معلومة

هل يمكن تقسيم الجين بين مواقع جينومية مختلفة عدة كيلوبايت؟

هل يمكن تقسيم الجين بين مواقع جينومية مختلفة عدة كيلوبايت؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل يمكن أن يكون لديك exons و introns من نفس الجين مفصولة بمئات كيلو بايت في الجينوم؟ إذا كان الأمر كذلك ، فكيف يتم تجميع الرنا المرسال الكامل في مثل هذه المسافة؟

أنا أعمل على نبات الميتوكوندريا ورأيت جينًا مشروحًا مقطوعًا بين جزء متميز جدًا من الجينوم.


نعم يمكن أن يكون لديك exons و introns من نفس الجين مفصولة بمئات (حتى آلاف!) من قواعد الكيلو.

فيما يلي مثال على الجينوم البشري: "في المتوسط ​​، هناك 8.8 exons و 7.8 introns لكل جين. حوالي 80٪ من exons على كل كروموسوم يكون طولها أقل من 200 زوج قاعدي. <0.01٪ من الإنترونات أقل من 20 زوجًا أساسيًا في الطول و <10٪ من الإنترونات يزيد طولها عن 11000 نقطة أساس."

المصدر: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15217358

بالنسبة لعملية الربط ، فهي ليست مشكلة في الواقع بالنسبة للمسافة. اسمحوا لي أن أعيد صياغة الأسئلة من خلال تحدي الافتراض الذي تقوم به: المسافات الطويلة في تسلسل تتوافق مع المسافة الطويلة في الفضاء.

في الواقع ، يمكن أن تحتوي جزيئات DNA / RNA على الكثير من البنية الثلاثية على سبيل المثال ، G الرباعية للحمض النووي ، وهيكل دبوس الشعر للحمض النووي الريبي.

المصدر: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/5d/ATPC_secondary_structure.jpg ">ShareImprove هذه الإجابةتم تحريره 22 مارس 2020 الساعة 10:50أجاب 22 مارس 2020 الساعة 9:48د. هـ. ليكترد. هـ. ليكتر6102 شارات فضية14 شارة برونزية

الفيروس المرتبط بالغدة

الفيروسات المرتبطة بالغدة (AAV) هي فيروسات صغيرة تصيب البشر وبعض أنواع الرئيسيات الأخرى. إنهم ينتمون إلى الجنس Dependoparvovirus، والتي بدورها تنتمي إلى الأسرة Parvoviridae. إنها فيروسات صغيرة (20 نانومتر) معيبة في النسخ المتماثل وغير مغلفة ولديها جينوم DNA أحادي الجديلة (ssDNA) بحوالي 4.8 كيلو قاعدة (kb). [1] [2]

لا يُعرف حاليًا أن AAV تسبب المرض. تسبب الفيروسات استجابة مناعية خفيفة للغاية. العديد من الميزات الإضافية تجعل من AAV مرشحًا جذابًا لإنشاء ناقلات فيروسية للعلاج الجيني ، ولإنشاء نماذج أمراض بشرية متجانسة المنشأ. [3] يمكن أن تصيب نواقل العلاج الجيني باستخدام AAV كلا من الخلايا المنقسمة والهادئة وتستمر في حالة خارج الصبغية دون الاندماج في جينوم الخلية المضيفة ، على الرغم من حدوث تكامل للجينات المحمولة بالفيروس في جينوم المضيف في الفيروس الأصلي. [4] يمكن أن يكون التكامل مهمًا لبعض التطبيقات ، ولكن يمكن أن يكون له أيضًا عواقب غير مرغوب فيها. أظهرت التجارب السريرية البشرية الحديثة التي تستخدم AAV للعلاج الجيني في شبكية العين نتائج واعدة. [5]


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو وصول كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


نتائج

تحليل الكروموسومات المحاكاة

يوفر ترجيح الطوبولوجيا ملخصًا إعلاميًا لبيانات الأنساب ويسلط الضوء على الاختلافات بين السيناريوهات المحاكاة (الشكل 2). كما هو موضح أعلاه ، هناك ثلاث طبولوجيا محتملة غير متجذرة للأصناف الأربعة. في السيناريو المحايد ، فإن الطوبولوجيا الأكثر انتشارًا ، <[(A ، B) ، C] ، D> ، والتي تعكس أوقات تقسيم السكان ، لديها متوسط ​​وزن 71٪ عبر الكروموسوم. الطبولوجيتان الأخريان كلاهما نادر إلى حد ما ، ولكن <[(B، C)، A]، D> أكثر شيوعًا في المتوسط ​​(17٪) من <[(A، C)، B]، D> (12٪) . هذا لأن الأول يمكن أن ينتج عن كل من تدفق الجينات وفرز النسب غير المكتمل (ILS) ، في حين أن الأخير يمكن أن ينتج فقط من ILS ، حيث لم يكن هناك هجرة محاكاة بين A و C أو بين B و D. في سيناريو الانطواء التكيفي ، الأوزان متشابهة جدًا مع السيناريو المحايد في المتوسط ​​، ولكن في وسط الكروموسوم هناك فائض قوي في الهيكل <[(B ، C) ، A] ، D> ، تم إنشاؤه عن طريق انتشار أليل مفيد من السكان C إلى B. أخيرًا ، في سيناريو Barrier Locus ، تؤدي الهجرة العالية من C إلى B إلى غمر الطوبولوجيا <[(B ، C) ، A] ، D> ، التي يبلغ متوسط ​​وزنها 65٪. ومع ذلك ، هناك ذروة واسعة في مركز الكروموسوم حيث لم تتآكل الطوبولوجيا المتفرعة للسكان <[(A ، B) ، C] ، D> ، بسبب التحديد الذي يحد من التقديم.

في عمليات المحاكاة المقابلة مع خمسة أصناف ، هناك 15 طبولوجيا تصنيفية محتملة (الشكل S7 في الملف S2). هناك تباين طوبولوجي أكبر بشكل عام ، حيث يوجد المزيد من الطرق التي يمكن أن يحدث بها الفرز غير الكامل. ومع ذلك ، تكتشف أوزان الهيكل بوضوح الاختلافات بين السيناريوهات ، وتسلط الضوء على الهياكل الأكثر وفرة بالإضافة إلى موقع الموقع المحدد (الشكل S7 في الملف S2).

استنتاج الأوزان من بيانات التسلسل المحاكاة

أعلاه ، قمنا بحساب الترجيحات مباشرة من سلاسل الأنساب المحاكاة ، لكننا قادرون أيضًا على إظهار أنه يمكن تقدير أوزان الهيكل بشكل موثوق عندما يتم استنتاج سلاسل الأنساب من بيانات التسلسل المحاكاة (الشكل 2D والشكل S7D في الملف S2). نظرًا لعدم معرفة سلاسل الأنساب ولا نقاط توقف إعادة التركيب التي يتم عندها تبديل علم الأنساب ، قمنا باختبار عدة طرق لاستنتاج سلاسل الأنساب لفترات ضيقة عبر الكروموسوم. أولاً ، أجرينا تحليلات طاقة مكثفة ، تغطي مجموعة من السيناريوهات الديموغرافية وتصميمات العينات ، لاستكشاف العلاقة بين عدد تعدد الأشكال المستخدمة في استدلال الشجرة ودقة ترجيح الهيكل. عبر مجموعة السيناريوهات التي تم فحصها ، نجد حدًا منخفضًا ثابتًا لـ 50 SNPs لتحقيق دقة تصل إلى 90٪ (الشكل S4 والشكل S5 والشكل S6 في الملف S2). التركيز بشكل خاص على TISs (انظر أعلاه) لا يحدث فرقًا ملحوظًا ، ربما لأن معظم SNPs في عمليات المحاكاة لدينا هي معلومات مفيدة. تشير هذه الاختبارات أيضًا إلى أن الأشجار المرتبطة بالجوار توفر أوزانًا أكثر دقة من أشجار الاحتمالية القصوى ، بالإضافة إلى حساب أسرع بكثير (الشكل S4 والشكل S5 والشكل S6 في الملف S2).

ثم قمنا بتحليل الأشجار التي تم استنتاجها بحثًا عن نوافذ غير متداخلة عبر كروموسوماتنا المحاكية لإعادة التركيب. يعطي حجم النافذة الثابت 50 SNPs النتائج التي تقترب إلى حد كبير من الأوزان الحقيقية (الشكل 2D والشكل S7D في الملف S2). بالاتفاق مع تحليلات القوة لدينا ، مع & lt50 SNPs ، تكون التقديرات أقل دقة وتميل إلى التقليل من أهمية ترجيح الهيكل الأكثر انتشارًا (الشكل S8 والشكل S9 في الملف S2). من المتوقع أن تكون الأوزان التي تميل نحو القيم الوسيطة نظرًا لأن الأشجار الأساسية تصبح أقل دقة في حلها. ومن المثير للاهتمام ، أن نوافذ ≥ 100 SNPs تؤدي أيضًا إلى انخفاض الدقة ، ولكن مع الميل إلى المبالغة في تقدير الدعم للطوبولوجيا الأكثر انتشارًا والتقليل من الدعم للآخرين (الشكل S8 والشكل S9 في الملف S2). يمكن تفسير ذلك من خلال حقيقة أن النوافذ الكبيرة تضطر إلى المتوسط ​​فوق مناطق من أصل مختلف ، وبالتالي تفضل الإشارة الأكثر انتشارًا. لتأكيد هذه الفرضية ، كررنا محاكاتنا المحايدة باستخدام معدل إعادة تركيب سكانية أقل بمقدار 10 أضعاف. في مجموعة البيانات الجديدة هذه ، تعطي 100 نافذة SNP أدق الأوزان ، وحتى 200 نافذة SNP تتمتع بدقة عالية ، بينما تعمل 50 نافذة SNP بشكل أقل بشكل هامشي (الشكل S10 والشكل S11 في الملف S2).

لقد اختبرنا ما إذا كان يمكن استخدام bootstrapping على SNPs في كل نافذة للتحقق من دقة الأوزان الملحوظة. تميل أوزان Bootstrap إلى أن تكون متشابهة ولكنها أكثر تحفظًا بشكل هامشي ، مما يقلل من وزن الهيكل الأكثر انتشارًا (الشكل 2D). هذا لأن أشجار التمهيد تميل إلى أن تكون أقل دقة قليلاً ، مما يؤدي إلى مزيد من الأوزان الوسيطة. لذلك ، يعد Bootstrapping وسيلة مفيدة لاختبار قوة الدعم لتحقيق ذروة ملحوظة في ترجيح طوبولوجيا معينة. ومع ذلك ، نظرًا لكون التمهيد متحفظًا بطبيعته ، لن يكون التمهيد قادرًا على تحديد ما إذا كان الترجيح الوسيط المرصود دقيقًا أو مجرد نتيجة لشجرة تم حلها بشكل سيئ.

نظرًا لأن نقاط توقف إعادة التركيب الحقيقية لا تكون متباعدة بشكل متساوٍ ، فقد اختبرنا أيضًا طريقتين يتم من خلالهما استنتاج حدود النافذة من البيانات نفسها. في نهجنا الأول ، استخدمنا الحزمة R. GenWin (بيسينجر وآخرون. 2015) لتلائم خطًا سلسًا للأوزان من 10 نوافذ SNP وتحديد حدود النافذة المحتملة كنقاط انعطاف ، ثم الأشجار المستنبطة لمناطق النوافذ المحددة حديثًا. تتطابق أوزان الهيكل الناتجة مع الترجيحات الحقيقية بشكل جيد إلى حد ما ، ولكن ليس كذلك بالنسبة لنوافذ SNP 50 الثابتة (الشكل S12 والشكل S13 في الملف S2). كما هو مذكور أعلاه ، يبدو أن هذا يرجع إلى الاستدلال السيئ للشجرة في أصغر النوافذ. الطريقة الثانية تستخدم الطريقة ساجوارو (زماني وآخرون. 2013) ، والذي يجمع بين نموذج ماركوف المخفي وخريطة ذاتية التنظيم لاستنتاج كل من الأشجار وحدود النوافذ. يلخص هذا النهج بشكل سيء الترجيحات الحقيقية ، مما يبالغ في تقدير الدعم للطوبولوجيا الأكثر انتشارًا (الشكل S12 والشكل S13 في الملف S2). لذلك استخدمنا النوافذ الثابتة لـ 50 SNPs لجميع التحليلات الإضافية.

تختلف أطوال الفروع باختلاف أنواع الطوبولوجيا

يعتبر ترجيح الطوبولوجيا في الأساس طريقة وصفية ، لكن الترجيح يحمل معلومات يمكن أن تساعد في الاستدلالات حول تاريخ السكان. يوفر سيناريو Barrier Locus المحاكي (الشكل 2) حالة اختبار مثيرة للاهتمام. نظرًا للإشارة الهائلة للتقدم ، سيكون من الصعب معرفة الطوبولوجيا التي تتوافق مع ترتيب تفرّع السكان الحقيقي (بمعنى آخر.، شجرة الأنواع) إذا لم يكن هذا معروفًا. الطبولوجيا <[(B ، C) ، A] ، D> سائدة عبر معظم الكروموسوم ، ولكن <[(A ، B) ، C] ، D> منتشرة حول مركز الكروموسوم. تم اقتراح أنه يمكن تحديد ترتيب تفريع السكان الأصلي من خلال النظر في أطوال الفروع (Fontaine وآخرون. 2015 جانتي وآخرون. 2016). تميل الأصناف التي تتجمع معًا بسبب التقديم الأخير إلى أن تكون مفصولة بفروع قصيرة ، في حين أن تلك التي تتجمع وفقًا لترتيب تفريع السكان يجب أن يكون لها انقسامات أعمق. في الواقع ، في الأشجار التي تم استنتاجها من 50 نافذة SNP ، تشير مسافات الفروع الزوجية بين الأصناف إلى أن مطابقة الأشجار الفرعية <[(B ، C) ، A] ، D> تميل إلى الظهور مؤخرًا بين B و C (الشكل S14 في الملف S2) ، مما يعني ضمنيًا أن <[(أ ، ب) ، ج] ، د> هو ترتيب تفريع السكان الأكثر احتمالا.

تحليل البيانات الجينومية الحقيقية

ال نيوروسبورا تتكون مجموعة البيانات من أربعة أصناف (ثلاثة طوبولوجيا محتملة) وهي أبسط مجموعتي بيانات حقيقيتين تم تحليلهما (الشكل 3 و A و B). تم اختياره لاختبار مدى جودة تويست قادر على اكتشاف إشارة حدث التقديم التكيفي الموصوف سابقًا من ن. هيسبانيولا إلى N. tetrasperma أفراد أ نوع التزاوج (كوركوران وآخرون. 2016). يغطي هذا التقديم كامل المنطقة غير المدمجة (∼7 ميجا بايت) لمجموعة الربط I (LGI). في الواقع ، وجدنا تحولًا جذريًا في نمط أوزان الطوبولوجيا في الجزء المركزي من LGI (الشكل 3C). طوبولوجيا شجرة الأنواع (topo1) ، والتي تجمع الاثنين N. tetrasperma أنواع التزاوج كأقرب الأقارب ، منتشرة في معظم الجينوم ولكن لها وزن ضئيل للغاية في الجزء المركزي من LGI. بدلاً من ذلك ، يتم استبداله بـ topo3 ، الذي يجمع نوع التزاوج أ أفراد N. tetrasperma مع ن. هيسبانيولا. في مكان آخر ، يمتلك topo3 وزنًا محدودًا ، مطابقًا تقريبًا لذلك الخاص بـ topo2 ، ويتوافق مع مستوى منخفض من ILS في جميع أنحاء الجينوم. ومع ذلك ، تُظهر منطقة مجموعة الربط IV أيضًا تحولًا ضعيفًا في الدعم نحو topo3 ، مما قد يعكس إشارة إدخال منفصلة تتضمن عددًا صغيرًا من التسلسلات.

نيوروسبورا التحليلات. (أ) شجرة الأنواع المفترضة. لاحظ أن نوع التزاوج أ و أ أفراد N. tetrasperma تُعرض كفروع منفصلة ، بينما في الواقع ، وبصرف النظر عن منطقة عدم الاتحاد من LGI ، تمثل هذه العينات مجموعة سكانية واحدة مُعاد توحيدها. التقديم المفترض من ن. هيسبانيولا إلى N. حصيرة تتراسبيرما أ الأفراد (كوركوران وآخرون. 2016) يشار إليه بسهم. (ب) طبولوجيا الأصناف الثلاثة المحتملة لهذه الأصناف الأربعة. (C) أوزان الطوبولوجيا لـ 50 إطارًا من SNP تم رسمها عبر جميع مجموعات الربط السبع ، مع تجانس اللوس (الامتداد = 500 كيلو بايت). تُظهر المخططات العلوية والسفلية نفس البيانات ، مرسومة على أنها مكدسة أو كخطوط منفصلة ، على التوالي.

ال Heliconius تمثل مجموعة البيانات حالة اختبار أكثر تعقيدًا وخماسية الأصناف. تشتمل الأصناف الخمسة على مجموعة خارجية واثنين من أزواج من الأصناف المتعاطفة وغير الشريكة ، والتي من المعروف أن تدفق الجينات يحدث بينهما (الشكل 4 أ). من بين 15 طوبولوجيا محتملة (الشكل 4 ب) ، النوعان الأكثر شيوعًا عبر هذه الكروموسومات هما topo3 و topo6. يتوافق topo3 مع ترتيب تفرع الأنواع المقبول ، والذي يتم فيه التباين H. ج. شيونيوس و H. ت. ثيلكسينوي هي أصناف شقيقة بينما topo6 مجموعات السكان حسب الجغرافيا ، بما يتفق مع تدفق الجينات بين الأنواع في كل من بنما وبيرو. السابق هو الأكثر انتشارًا في جميع أنحاء كروموسوم Z (الشكل 4C). على النقيض من ذلك ، فإن طوبولوجيا الأنواع لها ترجيح متغير عبر الكروموسوم 18 ، ويتم تفوقها في الأماكن حسب الطوبولوجيا المتوافقة مع تدفق الجينات (topo4 و topo5 و topo6 و topo11 و topo14). على وجه الخصوص ، هناك ذروة قوية في منطقة اوبتكس بالنسبة لـ topo11 ، الذي يجمع الأصناف حسب نمط الجناح ، ويتوافق مع الإدخال التكيفي الموصوف سابقًا لأليل النطاق الأحمر بين H. م. أمارلس و H. ت. ثيلكسينوي في بيرو (باردو دياز وآخرون. 2012 The Heliconius Genome Consortium 2012). يُظهر التكبير على هذه الذروة كتلة واضحة تبلغ 150 كيلو بايت يتم ترجيح طوبولوجيا التقديم عليها بدرجة عالية (الشكل S15 في الملف S2). تتضمن هذه الكتلة المنطقة التنظيمية المصب من اوبتكس من المعروف أنه يتحكم في تباين نمط الجناح في هذه الأنواع (باكستر وآخرون. 2010 والبانك وآخرون. 2016). أربعة طوبولوجيا أخرى تتطابق جزئيًا مع ترتيب تفرع الأنواع (topo1 و topo2 و topo10 و topo15) لها أوزان معتدلة في كل مكان ، في حين أن الهياكل المتوافقة مع لا شجرة الأنواع ولا تدفق الجينات (topo7 و topo8 و topo9 و topo12) منخفضة الأوزان ، خاصة عبر كروموسوم Z ، مما يعني أن ILS أقل من الكروموسوم 18.

Heliconius التحليلات. (أ) شجرة الأنواع المفترضة. تشير الأسهم المظللة إلى التدفق الجيني المستمر بين الأصناف المتعاطفة وغير الشقيقة في بنما وبيرو على التوالي (Martin وآخرون. 2013). يشير السهم الأحمر الصلب إلى التداخل التكيفي المفترض للأليل ذي نمط الجناح الأحمر بالقرب من الجين اوبتكس (باردو دياز وآخرون. 2012 The Heliconius Genome Consortium 2012). (ب) طبولوجيا التصنيف المحتملة الخمسة عشر لهذه الأصناف الخمسة. (C) أوزان طوبولوجيا لـ 50 نافذة SNP مرسومة عبر الكروموسومات 18 و 21 (Z) ، مع تجانس اللوس (امتداد = 500 كيلو بايت). تُظهر المخططات العلوية والسفلية نفس البيانات ، مرسومة على أنها مكدسة أو كخطوط منفصلة ، على التوالي. موقع اوبتكس على الكروموسوم 18 بخط رأسي متقطع.


التعبير والتوقيعات الطفرية

يمكن قياس الاختلافات العالمية في الأنماط الطفرية باستخدام تواقيع الطفرات ، والتي تحدد العمليات الطفرية الخاصة بنسيج المنشأ والتعرض البيئي 19. ومع ذلك ، فإن استخراج التواقيع الطفرية عملية إحصائية جوهرية تتطلب شرحًا توضيحيًا وظيفيًا لاحقًا. أجرينا تحليل ارتباط شامل للسرطان بين التواقيع الطفرية على مستوى الجينوم ومستويات التعبير الجيني لفك تشفير العمليات الجزيئية التي تصاحب وجود التواقيع الطفرية.

لقد نظرنا في 28 توقيعًا طفريًا مشتقًا باستخدام عامل مصفوفة غير سالب لترددات الطفرات الخاصة بالسياق 9. اختبرنا الارتباط بين انتشار التوقيع في المتبرعين والتعبير الجيني الكلي ، مع مراعاة العبء الطفري الكلي ، ونوع السرطان ، وغيرها من عوامل الإرباك التقنية والبيولوجية. حدد هذا 1،176 جينًا مرتبطًا بتوقيع واحد على الأقل (FDR 10 ٪) (بيانات موسعة الشكل 10 ، الجدول التكميلي 19).

لقد درسنا 18 توقيعًا مع 20 أو أكثر من الجينات المرتبطة لمزيد من الشرح (البيانات الموسعة الشكل 11) وقمنا بتقييم الإثراء باستخدام فئات GO 20 ومسارات Reactome 21. وجدنا أنه تم إثراء 11 توقيعًا لفئة واحدة على الأقل (FDR 10٪) (الجدول التكميلي 19) ، مما يكشف عن ارتباطات تتفق مع المسببات المرضية المعروفة وغير المعروفة (الشكل 1 د). على سبيل المثال ، التوقيع 38 ، المرتبط بالتوقيع المتعارف عليه للأشعة فوق البنفسجية 7 (ص 2 = 0.375, ص = 5 × 10 −40) (البيانات الموسعة الشكل 11 ج) ، كان مرتبطًا بعمليات الميلانين (الشكل 1 د). يتسبب تخليق الميلانين في الإجهاد التأكسدي للخلايا الصباغية 22 ، ووجدنا التوقيع 38 مرتبطًا بالجين المؤكسد المعزز للإجهاد TYR 23 (ص = 1.0 × 10 4). السمة المميزة لـ 38 جينًا هي طفرات C & gtA ، وهي منتج نموذجي لأنواع الأكسجين التفاعلية 24. يشير هذا إلى أن التوقيع 38 قد يلتقط تلف الحمض النووي الناجم بشكل غير مباشر عن الضرر التأكسدي المستحث بالأشعة فوق البنفسجية بعد التعرض المباشر لأشعة الشمس 25 ، مع TYR كوسيط محتمل للتأثير.


محتويات

تم حل التسلسل الكامل لجينوم HIV-1 ، المستخرج من الفيروسات المعدية ، إلى تحليل أحادي النوكليوتيدات. [6] يشفر جينوم فيروس نقص المناعة البشرية عددًا صغيرًا من البروتينات الفيروسية ، مما يؤدي دائمًا إلى إنشاء روابط تعاونية بين بروتينات فيروس نقص المناعة البشرية وبين فيروس نقص المناعة البشرية والبروتينات المضيفة ، لغزو الخلايا المضيفة واختطاف أجهزتها الداخلية. [7] يختلف فيروس نقص المناعة البشرية في هيكله عن الفيروسات القهقرية الأخرى. فيروس نقص المناعة البشرية هو

قطرها 100 نانومتر. تتكون منطقتها الأعمق من لب مخروطي الشكل يتضمن نسختين من جينوم ssRNA (المعنى الإيجابي) ، والإنزيمات المنتسخة العكسية ، و إنزيم الإنزيم البروتيني ، والبروتياز ، وبعض البروتينات الثانوية ، والبروتين الأساسي الرئيسي. [8] يشفر جينوم فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) 8 بروتينات فيروسية تلعب أدوارًا أساسية خلال دورة حياة فيروس نقص المناعة البشرية. [7]

يتكون HIV-1 من نسختين من الحمض النووي الريبي أحادي الجديلة غير المترابط وغير المرتبط بشكل إيجابي ، ومحاطة بقفيصة مخروطية مكونة من البروتين الفيروسي p24 ، النموذجي للفيروسات البطيئة. [9] [10] نسختان من خيوط الحمض النووي الريبي (RNA) مهمتان في المساهمة في إعادة تركيب HIV-1 ، والذي يحدث أثناء النسخ العكسي لتكاثر الفيروس. إن احتواء نسختين من الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة داخل فيريون ولكن إنتاج فيروس واحد فقط من الحمض النووي يسمى pseudodiploidy. [11] مكون الحمض النووي الريبي هو 9749 نيوكليوتيد طويل [12] [13] ويحمل غطاء 5 بوصات (Gppp) ، وذيل 3 بوصات بولي (A) ، والعديد من إطارات القراءة المفتوحة (ORFs). [14] يتم ترميز البروتينات الهيكلية الفيروسية بواسطة ORFs طويلة ، في حين أن ORFs الأصغر تشفر منظمات دورة الحياة الفيروسية: التعلق ، واندماج الغشاء ، والتكاثر ، والتجميع. [14]

يرتبط الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة ارتباطًا وثيقًا ببروتينات p7 nucleocapsid ، وبروتين التجميع المتأخر p6 ، والإنزيمات الأساسية لتطوير الفيريون ، مثل النسخ العكسي والانكريز. Lysine tRNA هو التمهيدي للنسخة العكسية المعتمدة على المغنيسيوم. [9] يرتبط nucleocapsid مع الحمض النووي الريبي الجينومي (جزيء واحد لكل هيكسامر) ويحمي الحمض النووي الريبي من الهضم بواسطة نوكليازات.يوجد أيضًا داخل جسيم الفيريون Vif و Vpr و Nef والبروتياز الفيروسي. [ بحاجة لمصدر ] يتكون غلاف الفيريون من غشاء بلازما من أصل خلية مضيفة ، وهو مدعوم بمصفوفة مكونة من بروتين p17 الفيروسي ، مما يضمن سلامة جسيم الفيريون. على سطح الفيريون ، يمكن العثور على عدد محدود من البروتين السكري المغلف (Env) لفيروس نقص المناعة البشرية ، وهو أداة تقليم مكونة من أجهزة قياس غير متجانسة من gp120 و gp41. Env مسؤول عن الارتباط بمستقبل مضيفه الأساسي ، CD4 ، ومستقبله المساعد (بشكل رئيسي CCR5 أو CXCR4) ، مما يؤدي إلى دخول الفيروس إلى الخلية المستهدفة. [15]

باعتبارها البروتينات الوحيدة الموجودة على سطح الفيروس ، فإن البروتينات السكرية المغلفة (gp120 و gp41) هي الأهداف الرئيسية لجهود لقاح فيروس نقص المناعة البشرية. [16] أكثر من نصف كتلة مسمار الغلاف ثلاثي القوائم عبارة عن جليكانات مرتبطة بـ N. تكون الكثافة عالية لأن الجليكانات تحمي البروتين الفيروسي الأساسي من تحييد الأجسام المضادة. هذا هو واحد من أكثر جزيئات الجليكوزيلات المعروفة كثافة وكثافة عالية بما يكفي لمنع عملية النضج الطبيعي للجليكان أثناء التكوّن الحيوي في الجهاز الإندوبلازمي وجهاز جولجي. [17] [18] وبالتالي فإن غالبية الجليكانات تتوقف بسبب الجليكانات "عالية المانوز" غير الناضجة التي لا توجد عادة على البروتينات السكرية البشرية المفرزة أو على سطح الخلية. [19] تعني المعالجة غير المعتادة والكثافة العالية أن جميع الأجسام المضادة التي تم تحييدها على نطاق واسع والتي تم تحديدها حتى الآن (من مجموعة فرعية من المرضى الذين أصيبوا بالعدوى لعدة أشهر إلى سنوات) ترتبط بهذه المغلفات أو تتكيف معها جليكانات. [20]

تم الآن تحديد التركيب الجزيئي للسنبلة الفيروسية بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية [21] والمجهر الإلكتروني بالتبريد. [22] أصبحت هذه التطورات في البيولوجيا الهيكلية ممكنة بسبب تطور أشكال مستقرة من السنبلة الفيروسية المؤتلفة عن طريق إدخال رابطة ثنائي كبريتيد بين الوحدات الفرعية وطفرة إيزوليوسين إلى برولين في gp41. [23] ما يسمى بأدوات التشذيب SOSIP لا تقوم فقط بإعادة إنتاج الخصائص المستضدية للسنبلة الفيروسية الأصلية ولكن أيضًا تعرض نفس الدرجة من الجليكانات غير الناضجة كما هو موضح في الفيروس الأصلي. [24] النتوءات الفيروسية الثلاثية المؤتلفة هي لقاحات واعدة مرشحة لأنها تعرض حواتم غير معادلة أقل من الحاتمات الأحادية المؤتلفة gp120 التي تعمل على قمع الاستجابة المناعية للحلقات المستهدفة. [25]

يحتوي فيروس نقص المناعة البشرية على العديد من الجينات الرئيسية المشفرة للبروتينات الهيكلية الموجودة في جميع الفيروسات القهقرية بالإضافة إلى العديد من الجينات غير التركيبية ("الملحقات") الفريدة لفيروس نقص المناعة البشرية. [26] يحتوي جينوم فيروس نقص المناعة البشرية على تسعة جينات تقوم بتشفير خمسة عشر بروتينًا فيروسيًا. [27] يتم تصنيعها كبروتينات متعددة تنتج بروتينات للفيريون الداخلي ، وتسمى Gag ، ومستضد مجموعة محددة الإنزيمات الفيروسية (بولي ، بوليميراز) أو البروتينات السكرية للفيريون الحسد (مغلف). [28] بالإضافة إلى ذلك ، يقوم فيروس نقص المناعة البشرية بترميز البروتينات التي لها وظائف تنظيمية ومساعدة معينة أيضًا. [28] يحتوي HIV-1 على عنصرين تنظيميين مهمين: Tat و Rev وعدد قليل من البروتينات الملحقة المهمة مثل Nef و Vpr و Vif و Vpu والتي ليست ضرورية للتكاثر في أنسجة معينة. [28] إن أسكت يوفر الجين البنية التحتية المادية الأساسية للفيروس ، و بول يوفر الآلية الأساسية التي تتكاثر بها الفيروسات القهقرية ، بينما تساعد الفيروسات الأخرى فيروس نقص المناعة البشرية على دخول الخلية المضيفة وتعزيز تكاثرها. على الرغم من أنها قد تتغير عن طريق الطفرة ، إلا أن كل هذه الجينات باستثناء تيف موجودة في جميع المتغيرات المعروفة لفيروس نقص المناعة البشرية انظر التباين الجيني لفيروس نقص المناعة البشرية. [ بحاجة لمصدر ]

يستخدم فيروس نقص المناعة البشرية نظامًا متطورًا من التضفير التفاضلي للحمض النووي الريبي للحصول على تسعة منتجات جينية مختلفة من جينوم أقل من 10 كيلو بايت. [29] يحتوي فيروس نقص المناعة البشرية على نسخة جينومية غير مقسمة تبلغ 9.2 كيلو بايت والتي ترمز لسلائف gag و pol وهي ترميز فردي مقسم ، 4.5 كيلو بايت لـ env و Vif و Vpr و Vpu وترميز مرنا مضاعف 2 كيلو بايت لـ Tat و Rev و Nef. [29]

البروتينات المشفرة بواسطة جينوم فيروس نقص المناعة البشرية
فصل اسم الجين منتجات البروتين الأولية منتجات البروتين المصنعة
البروتينات الهيكلية الفيروسية أسكت هفوة البروتين ماجستير ، كاليفورنيا ، SP1 ، NC ، SP2 ، P6
بول بولي بروتين RT ، RNase H ، IN ، PR
الحسد GP160 gp120 ، gp41
العناصر التنظيمية الأساسية تات تات
مراجعة القس
بروتينات تنظيمية ملحقة نيف نيف
vpr Vpr
vif فيف
vpu Vpu

تحرير البروتينات الهيكلية الفيروسية

  • أسكت رموز (مستضد خاص بالمجموعة) للبروتينات السليفة gag polyprotein التي تتم معالجتها بواسطة البروتياز الفيروسي أثناء النضج إلى MA (بروتين مصفوفة ، p17) CA (بروتين كابسيد ، p24) SP1 (فاصل الببتيد 1 ، p2) NC (بروتين نوكليوكابسيد ، ص 7) SP2 (فاصل الببتيد 2 ، p1) وبروتين P6. [30]
  • بول رموز إنزيمات النسخ العكسي للإنزيمات الفيروسية (RT) و RNase H ، و Integrase (IN) ، و HIV protease (PR). [28] مطلوب بروتياز فيروس نقص المناعة البشرية لشق السلائف بروتين الكمامة لإنتاج البروتينات الهيكلية ، و RT مطلوب لنسخ الحمض النووي من قالب الحمض النووي الريبي ، و IN ضروري لدمج الحمض النووي الفيروسي مزدوج الشريطة في جينوم المضيف. [26]
  • الحسد (بالنسبة إلى "المغلف") رموز gp160 ، المشقوق بواسطة بروتيز مضيف ، furin ، داخل الشبكة الإندوبلازمية للخلية المضيفة. تنتج المعالجة اللاحقة للترجمة بروتينًا سكريًا سطحيًا ، gp120 أو SU ، والذي يرتبط بمستقبلات CD4 الموجودة على الخلايا الليمفاوية ، و gp41 أو TM ، والتي يتم تضمينها في الغلاف الفيروسي لتمكين الفيروس من الارتباط بالخلايا المستهدفة والاندماج معها. [26] [30]

العناصر التنظيمية الأساسية تحرير

  • تات (منشط فيروس نقص المناعة البشرية) يلعب دورًا مهمًا في تنظيم النسخ العكسي للـ RNA للجينوم الفيروسي ، مما يضمن التوليف الفعال لـ mRNAs الفيروسي وتنظيم إطلاق الفيروسات من الخلايا المصابة. [28] يتم التعبير عن Tat على أنه 72-amino acid one-exon Tat بالإضافة إلى 86-101-amino-acid two-exon Tat ، ويلعب دورًا مهمًا مبكرًا في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. يرتبط Tat (14-15 كيلو دالتون) بالبنية الثانوية المنتفخة للحلقة الجذعية للحمض النووي الريبي الجينومي بالقرب من المنطقة 5 'LTR التي تشكل عنصر استجابة التنشيط العابر (TAR). [9] [28]
  • مراجعة (منظم التعبير عن بروتينات virion): يرتبط بروتين Rev بالجينوم الفيروسي عبر نموذج ربط RNA غني بالأرجينين والذي يعمل أيضًا بمثابة NLS (إشارات التوطين النووي) ، وهو مطلوب لنقل Rev إلى النواة من العصارة الخلوية أثناء تكاثر الفيروس. [28] يتعرف Rev على بنية حلقة جذعية معقدة من الرنا المرسال الحسد الموجود في intron الذي يفصل exon الترميز لـ Tat و Rev ، والمعروف باسم عنصر استجابة HIV Rev (RRE). [9] [28] Rev مهم لتخليق البروتينات الفيروسية الرئيسية وبالتالي فهو ضروري لتكاثر الفيروس. [بحاجة لمصدر]

تحرير البروتينات التنظيمية الملحقة

  • vpr (بروتين الفيروسة البطيئة R): Vpr هو بروتين تنظيمي متحرك مرتبط بالفيريون. [28] يُعتقد أنه يلعب دورًا مهمًا في تكرار الفيروس ، وتحديداً الاستيراد النووي لمركب ما قبل الاندماج. يبدو أن Vpr أيضًا يتسبب في توقف الخلايا المضيفة عن دورة الخلية في مرحلة G2. ينشط هذا الاعتقال آلية إصلاح الحمض النووي للمضيف والتي قد تمكن من تكامل الحمض النووي الفيروسي. [9] يقوم كل من HIV-2 و SIV بتشفير بروتين إضافي مرتبط بـ Vpr يسمى Vpx والذي يعمل بالاشتراك مع Vpr. [28]
  • vif - Vif هو بروتين فوسفوري محفوظ بدرجة عالية 23 كيلو دالتون مهم لإصابة فيروسات HIV-1 اعتمادًا على نوع الخلية. [9] وُجد أن HIV-1 يحتاج إلى Vif لتخليق الفيروسات المعدية في الخلايا الليمفاوية والضامة وبعض سلالات الخلايا البشرية. لا يبدو أنه يتطلب Vif لنفس العملية في خلايا هيلا أو خلايا كوس ، من بين أمور أخرى. [28]
  • نيف- Nef ، العامل السلبي ، هو فوسفوبروتين مرتبط بالغشاء مرتبط بـ N. يشارك في وظائف متعددة أثناء دورة تكرار الفيروس. يُعتقد أنه يلعب دورًا مهمًا في موت الخلايا المبرمج ويزيد من عدوى الفيروس. [28]
  • vpu (Virus protein U) - Vpu خاص بـ HIV-1. وهو عبارة عن بروتين فوسفوري غشائي قليل القسيمات من الدرجة الأولى مع العديد من الوظائف البيولوجية. يشارك Vpu في تدهور CD4 الذي يشمل مسار البروتياز يوبيكويتين وكذلك في الإطلاق الناجح للفيروسات من الخلايا المصابة. [9] [28]
  • تيف: هذا الجين موجود فقط في عدد قليل من عزلات HIV-1. إنه اندماج أجزاء من تات, الحسد، و مراجعة الجينات ، ورموز للبروتين مع بعض خصائص تات ، ولكن القليل من خصائص rev. [31]

تم تحديد العديد من عناصر البنية الثانوية المحفوظة داخل جينوم HIV RNA. يتكون هيكل 5'UTR من سلسلة من الهياكل ذات الحلقة الجذعية المتصلة بواسطة روابط صغيرة. [10] تتضمن حلقات الجذع هذه (5 'إلى 3') عنصر منطقة التنشيط العابر (TAR) ، وإشارة تعدد الأدينيل 5 '[poly (A)] ، و PBS ، و DIS ، و SD الرئيسي و ψ دبوس الشعر هيكل يقع داخل 5 'نهاية الجينوم وعنصر استجابة HIV Rev (RRE) داخل الجين env. [10] [32] [33] تم التعرف على بنية أخرى للحمض النووي الريبي وهي حلقة جذع الكمامة 3 (GSL3) ، والتي يُعتقد أنها متورطة في التغليف الفيروسي. [34] [35] تم اقتراح الهياكل الثانوية للحمض النووي الريبي للتأثير على دورة حياة فيروس نقص المناعة البشرية عن طريق تغيير وظيفة إنزيم بروتياز فيروس نقص المناعة البشرية والنسخة العكسية ، على الرغم من عدم تعيين وظيفة لجميع العناصر المحددة. [ بحاجة لمصدر ]

أظهر الهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي الذي يحدده تحليل SHAPE أنه يحتوي على ثلاث حلقات جذعية ويقع بين جينات إنزيم البروتياز HIV وجينات النسخ العكسي. هذه رابطة الدول المستقلة ثبت أن الحمض النووي الريبي التنظيمي محفوظ في جميع أنحاء عائلة فيروس نقص المناعة البشرية ويعتقد أنه يؤثر على دورة الحياة الفيروسية. [36]

ال الحلقة المتغيرة الثالثة أو حلقة V3 هو جزء أو منطقة من فيروس نقص المناعة البشرية. ال حلقة V3 من البروتين السكري لمغلف viron ، gp120 ، يسمح له بإصابة الخلايا المناعية البشرية عن طريق الارتباط بمستقبل السيتوكين على الخلية المناعية البشرية المستهدفة ، مثل خلية CCR5 أو خلية CXCR4 ، اعتمادًا على سلالة فيروس نقص المناعة البشرية. [37] يعتبر البروتين السكري المغلف (Env) gp 120/41 ضروريًا لدخول HIV-1 إلى الخلايا. يعمل Env كهدف جزيئي لدواء يعالج الأفراد المصابين بعدوى HIV-1 ، ومصدرًا للمناعة لتطوير لقاح الإيدز. ومع ذلك ، ظل هيكل مقصورة Env الوظيفي بعيد المنال. [38]


خلفية

كل العمليات ذات قالب الحمض النووي التي تحدث في الخلايا حقيقية النواة تفعل ذلك في سياق الكروماتين. يتكون الكروماتين من مجموعة من النيوكليوسومات تتكون من 147 زوجًا أساسيًا من الحمض النووي مزدوج الشريطة ملفوفة حول ثماني من بروتينات هيستون (Kornberg and Lorch 1999). يتم تنظيم الكروماتين بدرجة عالية لتسهيل الوظيفة المناسبة لعمليات قالب الحمض النووي على مستويات النيوكليوسومات الفردية ، وإمكانية الوصول إلى الحمض النووي ، والبنى عالية الترتيب - وكلها منظمة بواسطة عوامل تفاعل الكروماتين. يتم توجيه هذه العوامل المتفاعلة مع الكروماتين إلى مناطق الجينوم كسبب ونتيجة لبنية الكروماتين المحلية ، مما يخلق أنماطًا منفصلة لتوطين العوامل. ما ينشأ هو نظام معقد للمعاملة بالمثل تؤثر فيه العوامل التنظيمية للكروماتين على بنية النواة ، والتي بدورها تؤثر على ارتباط العوامل التنظيمية الجديدة. مع التفاعل الديناميكي بين هذه العمليات ، تعد الطرق المتنوعة ضرورية لفحص بنية النواة وربط العامل التنظيمي.

توجد العناصر التنظيمية داخل الخلية بشكل أساسي في المناطق المفتوحة أو التي يمكن الوصول إليها من الجينوم. لذلك يتم تحديد العناصر التنظيمية الخاصة بالخلية بشكل أساسي من خلال فحوصات إمكانية الوصول. يمكن أن يؤدي اكتشاف الكروماتين المفتوح أيضًا إلى تحديد مواقع الربط للبروتينات المتفاعلة مع الكروماتين. في هذه المراجعة ، سنناقش أولاً التقنيات في مجال بيولوجيا الكروماتين لفحص إمكانية الوصول إلى الكروماتين - بما في ذلك الهضم باستخدام DNase I والتسلسل العميق (DNase-seq) (كروفورد وآخرون 2006 أ ، ب سابو وآخرون. 2006 Song and Crawford 2010 ) ، عزل العناصر التنظيمية بمساعدة الفورمالديهايد (FAIRE-seq) (Giresi et al. 2007 Simon et al. 2012) ، وهضم نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase) متبوعًا بالتسلسل العميق (MNase-seq (Cui and Zhao 2012a Henikoff et al. 2011 Mieczkowski وآخرون .2016 Ramani وآخرون. سياق مهم لتنظيم الجينات ، لا سيما فيما يتعلق بشغل النواة وتحديد المواقع.

طرق رسم خرائط سهولة الوصول إلى الجينوم. أ يحدد DNase-seq المناطق المفتوحة للكروماتين. يعتمد DNase-seq على الهضم التفضيلي لمناطق الكروماتين غير المحمية ببروتينات مرتبطة ، تاركًا وراءه مناطق يسهل الوصول إليها تُعرف باسم مواقع DNase I شديدة الحساسية (DHSs). ب يعتمد FAIRE-seq على تشابك البروتينات المتفاعلة مع الكروماتين مع الحمض النووي باستخدام الفورمالديهايد. يتم بعد ذلك قص الكروماتين ، وتبقى المناطق غير المقيدة بالبروتينات (مثل الهستونات) في الطبقة المائية لاستخراج الفينول كلوروفورم ، بينما يظل الحمض النووي المتشابك في الطبقة العضوية. ج الملامح MNase-seq شغل النواة وتحديد المواقع. بعد تشابك الفورمالديهايد ، يقوم MNase المضاف بهضم الحمض النووي غير المحمي بالبروتينات المرتبطة ، مما يسمح للفرد باستنتاج إمكانية الوصول المتزايدة عن طريق التواجد المنخفض في مكتبة التسلسل. د. يعتمد ATAC-seq على ترانسبوزيز Tn5 المفرط النشاط لإدخال محولات التسلسل في مناطق يمكن الوصول إليها من الجينوم. بعد التحويل ، يمكن عزل الحمض النووي الجيني وتضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ثم تعريضه لتسلسل عميق. تم إنشاء الشكل باستخدام Biorender.com

الأهم من ذلك ، لا يمكن التنبؤ بالموقع الجينومي للعوامل أو بروتينات الهيستون في أنواع الخلايا عن طريق تسلسل الحمض النووي أو إمكانية الوصول وحدها. لذلك تُستخدم تقنيات التنميط الفردي للبروتين لتحديد الخصائص الخاصة بالخلية للربط الوظيفي. سنناقش تقنيات تحديد ارتباط العوامل بالكروماتين وتحديد موقعه ، بما في ذلك الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) (ألبرت وآخرون. 2007 Furey 2012 Gilmour and Lis 1984 Gilmour et al. 1991 O'Neill 2003 Solomon and Varshavsky 1985) ، DNA adenine methyltransferase تحديد الهوية (DamID (Greil et al. 2006 van Steensel and Henikoff 2000) ، وتقنيات مشتقة من التحلل المناعي للكروماتين (ChIC / CUT & ampRUN (Schmid et al. 2004 Skene and Henikoff 2017) الشكل 2).

طرق تحديد موقع البروتين على الكروماتين. أ DamID يستغل بكتريا قولونية DNA adenine methyltransferase (Dam) عن طريق دمجها في عامل مثير للاهتمام ونقل هذا البلازميد إلى خلية. هذا بناء ميثيلات الأدينينات الموجودة بالقرب من مواقع ربط العوامل. يمكن بعد ذلك عزل الحمض النووي الجيني وهضمه Dpnأنا ، الذي ينشق على وجه التحديد في التسلسل G m ATC. ثم يتم هضم جزء من الحمض النووي المهضوم به Dpnالثاني ، الذي يشق GATC غير الميثيل لتحديد المواقع الميثيلية المحتملة خارج نطاق السد. يتم إنشاء المكتبات جنبًا إلى جنب وإخضاعها لتسلسل عميق. ب ChIP-seq هي تقنية تعتمد على الأجسام المضادة وتبدأ بربط العوامل بالحمض النووي ، متبوعًا بقص الكروماتين وسحب الأجسام المضادة لعامل الاهتمام على حبات مغناطيسية أو خرز agarose. ثم يتم عكس الروابط المتقاطعة ، ويتم عزل الحمض النووي من أجل التسلسل العميق. ج يستفيد CUT & ampRUN من بناء اندماج بروتين A-MNase المؤتلف (pA-MNase) للارتباط بجسم مضاد أولي يتعرف على عامل الاهتمام ويحدد الحمض النووي في مواقع ربط العامل ، وبالتالي إنشاء أجزاء صغيرة يمكن عزلها عن النوى واستخدامها كأجزاء نموذج لبناء المكتبة والتسلسل العميق. يوفر CUT & ampRUN دقة زوج قريبة من القاعدة ويمكن إجراؤها في ظل ظروف أصلية (أي عدم التشابك) نظرًا لارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء في التسلسل. تم إنشاء الشكل باستخدام Biorender.com

معًا ، تم تحسين تقنيات التنميط الكروماتين التي تقيم إمكانية الوصول أو التوطين بدقة متزايدة لتحسين إشارة الهدف على الخلفية وتقليل مدخلات الخلية الضرورية في السنوات الأخيرة ، وغالبًا ما تصل إلى ذروتها مع تطوير تكيفات أحادية الخلية للتقنيات. هنا ، نراجع تطوير التكنولوجيا والأساليب والمزايا والعيوب والتحسين لتطبيقات الخلايا المنخفضة.

القسم الأول: طرق فحص إمكانية الوصول إلى الحمض النووي وحالة الكروماتين

يتم ضغط DNA حقيقيات النوى في النواة من خلال التفاعلات بين الحمض النووي وبروتينات الهيستون لتكوين الكروماتين (Lammerding 2011). بشكل عام ، تشكل وحدة التكرار الأساسية للكروماتين ، وهي النيوكليوسوم ، عقبة كبيرة أمام العمليات القوالب للحمض النووي ، حيث لا تستطيع العوامل احتلال مناطق على الحمض النووي المغطاة ببروتينات هيستون (Beato and Eisfeld 1997 Felsenfeld 1992 Wallrath et al. 1994) . ومع ذلك ، فإن مناطق الكروماتين المفتوح يمكن الوصول إليها من خلال بروتينات ربط الحمض النووي وغالبًا ما توجد في المناطق التنظيمية للجينوم (Song and Crawford 2010 Thurman et al. 2012). وبالتالي ، فإن تحديد مناطق الجينوم التي يمكن الوصول إليها من قبل البروتينات غير الهيستون يوفر معلومات مهمة عن المناطق التنظيمية الجينومية المفترضة ، مثل المعززات والمحفزات والعوازل بالإضافة إلى وصف التركيب النووي للمناطق التنظيمية المعروفة للجينوم (Thurman et al. 2012).

تعتمد الطرق الجينومية المستخدمة في فحص إمكانية الوصول إلى الكروماتين تقليديًا على الهضم الإنزيمي التفضيلي أو تعديل الحمض النووي الذي يمكن الوصول إليه للحمض النووي المحمي ببروتينات هيستون المرتبطة أو عوامل النسخ (الشكل 1). تطورت العديد من تقنيات الوصول الجينومي (على سبيل المثال ، DNase-seq و MNase-seq) من تجارب بصمة نوكلياز طويلة الاستخدام (Cappabianca et al. 1999 Dingwall et al. 1981 Galas and Schmitz 1978) ، مستفيدة من تطورات التسلسل من الجيل التالي إلى تقييم بنية الجينوم على مستوى الجينوم بدلاً من البصمة الخاصة بالموقع (كروفورد وآخرون 2006 ب شونيس وآخرون 2008). التقنيات التي ظهرت عديدة وقوية وقادرة على توفير بيانات عالية الدقة تصف إمكانية الوصول إلى الكروماتين. للحصول على خط أنابيب عام للمعلومات الحيوية حول كيفية تقييم مجموعات البيانات هذه ، انظر الشكل 3. على الرغم من أن العديد من الإنزيمات المستخدمة لتوصيف إمكانية الوصول تحمل تحيزات طفيفة ، إلا أن صور بنية الجينوم التي تظهر متسقة بشكل عام عند مقارنتها مع بعضها البعض.

خط أنابيب عام للمعلومات الحيوية لتحليل إمكانية الوصول على مستوى الجينوم أو مجموعات البيانات التنميطية. على الرغم من أن التحليلات تختلف اعتمادًا على التقنية المستخدمة لتقليل التحيزات ، فقد قدمنا ​​خط أنابيب عام لتحليل مجموعات البيانات الناتجة عن NGS. باتباع معلومات مراقبة الجودة ذات الصلة (Andrews 2010) ، تتضمن جميع تجارب التسلسل تعيين الجينوم المعني ، وإنشاء ملفات تحتوي على التسلسل ، ومعلومات المحاذاة ، ومعلومات الجودة ، والمعروفة باسم ملفات .sam (أو ، عند ضغطها ، ملفات .bam Langmead et 2009 لانجميد وسالتزبورج 2012 Li and Durbin 2009). يتم تصفية هذه الملفات المتوافقة واستخدامها في تحليلات المصب لدراسة إشغال النيوكليوسوم والعامل وتحديد المواقع ، ويتم إنشاء فئات الحجم لتقسيم المناطق التي يتعذر الوصول إليها حسب العوامل التي تمنع توفرها (Li، Handsaker et al. 2009 Schep et al. 2015). من ملفات الوصول. وآخرون 2008). من قمم العوامل ، يمكن استدعاء الزخارف لتحديد العوامل التي تربط هذه المواقع على الأرجح.عادةً ما يتم عرض البيانات الجينومية في شكل خرائط حرارية أو مخططات حوارية (Heinz et al. 2010 Ramírez et al. 2016). تم إنشاء الشكل باستخدام Biorender.com

DNase- تسلسل

DNase-seq هي طريقة تُستخدم لفحص إمكانية الوصول إلى الكروماتين باستخدام نوكلياز الحمض النووي غير المحدد DNase I ، والذي يؤدي إلى تدهور الحمض النووي بشكل تفضيلي غير المحمي بالبروتينات المرتبطة (على سبيل المثال ، بروتينات الهيستون ، الشكل 1 أ). قبل DNase-seq ، تم استخدام DNase I لبصمة القدم ، حيث يتم تشغيل مادة هلامية بعد معالجة DNase في كل من وجود وغياب المناطق الفارغة للبروتين محل الاهتمام على الجل والتي سيتم استنتاج أنها محمية و / أو يتعذر الوصول إليها في حين أن المزيد من المناطق المستنفدة للنيوكليوسوم - أو التي يمكن الوصول إليها - سيتم تمييزها بوجود موقع انقسام أكبر على مادة هلامية (Cappabianca et al. 1999 Dingwall et al. 1981 Galas and Schmitz 1978). طبقت مجموعة فرانسيس كولينز لأول مرة آثار أقدام DNase I على مستوى الجينوم في عام 2006 ، باستخدام رقائق ميكروأري (رقاقة DNase) وتسلسل سانجر الموازي بشكل كبير (كروفورد وآخرون 2006 أ ، ب سابو وآخرون 2006). في عام 2008 ، طورت مجموعة جريجوري كروفورد هذه التقنية من خلال الدمج مع تسلسل الجيل التالي (Boyle et al. 2008) لتحقيق نجاح أكبر من تجارب شريحة DNase و DNase-seq السابقة نظرًا لزيادة الدقة والجودة المقدمة عبر تقنية ميكروأري. ينطبق DNase-seq على جميع الكروماتين حقيقية النواة ، بما في ذلك أنظمة المختبرات الشائعة للنباتات ، والخميرة ، والديدان الخيطية ، والذباب ، وخلايا الثدييات.

يتم تنفيذ DNase-seq عن طريق عزل النوى من الخلايا ، وتعريض النوى لهضم الحمض النووي العام بواسطة DNase I ، وتحطيم الحمض النووي الريبي والبروتينات باستخدام RNases و Proteinase K ، على التوالي ، وتنقية الحمض النووي باستخدام استخراج الفينول الكلوروفورم وترسيب الإيثانول ، واستخراج الهلام شظايا ذات أحجام تتوافق مع فئة العوامل المرغوبة (نموذجيًا 50-100 زوج قاعدي لعوامل النسخ و 130-160 نقطة أساس للنيوكليوزومات (He et al. 2014) ثم يتم استخدام الحمض النووي المنقى والمختار الحجم كقالب لبناء المكتبة. كانت تلك المناطق الأقل تحديدًا في تسلسل مكتبات DNase-seq تتدهور في أغلب الأحيان بواسطة DNase I ويُستدل على أنها أكثر سهولة في الوصول إليها.

هناك تحيز جوهري لـ DNase I لتحطيم الحمض النووي بشكل مختلف بناءً على التسلسل ، وقد تم اقتراح أن هذا التأثير مرتبط بعرض الأخدود الصغير (Lazarovici et al. 2013). يجب أخذ هذا القيد في الاعتبار عند التحضير لتجربة DNase-seq (He et al. 2014). بالنسبة للعوامل التي يصعب تحديدها بواسطة DNase-seq ، فقد تم إدخال تعديل حديث على استخدام الربط المتشابك للفورمالديهايد بنسبة 0.1٪ للمساعدة في تحديد الهوية ، والذي يطلق عليه XL-DNase-seq (Oh et al. 2019). قام تعديل آخر لـ DNase-seq ، وهو DNase-seq أحادي الخلية (scDNase-seq) بتطبيق DNase-seq على الخلايا الفردية وعينات الأنسجة الأولية منخفضة المدخلات (Jin et al. 2015). على الرغم من أنه مشابه لـ DNase-seq التقليدي ، فقد تم تحسين scDNase-seq بشكل أكبر ، مع تطبيق التعديلات التالية: تضمين DNA الناقل البكتيري ، ونقص العزلة النووية ، وهضم DNase I الأمثل ، ونقص فصل هلام agarose ، وتغيير ظروف PCR. تم تصميم هذه التحسينات لتقليل فقد العينة وتسهيل تضخيم شظايا الحمض النووي الصغيرة (Cooper et al. 2017).

كان DNase-seq مؤثرًا بشكل كبير في تحديد المناطق التنظيمية المفترضة للجينوم. غالبًا ما تُستخدم المناطق التي نادرًا ما تظهر في مكتبات DNase-seq ، والمعروفة باسم مواقع DNase I شديدة الحساسية (DHSs) ، كبديل للمناطق التنظيمية النشطة ، مثل المعززات والمروجين. أسفرت محاولات تحديد هذه المسوح السكانية الصحية عن أوراق مؤثرة للغاية تغطي جميع مناطق رابطة الدول المستقلة المعروفة تقريبًا ، بما في ذلك أكثر من 2.9 مليون درهم إماراتي (Thurman et al. 2012) وأكثر من 45 مليون حدث شغل عامل النسخ (Neph et al. 2012). بالإضافة إلى ذلك ، أصبح DNase-seq أداة قيمة للتحقيق في الاختلافات بين الأنسجة اللاجينية ونوع الخلية ، إلى حد كبير من خلال جهود مشروع ENCODE و Roadmap Epigenomic Consortium (Consortium 2012 Maurano et al. 2015 Roadmap Epigenomics et al. 2015) .

FAIRE- تسلسل

كبديل لـ DNase-seq لتحديد المناطق التي يمكن الوصول إليها في جميع أنحاء الجينوم ، تم تطوير عزل العناصر التنظيمية بمساعدة الفورمالديهايد (FAIRE) في عام 2007. بدلاً من هضم الحمض النووي غير المحمي ، يعتمد FAIRE على الربط المتشابك للهيستونات مع الحمض النووي ، بينما يتم استنتاج الحمض النووي غير المرتبط لتكون في المتناول (الشكل 1 ب). تم تطوير FAIRE لأول مرة للاستخدام مع مصفوفات الحمض النووي الدقيقة (Giresi et al. 2007) ولكن سرعان ما تم دمجها مع تقنيات التسلسل من الجيل التالي (Gaulton et al. 2010). على غرار DNase-seq ، يمكن استخدام FAIRE-seq لفحص المناطق التنظيمية (بما في ذلك TSSs والمروجين والمعززات) ، والتي يشار إليها أيضًا باسم DHSs. تم التحقق من صحة FAIRE-seq في الخلايا النباتية والخميرة والديدان الخيطية والذباب والفأر والخلايا البشرية.

تتضمن تجربة FAIRE-seq النموذجية تشابكًا للفورمالديهايد ، مع أكثر أهداف التشابك وفرة هي بروتينات هيستون (Rodríguez-Gil et al. 2018 Simon et al. 2012). يتم بعد ذلك تقطيع الكروماتين المتشابك عن طريق الصوتنة إلى ما يقرب من 200-300 زوج قاعدي في الحجم وعزل الحمض النووي عن طريق استخراج الفينول-كلوروفورم ، حيث يظل الحمض النووي شديد الارتباط في الطور العضوي ويتم سحب الحمض النووي غير المتشابك إلى الطور المائي. يمكن بعد ذلك تضخيم الحمض النووي غير المتشابك من الطور المائي وتسلسله. تميل القراءات المخصبة في مجموعة التسلسل إلى أن تحتوي على ارتباط أقل بجسيم نووي وعامل ، وبالتالي يُستنتج أنها تأتي من مناطق يمكن الوصول إليها.

العيب الرئيسي لتجارب FAIRE-seq هو أنه على الرغم من كونه مفيدًا لهندسة الكروماتين المستندة إلى هيستون ، فإن المناطق التنظيمية المرتبطة بعوامل النسخ أو التي يتم نسخها بنشاط قادرة أيضًا على الارتباط المتشابك. لذلك تعتمد التقنية على وجود مجتمع مختلط لتحديد ملامح إمكانية الوصول بدقة وبالتالي فهي أقل دقة من التقنيات الأخرى الموصوفة في هذه المراجعة. نتيجة لذلك ، استخدمت مجموعات بحثية أقل هذه التقنية ، ومع ذلك ، فقد تم استخدام FAIRE-seq لتحديد المناطق التنظيمية التي تقود تطور الورم (Davie et al. 2015) ، للتمييز بين الخلايا الأرضية والخلايا الأولية متعددة القدرات (Murtha et al. 2015) ، وبالمثل ، إلى جهود ENCODE و Roadmap Epigenomic Consortium DNase-seq ، لرسم خريطة عالمية للمناطق التنظيمية التي يمكن الوصول إليها من الكروماتين (Bianco et al. 2015).

MNase- تسلسل

MNase-seq هي طريقة لفحص مواقع الجينوم وشغلها في جميع أنحاء الجينوم (الشكل 1 ج). نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase) هو إنزيم معزول عن المكورات العنقودية الذهبية التي تعرض نشاط نوكلياز داخلي وخارجي لهضم الحمض النووي الحر (Axel 1975 Dingwall et al. 1981). على غرار DNase I ، تم استخدام MNase في تجارب بصمة الحمض النووي لفحص إمكانية الوصول إلى الحمض النووي قبل اختراع تقنيات تسلسل الجيل التالي (Cappabianca et al. 1999 Dingwall et al. 1981). تم استخدام مصفوفات تبليط MNase (MNase-chip) من قبل مجموعات أولي راندو وكوري نيسلو وفرانك بوغ ، من بين آخرين ، لتحديد مواقع الجسيمات النووية بدقة عالية قبل ظهور التسلسل العميق (Lee et al. 2007 Mavrich et al. 2008 Yuan وآخرون 2005). كما هو الحال مع التقنيات الأخرى ، سرعان ما تم إقران التنميط MNase مع تقنيات التسلسل من الجيل التالي (Schones et al. 2008). تم استخدام MNase-seq لرسم خرائط معمارية النواة عبر حقيقيات النوى من النباتات إلى الخميرة إلى البشر.

تبدأ تجربة MNase-seq بخطوة تشابك فورمالدهايد في الجسم الحي مصممة لالتقاط التفاعل بين البروتينات والحمض النووي. يسمح هذا الارتباط المتشابك للبروتينات المرتبطة بحماية الحمض النووي المرتبط بها من الهضم بواسطة MNase. بعد التشابك ، يتم تحليل الخلايا وهضمها باستخدام MNase ، والذي يتم تنشيطه على وجه التحديد عن طريق إضافة Ca 2+ إلى المخزن المؤقت للتحلل. يتم إيقاف هذا الهضم عن طريق تخليب التفاعل ، وعند هذه النقطة يتم معالجة العينات بالـ RNase ، وعكس الروابط المتقاطعة ، ويتم هضم البروتينات بعيدًا عن الكروماتين. ثم يتم عزل الحمض النووي عن طريق استخراج الفينول والكلوروفورم وفحصه على هلام الاغاروز لضمان الهضم السليم للحمض النووي دون تدهور. نظرًا لأن البروتينات الأكثر اتصالًا بالحمض النووي وفرة هي الهستونات ، فإن هذا الهلام سيعرض عادةً سلمًا دوريًا كل 147 زوجًا قاعديًا ، يمثل أحاديًا وثنائيًا وثلاثي النواة ، وما إلى ذلك.

تنصح بروتوكولات MNase-seq التقليدية باستئصال النطاق أحادي النواة لإثراء شظايا الحمض النووي المحمية (Cui and Zhao 2012b Rando 2010 Zhang and Pugh 2011) ومع ذلك ، من الممكن أيضًا إجراء تسلسل عميق على كامل MNase المهضومة عينة (Henikoff وآخرون 2011). تمت حماية الأجزاء المتبقية بعد انقسام MNase من الهضم ، وبالتالي يُستدل على أنها مرتبطة بالبروتين. يمكن أن يوفر تسلسل الحمض النووي المحمي بواسطة جميع البروتينات المتشابكة بصمة إضافية تتوافق مع كل من البروتينات الصغيرة (& lt 80 نقطة أساس محمية من الهضم ، على سبيل المثال ، عوامل النسخ) بالإضافة إلى صفائف النوكليوزوم التقليدية (Hainer and Fazzio 2015 Henikoff et al. 2011).

الأهم من ذلك ، يعرض MNase حركيات هضم مختلفة بناءً على كمية الإنزيم المستخدم لهضم مجموعة من الخلايا (Mieczkowski et al. 2016) بالإضافة إلى ذلك ، في حالة بعض المواقع الجينومية (مثل النيوكليوزومات الهشة) ، يمكن لمحات الهضم المرتفعة والمنخفضة توفر معلومات مختلفة اختلافًا جذريًا (Chereji et al. 2017 Mieczkowski et al. 2016 Weiner et al. 2010). لذلك من الأهمية بمكان إجراء تجارب MNase-seq على مجموعة سكانية موحدة مع تكرارات no-MNase ، و MNase منخفضة ، و MNase عالية. بينما تم تقييد MNase-seq تقليديًا عن طريق المدخلات الخلوية المتاحة ، فقد تم مؤخرًا نشر MNase-seq أحادي الخلية (Lai et al. 2018).

لدى MNase تفضيل موثق جيدًا لانقسام الحمض النووي العاري الغني بـ AT (Chung et al. 2010) ، ومع ذلك ، فإن تفضيل التسلسل هذا يكون دقيقًا مقارنةً بالتفضيل بسبب إمكانية الوصول إلى الكروماتين (Allan et al. 2012). ومع ذلك ، تتوفر التقنيات التي يمكن أن تقلل من التحيز بسبب تفضيل MNase. نشر مختبر Jay Shendure بروتوكولًا بديلاً لبناء مكتبة أحادي السلسلة لـ MNase-seq ، والمعروف باسم MNase-SSP الذي يعرض تحيزًا منخفضًا في التسلسل ويثري الأجزاء الأقصر من تسلسل MNase التقليدي ، مما يجعل التنميط القوي لعوامل النسخ (Ramani et 2019). بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير عدد قليل من البدائل وثيقة الصلة التي تستخدم الانقسام الكيميائي للحمض النووي ، بدلاً من الهضم الأنزيمي. يستخدم MPE-seq ، الذي طورته مجموعة Bing Ren ، methidiumpropyl-EDTA-Fe (II) (MPE) لتفضيل فصل الحمض النووي الرابط بين الهيستونات (Ishii وآخرون ، 2015). طورت مجموعة Steve Henikoff أيضًا تقنية انشقاق كيميائية للحمض النووي ، باستخدام طفرة في H4 (S47C) لإنشاء نوكلياز خاص بالموقع عن طريق عملية إزالة معدن ثقيل من النحاس بوساطة الفينانثرولين ، والتي تشق الحمض النووي محليًا في محور ثنائي في وجود بيروكسيد (Chereji) وآخرون 2018).

تم استخدام MNase-seq لتشخيص إشغال النواة وتغييرات تحديد المواقع في المناطق التنظيمية نتيجة التمايز الخلوي ، وتسليط الضوء على التغييرات الرئيسية في معززات الخلايا الجذعية الجنينية (West et al. 2014). علاوة على ذلك ، يمكن استخدام MNase-seq لتحديد موضع Pol II المتوقف مؤقتًا ، وهو اتجاه تم تأكيده بواسطة Pol II ChIP-seq الموازي (Teves و Henikoff 2011). ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن استخدام التنميط MNase-seq للتنبؤ بشكل موثوق بتفاعلات الجينوم ثلاثي الأبعاد وهياكل الكروماتين عالية المستوى (Schwartz et al. 2019 Zhang et al. 2017). نظرًا لقدرتها على التقاط التفاعلات العابرة عبر الربط المتشابك ، تعد MNase-seq واحدة من أكثر تقنيات تحديد إمكانية الوصول إلى الكروماتين تنوعًا.

ATAC- تسلسل

يعد اختبار إمكانية الوصول إلى transposase والتسلسل العميق (ATAC-seq) تقنية إضافية لتقييم الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه. يتضمن ATAC-seq استخدام ناقل Tn5 مفرط النشاط لإدخال محولات التسلسل في مناطق مفتوحة من الكروماتين لتسلسل تلك المناطق من خلال تسلسل الجيل التالي (Buenrostro وآخرون 2013) الشكل 1D). على عكس تقنيات تحديد سمات الوصول الأخرى ، تم تطوير ATAC-seq مؤخرًا فقط (Buenrostro وآخرون. 2013) ، على الرغم من أنه تم تكييفه للاستخدام في مكان واحد (ATAC-qPCR (Yost et al. 2018). على الرغم من أن ATAC-seq هو تقنية جديدة نسبيًا ، كان الإنزيم المستخدم ، Tn5 transposase ، أحد أول الترانسبوزازات التي تم تحديدها ، وقد تم استخدامه في تجارب التحويل في المختبر لأكثر من 20 عامًا (Goryshin and Reznikoff 1998 Naumann and Reznikoff 2002 Reznikoff 2003 Reznikoff 2008). بواسطة آلية "قص ولصق" بوساطة الحمض النووي ، حيث يقوم الترانسبوساز باستئصال جزء من الحمض النووي ، ويرتبط بموقع الحمض النووي المستهدف ، ويؤدي إلى كسر مزدوج الخيط ، ويدخل الينقولات في الموضع الجديد (Ivics et al. 2009). في سلسلة ATAC-seq ، يتم تحميل Tn5 مع الينقولات المصممة لإضافة مهايئات التسلسل عند نقطة الإدخال ، لتشكيل ترانسبوزوم وظيفي. تم استخدام ATAC-seq لرسم خريطة لكروماتين مفتوح في الخميرة والنباتات والديدان الخيطية والذباب والثدييات ، وحتى الأنسجة المجمدة (Corces et al. 2017).

يتم تنفيذ ATAC-seq بخطوتين إلى ثلاث خطوات أساسية تتكون من التحلل الخلوي وخطوات تبديل الحمض النووي واستخراج الحمض النووي وتضخيمه (Buenrostro وآخرون 2013). تم تطوير العديد من بروتوكولات ATAC-seq بما في ذلك سلسلة ATAC الأصلية (Buenrostro et al. 2013) و FAST-ATAC-seq المصممة لخلايا الدم (Corces et al. 2016) و Omni-ATAC-seq (Corces) et al. 2017) ، تختلف إلى حد كبير في المنظفات المستخدمة في التحلل الخلوي. نظرًا لأن ATAC-seq يعتمد على الإدخال إلى الحمض النووي الذي يمكن الوصول إليه ، بدلاً من هضم الحمض النووي المحمي ، فإن التقنية عرضة لتسلسل التلوث بواسطة الحمض النووي للميتوكوندريا. بسبب هذا الانتشار ، تم تطوير طرق لتقليل قراءات الميتوكوندريا في سلسلة ATAC (Corces et al. 2017 Montefiori et al. 2017 Rickner et al. 2019).

تم استخدام ATAC-seq بنجاح لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين في الخلايا المفردة (Buenrostro et al. 2015 Mulqueen et al. 2019) ومن الأنسجة المجمدة (Corces وآخرون. القضايا الجينية المتعلقة بعدم تجانس الخلايا وانخفاض توافر العينة. في الواقع ، نشرت مجموعة Jay Shendure 85 نمطًا مختلفًا لإمكانية الوصول إلى الكروماتين (نوع خلية محدد إلى حد كبير) استنادًا إلى سلسلة ATAC-seq المفهرسة أحادية الخلية في أنسجة الفئران المختلفة (Cusanovich et al. 2018). بالإضافة إلى ذلك ، نشرت مجموعات Howard Chang’s و William Greenleaf دراسات حول إمكانية الوصول في مجموعة من السرطانات الأولية التي تصيب الإنسان باستخدام ATAC-seq (Corces et al. 2018). تم إقران ATAC أيضًا مع التصور وقياس التدفق الخلوي (ATAC-see) للسماح بالتصوير المباشر والكميات وفرز الخلايا كنتيجة لإمكانية الوصول إلى الجينوم (Chen et al. 2016).

ملخص

تعتمد التقنيات المستخدمة لقياس إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مبدأين أساسيين: أولاً ، أن البروتينات يمكن أن تحمي الحمض النووي من الهضم ، وثانيًا ، أن بروتينات الهيستون هي أبرز البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي. تعتمد DNase-seq و MNase-seq و ATAC-seq بشكل أساسي على المبدأ الأول ، بينما يعتمد FAIRE-seq و MNase-seq أكثر على المبدأ الثاني ، ومع ذلك ، فإن كلا المبدأين مهمان للأنماط المنفصلة لإمكانية الوصول التي تكشفها كل تقنية. توفر التقنيات المذكورة أعلاه لقطات متميزة - لكنها متسقة - لوضع النوكليوزوم وإمكانية الوصول إلى الكروماتين ، ولكل تقنية مزايا وعيوب خاصة (الجدول 1). لقد سلطت هذه التقنيات الضوء على حالة الجينوم التي يمكن الوصول إليها والتحقق منها من خلال الأساليب المتعامدة وأدت إلى تحديد ما يقرب من 3 ملايين منطقة تنظيمية مفترضة للجينوم البشري (Thurman et al. 2012).

بالتوازي مع رسم خرائط مناطق الجينوم التي يمكن الوصول إليها بشكل عام ، فإن التحقيق في العوامل التي تتفاعل مع الكروماتين وتنظم هذه المناطق التي يمكن الوصول إليها من خلال تحديد موضع البروتين الخاص بعامل معين مهم بنفس القدر لفهم المبادئ الأساسية لهندسة الجينوم.

القسم 2: طرق التنميط في توطين البروتين على الكروماتين

اعتمادًا على أدوارها المحددة داخل النواة ، تعرض البروتينات المتفاعلة مع الكروماتين أنماطًا مميزة للتوطين الجيني. من خلال تحديد المناطق الجينومية التي توجد فيها البروتينات ، من الممكن تحديد الأدوار الوظيفية ، والزخارف المهمة للربط ، والشبكات التنظيمية لعمليات قالب الحمض النووي في الجسم الحي. مثل طرق قياس إمكانية الوصول إلى الحمض النووي ، هناك طرق عديدة لتحديد مواقع الارتباط الجينومي للبروتينات المتفاعلة مع الكروماتين التي اكتسبت شعبية في السنوات الأخيرة (الشكل 2) ، لكل منها مزايا وعيوب (الجدول 1). بشكل عام ، يجب أن توازن طرق التنميط بين دقة تحديد موقع الربط مع العينة اللازمة لإجراء التجربة. بعض الطرق ، مثل ChIP-exo (Rhee and Pugh 2012) ، تعطي الأولوية لقرار الزوج الأساسي ، على حساب زيادة مدخلات العينة الضرورية ، بينما توفر طرق أخرى ، مثل DamID (van Steensel and Henikoff 2000) ، بيانات تفاعل قوية دون قيود الإدخال الأعلى - تقنيات الحل. في الآونة الأخيرة ، ظهرت تقنيات مشتقة من طريقة الكروماتين المناعي (ChIC) (Schmid et al. 2004) وهي قادرة على توفير تحديد عالي الدقة لمواقع الربط مع عينات مدخلات منخفضة للغاية. للحصول على خط أنابيب عام للمعلومات الحيوية حول كيفية تحديد مواقع الربط الجينومي هذه ، انظر الشكل 3.

رقاقة تسلسل

تم تطوير التقنية الأكثر شيوعًا لتقييم توطين البروتينات المرتبطة بالكروماتين ، الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) (الشكل 2 أ) ، للاستخدام في موضع واحد باستخدام وسم الحمض النووي المشع بواسطة Gilmour and Lis (1984) والربط المتشابك للفورمالديهايد والهلام - التصوير القائم من قبل سليمان وفارشافسكي (1985). كانت هذه التقنية قيد الاستخدام لسنوات عديدة قبل أن يتم تكييفها للتسلسل العميق بعد إنشاء المكتبة لفحص التعريف الجيني لموقع ارتباط البروتين المتفاعل مع الكروماتين (Albert et al.2007). استنادًا إلى تجارب الوسم الإشعاعي الأولية ، تم تطوير رقاقة ChIP ، وهي تقنية يتم فيها تهجين ChIP DNA إلى مصفوفات DNA الدقيقة مقابل مواضع جينية مختلفة ، في عام 2000 كأول تطبيق جيني واسع النطاق لـ ChIP (Ren et al. 2000). تم دمج ChIP مع PCR الكمي (ChIP-qPCR) كطريقة لفحص إشغال البروتين في مواقع متعددة بطريقة كمية كانت أكثر استهدافًا من رقاقة ChIP ، ولكنها أقل تقييدًا من رقاقة ذات علامة إشعاعية أحادية الموقع (Irvine et al.2002) . توصيف ChIP-seq بشكل قوي تفاعلات البروتين والحمض النووي عبر الأنواع حقيقية النواة.

تبدأ تجربة ChIP عادةً بحضانة الفورمالديهايد المصممة لربط ليسينات البروتينات المتفاعلة مع الحمض النووي المحلي. يتم بعد ذلك تحليل الخلايا لإطلاق الكروماتين المتشابك وتعريضها إلى صوتنة غير متحيزة لقص الكروماتين إلى أجزاء قصيرة (عادةً ما بين 100 و 400 زوج قاعدي). يتم بعد ذلك تحضين الكروماتين المنفصمة بجسم مضاد يستهدف البروتين المعني متبوعًا بإضافة جسم مضاد IgG ثانوي يتعرف على الجسم المضاد الذي يقترن عادةً بالسيفروز أو الخرزات المغناطيسية. عند التعرف على الحاتمة ، يتم سحب المنطقة المتفاعلة من الحمض النووي مع البروتين الذي يرتبط به بشكل متشابك ، وبالتالي عزل مناطق الحمض النووي على وجه التحديد التي يرتبط بها البروتين (والتي يكون البروتين قريبًا منها بالضرورة - تقريبًا 2 Å ( Perez-Romero and Imperiale 2007) يتم بعد ذلك عكس الروابط المتقاطعة ، وهضم البروتين ، وعزل الحمض النووي لاستخدامه كقالب لـ qPCR الخاص بالموقع أو ليتم تشغيله على مادة هلامية.

تم دمج ChIP-seq مع تقنيات مختلفة لتوفير دقة عالية ، بما في ذلك هضم نوكلياز لامدا (ChIP-exo و ChIP-nexus (He et al. 2015 Rhee and Pugh 2012) ، الارتباط المتشابك للأشعة فوق البنفسجية (UV-ChIP (Gilmour et al. 1991) ، وهضم MNase (Native ChIP (O'Neill 2003). ChIP-exo و ChIP-nexus هما طريقتان تستخدمان هضم نوكلياز لتحسين دقة تسلسل ChIP إلى مستوى قريب من زوج القاعدة. تستخدم ChIP-exo لامدا نوكلياز خارجي لهضم dsDNA 5′-3 غير المربوط حتى الوصول إلى الارتباط المتشابك بين البروتين والحمض النووي الذي لا يمكن أن يستمر نوكلياز من خلاله (Rhee and Pugh 2012). على غرار ChIP-exo ، تعتمد ChIP-nexus على هضم الحمض النووي المتشابك باستخدام نوكلياز لامدا ومع ذلك ، يشتمل ChIP-nexus أيضًا على بروتوكول إنشاء مكتبة معدل وشاشة قائمة على الباركود للتضخيم الزائد (He et al. 2015). بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب ChIP-nexus محول تسلسل 3 واحد فقط ، مما يقلل من متطلبات الإدخال بالنسبة إلى سلسلة ChIP التقليدية ( He et al. 2015). UV-ChIP تستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية كضوء صفري عامل التشابك gth في الجسم الحي الذي يختبر تفاعل البروتين المباشر ، ومع ذلك ، يوفر الارتباط المتشابك بالأشعة فوق البنفسجية عوائد منخفضة ، مما يجعله غير مناسب للعينات منخفضة المدخلات أو التفاعلات غير المتكررة (Toth and Biggin 2000). يستخدم Native ChIP الهضم MNase كبديل لطيف للصوتنة التي تسمح بتحديد ارتباط البروتين على الكروماتين غير المتشابك ، وبدقة أعلى بكثير من سلسلة ChIP التقليدية لأنها لم تعد مقيدة بكفاءة الصوتنة (O’Neill 2003).

يتمثل الحد الأكثر إلحاحًا لتجربة ChIP-seq في الإدخال لإنتاج نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية ، وتتطلب ChIP-seq عادةً ملايين من خلايا الإدخال ، خاصة لفحص ارتباط عامل النسخ. نظرًا لأن الهستونات أكثر وفرة بكثير من بروتينات ربط الحمض النووي الأخرى ، فإن تحسين تقنيات ChIP-seq للمدخلات المنخفضة كان أكثر فائدة باستخدام الهستونات من العوامل. بالنسبة لتقنيات ChIP-seq التقليدية القائمة على التشابك ، كانت μChIP-seq كافية لتشكيل تعديلات هيستون في 400 خلية (Dahl et al. 2016) ، على الرغم من أن ChIP قد تم إقرانها بتقنية ميكروفلويديك (Cao et al. 2015 Rotem et al. 2015) لتقليل المدخلات الضرورية إلى 100 خلية لتحديد ملامح تعديلات هيستون. كانت تقنيات تسلسل ChIP الأصلية أكثر نجاحًا في تقليل المدخلات الخلوية بسبب القص اللطيف للكروماتين. في عام 2006 ، تم استخدام Carrier ChIP بنجاح لتشخيص تعديلات الهيستون في 50 خلية (وإن كان ذلك مع ملايين الخلايا "الحاملة" لتقليل فقد العينة (O'Neill et al. 2006) ، بينما أدت المحاولات الأحدث إلى تقليل المدخلات الخلوية لتوصيف تعديل هيستون إلى 500 خلية (MINT-ChIP و ULI-NChIP) و 200 خلية (STAR-ChIP (Liu et al. 2016 van Galen et al. 2016 Zhang et al. 2016). في حين أن وفرة عوامل النسخ والربط العابر تجعلها أكثر صعوبة الملف الشخصي في العينات منخفضة المدخلات ، تم بنجاح خفض اثنين من التقنيات القائمة على ChIP إدخال الخلية: ChIPmentation و ChIP-assisted ChIP-seq. الأول ، ChIPmentation ، تم تطويره بواسطة مجموعة Christoph Bock ويستخدم Tn5 transposase لربط محولات التسلسل مباشرة على الكروماتين على الخرز (Schmidl et al. 2015) تم استخدام ChIPmentation لتحديد عوامل النسخ في 100000 خلية.بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت مجموعة Jason Carroll مجموعة ChIP-seq بمساعدة الناقل لتوطين عامل النسخ الشخصي في أقل من 10،0 00 خلية (Zwart et al. 2013).

كواحدة من أولى وأبرز التقنيات الجينومية ، كان لـ ChIP ومشتقاته تأثير غير عادي في فهم تنظيم تفاعلات الكروماتين والنسخ. حتى الآن ، يحتوي مصطلح "الترسيب المناعي للكروماتين" على ما يقرب من 23000 زيارة في PubMed وأكثر من 9000 مجموعة بيانات متاحة للجمهور في قاعدة بيانات ENCODE ، مع تخزين المزيد في أرشيف قراءة تسلسل NCBI (Consortium 2012). على الرغم من أن ChIP-seq لا يزال يمثل المعيار الذهبي لتحديد سمات توطين العوامل ، فقد تم تطوير تقنيات أخرى على مدار الثلاثين عامًا الماضية لفحص توطين العوامل من خلال مناهج مختلفة.

داميد

يقدم DamID بديلاً غير ChIP لتحديد موقع البروتينات على الكروماتين (الشكل 2 ب) (van Steensel and Henikoff 2000). يستخدم DamID بروتينًا مؤتلفًا (الإشريكية القولونية يندمج DNA Adenine Methyltransferase أو Dam) مع البروتين المتفاعل مع الكروماتين ذي الأهمية لتحديد المناطق الجينومية التي يتفاعل فيها البروتين. السد ميثيلات الأدينين ضمن تسلسل GATC (Barras and Marinus 1989 Boivin and Dura 1998 Wines et al. 1996). نظرًا لأن مثيلة الأدينين لا تحدث في معظم حقيقيات النوى ، فإن DamID يوفر قراءة أصلية ومحددة لتوطين العامل (Barras and Marinus 1989). يمكن أن تنتشر مثيلة السد حتى 5 كيلو بايت من موقع ربط البروتين (van Steensel and Henikoff 2000) ، مما يبرز المقايضة بين الدقة والنوعية المتوازنة في تجارب DamID. بالإضافة إلى ذلك ، من المرجح أن يتم ميثلة مناطق الجينوم التي يمكن الوصول إليها بشكل أكبر بواسطة Dam (Greil et al. 2006) ، وهو متغير يتم التحكم فيه عن طريق التنميط مع ترنسفكأيشن للسد غير المستخدم. على الرغم من أن DamID كان رائدًا مع النشاف الجنوبي والكمي PCR (qPCR) كتقدير كمي للميثيل ، فقد تم استبدالها منذ ذلك الحين بتقنيات التسلسل من الجيل التالي (Aughey et al. 2019 Greil et al.2006). يتم تطبيق DamID بشكل شائع في ذبابة الفاكهة الخلايا ولكن تم استخدامها في الخميرة ، C. ايليجانس, أرابيدوبسيس، والفئران ، والخلايا البشرية ، مما يوضح نطاقًا أكثر تنوعًا من التنميط.

تتضمن تجربة DamID النموذجية بناء بلازميد بسد مدمج في الطرف N أو C للبروتين المعني. يتم بعد ذلك نقل البلازميد إلى الخلايا المراد فحصها ، كما هو الحال بالنسبة لبلازميد التحكم الذي يحتوي على السد وحده وناقل فارغ. ثم يتم عزل الحمض النووي الجيني من الخلايا المنقولة ويتم هضمه باستخدام Dpnأنا إنزيم التقييد. كما Dpnأنا حصريًا وعلى وجه التحديد هضم G m ATC ، ويُستدل على الأجزاء المتولدة من هذا الهضم أنها كانت على مقربة من البروتين المتفاعل مع الكروماتين موضع الاهتمام. المحولات مرتبطة بـ Dpnشظايا I المهضومة ، ثم يتم معالجة الحمض النووي DpnII ، إنزيم التقييد الذي يشق فقط GATC غير الميثيل ، ليختار بشكل مضاعف لـ G m ATC في الجينوم. يتم بعد ذلك تضخيم مكتبات الحمض النووي ويمكن تقديمها للتسلسل العميق.

لم يصل DamID إلى نفس الشعبية مثل ChIP-seq ولكنه يقدم بعض نقاط القوة الملحوظة. أولاً ، لا يعتمد DamID على الأجسام المضادة لربط عامل المظهر الجانبي ، وهي ميزة مهمة لتحديد مواصفات البروتينات غير المدروسة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت DamID هي الطريقة الأولى التي يمكن من خلالها تأكيد بيانات ChIP من خلال نهج بديل. ومع ذلك ، فإن DamID يتضرر من حقيقة أن البروتين الموصوف ليس داخليًا للخلايا المضيفة. غالبًا ما تكون مواقع الربط الخاصة ببناء اندماج السد قابلة للمقارنة مع بروتين داخلي ، ولكن من المحتمل ألا تكون متطابقة بسبب وجود بناء السد نفسه بالإضافة إلى تعبيره القائم على البلازميد. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب DamID نظامًا قابلًا للجين وراثيًا يمكن نقله باستخدام بلازميد اندماج السد. علاوة على ذلك ، فإن DamID محدود بدقته المنخفضة لأن السد يمكنه ميثيل البقايا حتى 5 كيلو بايت من موقع ربط بروتين الاندماج ، ويمكن العثور على إيجابيات خاطئة واسعة النطاق (van Steensel and Henikoff 2000). بسبب هذا النطاق من المثيلة ، من غير المرجح أن يصل DamID إلى الدقة التي توفرها التقنيات القائمة على ChIP ، ومع ذلك ، لا يتم تقييد DamID بنفس قيود الإدخال ، وقد تم استخدامه لملف تعريف ارتباط عامل النسخ من 1000 خلية ES (Tosti et al. .2018) وحتى الخلايا المفردة (Lai et al. 2019). على الرغم من أن ChIP-seq (ومؤخرًا ، CUT & ampRUN) قد حل محل DamID إلى حد كبير لتوطين العوامل ، أصبح DamID أكثر شيوعًا في دراسة ميزات الكروماتين الأوسع على سبيل المثال ، تم تطوير Chromatin Accessibility Targeted DamID (CATaDA) لتقييم الكروماتين المفتوح (Aughey et al. 2018). يستخدم CATaDa بروتين السد غير المربوط لمناطق الميثيل من الكروماتين المفتوح ، مما يترك الحمض النووي المرتبط بالنيوكليوزوم غير ميثيل (Aughey et al. 2018). تم استخدام Split DamID أيضًا لتوصيف الإشغال المشترك لبروتينين في مواقع الجينوم ، يعملان بطريقة مماثلة لشاشة الخميرة ثنائية الهجين (هاس وآخرون. Dpnتم استخدام بنية الاندماج I-GFP لفحص مثيلة GATC المدفوعة بالسد في الوقت الفعلي باستخدام الفحص المجهري (Kind et al. 2015).

قطع & ampRUN

تم تطوير الانقسام تحت الأهداف والإفراج باستخدام نوكلياز (CUT & ampRUN) بواسطة Skene و Henikoff في عام 2017 كتعديل على مستوى الجينوم لتقنية ChIC لعام 2004 لمجموعة Ulrich Laemmli ، حيث يمكن دمج البروتين المؤتلف A المندمج مع نوكلياز ميكرو (pA-MNase) مع جسم مضاد أولي لاستهداف MNase على وجه التحديد وشق الحمض النووي حول المواقع التي يرتبط فيها البروتين محل الاهتمام (الشكل 2C (شميد وآخرون 2004). تشتمل التقنيات المماثلة على الانقسام الداخلي للكروماتين (ChEC (Schmid et al. 2004) ، والذي يتضمن اندماج طرفية C لـ MNase إلى بروتين مهم و ChEC-seq ، وهو اقتران على مستوى الجينوم من ChEC وتسلسل الجيل التالي (Zentner et al. 2015). بينما تم تطبيق ChEC بنجاح لتقييم توطين البروتينات المتعددة (Baptista et al. 2017 Grunberg et al. 2016 Grunberg and Zentner 2017 Warfield et al. 2017 Zentner et al. 2015) ، فإن هذه التقنية محدودة بالحاجة إلى تحديد البروتين محل الاهتمام على وجه التحديد. CUT & ampRUN ، من ناحية أخرى ، يمكن استخدامها يقوم بروتين pA-MNase المؤتلف للتعرف على أي جسم مضاد أولي له أعمدة أساسية متوافقة مع IgG. على الرغم من أن CUT & ampRUN هي تقنية تم تطويرها مؤخرًا ، فقد تم استخدامها لتوصيف تفاعلات البروتين والحمض النووي في أرابيدوبسيسوالخميرة والذباب والفئران والخلايا البشرية ، مما يدل على مجموعة متنوعة من التطبيقات.

تتضمن تجربة CUT & ampRUN إما عزلًا نوويًا بمخزن مؤقت ناقص التوتر ليحلل الخلايا (Hainer and Fazzio 2019 Skene and Henikoff 2017) أو نفاذية الخلية باستخدام الديجيتونين (Skene وآخرون. . يتم تنفيذ الخطوات اللاحقة في النوى المرتبطة بالخرز حتى يتم تحرير أجزاء الحمض النووي المحمية قبل إعداد المكتبة. يُضاف الجسم المضاد الأولي الذي يستهدف البروتين المعني ويسمح له بالانتشار بحرية في النوى ، متبوعًا بإضافة pA-MNase المؤتلف ، والذي يتعرف على العمود الفقري IgG للجسم المضاد الأساسي ، وبالتالي يتم توجيهه تحديدًا إلى مواقع ارتباط البروتين محل الاهتمام على الكروماتين . يتم بعد ذلك تنشيط MNase بإضافة Ca 2+ وهضمه في حمام ماء جليدي (من أجل حركية هضم MNase شبه المثالية) لشق الحمض النووي وإطلاق الأجزاء المرتبطة بالبروتين في المادة الطافية. يتم بعد ذلك معالجة الأجزاء التي تم إصدارها باستخدام RNase ، وهضمها بالبروتيناز K ، وتنقيتها ، واستخدامها كمدخلات لبناء المكتبة. يتم إجراء تجارب CUT & ampRUN جنبًا إلى جنب مع نسخة مكررة يتم فيها إما ترك الجسم المضاد الأساسي خارج العينة أو استبداله بجهاز تحكم IgG ، وقياس قطع الخلفية عن طريق بناء pA-MNase المجاني وتصحيح التحيز المتأصل نحو مناطق يسهل الوصول إليها في المنطقة. الجينوم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن زيادة الحمض النووي غير المتجانسة في التفاعل عند تخليب هضم MNase (Skene and Henikoff 2017) أو التلوث بكتريا قولونية يمكن استخدام الحمض النووي من تنقية pA-MNase كزيادة في (Meers et al. 2019). يوفر CUT & ampRUN نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية ، مع خلفية مخفضة تسمح بالتسلسل الشامل مع ما يقرب من 10 ملايين قراءة ، بينما تتطلب تجربة ChIP-seq 20-40 مليون قراءة لتقييم ارتباط البروتين بدقة.

أثبتت CUT & ampRUN أنها قابلة للتكيف مع العديد من التعديلات لتلائم السياقات التجريبية ، والتي تم تطوير معظمها بواسطة مجموعة Steve Henikoff. أحد هذه التعديلات هو الأتمتة الآلية لبروتوكول التنميط عالي الإنتاجية (AutoCUT & ampRUN (Janssens وآخرون. كروماتين مركزي أو كروماتين غير قابل للذوبان بطريقة أخرى في ظل ظروف نموذجية (Thakur and Henikoff 2018). لتحسين كفاءة ربط الأجسام المضادة لـ pA-MNase ، صممت مجموعة Henikoff بنية اندماج البروتين A-Protein G-MNase المؤتلف التي تسمح بتحديد ملامح الأجسام المضادة غير الأرانب بدون خطوة جسم ثانوي (Meers et al. 2019). أخيرًا ، تم دمج CUT & ampRUN مع ChIP التقليدية (CUT & ampRUN.ChIP) التي تسمح للمرء بـ ChIP لمجمعات البروتين الموجودة داخل أجزاء CUT & ampRUN الصادرة (Brahma و Henikoff 2019). لذلك تبدو التقنية مرنة لتوصيف توطين البروتين لمجموعة متنوعة من التصاميم التجريبية والنتائج المرجوة.

في عام 2019 ، تم نشر أول تصنيف على مستوى جينوم الخلية الواحدة للبروتينات المرتبطة بالكروماتين باستخدام CUT & ampRUN لفحص عوامل تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (Hainer et al. 2019). بالإضافة إلى التنميط في الخلايا المفردة ، تم تحديد ارتباط العامل في الكيسات الأريمية المبكرة الفردية (التي تتكون من 30-50 خلية لكل منها) ، وهو تطبيق لم يكن ممكنًا في السابق باستخدام التقنيات القائمة على ChIP. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير Cleavage Under Targets and Tagmentation ، أو CUT & ampTag ، كتعديل على CUT & ampRUN الذي يستخدم اندماج بروتين A-Tn5 transposase المؤتلف بدلاً من بروتين الانصهار المؤتلف pA-MNase (Kaya-Okur et al. 2019). تم استخدام CUT & ampTag لتوصيف تعديلات هيستون في خلايا مفردة ، على الرغم من أنه لم يتم استخدامه بعد لتوصيف ارتباط عامل النسخ في الخلايا المفردة (Kaya-Okur et al. 2019). بالإضافة إلى CUT & ampTag ، تم تطوير تعديل مماثل للخلية المفردة لـ ChIC ، scChIC-seq ، والذي يتضمن ربط MNase بجسم مضاد محدد وانشقاق المواقع المستهدفة باستخدام الجسم المضاد لتوجيه MNase ، ثم تم تطوير تضخيم القطع المشقوق بشكل انتقائي بواسطة PCR ( كو وآخرون 2019). بين CUT & ampRUN و uliCUT & ampRUN و CUT & ampTag و ChEC-seq و ChIC-seq و ChIC- و ChEC المستمدة من التقنيات تبدو مهيأة لتسهيل العصر التالي من التنميط عن عامل التفاعل مع الكروماتين.

ملخص

نظرًا لأن صقل التقنية الجينومية سمح للباحثين بتحديد مواقع ارتباط العوامل على إمكانية الوصول إلى الكروماتين والحمض النووي بدقة عالية ، فقد أصبحت قيود التقنيات القياسية أكثر وضوحًا. بسبب الاختلافات بسبب عدم التجانس الخلوي ، وحركية هضم الإنزيم غير المتسقة ، وعزل العينة غير المستهدف ، ركزت التطورات الحديثة في التقنيات الجينية على تقليل إدخال العينة الضروري وإشارة الخلفية. جعلت هذه التحسينات التقنية من الممكن فحص بنية الجينوم وملامح ربط العوامل في الخلايا الفردية ، وعينات المدخلات المنخفضة مثل خزعات المريض ، ومجموعات فرعية من المجموعات الخلوية غير المتجانسة. ما ظهر من الدراسات الجينومية لإمكانية الوصول وربط العامل هو صورة معقدة لأنشطة قالب الحمض النووي التي تنظمها بنية الكروماتين.

لقد مهد تحديد إمكانية الوصول إلى الجينوم وربط العوامل المرحلة لتحديد آليات تنظيم الجينوم ، ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات هي مجرد بداية نحو فهم تنظيم الجين على المستوى الآلي. يجب دمج هذه البيانات لفهم كيفية عمل الشبكات النسخية والخلوية بشكل تعاوني ومضاد لتشكيل الجينوم الوظيفي. بالإضافة إلى ذلك ، ستكون المقارنات بين أنواع الخلايا مهمة لتوفير نظرة ثاقبة للطرق التي تدفع بها مجموعة مشتركة من العوامل وظائف خاصة بنوع الخلية.


شكر وتقدير

نشكر M. Garlovsky و S. Martin و C. Cooney و C. Roux و J. Larson و J. Mallet على التعليقات النقدية والمناقشة. قدم كل من K. Lohse و M. de la Cámara و J. Cerca و M.A Chase و C. Baskett و A.M Westram و N.H Barton ملاحظات على مسودة المخطوطة. قدم O. Seehausen ، اثنان من المراجعين المجهولين ، و AE (Michael Kopp) التعليقات التي حسنت المخطوطة بشكل كبير. أجرى V. Holzmann العديد من التصحيحات على البراهين. ساهم كل من G. Bisschop و K. Lohse في عمليات المحاكاة والتحليلات المقدمة في المربع 3. كما نود أن نتقدم بالشكر لكل من شارك في مسح الأنواع ، والذي حصل على الموافقة الأخلاقية من خلال إجراءات مراجعة الأخلاقيات بجامعة شيفيلد (التطبيق) 029768). نحن ممتنون بشكل خاص لـ R.K. Butlin لتحفيز المناقشة طوال كتابة المخطوطة وللتعليقات على مسودة سابقة.


الظروف الصحية المتعلقة بالتغيرات الجينية

ثلاسيميا بيتا

ما يقرب من 400 طفرة في HBB تم اكتشاف أن الجين يسبب ثلاسيميا بيتا. تتضمن معظم الطفرات تغييرًا في لبنة بناء DNA واحدة (نوكليوتيد) داخل أو بالقرب من HBB الجين. تقوم الطفرات الأخرى بإدخال أو حذف عدد صغير من النيوكليوتيدات في HBB الجين.

HBB تؤدي الطفرات الجينية التي تقلل من إنتاج بيتا غلوبين إلى حالة تسمى ثلاسيميا بيتا بلس (β +). تؤدي الطفرات التي تمنع الخلايا من إنتاج أي بيتا جلوبين إلى ثلاسيميا بيتا-صفر (0).

مشاكل الوحدات الفرعية التي تشكل الهيموجلوبين ، بما في ذلك المستويات المنخفضة من بيتا غلوبين ، تقلل أو تقضي على إنتاج هذا الجزيء. يعطل نقص الهيموجلوبين التطور الطبيعي لخلايا الدم الحمراء. يمكن أن يؤدي النقص في خلايا الدم الحمراء الناضجة إلى تقليل كمية الأكسجين التي يتم توصيلها إلى الأنسجة إلى ما دون المطلوب لتلبية احتياجات الجسم من الطاقة. يمكن أن يؤدي نقص الأكسجين في أنسجة الجسم إلى ضعف النمو وتلف الأعضاء ومشاكل صحية أخرى مرتبطة بمرض الثلاسيميا بيتا.

ميتهيموغلوبين الدم ، نوع بيتا غلوبين

أكثر من 10 طفرات في HBB تم العثور على جين يسبب ميتهيموغلوبين الدم ، نوع بيتا غلوبين ، وهي حالة تغير الهيموغلوبين داخل خلايا الدم الحمراء. غالبًا ما تؤثر هذه الطفرات على منطقة البروتين التي ترتبط بالهيم. لكي يرتبط الهيموغلوبين بالأكسجين ، يجب أن يكون الحديد الموجود داخل جزيء الهيم في شكل يسمى الحديد الحديدية (Fe 2+). يمكن أن يتغير الحديد الموجود داخل الهيم إلى شكل آخر من أشكال الحديد يسمى الحديد الحديدي (Fe 3+) ، والذي لا يمكنه الارتباط بالأكسجين. يُعرف الهيموغلوبين الذي يحتوي على الحديد باسم ميثيموغلوبين وهو غير قادر على توصيل الأكسجين بكفاءة إلى أنسجة الجسم.

في ميتهيموغلوبين الدم ، نوع بيتا غلوبين ، الطفرات في HBB يغير الجين بروتين بيتا غلوبين ويعزز الحديد الهيم ليتحول من الحديدوز إلى الحديدي. هذا الهيموجلوبين المتغير يعطي الدم لونًا بنيًا ويسبب مظهرًا مزرقًا للجلد والشفتين والأظافر (زرقة). تقتصر علامات وأعراض ميتهيموغلوبين الدم ، نوع بيتا غلوبين بشكل عام على الازرقاق ، والذي لا يسبب أي مشاكل صحية. ومع ذلك ، في حالات نادرة ، يمكن أن يسبب ميتهيموغلوبينية الدم الشديدة ، نوع بيتا غلوبين الصداع والضعف والإرهاق.

مرض فقر الدم المنجلي

فقر الدم المنجلي هو الشكل الأكثر شيوعًا لمرض الخلايا المنجلية. هذا النموذج ناتج عن طفرة معينة في HBB الجين الذي يؤدي إلى إنتاج نسخة غير طبيعية من بيتا غلوبين تسمى الهيموغلوبين S أو HbS. في هذه الحالة ، يحل الهيموغلوبين S محل كل من وحدات بيتا غلوبين الفرعية في الهيموغلوبين. تغير الطفرة التي تسبب الهيموغلوبين S لبنة بناء بروتينية واحدة (حمض أميني) في بيتا غلوبين. على وجه التحديد ، يتم استبدال حمض الجلوتاميك من الأحماض الأمينية بحمض أميني فالين في الموضع 6 في بيتا غلوبين ، مكتوبًا باسم Glu6Val أو E6V.يؤدي استبدال حمض الغلوتاميك بالفالين إلى التصاق وحدات الهيموغلوبين S غير الطبيعية معًا وتشكيل جزيئات طويلة وصلبة تعمل على ثني خلايا الدم الحمراء في شكل منجل (هلال). تموت الخلايا المنجلية الشكل قبل الأوان ، مما قد يؤدي إلى نقص خلايا الدم الحمراء (فقر الدم). تكون الخلايا المنجلية صلبة ويمكن أن تسد الأوعية الدموية الصغيرة ، مما يسبب ألمًا شديدًا وتلفًا للأعضاء.

الطفرات في HBB يمكن أن يسبب الجين أيضًا تشوهات أخرى في بيتا غلوبين ، مما يؤدي إلى أنواع أخرى من مرض فقر الدم المنجلي. غالبًا ما يتم تحديد هذه الأشكال غير الطبيعية من بيتا غلوبين بأحرف الأبجدية أو أحيانًا بالاسم. في هذه الأنواع الأخرى من مرض الخلايا المنجلية ، يتم استبدال وحدة فرعية واحدة فقط من بيتا-غلوبين بالهيموجلوبين S. يتم استبدال الوحدة الفرعية الأخرى لبيتا-غلوبين بمتغير مختلف غير طبيعي ، مثل الهيموجلوبين C أو الهيموجلوبين E.

في مرض الهيموغلوبين SC (HbSC) ، يتم استبدال وحدات بيتا-غلوبين الفرعية بالهيموجلوبين S والهيموجلوبين C. ينتج عن الهيموجلوبين C عندما يحل الحمض الأميني ليسين محل حمض الجلوتاميك الأميني في الموضع 6 في بيتا جلوبين (مكتوب Glu6Lys أو E6K). إن شدة مرض الهيموجلوبين SC متغيرة ، لكنها يمكن أن تكون شديدة مثل فقر الدم المنجلي. يحدث الهيموغلوبين E (HbE) عندما يتم استبدال حمض الجلوتاميك من الأحماض الأمينية بالحمض الأميني ليسين في الموضع 26 في بيتا غلوبين (مكتوب Glu26Lys أو E26K). في بعض الحالات ، تظهر طفرة الهيموجلوبين E مع الهيموجلوبين S. في هذه الحالات ، قد يكون لدى الشخص علامات وأعراض أكثر حدة مرتبطة بفقر الدم المنجلي ، مثل نوبات الألم وفقر الدم ووظيفة الطحال غير الطبيعية.

تحدث حالات أخرى ، تُعرف باسم ثلاسيميا الهيموجلوبين المنجلية بيتا (HbSBetaThal) ، عندما تحدث الطفرات التي تنتج الهيموغلوبين S وبيتا ثلاسيميا معًا. تؤدي الطفرات التي تجمع بين مرض فقر الدم المنجلي مع ثلاسيميا بيتا-صفر (0) إلى مرض شديد ، بينما يكون مرض فقر الدم المنجلي المصحوب بمرض فقر الدم المنجلي (β +) أكثر اعتدالًا بشكل عام.

اضطرابات أخرى

تم تحديد مئات الاختلافات في HBB الجين. تؤدي هذه التغييرات إلى إنتاج إصدارات مختلفة من بيتا جلوبين. بعض هذه الاختلافات لا تسبب أي علامات أو أعراض ملحوظة وتوجد عندما يتم عمل الدم لأسباب أخرى ، في حين أن أسباب أخرى HBB قد تؤثر الاختلافات الجينية على صحة الشخص. اثنان من أكثر المتغيرات شيوعًا هما الهيموغلوبين C والهيموغلوبين E.

يُعد الهيموغلوبين C (HbC) ، الناجم عن طفرة Glu6Lys في بيتا غلوبين ، أكثر شيوعًا في الأشخاص المنحدرين من أصل غرب إفريقيا منه لدى السكان الآخرين. الأشخاص الذين لديهم وحدتان فرعيتان من الهيموغلوبين C في الهيموجلوبين لديهم ، بدلاً من بيتا غلوبين العادي ، يعانون من حالة خفيفة تسمى مرض الهيموغلوبين سي. غالبًا ما تسبب هذه الحالة فقر الدم المزمن ، حيث يتم تكسير خلايا الدم الحمراء قبل الأوان.

الهيموغلوبين E (HbE) ، الناجم عن طفرة Glu26Lys في بيتا غلوبين ، هو نوع من الهيموغلوبين الأكثر شيوعًا في سكان جنوب شرق آسيا. عندما يكون لدى الشخص وحدتان فرعيتان من الهيموغلوبين E في الهيموغلوبين بدلاً من بيتا غلوبين ، يمكن أن يحدث فقر دم خفيف يسمى مرض الهيموغلوبين E. في بعض الحالات ، توجد الطفرات التي تنتج الهيموجلوبين E وبيتا ثلاسيميا معًا. يمكن أن يعاني الأشخاص المصابون بمزيج الهيموغلوبين من علامات وأعراض تتراوح من فقر الدم الخفيف إلى الثلاسيميا الكبرى.


الظروف الصحية المتعلقة بالتغيرات الكروموسومية

ترتبط الشروط الكروموسومية التالية بالتغيرات في بنية أو عدد نسخ الكروموسوم 9.

9q22.3 الحذف الصغير

9q22.3 الحذف الصغير هو تغيير كروموسومي يتم فيه حذف قطعة صغيرة من الذراع الطويلة (q) للكروموسوم 9 في كل خلية. يفتقد الأفراد المتأثرون إلى ما لا يقل عن 352000 زوجًا أساسيًا ، مكتوبًا أيضًا على هيئة 352 كيلو قاعدة (kb) ، في منطقة q22.3 من الكروموسوم 9. يُعرف هذا الجزء الذي يبلغ حجمه 352 كيلو بايت باسم المنطقة الحرجة الدنيا لأنه أصغر حذف تم إجراؤه وجد أنها تسبب العلامات والأعراض المتعلقة بالحذف الصغير 9q22.3. تشمل هذه العلامات والأعراض تأخر النمو ، والإعاقة الذهنية ، وبعض التشوهات الجسدية ، والسمات المميزة لحالة وراثية تسمى متلازمة جورلين (المعروفة أيضًا باسم متلازمة سرطان الخلايا القاعدية الوحمية). يمكن أن تكون عمليات الحذف الصغيرة 9q22.3 أكبر بكثير ، حيث تضمن أكبر حذف تم الإبلاغ عنه 20.5 مليون زوج أساسي (20.5 ميجا بايت).

يفتقد الأشخاص الذين يعانون من الحذف الصغير 9q22.3 من اثنين إلى أكثر من 270 جينًا على الكروموسوم 9. تشتمل جميع عمليات الحذف الدقيقة 9q22.3 المعروفة على PTCH1 الجين. يعتقد الباحثون أن العديد من الميزات المرتبطة بالحذف الصغير 9q22.3 ، وخاصة علامات وأعراض متلازمة جورلين ، ناتجة عن فقدان PTCH1 الجين. من المحتمل أن تنجم العلامات والأعراض الأخرى المتعلقة بالحذف الصغير 9q22.3 عن فقدان جينات إضافية في منطقة q22.3. يعمل الباحثون على تحديد الجينات المفقودة التي تساهم في الميزات الأخرى المرتبطة بالحذف.

سرطان المثانة

توجد عمليات حذف جزء من الكروموسوم 9 أو كله في سرطان المثانة. سرطان المثانة هو مرض تصبح فيه خلايا معينة في المثانة غير طبيعية وتتكاثر دون حسيب ولا رقيب لتشكل ورمًا. قد يتسبب سرطان المثانة في ظهور دم في البول ، وألم أثناء التبول ، وكثرة التبول ، والشعور بالحاجة إلى التبول دون القدرة على ذلك ، أو آلام أسفل الظهر.

ينقسم سرطان المثانة عمومًا إلى نوعين ، سرطان المثانة غير الغازي للعضلات (NMIBC) وسرطان المثانة الغازي للعضلات (MIBC) ، بناءً على مكان وجود الورم في المثانة. العديد من حالات أورام NMIBC لها حذف للكروموسوم 9 ، والذي يحدث عادة في وقت مبكر من تكوين الورم. تظهر هذه التغيرات الكروموسومية فقط في الخلايا السرطانية. تظهر الأبحاث أن العديد من الجينات التي تتحكم في نمو الخلايا وانقسامها توجد في الكروموسوم 9. العديد من هذه الجينات هي كابتات للأورام ، مما يعني أنها تساعد عادةً في منع الخلايا من النمو والانقسام بطريقة غير منضبطة. من المحتمل أن يلعب فقدان واحد أو أكثر من هذه الجينات دورًا في التطور المبكر لسرطان المثانة وتطوره.

سرطان الدم النخاعي المزمن

تؤدي إعادة ترتيب (إزفاء) المادة الجينية بين الكروموسومات 9 و 22 إلى نوع من سرطان الخلايا المكونة للدم يسمى ابيضاض الدم النخاعي المزمن. يؤدي هذا السرطان البطيء النمو إلى زيادة إنتاج خلايا الدم البيضاء غير الطبيعية. تشمل السمات الشائعة للحالة التعب المفرط (التعب) والحمى وفقدان الوزن وتضخم الطحال.

النقل المتضمن في هذه الحالة ، مكتوبًا بالرمز t (922) ، يدمج جزءًا من ABL1 الجين من الكروموسوم 9 مع جزء من BCR الجين من الكروموسوم 22 ، مما يخلق جين اندماج غير طبيعي يسمى BCR-ABL1. يطلق على الكروموسوم 22 غير الطبيعي ، الذي يحتوي على قطعة من الكروموسوم 9 وجين الاندماج ، عادةً كروموسوم فيلادلفيا. يتم الحصول على الإزاحة خلال حياة الشخص وهي موجودة فقط في خلايا الدم غير الطبيعية. هذا النوع من التغيير الجيني ، الذي يسمى الطفرة الجسدية ، ليس وراثيًا.

البروتين المنتج من BCR-ABL1 يشير الجين للخلايا إلى استمرار الانقسام بشكل غير طبيعي ويمنعها من التدمير الذاتي ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاج الخلايا غير الطبيعية.

تم العثور على كروموسوم فيلادلفيا أيضًا في بعض حالات سرطانات الدم سريعة التقدم والمعروفة باسم اللوكيميا الحادة. من المحتمل أن يكون شكل سرطان الدم الذي يتطور يتأثر بنوع خلايا الدم التي تكتسب الطفرة والتغيرات الجينية الأخرى التي تحدث. يوفر وجود كروموسوم فيلادلفيا هدفًا للعلاجات الجزيئية.

متلازمة كليفسترا

يفتقد معظم المصابين بمتلازمة كليفسترا ، وهو اضطراب له علامات وأعراض تشمل أجزاء كثيرة من الجسم ، تسلسلًا من حوالي مليون لبنة بناء DNA (أزواج قاعدية) في نسخة واحدة من الكروموسوم 9 في كل خلية. يحدث الحذف بالقرب من نهاية الذراع الطويلة (q) للكروموسوم في موقع محدد q34.3 ، وهي منطقة تحتوي على جين يسمى EHMT1. بعض الأفراد المتأثرين لديهم عمليات حذف أقصر أو أطول في نفس المنطقة.

فقدان EHMT1 يُعتقد أن جينًا من نسخة واحدة من الكروموسوم 9 في كل خلية مسؤول عن السمات المميزة لمتلازمة كليفسترا لدى الأشخاص المصابين بحذف 9q34.3. ومع ذلك ، فإن فقدان الجينات الأخرى في نفس المنطقة قد يؤدي إلى مشاكل صحية إضافية لدى بعض الأفراد المصابين.

ال EHMT1 يقدم الجين تعليمات لصنع إنزيم يسمى euchromatic histone methyltransferase 1. هيستون methyltransferase هي إنزيمات تقوم بتعديل بروتينات تسمى الهستونات. الهيستونات عبارة عن بروتينات هيكلية تربط (ترتبط) بالحمض النووي وتعطي الصبغيات شكلها. عن طريق إضافة جزيء يسمى مجموعة الميثيل إلى الهيستونات ، يمكن أن يوقف هيستون ميثيل ترانسفيراز (قمع) نشاط جينات معينة ، وهو أمر ضروري للتطور الطبيعي والوظيفة. يؤدي نقص إنزيم هيستون ميثيل ترانسفيراز 1 المتساوي اللون إلى إعاقة التحكم السليم في نشاط جينات معينة في العديد من أعضاء وأنسجة الجسم ، مما يؤدي إلى حدوث خلل في التطور والوظيفة المميزة لمتلازمة كليفسترا.

حالات صبغية أخرى

يمكن أن يكون للتغييرات الأخرى في بنية أو عدد نسخ الكروموسوم 9 تأثيرات متنوعة. تعد الإعاقة الذهنية وتأخر النمو وملامح الوجه المميزة وشكل الرأس غير المعتاد من السمات الشائعة. تتضمن التغييرات في الكروموسوم 9 قطعة إضافية من الكروموسوم في كل خلية (التثلث الصبغي الجزئي) ، وجزءًا مفقودًا من الكروموسوم في كل خلية (الصبغ الأحادي الجزئي) ، وبنية دائرية تسمى كروموسوم الحلقة 9. ويحدث الكروموسوم الحلقي عندما يحدث كلا الطرفين من الكروموسوم المكسور. يمكن أن تؤدي عمليات إعادة ترتيب المواد الجينية بين الكروموسوم 9 والكروموسومات الأخرى إلى وجود أجزاء كروموسوم إضافية أو مفقودة.

السرطانات الأخرى

تم العثور على تغييرات في بنية الكروموسوم 9 في العديد من أنواع السرطان. هذه التغييرات ، التي تحدث فقط في الخلايا التي تؤدي إلى الإصابة بالسرطان ، عادة ما تنطوي على فقدان جزء من الكروموسوم أو إعادة ترتيب المادة الصبغية. على سبيل المثال ، تم تحديد فقدان جزء من الذراع الطويلة (q) للكروموسوم 9 في بعض أنواع أورام المخ. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عمليات إعادة ترتيب الكروموسومات التي تدمج ABL1 الجين مع جينات أخرى غير BCR تم العثور عليها في عدد قليل من اللوكيميا الحادة. الآليات الدقيقة التي تؤدي بها هذه التغييرات الجينية إلى الإصابة بالسرطان ليست مفهومة تمامًا ، على الرغم من أنه من المحتمل أن البروتينات المنتجة منها تعزز النمو غير المنضبط للخلايا.