فيما يتعلق بالموضع المشحون سالبًا (Asp / Glu) لإنشاء نموذج إجماع PKA. أثناء الحفاظ على Asp / Glu في الموضع 0 ، يجب أن يحتفظ kinase بوظيفته في وجود RRx. تم تغيير الموضع 0 التالي إلى Ala في سياق RRx لإزالة الشحنة السالبة. يجب أن تؤدي إزالة الشحنة السالبة إلى فقدان وظيفة كيناز. أخيرًا ، يجب أن يؤدي تغيير الموضع 0 إلى Ser إلى استعادة نشاط كيناز بشكل مشروط في وجود نشاط PKA.E. أدى إدخال نموذج RRx في الموضع 68 إلى فقد Kss1 للوظيفة كما تم فحصه لتنشيط AGA1pr- مراسل YFP عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد العلاج بـ 0 ، 0.01 ، 0.1 و 1 ميكرومتر αF لمدة 4 ساعات. تمثل القضبان متوسط ​​مضان YFP من 3 مكررات بيولوجية تم تطبيعها إلى غير المعالجة kss1Δ الخلايا وأشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري للتكرارات البيولوجية.

F. أدى إدخال عزر RRx في الموضع 68 إلى تقليل تعبير البروتين Kss1 وفقدان الفسفرة في حلقة التنشيط. تمت مراقبة عينات من WT و pka-E68 ذات علامات 3xFLAG بواسطة لطخة غربية مضادة لـ FLAG ، وتم فحصها أيضًا من أجل الفسفرة في حلقة التنشيط (حركة الفوسفور. حلقة)

أ. رسم تخطيطي لمسار فرمون الخميرة المعتمد على Kss1. يرتبط فرمون التزاوج بعامل ألفا (αF) بمستقبل مقترن ببروتين G (GPCR) ، مما يؤدي إلى تنشيط سلسلة إشارات تبلغ ذروتها في MAPK Kss1. يقوم Kss1 بعد ذلك بتنشيط عامل النسخ Ste12 للحث على برنامج نسخ التزاوج ، والذي يمكن مراقبته عن طريق دمج محفز الجين المستهدف AGA1 لمراسل YFP.

ب. رسم تخطيطي لشريط نموذج تجانس Kss1 (34) مع 40 من بقايا Asp / Glu التي يمكن الوصول إليها من المذيبات والتي تظهر على شكل كرات. يشار إلى شكل DFG وحلقة التنشيط باللون الأزرق الفاتح. تم تحور جميع المواقف الأربعين بشكل فردي إلى ألانين لإزالة الشحنة السالبة.

ج. سلالات الخميرة الأربعون الناتجة جنبًا إلى جنب مع WT و kss1Δ تم فحص الضوابط لتفعيل AGA1pr-YFP مراسل عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد العلاج بـ 0 ، 0.01 ، 0.1 و 1 ميكرومتر αF لمدة 4 ساعات. تمثل القضبان متوسط ​​مضان YFP من 3 مكررات بيولوجية تم تطبيعها إلى غير المعالجة kss1Δ الخلايا وأشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري للتكرارات البيولوجية. أدت الطفرات في المواضع الحمراء والخضراء إلى انخفاض أو زيادة تعبير YFP بشكل ملحوظ (ص & lt 0.05) استجابةً لجرعتين على الأقل من aF ، على التوالي. تشير المواقف الصفراء إلى أن الطفرة لم يكن لها أي تأثير في هذا الاختبار. الترميز اللوني متطابق في (ب). تظهر البيانات أن تسعة مواضع حمضية على سطح المذيب الذي يمكن الوصول إليه مرتبطة وظيفيًا بنشاط كيناز.

اختبرنا بعد ذلك ما إذا كانت هذه المواقف يمكن أن تدعم التنظيم الجديد لـ Kss1 من خلال الفسفرة بواسطة كيناز خميرة آخر في الجسم الحي. من حيث المبدأ ، يمكن لهذا الكسب من الوظيفة أن يعيد توصيل الإشارات بشكل فعال من خلال مسار استجابة التزاوج. اخترنا تنظيم تنظيم Kss1 بواسطة بروتين كيناز A (PKA) لأن نموذج إجماع الركيزة PKA ، RRxS / T يتطلب الحد الأدنى من التعديلات المحلية ، ونشاطه في خلايا الخميرة متعامد مع مسار الفيرومون ، ويمكن تنشيطه بشكل مفرط في الخميرة عبر التعبير خارج الرحم لـ Ras2 G19V (الشكل 3 أ ، الشكل التكميلي 1 ب ، ج). اخترنا ثلاثة من تسعة مواقع حساسة للطفرات (D8 و E68 و E70) مع أعلى درجات ركيزة PKA التي تنبأت بها الأداة الحسابية pkaPS (1). للمطالبة بالتنظيم الخيفي بوساطة PKA لـ Kss1 ، يجب أن نوضح: 1) أن Kss1 يحتفظ بالوظائف بعد تقديم نموذج توافق PKA المحلي (RRxد / هـ، يسمى pka-D / E) 2) يفقد Kss1 النشاط عند تحييد الشحنة (RRxأ، يسمى pka-A) و 3) أن Kss1 يعرض الآن النشاط المعتمد على PKA في الجسم الحي مع إدخال بقايا قابلة للفوسفور (RRxس، يسمى pka-S) (الشكل التكميلي 1 د). وبهذه الطريقة ، يمكن للبقايا المشحونة السطحية الوظيفية أن تكتسب بشكل محايد تسلسل إجماع الركيزة للكيناز وتصبح موقعًا لتنظيم الفسفور بخطوة واحدة من الاختلاف.

ألف رسم كاريكاتوري من مسار فرمون الخميرة المعتمد على PKA‐ و Kss1. في هذا التخطيطي ، يتطلب تنشيط Kss1 كلاً من فسفرة حلقة التنشيط بواسطة MAP2K Ste7 المنبع ، والفسفرة بواسطة PKA على سطح مقترن متباينًا. لزيادة نشاط PKA تجريبيًا ، يتم تحفيز التعبير عن Ras2 (G19V) المنشط بشكل أساسي عن طريق إضافة استراديول ، والذي بدوره ينشط adenylate cyclase (AC) لتوليد AMP دوري (cAMP) من ATP لتنشيط PKA.

ب. تم تقديم طفرات Kss1 مع زخارف إجماع موقع الفسفرة PKA بالقرب من الموضع 8 (pka-X8 ، اللوحة العلوية) أو الموضع 70 (pka-X70 ، اللوحة السفلية) للتعبير عن AGA1pr-YFP مراسل كما في الشكل 2 ج. "X"يرمز إلى الحمض الأميني في الموضع 8 أو 70 كما هو موضح أسفل الرسوم البيانية الشريطية. تُظهر الصور الموجودة أسفل الرسوم البيانية الشريطية الشكل والتعبير عن ملف AGA1pr-YFP مراسل في خلايا الخميرة التي تحمل طفرات Kss1 المشار إليها في وجود عامل ألفا 1 ميكرومتر بعد النمو في وجود أو عدم وجود 20 نانومتر استراديول. تشير البيانات إلى أن الفسفرة بواسطة PKA في هذه المواقف يمكن أن تنظم نشاط Kss1 بشكل موحد.ج. 3xFLAG بعلامات من النوع البري Kss1 و pka-X8 و -Xتم تحصين 70 طفرة من الخلايا أو الخلايا غير المعالجة التي تم علاجها باستخدام كل من استراديول 20 نانومتر وعامل ألفا 1 ميكرومتر.

تم تحليل الوصلات IP بواسطة النشاف الغربي لإجمالي Kss1 بالإضافة إلى Kss1 الفسفوري في حلقة التنشيط الخاصة به (حلقة فعل الفوسفور) أو في موقع PKA المصمم هندسيًا (موقع phospho pka). تُظهر الصور المدمجة أنه يمكن فسفرة جميع المسوخات في حلقة التنشيط الخاصة بها في وجود عامل ألفا ، ولكن يمكن فسفرة pka-S8 و pka-S70 فقط بواسطة PKA في وجود استراديول.

أدى إدخال pka-E في الموضع 68 إلى فقدان الوظيفة Kss1 (الشكل التكميلي 1E ، F) ، مما يشير إلى أنه في هذه الحالة ، لم يكن تحور المواضع 65-66 إلى أرجينين لتقديم موقع PKA محايدًا. ومع ذلك ، فإن تقديم نموذج توافق PKA في الموضعين D8 و E70 أظهر النمط الكامل المتوقع للنشاط لاكتساب تنظيم الفسفور (الشكل 3 ب). بالنسبة إلى كلا الموقعين ، كان إدخال بقايا الأرجينين المنبع محايدًا تقريبًا ، وتسبب طفرة البقايا المشحونة سالبة في فقدان الوظيفة ، واعتمد نشاط Kss1 pka-S على نشاط PKA المحسن عبر التعبير المستحث بالإستراديول لـ Ras2 G19V (الشكل 3 ب) . يدعم هذا الاكتشاف الترسيب المناعي لطفرات Kss1 ذات العلامات 3xFLAG متبوعًا بتحليل اللطخة الغربية. عرض كل من المتغيرات pka-A و pka-S فسفرة حلقة التنشيط عند معالجتها بعامل ألفا ، مما يشير إلى أنها تظل ركائز Ste7.

ومع ذلك ، تم التعرف فقط على Kss1-pka-S8 و Kss1-pka-S70 بواسطة جسم مضاد خاص بركائز PKA المفسفرة عند تنقيتها من الخلايا المعالجة بالإستراديول (الشكل 3 ج). علاوة على ذلك ، كان كل من Kss1-pka-S8 و Kss1-pka-S70 قادرين على تحفيز الاستجابة المورفولوجية للفرمون - إسقاط التزاوج المعروف باسم "shmoo" - بطريقة تعتمد على النشاط αF‐ و PKA (الشكل 3 ب). وبالتالي ، يمكن إعادة توصيل المخرجات النصية والفسيولوجية لـ Kss1 للاعتماد على إدخال متعامد من خلال عملية متدرجة لإدخال موقع فسفرة في مواقع سطح خيفي كامنة.

ما الذي يميز الأحماض الأمينية ذات الأسطح التسعة ذات الشحنة السالبة والتي يتم توصيلها مسبقًا بأسلاك مختلفة لتنظيم موقع Kss1 النشط؟ هل هذا الاقتران الوظيفي خاص بـ Kss1 أم محفوظ في عائلة كيناز؟ لمعالجة هذا ، استخدمنا تحليل الاقتران الإحصائي (SCA) (22-24) لفحص الحفظ المترابط (أو التطور المشترك) لمواضع الأحماض الأمينية في محاذاة تشمل جميع فصائل EPK الفرعية ومحاذاة مركزة لعائلة CMGC الفرعية التي تتضمن كينازات MAP (الشكل التكميلي 2A ، B). النتيجة الأساسية من SCA هي اكتشاف أن عائلات البروتين لديها شبكات داخلية من الأحماض الأمينية المتغيرة (تسمى "القطاعات") التي تميل إلى ربط المواقع النشطة للبروتين بمواقع السطح الخيفي البعيدة (22, 25-28). تمشيا مع هذا ، حددنا قطاعًا بروتينيًا في عائلة EPK يشكل شبكة متجاورة جسديًا من الأحماض الأمينية داخل الهيكل ثلاثي الأبعاد (الشكل التكميلي 2C-E ، الجدول التكميلي 4). تم إثراء القطاع للوظائف المرتبطة بوظيفة كيناز: تُظهر المقارنة مع المسح الطفري العميق لـ ERK2 البشري ارتباطًا واضحًا ودائمًا من الناحية الإحصائية بين القطاع والمواقع المرتبطة بفقدان الوظيفة (ص = 2.3E-19 بواسطة اختبار فيشر الدقيق ، الشكل التكميلي 3 ، الجدول التكميلي 5). علاوة على ذلك ، يضم القطاع العديد من الأشكال الهيكلية المعروفة جيدًا بأنها مرتبطة بتنشيط كيناز بما في ذلك الحلزون aC و DFG والأشواك الحفازة والتنظيمية (الشكل التكميلي 2C-E ، الشكل التكميلي 4) (30, 31). وهكذا ، كما هو الحال بالنسبة للبروتينات الأخرى ، يوفر تحليل التطور المشترك المحفوظ للأحماض الأمينية في EPKs نموذجًا متناثرًا وموزعًا للتوصيل النشط وظيفيًا للأحماض الأمينية (24).

تم إجراء التحليل لاثنين من محاذاة التسلسل المتعدد المختلفين للمجال التحفيزي للكيناز: واحد خاص بـ CMGC kinases (635 تسلسلًا) ، والآخر يحتوي على 7128 كيناز تم أخذ عينات منها عبر kinome.

أ. رسم بياني يوضح توزيع هويات التسلسل الزوجي المحسوبة عبر جميع أزواج التسلسلات في محاذاة CMGC.

ب. كما في (أ) ولكن من أجل المحاذاة العريضة kinome. تُظهر كلتا المحاذاة توزيعًا أحاديًا مع هوية تسلسل زوجي متوسط ​​قريب

ج. يتم توزيع المواقف القطاعية المشتقة من محاذاة CMGC (باللون الأزرق) أو المحاذاة على مستوى kinome (الأصفر) على طول الهيكل الأساسي والثانوي لـ CMGC / MAPK ERK2. المناطق الخاصة بالعائلة الفرعية ، مثل إدراج MAPK ، ليست سوى جزء من القطاع المشتق من محاذاة CMGC.

د. العلاقة بين القطاع والحفظ الموضعي (محسوبة على أنها الانتروبيا النسبية Kullback-Leibler ، دأنا) لكل من CMGC والمحاذاة على مستوى kinome. يتم تمييز مواقف القطاع باللون الأزرق أو الأصفر لمحاذاة CMGC و kinome على التوالي. تشير النجوم الحمراء إلى مواقع محفوظة بدرجة عالية (تُعرف بـ دأنا & GT 2.0 في محاذاة على نطاق kinome).

E. تم تعيين قطاعات kinome-wide و CMGC (الأسطح الشفافة الصفراء والزرقاء ، على التوالي) على ERK2 البشري (الشريط الرمادي) (PDB: 2ERK). تظهر المواضع المحفوظة على شكل كرات حمراء.

أ. يتم عرض قطاع CMGC كسطح سماوي شفاف مغطى بنموذج الكرة والعصا R. norvegicus ERK2 (PDB: 2ERK). يشير الترميز اللوني لخريطة الحرارة باللونين الأحمر والأبيض والأزرق لنموذج الكرة والعصا إلى بقايا تم تحويرها بواسطة Brenan et al. (29) أدى إلى استنتاج اكتساب الوظيفة (GOF) والنشاط المحايد وفقدان الوظيفة (LOF) ، على التوالي ، من ERK2 البشري.

ب. يوضح جدول فيشر الدقيق الإثراء ذي الدلالة الإحصائية لطفرات LOF المستنبطة في ERK2 مع المواضع المرتبطة بقطاع CMGC.

أ. مواقف الحفاز (C) والتنظيم (R) العمود الفقري كما حددها Kornev وآخرون (30, 31) ، الكرات الصفراء والحمراء الداكنة على التوالي) على مخطط شريط رمادي لبروتين كيناز أ (PDB: 2CPK).

ب. يتم تراكب القطاع على مستوى kinome باللون الأزرق على اللوحة (أ).

ج.شريحة عمودية في منتصف الطريق من خلال اللوحة (ب) الكشف عن التداخل بين العمود الفقري والقطاع. يتم تغليف جميع أوضاع العمود الفقري داخل قطاع أو قطاع متصل.

أ. مخطط ملء الفراغ لنموذج التماثل Kss1 (34). يُشار إلى قطاع CMGC ، الذي تم تعريفه على أنه المواقف التي تتطور بشكل مشترك عبر كينازات CMGC ، باللون الأزرق. تظهر بقايا السطح الحمضية ذات التأثير المحايد أو المنشط أو المعطل على وظيفة كيناز عند حدوث طفرة في الألانين على شكل كرات صفراء أو خضراء أو حمراء على التوالي.

ب. يوضح جدول فيشر الدقيق إثراءًا مهمًا من الناحية الإحصائية لمخلفات السطح الحمضية مع تأثير وظيفي على الطفرة في المواضع المتصلة بالقطاع. لكي تكون متصلاً بالقطاع ، يجب أن يحتوي الموضع على ذرة واحدة على الأقل ضمن 4 Å من القطاع.

ج. تم تعيين القطاع الواسع للعائلة الفائقة EPK (الكرات الزرقاء) على CMGC خميرة كيناز Pho85 (PDB: 2PK9 ، كارتون رمادي وسطح). المواقف الحمراء هي المواقع التي تم جمعها من الأدبيات المعروفة بتغيير وظيفة كيناز عند تحورها في دراسة وظيفية أو سياق مرض بشري (الجدول التكميلي 7).

د. يوضح جدول فيشر الدقيق إثراءًا مهمًا إحصائيًا للطفرات الوظيفية الموضحة في ج في مواقع مرتبطة بالقطاع.

E. نموذج لتطور التنوع التنظيمي. ترتبط المواقع الخيفية الكامنة الموزعة عبر سطح البروتين (الدوائر الحمراء) بالموقع النشط عبر قطاع البروتين (الأسهم الزرقاء). هذه المواقع مهيأة لاكتساب تنظيم جديد عبر العمليات التطورية أو المرضية أو الهندسية. في أي فرد معين من أفراد الأسرة ، يمكن استخدام مجموعة فرعية فقط من المواقع ، ولا يلزم حفظ الآلية التنظيمية عبر المتماثلات.

اقترح العمل السابق أن يمثل القطاع الآلية المادية التي يقوم عليها التمديدات المسبقة للمواقع السطحية التي تعمل كنقاط ساخنة لظهور تنظيم خيفي جديد (10, 32). تمشيا مع هذا ، ثمانية من تسعة من مخلفات D / E السطحية المقترنة وظيفيا في Kss1 متصلة بقطاع (P = 0.0098 ، اختبار فيشر الدقيق) (الشكل 4 أ ، ب) ، بما في ذلك الاثنان اللذان ينتجان فسفورًا جديدًا يعتمد على PKA. وبالتالي ، فإن اكتساب الوظيفة التنظيمية الجديدة في Kss1 يحدث في المواقع التي ليست ذات طابع خاص ، ولكنها تتفاعل مع شبكة خيفية تتطور معًا في عائلة كيناز بأكملها. هذه النتيجة قوية لتفاصيل إنشاء المحاذاة والقطع الإحصائي لتحديد مواقع القطاع (الشكل التكميلي 5 ، الجدول التكميلي 6). تدعم هذه البيانات نموذجًا يظهر تنظيمًا جديدًا بشكل تفضيلي في البروتينات الموجودة في المواقع السطحية والتي تكون مسبقة التوصيل تطوريًا في عائلات البروتين.

ضمن النص الرئيسي ، نعرض ارتباطًا ذا دلالة إحصائية بالقطاع المحدد باستخدام المحاذاة المحددة لـ CMGC. للمقارنة ، نعرض هنا النتائج باستخدام محاذاة kinome-wide (EPK).

أ. نموذج Kss1 يملأ الفراغ باللون الرمادي ، مع قطاع عرض kinome باللون الأزرق. المواقف ذات الطفرات المحايدة وفقدان الوظيفة واكتساب الوظيفة مرمزة بالألوان (أصفر ، أحمر ، أخضر ، على التوالي).

بيوضح جدول فيشر الدقيق إثراءًا مهمًا من الناحية الإحصائية للمخلفات الوظيفية في المواضع المتصلة بالقطاع المستمدة من المحاذاة على مستوى كينوم.

إذا كان الأمر كذلك ، يجب أن تتبع جميع الكينازات الطبيعية المبدأ القائل بأنه يجب العثور على المواقع الخيفية الحساسة وظيفيًا وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، بغض النظر عن الآلية ، بتفضيل إحصائي على الأسطح المتصلة بالقطاع. ستوفر الأسطح المتصلة بالقطاع بعد ذلك تفسيرًا لتنوع المواقع التنظيمية التي لوحظت في كينازات موجودة (الشكل 1). للتحقيق في ذلك ، أنشأنا قاعدة بيانات منظمة للطفرات التي تم أخذ عينات منها عبر مجموعة متنوعة من كينازات (تلك المدرجة في الشكل 1 أ ، الجدول التكميلي 7). تم اختيار هذه الطفرات لأنها أثبتت تجريبياً أنها تعطل تنظيم و / أو وظيفة الكيناز ، وفي كثير من الحالات ، ترتبط أيضًا بالمرض. يكشف تحليل الطفرات المأخوذة من عائلة كيناز عن نمط واضح: مجموعة الطفرات الوظيفية حول حواف القطاع مع تفضيل إحصائي قوي (ع = 0.00068 ، اختبار فيشر الدقيق) (الشكل 4 ج ، د ، الجدول التكميلي 8). وهكذا ، نستنتج أن البنية الطبيعية لأنازات البروتين تسهل بالفعل تطور التنوع التنظيمي.

الفكرة المركزية التي تدعمها نتائجنا هي أن البروتينات تحتوي على آلية تعاونية محفوظة تمنح مواقع محددة على سطح البروتين قدرة كامنة على التباين. نتيجة لهذه العمارة التعاونية الجوهرية ، قد يظهر التنظيم الخيفي في مجموعة متنوعة من الأشكال الميكانيكية في مواقع متعددة ومتميزة في أفراد الأسرة المختلفين (الشكل 4E). توضح نتائجنا إستراتيجية عامة لهندسة مسارات إشارات الخلايا الجديدة - في الجسم الحي يمكن من حيث المبدأ إدخال تنظيم الفسفور في أي بروتين قابل للذوبان عن طريق استهداف المخلفات سالبة الشحنة على الأسطح المتصلة بالقطاع (3). علاوة على ذلك ، يوفر القطاع سياقًا لتفسير طفرات كيناز المتضمنة في المرض (الشكل 4 ج) ، ويقترح مواقع خفية محتملة لتطوير مثبطات التباين (8). بشكل عام ، يوفر هذا النموذج مسارًا لفهم كيفية تطور الأنظمة التنظيمية المعقدة ، ويقترح أن توفر حواف القطاع ركيزة لتوليد تباين في الإشارات الخلوية والاتصالات.


خطاب القرار

حرصًا على الشفافية ، تتضمن خدمة eLife خطاب قرار التحرير وردود المؤلف المصاحبة. نسخة معدلة بشكل طفيف من الرسالة المرسلة إلى المؤلفين بعد عرض مراجعة الأقران ، مما يشير إلى المخاوف الأكثر جوهرية التي لا يتم تضمين التعليقات الثانوية عادة.

شكرًا لك على إرسال مقالتك "استنتاج المحددات الهيكلية للتسلسل المشترك للخصوصية الوظيفية للبروتين" للنظر فيها eLife. تمت مراجعة مقالتك من قبل ثلاثة من المراجعين النظراء ، وأشرف على التقييم محرر مراجعة وريتشارد ألدريتش بصفته محررًا أول. وافق الشخص التالي الذي شارك في مراجعة طلبك على الكشف عن هويته: David T Jones (المراجع رقم 2).

ناقش المراجعون المراجعات مع بعضهم البعض وصاغ المحرر المراجع هذا القرار لمساعدتك في إعداد إرسال منقح.

قدم المؤلفون منهجًا لتحديد المخلفات الوظيفية المحددة التي تميز المجموعات الفرعية الوظيفية في العائلة الفائقة التطورية للبروتين. تعتمد الطريقة على تحديد مجموعات المخلفات من خلال تحليل التسلسل (التقسيم البايزي مع اختيار النمط ، BPPS) التي تميز العائلات الفرعية الفردية لعائلة أكبر / عائلة عظمى. يتبع ذلك خطوة ثانية تحدد مجموعات المخلفات باستخدام نهج يعتمد على بنية البروتين (الأهمية المستنتجة لبقايا الأنماط المتفاعلة هيكليًا ، SIPRIS) وحساب أهمية إحصائية لتداخل الكتلة القائمة على الهيكل مع الكتلة القائمة على التسلسل. هذا المزيج هو نهج يحتمل أن يكون قويًا جدًا وثاقبًا وقيِّمًا ، مع تطبيقات واسعة النطاق في الكشف عن آليات التباين.

كان المراجعون متحمسين للتأثير المحتمل للطريقة ، بالإضافة إلى كتابة وتقديم المخطوطة ، واتفقوا على أن المقارنة المعيارية للمخلفات التعددية محدودة من خلال الأدبيات التجريبية المتاحة ، مما يبرر استخدام أمثلة محددة. ومع ذلك ، تتطلب جوانب أخرى من النهج مزيدًا من القياس الكمي والقياس المعياري. على وجه التحديد ، سوف تتحسن الثقة في الطريقة بشكل كبير من خلال تضمين:

1) معيار لقدرة استراتيجية BPPS / SIPRIS على تحديد بقايا موقع الربط الوظيفي ، مثل البقايا المحددة للنوعية التي تميز مجموعات البروتين الفرعية التي تربط روابط مختلفة. يجب أن تكون هذه التنبؤات سهلة التقييم باستخدام مواقع ربط الركيزة المعروفة على سبيل المثال. مورد IBIS.

2) المقارنة المعيارية للتقسيم إلى عائلات فرعية بواسطة طريقة BPPS. يمكن للمؤلفين مقارنة المجموعات الفرعية التي حققتها طريقة MCMC لـ BPPS مع المجموعات المحددة من خلال التوصيف التجريبي للأقارب ، على سبيل المثال. في مورد SFLD الذي يوفر مجموعات هرمية منظمة لأقارب تسلسل الأسرة الفائقة. انظر على سبيل المثال المقارنة المعيارية لتجميع الفصائل الفرعية في Brown، D.P.، Krishnamurthy، N. and Sjölander، K.، 2007. التعرف الآلي على فصيلة البروتين وتصنيفها. PLoS علم الأحياء الحسابي ، 3 (8) ، ص. هـ 160.

3) تحليل أو مناقشة اعتماد طريقة BPPS على جودة محاذاة تسلسل الإدخال المتعدد (MSA). على الرغم من استخدام البحث المتسلسل لتوسيع مجموعات البيانات ، فمن المفترض أنه من الضروري وجود ممثلين رئيسيين في مجموعة البداية. يشير هذا إلى أن بعض المعرفة بالمجموعات الفرعية ضرورية قبل البدء في تحليل BPPS. ما مدى اعتماد الطريقة على وجود مجموعات إعلامية من التسلسلات لكل مجموعة فرعية في المجموعة البادئة؟ ما هو نطاق RMSD بين الأقارب في MSA المستخدم لتحليل مثال العائلات الفائقة؟ ما مدى انطباق هذه الطريقة على العائلات الفائقة شديدة التباين من الناحية الهيكلية؟

4) وفقًا لسياسة المجلة ، يجب توفير أقصى حد ممكن من برامج BPPS و SIPRIS. يجب أن يتوافق الرمز مع تعريف المصدر المفتوح (https://opensource.org/docs/osd) ، ويجب إيداعه في مستودع عام مناسب.لضمان إمكانية إعادة إنتاج البرامج دون قيود ومن الاعتراف بالمؤلفين بشكل صحيح لعملهم ، يجب على المؤلفين ترخيص الكود الخاص بهم باستخدام ترخيص مفتوح المصدر. يتم تشجيع المؤلفين على استخدام خدمات التحكم في الإصدار مثل GitHub و GitLab و SourceForge. eLife يحتفظ بحساب GitHub لأرشفة الكود المصاحب eLife المنشورات التي تم إيداعها على GitHub أو خدمة التحكم في الإصدارات الأخرى.


هندسة خصوصية ركيزة أسيل ترانسفيراز لتركيبات بولي كيتيد خط التجميع

تعمل منتجات Polyketide الطبيعية كمجموعة واسعة من العلاجات ، بما في ذلك المضادات الحيوية ومثبطات المناعة والعوامل المضادة للسرطان. ينبع هذا التنوع العلاجي من التنوع الهيكلي لهذه الجزيئات الصغيرة ، والتي يتم إنتاج العديد منها بطريقة خط التجميع بواسطة مركبات البوليكيتيد المعيارية. نطاقات أسيلترانسفيراز (AT) لهذه الأطوار الضخمة هي المسؤولة عن اختيار وإدماج كتل بناء أحادية بسيطة ، وبالتالي فهي مسؤولة عن كمية كبيرة من التنوع الهيكلي الناتج عن البوليكيتيد. غالبًا ما يتم استهداف خصوصية الركيزة لهذه المجالات للهندسة في توليد منتجات طبيعية جديدة نشطة علاجيًا. توضح هذه المراجعة التطورات الأخيرة التي يمكن استخدامها في الهندسة الناجحة لهذه المجالات ، بما في ذلك تسلسل AT والبيانات الهيكلية والرؤى الميكانيكية وإنتاج مجموعة متنوعة من وحدات الموسع. كما يوفر نظرة عامة على محاولات هندسة مجال AT السابقة ، ويختتم بالنهج الهندسية المقترحة التي تستفيد من المعرفة الحالية. قد تؤدي هذه الأساليب إلى الإنتاج الناجح للمنتجات الطبيعية النشطة بيولوجيًا "غير الطبيعية".

1 المقدمة

كانت المنتجات الطبيعية تاريخياً مورداً لا يقدر بثمن في اكتشاف وتطوير الجزيئات الصغيرة النشطة علاجيًا. أصبحت المنتجات الطبيعية المشتقة من الكائنات الحية الدقيقة أكثر انتشارًا بعد اكتشاف البنسلين وظلت مهمة حتى التسعينيات ، عندما كان ما يقرب من 80 في المائة من الأدوية إما منتجات طبيعية أو نظائرها من المنتجات الطبيعية [1]. على الرغم من التراجع اللاحق في الاستثمارات في أبحاث المنتجات الطبيعية من قبل صناعة الأدوية ، فإن المجال الآن مجهز بشكل أفضل من أي وقت مضى لتلبية الاحتياجات العلاجية الحرجة. إن التطورات في تقنيات التسلسل وتقنيات التحليل البنيوي ، جنبًا إلى جنب مع فهم أفضل لمسارات التخليق الحيوي وثروة من كائنات المصدر غير المكتشفة ، تخلق بيئة مثيرة لاكتشاف الأدوية في المستقبل [1-3].

شهدت فئة البوليكيتيد من المنتجات الطبيعية نجاحًا هائلاً في مجال الأدوية التجارية ، مع "معدل إصابة" أعلى بعدة أوامر من حيث الحجم فوق مكتبات المركبات الاصطناعية [1]. تعمل مادة البوليكيتيدات كمجموعة واسعة من العلاجات ، بما في ذلك المضادات الحيوية (إريثروميسين أ) ، ومثبطات المناعة (FK506 ، رابامايسين) ، والعوامل المضادة للسرطان (سالينوسبوراميد أ ، إيبوثيلون ب) وغيرها (الشكل 1). يتم إنتاج العديد من البوليكيتيدات عن طريق خط التجميع التركيبات البوليكيتيد (PKSs) ، والتي تبني سلاسل البوليكيتيد عن طريق التكثيف المتتالي للوحدات الفرعية المشتقة من الإنزيم المساعد A (CoA). وقد وضعت الوحدات النمطية الهيكلية والوظيفية لمجمعات الإنزيمات هذه في طليعة المساعي الهندسية في السعي وراء المنتجات الطبيعية النشطة بيولوجيًا "غير الطبيعية". تنبع كمية كبيرة من تنوع البوليكيتيد من الاختلافات في اختيار كتلة البناء بواسطة نطاقات أسيلترانسفيراز (AT) ، وبالتالي فقد ركزت العديد من الجهود الهندسية على تغيير النشاط التحفيزي لهذه المجالات.

الشكل 1. التنوع الهيكلي والعلاجي لمنتجات البوليكيتيد الطبيعية. ينبع هذا التنوع إلى حد كبير من الاختلافات في اختيار وحدة الموسع بواسطة مجال AT (للحصول على التفاصيل ، انظر النص).

في حين أن البيئة مناسبة للتطورات الرئيسية في هندسة البوليكيتيد ، يجب أن تكون هذه المساعي على علم بالجهود السابقة والمعرفة الجديدة. تبدأ هذه المراجعة بفحص خصائص وحدات PKS المعيارية التي وضعتها في الأصل في طليعة الجهود الهندسية ، وتوضح التطورات الأخيرة التي يمكن استخدامها بشكل أكبر في الهندسة الناجحة لخطوط التجميع الأنزيمية هذه (الشكل 2). ندرس المحاولات السابقة لهندسة اختيار الركيزة PKS من خلال هندسة مجال AT ، مثل تبديل مجال AT ، وضربات القاضية AT والتكملة بواسطة مجال يعمل عادةً في عبر، والطفرات الموجهة من موقع AT (الشكل 3). نختتم باقتراح مناهج هندسية مستقبلية نعتقد أنها ستكون الأكثر نجاحًا في البحث عن بوليكيتيدات جديد. تستفيد هذه الأساليب القائمة على الهيكل والتسلسل من المعلومات المذكورة أعلاه وتبني على الهندسة الناجحة لعائلات البروتين المماثلة. وهذا سوف يمهد الطريق لتطوير الأدوية المنتجة في المستقبل القريب (الشكل 4).

الشكل 2. أدوات لهندسة خصوصية الركيزة لمجالات AT المعيارية. تجمع مجموعة متنوعة من الركائز والرؤى الميكانيكية والتسلسل والمعلومات الهيكلية للسماح لهندسة خصوصية ركيزة AT المنتجة باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات (للحصول على التفاصيل ، انظر النص). (نسخة ملونة على الإنترنت.)

الشكل 3. المحاولات السابقة لهندسة خصوصية ركيزة مجال AT. يُعرَّف مجال AT "المتقبل" على أنه سقالة هندسة البداية ، بينما يمتلك مجال AT "المانح" خصوصية الركيزة النهائية المرغوبة ويستخدم إما لاستبدال أو توفير نموذج لطفرة المجال المتقبل. MMCoA ، methylmalonyl-CoA MCoA ، malonyl-CoA EMCoA ، ethylmalonyl-CoA MeO-ACP ، methoxymalonyl-ACP PPM-SNAC ، 2-propargylmalonyl-ن- أسيتيل سيستامين. (نسخة ملونة على الإنترنت.)

الشكل 4. مستقبل هندسة مجال AT. بالنظر إلى الأدوات الموجودة لهندسة خصوصية الركيزة لمجال AT ، فإن العديد من التقنيات المختلفة ممكنة. تم استخدام التقنيات المحددة سابقًا لهندسة خصوصية الركيزة لعائلات البروتين الأخرى. (نسخة ملونة على الإنترنت.)

2. مجال نقل الأسيل كهدف هندسي

2.1. تنوع البوليكيتيد: أهمية مجال ناقل الأسيل

تم العثور على النوع المعياري I PKSs بشكل أساسي في البكتيريا سالبة الجرام والموجبة ، وهي منتشرة بشكل خاص في الفطريات الشعاعية [4]. تتكون هذه الأطوار الضخمة من العديد من الوحدات التحفيزية التي تكون كل منها مسؤولة عن جولة واحدة من استطالة سلسلة البوليكيتيد. تتكون كل وحدة من عدة مجالات إنزيمية مختلفة ، يلعب كل منها دورًا مميزًا في تمديد وتعديل البوليكيتيد المتنامي. تحدد مجالات AT لبنة البناء المناسبة α-carboxyacyl-CoA وتحفز تحميلها على ذراع الفوسفوبانتيثين لبروتين حامل الأسيل (ACP). تقبل نطاقات Ketosynthase (KS) سلسلة polyketide من ACP المنبع وتحفز تكثيفًا شبيهًا بـ Claisen بينها وبين وحدة موسع α-carboxyacyl-CoA المرتبطة بـ ACP. معًا ، تشتمل KS و AT و ACP على الحد الأدنى من الوحدة الضرورية والكافية لجولة واحدة من استطالة السلسلة. قد تكون مجالات الملحقات مثل ديهيدراتاز (DH) ، واختزال إنوييل (ER) ونطاقات اختزال كيتو (KR) موجودة أيضًا في وحدة نمطية وتتحكم في مستوى تعديل الأكسدة لمجموعة β-keto بعد استطالة السلسلة. مجال thioesterase (TE) مسؤول عن إطلاق منتج polyketide النهائي ، إما عن طريق cyclization أو عن طريق هجوم من nucleophile خارجي.

جينات PKS المعيارية والبروتينات المقابلة لها خطية مشتركة [5،6] - تنظيم خط التجميع (وبالتالي بنية منتج البوليكيتيد) يمكن غالبًا التنبؤ به من تسلسل الجينات. جعلت هذه الوحدة النمطية المجمعة هذه المحفزات أهدافًا جذابة في هندسة المنتجات الجديدة عبر التخليق الحيوي التوافقي [7،8]. تتلقى معظم المجالات في خط التجميع ركائزها من الخطوات التحفيزية السابقة وليس عن طريق التحميل المنتشر ، وبالتالي قد لا تكون هذه الإنزيمات مدفوعة تطوريًا لتطوير خصائص ركيزة صارمة ويمكن أن تكون قوية بطبيعتها لإعادة الترتيب [9]. في الواقع ، تم إثبات أن تحميل مجالات AT و KS و ACP و KR و DH و ER من سينثاز 6-deoxyerythronolide B (DEBS) يقبل ركائز تختلف اختلافًا كبيرًا عن ركائزها الأصلية [10-15]. بدلاً من ذلك ، تستقبل نطاقات AT الموسعة ركائزها بشكل منتشر وتظهر عادةً خصوصية صارمة تجاه كتلة بناء α-carboxyacyl-CoA واحدة [10،14]. من خلال العمل كحراس البوابة الأساسيين لدمج اللبنات الأساسية ، تلعب هذه المجالات دورًا مهمًا في تنويع البوليكيتيد وغالبًا ما تكون الهدف الأساسي للجهود الهندسية. هم أيضا محور هذه المراجعة.

2.2. تنوع وحدة الموسع

تكون نطاقات AT الممتد في وحدات PKS المعيارية محددة بشكل طبيعي للعديد من ركائز α-carboxyacyl-CoA المختلفة ، ولكن يتم استخدام malonyl-CoA و methylmalonyl-CoA بشكل شائع في مسارات التخليق الحيوي المميزة حتى الآن [16]. تم تحديد مجالات AT أيضًا القادرة على التعرف على ركائز مرتبطة بـ ACP ، مثل تلك التي تشارك في التخليق الحيوي للجيلداناميسين [17] و zwittermicin A [16،18-20] و guadinomine [21]. في الجسم الحي و في المختبر كانت الدراسات التي تهدف إلى استجواب خصوصية الركيزة AT مقيدة سابقًا بتكلفة وتوافر هذه الوحدات الموسعة [22-23] ، ولكن ظهرت طرق لإنتاج مجموعات متنوعة من الوحدات الباسطة بشكل إنزيمي في السنوات الأخيرة.

أدى اكتشاف متجانسات كروتونيل- CoA carboxylase / reductase (CCR) في مسارات التخليق الحيوي للبوليكيتيد إلى مضاعفة عدد وحدات الموسع المرتبطة بـ CoA والمعروفة بدمجها في البوليكيتيدات. تحفز هذه الإنزيمات الكربوكسيل الاختزالي لسلائف α ، غير المشبعة أسيل CoA (للمراجعة ، انظر Wilson & amp Moore [24]). اكتشفت في الأصل في سياق ethylmalonyl-CoA [25] ، وسرعان ما توسعت وظيفة CCR لتشمل التخليق الحيوي لألكيل مالونيل CoA ومشتقات malonyl-CoA المستقيمة والمتفرعة السلسلة. تظهر نطاقات AT المرتبطة بوحدات الموسع المتولدة من CCR عادةً خصوصية مريحة ، وقد تم عمل العديد من نظائر البوليكيتيد التي تستفيد من هذه الحقيقة ، لكن المساعي الأكثر طموحًا ستستفيد من الهندسة العقلانية [24].

يمكن إنتاج Malonyl-CoA عن طريق التنشيط المباشر للمالونات بواسطة مركب تخليق malonyl-CoA المعتمد على ATP (MatB [26،27]). إن التركيبات malonyl-CoA من ريزوبيوم تريفولي [28] و Streptomyces coelicolor [22] تبين أن لديها قدرة تحمل واسعة للركيزة ، وتنشيط العديد من ركائز 1.3-ديكاربوكسيلات المختلفة بكفاءة قابلة للقياس. ال S. coelicolor كما تم إثبات أن MatB مختلط تجاه متقبلات الثيول ، وقادر على الإنتاج ن-اسيتيل سيستامين- (SNAC-) ووحدات البانتيثين المرتبطة [22]. تم إثبات أن مجالات AT تقبل نظائر SNAC و Pantetheine ، ويتم امتصاص هذه الركائز بسهولة بواسطة خلايا من الوسائط الخارجية [22،29-35]. نشاط R. trifolii تم تحسين MatB تجاه العديد من مشتقات malonate الطبيعية وغير الطبيعية باستخدام طفرات التشبع الموجهة بالهيكل [36،37]. ومن المثير للاهتمام أن عبرتبين أن مجال -AT من kirromycin PKS أكثر اختلاطًا مما كان متوقعًا في الأصل عند فحصه لنشاط transacylation مع وحدات الموسع المولدة من MatB [37].

توفر مجموعة متنوعة من وحدات الموسع المرتبطة بـ CoA مجموعة أدوات قيّمة لمهندس البوليكيتيد. القدرة على دمج العديد من وحدات الموسع المرتبطة بـ MatB أو CCR المشتقة من CCR في DEBS ، على سبيل المثال ، لديها القدرة على إنتاج أكثر من مليون منتج جديد بمفردها. توفر وحدات الموسع هذه لـ في الجسم الحي و في المختبر تسمح الدراسات باستجواب المحددات الهيكلية والميكانيكية لخصوصية الركيزة. إن ظهور مجالات AT القادرة على اختيار ركائز غير موجودة في المضيف الأصلي يوفر أيضًا سقالات انطلاق جديدة في السعي وراء مجالات AT ذات الخصوصية المتغيرة.

2.3 رؤى ميكانيكية Acyltransferase

يحدث الدمج المحفز لـ AT للوحدات الموسعة المشتقة من CoA بواسطة آلية ping-pong ثنائية ثنائية [38،39] تتضمن وسيطًا من acyl-AT والذي يخضع لهجوم محب للنواة بواسطة بقايا thiol الموجودة على ذراع phosphopantetheine لـ ACP. كشفت الدراسات المبكرة أن نطاقات AT المعيارية من المحتمل ألا تمتلك نشاط epimerase ، وجميع المجالات في DEBS تتضمن حصريًا (2)س) -methylmalonyl-CoA [40]. إن المعدل السريع الذي تحفز به نطاقات AT تحفيز transacylation جعل التوصيف الحركي لنشاطها بعيدًا عن بقية خط التجميع أمرًا صعبًا. في الآونة الأخيرة ، تم تمييز مجال AT من الوحدة 3 من DEBS باستخدام مقايسة إنزيمية مقترنة سمحت بالمراقبة المستمرة للنشاط التحفيزي AT وبالتالي توصيف خصوصية α-carboxyacyl-CoA و ACP. كشفت هذه الدراسة أن (2S) -Methylmalonyl-CoA لهذا الإنزيم تكمن في تفاعل النصف الأول لآلية بينج بونج (تكوين ميثيل مالونيل- AT الوسيط [39]). تم افتراض أن الانقسام المائي للركائز غير الصحيحة هو آلية تحديد الخصوصية المستخدمة من قبل مجالات AT ، لكن الأهمية المبلغ عنها لهذه الآلية قد اختلفت [39،41].

أثبتت العديد من الدراسات أهمية تفاعلات AT-ACP المناسبة أثناء transacylation. كشف فحص المجالات من الوحدات 3 و 6 من DEBS أن أزواج AT-ACP المتشابهة لها خصوصية أكبر بمقدار 10 أضعاف لبعضها البعض مقارنة بالبروتينات غير المتجانسة [39،42]. يعتمد انتقال سلسلة البوليكيتيد [43] والاستطالة [15] أيضًا على تفاعلات البروتين والبروتين المناسبة داخل وحدة نمطية ، وقد تم تحديد أجزاء معينة من مجال AT تساهم في هذه التفاعلات. على سبيل المثال ، تم توضيح الشق الذي تم تكوينه بواسطة مجال KS و KS to AT linker ومجال AT ليكون موقع إرساء محتمل لـ ACP أثناء نقل السلسلة والاستطالة [44،45]. سيكون الحفاظ على تفاعلات البروتين والبروتين الضرورية لجميع الأنشطة في خط التجميع أمرًا مهمًا عند هندسة مجالات AT لإدماج الركيزة الجديدة.

2.4 تسلسل مجال ترانسفيراز وهيكله

أدى تطوير تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية والارتفاع في تسلسل الجينوم الكامل إلى زيادة سريعة في عدد سلاسل مجموعات PKS المتاحة [46]. تم تسلسل المئات من مجالات AT وتم تمييز مجموعاتها كيميائيًا حيويًا [47] ، مما يوفر مجموعة بيانات مفيدة في هندسة هذه المجالات باستخدام الأساليب الإحصائية القائمة على التسلسل. تشترك العديد من نطاقات AT في تناظر التسلسل العالي ويمكن تحديدها حسابيًا استنادًا إلى تشابه تسلسلها مع قالب مجال AT [48]. ومن المثير للاهتمام ، أن الاختلاف يحدث على أساس خصوصية وحدة الموسع وليس على أساس الأنواع الأصلية أو تكوين بقية وحدة PKS [49]. تنتج التحليلات الوراثية لنطاقات AT المشروحة لخصوصية الركيزة صفيحتين رئيسيتين بناءً على خصوصية methylmalonyl- أو malonyl-CoA [48-50] ، ويتم تحسين هذا الفصل عند النظر فقط في الموقع النشط والبقايا المحفوظة للغاية والتي تختلف مع ميثيل مالونيل أو مالونيل- خصوصية الركيزة CoA [48]. تم التعرف أيضًا على المخلفات المهمة في التنبؤ بخصوصية إيثيل مالونيل وميثوكسيمالونيل- CoA [4] ، ومن المرجح أن يصبح التنبؤ بالخصائص الأقل شيوعًا أكثر دقة نظرًا لتوصيف نطاقات AT المتسلسلة بشكل وظيفي.

تم حل الهياكل البلورية للأشعة السينية لاثنين من مجالات AT المعيارية من DEBS (مدخلات بنك بيانات البروتين (PDB) 2QO3 و 2HG4) [51،52] ، بالإضافة إلى عبر- تمثيل مجال AT من سينسيز disorazole (إدخال PDB 3RGI) [53]. جنبًا إلى جنب مع نطاقات FabD AT متعددة الأغراض من الإشريكية القولونية (إدخال PBD 1MLA) [54] و S. coelicolor (إدخال PDB 1NM2) [55] ، سهلت هذه الهياكل البلورية تحديد البقايا التي قد تلعب دورًا في تحديد خصوصية الركيزة. ال بكتريا قولونية تمت بلورة بروتين FabD مع malonyl-CoA (إدخال PDB 2G2Z) ، مما يسمح بتحديد بقايا ثقب الأوكسانيون المحفوظة (ترقيم Gln11 ، Leu93 2G2Z) ، وبقايا أرجينين محفوظة (Arg117 2G2Z ترقيم) التي تتفاعل مع الكربوكسيل المرتبط بـ CoA وحدة موسع [56]. كانت الهياكل البلورية مفيدة أيضًا بالاقتران مع المحاذاة التسلسلية المتعددة لتحديد المخلفات في الموقع النشط وحوله والتي تُظهر ارتباطات قوية مع خصوصية الركيزة ، بما في ذلك أربعة بقايا تم تحديدها مرارًا وتكرارًا في سياقات مختلفة (Leu93 ، Ser197 ، Val198 ، Ser200 2G2Z ترقيم ) [48،57-60]. يسمح تحليل التسلسل المستند إلى الهيكل لخادم تركيب البوليكيتيد بالنمذجة ثلاثية الأبعاد لنطاقات AT التي لم يتم بلورتها ، كما يسمح بإجراء مقارنات قائمة على التسلسل والتنبؤ بجهات الاتصال بين الوحدات الفرعية [47]. بالإضافة إلى ذلك ، تمت بلورة مجال AT بخصوصية غير نمطية لركائز acyl-CoA طويلة السلسلة من المتفطرة PKS Pks13 (إدخال PDB 3TZX) مؤخرًا ، مما كشف عن قناة مخصصة للسلسلة الطويلة غير النمطية وتوفير مقارنة مثيرة للاهتمام لميثيل مالونيل المتبلور سابقًا. ومجالات malonyl-CoA AT [61]. إن التقدم الهيكلي الذي تم إحرازه في توضيح بنية مجال AT ، بالإضافة إلى التقدم في وصف التشكل ثلاثي الأبعاد لبقية وحدات PKS المعيارية [62] وضع مهندس البروتين لمتابعة العديد من الأساليب الهندسية المختلفة القائمة على الهيكل.

3. المحاولات السابقة لهندسة خصوصية ركيزة أسيلترانسفيراز

3.1. مقايضات مجال Acyltransferase

على الرغم من تحديد البقايا المحددة التي من المحتمل أن تلعب دورًا في تحديد خصوصية الركيزة ، فإن النهج الأكثر شيوعًا لتغيير النشاط التحفيزي AT حتى الآن هو مبادلة مجال AT بأكمله بمتماثل بخصوصية مختلفة. تم إنتاج العديد من نظائر ديسميثيل إريثروميسين أو ديسميثيل -6-ديوكسي إثرونوليد ب (ديسميثيل -6-ديسيبل) أو نظائر ديسميثيل ترايكيتيد لاكتون بنجاح عن طريق تبديل مجالات ميثيل مالونيل- CoA المحددة في DEBS لنطاقات AT الخاصة بالمالونيل- CoA من رابامايسين PKS [40،63 - 67]. تم إنتاج تناظرية 6-desmethyl-6-ethylerythromycin A عن طريق مبادلة AT4 من DEBS بنطاق AT خاص بإيثيل مالونيل- CoA من niddamycin PKS. عندما يتم التعبير عنها بتنسيق حمامية السكاروبوليسبورا، أنتج PKS الهجين الإريثروميسين أ فقط ما لم يتم استكمال وسط الاستزراع بسلائف لإيثيل مالونات. كان التناظرية 6-desmethyl-6-ethylerythromycin A هو الماكروليد الأساسي الذي تم إنتاجه عندما ccr الجين من Streptomyces collinus تم التعبير عنه أيضًا في هذه السلالة [68]. تم أيضًا دمج لبنة بناء methoxymalonate في سقالة 6-dEB لتشكيل 2-desmethyl-2-methoxy-6-dEB عن طريق تبديل AT6 من DEBS مع AT8 من FK520 PKS [69]. تم استبدال مجالات AT في geldanamycin PKS الخاصة بـ methylmalonyl- أو methoxymalonyl-CoA بنجاح بمجالات محددة malonyl-CoA من rapamycin PKS. أدت مقايضات المجال هذه إلى تحديد نظير الجلداناميسين مع تقارب أعلى بأربعة أضعاف تجاه Hsp90 ، وهو هدف دوائي بروتيني [70].تم تنفيذ مقايضات النطاقات بنجاح مع PKSs الأخرى أيضًا [59،64،71].

على الرغم من النجاح الواضح لمقايضات نطاقات AT في إنتاج منتجات جديدة من polyketide ، فإن هذه النجاحات غالبًا ما تأتي على حساب انخفاض عيار المنتج [72] ، ويبدو أن بعض نطاقات AT يصعب استبدالها بشكل خاص [58]. في حين أن أسباب هذه النواقص ليست مفهومة جيدًا ، فقد يكون السبب هو اضطراب تفاعلات البروتين والبروتين المناسبة أو عدم قدرة وحدات المصب على التعامل مع الركائز المتغيرة [73]. يتم تقليل العدادات بدرجات متفاوتة اعتمادًا على موقع المقايضة في خط تجميع PKS [40،64] ، مما يشير إلى التباين في قدرة وحدات المصب على معالجة ركائز غير أصلية. يمكن أيضًا أن تتعطل الواجهة البينية الواسعة المشتركة بين نطاقات AT مع جيرانها من KS [51،52] عن طريق تبادل المجال ، كما يمكن أن تتعطل تفاعلات ACP مع KS – AT المثير أثناء استطالة السلسلة [44،74].

3.2 توليد نطاقات أسيلترانسفيراز الهجينة

يتضمن النهج الأقل شيوعًا لتغيير النشاط الحفاز AT إنشاء مجالات AT هجينة ، حيث يتم استبدال مناطق تحديد الخصوصية المحتملة بأشرطة مماثلة من مجال AT بخصوصية α-carboxyacyl-CoA مختلفة. تم إنشاء مجالات AT الهجينة باستخدام مجالات محددة من methylmalonyl-CoA من DEBS ومجال AT الخاص بـ malonyl-CoA من الوحدة الثانية من rapamycin PKS اقترحت أن "منطقة متغيرة للغاية" قصيرة للطرف C كانت المحدد الأساسي لخصوصية AT [40]. إن أهمية هذه المنطقة في سياق مجالات AT الأخرى ليست واضحة ، ولكن من المهم أن نلاحظ في ضوء نجاح المجالات الهجينة في تغيير تفاعل نطاقات PKS المعيارية الأخرى [44 ، 74].

3.3 الطفرات الموجهة للموقع

كما ذكر أعلاه ، أدى فحص محاذاة التسلسل المتعددة والهياكل البلورية إلى تحديد العديد من البقايا في موقع AT النشط والمجاور له والتي تتباعد بناءً على خصوصية الركيزة α-carboxyacyl-CoA [48،57-60]. الطفرات الموجهة بالموقع للمخلفات الهامة لديها القدرة على الحد الأدنى من التدخل الجراحي ، مما يسمح لمجال AT بالبقاء في بيئته الأصلية والتسبب في الحد الأدنى من الاضطراب في تفاعلات البروتين والبروتين الهامة. عادة ما يتم استهداف عزر ما يقرب من 100 وحدة بقايا C- الطرفية من سيرين الموقع النشط لطفرة الطفرات من شكل YASH الخاص بالميثيل مالونيل CoA إلى نموذج HAFH الخاص بـ malonyl-CoA في AT1 [59] و AT4 [58] و AT6 [60] ] من DEBS أدى باستمرار إلى نطاقات AT مختلطة قادرة على دمج كل من وحدات الموسع. أدت الطفرات خارج هذا الشكل أيضًا إلى الاختلاط ، ولكنها سمحت بدمج وحدة الموسع غير الأصلية بدرجة أقل [58 ، 60]. سمحت محاكاة الديناميكيات الجزيئية (MD) متبوعة بتحسينات ميكانيكا الكم / الميكانيكا الجزيئية (QM / MM) على DEBS AT6 بتحديد البقايا في جيب الموقع النشط الذي يبدو أنه يقيد حجم السلسلة الجانبية لوحدة الموسع. سمح تحور هذه البقايا من الفالين إلى الألانين بدمج الركيزة غير الطبيعية 2-propargylmalonyl-SNAC ، على الرغم من الكميات المحدودة [60].

من المهم ملاحظة أن التغييرات في خصوصية الركيزة AT غالبًا ما يتم تحديدها كميًا في الجسم الحي، وبالتالي لا يمكن التحكم بسهولة في توافر ركائز α-carboxyacyl-CoA المختلفة. لا يمكن تحديد المعلمات الحركية النسبية التي تصف خصوصية مجال AT المتحول باستخدام في الجسم الحي وحتى وقت قريب لم تكن التأثيرات الحركية لمثل هذه الطفرات معروفة. في المختبر تحليل متحولة YASH إلى HAFH DEBS AT3 ، جنبًا إلى جنب مع متحولة نقطة أخرى تم فحصها مسبقًا في الجسم الحي [58،60] كشف أن نشاط هذه الطفرات ضعيف بشكل كبير ، مما يعني أن دمج وحدات البسط غير الطبيعية من المحتمل أن يحدث نتيجة لتقلص النشاط التحفيزي AT وليس بسبب زيادة الخصوصية تجاه الركيزة غير الأصلية [39] . وبالتالي ، فإن هندسة مجالات AT عن طريق الطفرات الموجهة بالموقع لديها مجال واسع للتحسين وستستفيد بشكل كبير من استخدام التقنيات المتقدمة القائمة على التسلسل والبنية.

3.4. عبر- مكمل ترانسفيراز

تم تحديد العديد من وحدات PKS المعيارية التي تفتقر إلى الكنسي رابطة الدول المستقلة-AT وبدلاً من ذلك استخدم المجالات القائمة بذاتها التي تعمل فيها عبر، على غرار مجالات تصنيع الأحماض الدهنية من النوع الثاني القائمة بذاتها من النوع AT [75]. هؤلاء عبر-AT PKSs تشمل تلك المسؤولة عن إنتاج disorazoles [76،77] ، kirromycin [78-80] والعديد من الآخرين [75،81،82]. تتضمن الإستراتيجية الهندسية المحتملة التعطيل الانتقائي لـ رابطة الدول المستقلة-AT والتكامل باستخدام أ عبر-AT مع اختلاف خصوصية [9]. هذا النهج لديه القدرة على فرض الحد الأدنى من الضغط التوافقي على synthase. الأغلبية عبريُعتقد أن مجالات -AT خاصة بـ malonyl-CoA ، ولكن تم اقتراح مجالات ذات خصوصيات مختلفة مؤخرًا [80]. الكيروميسين المحدد بإيثيل مالونيل- CoA عبرتم إثبات أن مجال -AT مختلط ، وقادر على تحفيز انتقال العديد من ركائز α-carboxyacyl-CoA غير الموجودة في مضيفه الأصلي [37]. علاوة على ذلك ، عدة عبرأظهرت نطاقات -AT اختلاطًا تجاه ركائز ACP الخاصة بها أيضًا ، مع أنشطة تجاه مجالات ACP غير المتجانسة التي تلبي أو تتجاوز أنشطة الأم. رابطة الدول المستقلة-AT [42،83]. توجد عدة أمثلة على عبر-AT تكملة في سياق وحدة AT-null PKS. إن malonyl-CoA: ACP transacylase من S. coelicolor تم استخدامه مع وحدة AT-null DEBS 6 في إنتاج 2-desmethyl-6-dEB [83] و عبراستكملت نطاقات -AT من bryostatin PKS أيضًا وحدة AT-null DEBS 6 [84].

في الهندسة رابطة الدول المستقلة- و عبرAT ، من المهم ملاحظة أن هذه المجالات تختلف في أصولها التطورية. في حين رابطة الدول المستقلة تم العثور على المجالات في الغالب في الفطريات الشعاعية والبكتيريا المخاطية والبكتيريا الزرقاء ، عبر المجالات تنبع إلى حد كبير من البكتيريا البروتينية ، والبكتيريا المخاطية والعصيات [75]. يبدو أن هذه المجالات قد تطورت بشكل مستقل جيكونيبدو أن مجالات -AT قد تطورت إلى حد كبير عن طريق الازدواج الجيني والتنويع ، بينما عبر تطورت المجالات بشكل كبير عن طريق نقل الجينات الأفقي [49،75،81،85]. عبرتُظهر -AT PKSs بنى معيارية متنوعة وتنحرف عن قواعد الخطية المشتركة العادية [81] ، وقد تم استخدام مجالات KS لهذه PKSs للتنبؤ بهيكل المنتج. يعتمد الفصل الوراثي لهذه المجالات إلى حد كبير على بنية الركيزة ، ويمكن استنتاج وظيفة وحدة PKS وهيكل المنتج العام من خصوصية الركيزة المتوقعة لكل مجال KS [75،86،87].

4. مستقبل هندسة مجال ترانسفيراز أسيل

أصبحت هندسة مجال AT من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات الحسابية والتجريبية ممكنة الآن نظرًا لتوافر تسلسل عالي الجودة والبيانات الهيكلية والتطورات في في المختبر تقنيات الفحص. على وجه التحديد ، يمكن اتباع النهج في كل من التطور الموجه والتصميم العقلاني - السمات المميزة لهندسة البروتين في العقود العديدة الماضية - نظرًا للتطورات في بنية مجال AT والوظيفة الموضحة أعلاه. ستتطلب الهندسة المستقبلية لخصوصية مجال AT النظر في تفاعلات البروتين والبروتين وتأثيرات التعديلات على كل خطوة من خطوات الآلية التحفيزية. نوضح أدناه العديد من التقنيات التي قد تكون ذات صلة بشكل خاص بهندسة خصوصية مجال AT.

4.1 التطور المشترك للأحماض الأمينية

بالنظر إلى بيانات التسلسل الشاملة المتاحة لنطاقات AT المعيارية ، فإن التقنيات التي تستخدم محاذاة تسلسل متعددة مفيدة بشكل خاص. اقتصر الاستخدام السابق لمحاذاة AT على تحديد المخلفات المحفوظة جزئيًا بناءً على خصوصية الركيزة [48،57-60]. تم تحديد هذه المخلفات باستخدام أشجار النشوء والتطور بالاشتراك مع محاذاة تسلسل متعددة من أجل تحديد أنماط فصل التسلسل. نظرًا للنجاح المحدود لمحاولات الطفرات المستهدفة بناءً على هذه التحليلات ، فمن الواضح أن القوة الدافعة الأساسية للخصوصية لا يتم التقاطها باستخدام الحفظ وحده. الخطوة الطبيعية التالية هي دمج معلومات التطور المشترك ، أو الطفرة المرتبطة بالبقايا استجابة لضغط تطوري. نتوقع أنه ، بخلاف العناصر المحفوظة للغاية التي تم تحديدها بالفعل في مجالات AT ، هناك بقايا أخرى تطورت بطريقة تعويضية. تم تطوير عدة طرق لتحليل التطور المشترك للأحماض الأمينية في تسلسل البروتين (انظر المراجعات [88-90]). نركز هنا على عدد قليل من التقنيات المختارة التي تم استخدامها بنجاح لتغيير أو استجواب خصوصية الركيزة لعائلات البروتين الأخرى.

غالبًا ما يُشار إلى المخلفات التي يتم حفظها بشكل تفاضلي بناءً على الفصيلة الفرعية ، مثل البقايا التي تختلف بناءً على خصوصية ميثيل مالونيل مقابل مالونيل كوا ، على أنها "مواقع تحديد الخصوصية". من المفترض أن هذه البقايا يجب أن تتطور معًا لأنها تظهر أنماط طفرة مرتبطة [88]. يمكن استخدام العديد من التقنيات الحسابية لتحديد مجموعات من المخلفات المشتركة في محاذاة متعددة التسلسلات الكبيرة [91-101]. تم تطوير حزمة برامج JD et مؤخرًا لتحديد ومعالجة المخلفات المشتركة من محاذاة الإدخال باستخدام عدة طرق مختلفة [102]. تستخدم إحدى الطرق ، المشار إليها باسم S3det ، تحليل المراسلات المتعددة ، والذي يسمح باستخراج مصادر التباين المستقلة في المحاذاة. يمكن ربط هذه الاختلافات بمجموعات البروتينات المقابلة من أجل تحديد الفصائل الفرعية. تم استخدام S3det للتعرف بنجاح على مواقع الارتباط بالروابط في العديد من عائلات البروتين من قاعدة بيانات Pfam [100]. كمثال آخر ، تم تصميم خصوصية الركيزة لنبات أسيل- ACP TE باستخدام مواضع محددة للخصوصية تم تحديدها عبر محدد موقع فرق الملكية المحفوظ ، والذي يفحص الحفظ التفاضلي بالإضافة إلى خصائص الإجماع مثل الحجم والكارهة للماء [96،103]. يمكن أن يؤدي استخدام التقنيات الحسابية لتحديد مواقع تحديد الخصوصية إلى تحسين هندسة مجال AT ، والتي ربما كانت محدودة في السابق بحجم عينة التسلسل وكثيراً ما اعتمدت على الفحص اليدوي أو فحص الهياكل البلورية لتحديد المخلفات المحددة للخصوصية.

تم استخدام تحليل الاقتران الإحصائي (SCA) في عدة مناسبات لتحديد مجموعات المخلفات التي نشأت معًا لتحديد خصوصية الركيزة. تتخطى SCA الطرق الموصوفة سابقًا من خلال المحاسبة الصريحة لتباين الأحماض الأمينية. ويستخدم "مصفوفة SCA" ، أو مصفوفة ارتباط الموضع المرجح بالحفظ التي تصف رياضيًا الحفظ في مواضع الأحماض الأمينية الفردية وتغايرها بين المخلفات [104،105]. تحدد التطبيقات الحديثة لـ SCA الارتباطات ذات الدلالة الإحصائية بين مجموعات المخلفات ، أو "القطاعات" ، عن طريق التحلل الطيفي لمصفوفة SCA متبوعًا بتحليل المكون الرئيسي. يسمح هذا النهج أيضًا بفحص العلاقات بين تباعد التسلسل وتغاير الأحماض الأمينية باستخدام مصفوفة ارتباط تسلسل مرجح بالحفظ [106،107]. نجح أحد تطبيقات SCA في تحديد المخلفات المهمة لخصوصية الركيزة لـ S1A سيرين بروتياز ، وتسبب طفرة مخلفات القطاع في اضطراب ثوابت الخصوصية النسبية (كقط/كم) لمختلف الركائز [105]. تم استخدام SCA أيضًا في تصميم مجالات WW غير الطبيعية ، والزخارف الصغيرة للتعرف على الببتيد المصنفة بناءً على طبيعة الشكل المستهدف المحتوي على البرولين [108،109]. تم اقتراح مجموعة من ثمانية وحدات بنائية أظهرت درجة عالية من التطور المشترك لتشفير خصوصية الربط لهذه المجالات. أظهرت هذه البقايا القطاعية الثمانية المتغيرة أنماطًا للحفظ ترتبط ارتباطًا وثيقًا بخصوصية النموذج [109]. يمكن أن تحدد SCA المخلفات غير الواضحة على الفور باستخدام فحص الحفظ أو الهيكل وحده ، وبالتالي لديها القدرة على التوسع والتحسين على مجموعة من المخلفات المحددة مسبقًا لـ AT.

تعتمد الأهمية الوظيفية للمخلفات التي تم تحديدها باستخدام تقنيات التطور المشترك على القيود التي تدفع تطور عائلة البروتين محل الاهتمام. يوفر الفصل الجيني الواضح لنطاقات AT إلى clades استنادًا إلى خصوصية الركيزة α-carboxyacyl-CoA دليلًا على احتمال وجود ضغط تطوري لهذه الوظيفة. وبالتالي ، من المحتمل أن تؤدي تحليلات التطور المشترك على مجالات AT المعيارية إلى تحديد المخلفات المراوغة سابقًا والتي ، عند تعديلها ، ستؤدي إلى تغييرات في الخصوصية. علاوة على ذلك ، تم استخدام تحليلات التطور المشترك لاكتشاف أسطح تفاعل البروتين (انظر المراجعات [88-90]) ، وبالتالي قد تكون مفيدة في تحديد البقايا اللازمة لتفاعلات البروتين والبروتين التي تسمح بالتشغيل السليم لخط التجميع. يمكن أن تتيح معرفة أسطح التفاعل بين مجالات AT والبروتينات الأخرى في synthase هندسة الخصوصية التي تحافظ بشكل صحيح على هذه التفاعلات ، ويمكن أن تلقي الضوء أيضًا على الوصلات المناسبة للهندسة القائمة على استبدال مجال AT.

4.2 التقنيات القائمة على الهيكل

يوفر توافر العديد من الهياكل البلورية للأشعة السينية لمجالات AT الفرصة لاستخدام الهندسة القائمة على الهيكل. قدمت هذه الهياكل البلورية إرشادات في محاولات هندسة AT السابقة [48،57-60] ، ولكن تم استخدامها في الغالب لتحديد المخلفات التي قد تتلامس مع الركيزة. المزيد من الأساليب العالمية يمكن أن تسمح بهندسة أكثر نجاحًا لخصوصية التكنولوجيا المُعينة.

سيتم تعزيز فهم الأساس الجزيئي لخصوصية الركيزة AT من خلال محاكاة MD ، والتي كانت مفقودة إلى حد كبير من دراسات PKS المعيارية حتى وقت قريب [60،62،110،111]. تعتمد محاكاة MD على الفيزياء النيوتونية لتقريب التفاعل الجزيئي وطاقة التشكل ونمذجة الحركة الذرية [112-114]. نموذج هيكلي لـ DEBS AT6 مع (2S) - تم فحص ميثيل مالونيل- CoA الذي تم إرساؤه في الموقع النشط باستخدام محاكاة 30 نانوثانية MD متبوعة بتحسين QM / MM. أكدت هذه المحاكاة دور بقايا الموقع النشط المقترحة والمخلفات المحددة بدقة في الحفاظ على البيئة الكيميائية المناسبة للمناطق القطبية وغير القطبية من الركيزة. ساعدت عمليات محاكاة MD على الأنظمة المحورة باستخدام methylmalonyl-CoA الأصلي و malonyl-CoA غير الأصلي في توفير الأساس المنطقي لما تمت ملاحظته في الجسم الحي خصوصية الركيزة لمجالات AT6 الطافرة هذه. علاوة على ذلك ، ساعدت عمليات محاكاة MD في تحديد بقايا بدا أنها تمنع دمج ركائز مع بدائل ألفا أكبر. سمح تحور هذه البقايا بالاستخدام القابل للاكتشاف لبنة بناء 2-propargylmalonyl-SNAC [60]. توفر فائدة محاكاة MD الأولية هذه على مجال AT المعياري الدافع للتنفيذ المستقبلي لهذه التقنية. إن السماح لمحاكاة MD بلعب دور أكثر نشاطًا في تصميم التجارب ، بدلاً من استخدامها في المقام الأول لشرح الظواهر المرصودة ، من المرجح أن يساعد في تحديد المخلفات خارج الموقع النشط التي تؤثر بشكل غير مباشر على بنية الموقع النشط. سيكون فحص الديناميكيات طويلة الأمد في وجود ركائز أصلية وغير محلية استراتيجية محتملة في السعي لتحقيق هذا الهدف.

كما تم استخدام تقنيات أخرى قائمة على QM لفحص خصوصية الركيزة الأنزيمية. تم تصميم مجالات Adenylation من تركيبات الببتيد غير الريبوزومية ، والتي تشبه نطاقات AT في PKSs ، لتتناول ركائز مختلفة من الأحماض الأمينية باستخدام خوارزمية قائمة على البنية تُعرف باسم K *. K * عبارة عن خوارزمية حسابية تعتمد على المجموعة وتقوم بنمذجة ارتباط البروتين - الترابط باستخدام وظائف التقسيم التقريبية وتقليل الطاقة [115]. تمت هندسة مجال الأدينيل الخاص بالفينيل ألانين من سينثيز الجراميسيدين لأول مرة لتحسين النوعية تجاه بقايا الليوسين [116] ، وبعد عدة تحسينات على خوارزمية K * [117-119] ، تمت هندسته لمبادلة خصوصية كاملة لليوسين وتحسين الخصوصية نحو العديد من الأحماض الأمينية الأخرى [120].

أخيرًا ، سيتم تحسين هندسة مجالات AT باستخدام التقنيات الهيكلية من خلال التوضيح الهيكلي لمجالات AT مع خصوصية α-carboxyacyl-CoA الأخرى. باستثناء مجال AT من المتفطرة Pks13 [61] ، فإن جميع نطاقات AT المعيارية التي تبلورت حتى الآن خاصة بميثيل مالونيل أو مالونيل كوا [51-55]. يمكن لفحص بنية الموقع النشط والخصائص الهيكلية العالمية للمجالات ذات الخصائص الفريدة أكثر ، جنبًا إلى جنب مع المحاذاة الهيكلية البسيطة مع الهياكل الموضحة حاليًا ، إلقاء الضوء على المحددات الهيكلية لخصوصية كتلة البناء. علاوة على ذلك ، يمكن توضيح خصوصية ACP لمجالات AT والدور الذي تلعبه هذه الخصوصية في السماح بالانتقال المنتج من خلال تبلور مجمع AT-ACP. ثبت أن التوصيف الهيكلي لهذه المجمعات أمر صعب ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الطبيعة الديناميكية الطبيعية لمجال ACP. توجد عدة طرق للربط المتبادل لمجالات ACP و KS بناءً على تعديل مجموعة فسفوبانثيثين الاصطناعية على ACP [121،122] ، ولكن لا توجد مثل هذه الطرق للربط المتبادل AT-ACP. تم ابتكار طريقة للربط المتبادل والتنقية اللاحقة لـ عبر-AT من disorazole PKS مع ACP المتشابه من الوحدة 1 بهدف استخدام هذا التقريب كأداة لعلم البلورات. استخدمت هذه الطريقة سيرين الموقع النشط إلى متحولة السيستين AT ، والتي تم ربطها بذراع الفوسفوبانتيثين في ACP باستخدام ديبروموبروبانون. تم تنقية المركب من بروتينات AT و ACP المجانية باستخدام إجراء كروماتوغرافيا تقارب من خطوتين [53]. إن تبلور هذا المركب وما شابه سيكون مفيدًا في فهم تفاعلات البروتين والبروتين بشكل كامل بين مجالات AT و ACP ، مما يسمح بالحفاظ على تفاعلات المجال هذه في الأنظمة الهندسية.

4.3 التطور الموجه

التطورات في التقنيات التحليلية القادرة على التحليل السريع لتحفيز AT [39] تجعل التطور الموجه لمجال AT احتمالًا تجريبيًا ، على الرغم من أن اختبار عدد كبير جدًا من المتغيرات لا يزال غير ممكن تقنيًا. تعتمد تقنيات التطور الموجه (للمراجعات ، انظر [123-125]) على إنشاء مكتبة متحولة بطرق مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ (PCR) أو خلط الحمض النووي أو طفرات التشبع. يتم بعد ذلك فحص هذه المكتبة من أجل تحسين الوظيفة ، وتخضع المسوخات المحددة لجولة أخرى من الطفرات والاختيار في عملية تحاكي التطور الطبيعي. عادة ما تتكرر هذه العملية عدة مرات حتى يتم تحقيق الوظيفة المطلوبة. إن فحص جميع المسوخات المحتملة غير ممكن أو مرغوب فيه ، والعديد منها في السيليكو تم تطوير تقنيات للمساعدة في تصميم أفضل مكتبة متحولة [126].في حين أنه ليس ضروريًا ، يكون التحسين الحسابي مفيدًا في حالة عدم وجود اختبار عالي الإنتاجية للغاية.

تم تصميم خصوصية الركيزة الخاصة بإنزيم الخياطة المتورط في تحويل حمض الموناكولين J (MJA) إلى عقار لوفاستاتين الخافض للكوليسترول باستخدام تقنيات التطور الموجهة. LovD ، AT الذي ينقل α- بشكل طبيعيس-تم تصميم methylbutyrate إلى MJA لتحسين النشاط تجاه α-dimethylbutyrate ، وهي ركيزة عند إضافتها إلى MJA تخلق عقار سيمفاستاتين الذي يخفض الكوليسترول. تم إنشاء مكتبات متحولة إما عن طريق PCR المعرض للخطأ أو طفرات التشبع وتم فحصها باستخدام مقايسة تثبيط نمو الخلية الكاملة. أنتجت سبع جولات من الطفرات والفحص متغيرًا به طفرات ست نقاط أظهرت نشاطًا للخلايا الكاملة أعلى بمقدار 11 ضعفًا نحو تخليق سيمفاستاتين وزيادة الاستقرار الحراري. أظهر التبلور أن البقايا الطافرة كانت مبعثرة على البنية الثلاثية ، بعيدة عن الموقع النشط وفي كل من المناطق المعرضة للمذيبات والمدفونة. هذه البقايا ، مثل معظم المخلفات التي تم تحديدها باستخدام التطور الموجه ، كان من الصعب تحديدها باستخدام التركيب البلوري وحده [127].

5. الاستنتاجات والنظرة المستقبلية

إن إمكانات هندسة PKSs لإنتاج جزيئات نشطة بيولوجيًا جديدة لا حدود لها أساسًا. تتناسب خطوط التجميع الجزيئي هذه بشكل جيد مع الهندسة ، حيث أن الخطية المشتركة للجينات ومنتجات الجينات جنبًا إلى جنب مع إمكانية التنبؤ بالبوليكيتيد المقابل تسمح بالتلاعب العقلاني مع وضع المنتج المقصود في الاعتبار. تعمل نطاقات AT كحراس بوابات لدمج وحدة موسع polyketide وبالتالي تتحكم في مصدر كبير للتنوع الهيكلي لهذه المنتجات الطبيعية. هذا المجال مجهز بشكل أفضل من أي وقت مضى لهندسة مجال AT ، مع المعرفة الآلية والتسلسل والهيكلية في هذا المجال التي تنمو بوتيرة سريعة في السنوات الأخيرة. العديد من التقنيات الهندسية مفتوحة الآن لمهندس مجال AT. من المحتمل ألا تكون أي طريقة واحدة فعالة تمامًا في تغيير خصوصية نطاقات AT ، وسيأتي النجاح مع مجموعات من هذه التقنيات. تجسير في المختبر من النتائج إلى في الجسم الحي ستكون بيئات الإنتاج مهمة للإنتاج الناجح للعلاجات الجديدة. سيستمر التوصيف الوظيفي والهيكلي الإضافي لنطاقات AT المتسلسلة ، جنبًا إلى جنب مع أدوات أفضل لمعالجة كل من المجالات الفردية والتعبير عنها وتحليلها ، و PKS العام في المساعدة في جعل إنتاج polyketides الجديد حقيقة واقعة. تتطلب هندسة تحفيز مجال AT معرفة متعمقة لكيفية تأثير هذه التعديلات على دورة التخليق الحيوي للبوليكيتيد بأكملها. وبالتالي ، فإن فهم الآليات التحفيزية الأساسية وتفاعلات البروتين والبروتين الضرورية للتخليق الحيوي للبوليكيتيد ضرورية لنجاح هندسة خصوصية مجال AT. هذه المعرفة ، إلى جانب التطورات الموضحة في هذه المراجعة ، تضع مهندس مجال AT في اتخاذ خطوات كبيرة في تنويع البوليكيتيد في المستقبل القريب جدًا.


شاهد الفيديو: تحليل فني ل سهم الكهرباء و كيان العالميه و انابيب السعوديه والحكير (شهر نوفمبر 2022).