معلومة

كيف يختلف البروتياز المثبط بواسطة lopinavir في SARS-CoV-2 مقارنةً بـ SARS-CoV؟

كيف يختلف البروتياز المثبط بواسطة lopinavir في SARS-CoV-2 مقارنةً بـ SARS-CoV؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ثبت أن مثبط البروتياز lopinavir ، الذي تم تطويره في الأصل كعلاج ضد الإيدز وفيروس نقص المناعة البشرية ، فعال ضد فيروس كورونا السارس SARS-CoV.

داير إم آر ، طالب غسابي إس ، داير إم إس لوبينافير ؛ دواء قوي ضد عدوى فيروس كورونا: نظرة ثاقبة من دراسة الالتحام الجزيئي ، Arch Clin Infect Dis. 2017 ؛ 12 (4): e13823. دوى: 10.5812 / archcid.13823.

لماذا يعتبر Lopinavir غير فعال ضد SARS-CoV-2؟ هل هناك اختلاف في الترميز الجيني للبروتياز؟


هل هناك اختلاف في الترميز الجيني للبروتياز؟

هذه الورقة من قبل وو وآخرون. يشرح جينوم SARS-CoV-2 ويقارن اختلافه عن فيروسات كورونا الأخرى ، مما قد يساعد في الإجابة على سؤالك الثاني.

يتضمن هذا التعليق التوضيحي 16 جينًا للبروتين غير الهيكلي ("nsp"). تشير المواد التكميلية لهذه الورقة إلى أن جميع هذه البروتينات باستثناء اثنين (nsp7 و nsp13) لها بدائل للأحماض الأمينية بين SARS-CoV-2 ("2019-nCoV" في الورقة) و SARS-CoV.

يقوم الجين nsp5 بترميز 3CLpro (بروتياز السيستين الشبيه بالكيموتريبسين) ، لذلك هناك اختلافات هناك.

تشير الأدبيات إلى أن البروتينات غير الهيكلية والبروتينات الأخرى هي أهداف محتملة لعدد من العلاجات المضادة للفيروسات.

تشير ورقة أخرى أيضًا إلى أن لوبينافير يستهدف منتجات nsp3 ، من بين البروتينات الأخرى ، المستخدمة ضد SARS-CoV:

الهدف المحتمل لـ Lopinavir هو Nsp3b و Nsp3c و Helicase و NRBD أو E-channel مع mfScores من -158.050 و -189.140 و -114.018 و -171.127 و -221.785 على التوالي.

يحتوي الجين nsp3 على مجال شبيه بالبروتياز 2 (PL2pro). تشير المواد التكميلية من الورقة الأولى المرتبطة إلى أن nsp3 يحتوي على تسلسل مختلف من الأحماض الأمينية بين SARS-CoV و SARS-CoV-2.

قد يكون من المفيد الحفر في وو وآخرون. ورقة وبيانات التعليقات التوضيحية الخام للنظر في ما هؤلاء أ. البدائل ، لمعرفة ما إذا كان ذلك قد يساعد في تحديد سبب عدم فعالية lopinavir في تعطيل PL2pro وتقليل مستويات فيروس كورونا الجديد.

قد يكون من المفيد أيضًا التفكير في الهدف نفسه. بالعودة إلى مقالة Nature Biotechnology:

لكن إريك دي كليرك ، من معهد ريجا للأبحاث الطبية في لوفين ، بلجيكا ، يقول إنه عند البحث عن أو تصميم عقاقير فعالة ضد COVID-19: "يجب أن نبتعد عن الأدوية المضادة للفيروسات المعروفة بأنها تعمل على أهداف لا تلعب دورًا في تكرار فيروسات كورونا ". تشمل هذه الأدوية بينسيكلوفير ، الذي يستهدف بوليميريز الحمض النووي لفيروس الهربس ، ولوبينافير / ريتونافير ، اللذين يستهدفان بروتياز فيروس نقص المناعة البشرية. بدلاً من ذلك ، كان يفضل استهداف بروتين خاص بالفيروس مثل بوليميريز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي ، مشيرًا إلى أن فيروسات كورونا لا تحتوي أو تستخدم نسخة عكسية.


إن البروتياز الرئيسي (M pro) لـ SARS-CoV-2 هو هدف رئيسي للأدوية المضادة للفيروسات. في حين أن معظم مثبطات M pro تحتوي على مركب γ-lactam glutamine في الموضع P1 ، وجدنا مؤخرًا أن العديد من مثبطات M pro لها شقوق كارهة للماء في موقع P1 ، بما في ذلك مثبطات calpain II و XII ، والتي تنشط أيضًا ضد الكاتيبسين البشري L ، a مضيف البروتياز وهو أمر مهم للدخول الفيروسي. في هذه الدراسة ، قمنا بحل الهياكل البلورية للأشعة السينية لـ M pro في مركب مع مثبطات calpain II و XII وثلاثة نظائر من GC-376. أكد هيكل M pro مع مثبط calpain II أن الجيب S1 يمكن أن يستوعب سلسلة جانبية ميثيونين كارهة للماء ، مما يتحدى فكرة أن البقايا المحبة للماء ضرورية في هذا الموضع. كشفت بنية مثبط الكالبين الثاني عشر عن وضع ربط مقلوب غير متوقع. توفر البيانات البيوكيميائية والحسابية والهيكلية والخلوية المقدمة معًا اتجاهات جديدة لتطوير مثبطات مزدوجة كأدوية مضادة للفيروسات SARS-CoV-2.

ظهر وباء COVID-19 (مرض فيروس كورونا 2019) في أواخر ديسمبر 2019 في ووهان بالصين وتطور ليصبح أحد أسوأ أزمات الصحة العامة في التاريخ الحديث. كان تأثير COVID-19 على الصحة العامة والاقتصاد العالميين شديدًا. العامل المسبب للمرض لـ COVID-19 هو فيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) ، والذي يشارك

تشابه جيني بنسبة 78٪ مع فيروس SARS-CoV ، الفيروس الذي أدى إلى تفشي مرض السارس في عام 2003. على الرغم من أن تفشي فيروس كورونا مثل COVID-19 ليس غير متوقع ، فإن معدل الوفيات المرتفع وسهولة انتقال فيروس SARS-CoV-2 غير مسبوق.

يوجد حاليًا عدد قليل من الأدوية المضادة للفيروسات ولا توجد لقاحات متاحة لـ SARS-CoV-2. وبالتالي ، من الضروري تحديد أهداف الأدوية التي يمكن أن تؤدي إلى مضادات فيروسات فعالة. بناءً على الأبحاث التي أجريت على فيروسات كورونا المماثلة ، وفيروس SARS-CoV ، وفيروس كورونا المتلازمة التنفسية للشرق الأوسط (MERS-CoV) ، تم إعطاء الأولوية للعديد من البروتينات الفيروسية كأهداف للأدوية المضادة للفيروسات SARS-CoV-2: بروتين سبايك ، RNA بوليميريز RNA المعتمد (RdRp) ) ، والبروتياز الرئيسي (M pro) ، والبروتياز الشبيه بغراء (PL pro) (1, 2). مُنح مثبط SARS-CoV-2 RdRp remdesivir ترخيصًا للاستخدام في حالات الطوارئ من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية في 1 مايو 2020. يحتوي Remdesivir على نشاط واسع النطاق مضاد للفيروسات ضد SARS-CoV و SARS-CoV-2 و MERS-CoV في الخلية حضاره (35). تم تأكيد الفعالية المضادة للفيروسات بشكل أكبر في نماذج الفئران المصابة بفيروس MERS-CoV وقرود المكاك (6, 7). تشمل مثبطات RdRp الإضافية قيد التحقيق لـ SARS-CoV-2 EIDD-2801 و favipiravir (T-705) و ribavirin و galidesivir (8, 9). أظهر مثبط الاندماج EK1C4 ، الذي تم تصميمه على أساس ببتيد H2 في مجال S2 لبروتين سبايك HCoV-OC43 ، نشاطًا واعدًا مضادًا للفيروسات واسع النطاق ضد SARS-CoV-2 و SARS-CoV و MERS-CoV ، وكذلك فيروسات كورونا البشرية HCoV-229E و HCoV-NL63 و HCoV-OC43 (10, 11). وفي الوقت نفسه ، تم استكشاف M pro على نطاق واسع كهدف دوائي ليس فقط لـ SARS-CoV-2 ولكن أيضًا SARS-CoV و MERS-CoV ، بالإضافة إلى الفيروسات المعوية وفيروسات الأنف والنوروفيروس (12). M pro عبارة عن بروتياز السيستين المشفر فيروسيًا وله تفضيل فريد للركيزة لبقايا الجلوتامين في موقع P1 ، والذي تم تأكيده مؤخرًا من خلال التنميط الركيزة لـ SARS-CoV-2 (13). وبالتالي ، فإن معظم مثبطات M pro المصممة تحتوي إما على 2-بيروليدون أو 2-بيبيريدينون في موقع P1 كمحاكاة لبقايا الجلوتامين في الركيزة (14). تشمل الأمثلة المركبات N3, 13 ب, 11 أ, 11 ب، والتي تم تحديدها مؤخرًا GC-376 (1518) —جميعها لها تثبيط إنزيمي قوي في المقايسة البيوكيميائية والنشاط المضاد للفيروسات في زراعة الخلايا. تم الكشف عن آلية عملها وطريقة التثبيط من خلال الهياكل البلورية للأشعة السينية المرتبطة بالدواء (1518).

وجدت دراستنا السابقة اثنين من مثبطات SARS-CoV-2 M pro غير التقليدية ، مثبطات calpain II و XII ، والتي تختلف هيكليًا عن مثبطات M pro التقليدية ، مثل GC-376 (15). على وجه التحديد ، تشتمل مثبطات الكالبين II و XII على سلاسل جانبية مسعورة ميثيونين ونورفالين في موضع P1 ، على التوالي. يتحدى هذا الاكتشاف فكرة أن محاكيات الجلوتامين المحبة للماء مطلوبة في الموضع P1. علاوة على ذلك ، يعتبر مثبط الكالباين II مثبطًا قويًا للبروتياز كاثيبسين L البشري ، مع ثابت التثبيط كأنا من 50 نانومتر (19). يلعب Cathepsin L دورًا مهمًا في الدخول الفيروسي لـ SARS-CoV-2 عن طريق تنشيط بروتين سبايك الفيروسي في الجسيم الداخلي أو الليزوزوم (2022) وله تفضيل ركيزة واسع نسبيًا في الموضع P1 (23, 24). أشارت الدراسات إلى أن مثبطات الكاتيبسين L مثل MDL28170 يمكنها منع دخول الفيروس أو تقليله بشكل كبير (20, 25). في هذه الدراسة ، نستكشف سلسلتين من مثبطات M pro ، واحدة هي المثبطات المزدوجة التي تستهدف كلاً من M pro و cathepsin L مثل مثبطات calpain II و XII ، والأخرى هي مثبطات M pro الخاصة مثل GC-376 النظير UAWJ246, UAWJ247، و UAWJ248. لتشريح آلية عمل المثبطات المزدوجة ، قمنا بحل الهياكل البلورية عالية الدقة للأشعة السينية لـ M pro باستخدام مثبطات calpain II و XII. وجدنا أن مثبط calpain II مرتبط بـ M pro في التشكل الكنسي الموسع ، لكن مثبط calpain XII يتبنى وضع ربط غير متوقع ، حيث يفترض تشكلاً مقلوبًا شبه حلزوني حيث يتم وضع حلقة P1 بيريدين في S1 جيب بدلا من سلسلة جانبية نورفالين P1 ، كما يتوقع المرء. تكشف الهياكل المعقدة لمثبطات الكالباين II و XII ، جنبًا إلى جنب مع دراسات العلاقة بين البنية والنشاط ، أن الجيب S1 من M pro يمكن أن يستوعب كلاً من الاستبدالات المحبة للماء والطارئة للماء ، مما يمهد الطريق لتصميم مثبطات مزدوجة تستهدف كلاً من الفيروس M pro and host cathepsin L. Last ، مسترشدًا بالبنية البلورية للأشعة السينية لـ SARS-CoV-2 M pro مع GC-376 [بنك بيانات البروتين (PDB): 6WTT] (15) ، ثلاثة مثبطات موالية محددة UAWJ246, UAWJ247، و UAWJ248 تم تصميمها لتوصيف تفضيلات السلسلة الجانبية للجيوب S1 ′ و S2 و S3 و S4. بشكل عام ، توفر الهياكل البلورية للأشعة السينية وملف النشاط الشخصي المقدم هنا رؤى قيمة حول اختلاط الركيزة لـ M pro ، بالإضافة إلى اتجاه جديد في تصميم مثبطات مزدوجة تستهدف كلاً من SARS-CoV-2 M pro و cathepsin L المضيفة. .


البحوث الأصلية المادة

  • 1 قسم الكيمياء الصيدلانية والطبية ، المركز القومي للبحوث ، القاهرة ، مصر
  • 2 قسم العلوم ، الجامعة التكنولوجية والعلوم التطبيقية ، الرستاق ، الرستاق ، عمان
  • 3 معهد بحوث إعادة التأهيل في سنغافورة ، جامعة نانيانغ التكنولوجية ، سنغافورة ، سنغافورة
  • 4 قسم الأحياء الدقيقة ، قسم الفيروسات ، كلية الطب ، جامعة الطائف ، الطائف ، المملكة العربية السعودية

SARS-CoV-2 هو فيروس كورونا ظهر حديثًا يسبب مرضًا تنفسيًا متفاوت الخطورة وعواقب مميتة. تم الإبلاغ عنه لأول مرة في ووهان ثم تسبب في وباء عالمي. يرتبط البروتين الشائك الفيروسي بمستقبلات سطح الخلية ACE-2 للدخول ، بينما يؤدي TMPRSS2 إلى اندماج الغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي (RdRp) و 3 & # x2032 & # x20135 & # x2032 exoribonuclease (nsp14) والبروتياز الفيروسي والبروتينات N و M مهمة في مراحل مختلفة من تكاثر الفيروس. وفقًا لذلك ، فهي أهداف جذابة لمختلف العوامل العلاجية المضادة للفيروسات. على الرغم من استخدام العديد من العوامل المضادة للفيروسات في تجارب سريرية مختلفة وإدراجها في بروتوكولات العلاج المختلفة ، إلا أن طريقة العمل ضد SARS-CoV-2 لا تزال غير مفهومة تمامًا. تم فحص العديد من الأدوية المعاد توجيهها المحتملة ، بما في ذلك ، الكلوروكين ، هيدروكسي كلوروكين ، إيفرمكتين ، ريمديزفير ، و فافيبيرافير ، في هذه الدراسة. تم إجراء الالتحام الجزيئي لهذه الأدوية ببروتينات مستهدفة مختلفة لـ SARS-CoV-2 ، بما في ذلك بروتينات السنبلة والغشاء ، و RdRp ، والبروتينات النووية ، والبروتياز الفيروسي ، و nsp14. علاوة على ذلك ، تم تقييم الارتباطات الملزمة لمستقبلات ACE-2 البشري و TMPRSS2 بالعقاقير المختلفة. كما تم إجراء محاكاة الديناميات الجزيئية وحساب MM-PBSA. تم العثور على Ivermectin و remdesivir ليكونا أكثر الأدوية الواعدة. تشير نتائجنا إلى أن كلا هذين الدواءين يستخدمان آليات مختلفة في مرحلتي الدخول وما بعد الدخول ويمكن اعتبارهما مثبطات محتملة لتكرار SARS-CoV-2.


نتائج

وفرة البروتين والاستقرار الحراري عند الإصابة بـ SARS-CoV-2

نظرًا لأن مسببات الأمراض الفيروسية تحتاج إلى اختطاف آلات بروتين المضيف الذاتية لتكرارها ، فقد اعتقدنا أن TPP سيكون وسيلة قوية للكشف عن التغييرات ذات الصلة وظيفيًا أثناء الإصابة بـ SARS-CoV-2 (Savitski وآخرون، 2014). لإنشاء ملفات تعريف استقرار حراري على مستوى البروتيوم في سير عمل TPP نموذجي ، تخضع قسامات الخلية لعشر درجات حرارة مختلفة لتعزيزها فى الموقع تتكشف البروتين. يتم بعد ذلك تحليل الخلايا وإزالة البروتينات غير القابلة للذوبان ، ويتم جمع جزء البروتين القابل للذوبان المتبقي في كل درجة حرارة وتحليلها باستخدام البروتينات الكمية القائمة على قياس الطيف الكتلي (Becher وآخرون، 2016 ، 2018). لضمان التوافق مع بيئة العمل BSL3 ، قمنا أولاً بتكييف بروتوكول TPP القياسي (Franken وآخرون، 2015) عن طريق استبدال خطوات الطرد المركزي - التي يمكن أن تؤدي بخلاف ذلك إلى توليد الهباء الجوي المحتوي على مسببات الأمراض المحمولة جواً - بخطوة ترشيح بمساعدة التفريغ لإزالة تراكمات البروتين التي يمكن إجراؤها داخل خزانة التدفق الصفحي المصفاة HEPA (الشكل 1 أ ، انظر المواد والطرق للتفاصيل). أكدنا أن هذه الخطوة كانت فعالة مثل إجراء الطرد المركزي السابق (الملحق الشكل S1A و B).

الشكل 1. التقييم العالمي لوفرة العائل وتغيرات الثبات الحراري أثناء عدوى السارس

  1. تم إصابة طبقات Caco-2 أحادية الطبقة المكونة من 1.5e 6 خلايا لكل عينة بـ SARS-CoV-2 بمعدل وزارة الداخلية 0.5 (انظر المواد والطرق). تم جمع ثلاث مكررات مستقلة بيولوجيًا في كل نقطة زمنية. تعرضت العينات إلى 2D-TPP على أساس فراغ. بعد إزالة البروتينات غير القابلة للذوبان ، تم تمييز الأجزاء القابلة للذوبان المتبقية بعلامات كتلة متساوية الضغط (TMTpro) لتمكين تقدير كمية البروتين. تم دمج العينات في تخطيط 2D-TPP من أجل مقارنة الاستقرار الحراري للبروتين ووفرة خلال فترة الإصابة (Becher وآخرون، 2018). غير المصاب (ر−1) تم استخدام النقطة الزمنية كمرجع لحساب تغييرات الطية (FC). يتم تمثيل التغيرات الكبيرة في البروتين (الوفرة والاستقرار الحراري) كمخططات دائرية للبروتينات الفردية ، كما هو موضح سابقًا (Becher وآخرون، 2018). تتوافق الدائرة الداخلية مع وفرة البروتين وتتوافق الدائرة الخارجية مع تغيرات الاستقرار الحراري (ن = 3).
  2. أصيبت خلايا Caco-2 بـ SARS-CoV-2 حسب (A). تم غسل الخلايا وتثبيتها وتلطيخها بـ DAPI (أزرق) لتصور نوى الخلية واحتضانها بجسم مضاد للبروتين N (أحمر) لتصور الخلايا المصابة بـ SARS-CoV-2. يشير شريط المقياس إلى 10 ميكرومتر.
  3. تم حساب معدلات الإصابة باستخدام برنامج التصوير الآلي (انظر المواد والطرق) المحسوبة من ستة مجالات رؤية لكل نقطة زمنية لكل تكرار بيولوجي. تشير نقطة البيانات إلى متوسط ​​العينة ويمنع الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) (ن = 3).
  4. اكتشف SARS-CoV-2 البروتينات التي تم رسمها كدالة للوقت حيث تشير كل نقطة بيانات إلى تكرار مختلف (ن = 3).

قمنا بعد ذلك بتطبيق سير عمل TPP المعدل لدراسة كيف تعدل عدوى SARS-CoV-2 الاستقرار الحراري لبروتين المضيف ووفرة. خلايا Caco-2 ، التي تسمح للإصابة بعدوى SARS-CoV-2 (Stanifer وآخرون، 2020 بوجكوفا وآخرون، 2020) ، في ثلاث نسخ بفيروس SARS-CoV-2 بتعددية عدوى (MOI) 0.5 لمدة ساعة واحدة ، وبعد ذلك تمت إزالة الجزيئات الفيروسية غير المربوطة وحصاد العينات عند 1 ، 2 ، 4 ، 7 ، 12 ، 24 و 48 ساعة بعد الإصابة (الشكل 1 أ). أربع ساعات بعد إضافة الفيروس

أصيب 5.2 ٪ من الخلايا ، وبلغت معدلات الإصابة بالخلايا ذروتها عند حوالي 18 ٪ بحلول 24 ساعة (الشكل 1 ب و ج). في كل نقطة زمنية ، تم حصاد العينات ومعالجتها باستخدام إزالة الركام القائمة على الفراغ كما هو موضح أعلاه وتحليلها بواسطة البروتينات الكمية القائمة على قياس الطيف الكتلي (الشكل 1 أ).

اكتشفنا 7414 بروتينًا مع اثنين على الأقل من الببتيدات الفريدة. وشمل ذلك ثلاثة بروتينات فيروسية: البروتين السكري (S) ، والبروتين النووي (N) و Orf9b. التغييرات الوفرة في هذه البروتينات الثلاثة بمرور الوقت أعادت إلى حد كبير تلخيص ملاحظات الفحص المجهري لتكاثر الفيروس (الشكل 1 د). كانت حركيات انتشار SARS-CoV-2 وتغطية البروتين الفيروسي مماثلة لتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقًا في خلايا Caco-2 (Bojkova وآخرون، 2020). قمنا بعد ذلك بحساب تغييرات الوفرة بالنسبة إلى التحكم غير المصابة لـ 5564 بروتينًا (تم اكتشافهما عند أدنى درجتين لدرجات الحرارة في نسختين على الأقل) ، وتغيرات الاستقرار الحراري لـ 4076 بروتينًا (تم اكتشافهما عند أدنى درجة حرارة في نسختين على الأقل وبشكل عام تم اكتشافه في عشر درجات حرارة على الأقل Dataset EV1 انظر المواد والطرق للحصول على التفاصيل). من بين هؤلاء ، أظهر 350 بروتينًا تغيرات كبيرة في الوفرة (|ض-الدرجة | & GT 1.96 و ف- القيمة & lt 0.05 انظر المواد والطرق للحصول على التفاصيل) وأظهر 278 بروتينًا تغيرات في الاستقرار الحراري في نقطة زمنية واحدة على الأقل (Dataset EV1 ، الملحق الشكل S2). تمشيا مع الملاحظات السابقة ، كانت غالبية التغييرات في وفرة البروتين نتيجة للتنظيم المنخفض (62.9 ٪ من الوفرة الكلية تغيرت 220 بروتينًا في المجموع) (بوحدو وآخرون، 2020) ، في حين هيمن زعزعة استقرار البروتين على تغييرات الاستقرار (61.9 ٪ من تغيرات الاستقرار الحراري الكلي: 172 بروتينًا في المجموع) (الشكل 2 أ والملحق الشكل S2). على سبيل المثال ، لاحظنا زيادة مبكرة في وفرة نسخ المضيف والبروتينات المتعلقة بالترجمة (بما في ذلك العمليات المرتبطة بالفيروسات) ، على وجه التحديد خلال الساعة الأولى من الإصابة ، في حين أن تغيرات الثبات الحراري لهذه العمليات كانت مستدامة في الغالب طوال فترة العدوى ( الشكل 2 ب ومجموعة البيانات EV2). تغيرت البروتينات المرتبطة بترجمة الميتوكوندريا بوفرة فقط خلال أول ساعتين من الإصابة ، وتغيرت البروتينات المتعلقة بإعادة تشكيل الهيكل الخلوي وطي البروتين فقط في الاستقرار الحراري في الغالب نحو المراحل المتأخرة من العدوى (الشكل 2 ب ومجموعة البيانات EV2). كانت النتائج المتعلقة بطي البروتين في الغالب نتيجة عدم الاستقرار الحراري وتم تثبيت بروتينات التصاق الخلايا الخلوية حرارياً في الغالب (الملحق الشكلان S3 و S4 و Dataset EV2). باختصار ، نكشف عن خريطة غنية وديناميكية لوفرة البروتين المضيف وتغيرات الاستقرار الحراري عند الإصابة بـ SARS-CoV-2 والتي قد تمثل أهدافًا علاجية جديدة ذات صلة.

الشكل 2. وفرة البروتين العالمي وتغيرات الاستقرار الحراري عند الإصابة بـ SARS-CoV-2

  1. العدد الإجمالي للبروتينات المرتفعة أو الخاضعة للتنظيم بشكل كبير (|ض-الدرجة | & GT 1.96 ، ف-القيمة & lt 0.05) لكل نقطة زمنية لخلايا Caco-2 المصابة بـ SARS-CoV-2 كما هو موضح في الشكل 1 أ. يتم تصنيف البروتينات التي تم تغييرها بشكل كبير في الوفرة (يسار) والاستقرار الحراري (يمين) وفقًا للتنظيم السفلي / عدم الاستقرار (الأحمر) أو التنظيم / الاستقرار (الفيروز).
  2. علم الوجود الجيني (GO) العملية البيولوجية وإثراء المسارات لمسارات مختارة. راجع Dataset EV2 للاطلاع على العملية البيولوجية الكاملة لمصطلح GO وتخصيب المسار.

تتلاقى تغييرات الاستقرار الحراري التي يسببها SARS-CoV-2 مع مثبطات مضخة البروتون المضيفة الفيروسية وتنظيم الفوسفوزيت

بعد ذلك ، سألنا ما إذا كانت البروتينات التي تتغير في الوفرة أو الاستقرار الحراري أثناء عدوى SARS-CoV-2 تشارك أيضًا في مثبطات مضخة البروتون المضيفة الفيروسية و / أو تمتلك الفسفوسات التي يتم تنظيمها بشكل تفاضلي عند الإصابة بـ SARS-CoV-2 (Bouhaddou) وآخرون، 2020 ما قبل الطباعة: Samavarchi-Tehrani وآخرون، 2020 جوردون وآخرون، 2020 ب). للقيام بذلك ، قمنا بمقارنة قائمة البروتينات هذه بمجموعات البيانات المكتسبة سابقًا على مستوى البروتين والتي تصف مثبطات مضخة البروتون المضيفة لـ SARS-CoV-2 وتنظيم الفوسفوزيت عند الإصابة (Bouhaddou وآخرون، 2020 جوردون وآخرون، 2020 ب). وجدنا تداخلًا في 30 بروتينًا غيرت وفرة أو استقرارًا حراريًا وقد ثبت سابقًا أنها تتفاعل جسديًا مع الطعوم الفيروسية في تجارب مطياف الكتلة لتنقية التقارب (AP-MS) (Gordon وآخرون، 2020b Appendix Fig S5A) و 204 بروتينات في تجارب BioID (نسخة أولية: Samavarchi-Tehrani وآخرون، 2020) (الملحق الشكل S5B). بالإضافة إلى ذلك ، أظهر 107 من البروتينات ذات الوفرة المتغيرة أو الاستقرار الحراري أيضًا حالات فسفرة متغيرة أثناء عدوى SARS-CoV-2 (الملحق الشكل S5C Bouhaddou وآخرون، 2020). وبالتالي ، فإن البروتينات التي تظهر تغيرات متعددة في الوفرة والاستقرار الحراري و / أو تفاعلها أو حالة الفسفرة توفر مزيدًا من الدعم الجزيئي لدورها الوظيفي أثناء عدوى SARS-CoV-2. الأهم من ذلك ، أن غالبية البروتينات المتغيرة في الاستقرار الحراري كانت فريدة من نوعها لتجربة TPP. كما نوقش أدناه ، فإن بعض هذه النتائج هي أهداف مباشرة للأدوية المثبطة لـ SARS-CoV-2 ، مما يشير إلى أن TPP يوفر معلومات متعامدة عن بيولوجيا عدوى SARS-CoV-2.

لفهم كيفية ارتباط تغيرات الاستقرار الحراري بالتغييرات في العمليات الخلوية المضيفة ، استخدمنا بروتينات ذات ثبات حراري متغير لبذر شبكة تم نشرها بعد ذلك باستخدام بروتينات مضيفة تبين سابقًا أنها تتفاعل مع بروتينات SARS-CoV-2 أو تظهر اضطرابات في تنظيم الفوسفوزيت أثناء عدوى SARS-CoV-2 (بوحدو وآخرون، 2020 جوردون وآخرون، 2020b الشكل 3 أ). بعد انتشار الشبكة ، تم إجراء التجميع لتقسيم الشبكة إلى وحدات تحتوي على بروتينات ذات وظائف بيولوجية ذات صلة. كشف تحليل المسار البيولوجي عن تقارب واضح لتنظيم البروتين المضيف (الاستقرار الحراري أو الفوسفوزيت) والتفاعلات الفيزيائية (مثبطات مضخة البروتون المضيفة الفيروسية) داخل العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك البروتينات المشاركة في تنظيم دورة الخلية وتنظيم الأنابيب الدقيقة وتنظيم الربط mRNA (الشكل 3 أ و ب). والجدير بالذكر أن البروتينات المشاركة في ربط الحمض النووي الريبي (الوحدة M-3) (على سبيل المثال SNRNP70 و SNRPGP15 و SRSF10 و SNRPG و SRSF1 و SRSF7 و SRRM1 و LUC7L3) تم زعزعتها حراريًا بشكل ثابت عند ساعتين بعد الإصابة (الشكل 3C). تتماشى الاضطرابات في آلية الربط RNA مع التقارير الأخيرة التي توضح التغييرات في الوفرة (Bojkova وآخرون، 2020) ودول الفسفرة (بوحدو وآخرون، 2020) للبروتينات المرتبطة بالربط RNA أثناء عدوى SARS-CoV-2. الأهم من ذلك ، أن المتطلبات الوظيفية لوظيفة spliceosome في عدوى SARS-CoV-2 قد تم إثباتها سابقًا باستخدام مثبط لصقوسوم ، بلادينوليد B ، الذي منع تكرار SARS-CoV-2 (Bojkova). وآخرون، 2020). ومن المثير للاهتمام ، أن بروتين SARS-CoV-2 nsp16 يعطل أحداث ربط الرنا المرسال من خلال ربط مجالات التعرف على الرنا المرسال U1 / U2 snRNAs ، وبالتالي يمنع ترجمة منتجات الجينات المضادة للفيروسات (Boudreault وآخرون، 2019 مارانون وآخرون، 2020 بانيرجي وآخرون, 2020 ).

الشكل 3. تحليل الشبكة لمجموعات بيانات SARS-CoV-2 المتكاملة

  1. تم تغيير شبكة البروتينات أو استهدافها بشكل شائع أثناء عدوى SARS-CoV-2. تم استخدام البروتينات التي تظهر تغيرات كبيرة في الاستقرار الحراري كبذور لبناء الشبكة. تم استخدام الفوسفوسيت المنظم بعدوى SARS-CoV-2 وحركية المنبع المتوقعة بالإضافة إلى تفاعلات البروتين والبروتين بين الطعوم الفيروسية وبروتينات الفريسة المضيفة لنشر الشبكة. بعد انتشار الشبكة ، تم إجراء التجميع لتقسيم الشبكة إلى وحدات (انظر المواد والطرق). يتم عرض إثراء مصطلح GO لكل وحدة أسفل اليمين. بيانات الاستقرار الحراري للبروتين مأخوذة من هذه الدراسة ، في حين أن تنظيم الفسفرة / كيناز (بوحدو وآخرون، 2020) والتفاعل الفيروسي - البشري - البروتيني (Gordon وآخرون، 2020b) تم الحصول على البيانات من الأعمال السابقة واستخدامها لنشر نتائج الشراكة عبر المحيط الهادئ (TPP) التي تبذر هذه الشبكة. يتم عرض جميع مرات الاستقرار الحراري TPP لكل وحدة.
  2. ثم تم إجراء اختبارين إحصائيين على الشبكة المولدة من (أ). أولاً ، لتقييم ما إذا كانت الوحدات النمطية مخصبة في نتائج TPP (اختبار فيشر) ، وثانيًا ، لتحديد ما إذا كانت قد تلقت قدرًا كبيرًا من إشارة البدء (اختبار KS). يمثل الخط الأحمر المتقطع حد الأهمية (ص-ضج & اللفتنانت 0.05).
  3. توضح الخريطة الحرارية النقطة الزمنية التي يتم فيها العثور على نتائج TPP داخل كل وحدة محددة في (A). يشير البلاط الأخضر إلى تغييرات كبيرة في الاستقرار الحراري.

علاوة على ذلك ، لاحظنا تغيرات واضحة في الاستقرار الحراري للمكونات الهيكلية للديسموسومات التي تشارك في التصاق الخلية الخلوية ديسموبلاكين (DSP) تم زعزعة الاستقرار حرارياً بين 7 و 24 ساعة من العدوى بينما ديزموجلين 2 (DSG2) و plakophilin-2 (PKP2) ) أظهر الاستقرار الحراري نحو نقاط زمنية لاحقة (الشكل 3 أ ، ومجموعة البيانات EV1). قد يكون لهذا آثار على انتشار SARS-CoV-2 ، حيث ثبت أن فيروسات أخرى تستهدف بروتينات تقاطع الخلية مع الخلايا لتسهيل انتشارها إلى الخلايا المجاورة (ماتيو) وآخرون, 2015 ).

اكتشفنا عدم استقرار قوي في إنزيم نازعة هيدروجين الإينوزين-5′-أحادي الفوسفات 2 (IMPDH2) بدءًا من 4 ساعات بعد الإصابة (الشكل 4 أ). يحفز IMPDH2 تحويل إينوزين 5-فوسفات (IMP) إلى زانثوزين 5′-فوسفات (XMP) ، وهي خطوة تحد من معدل من جديد التخليق الحيوي للجوانين. تم عرض تثبيط IMPDH2 باستخدام ريبافيرين المضاد للفيروسات مسبقًا لقمع تكرار SARS-CoV-2 (Bojkova وآخرون، 2020) ، وكذلك الاستئصال الوراثي (Gordon وآخرون، 2020a). تقدم هذه النتائج دليلًا إضافيًا على أن IMPDH2 يتم تعديله وظيفيًا أثناء الإصابة ، ربما عن طريق التفاعل المباشر مع nsp14 ، ويوفر نظرة جزيئية إضافية حول سبب قيام تثبيط IMPDH2 الدوائي بقمع النسخ المتماثل لـ SARS-CoV-2 بشكل فعال.

الشكل 4. تغييرات الاستقرار الحراري في البروتينات المضيفة المستهدفة لـ SARS-CoV-2

  1. تم زعزعة استقرار IMPDH2 باستمرار من 4 ساعات بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2. سبق أن أظهر IMPDH2 أنه يشكل تفاعل بروتين-بروتين مع nsp14 (الخط الأخضر) (جوردون وآخرون، 2020b) وأن تكون عاملاً حاسمًا في دعم تكرار SARS-CoV-2 (Gordon وآخرون، 2020a). يلعب SARS-CoV-1 nsp14 دورًا مزدوجًا في إصلاح عدم تطابق زوج القاعدة وتوليف غطاء 5 الغني بالـ Guanine من الحمض النووي الريبي الفيروسي (Chen وآخرون، 2009 سميث ودينيسون ، 2013 سميث وآخرون، 2015). الثبات الحراري الدائري ومخططات الوفرة من خلايا Caco-2 المصابة بـ SARS-CoV-2 كما هو موضح في الشكل 1A (انظر أيضًا الشكل 1A لأسطورة المؤامرة). تشير النجمة إلى تنظيم مهم (انظر المواد والطرق).
  2. يتزامن زعزعة الاستقرار الحراري لـ UGDH و PAAF1 مؤقتًا وكلاهما يتفاعل سابقًا مع بروتينات SARS-CoV-2 nsp6 (UGDH) و M (UGDH و PAAF1) (ما قبل الطباعة: Samavarchi-Tehrani وآخرون، 2020). ينظم PAAF1 سلبًا البروتيازوم من خلال التحكم في التجميع / التفكيك (Park وآخرون، 2005) وقد تم ربطه سابقًا بنسخ HIV-1 (Lassot وآخرون، 2007 ناكامورا وآخرون، 2012). يتم تمثيل التغيرات الكبيرة في البروتين (الوفرة والاستقرار الحراري) كمخططات دائرية للبروتينات الفردية ، كما هو موضح سابقًا (Becher وآخرون، 2018). تتوافق الدائرة الداخلية مع وفرة البروتين وتتوافق الدائرة الخارجية مع تغيرات الاستقرار الحراري (ن = 3). تشير النجمة إلى تنظيم مهم (انظر المواد والطرق).
  3. تغيرات وفرة فسفوببتيد SAFB أثناء عدوى SARS-CoV-2. بيانات Vero cell phosphopeptide من (Bouhaddou وآخرون، 2020). البيانات التي تم الحصول عليها سابقًا من خلايا Vero المصابة بـ SARS-CoV-2 (Bouhaddou وآخرون، 2020). S604 الفوسفوزيت الذي يتزامن مؤقتًا مع عدم الاستقرار الحراري SAFB (نسخة أولية: Potel وآخرون، 2020). يظهر فوق مخطط الخط ملامح الثبات الحراري والوفرة لـ SAFB في خلايا Caco-2 المصابة بـ SARS-CoV-2 كما هو موضح في الشكل 1A (ن = 3). تشير النجمة إلى تنظيم مهم (انظر المواد والطرق).
  4. ملف الاستقرار الحراري لجميع الببتيدات SAFB غير المعدلة (الخضراء) والفوسفور S604 (pS604) (الأرجواني) في خلايا هيلا. البيانات من Potel وآخرون (ما قبل الطباعة: Potel وآخرون, 2020 ).

وجدنا أن بروتين التخليق الحيوي للجليكوزامينوجليكان UDP-glucose 6-dehydrogenase و UGDH ومثبط البروتوزومال 26S ، PAAF1 ، قد تم زعزعتهما عند الإصابة بعدوى SARS-CoV-2 (الشكل 4 ب). الأهم من ذلك ، أن كلاً من UGDH و PAAF1 مطلوبان لعدوى SARS-CoV-2 (نسخة أولية: Wang وآخرون، 2020) ، و nsp6 سابقًا للتفاعل جسديًا مع UGDH ، والبروتين السكري للغشاء الفيروسي M مع UGDH و PAAF1 في تجارب BioID (ما قبل الطباعة: Samavarchi-Tehrani وآخرون، 2020) (الشكل 4 ب). تشير هذه البيانات إلى أن زعزعة الاستقرار الحراري لـ UGDH و PAAF1 أثناء عدوى SARS-CoV-2 تلتقط التغييرات ذات الصلة وظيفيًا في حالتها الفيزيائية الحيوية التي تؤثر على انتشار SARS-CoV-2.

لقد أبلغنا سابقًا أن فسفرة البروتين ، في بعض الحالات ، تتوافق مع التغيرات في الاستقرار الحراري للبروتين (نسخة أولية: Potel وآخرون، 2020). لاحظنا أن بعض أحداث الفسفرة التي لاحظناها سابقًا (بوحدو وآخرون، 2020) خلال عدوى SARS-CoV-2 بشكل مؤقت مع تغيرات الاستقرار الحراري للبروتين ، خاصة خلال فترات زمنية سابقة. على سبيل المثال ، تزامنت فسفرة S604 على عامل ربط سقالة عامل النسخ B1 (SAFB) ، مؤقتًا مع عدم استقرارها الذي بدأ عند 1 نقطة في البوصة ووصل إلى أهمية عند 2 نقطة في البوصة (بوحدو) وآخرون، 2020 الشكل 4C). لقد أظهرنا سابقًا أن الفسفرة لـ S604 مرتبطة بزعزعة الاستقرار الحراري لـ SAFB (نسخة أولية: Potel وآخرون، 2020 Fig 4D) ، مما يشير إلى أن عدوى SARS-CoV-2 تعزز عدم الاستقرار الحراري لـ SAFB عن طريق الفسفرة في S604. تمشيا مع دور S604 في تنظيم وظيفة SAFB ، زادت وفرة البروتين في الجينات المستهدفة لـ SAFB FBL و RPS15 و TAF15 بالتزامن مع مستويات S604 (الملحق الشكل S6A). والجدير بالذكر أن منتج الجين المستهدف لـ SAFB LARP1 وجد سابقًا أنه يتفاعل مع بروتين SARS-CoV-2 N ، والجين المستهدف neuroguidin (NGDN) مع بروتين SARS-CoV-1 nsp9 (جوردون). وآخرون، 2020a ، 2020b). تأكيدًا على الأهمية الوظيفية لـ SARS-CoV-2 ، تم مؤخرًا إثبات أن NGDN مطلوب لانتشار SARS-CoV-2 (الطباعة المسبقة: Wang وآخرون، 2020). تشير هذه النتائج إلى تفاعل زمني محتمل بين SARS-CoV-2 و SAFB ، حيث تؤدي فسفرة S604 على SAFB إلى التعبير عن البروتينات المستهدفة مباشرة بواسطة SARS-CoV-2 أثناء الإصابة.

كان لدى العديد من المرافقين المضيفين تغيرات عميقة في الاستقرار الحراري أثناء عدوى SARS-CoV-2. على سبيل المثال ، تم تثبيت المكونات الأساسية لمركب مرافق الإنسان (TRiC / CCT) بشكل معتدل حرارياً في وقت مبكر من العدوى ، في حين تم زعزعة استقرارها بشدة في مراحل العدوى اللاحقة (الملحق الشكل S6B). هذا المركب مطلوب لتكاثر فيروس الأنفلونزا ، حيث تبين أنه يشكل مركبًا بروتينيًا مع الوحدة الفرعية RNA polymerase PB2 (Fislová). وآخرون، 2010). بالإضافة إلى ذلك ، تم زعزعة استقرار العديد من مرافق الصدمات الحرارية المضيفة حراريًا (على سبيل المثال HSP90AB1 ، HSP90AA1 ، HSPB1 ، HSPA8) ، وبعضها يحتوي أيضًا على فوسفوسيت منظم تفاضليًا عند عدوى SARS-CoV-2 (بوحدو وآخرون، 2020). على سبيل المثال ، ارتبط عدم الاستقرار الحراري لـ HSPB1 بزيادة الفسفرة لـ S15 و S78 و / أو S82 (الملحق الشكل S6C). على وجه الخصوص ، يعمل S78 و / أو S82 كمفتاح توافقي يلعب دورًا مهمًا في تنظيم تشكيل ثنائي HSPB1 ويعزز نشاط المرافق (تشوي وآخرون، 2019). مجتمعة ، تُظهر هذه النتائج أن TPP يوفر مزيدًا من البصيرة الجزيئية للمسارات التي تورطت سابقًا في عدوى SARS-CoV-2 ، بالإضافة إلى تورط مسارات جديدة في عدوى SARS-CoV-2.

التأثيرات المضادة للفيروسات لمرافق الصدمة الحرارية ومثبطات السيتوكروم P450

لقد درسنا ما إذا كان الاستقرار الحراري أو تغييرات الوفرة يمكن أن تكشف عن بروتينات مضيفة ذات صلة وظيفيًا يمكن استغلالها كأهداف دوائية محتملة لمنع تكرار SARS-CoV-2. استنادًا إلى قدرتنا فقط على العثور على المركبات التي تعدل بشكل انتقائي نشاط البروتينات المضيفة التي تم تغييرها بشكل كبير في بياناتنا ، قمنا يدويًا بوضع قائمة مختصرة لسبعة بروتينات مستهدفة مضيفة للأدوية والتي وجدنا أنها تُظهر وفرة متغيرة (CYP1A1: مثبطة بواسطة rhapontigenin) أو الثبات الحراري (CAPN1) : PD-150606، IMPDH1 / 2: ribavirin and mycophenolic acid، HSP90: tanespimycin، PTRG1: acetylsalicylic acid and diclofenac، CTSV: E64d and CA-074-Me) عند الإصابة بفيروس SARS-CoV-2. لحساب تأثيرات المركبات على كل من دخول الفيروس وتكاثره ، تمت معالجة الخلايا مسبقًا بمركبات وتم الاحتفاظ بها طوال التجربة. تم تقييم قدرة المركبات المختبرة على تثبيط تكاثر SARS-CoV-2 عن طريق تحديد كمية الحمض النووي الريبي الفيروسي مزدوج الشريطة بعد 20-24 ساعة بعد الإصابة وتأثيراتها على حيوية الخلية بشكل متوازٍ على الخلايا غير المصابة. قام اثنان من المركبات المختبرة بقمع انتشار SARS-CoV-2 (الشكل 5) (تمت مناقشته أدناه). لم تظهر المركبات الأخرى أي تأثير على انتشار SARS-CoV-2 في نطاق التركيز الذي تم اختباره (الملحق الشكل S7A-H) ، وهذا لا يستبعد أنها يمكن أن تكون نشطة مع أدوية أخرى أو في أنظمة خلوية مختلفة ، كما هو الحال مع حالة ريبافيرين (بوجكوفا وآخرون، 2020) ومثبط CAPN1 (Ma وآخرون, 2020 ).

الشكل 5. تغيرات وفرة واستقرار 2D-TPP تكشف عن أهداف مضيفة ذات صلة وظيفيًا أثناء عدوى SARS-CoV-2

  1. تم زعزعة استقرار بروتينات الصدمة الحرارية ، HSP90AA1 و HSP90AB1 ، حراريًا أثناء عدوى SARS-CoV-2 لخلايا Caco-2 (قطع دائرية ، الجانب الأيسر (ن = 3) انظر الشكل 1 أ لأسطورة الحبكة الدائرية). يتم تمثيل التغيرات الكبيرة في البروتين (الوفرة والاستقرار الحراري) كمخططات دائرية للبروتينات الفردية ، كما هو موضح سابقًا (Becher وآخرون، 2018). تتوافق الدائرة الداخلية مع وفرة البروتين وتتوافق الدائرة الخارجية مع تغيرات الاستقرار الحراري (ن = 3). تشير النجمة إلى تنظيم مهم (انظر المواد والطرق).
  2. مثبط HSP90 المقابل ، Tanespimycin ، قمع بشكل فعال انتشار SARS-CoV-2 (ن = 2). تم تحضين خلايا Calu-3 مسبقًا بالمركب ، متبوعًا بإضافة SARS-CoV-2 وحضانة مشتركة لاحقة في وجود المركب لمدة 20-24 ساعة. تم قياس الحمل الفيروسي بالتوازي باستخدام الكشف المعتمد على الجسم المضاد للحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة (البرتقالي). تم تقييم السمية المركبة في خلايا Calu-3 (أرجوانية) تمت معالجتها بالمركب وحده لمدة 20-24 ساعة.
  3. زاد هيدروكسيلاز أريل هيدروكربون (CYP1A1) بكثرة بين 4 و 12 ساعة بعد الإصابة ثم تم تقليله بين 24 و 48 ساعة بعد الإصابة (مخطط دائري ، يسار ، (ن = 3) انظر الشكل 1 أ لأسطورة الحبكة الدائرية). المخططات الدائرية المعروضة كما هو موضح في اللوحة "أ" تشير العلامة النجمية إلى تنظيم مهم (انظر المواد والطرق).
  4. قام مثبط CYP1A1 بقمع انتشار SARS-CoV-2 (ن = 2). تم إجراء منحنيات الجرعة والاستجابة كما هو موضح في الشكل 4 أ. انظر الملحق الشكل S7 للأدوية الإضافية المختبرة. يتم عرض البيانات كما هو موضح في (ب).

اقترح عدم الاستقرار الحراري الشامل والمتسق للمرافقين المشاركين في طي البروتين غير المطوي تحولًا عالميًا في مشاركتهم مع بروتينات العميل غير المكشوفة (الشكل 2 ب). قد يكون هذا بسبب الزيادة الكبيرة في إشغال المرافق بأحجام كبيرة من ركائز البروتين الفيروسي غير المطوية ، والتي قد تترجم إلى تحول يمكن اكتشافه في الاستقرار الحراري للمرافق. لقد تحققنا من الأهمية الوظيفية لزعزعة الاستقرار الحراري HSP90AA1 و HSP90AB1 (الشكل 5 أ) باستخدام مثبط انتقائي تانيسبيمايسين ، والذي أدى بكفاءة إلى قمع تكاثر الفيروس عند تركيزات منخفضة من الميكرومولار (EIC).50

2 ميكرومتر) التي لم تكن سامة للخلايا البشرية (الشكل 5 ب). بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا زيادة واضحة في وفرة CYP1A1 بين 4 و 12 ساعة بعد الإصابة ، والتي أعقبها انخفاض قوي بين 24 و 48 ساعة بعد الإصابة (الشكل 5C). ومن المثير للاهتمام ، أن العلاج باستخدام مثبط CYP1A1 الانتقائي ، rhapontigenin ، قمع تكاثر SARS-CoV-2 داخل نطاق الميكرومولار (EIC50

مجتمعة ، توضح هذه النتائج أن التغييرات في وفرة البروتين أو الاستقرار الحراري يمكن أن تشير إلى أهداف جزيئية لتثبيط تكاثر الفيروس. يوضح هذا فائدة TPP للكشف عن مسارات المضيف ذات الصلة بالعدوى ، والتي يمكن أن تسرع في تحديد العلاجات المحتملة المضادة للفيروسات.


المناقشة والاستنتاج

مسترشدين بدراسات الكيمياء الطبية السابقة حول SC1M Pro ، قمنا بتصميم وتصنيع عدد من مثبطات ثنائي الببتيدل وثلاثي ببتيدل القائمة على أوبال والتي تثبط بشكل فعال SC2M Pro ، وهو إنزيم أساسي لـ SARS-CoV-2 ، الممرض لـ COVID-19. باعتباره المانع الأكثر فاعلية لـ SC2M Pro ، أظهر MPI3 IC50 قيمة 8.5 نانومتر. بقدر ما نعلم ، هذا هو أدنى مستوى تم الإبلاغ عنه50 لمثبطات SC2M Pro المعروفة. أثناء البحث عن الظروف المثلى لـ IC50 التوصيفات ، لاحظنا أن 10 نانومتر كان أقل تركيز SC2M Pro يمكن أن يوفر نشاطًا موثوقًا به. 11 ج لتوصيف كأنا قيمة المانع ، كم يجب تحديد قيمة الركيزة المستخدمة. الركيزة التي استخدمناها لتوصيف المثبط لها تسلسل مثل Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans. عند تركيز إنزيم ثابت عند 20 نانومتر ، كان معدل انقسام الركيزة متناسبًا تقريبًا مع تركيز الركيزة المضافة حتى 200 ميكرومتر (الشكل S2). فوق 200 ميكرومتر ، كان للركيزة تأثير تبريد كبير ولم تكن قابلة للذوبان بشكل جيد. بناءً على نتائجنا ، فإن كم القيمة حوالي 422.4 ميكرومتر. بناء على هذا العزم كم القيمة، كأنا لجميع مثبطات يتم حسابها وعرضها في الشكل 2B. كشف تحليل علم البلورات بالأشعة السينية لمجمع SC2M − MPI3 أن MPI3 يناسب بدقة جيوب الربط P1 و P2 في موقع SC2M Pro النشط (معرف PDB: 7JQ0). تستلزم تفاعلات van der Waals القوية في جيوب الربط P1 و P2 ، وتسعة روابط هيدروجينية مع بقايا الموقع النشط ، والتفاعل التساهمي مع C145 تقاربًا كبيرًا من MPI3 إلى SC2M Pro. لم يتم تحديد مجموعة السد N-terminal الخاصة بـ MPI3 والمثبطات الأخرى بشكل جيد في الهياكل البلورية ، مما يشير إلى حجم غير مناسب لهذه المجموعة أو نمط غير محكم نسبيًا في جيب ربط P4. تحسين الحجم أو تفاعل البروتين الرابط لإدخال تفاعل أقوى بين ligand و SC2M pro في هذا الموقع من شأنه أن يساهم في توليد مثبطات أكثر فاعلية في المستقبل. على الرغم من أن MPI3 هو أقوى مثبط للإنزيم ، إلا أن نشاطه الخلوي في تثبيط SARS-CoV-2 أقل بكثير من العديد من المثبطات الأخرى التي أنشأناها. السبب المحتمل هو استقرارها الخلوي المنخفض. يحتوي MPI3 على Leu و Val في مواقع P2 و P3 على التوالي. كلاهما من الأحماض الأمينية التي تحدث بشكل طبيعي والتي من المتوقع أن تكون مستهدفة من قبل كل من البروتياز خارج الخلية والخلوية. نظرًا لأن Leu و Val عبارة عن بقايا مثالية في موقعين ، فإن التغييرات المتواضعة بناءً على هذه الهياكل ستكون ضرورية لكل من الحفاظ على الفاعلية العالية في تثبيط SC2M Pro وتحسين الاستقرار الخلوي لتعزيز النشاط الخلوي في تثبيط الفيروس. على هذا النحو ، يجب استكشاف نظائر Val و Leu في هذين الموقعين. نظرًا لأن كلا من MPI5 و MPI8 يظهران نشاطًا عاليًا لمكافحة SARS-CoV-2 في كل من خلايا Vero E6 و ACE2 + A549 ولكل منهما Cha في موقع P2 ، فإننا نقترح الحفاظ على Opal و Cha في مواقع P1 و P2 وتغيير البقايا في P3 و جزء السد N-terminal لتحسين النشاط المضاد لـ SARS-CoV-2 في الخلايا. استنادًا إلى هياكل مجمعات SC2M Pro التي تحتوي على سبعة مثبطات ، يشغل P1 Opal على وجه التحديد جيب الربط P1 في SC2M Pro وثلاثة روابط هيدروجينية مع Opal lactam amide ضرورية في الحفاظ على ارتباط قوي بـ SC2M Pro. تعد المساحة الكيميائية لمعالجة بقايا P1 في المانع لتحسين الارتباط بـ SC2M Pro ضئيلة. لكن أحد الاتجاهات التي يمكن استكشافها هو إدخال ذرة (ذرات) غير متجانسة إضافية إلى الأوبال لتشكيل رابطة (روابط) هيدروجينية مع السلسلة الجانبية N142 am-ID. في مجمع SC2M Pro −MPI3 ، تنقلب السلسلة الجانبية N142 بحوالي 180 درجة من موقعها في الإنزيم لتشكيل جيب مغلق P1 ملزم. ومع ذلك ، فإن تفاعلات van der Waals مع Opal فقط هي التي تشارك في N142. بالنظر إلى المسافة القريبة بين سلسلة أوبال الجانبية وسلسلة أميد الجانبية لـ N142 ، قد يتم تصميم بعض روابط الهيدروجين لتحسين الفاعلية. في جميع مثبطاتنا المصممة ، يشارك الأوبال ألدهيد في تكوين تفاعل تساهمي مع C145. هذا التصميم ، على الرغم من أنه ضروري لتشكيل مركب تساهمية نصفي ، إلا أنه يستبعد بشكل فعال استكشاف موقع ربط P3 في SC2M Pro لتحسين الفاعلية في مثبط مصمم. يوضح الشكل 4 د أن جيب ربط P3 فارغ تمامًا. في مناقشتنا المبكرة ، ناقشنا أنه من الأهمية بمكان الحفاظ على رابطة الهيدروجين بين أكسجين الأميد المقصي في الركيزة و SC2M Pro من أجل التقارب العالي. يعد تغيير الأميد المقصي إلى ألدهيد في مثبط فعالًا في الحفاظ على رابطة الهيدروجين ويسمح بالتفاعل التساهمي مع C145. تساهم رابطتان هيدروجينيتان تتشكلان بين كحول نصفي و SC2M Pro في الفعالية العالية لهذه المجموعة من الجزيئات.

في دراستنا ، لا يرتبط نشاط مكافحة SARS-CoV-2 المستند إلى الخلايا لمثبطاتنا المصممة مع IC الخاص بهم50 القيم في تثبيط SC2M Pro. هذا متوقع نظرًا لأن الاستقرار الخلوي والميزات الأخرى لهذه المثبطات مختلفة تمامًا. ومع ذلك ، فإن المعلومات المتعلقة بكل من تثبيط الإنزيم IC50 القيم والنشاط المضاد لـ SARS-CoV-2 أمر بالغ الأهمية لتصميم جيل جديد من المثبطات التي تقدم أداءً ممتازًا في كلا الجانبين. بالنظر إلى أن MPI3 قد وصل بالفعل إلى IC متناهي الصغر أحادي الرقم50 القيمة و MPI5 و MPI8 يظهران فاعلية عالية في تثبيط SARS-CoV-2 ، سيؤدي دمج ميزات الجزيئات الثلاثة إلى مثبطات ذات فاعلية قصوى في تثبيط الفيروس. أشارت فحوصاتنا المضادة للفيروسات إلى أن أداء MPI5 و MPI8 كان أفضل بكثير من GC376 و 11 أ، اثنان من الجزيئات التي تم استكشافها من أجل COVID-19 الاختبارات السريرية والسريرية. هذان الجزيئان جاهزان للتحليل قبل السريري الذي نستكشفه بنشاط. لاحظنا في فحوصاتنا المضادة للفيروسات أن MPI5 و MPI8 يتمتعان بفاعلية أعلى بكثير في خلايا A549 / ACE2 مقارنة بخلايا Vero E6. يحتوي هذان الخطان من الخلايا على بروتينات بروتياز مضيف مختلفة. من المحتمل أن يقوم MPI5 و MPI8 بتثبيط بعض البروتياز المضيف الذي يخدم وظائف حرجة في دخول SARS-CoV-2 إلى الخلايا المضيفة وتكرارها وبالتالي يمارسان تثبيطًا مختلفًا لـ SARS-CoV-2.


مناقشة

تحمل الأنشطة الكيميائية الحيوية والخصائص الهيكلية لمجال PLpro لبروتين SARS-CoV-2 الأساسي nsp3 وعودًا هائلة كهدف لتوليد فئة جديدة من مضادات الفيروسات لفيروسات كورونا. الركائز الثلاث المتميزة لـ PLpro ، وهي البروتينات الفيروسية المتعددة ، وإشارات Lys48-polyubiquitin المتحللة ، وإشارات ISG15 المضادة للفيروسات ، تجعل من PLpro مرشحًا ممتازًا للتدخل الدوائي.

معًا ، تؤكد تحليلاتنا البيوكيميائية والهيكلية والطفرية أنه أولاً ، يتم توفير تفضيل ISG15 من خلال موقع ربط SARS2 PLpro S1 Ub / Ubl ، والذي يربط بشكل تفضيلي ISG15 CTD من خلال وضع الربط التفاضلي مقارنةً بـ يوبيكويتين. ثانيًا ، يستخدم PLpro موقع ربط S2 لتوفير خصوصية رائعة لـ polyubiquitin المرتبط بـ Lys48. Monoubiquitin هو ركيزة رديئة مقارنة بـ ISG15 ، ولكن بمجرد تمديده عبر روابط Lys48 يصبح ركيزة مناسبة. مجتمعة ، تجعل ميزات PLpro هذه إنزيمًا تفضيليًا ISG15 (بواسطة

18 ضعفًا) ، يمكن أيضًا أن يشق بوليوبيكويتين المرتبط بـ Lys48 ، ولكن من غير المرجح أن يزيل تعديلات مونوبيكويتين. تتوافق هذه النتائج مع التحليلات والتركيبات البيوكيميائية التي تم الإبلاغ عنها مؤخرًا والتي تم الإبلاغ عنها مؤخرًا بواسطة مختبر Pegan (Freitas) وتشرحها ميكانيكيًا. وآخرون، 2020) ، مختبر ديكيك (شين وآخرون، 2020) ، ومختبر Olsen (نسخة أولية: Rut وآخرون, 2020 ).

بالنظر إلى الوفرة النسبية لتعديلات يوبيكويتين و ISG15 في الخلايا ، فإن الاختلاف في النشاط قد يضمن أن إشارات ISG15 الأقل وفرة بكثير يتم قطعها على خلفية سلاسل Lys48-ubiquitin الوفيرة للغاية. في الواقع ، يُظهر البروتياز الفيروسي الآخر مثل Lbpro لـ FMDV (فيروس مرض الحمى القلاعية) تفضيل ISG15 أكثر وضوحًا (Swatek وآخرون، 2018). حتى داخل فيروسات كورونا ، تختلف أنشطة ISG15 و ubiquitin وأنماط الربط بين السارس و MERS [انظر المناقشة في الشكل EV2 ، وأيضًا (Freitas وآخرون, 2020 )].

يستهدف Lys48 polyubiquitination الأكثر شيوعًا البروتينات لتحلل البروتوزومال ويلعب أدوارًا مهمة في مسارات الالتهاب. تشير العديد من الدراسات إلى SARS PLpro في هذه المسارات ، ومع ذلك ، فإن معظم PLpro أو nsp3 السريع في عزلة. قد تكون الوظيفة الإضافية لـ PLpro هي تثبيت مجمع النسخ المتماثل الفيروسي الذي يعد nsp3 جزءًا منه ، ويبدو من المعقول أن PLpro قد يعمل على الحفاظ على Lys48-polyubiquitin المتماثل خاليًا.

على الرغم من دور ISG15 كإشارة مضادة للفيروسات ، فإن مساهمتها في الإشارات الالتهابية ، أو دور PLpro في شقها ، ليست مفهومة جيدًا. من المتوقع أن يقيد موقع PLpro داخل nsp3 (والنسخ المتماثل) نصف قطر عمله مقارنةً بـ PLpro أو nsp3 المعزول ، مما يزيد من تعقيد تفسير دراسات التعبير خارج الرحم. يمكن أن تكون إعادة تكوين النسخة المتماثلة ، بالاقتران مع طفرات فصل الوظيفة المحددة هنا ، مفيدة في الدراسات المستقبلية التي تشريح مساهمات نشاط PLpro تجاه ISG15 مقابل Lys48-polyubiquitin أثناء العدوى الفيروسية.

بغض النظر عن النشاط المنخفض لـ PLpro تجاه اليوبيكويتين ، نظهر أنه يمكن تطوير شاشة قوية عالية الإنتاجية لـ SARS2 PLpro باستخدام ubiquitin-rhodamine. هذا جنبًا إلى جنب مع رؤيتنا الهيكلية يمهد الطريق نحو اكتشاف الأدوية الموجهة بالبنية. في الواقع ، في حين أن الأدوية المعتمدة سريريًا التي تم اختبارها هنا قد لا تكون مناسبة لاستهداف PLpro (الشكل 4) ، فإن مركبات الرصاص غير المكررة دوائيًا متاحة بالفعل لاستهداف SARS2 PLpro على وجه التحديد (الشكل 5). نوضح أن أحدث مركبات أدبيات SARS PLpro ، ولا سيما rac5c ، لها فعالية مضادة للفيروسات وتبدو قوية مثل الأدوية التي تستهدف التكاثر الفيروسي (مثل مثبط البوليميراز الفيروسي Remdesivir) ، في الأنظمة القائمة على الخلية التي تم اختبارها. سيتعين على الدراسات المستقبلية تقييم استقلاب الدواء والحركية الدوائية والفعالية المركبة في الجسم الحي.

كانت النتيجة المهمة المحتملة هي التثبيط الملحوظ بوساطة rac5c لانقسام nsp3-GFP في الخلايا. في هذا الإعداد ، ينتج عن إنشاء بروتين nsp3 كامل الطول الموسوم مجال PLpro بموقع واحد لتحليل البروتين ، وسيحتاج PLpro إلى القطع مرة واحدة فقط لتحرير العلامة (أو ثلاث مرات في بيئة فيروسية ، لإنتاج بروتينات nsp1 و nsp2 و nsp3 - هذه أحداث أساسية لبناء التكرار الفيروسي). يختلف الانقسام الذاتي اختلافًا جوهريًا عن التحلل المائي لوبيكويتين أو تعديلات ISG15 التي ، بالمقارنة ، وفيرة ومتجددة باستمرار بواسطة الخلية المضيفة. كان من المشجع أن rac5c منع المعالجة الذاتية لـ nsp3-GFP لأنه يشير إلى أن مثبط PLpro يمكن أن يستهدف التكاثر الفيروسي بشكل مباشر وفعال. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن يتم استكمال هذه التأثيرات المضادة للفيروسات المباشرة لمثبطات PLpro عن طريق قمع دور PLpro في تخريب الجهاز المناعي الفطري من خلال تداخله مع الخلية المضيفة ISG15 وإشارات اليوبيكويتين. قد تكون مثبطات PLpro مفيدة أيضًا في إعادة (و / أو إعادة التوازن) لاستضافة عمليات المناعة الفطرية التي تم تحريرها مرضيًا في COVID-19.


كيف يختلف البروتياز المثبط بواسطة lopinavir في SARS-CoV-2 مقارنةً بـ SARS-CoV؟ - مادة الاحياء

خلفية: منذ إدخال فيروس SARS-CoV-2 إلى العالم في ديسمبر 2019 ، لم يتم اعتماد أي أدوية أو ثبت فعاليتها في علاج هذا الوباء. لوبينافير هو مثبط للبروتياز لفيروس نقص المناعة البشرية يتم دمجه مع ريتونافير لزيادة نصف عمره. تمت دراسة هذا المزيج من الأدوية أيضًا في مرض الالتهاب الرئوي الحاد (سارس) ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (ميرس) وأظهر نتائج واعدة. هذا يجعلها هدفًا بحثيًا لـ COVID-19. ينتظر الكثير منا علاجًا يعمل ضد SARS-CoV-2 ويريدون بشدة / يحتاجون إلى علاج آمن وفعال. في هذا المنشور ، قام المؤلفون بتقييم فعالية وسلامة لوبينافير ريتونافير عن طريق الفم من أجل عدوى السارس- CoV-2 في المرضى البالغين في المستشفى مع COVID-19 الوخيم.

ورق: كاو ب وآخرون. تجربة Lopinavir-Ritonavir على البالغين في المستشفى المصابين بفيروس COVID-19 الشديد. NEJM 2020. [Epub Ahead of Print]

السؤال السريري: هل يؤدي الجمع بين لوبينافير-ريتونافير + الرعاية القياسية إلى تقليل وقت التحسن السريري لدى المرضى المصابين بعدوى COVID-19 الشديدة مقارنة بالرعاية القياسية وحدها؟

ماذا فعلوا:

  • تجربة معشاة بشكل فردي ومضبوطة ومفتوحة التسمية تشمل مرضى بالغين في المستشفى مصابين بعدوى مؤكدة بفيروس SARS-CoV-2 ، وتشبع O2 94٪ أثناء تنفس الهواء المحيط أو نسبة P / F تبلغ 300mmHg
  • تمت الدراسة في ووهان ، الصين
  • تم توزيع المرضى بشكل عشوائي على:
    • التدخل: Lopinavir-ritonavir 400mg / 100mg BID for 14d + Standard Care
    • التحكم: الرعاية القياسية وحدها
    • لا يوجد دعم للأكسجين
    • دعم الأكسجين بقنية أو قناع أنفي
    • دعم الأكسجين مع HFNC
    • دعم الأكسجين مع NIV
    • دعم الأكسجين مع التهوية الغازية بما في ذلك ECMO

    النتائج:

    • ابتدائي: الوقت المستغرق في التحسين السريري (يُعرَّف بأنه الوقت من التوزيع العشوائي إلى إما تحسين نقطتين على مقياس ترتيبي من سبع فئات أو الخروج من المستشفى ، أيهما يأتي أولاً)
    • مقياس ترتيبي من 7 نقاط
      • 1 = عدم دخول المستشفى مع استئناف الأنشطة العادية
      • 2 = لم يدخل المستشفى ولكن غير قادر على استئناف الأنشطة العادية
      • 3 = في المستشفى ، لا يحتاج إلى أكسجين إضافي
      • 4 = في المستشفى ، وتتطلب أكسجين إضافي
      • 5 = في المستشفى ، تتطلب علاجًا بالأكسجين عالي التدفق للأنف ، NIV ، أو كليهما
      • 6 = دخول المستشفى ، يتطلب ECMO ، تهوية ميكانيكية غازية ، أو كليهما
      • 7 = الموت
      • الحالة السريرية كما تم تقييمها بمقياس ترتيبي من سبع فئات في اليومين 7 و 14
      • 28d معدل الوفيات
      • مدة التهوية الميكانيكية
      • مدة مكوث الناجين في المستشفى
      • الوقت (بالأيام) من بدء العلاج حتى الوفاة
      • النسبة مع الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بمرور الوقت
      • منطقة عيار الحمض النووي الريبي الفيروسي تحت المنحنى (AUC)
      • الأحداث الضائرة أثناء العلاج
      • أحداث سلبية خطيرة (فشل تنفسي أو ARDS ، AKI ، عدوى ثانوية ، صدمة ، فقر دم حاد ، التهاب المعدة الحاد ، GIB ، استرواح الصدر ، فقدان الوعي ، DIC ، تعفن الدم ، قصور القلب الحاد)
      • الأحداث الضائرة في الجهاز الهضمي (الغثيان والقيء والإسهال)
      • التوقف المبكر عن العلاج

      تضمين:

      • مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل الموجب للنسخ العكسي (RT-PCR)
      • المرضى البالغين الذين تقل أعمارهم عن 18 عامًا
      • تم تأكيد الالتهاب الرئوي عن طريق تصوير الصدر
      • تشبع الأكسجين ≤94٪ على هواء الغرفة
      • نسبة P / F 300mmHg

      استبعاد:

      • قرار الطبيب بأن المشاركة في التجربة لم تكن في مصلحة المريض
      • وجود أي شرط لا يسمح باتباع البروتوكول بأمان
      • حساسية معروفة أو فرط حساسية تجاه لوبينافير ريتونافير
      • مرض الكبد الحاد المعروف (مثل تليف الكبد ، مع ALT و GT5x الحد الأعلى للنطاق الطبيعي)
      • استخدام الأدوية التي يتم بطلانها مع lopinavir-ritonavir ولا يمكن استبدالها أو إيقافها خلال الفترة التجريبية
      • حمل
      • الرضاعة الطبيعية
      • عدوى فيروس العوز المناعي البشري المعروفة (بسبب المخاوف بشأن تطوير مقاومة لوبينافير-ريتونافير إذا تم استخدامه دون التمشيط مع مضادات الفيروسات القهقرية الأخرى)
      • غير قادر على ابتلاع تلقي الدواء من خلال أنبوب NG

      نتائج:

      • خضع 199 مريضا التوزيع العشوائي
        • كان متوسط ​​العمر 58 عامًا (المدى من 49 إلى 68)
        • كان متوسط ​​الفترة الزمنية بين ظهور الأعراض والعشوائية 13 يومًا (النطاق 11 إلى 16 د)

        • ارتبط علاج التدخل في غضون 12 يومًا بعد ظهور الأعراض بوقت أقصر للتحسين السريري (HR 1.25 95٪ CI ، 1.77 to 2.05)
          • كان هذا هو البيان في 18 مارس 2020 و # 8230 ولكن في 26 مارس 2020 و # 8230
          • علاج التدخل في غضون 12 يوم بعد ظهور الأعراض لم يكن يرتبط بوقت أقصر للتحسين السريري (HR 1.25 95٪ CI 0.77 to 2.05)

          • لم يكن علاج التدخل و gt12d بعد ظهور الأعراض مرتبطًا بوقت أقصر للتحسين السريري (HR 1.30 95٪ CI 0.84 إلى 1.99)
          • لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في مدة العلاج O2 ، ومدة الاستشفاء ، والوقت من التوزيع العشوائي حتى الوفاة
          • لم يكن هناك فرق بين المجموعات في أحمال الحمض النووي الريبي الفيروسي بمرور الوقت
          • تم إيقاف التدخل في وقت مبكر في 13 مريضا (13.8 ٪) بسبب الأحداث السلبية
          • كانت النسب المئوية للمرضى المصابين بالفيروس القابل للاكتشاف متشابهة في نقاط زمنية مختلفة

          نقاط القوة:

          • أول دراسة منشورة تطرح سؤالًا مهمًا سريريًا بخصوص علاج COVID19
          • لتقليل تحيز التخصيص ، أجرى المؤلفون إخفاء التخصيص حتى انتهاء التوزيع العشوائي
          • تم الحصول على عينات البلعوم الأنفي لجميع المرضى الـ 199 الذين كانوا لا يزالون على قيد الحياة في كل نقطة زمنية
          • استخدم تحليل النية إلى العلاج والذي يشمل جميع المرضى الذين تم اختيارهم عشوائيًا بغض النظر عن انتهاكات البروتوكول التي تشبه الممارسة السريرية
          • تم تقييم وقت التحسن السريري بعد وصول جميع المرضى إلى اليوم 28 مع الفشل في الوصول إلى التحسن السريري أو الوفاة قبل اليوم 28
          • أجرى تحليل نية إلى علاج معدل استبعد أيضًا ثلاث حالات وفاة مبكرة
          • لا توجد فروق بين المجموعات في التركيبة السكانية أو الاختبارات المعملية الأساسية أو توزيع درجات المقياس الترتيبي أو درجات NEWS2 عند التسجيل

          محددات:

          • لم يتلق 5 مرضى (5٪) في مجموعة التدخل أي جرعات من التدخل (توفي 3 منهم في 24 ساعة) وتم تضمينهم في تحليل نية العلاج مما قد يؤدي إلى تحيز النتائج لصالح الرعاية المعيارية
          • لم يتضمن التحليل الإحصائي شرطًا لتصحيح تعدد الاختبارات للنتائج الثانوية أو النتائج الأخرى ، لذلك لم يتم تعديل عروض فترات الثقة لهذا الغرض. بسبب هذا الثقة لا ينبغي استخدام فترات الثقة لاستنتاج آثار العلاج النهائية
          • تم إعطاء الجلوكوكورتيكويدات الجهازية في 33.0٪ من المرضى في مجموعة lopinavir-ritonavir وفي 35٪ من المرضى في مجموعة الرعاية القياسية. من المفترض أن المنشطات يمكن أن تطيل التكاثر الفيروسي مما قد يؤثر على نتائج هذه الدراسة
          • بدت المجموعة الضابطة أكثر مرضًا سريريًا من مجموعة التدخل التي تحتوي على المزيد من عوامل ضغط الأوعية (27.0٪ مقابل 17.2٪) ، وأكثر من NIV (19.0٪ مقابل 10.1٪) ، والمزيد من RRT (6.0٪ مقابل 3.0٪). قد يؤدي هذا إلى تحيز النتائج لصالح التدخل
          • تم أخذ عينات الحمض النووي الريبي الفيروسي بشكل متقطع ، وقد يكون أخذ العينات الأكثر تكرارًا قد وفر مزيدًا من المعلومات حول حركية الحمل الفيروسي في المجموعتين
          • تم استخدام عينات مسحة الحلق لاختبار الأحمال الفيروسية التي قد تكون السبب في عدم وجود اختلاف في الأحمال الفيروسية. ثبت أن مسحات الحلق تحتوي على حمولات فيروسية أقل من عينات البلعوم الأنفي.
          • تجربة غير معماة ، مما يجعل من الممكن أن تكون معرفة مهمة العلاج قد أثرت على اتخاذ القرارات السريرية التي يمكن أن تؤثر على النتيجة الأولية
          • كان لدى مجموعة lopinavir-ritonavir أحمال فيروسية أعلى قليلاً في الحلق مما قد يثير مشكلة تكاثر الفيروس بشكل أكبر
          • استخدام القشرانيات السكرية في ثلث المرضى ، والذي من المعروف أنه يزيد من تساقط الفيروس

          مناقشة:

          • فرق اليوم 8 هو فارق زمني طويل إلى حد ما للتحسين السريري. جانبا ، دواء أوسيلتاميفير ، الذي يستخدم للإنفلونزا ، لديه تحسن في الأعراض لمدة نصف يوم أو يوم كامل. قد تكون هذه التجربة قد تم إعدادها للفشل من خلال البحث عن اختلاف 8 أيام في التحسين السريري
          • بسبب الطبيعة الطارئة للتجربة ، لم يتم تحضير الدواء الوهمي لوبينافير ريتونافير
          • كان التسجيل المخطط لـ 160 مريضًا ، ولكن بعد التقييم ، تقرر أن التجربة كانت ضعيفة وتم اتخاذ قرار بمواصلة التسجيل من قبل المحققين ، ولكن أصبح دواء آخر محتمل ، وهو remdesivir متاحًا للتجارب السريرية ، لذلك تم تعليق التسجيل بعد تجنيد 199 مريضًا للتوزيع العشوائي
          • أظهر تحليل لاحق أنه إذا تم إعطاؤه مسبقًا (& lt12d) ، فقد أدى lopinavir-ritonavir إلى تقليل معدل الوفيات بشكل عام. إن مسألة ما إذا كان علاج لوبينافير-ريتونافير السابق في COVID-19 يمكن أن يكون له فائدة سريرية هو سؤال افتراضي في هذا الوقت
          • ومن المثير للاهتمام ، هناك اكتشاف آخر جدير بالذكر ، وهو أن المرضى الذين يتلقون lopinavir-ritonavir لديهم حالات أقل من AKI والالتهابات الثانوية.
          • مدفون في الملحق هو التوزيع النسبي للمرضى على مقياس ترتيبي من فئة 7. يبدو أن شدة المرض كانت أكبر في المرضى الذين عولجوا فقط بالرعاية القياسية على مدى 28 يومًا

          • يُعتقد أن تركيز lopinavir-ritonavir اللازم للعمل ضد SARS-C0V-2 مرتفع جدًا ولكنه كان منخفضًا إلى حد ما في هذه الدراسة. This would need to be balanced with the potential side effects that would be increased for higher doses or longer regimens that patients may not tolerate.

          Author Conclusion: “In hospitalized adult patients with severe COVID-19, no benefit was observed with lopinavir-ritonavir treatment beyond standard care. Future trials in patients with severe illness may help to confirm or exclude the possibility of a treatment benefit.”

          Clinical Take Home Point: This was a very sick population with a 25% mortality rate in the control group and it could be that the patients recruited were late in the infection process therefore already having significant lung damage that was irreversible regardless of treatment. Despite the overall negative bottom line of this trial, which may be due to a rather large time difference in improvement of clinical symptoms (8d), there are some very promising results that will require further study including 28 mortality, median ICU length of stay, and percentage of patients with clinical improvement at 14d.

          مراجع:

          1. Cao B et al. A Trial of Lopinavir-Ritonavir in Adults Hospitalized with Severe COVID-19. NEJM 2020. [Epub Ahead of Print]

          For More Thoughts on This Topic Checkout:

          Post Peer Reviewed By: Anand Swaminathan, MD (Twitter: @EMSwami)


          شكل 1

          Figure 1. Crystal structure of SARS CoV-2-PLpro (Protein Databank (PDB) 6W9C)(6) represents three domains: (A) putative labile Zn-binding domain Zn (gray ball) is coordinated with four Cys residues (C189، ج192، ج224, and C226 are shown by stick), (B) catalytic domain (Cys111–His272–Asp286 triad is shown by sphere with color code C: light gray, O: red, N: blue, and S: yellow), and (C) ubiquitin domain.

          In viral PLpro, the conserved cysteine residue serves two roles: (1) structural role by binding the Zn II ion (that induces the correct protein folding and stabilizes the local geometry) and (2) catalytic role by nucleophilic attack on substrate, leading to the structure/function of PLpro. Therefore, ejection of Zn II ion from the putative labile Zn site and/or blocking of the Cys residue at the catalytic site of CoV-2 PLpro are potential antiviral therapies which may lead to dysfunction of CoV-2 PLpro and thereby retard viral replication. However, no registered drugs or therapies agents targeting CoV-2 PLpro are on the market yet. Using the above guidelines, the initial step is to identify potential thiol-reacting inhibitors from marketed drugs, which can covalently bind conserved Cys residues in CoV-2-PLpro to yield a Cys–inhibitor complex(7) (Figure 2), which ultimately inactivates the CoV-2-PLpro activity, resulting in interference of the virus replication. Various categories of inhibitors as Zn-ejectors are reported. The most common category of Zn-ejectors is soft electrophiles, disulfide-based thiol-reacting inhibitors such as disulfiram (DSF). DSF, a clinically safe, FDA-approved drug to treat chronic alcohol dependence, has been extensively studied in cell cultures against other viruses, including HIV-1, HCV, MERS, and SARS, for ejection of Zn II from PLpro.(8,9) As both CoV-2-PLpro and CoV-PLpro share ∼83% of their genome sequence(10) and have similar structures,(6) DSF may likely to be considered as a potential Zn-ejector drug against CoV-2-PLpro.(7) Recently, Sargsyan et al.(11) reports that DSF shows dual functions, Zn-ejector as well as cysteine modifier drug, against CoV-2 PLpro, leading to the loss of structure/function of CoV-2-PLpro and thereby inhibiting virus replication in vitro. This result raises interest in the use of other sulfur-based drugs against COVID-19 illness. Varieties of sulfur-based FDA-approved drugs are in line for testing of COVID-19, such as diethyldithiocarbamate (DDC), captopril, 2,2′-dithiodipyridine, 2,2′-dithiobis(benzothiazole), 6-thioguanine (6-TG), and so on. For instance, Swaim et al.(12) report that 6-TG strongly inhibits the enzyme activity of CoV-2-PLpro and thereby halts CoV-2 replication in cell cultures at submicromolar concentrations. In addition, a metallothiol-based drug, auranofin, an FDA-approved drug to treat rheumatoid arthritis, can strongly inhibit replication of COV-2 in human cells, even at low micromolar levels.(13)


          Effects of Asthma and Human Rhinovirus A16 on the Expression of SARS-CoV-2 Entry Factors in Human Airway Epithelium

          The factors that facilitate and impact transmission of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) are not well understood, particularly in children and young adults. It has been established that the S (Spike) protein of SARS-CoV-2 binds to ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2) as the entry receptor and employs the serine protease TMPRSS2 for proteolytic separation of the S protein subunits, termed “S protein priming,” which is necessary for membrane fusion (1). ACE2 و تمبرس 2 are expressed in ciliated epithelial cells of the upper and lower airway where the initial transmission of the virus likely occurs and are expressed at high concentrations on pneumocytes in the distal lung (2). Although the upregulation of this system serves as a potential mechanism to facilitate viral entry and thus transmission, there is also evidence that upregulation of ACE2 may decrease the severity of the disease (3, 4). Thus, we questioned whether asthma, which is the most prevalent chronic medical condition in children and young adults, or respiratory viral infection, which serves as a common trigger for asthma in this population, alters the expression of either ACE2 أو تمبرس 2. Infections with major serotype rhinovirus, including human rhinovirus-A16 (HRV-A16) are responsible for the majority of HRV infections in children and young adults. For other respiratory viruses, it has been established that heterologous viral infection can alter the susceptibility and immune response to a second respiratory viral insult (5).

          We initially examined the expression of the ACE2 و تمبرس 2 genes in epithelial brushings from a previously described cohort of individuals with and without asthma who were extensively characterized for airway hyperresponsiveness (AHR) and were not using controller therapy (6). We did not see any evidence of differential expression between subjects with asthma and healthy control subjects ( Figures 1A and 1C ), which is consistent with other emerging data (7). We did not detect any correlation between ACE2 expression and baseline lung function or direct AHR (data not shown). However, subjects with asthma defined by both a positive methacholine challenge (i.e., direct AHR) and indirect or endogenous AHR as determined by a dry air exercise challenge to assess exercise-induced bronchoconstriction (EIB+) were found to have higher concentrations of ACE2 expression in comparison with subjects with asthma without EIB (EIB−, Figure 1A ). There was also a modest association between ACE2 expression with the severity of EIB as determined by the area under the forced expiratory volume in 1 second (FEV1) versus 30 minutes postexercise challenge time curve (AUC30) ( Figure 1B ). In ptcontrast, the expression of تمبرس 2 correlated with lower baseline FEV1 ( Figure 1D ) and baseline FEV1/forced vital capacity (FVC) values (ص 2 = 0.31 ص = 0.006) but not direct or indirect AHR. We acknowledge the inherent limitations of this study and their impacts on our findings, particularly the small number of control subjects and the analysis of multiple subgroups.

          شكل 1. Epithelial brushings were obtained via bronchoscopy from the fourth- and fifth- generation airways from a cohort of individuals with and without asthma, and for those with asthma, with and without exercise-induced bronchoconstriction (EIB) (control, ن = 3 EIB−, ن = 9 EIB+, ن = 11). (أ و ج) ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2) expression (أ) و تمبرس 2 expression (ج) were quantified by normalized log2 counts. Median values with interquartile ranges are shown. ص values represent the result of a one-way ANOVA. There was a trend toward correlation between ACE2 expression and indirect or endogenous airway hyperresponsiveness as determined by the severity of EIB, defined by the area under the forced expiratory volume in 1 second (FEV1) versus 30 minutes postexercise challenge time curve (ب). (د) تمبرس 2 expression correlated with baseline FEV1. Linear regression lines are shown with the 95% confidence intervals as dotted lines. AUC30 = 30 minutes postexercise challenge time curve TMPRSS2 = transmembrane serine protease 2.

          We also examined the expression of ACE2 و تمبرس 2 في خارج الجسم الحي cultured lower airway epithelial cells (AECs) from children with and without asthma both at baseline and during infection with HRV-A16 for 48 hours (6). There were no significant differences in the age, sex, baseline FEV1, and fraction of exhaled nitric oxide between the groups, but the children with asthma had more airflow obstruction measured by the FEV1/FVC ratio (ص = 0.02), significantly higher total serum IgE concentrations (mean values of 381 vs. 16 kU/L ص = 0.01), and higher number of positive allergen-specific IgE titers on radioallergosorbent testing (mean values, 2.7 vs. 0 ص < 0.01) relative to healthy control children. We did not identify any difference in the baseline expression amount of ACE2 و تمبرس 2 between AECs cultured from children with asthma compared with healthy control children however, there was upregulation of both ACE2 و تمبرس 2 expression in response to infection with HRV-A16 in AECs from children with asthma and healthy control children ( Figures 2A and 2D ). We further confirmed these results using primary tracheal AECs from nondiseased donors to demonstrate increased expression of ACE2 ( Figure 2B ) and تمبرس 2 ( Figure 2E ) after infection with HRV-A16. Interestingly, the expression pattern of these genes differs after HRV-A16 infection, as تمبرس 2 expression increased at 4 hours postinfection and remained elevated at 72 hours ( Figure 2E ), whereas ACE2 expression was decreased at 4 hours but then increased at 48 and 72 hours after infection ( Figure 2B ). This suggests that changes in ACE2 و تمبرس 2 expression after HRV infection are regulated by different mechanisms. Rhinovirus infection is known to induce a type 1 and type III IFN response in airway epithelium (8), which prompted us to stimulate pediatric AECs with IFNβ1 and IFNλ2 and evaluate their effects on ACE2 و تمبرس 2 التعبير. We found IFNβ1 stimulation resulted in increased ACE2 expression, but IFNλ2 stimulation did not induce the expression of ACE2 ( Figure 2C ). There was no effect of either IFN on تمبرس 2 expression ( Figure 2F ).

          الشكل 2. (أ و د) RNA sequencing was performed on airway epithelial cells (AECs) obtained via blind bronchial epithelial brushings from intubated pediatric study subjects (healthy control subjects [HC], subjects with asthma [A], and all subjects [All]) and differentiated in organotypic cultures. ACE2 expression (أ) و تمبرس 2 expression (د) were quantified by normalized log2 counts both at baseline and after infection with human rhinovirus-A16 (HRV-A16) at 48 hours. Median values with interquartile ranges are shown. ص values comparing HC to A ± HRV-A16 represent the results of a two-way ANOVA. ص values comparing All ± HRV-A16 represent the results of paired t الاختبارات. (ب و ه) PCR analysis was performed on nondiseased lung transplant donor AECs differentiated in air–liquid interface organotypic cultures and exposed to HRV-A16. ACE2 (ب) و تمبرس 2 (ه) expression levels in comparison with the housekeeping gene HPRT were assessed at various time points after infection (ن = 4, each data point represents the mean of two PCR reactions). Mean values are shown with error bars representing the SE of the mean. ص values represent the result of one-way ANOVA. (ج و F) PCR analysis was performed on AECs from healthy control pediatric study subjects who were stimulated with IFNβ1 (1 ng/ml) and IFNλ2 (1 ng/ml) for 72 hours. ACE2 (ج) و تمبرس 2 (F) expression levels in comparison with the housekeeping gene GAPDH (ن = 4, each data point represents the mean of three PCR reactions) are shown. Mean values are shown with error bars representing the SE of the mean. ال ص value in ج is the result of a one-way ANOVA. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص & lt 0.001 ، و ****ص & lt 0.0001. Ctrl = control HPRT = hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase.

          Our findings demonstrate that HRV-A16 infection significantly upregulates the expression of the ACE2 و تمبرس 2 in epithelial cells and indicates ACE2 expression is regulated by IFNβ1. Major serotype rhinoviruses are among the most common respiratory viral infections in children and young adults (9, 10), and upregulation of ACE2 and TMPRSS2 on AECs with symptomatic infection or asymptomatic harboring of rhinovirus could impact transmission of SARS-CoV-2 through our communities. Studies of the original SARS coronavirus suggested that the virus itself decreased ACE2 expression and that the upregulation of ACE2 may be protective for severe disease in mice (3, 4). We expand on recently published studies that have demonstrated ACE2 is an IFN-stimulated gene (11–13) by specifically exploring the roles of IFNβ1 and IFNλ2, which are known to be induced in the airway epithelium in response to rhinovirus infection and evaluated effects on both ACE2 و تمبرس 2. These results suggest that infection with major serotype HRVs could facilitate SARS-CoV-2 transmission and modulate disease severity through IFNβ1.

          Our results further refine the relationship between asthma and the expression of the ACE2 و تمبرس 2 in the airway epithelium by identifying relationships to AHR and lung function. Prior studies have found that individuals with asthma may have heightened susceptibility to HRV infection, and although خارج الجسم الحي infection with HRV-A16 upregulated ACE2 و تمبرس 2 expression, there was no specific effect of asthma status. Our findings are concordant with initial reports suggesting that asthma is not a major risk factor for severe disease (14), but little is known about how these factors affect transmission. Our results should spur additional studies that focus on risk factors involved in SARS-CoV-2 transmission, including the prevalence of asthma and the frequency of infection or coinfection with HRVs, particularly the timing of these factors in relation to community surges of coronavirus disease (COVID-19).


          شاهد الفيديو: Novel corona-virus- nCov-2019- Disease briefings (شهر نوفمبر 2022).