معلومة

كيفية تشغيل آجار جل الكهربائي في المنزل

كيفية تشغيل آجار جل الكهربائي في المنزل


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد بحثت في مواقع مختلفة تشرح كيف يمكنك بسهولة صنع مجموعة الرحلان الكهربائي للهلام في المنزل. لكنهم دائمًا ما يختبرون أصباغ الطعام المختلفة على هذه المجموعات المصنوعة منزليًا بدلاً من عينات الحمض النووي الفعلية. يمكن أيضًا استخراج الحمض النووي من المادة النباتية بسهولة في المنزل ، فلماذا لا يمكنك تشغيل هذا على العدة محلية الصنع؟


هناك عدة أسباب لعدم اقتراح ذلك عادة.

  • الحمض النووي نفسه غير مرئي (على الأقل ليس بالكميات التي يتم تشغيلها على الجل الخاص بك). أنت بحاجة إلى مركب (صبغة) يرتبط بالحمض النووي لجعله مرئيًا ، ولأنه يرتبط بالحمض النووي ، فإن معظم هذه المركبات مسرطنة. حتى إذا كنت تستخدم مثل هذه الصبغة ، فإن العديد منها لا يظهر إلا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، وهذا يمثل صعوبة إضافية. يمكنك أيضًا شراء صبغة آمنة تكون فعالة ومرئية ، لكن هذا يجعل التلطيخ أيضًا أكثر صعوبة. ستكون ألوان الطعام مرئية طوال الوقت ، بالفعل عند تشغيل الجل.

  • تعرض المواد الهلامية اللطيفة CSI التي تشاهدها على التلفزيون منتجات PCR (المفترضة) ذات تكرارات ترادفية قصيرة ، مما يمنحك فرقًا لطيفة على ارتفاعات مختلفة على الجل. هذه النطاقات لها أيضًا حجم مناسب للهلام الكهربائي. تحليل تقييد البلازميدات هو أيضًا شيء تراه كثيرًا ، وهنا أيضًا تتراوح القطع بين 100 و 10000 نقطة أساس. يتكون الحمض النووي المستخرج من النباتات من الحمض النووي الجيني ، والخيوط الضخمة (الملايين من أزواج القواعد) التي لن تعمل حقًا على هلام الاغاروز. إن الحصول على مجموعة مختارة من أجزاء الحمض النووي ذات الحجم المنفصل ليس بالأمر السهل حقًا في مطبخك ، ولهذا السبب يلجأون إلى صبغات الطعام.


لماذا يستخدم الاغاروز في الرحلان الكهربائي للهلام بدلا من الاجار؟

الاغاروز الكهربائي للهلام يفصل شظايا الحمض النووي حسب حجمها. التيار الكهربائي تستخدم لتحريك جزيئات الحمض النووي عبر هلام الاغاروز، وهي عبارة عن مصفوفة متعددة السكاريد تعمل كنوع من الغربال. تساعد المصفوفة على "التقاط" الجزيئات أثناء نقلها بواسطة التيار الكهربائي.

علاوة على ذلك ، هل Agar و agarose نفس الشيء؟ الفرق بين أجار وأغاروز. الفرق الرئيسي بين أجار و [اغروس) هل هذا هو أجار هي مادة هلامية يتم الحصول عليها من الطحالب الحمراء بينما الاغاروز هو بوليمر خطي منقى من أجار أو الأعشاب البحرية الحمراء. أجار و [اغروس) نوعان من منتجات السكاريد التي تأتي من الطحالب الحمراء أو الأعشاب البحرية.

ومن ثم هل يمكنني استخدام الاغاروز بدلا من الاجار؟

ان الاغاروز مع المجموعات منخفضة الشحن يفضل بشكل عام استعمال في الاغاروز الرحلان الكهربائي للهلام للأحماض النووية. كما أجار عبارة عن خليط معقد يحتوي على Agaropectin ، الذي يحتوي على مجموعات كبريتات وبيروفات ، أعتقد أنه يتفاعل مع الجزيئات الحيوية أكثر من الاغاروز.

مما يتكون الاغاروز الكهربائي للهلام؟

الهلام لفصل الحمض النووي في كثير من الأحيان مصنوع من عديد السكاريد يسمى الاغاروز، والتي تأتي على شكل رقائق جافة ومسحوق. عندما الاغاروز يسخن في محلول (ماء به بعض الأملاح) ويترك ليبرد ، سيشكل مادة صلبة إسفنجية قليلاً هلام.


المواد المطلوبة:

محاليل الاغاروز.
بروميد الايثيديوم.
العازلة الكهربائي.

الأحماض النووية وأليغنوكليوتيدات:

(عادةً ما يتم إنشاء عينات الحمض النووي ذات الحجم المعروف عن طريق هضم إنزيم مقيد لبلازميد أو دنا عاثيات من تسلسل معروف).
تعد المعدات والإمدادات اللازمة لإجراء عملية الفصل الكهربائي لجيل الاغاروز بسيطة نسبيًا وتشمل:

  • غرفة رحلان كهربائي ومصدر طاقة.
  • صواني جل الصب، والتي تتوفر بأحجام مختلفة وتتكون من بلاستيك شفاف للأشعة فوق البنفسجية.
  • عينة أمشاط ، حوله يتم سكب الاغاروز المنصهر لتكوين آبار عينة في الهلام.
  • العازلة الكهربائي ، عادة Tris-acetate-EDTA (TAE) أو Tris-borate-EDTA (TBE).
  • تحميل العازلة ، الذي يحتوي على شيء كثيف (مثل الجلسرين) للسماح للعينة بـ & quot ؛ & quot ؛ & quot ؛ & quot ؛ في آبار العينة ، وصبغة تتبع واحدة أو اثنتين ، والتي تهاجر في الهلام وتسمح بالمراقبة البصرية أو إلى أي مدى تقدم الرحلان الكهربائي.
  • بروميد الايثيديوم، صبغة فلورية تستخدم لتلوين الأحماض النووية.
  • ترانسيلومينيتور (صندوق ضوء فوق بنفسجي) ، والذي يستخدم لتصور الحمض النووي الملون ببروميد الإيثيديوم في المواد الهلامية.

ملاحظة: قم دائمًا بارتداء نظارات واقية عند مراقبة الحمض النووي على جهاز Transilluminator لمنع تلف العين من الأشعة فوق البنفسجية.

لهذا نأخذ 2 مل من محلول TAE في دورق مخروطي ونجعل الحجم يصل إلى 100 مل عن طريق إضافة 98 مل من الماء المقطر. حل العمل 1x هو 40 ملي أسيتات تريس / 1 مم EDTA

من المهم استخدام نفس الدفعة من محلول الرحلان الكهربي في كل من خزان الرحلان الكهربائي وإعداد الهلام.

لهذا عادة يضاف 2 جرام من الاغاروز إلى 100 مل من محلول الرحلان الكهربي.

تركيز الاغاروز في هلام (٪ [w / v])

نطاق الفصل من جزيئات الحمض النووي الخطية (كيلوبايت)


تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف ممكنة بسبب العديد من الأدوات المفيدة لمعالجة جزيئات الحمض النووي وتحويل الخلايا - بما في ذلك البلازميدات ، والإنزيمات المقيدة و DNA ligase. يقدم لك هذا المعمل تعريفًا بالبلازميدات والإنزيمات المقيدة ، بالإضافة إلى التقنية المعملية للرحلان الكهربائي للهلام. ستعرفك التجارب المعملية اللاحقة على أدوات التكنولوجيا الحيوية الأخرى.

أنزيمات التقييد (وتسمى أيضا نوكليازات تقييد) هي بروتينات تصنعها العديد من الأنواع البكتيرية ، للدفاع ضد الالتهابات الفيروسية. يتحرك كل إنزيم تقييد على طول جزيء الحمض النووي حتى يجد محددًا تسلسل التعرف في الحمض النووي. يقطع الإنزيم الحمض النووي مزدوج الشريطة ، مما يؤدي إلى شظايا الحمض النووي. تم اكتشاف أكثر من 3000 إنزيم تقييد يتعرف على متواليات متناظرة قصيرة (4-8 بي بي).

الشكل 1. تسلسل التعرف على إنزيم هند الثالث

يوضح الشكل 1 تسلسل التعرف على إنزيم التقييد Hind III. لاحظ أن تسلسل التعرف هو ملف متناظرة، ويقرأ نفس الانتقال للأمام وللخلف. يصنع إنزيم Hind III مذهول قطع من الحمض النووي ، وتنتج شظايا لها مناطق تقطعت بهم السبل واحدة تسمى & ldquosticky end & rdquo. يوضح الشكل 2 تسلسل التعرف على اثنين من إنزيمات التقييد الأخرى Sca 1 و Pst 1. يقوم الإنزيم Pst 1 بعمل قطع متقطع من الحمض النووي عند تسلسل التعرف عليه. لكن إنزيم التقييد Sca I يجعل a حاد قطع في تسلسل التعرف الخاص به لتوليد أجزاء من الحمض النووي بدون نهايات لزجة.

الشكل 2: مواقع التعرف على إنزيم التقييد.

تحتوي الخلايا البكتيرية على جميع جيناتها (الجينوم) في كروموسوم دائري واحد. لكن الخلايا البكتيرية يمكن أن تحمل أيضًا قطعًا غير أساسية من الحمض النووي تسمى البلازميدات. البلازميد عبارة عن دنا دائري صغير قادر على تكرار نفسه ، ويمكن أن يحمل بعض الجينات من خلية إلى أخرى. العلماء قادرون على تصميم البلازميدات المؤتلفة لنقل جينات معينة إلى الخلية المضيفة المستهدفة.

الشكل 3: خريطة البلازميد لـ pUC19.

تظهر الخريطة الجينية للبلازميد و ldquopUC19 & rdquo في الشكل 3. الحجم الإجمالي للبلازميد هو 2686 نقطة أساس. يوجد موقع التعرف على Pst I في الموضع 439 ، موقع التعرف Hind III في الموضع 447 ، وموقع التعرف Sca I في 2179. إذا تم استخدام إنزيم تقييد واحد لقطع البلازميد pUC19 ، فما الذي سيتم إنتاجه؟

حدد أجزاء الحمض النووي التي يتم إنتاجها عند استخدام إنزيمين مقيدين لقطع الحمض النووي للبلازميد pUC19.

قطع باستخدام إنزيمات تقييد

Sca I و Pst I

Sca I و Hind III

Pst I و Hind III

أحجام أجزاء الحمض النووي الناتجة


محتويات

Agarose gel عبارة عن مصفوفة ثلاثية الأبعاد تتكون من جزيئات agarose حلزونية في حزم فائقة الالتفاف تتجمع في هياكل ثلاثية الأبعاد مع قنوات ومسام يمكن للجزيئات الحيوية أن تمر من خلالها. [3] يتم تثبيت الهيكل ثلاثي الأبعاد مع روابط هيدروجينية وبالتالي يمكن أن يتم تعطيله بالتسخين مرة أخرى إلى الحالة السائلة. تختلف درجة حرارة الانصهار عن درجة حرارة التبلور ، اعتمادًا على المصادر ، تبلغ درجة حرارة هلام الاغاروز 35-42 درجة مئوية ودرجة حرارة الانصهار 85-95 درجة مئوية. تتوفر أيضًا agaroses منخفضة الانصهار ومنخفضة التبلور التي يتم إجراؤها من خلال التعديلات الكيميائية.

يحتوي Agarose gel على حجم مسام كبير وقوة جيدة للهلام ، مما يجعله مناسبًا كوسيط مضاد للتشنج للرحلان الكهربائي للحمض النووي وجزيئات البروتين الكبيرة. تم تقدير حجم المسام للهلام بنسبة 1٪ من 100 نانومتر إلى 200-500 نانومتر ، [4] [5] وتسمح قوته الهلامية بتخفيف المواد الهلامية بنسبة 0.15٪ لتشكيل لوح للهلام الكهربائي. [6] لكن المواد الهلامية منخفضة التركيز (0.1-0.2٪) هشة وبالتالي يصعب التعامل معها. يتمتع هلام Agarose بقدرة حل أقل من هلام بولي أكريلاميد للحمض النووي ولكن لديه نطاق فصل أكبر ، وبالتالي فهو يستخدم لشظايا الحمض النووي التي يتراوح حجمها عادة بين 50 و 20000 زوج قاعدي. يبلغ الحد الأقصى لاستبانة الرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز القياسي حوالي 750 كيلو بايت ، ولكن الدقة التي تزيد عن 6 ميغا بايت ممكنة باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام النبضي (PFGE). [7] يمكن استخدامه أيضًا لفصل البروتينات الكبيرة ، وهو المصفوفة المفضلة للهلام الكهربائي للجسيمات ذات نصف القطر الفعال الأكبر من 5-10 نانومتر. يحتوي هلام الاغاروز 0.9٪ على مسام كبيرة بما يكفي لدخول البكتيريا T4. [6]

يحتوي بوليمر الاغاروز على مجموعات مشحونة ، على وجه الخصوص البيروفات والكبريتات. [8] تخلق هذه المجموعات ذات الشحنة السالبة تدفقًا للماء في الاتجاه المعاكس لحركة الحمض النووي في عملية تسمى الانصمام الكهربي (EEO) ، وبالتالي يمكن أن تؤخر حركة الحمض النووي وتسبب ضبابية العصابات. المواد الهلامية عالية التركيز سيكون لها تدفق كهربي اندمائي أعلى. لذلك يفضل استخدام agarose منخفض EEO بشكل عام في الرحلان الكهربائي للهلام agarose للأحماض النووية ، ولكن يمكن استخدام agarose عالي EEO لأغراض أخرى. محتوى الكبريتات المنخفض من agarose منخفض EEO ، وخاصة نقطة الانصهار المنخفضة (LMP) ، مفيد أيضًا في الحالات التي يتم فيها استخدام الحمض النووي المستخرج من الجل لمزيد من التلاعب حيث قد يؤثر وجود كبريتات ملوثة على بعض الإجراءات اللاحقة ، مثل مثل الربط و PCR. ومع ذلك ، فإن agaroses الصفرية EEO غير مرغوب فيها لبعض التطبيقات حيث يمكن إجراؤها عن طريق إضافة مجموعات مشحونة إيجابياً ويمكن أن تؤثر هذه المجموعات على تفاعلات الإنزيم اللاحقة. [9] يعتبر التناضح الكهربي سببًا لاستخدام agarose في تفضيله على الأجار نظرًا لأن مكون agaropectin في الأجار يحتوي على كمية كبيرة من مجموعات الكبريتات والكربوكسيل ذات الشحنة السالبة. إن إزالة agaropectin في agarose يقلل بشكل كبير من EEO ، بالإضافة إلى تقليل الامتزاز غير النوعي للجزيئات الحيوية إلى مصفوفة الهلام. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض التطبيقات مثل الرحلان الكهربي لبروتينات المصل ، قد يكون من المرغوب فيه ارتفاع EEO ، ويمكن إضافة agaropectin في الهلام المستخدم. [10]

العوامل المؤثرة في انتقال الحمض النووي في هلام التحرير

يمكن أن يؤثر عدد من العوامل على هجرة الأحماض النووية: أبعاد مسام الهلام (تركيز الهلام) ، وحجم الحمض النووي الذي يتم نقله بالكهرباء ، والجهد المستخدم ، والقوة الأيونية للعازل ، وتركيز الصبغة المقحمة مثل بروميد الإيثيديوم إذا تم استخدامه أثناء الرحلان الكهربائي. [11]

تنتقل الجزيئات الأصغر بشكل أسرع من الجزيئات الأكبر في الهلام ، ويتحرك الحمض النووي مزدوج الشريطة بمعدل يتناسب عكسًا مع لوغاريتم عدد أزواج القواعد. ومع ذلك ، تنهار هذه العلاقة مع أجزاء كبيرة جدًا من الحمض النووي ، ويتطلب فصل أجزاء كبيرة جدًا من الحمض النووي استخدام المجال الكهربائي للهلام النبضي (PFGE) ، والذي يطبق تيارًا متناوبًا من اتجاهين مختلفين ويتم فصل أجزاء الحمض النووي الكبيرة أثناء إعادة توجيه نفسها باستخدام التيار المتغير. [12]

بالنسبة للرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز القياسي ، يتم حل الجزيئات الأكبر بشكل أفضل باستخدام هلام منخفض التركيز بينما تنفصل الجزيئات الأصغر بشكل أفضل في هلام عالي التركيز. ومع ذلك ، يتطلب الجل ذو التركيزات العالية أوقات تشغيل أطول (أحيانًا أيام).

قد تتأثر حركة الحمض النووي بتشكيل جزيء الحمض النووي ، على سبيل المثال ، عادةً ما يتحرك الحمض النووي الفائق الالتفاف أسرع من الحمض النووي المريح لأنه ملفوف بإحكام وبالتالي يكون أكثر إحكاما. في تحضير DNA البلازميد العادي ، قد توجد أشكال متعددة من الحمض النووي. [13] يُظهر الرحلان الكهربائي للهلام للبلازميدات عادةً الشكل الملفوف السالب باعتباره النطاق الرئيسي ، بينما يظهر الحمض النووي المكسور (شكل دائري مفتوح) والشكل الدائري المغلق المريح على شكل عصابات ثانوية. ومع ذلك ، فإن المعدل الذي تتحرك به الأشكال المختلفة يمكن أن يتغير باستخدام ظروف الرحلان الكهربائي المختلفة ، [14] وقد تتأثر حركة الحمض النووي الدائري الأكبر بشكل أقوى من الحمض النووي الخطي بحجم مسام الهلام. [15]

يمكن لبروميد الإيثيديوم الذي يتحول إلى دنا دائري أن يغير شحنة جزيء الحمض النووي وطوله وكذلك قوته الفائقة ، وبالتالي فإن وجوده في الهلام أثناء الرحلان الكهربائي يمكن أن يؤثر على حركته. على سبيل المثال ، يمكن أن تقلل الشحنة الموجبة لبروميد الإيثيديوم من حركة الحمض النووي بنسبة 15٪. [12] يمكن استخدام الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز لحل الحمض النووي الدائري باستخدام طوبولوجيا الالتفاف الفائق المختلفة. [16]

كما أن تلف الحمض النووي الناتج عن زيادة الارتباط المتبادل سيقلل أيضًا من هجرة الحمض النووي الكهربي بطريقة تعتمد على الجرعة. [17] [18]

يتناسب معدل هجرة الحمض النووي مع الجهد المطبق ، أي كلما زاد الجهد ، زادت سرعة تحرك الحمض النووي. ومع ذلك ، فإن دقة شظايا الحمض النووي الكبيرة تكون أقل عند الجهد العالي. قد يتغير تنقل الحمض النووي أيضًا في مجال غير مستقر - في حقل يتم عكسه بشكل دوري ، قد تنخفض حركة الحمض النووي بحجم معين بشكل كبير عند تردد دورة معين. [4] يمكن أن تؤدي هذه الظاهرة إلى انعكاس النطاق في الرحلان الكهربائي للهلام الانعكاسي (FIGE) ، حيث تتحرك شظايا DNA الأكبر بشكل أسرع من الأجزاء الأصغر.

الهجرة الشاذة تحرير

  • المواد الهلامية "Smiley" - يحدث تأثير الحافة هذا عندما يكون الجهد المطبق مرتفعًا جدًا بالنسبة لتركيز الهلام المستخدم. [19]
  • التحميل الزائد للحمض النووي - التحميل الزائد للحمض النووي يبطئ هجرة شظايا الحمض النووي.
  • التلوث - يمكن أن يؤثر وجود الشوائب ، مثل الأملاح أو البروتينات ، على حركة الحمض النووي.

آلية الهجرة والانفصال تحرير

تحرك الشحنة السالبة من العمود الفقري للفوسفات الحمض النووي تجاه القطب الموجب الشحنة أثناء الرحلان الكهربائي. ومع ذلك ، فإن هجرة جزيئات الحمض النووي في المحلول ، في حالة عدم وجود مصفوفة هلامية ، تكون مستقلة عن الوزن الجزيئي أثناء الرحلان الكهربائي. [4] [20] وبالتالي فإن مصفوفة الهلام مسؤولة عن فصل الحمض النووي حسب الحجم أثناء الرحلان الكهربائي ، وهناك عدد من النماذج لشرح آلية فصل الجزيئات الحيوية في مصفوفة الهلام. أحد النماذج المقبولة على نطاق واسع هو نموذج Ogston الذي يعامل مصفوفة البوليمر كمنخل. يتحرك بروتين كروي أو ملف عشوائي DNA عبر المسام المترابطة ، ومن المرجح أن يتم إعاقة حركة الجزيئات الأكبر وإبطائها بسبب الاصطدام بمصفوفة الهلام ، وبالتالي يمكن فصل الجزيئات ذات الأحجام المختلفة في عملية الغربلة هذه . [4]

ومع ذلك ، فإن نموذج Ogston ينهار للجزيئات الكبيرة حيث تكون المسام أصغر بكثير من حجم الجزيء. بالنسبة لجزيئات الحمض النووي التي يزيد حجمها عن 1 كيلو بايت ، فإن نموذج إعادة التكرار (أو متغيراته) هو الأكثر شيوعًا. يفترض هذا النموذج أن الحمض النووي يمكن أن يزحف بطريقة "تشبه الثعبان" (ومن ثم "التكرار") عبر المسام كجزيء ممدود. يتم تطبيق نموذج التكرار المتحيز عند شدة مجال كهربائي أعلى ، حيث يصبح الطرف المتقدم للجزيء متحيزًا بشدة في الاتجاه الأمامي ويسحب باقي الجزيء على طول. [21] ومع ذلك ، أظهر الفحص المجهري الفلوري في الوقت الحقيقي للجزيئات الملطخة ديناميكيات أكثر دقة أثناء الرحلان الكهربائي ، مع إظهار الحمض النووي مرونة كبيرة حيث يتمدد بالتناوب في اتجاه المجال المطبق ثم يتقلص في كرة ، أو يصبح مربطًا في على شكل حرف U عندما تعلق على ألياف البوليمر. [22] [23]

قد تختلف تفاصيل تجربة الرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز اعتمادًا على الطرق ، ولكن معظمها يتبع إجراءً عامًا.


في المرة القادمة

  1. خذ log10 من طول كل علامة وزن جزيئي يمكنك تحديدها على صورة هلام agarose. رسم السجل10 من طولهم على المحور ص مقابل المسافة التي هاجروا من البئر على المحور السيني ، مقاسة بالملم باستخدام المسطرة وصورة هلام الاغاروز الخاص بك. تم العثور على مثال على هذا الرسم البياني في مقدمة تجربة اليوم. استخدم معادلة الخط من الرسم البياني الخاص بك لتحديد حجم العمود الفقري M13KO7 الخاص بك (استخدم الشريط في الممر الذي قمت بتحميل الحمض النووي المقطوع فيه). كيف يقارن هذا القياس بالحجم المتوقع؟
  2. كم عدد اللويحات التي تتوقعها إذا قمت بطلاء 10 ميكرول من 10 -8 تخفيف من الملتهمة ، إذا كان عيار الملتهمة هو 10 12 من وحدات تشكيل البلاك / مل؟ كم عدد اللويحات التي تتوقعها إذا اختبرت مخزون العاثيات على سلالة DH5؟
  3. يستخدم oligonucleotide الذي تضيفه إلى p3 تقنيات الهندسة الوراثية التقليدية (& quotrecombinant & quot). هذه طرق قوية ودقيقة لنقل الجينات المفردة من كائن حي إلى آخر ولصنع منتجات بروتين كيميري مفيدة مثل تلك التي تعمل عليها الآن. البيولوجيا التركيبية هي طريقة جديدة لبرمجة الخلايا. يرجى قراءة واحد (أو أكثر!) من المقالات التالية ثم كتابة فقرة تستكشف شرعية العبارة التالية:
    • تاكر ، جوناثان ب. ، وريموند إيه زيلينسكاس. & quot The Promise and Perils of Synthetic Biology. & quot The New Atlantis ، Spring 2006.
    • ستون ، مارسيا. & quot إعادة تصميم الحياة لتلائم الحشد الهندسي. & quot Microbe ، خريف 2006.
    • مارجيت ، ب ، وآخرون. & quotBiology عن طريق التصميم: الحد من المكونات والسلوك الخلوي وتوليفها. & quot Journal of the واجهة المجتمع الملكي 4 لا. 15 (22 أغسطس 2007): 607-623. (بي دي إف)

سحابة بيضاء كبيرة في هلام أجار الكهربائي - (أبريل / 16/2012)

مرحبا للجميع. كنت أواجه مشكلة مع الرحلان الكهربائي خلال الأسبوعين الماضيين. تظهر سحابة بيضاء في أكثر من النصف العلوي من الجل كما هو موضح في الصورة. عادةً ما أصنع جل agarose بنسبة 2 ٪ باستخدام TAE 50x. أقوم بعمل مخزون 1500 مل وأستخدم 50 مل من هذا المحلول للجيل ، مع 3ul من Etrb (10 مجم / مل). أقوم بتحميل الآبار بـ 6ul (5uL dna و 1 uL من الصبغة) بالنسبة للسلم ، أستخدم 1 uL من الصبغة و 2 uL من السلم. لا أعلم ما الذي يجري بحق الجحيم. لقد قمت بتخفيض حمل Etrb إلى 3uL (قبل أن أستخدم 5uL) ، اشتريت صبغة جديدة ولكن المشكلة استمرت ، وحاولت أيضًا تغيير أوقات التعرض في جهاز ترانسيلومينيتور للأشعة فوق البنفسجية. قرأت أن هذا قد يكون بسبب تلوث الحمض النووي الريبي؟ لأنهم في بعض الأحيان يستخدمون هذا الجدول للحصول على الحمض النووي الريبي أيضًا. سيتم تقدير الاقتراحات بشكل كبير. شكرا جزيلا.

وهذا ما يسمى ظل الإيثيديوم ، وينتج عن هجرة بروميد الإيثيديوم في الاتجاه المعاكس للحمض النووي (أي نحو القطب الكهربي). يمكن إصلاحه عن طريق إضافة بروميد إيثيديوم إلى المخزن المؤقت أو عن طريق تلطيخ الجل بعد ذلك.

لاحظ أن EtBr يستخدم عادة بمعدل 0.5 ميكروغرام / مل وليس 20 ميكروغرام / مل الذي تستخدمه.

شكرا لك على إجابتك بوب ، قال لي شخص ما في مختبر آخر نفس الشيء. لا أفهم كيف ستحدث إضافة Etbr إلى TAE فرقًا. عادةً ما أقوم بصنع TAE ، ثم هلام agarose ، وضعه في الميكروويف 1.30 دقيقة (خذها كل 30 ثانية ورجها) وبعد ذلك ضع Etbr. أيضًا ، أستخدم 3 مايكرولتر من محلول 10 مجم / مل من EtBr ، هل تعتقد أنني أستخدم كمية سيئة؟

كان بوب يقول لإضافة EtBr إلى المخزن المؤقت في جهاز الجل الخاص بك ، بالإضافة إلى المخزن المؤقت المستخدم في صنع الجل. أنت فقط بحاجة إليه في القطب الموجب. يحل EtBr الموجود في المخزن المؤقت قيد التشغيل محل EtBr الذي ينتقل في الهلام.

شكرًا لك على النصيحة Phage ، أنا أحاول ذلك الآن ، سأقوم بالنشر إذا حصلت على نتائج أم لا لاحقًا ، شكرًا لك ، ماذا عن PCR ، هل يمكن أن يؤدي عدم تأقلم أوقات الدورة في PCR إلى هذا النوع من الصور لاحقًا؟

هذه هي الصورة التي حصلت عليها اليوم بعد إضافة EtBr في المخزن المؤقت قيد التشغيل وبعد أن صرخ مشرفي لي أن هذا قد يسبب السرطان للجميع في المختبر على الرغم من أنني غطيت الزجاج بشريط لاصق. أعتقد أنني أسيء تشغيل PCR آخر

نعم. أفضل بكثير. أنت تفرط في تحميل الكثير من الحمض النووي على الجل ، لكن من السهل إصلاح ذلك. من المحتمل ألا يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الخاص بك. أود أن أقول إن العصابات التي تراها من المحتمل أن تكون ثنائيات أولية ، أو ربما مجرد مواد أولية. أخبرنا بالمزيد عن تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل - القالب ، والبادئات ، والحجم المتوقع ، وظروف ركوب الدراجات ، والإنزيمات ، وكل شيء. ما السلم الذي تستخدمه؟

يعتقد مشرفك أن إضافة EtBr في المخزن المؤقت للدبابات سيؤدي إلى الإصابة بالسرطان؟

أين بالضبط يعتقد / تعتقد أن كل EtBr في المواد الهلامية يهاجر إلى أي حال؟ يمكنك محاولة (بلطف) الإشارة إلى أن جميع الخزانات ملوثة بالفعل بـ EtBr وبالتالي يجب التعامل معها دائمًا بالقفازات المناسبة على أي حال.

ناهيك عن أن هستيريا EtBr / السرطان هي رد فعل مبالغ فيه. لم أجد حتى الآن أي كتابات عن أي حالة واحدة من حالات السرطان تُنسب إلى EtBr (يسعدني تصحيح ذلك ، لكنني أشك في وجود أي شيء).


كيفية تشغيل آجار جل الكهربائي في المنزل - علم الأحياء

تقرير معمل الرحلان الكهربائي:

حساب حجم جزء من جزيئات الحمض النووي غير المعروفة

في هذا المعمل ، تم استخدام قاعدة الاغاروز السائلة لإنشاء قاعدة هلامية لإجراء الرحلان الكهربائي باستخدام خيوط مختلفة من الحمض النووي. يستخدم الرحلان الكهربائي للهلام لفصل الجزيئات الكبيرة إلى شظايا بناءً على حجمها. تم وضع عينات الحمض النووي في آبار هلام الاغاروز في النهاية السالبة ، ثم تم تشغيل تيار من خلالها ، مما تسبب في انتقال الحمض النووي بطول معين إلى الجانب الإيجابي من خلال الهلام اعتمادًا على حجمها. تم حساب النتائج عن طريق قياس المسافة التي قطعتها الخيوط خلال الهلام ، ثم رسم خريطة على الرسم البياني اللوغاريتمي.

الغرض من هذا المعمل هو استكشاف الرحلان الكهربائي ومعالجة الحمض النووي. في الأيام الأولى للعلم ، تم فصل الحمض النووي عن طريق الجاذبية ولكن في الخمسينيات من القرن الماضي اكتشف أوليفر سميثيز (سميثيز) الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي. تقوم هذه العملية بفرز شظايا الحمض النووي حسب الحجم باستخدام الكهرباء التي تمر عبر مصفوفة هلامية (بوين). يتكون الحمض النووي بأحجام مختلفة من خلال إنزيمات مقيدة ، وهي إنزيمات تقطع الحمض النووي إلى قطع أصغر بحيث يمكن تحليلها (بيرسون). بمجرد قطع الحمض النووي ، يتم تلطيخه ثم إدخاله في الآبار. عندما تتدفق الكهرباء ، يتم سحب الحمض النووي من الجانب السلبي إلى الجانب الإيجابي لأن الحمض النووي له شحنة سالبة (مكتبة الرسوم المتحركة في علم الأحياء). يتحرك الجزيء الأصغر بسهولة أكبر بينما تتحرك الجزيئات الأكبر بشكل أبطأ خلال الهلام. هذا يؤدي إلى جزيئات أصغر (وبالتالي الجزيء الذي تم قطعه بواسطة إنزيمات التقييد) تنتقل أكثر نحو القطب السالب (مكتبة الرسوم المتحركة البيولوجية). نحن نقوم بهذا المعمل لاختبار هذه العملية ومعرفة ما إذا كانت ناجحة. نظرًا لأنه تم إجراء ذلك عدة مرات بواسطة آلاف العلماء ، فإننا نفترض أننا سنكون قادرين على فصل أجزاء الحمض النووي من خلال الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي.

تم إجراء مختبرنا للفصل الكهربائي في 28 و 29 يناير من عام 2016 وتم كتابته بواسطة Pearson LabBench. بدأنا باستخدام الاغاروز السائل لصنع قاعدة هلامية لجزيئات الحمض النووي الخاصة بنا لتنتقل من خلالها ووضعنا مشطًا في الطرف السلبي لإنشاء آبار ستعمل لاحقًا كموقع لحقن الحمض النووي في الهلام. بمجرد التصلب ، قمنا بتغطية الجل في سائل مخزن مؤقتًا وسمحنا لعلبة الجل بالتبريد لمدة 24 ساعة. بعد فترة التبريد ، أزلنا المشط من الدرج لفضح سلسلة من الآبار المشكلة التي يمكننا فيما بعد حقن جزيئات DNA مجزأة فيها. قمنا بحقن الأشكال الخمسة التالية من الحمض النووي المجزأ: Lambda DNA و BamHI و EcoRI و Hindi III والتحكم (DNA غير المقسم.) ثم قمنا بغمر علبة الهلام بالمخزن وقمنا بتطبيق تيار ثابت 75V (الصورة على اليمين) لحوالي 15-20 الدقائق. ثم أوقفنا التيار وأزلنا الهلام وقمنا بقياس أي هجرات DNA حدثت ولاحظناها. تم وضع الصبغة على علبة الهلام للمساعدة في إبراز أي جزيئات DNA موجودة.


مسحوق Agarose ، TAE أو TBE ، بروميد إيثيديوم وصبغة زرقاء بروموفينول.

عجلة جل ، حجرة رحلان كهربائي ، مصدر جهد كهربائي ، صينية هلامية ، مشط ، فرن ، ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

الماصات ، الرؤوس ، الدورق ، موازنة الوزن.

يظهر التمثيل الافتراضي لمعدات الاغاروز الكهربائي للهلام أدناه ،

تمثيل رسومي لجهاز التفريد.


تحليل الحمض النووي الريبي على الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز غير المتحول

1. يوصى بشروط الرحلان الكهربائي للهلام التالية:

- استخدم محلول 1X TAE بدلاً من 1X TBE - استخدم هلام agarose بتركيز 1.1٪ -1.2٪ - أضف بروميد الإيثيديوم (EtBr) إلى المخزن المؤقت للهلام والرحلان الكهربي لتجنب الخطوة الإضافية (التي يحتمل أن تكون عرضة لـ RNAse) من تلطيخ الجل - استخدم دائمًا هلامًا جديدًا ومخزنًا مؤقتًا بالإضافة إلى معدات الرحلان الكهربي لتحليل الحمض النووي الريبي. قم بارتداء القفازات لحماية عينات الحمض النووي الريبي من التحلل بواسطة نوكليازات وتجنب ملامسة اليد لـ EtBr. - استخدام جهد تشغيل يصل إلى 10 فولت / سم (10 فولت لكل سم مسافة بين الأقطاب الكهربائية في الغرفة الكهربية). لا تستخدم الجهد العالي لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي أثناء الرحلان الكهربائي.

2. سخن قسامة من محلول الحمض النووي الريبي عند 70 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة وضعها على الجليد قبل تحميلها على مادة هلامية.

3. قم بتحميل كمية معروفة من سلم الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي جنبًا إلى جنب مع عينة الحمض النووي الريبي كمعيار لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي. يمكن تقدير تركيز الحمض النووي الريبي تقريبًا بافتراض أن كفاءة دمج EtBr في الرنا الريباسي هي نفسها بالنسبة للحمض النووي (يمكن اعتبار الحمض النووي الريبي جزيءًا مزدوج الشريطة بسبب بنيته الثانوية الواسعة).

4. أول علامة على تدهور الحمض النووي الريبي (RNA) على الهلام غير المتحول هو مسحة طفيفة تبدأ من نطاقات الرنا الريباسي وتمتد إلى منطقة الشظايا الأقصر. يظهر RNA هذا المدى من التدهور لا يزال جيدًا لمزيد من الإجراءات. ومع ذلك ، إذا كان التلطيخ الهابط واضحًا بحيث لا تحتوي نطاقات الرنا الريباسي على حافة سفلية يمكن تمييزها ، فيجب التخلص من هذا الحمض النووي الريبي.

تشير الخصائص التالية إلى تحضير ناجح للحمض النووي الريبي:

- بالنسبة للحمض النووي الريبي الكلي للثدييات ، يجب ملاحظة شريطين مكثفين مقابل مسحة ضوئية. تمثل هذه العصابات 28S و 18S rRNA. يجب أن تكون نسبة شدة هذه النطاقات حوالي 1.5-2.5: 1. يظهر بولي الثدييات السليمة (A) + RNA على شكل مسحة بحجم من 0.1 إلى 4-7 (أو أكثر) كيلو بايت مع نطاقات خافتة 28S و 18S rRNA.

- في حالة الحمض النووي الريبي من مصادر غير ثديية (نباتات ، حشرات ، خميرة ، برمائيات) ، قد لا تتجاوز مسحة mRNA الطبيعية على هلام الاغاروز غير المتحول طبيعة 2-3 كيلو بايت. علاوة على ذلك ، فإن الغالبية العظمى من اللافقاريات لديها 28 ثانية من الرنا الريباسي مع ما يسمى ب "الفاصل الخفي" (إيشيكاوا ، 1977). في بعض الكائنات الحية ، يكون التفاعل بين أجزاء الرنا الريباسي 28 ثانية ضعيفًا نوعًا ما ، لذا فإن التحضير الكلي للحمض النووي الريبي يُظهر نطاقًا واحدًا من الرنا الريباسي يشبه 18 ثانية حتى على مادة هلامية غير متغيرة الطبيعة. في الأنواع الأخرى ، يكون الرنا الريباسي 28s أكثر قوة ، لذلك لا يزال مرئيًا كفرقة ثانية.

ملحوظة: إذا كان RNA التجريبي الخاص بك أقصر من المتوقع و / أو متدهورًا وفقًا لبيانات الرحلان الكهربائي ، فقم بإعداد RNA جديد بعد التحقق من جودة كواشف تنقية RNA. إذا استمرت المشاكل ، فقد تحتاج إلى العثور على مصدر آخر للأنسجة / الخلايا. في بعض الحالات ، يتوفر الحمض النووي الريبي المتحلل جزئيًا فقط (مثل عينات الورم أو الأنسجة المعالجة بشدة). يمكن استخدام هذا الحمض النووي الريبي لإعداد (كدنا) ، لكن عينة (كدنا) ستحتوي على عدد مخفض من الجزيئات كاملة الطول.

مجموع الحمض النووي الريبي من الخلايا البشرية البطانية.

- بشكل عام ، لا يتجاوز تلوث الحمض النووي الجينومي الكمية التي تظهر على هلام الاغاروز / EtBr كحزمة ضعيفة ذات وزن جزيئي مرتفع. مثل هذا التلوث لا يؤثر على تخليق [كدنا]. لا ينصح بمعالجة الدناز لتحطيم الحمض النووي الجيني. في بعض الحالات ، يمكن إزالة الفائض من الحمض النووي الجيني عن طريق ترسيب LiCl أو عن طريق استخراج الفينول: استخلاص الكلوروفورم.


شاهد الفيديو: Gel electrophoresis (ديسمبر 2022).