معلومة

منتج غير مرغوب فيه E. coli في منتج البلازميد

منتج غير مرغوب فيه E. coli في منتج البلازميد


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

باستخدام مجموعة TOPO XL Cloning ، أخذ مختبرنا بعض الحمض النووي البشري المكبر ، وأدخله في المتجه ، وحاول استنساخه في بكتريا قولونية. ومع ذلك ، عند تسلسل منتج البلازميد المنقى ، كان التسلسل الذي حصلنا عليه بكتريا قولونية بل هو الإنسان الذي قمنا بتضخيمه. جلس التمهيدي في البلازميد على النحو المنشود ، ويبدو أن التسلسل بين البادئات فقط من بكتريا قولونية (كما يوحي ذلك عن طريق تفجيرها ضد الإنسان ، وعدم الحصول على نتائج ، ثم تفجيرها ضدها بكتريا قولونية والحصول على ضربة).


تبين أن السبب الجذري هو مواصفات كاذبة. باستخدام نموذج مختلف ، تم الكشف عن عدم وجود قالب DNA تقريبًا في التضخيم الأولي. لا حمض نووي ولا بلازميدات جيدة.


التطور غير المرغوب فيه لتسلسل الحمض النووي المصمم يحد من جهود هندسة الأيض والجينوم. يتم تعطيل الوظائف المهندسة التي تشكل عبئًا على الخلايا المضيفة وتبطئ من تكاثرها بسرعة بسبب الطفرات ، وغالبًا ما تتراكم الطفرات غير المخطط لها ذات التأثيرات غير المتوقعة جنبًا إلى جنب مع التغييرات المصممة في مشاريع تحرير الجينوم واسعة النطاق. لقد طورنا إستراتيجية تطور موجهة ، اختيار P eriodic Res لـ E volutionically R eliable V ariants (PResERV) ، لاكتشاف الطفرات التي تطيل وظيفة تسلسل الحمض النووي المرهق في كائن حي مُعدَّل هندسيًا. هنا ، استخدمنا PResERV للعزل الإشريكية القولونية الخلايا التي تنسخ البلازميدات من نوع ColE1 بدقة أعلى. وجدنا طفرات في DNA polymerase I و RNase E تقلل معدلات طفرة البلازميد بمقدار 6 إلى 30 ضعفًا. تختار طريقة PResERV ضمنيًا الحفاظ على معدل نمو الخلايا المضيفة ، ويتم الحفاظ على أعداد نسخ البلازميد العالية ومستويات التعبير الجيني في بعض الخلايا المتطورة بكتريا قولونية سلالات ، مما يشير إلى أنه من الممكن تحسين الاستقرار الجيني للهيكل الخلوي دون مواجهة مقايضات في خصائص الأداء المرغوبة الأخرى. الاستفادة من هذه المضادات الجديدة بكتريا قولونية وتطبيق PResERV على كائنات أخرى في المستقبل يعد بمنع الفشل التطوري وعدم القدرة على التنبؤ لتوفير أساس جيني أكثر استقرارًا للبيولوجيا التركيبية.

تواجه مجموعات الخلايا المصممة هندسيًا لتعمل كمصانع أو أجهزة استشعار حيوية حالة فشل خاصة بالنظم الحية: فهي تتطور. التطور غير المرغوب فيه هو مشكلة أساسية للهندسة الحيوية التي تحد من كفاءة جهود هندسة الأيض وهندسة الجينوم والتنبؤ بها (1 & # x020135). غالبًا ما تعمل الوظيفة المهندسة على تحويل الموارد الحرجة من التكرار الخلوي أو تتداخل مع النمو أو التوازن (6،7). في هذه الحالات ، يمكن للخلايا & # x02018 المكسورة & # x02019 ذات الطفرات التي تعطل الوظيفة المهندسة أن تتفوق بسرعة على التصميم الأصلي (8 & # x0201310). يمكن تلخيص المعدل الذي تتحلل به الوظيفة المهندسة داخل مجتمع الخلية بهذه الطريقة على أنه عمر تطوري أو نصف عمر (8) أو تحديده من حيث المشهد التطوري من خلال المعدلات التي تحدث فيها أنماط الفشل الطفري المختلفة وكل منها فوائد اللياقة البدنية (9،10).

من الممكن أحيانًا تعديل الجينوم لإزالة أو تقليل المعدل الذي تحدث به أنواع معينة من الطفرات (11 & # x0201316) أو ابتكار طريقة لتقليل عبء الوظيفة الهندسية (2،17). ومع ذلك ، نظرًا لتعقيد عمليات تكرار وإصلاح الحمض النووي والطرق المتنوعة التي يمكن أن تؤديها وظيفة هندسية إلى تحميل خلية مضيفة ، يتم الوصول إلى نقطة يصعب فيها تحسين موثوقية الخلية. التطور الموجه هو استراتيجية فعالة لتحسين أداء الأنظمة المعقدة مع العديد من المكونات المتفاعلة ، حتى عندما تتضمن عوامل غير معروفة. على سبيل المثال ، تم استخدامه لهندسة إنزيمات جديدة تتفوق في الأداء على نظيراتها الطبيعية (18) ولضبط دوائر الجينات الاصطناعية لأداء العمليات المنطقية بفعالية (19).

نظرًا للقيود المعقدة المماثلة الكامنة وراء الطفرات الخلوية وأعباء اللياقة للوظائف الهندسية المتنوعة ، فقد فكرنا في أن إجراء التطور الموجه ، اختيار P eriodic Res لـ E volutionically R eliable V arriants (PResERV) (الشكل & # x200B (الشكل 1) ، 1) ، يمكن أن تكون استراتيجية فعالة لتحسين الموثوقية التطورية للخلية المهندسة. في PResERV ، يختار المرء بشكل مصطنع الخلايا الطافرة التي تظهر صيانة محسّنة لوظيفة هندسية مرهقة عبر عشرات إلى مئات الانقسامات الخلوية. لقد توقعنا أن PResERV قد تعزل الخلايا ذات الطفرات التي إما أن تقلل من معدل حدوث طفرات الفشل أو عبء اللياقة للوظيفة المهندسة ، أو كليهما ، ربما بطرق من شأنها أن تعمم على تثبيت الوظائف الهندسية الأخرى في الخلايا المتطورة. هنا ، نصف الإشريكية القولونية سلالات تم تطويرها بواسطة PResERV والتي تظهر معدلات طفرة أقل من الطبيعي للجينات المشفرة على البلازميدات عالية النسخ ، وبالتالي تثبيتها ضد التطور غير المرغوب فيه.

إعادة الاختيار الدورية للمتغيرات الموثوقة تطوريًا (PResERV) وطريقة # x000a0. يبدأ PResERV بمجموعة من الخلايا تعبر عن GFP إلى مستوى عالٍ بحيث يفرض عبئًا كبيرًا على اللياقة البدنية. بعد الطفرات ، تتم تربية السكان من خلال مضاعفات كافية للخلايا بحيث تظهر طفرات ذات تعبير منخفض من GFP وتتفوق على الخلايا الأخرى. مع معدلات طفرة منخفضة أو تكلفة لياقة أقل لتعبير GFP. بمجرد زيادة الاستقرار التطوري لتعبير GFP ، يتم عزل الخلايا الفلورية ويتم ترتيب تسلسل الجينوم الخاص بها لتحديد وتوصيف التغييرات الجينية التي تساهم في هذا التحسين. إن إعادة نمو الخلايا أثناء PResERV يختار ضمنيًا فقط تلك الطفرات التي تحقق استقرارًا وراثيًا محسنًا دون تقديم أي مقايضات تقلل بشكل كبير معدلات النمو الخلوي.


خلفية

في عام 2009 ، تم إنتاج ما يقرب من ثلث (45 من 151) بروتينات المؤتلف الصيدلانية الحيوية التجارية المرخصة من قبل إدارة الغذاء والدواء وأوروبا والشرق الأوسط وأفريقيا عن طريق زراعة الإشريكية القولونية[1]. هذا يعني أن ما يقرب من 30 ٪ من البروتينات المؤتلفة عالية القيمة تم إنتاجها عن طريق نظام التعبير القائم على البلازميد. تم الحصول أيضًا على العديد من البروتينات المؤتلفة التجارية الأخرى (مثل الإنزيمات) أو المنتجات غير البروتينية (مثل الأحماض الأمينية) بسلالات من بكتريا قولونية إيواء البلازميدات. البحث في قاعدة بيانات فهرس الاقتباسات العلمية عن "القولونية البروتين المؤتلف "يؤدي إلى أكثر من 26000 نتيجة. هذه الحقائق تظهر الأهمية العالية لـ بكتريا قولونية كنظام تعبير للاستخدام التجاري والعلمي.

تعتمد أنظمة التعبير على بكتريا قولونية يعتمد في جميع الحالات تقريبًا على وجود بلازميد واحد على الأقل ، والذي يجب فصله إلى خلايا مقسمة أثناء النمو. عدم كفاية استقرار البلازميد الفصل العنصري من شأنه أن يجعل أنظمة التعبير القائمة على البلازميد عديمة الفائدة. لذلك ، تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق من أجل تحقيق استقرار البلازميد [2]. تتمثل الطريقة الشائعة الاستخدام في إضافة المضادات الحيوية إلى وسط الزراعة ووضع جينات مقاومة المضادات الحيوية على البلازميد الذي يحمل الجين المستهدف. تُستخدم هذه الاستراتيجية على نطاق واسع في البحث ، حيث يجب في أغلب الأحيان تطبيق أحجام العمل المنخفضة فقط. في التكنولوجيا الحيوية الصناعية ، يمكن استبعاد إضافة المضادات الحيوية بشكل عام - ليس فقط لأسباب اقتصادية. قد يكون التخلص من المضادات الحيوية من الوسائط وتيارات النفايات مطلوبًا أثناء المعالجة النهائية. لذلك ، هناك طلب كبير على طرق أخرى لتثبيت البلازميد.

تتمثل إحدى الإستراتيجيات البسيطة في محاولة الحفاظ على استقرار بلازميد عالٍ دون إضافة مضادات حيوية في استخدام بلازميدات ذات عدد نسخ مرتفع وتوقع أن التوزيع الإحصائي للبلازميدات أثناء انقسام الخلية قد ينتج دائمًا خلايا تحتوي على بعض البلازميدات على الأقل. يعمل هذا بشكل جيد طالما أن متوسط ​​عدد نسخة البلازميد متجانس [3]. بمجرد أن تظهر الخلايا ذات أرقام نسخ البلازميد المنخفضة جدًا بشكل تفضيلي أثناء معدلات النمو المرتفعة ، فقد لا يكون لدى الخلايا وقت كافٍ لتركيب البلازميدات بأعداد نسخ عالية. بسبب العبء الأيضي الإضافي ، قد تفقد البلازميدات تمامًا ، لأن الخلايا الخالية من البلازميد ستكتسب ميزة نمو مقارنة بالخلايا الحاملة للبلازميد. سيكون لهذا تأثير كبير خاصة على عمليات الزراعة المتدفقة والدُفعة المستمرة.

يتطلب العبء الأيضي المرتفع ومستويات النسخ القاعدية والتأثيرات السامة المحتملة للبروتينات المؤتلفة طرقًا أخرى لتثبيت البلازميدات. في بعض الحالات ، قد تؤدي التغييرات في استراتيجيات الزراعة ، بشكل رئيسي عن طريق خفض معدل النمو المحدد ، إلى استقرار البلازميد الكافي. يمكن تحقيق ذلك عن طريق تقليل درجة حرارة الزراعة أو تغيير مصدر الكربون في الوسط. ومع ذلك ، تعتمد معظم الطرق على إضافة بعض عناصر التثبيت عن طريق الهندسة الوراثية.

يمكن تعلم بعض الدروس من استراتيجيات الطبيعة لضمان الفصل البلازميدي. وبالتالي ، غالبًا ما تُظهر البلازميدات ذات النسخة المفردة آليات استقرار متطورة مثل تلك القائمة على على قدم المساواة- النظام الذي يؤدي إلى توزيع متحكم فيه للبلازميدات ، مشابه لتوزيع الكروموسوم عالي التنظيم والتحكم في الكائنات الحية الأعلى. ال على قدم المساواة- يتكون النظام من اثنين على الأقل من الجينات المشفرة للبروتين وموقع خاص واحد على البلازميد للتوزيع المتحكم فيه في الخلية المنقسمة [4].

تؤدي الأنظمة الأخرى إلى قتل الخلايا الخالية من البلازميد بعد الفصل العنصري وتحتاج إلى المعلومات الجينية للسم والترياق المقابل له ، مع الترياق على البلازميد المستهدف [5]. تم تطبيق هذا المزيج مؤخرًا لتطوير a ستربتوميسيس نظام التعبير البروتيني [6].

في جميع هذه الحالات ، قد تصبح البلازميدات كبيرة جدًا ، مما يؤدي إلى زيادة العبء الأيضي. قد يؤدي الحجم الأكبر أيضًا إلى مشكلة أخرى - انخفاض الاستقرار الهيكلي للبلازميد بسبب الطفرات العشوائية ، مما قد يؤدي إلى انخفاض في الإنتاجية أيضًا. في هذا الصدد ، فإن ccdB/ccdA يوفر نظام الترياق السام ، المعدل كنظام تثبيت مكون منفصل ، بديلاً باستخدام تركيبات وراثية صغيرة جدًا لتوفير صيانة فعالة خالية من المضادات الحيوية للبلازميد في بكتريا قولونية[7].

اهتمت العديد من الدراسات حول إنتاج لقاح الدنا بشكل خاص بآليات اختيار البلازميد البديلة ، نظرًا للحاجة إلى تجنب جميع أنواع الجينات المقاومة أو البروتينات في الحمض النووي العلاجي وفقًا لمعايير السلامة. طريقة تعتمد على الحمض النووي الريبي ، باستخدام التعبير التأسيسي لـ سايب كواسم قابل للاختيار المضاد أثناء النمو على السكروز تم الإبلاغ عن أنه قادر على تحقيق الانتقاء الخالي من المضادات الحيوية والتخمير عالي الإنتاجية بينما لا يقتصر على نواقل ColE1 [8].

ربما تكون هناك طريقة أخرى أكثر أناقة لتحقيق الاستقرار في انتشار البلازميدات ، وهي تدمير وظيفة الجين الأساسي على الكروموسوم ووضع هذا الجين على البلازميد الذي يحمل الجينات المستهدفة. يتطلب هذا النهج استراتيجية لتوليد خلايا مختصة من السلالة المساعدة الآن. كانت إحدى الطرق الأولى للاستخدام التجاري هي فالس-نظام [9]. الجين من النوع البري لـ valyl-tRNA synthetase (فالس) للمضيف يحمل طفرة حساسة لدرجة الحرارة ، في حين أن الجين بدون طفرة يوضع على البلازميد. للتحول ينمو المضيف عند 30 درجة مئوية. أثناء الزراعة عند 37 درجة مئوية ، يفقد المركب المتحور الموجود على الكروموسوم وظيفته ولا يحمل سوى الخلايا التي تحمل المادة فالس- يمكن للبلازميد المأوى أن يعيش وينمو. ومع ذلك ، فإن فالس الجين لا يزال موجودًا على الكروموسوم وضغط الاختيار يفضل إعادة تركيب الجين المتحور فالس على الكروموسوم والنوع البري فالس على البلازميد. ينتج عن إعادة التركيب هذه عتادات بدون ضغط اختيار بواسطة فالس ويؤدي إلى عدم استقرار البلازميد. إحدى الطرق لتقليل احتمالية إعادة التركيب هي الضربة القاضية الكاملة لجين الكروموسومات. في حالة فالس هذا لن يسمح بالحصول على خلايا قابلة للحياة للتحول ، وبالتالي ، لن يكون عمليًا.

تعتمد إستراتيجية المشغل - المكبّر - المعايرة (ORT) على التنظيم السلبي لجين كروموسومي أساسي من خلال تسلسل عامل يسمح بربط بروتين مثبط معبر عنه بشكل أساسي. من أجل السماح بالتعبير عن الجين الأساسي والبقاء على قيد الحياة ، يتعين على الخلية معايرة جزيئات المثبط مقابل تسلسل عامل مماثل قد يكون موجودًا في نسخ متعددة على البلازميد المستهدف ليتم الحفاظ عليه [10]. يمكن أن تكون استراتيجية تكميل الوظيفة الأساسية فعالة أيضًا على مستوى RNA. في الآونة الأخيرة ، تم إدخال طفرة كهرمانية هراء في الأساسي ثا تم التغلب على الجين في الكروموسوم المسبب لضمور الثيميدين بواسطة البلازميدات المؤتلفة التي تحمل الحمض الريبي النووي النقال الكابح ، والذي سمح بانتقاء البلازميد الخالي من المضادات الحيوية وأيضًا التعبير عن مراسل لوسيفيراز المؤتلف في الأنسجة حقيقية النواة وفي الخلايا السرطانية [11]. كان نظام fabI - triclosan ، وهو مزيج أساسي من مثبطات الجينات الجينية ، مفهومًا مختلفًا تمامًا لاختيار البلازميد. ومع ذلك ، لوحظت أيضًا المخاطر المرتبطة بمبيد التريكلوسان الحيوي ، ومتطلبات عامل الاختيار بسبب تأثير الإدمان ، والحاجة إلى الحث على علامة الجين الأساسية والتعبير عنها بشكل مفرط وعدم استقرار البلازميد في غياب الاختيار [12]. مثال آخر على اختيار البلازميد الخالي من المضادات الحيوية هو الاستراتيجية التي تتضمن الأساسيات infA الترميز الجيني لعامل بدء الترجمة [13].

إذا كان من الممكن التغلب على الضمور المساعد عن طريق المكملات في الوسط ، فيمكن تحضير الخلايا المختصة وتحويلها باستخدام مثل هذه الوسيلة التكميلية. يمكن تحقيق ذلك بالضربة القاضية لجين أساسي على سبيل المثال تخليق حمض أميني مثل الجلايسين [14]. في هذه الحالة ، فإن glya تم ضرب الجين فيها بكتريا قولونية M15 يؤدي إلى سلالة مساعدة والتي يمكن زراعتها على وسائط تحتوي على الجليكاين. ال glya يتم استنساخ الجين على ناقل تعبير تحت سيطرة محفز ضعيف التأسيس. هذا النظام له عيب واحد في أن الوسائط المحتوية على الجليسين قد تؤدي إلى خلايا خالية من البلازميد ، والعديد من الوسائط الصناعية المعقدة تحتوي على الجلايسين.

يتمثل أحد حلول هذه المشكلة في بناء سلالة خروج المغلوب ، والتي لا يزال خروجها من الكروموسومات يسمح ببعض النمو على الأقل على الوسائط المعقدة. يمكن أن يولد معدل النمو المحدد لسلالة تؤوي البلازميد الذي يحتوي على جين الضربة القاضية ميزة اختيار عالية بما يكفي للحفاظ على البلازميد في مجتمع الخلايا.

أثناء البحث عن الجين الذي سيكون مناسبًا لتطبيق الإستراتيجية القائمة على التغذية المساعدة لتثبيت البلازميد ، ركزنا على tpi، جين ثلاثي فوسفات أيزوميراز ، وهو إنزيم مركزي في مسار تحلل السكر. أحد الإنجازات العلمية العظيمة الحديثة في بكتريا قولونية كان البحث هو إنشاء ما يسمى مجموعة Keio من سلالات الضربة القاضية [15]. باستخدام Keio tpi سلالة بالضربة القاضية نقدم لكم بناء tpi- إيواء البلازميدات المؤدية إلى بكتريا قولونية سلالات تحمل بلازميدات عالية الاستقرار الفصل العنصري.


نواقل الإشريكية القولونية البلازميدية

تشكل معالجة الحمض النووي المؤتلف ، والتي يتم إجراؤها بشكل حصري تقريبًا باستخدام المضيف E. coli ، إحدى المنهجيات الأساسية للتكنولوجيا الحيوية الجزيئية. في نواقل الإشريكية القولونية البلازميدية ، يصف باحثو مقاعد البدلاء ذوي الخبرة تقنياتهم المؤكدة لمعالجة البلازميدات المؤتلفة باستخدام هذا المضيف البكتيري الشهير. يصف المؤلفون طرقًا قابلة للتكاثر بسهولة لاستنساخ الحمض النووي إلى نواقل بلازميد ، وتحويل البلازميدات إلى الإشريكية القولونية ، وتحليل الحيوانات المستنسخة المؤتلفة. وهي تشمل أيضًا بروتوكولات لبناء وفحص المكتبات ، فضلاً عن تقنيات محددة لمركبات الاستنساخ المتخصصة ، مثل الكوسميدات ، والكروموسومات الاصطناعية البكتيرية ، والناقلات ، والفاجميدات. كما تم تقديم طرق للتطبيقات النهائية الشائعة ، مثل الطفرات ، والتعبير عن البروتينات المؤتلفة ونصوص الحمض النووي الريبي ، واستخدامات جينات المراسل. يتم وصف كل بروتوكول تم اختباره بالكامل بالتفصيل خطوة بخطوة من قبل خبير متمرس في هذا المجال ويتضمن مقدمة توضح المبادئ الكامنة وراء التقنية ، وقوائم بالمعدات والكواشف الضرورية ، ونصائح حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتجنب المزالق المعروفة ، وعند الحاجة ، مناقشة تفسير واستخدام النتائج.
تقدم متجهات الإشريكية القولونية البلازميدية الشاملة والعملية للغاية لأولئك الجدد في هذا المجال دليلاً أساسيًا لاستخدام نواقل البلازميد في مضيف الاستنساخ الإشريكية القولونية ، والباحثين الأكثر خبرة مجموعة واسعة النطاق ومثبتة من التقنيات الناجحة.

. مراجعة علمية و "كتاب طبخ" منهجي عالي الجودة. إنه حقًا كتيب عملي للغاية ومفيد لجميع العلماء الذين يعملون في مجال استنساخ الجينات والتلاعب بها. "- Folia Microbiologica

". إضافة مفيدة للغاية للمختبرات التي تبحث عن البلازميدات في حد ذاتها ، ولمن يستخدمون البلازميدات كناقلات لاستنساخ الجينات." - علم الأحياء الدقيقة اليوم


التحول - إدخال المتجه المعدل إلى مضيف

التحول هو الخطوة الثالثة لتقنية الحمض النووي المؤتلف ويتضمن إدخال الحمض النووي المؤتلف (البلازميد المعدل) في الخلية المضيفة (مثل البكتيريا). الهدف الأساسي من هذه الخطوة هو استعادة كميات كبيرة من جزيء الحمض النووي.

تعد بكتيريا E. coli واحدة من أكثر العوائل استخدامًا. هذا لأنها غير مكلفة للاستخدام ولديها نمو سريع جدًا (مضاعفة الوقت حوالي 20 دقيقة). لذلك ، يمكن الوصول إلى المرحلة الثابتة في غضون فترة زمنية قصيرة جدًا.

على الرغم من سهولة استخدام الخلايا البكتيرية مثل الإشريكية القولونية ، إلا أنه من الجدير بالذكر أنها لا تقبل بسهولة المواد الجينية الأجنبية. لهذا السبب ، يجب معالجة هذه الخلايا من أجل إدخال الحمض النووي الجديد بنجاح.

تضمنت إحدى الطرق التي تم استخدامها لإدخال البلازميد المعدل في الخلية تبريد الخلايا وتسخينها بسرعة. أدى هذا إلى خلق مسام صغيرة على غشاء الخلية يمكن من خلالها للبلازميدات أن تدخل الخلية. ومع ذلك ، مع مرور الوقت ، ستبدأ هذه الثقوب / المسام في الانغلاق. اليوم ، يتم استخدام عدد من الأساليب الجديدة لإدخال نواقل في الخلايا.

· حقن مكروي - تتضمن هذه الطريقة استخدام إبرة زجاجية (ماصة microcapillary) لإدخال مادة DNA الجديدة مباشرة في الخلية. هنا ، يتم استخدام معالج دقيق (للدقة) لتوجيه حركة الإبرة.

· التفريد الكهربي - في هذه الطريقة ، يتم تطبيق مجال كهربائي لزيادة نفاذية غشاء الخلية. هذا يجعل من السهل إدخال البلازميد المعدل في الخلية.

· نقل الجينات بوساطة الموجات فوق الصوتية

· نقل الجينات بوساطة ألياف كربيد السيليكون

· نقل كلوريد الكالسيوم بوساطة

* بينما تساعد طرق التحكم المذكورة أعلاه في تقليل فرص الارتباط الذاتي للنواقل من بين النتائج الأخرى غير المرغوب فيها ، فقد ثبت أن إدخال الحمض النووي المؤتلف في الخلايا المضيفة يؤدي إلى نتائج مختلفة.

في حين أن بعض الخلايا المضيفة ستأكل البلازميد المؤتلف (الذي يحتوي على الجين المعني) ، قد تأخذ بعض الخلايا المضيفة الأخرى خلايا البلازميد التي خضعت للربط الذاتي بينما تحتوي خلايا أخرى على بلازميدات ذات جينات غير مرغوب فيها. لهذا السبب ، من المهم تحديد الخلايا المضيفة المحولة.


إصلاح الحمض النووي في الإشريكية القولونية: تحديد المنتج الجيني للأشعة فوق البنفسجية

تم استنساخ جزء من الحمض النووي بحجم 2.9 كيلو بايت (kb) يحتوي على جين uvrD الخاص بـ Escherichia coli K-12 في مركبات بلازميد ذات نسخ منخفضة ومتعددة النسخ. يكمل بلازميد uvrD ذو النسخ المنخفضة (pVMK49) مجموعة متنوعة من طفرات الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية و recL. في المقابل ، تظل السلالات نفسها التي تحمل الجزء 2.9 كيلو بايت في بلازميد متعدد النسخ (pVMK45) حساسة للأشعة فوق البنفسجية (UV). بالإضافة إلى ذلك ، فإن محولات pVMK45 من E. coli البرية حساسة للأشعة فوق البنفسجية وميثان سلفونات الميثان ويبدو أنها تعاني من نقص في إعادة التركيب. لا يكمل جين uvrD المستنسخ أليل uvrD3 السائد. يشفر إدخال 2.9 كيلو بايت Pvu II في هذه البلازميدات بروتينًا واحدًا يبلغ 76000 دالتون ، والذي يجب أن يكون منتج جين uvrD على أساس تجارب التعطيل التدخلي مع Tn1000 transposon. تؤكد هذه البيانات التحليل الجيني السابق الذي اقترح أن recL و uvrE و uvrD كانت كلها أليلية. كما تم تحديد اتجاه نسخ جين الأشعة فوق البنفسجية.


4. الخلاصة

يمكننا إثبات قابلية تطبيق الرواية بكتريا قولونية سلالة الضغط X لإنتاج البروتينات المؤتلفة خارج الخلية. استكشفنا مساحة التصميم ، حيث يُفضل إنتاج البروتين خارج الخلية دون التضحية بالجدوى: بالنسبة للبروتين النموذجي القابل للذوبان SpA ، درجات حرارة الزراعة بين 30 و 35 درجة مئوية و فق ، 0 ما يصل إلى 0.25 جم جم -1 ساعة -1 عزز كلاً من التسرب والإنتاجية مع الحفاظ على تحلل الخلية عند الحد الأدنى. أثرت معاملات العملية على عيار المنتج الكلي والتسرب بشكل إيجابي في كل من مضيفات التعبير التي تم فحصها. عن طريق قمع النمو المحرض ، الرواية بكتريا قولونية أظهرت سلالة X-press قابلية أقل للعبء الأيضي لإنتاج البروتين المؤتلف ، وبالتالي تسمح بتحكم أكثر إحكامًا في العملية بسبب انخفاض التباين عبر ظروف العملية المختلفة ، على الرغم من استمرار ملاحظة اعتماد النمو على درجة الحرارة. أخيرًا ، أظهرنا أن سلالة X-press يمكنها تحقيق عيارات عالية من فئات مختلفة من البروتين المؤتلف وتسرب ما يصل إلى 90 ٪ من جميع المنتجات القابلة للذوبان. لذلك ، تعتبر هذه السلالة مرشحًا واعدًا لإنتاج البروتين خارج الخلية في تطبيقات الدُفعات المغذية الحالية أو التصنيع المستمر في المستقبل. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى فحص إضافي لمساحة التصميم لمنتجات مختلفة ، خاصة للبروتينات المعرضة لتشكيل IB. يجب توجيه المزيد من البحث نحو العلاقة بين أنظمة التعبير المختلفة ، ومعلمات العملية ، وآثارها على إطلاق البروتين المحيطي.


ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي: Jie Qiao و Wenqiang Li و Siyu Lin.

الانتماءات

مختبر الدولة الرئيسي للحفز الحيوي وهندسة الإنزيم ، كلية علوم الحياة ، جامعة هوبى ، ووهان ، 430062 ، هوبى ، الصين

جي تشياو ، وينكيانغ لي ، سيو لين ، ليكسين ما وأمبير يي ليو

مركز هوبى للابتكار التعاوني للتحول الأخضر للموارد الحيوية ، ووهان ، 430062 ، هوبي ، الصين

وينلي صن وليكسين ما وأمبير يي ليو

مختبر هوبي الرئيسي للتكنولوجيا الحيوية الصناعية ، كلية علوم الحياة ، ووهان ، 430062 ، هوبى ، الصين

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

Y.L. و L.X.M. وضع تصور وتصميم التجارب W.L.S. و W.Q.L. شيدت التعبير البلازميدات وتنقى Cas9 و Cas12a RNPs J.Q. و S.Y.L. أجرى التجارب الخلوية Y.L. حلل البيانات وكتب الورقة.

المؤلفون المراسلون


الدورات

موضوعات مختارة في البيولوجيا الجزيئية التي تشكل أساس التكنولوجيا الحيوية والصناعة الطبية الحيوية اليوم. تشمل الموضوعات تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف ، وأدوات البحث الجزيئي ، والتلاعب في التعبير الجيني ، والطفرات الموجهة وهندسة البروتين ، والتشخيصات القائمة على الحمض النووي والمصفوفات الدقيقة للحمض النووي ، والأجسام المضادة والتشخيصات القائمة على البروتين ، والجينوميات والمعلوماتية الحيوية ، وعزل الجينات البشرية ، والعلاج الجيني ، والأنسجة هندسة.

محاضرة CH 104D عن التكنولوجيا الحيوية الجزيئية: من الجين إلى المنتج

تكامل التقنيات الجزيئية والهندسية في التكنولوجيا الحيوية الحديثة. استنساخ الجين المرمز للبروتين إلى بلازميد ، وتحويل البنية إلى E. coli ، وإنتاج منتج الجين في مفاعل حيوي ، والمعالجة النهائية لمرق المفاعل الحيوي لتنقية البروتين المؤتلف ، وتوصيف البروتين المنقى.

مختبر التكنولوجيا الحيوية الجزيئية CH 104DL: من الجين إلى المنتج

تكامل التقنيات الجزيئية والهندسية في التكنولوجيا الحيوية الحديثة. استنساخ الجين المرمز للبروتين إلى بلازميد ، وتحويل البنية إلى E. coli ، وإنتاج منتج الجين في مفاعل حيوي ، والمعالجة النهائية لمرق المفاعل الحيوي لتنقية البروتين المؤتلف ، وتوصيف البروتين المنقى.

CH 125 عمليات الفصل الحيوي والعمليات الحيوية

استراتيجيات الفصل وعمليات الوحدة والعوامل الاقتصادية المستخدمة لتصميم عمليات عزل وتنقية المواد مثل الخلايا الكاملة أو الإنزيمات أو المضافات الغذائية أو المستحضرات الصيدلانية التي هي منتجات مفاعلات بيولوجية.

CH 100 أساسيات الهندسة الكيميائية والبيولوجية الجزيئية

مقدمة في تحليل وتصميم العمليات الكيميائية الصناعية. موازين المواد والطاقة. مقدمة في البرمجة في MATLAB


DNA و RNA

مجموعة شاملة من الكواشف والأطقم لتنقية ومعالجة وتحليل DNA و RNA لدراسات البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الخلية.

تعمل مجموعات تنقية الحمض النووي الخاصة بنا على تنقية الحمض النووي الجيني عالي الجودة من مجموعة متنوعة من المصادر ومجموعة واسعة من التطبيقات. OmniPrep & trade مجموعات الحمض النووي الجينومي للحمض النووي الجيني النقي جدًا الذي يناسب جميع التطبيقات النهائية وقابلة للتطوير بشكل كامل. معدات GET & trade لعزل الحمض النووي الجيني للعزل السريع لقوالب الحمض النووي من العينات الصغيرة. وهي تعتمد على تقنية الجينوم الفعالة التي تستخدم الطور الصلب للاستخراج ، كل من أعمدة الدوران والخرز المغناطيسي ، لا تتطلب مجموعات XIT والتجارة استخراج الكلوروفورم أو الفينول وتنتج DNA خالٍ من البروتين وعالي الجودة. تم تصميم OmniTemplate & trade للجيل السريع من القوالب الجينومية الجاهزة لـ PCR. تسمح مجموعات MegaLong & trade لاستخراج الحمض النووي الجيني باستخراج الحمض النووي من مجموعة متنوعة من العينات ، بما في ذلك الأنسجة الحيوانية والخلايا المستنبتة والدم الكامل والبكتيريا والخميرة أو الفطريات.

يمكن العثور على مجموعة مختارة من المنتجات لعزل DNA البلازميد والتحويل وفحص الإنتاجية العالية للبلازميدات. تشمل المنتجات لدينا مجموعة فريدة من نوعها وسهلة الاستخدام من Plasmid Screening Toothpick & trade و ToothPick & trade-PCR ، والتي تقوم بفحص المستعمرات بسرعة بحثًا عن DNA البلازميد و HP-Ampicillin والتجارة ، مما يقضي على مشاكل تكوين مستعمرات الأقمار الصناعية أو الخلفية والمواد الكيميائية بما في ذلك Isopropyl & beta-D-1- ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG).

بالنسبة إلى كواشف تعداء العدوى ، يتم تقديم سلسلة من أربعة خيارات استنادًا إلى G-FECT & Trade Transfection Reagent لكل عمليات النقل اليومية. تم تصميم الإصدارات المعدلة لزيادة كفاءة تعداء الخلايا وانخفاض سمية الخلايا.

بالنسبة لـ PCR (تفاعل البوليميراز المتسلسل) ، يتم تقديم كواشف عالية الجودة وبأسعار معقولة ، بما في ذلك Taq و Pfu Polymerases و dNTPs (Deoxynucleotides) ، بشكل فردي أو ممزوج مسبقًا.

بالنسبة لأبحاث الحمض النووي الريبي ، منتجات لعزل الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك المخزن المؤقت للاستخراج والتوقيف ، والحصول على وتداول إجمالي الحمض النووي الريبي ، والحصول على وتداول إجمالي RNA-Mag و TriXtract والتجارة ، لعزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة. تتوفر منتجات للكشف عن RNase وتطهيره ، بما في ذلك RNaseOUT والتجارة التي تقتل RNase عند التلامس.

للكشف عن الأحماض النووية ، تتوفر مخازن الرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز والمواد الكيميائية وسلالم الحمض النووي ومقايسة الحمض النووي الخاصة التي لا تتطلب مقياس طيف ضوئي.

تتوفر أيضًا العديد من أدوات وإكسسوارات أبحاث الخميرة لمساعدة الباحثين في مجموعة متنوعة من التطبيقات التي تستخدم الخميرة. تتوفر أيضًا مجموعة كاملة من ملحقات درجة البيولوجيا الجزيئية والكواشف والمخازن المؤقتة لأبحاث بيولوجيا الخلية.


شاهد الفيديو: escherichia coli Ешерихия Коли (شهر فبراير 2023).