معلومة

10.4: بنية الحمض النووي الريبي - علم الأحياء

10.4: بنية الحمض النووي الريبي - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد تعلمنا عن الوظائف المختلفة للحمض النووي الريبي ، ويجب أن يكون واضحًا الآن مدى أهمية دور الحمض النووي الريبي في الأنظمة الحية. نظرًا لأنه من المستحيل فهم كيفية قيام RNA فعليًا بكل هذه الأنشطة في الخلية ، دون معرفة ما هو هيكلها ، سننظر في هذا الجزء في بنية الحمض النووي الريبي.

يمكن دراسة بنية الحمض النووي الريبي في ثلاثة مستويات مختلفة:

  1. الهيكل الأساسي: التسلسل الذي يتم فيه محاذاة القواعد (U ، A ، C ، G).
  2. البنية الثانوية: التحليل ثنائي الأبعاد للروابط [الهيدروجينية] بين أجزاء مختلفة من الحمض النووي الريبي. بعبارة أخرى ، حيث يصبح RNA مزدوج الشريطة ، حيث يشكل RNA دبوس شعر أو حلقة أو أشكال أخرى مماثلة.
  3. البنية الثلاثية: البنية الكاملة ثلاثية الأبعاد للحمض النووي الريبي ، أي كيف تنحني السلسلة وأين تلتف وهكذا.

كما ذكرنا من قبل ، فإن وجود الريبوز في الحمض النووي الريبي يمكّنه من الثني وإنشاء حلزون مزدوج بنفسه. من السهل الحصول على الهيكل الأساسي من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي. نحن مهتمون بشكل أساسي بفهم البنية الثانوية لـ RNA: حيث تتشكل الحلقات والروابط الهيدروجينية وتخلق السمات الوظيفية لـ RNA. من الناحية المثالية ، نود دراسة البنية الثلاثية لأن هذه هي الحالة النهائية للحمض النووي الريبي ، وما يمنحها وظائفها الحقيقية. ومع ذلك ، من الصعب للغاية حساب الهيكل الجامعي ويتجاوز نطاق هذه المحاضرة.

على الرغم من أن دراسة البنية الثانوية قد تكون صعبة ، إلا أن هناك بعض الأفكار البسيطة التي تعمل جيدًا في التنبؤ بها. على عكس البروتينات ، في RNA ، تأتي معظم الطاقة الحرة للجزيء من بنيته الثانوية (وليس من الدرجة الثالثة في حالة البروتينات). تنثني الحمض النووي الريبي في البداية في بنيتها الثانوية ثم تشكل هيكلها الثالث ، وبالتالي هناك حقائق مثيرة للاهتمام للغاية يمكننا التعرف عليها عن جزيء معين من الحمض النووي الريبي بمجرد معرفة بنيته الثانوية.

أخيرًا ، هناك خاصية أخرى رائعة للبنية الثانوية وهي أنها عادة ما تكون محفوظة جيدًا في التطور ، مما يساعدنا على تحسين تنبؤات البنية الثانوية وأيضًا للعثور على ncRNA (الحمض النووي الريبي غير المشفر). هناك تمثيلات مستخدمة على نطاق واسع للهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي:

بشكل رسمي: الهيكل الثانوي عبارة عن رسم بياني يسمى الرأس على رؤوس n مع مصفوفة مجاورة A = (aij) تحقق:

• أأنا ، أنا + 1 = 1ل1 ≤ أنا ≤ n1 (العمود الفقري المستمر)
• لكل i ، 1≤i≤N هناك واحد على الأكثر أاي جاي = 1 حيث (j gneqq i +/- 1 ) (تشكل القاعدة فقط زوجًا مع الآخر في ذلك الوقت)
• اذا كاناي جاي = أكوالا لمبور = 1andi

RNAstructure ، الإصدار 6.3:

RNAstructure عبارة عن حزمة كاملة لتنبؤ وتحليل البنية الثانوية للحمض النووي الريبي والحمض النووي. يتضمن خوارزميات للتنبؤ بالهيكل الثانوي ، بما في ذلك وسيلة للتنبؤ باحتمالات الاقتران الأساسي. يمكن استخدامه أيضًا للتنبؤ بالهياكل ثنائية الجزيء ويمكنه التنبؤ بألفة ربط التوازن لأوليغنوكليوتيد مع هدف RNA منظم. هذا مفيد لتصميم siRNA. يمكن أن يتنبأ أيضًا بالبنى الثانوية المشتركة في تسلسلين غير محاذيين ، وهو أكثر دقة من تنبؤ البنية الثانوية أحادية التسلسل. أخيرًا ، يمكن أن تأخذ بنية RNA عددًا من الأنواع المختلفة لبيانات تعيين التجربة لتقييد أو تقييد تنبؤ البنية. وتشمل هذه الخرائط الكيميائية ، ورسم الخرائط الإنزيمية ، وبيانات الرنين المغناطيسي النووي ، وبيانات الشكل.

يتوفر RNAstructure كواجهة مستخدم رسومية لنظام التشغيل Windows وواجهة مستخدم رسومية لـ JAVA لنظام التشغيل Mac OS-X أو واجهات سطر أوامر Linux لنظام التشغيل Max OS-X أو Linux أو Windows وكود المصدر للترجمة المحلية. يشتمل الكود المصدري على مجموعة من فئات C ++ لإدراجها بسهولة في البرامج الجديدة.


الهيكل والفاعلية والبيولوجيا للحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة

يركز هذا الفصل على التركيب والخصائص الفيزيائية والكيميائية للحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة (dsRNA) على الإنزيمات التي تتحلل أو تعدل أو تعدل بنية ووظيفة الرنا المزدوج الجديلة وعلى أشكال البروتين التي تتعرف بشكل خاص على الرنا المزدوج الجديلة. يناقش التمثيل الغذائي والوظائف التنظيمية للـ dsRNA في الخلية بدائية النواة ، وكذلك وظائف dsRNA والإنزيمات الخاصة بـ dsRNA في الخلايا حقيقية النواة. كما يغطي الاستجابة الخلوية والفسيولوجية للثدييات للـ dsRNA واحتمالات الرنا المزدوج الجديلة كعامل علاجي. الحلزون المزدوج للحمض النووي الريبي (RNA) هو عنصر بنيوي موجود في كل مكان في الكائنات الحية. يتم إنشاء الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل بواسطة عدد من مسارات التخليق الحيوي ، ثم يتم تحللها أو تشويهها أو تعديلها على وجه التحديد من خلال الأنشطة الأنزيمية. كما أنه بمثابة مستودع ثابت للمعلومات الجينية للعديد من الفيروسات. حفزت الأدوار الوظيفية المتنوعة لل dsRNA دراسات مكثفة على العمليات الكيميائية الحيوية التي تنطوي على dsRNA. جاءت المعلومات الهيكلية الأولى عن الرنا المزدوج الجديلة من تحليلات حيود الأشعة السينية لألياف الحمض النووي الريبي الاصطناعية أو التي تحدث بشكل طبيعي. توفر تحليلات هياكل RNAs بدائية النواة المضادة للاندماج والتفاعلات الدقيقة مع أهدافها نظرة ثاقبة لديناميكيات تكوين dsRNA والطريقة التي يتم بها تنظيم التعبير الجيني عن طريق تفاعلات RNA-RNA.


نتائج

يحتوي تصميم sgRNA الحالي الأكثر شيوعًا على تقصير مزدوج بمقدار 10 نقطة أساس مقارنةً بالتصميم المزدوج الأصلي لـ crRNA-tracrRNA (الشكل 1 أ) ، والذي لا يبدو أنه يقلل من وظائفه في المختبر [6]. هسو وآخرون. [9] أظهر أيضًا أن تمديد الازدواج يبدو أنه ليس له أي تأثير على كفاءة الضربة القاضية في الخلايا. ومع ذلك ، Chen et al. [10] أظهر أن تمديد الازدواج يعزز بشكل كبير كفاءة التصوير لبروتين الاندماج dCas9-GFP في الخلايا. كنا نشك في أن تمديد الازدواج قد يزيد من كفاءة الضربة القاضية في الخلايا. لاختبار هذه الفرضية ، قمنا بتوسيع الازدواج في اثنين من sgRNAs تستهدف CCR5 الجين ، كما هو مبين في الشكل 1 أ ، وحدد كفاءة الضربة القاضية لهذه المسوخ في خلايا TZM-bl. أدى توسيع وحدة الطباعة على الوجهين بمقدار 1 أو 3 أو 5 أو 8 أو 10 نقاط أساس إلى زيادة كبيرة في كفاءة الضربة القاضية في كل من sgRNAs المختبرين ، ويبدو أن تمديد الإرسال على الوجهين بمقدار 5 نقاط أساس يعطي أعلى كفاءة على مستوى البروتين (الشكل 1 ب الشكل S2 في إضافية ملف 1). تم تأكيد معدل التعديل على مستوى الحمض النووي أيضًا عن طريق التسلسل العميق للمواقع المستهدفة (ملف إضافي 2) ، وكانت النتائج مرتبطة جيدًا بالنتائج المحددة على مستوى البروتين (الشكل 1 ب الشكل S2 في ملف إضافي 1). نظرًا لأن قياس معدل التعديل عن طريق التسلسل العميق يعد أكثر تكلفة ويتطلب عمالة مكثفة ، فقد اعتمدنا بشكل أساسي على فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لتحديد CCR5 معدل التعطيل في هذه الدراسة. عندما تم اختبار تأثير تمديد مزدوج الاتجاه لـ sgRNA آخر (sp2) ، كانت النتائج متوافقة مع تلك الخاصة بـ sp1 (الشكل 1 ج ، الشكل S2 في ملف إضافي 1). وبالتالي ، يبدو أن تمديد الطباعة المزدوجة يزيد من كفاءة الضربة القاضية لنظام CRISPR-Cas9.

يمكن زيادة كفاءة الضربة القاضية عن طريق تمديد الازدواج وتعطيل التسلسل المستمر لـ Ts. أ التمديد على الوجهين. لون أخضر يشير إلى 3 '34 نيوكليوتيدات ، وهي ليست مطلوبة لوظيفة sgRNA في المختبر ولكنها مطلوبة في الخلايا أحمر يشير إلى أزواج القاعدة الممتدة. ب أدى تمديد الازدواج إلى زيادة كفاءة الضربة القاضية. يبني إيواء sgRNAs التي تستهدف CCR5 تم نقل الجين مع بلازميد معبر عن Cas9 إلى خلايا TZM-bl. خدم sgRNA الذي يستهدف جينوم فيروس نقص المناعة البشرية كعنصر تحكم وهمي. تم فرز الخلايا الإيجابية لـ GFP بعد 48 ساعة من تعداء ، وتم تحديد معدلات تعديل الجينات على مستويات البروتين والحمض النووي ، على التوالي. اضطراب مستوى البروتين: تم تحديد التعبير عن CCR5 من خلال تحليل التدفق الخلوي. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S2 في ملف إضافي 1. معدل تعديل مستوى الحمض النووي: تم استخراج الحمض النووي الجيني ، وتم تضخيم المواقع المستهدفة وتسلسلها بعمق باستخدام جهاز التسلسل MiSeq. يتم توفير البيانات الأولية في ملف إضافي 2. ج التجربة في (ب) على مستوى البروتين ل sgRNA آخر ، sp2. الفرق مع (ب) هو أن الخلايا لم يتم فرزها ، ولكن ملف CCR5 تم قياس معدل التعطيل في الخلايا الإيجابية GFP. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S2 في ملف إضافي 1. د تحور بوليميراز الحمض النووي الريبي (بول الثالث) إشارة الإيقاف المؤقت زادت بشكل كبير من كفاءة الضربة القاضية. يتم عرض النيوكليوتيدات الطافرة في بالخط العريض. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S3 في ملف إضافي 1. تمثل الرسوم البيانية التكرارات البيولوجية من واحدة من ثلاث تجارب مستقلة ذات نتائج مماثلة ، والتي تظهر على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (ن = 3). تم حساب الأهمية باستخدام Student ر-اختبار: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.005 ****ص & lt 0.001. ا أصلي، م متحولة

نظرًا لأن التسلسل المستمر لـ Ts بعد تسلسل الدليل هو إشارة توقف لـ RNA polymerase III [11] ، فقد تمت دراسة تأثير تعطيله في sgRNAs سابقًا [9 ، 10]. لقد اشتبهنا في أن تحور التسلسل المستمر لـ Ts قد يؤدي أيضًا إلى تحسين كفاءة الضربة القاضية في الخلايا. وفقًا لذلك ، قمنا بتحور هذا التسلسل في مواقع مختلفة وحددنا كفاءة الضربة القاضية للطفرات (الشكل 1 د الشكل S3 في ملف إضافي 1). تمت زيادة كفاءة الضربة القاضية في جميع المسوخ ، وكان للطفرة في الموضع 4 التأثير الأكبر.

بعد ذلك ، حققنا بشكل منهجي في تأثير تمديد الازدواج أثناء تحوير T الرابع في تسلسل Ts (الشكل 2 أ الشكل S4 في ملف إضافي 1). تمشيا مع النتيجة الموضحة في الشكل 1 ب ، أدى تحوير T الرابع إلى زيادة كفاءة الضربة القاضية بشكل كبير لجميع الرناوات الصغيرة الحجم (sgRNAs) المختبرة (الشكل 2 أ). علاوة على الزيادة الناتجة عن الطفرة ، أدى تمديد الازدواج أيضًا إلى زيادة كفاءة الضربة القاضية ، ووصلت إلى ذروتها عند حوالي 5 نقاط أساس ، ولكنها انخفضت بعد ذلك مع امتدادات أطول ، على الرغم من أن النمط يبدو مختلفًا بعض الشيء بالنسبة لـ sgRNAs المختلفة (الشكل 2 أ) ، والتي يتوافق مع نتائج Chen et al. التي تظهر أن تعديل كلا العنصرين يعزز بشكل كبير كفاءة التصوير لبروتين الاندماج dCas9-GFP في الخلايا [10].

يمكن زيادة كفاءة الضربة القاضية من خلال الجمع بين التمديد المزدوج مع تعطيل التسلسل المستمر لـ Ts. أ تأثير التمديد المزدوج عند تحوير الرابع T إلى A في أربعة sgRNAs. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S4 في ملف إضافي 1. ب تأثير طفرة Ts في المواضع المشار إليها إلى A أو C أو G عند تمديد الإرسال على الوجهين بمقدار 5 نقاط أساس. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S5 في ملف إضافي 1. تمثل الرسوم البيانية التكرارات البيولوجية من واحدة من ثلاث تجارب مستقلة ذات نتائج مماثلة ، والتي تظهر على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (ن = 3). تم حساب الأهمية باستخدام Student ر-اختبار: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.005 ****ص & lt 0.001. م متحولة

لقد اختبرنا سابقًا تأثير الطفرة T → A على كفاءة الضربة القاضية دون تمديد الطباعة على الوجهين (الشكل 1 ج). بعد ذلك ، أردنا أيضًا اختبار تأثير تحور T → A أو C أو G أثناء تمديد الطباعة على الوجهين أيضًا. تمشيا مع الملاحظات السابقة ، كان للطفرات في الموضع 4 بشكل عام أعلى كفاءة خروج قاضية ، على الرغم من أن تحور T → C في الموضع 1 كان له نفس الفعالية. بالإضافة إلى ذلك ، كان للطفرة T → C أو G بشكل عام كفاءة خروج قاضية أعلى من تحور T → A في مواضع مختلفة (الشكل 2 ب الشكل S5 في ملف إضافي 1). وبالتالي ، فإن تحوير T → C أو G في الموضع 4 أسفر عن أعلى كفاءة خروج قاضية.

بناءً على هذه النتائج ، قم بتحويل T → G أو C في الموضع 4 وتمديد الازدواج بمقدار

يبدو أن 5 نقاط أساس لتحقيق بنية sgRNA الأمثل ، مع أعلى كفاءة خروج المغلوب. لذلك ، قمنا بمقارنة كفاءة الضربة القاضية للهياكل الأصلية والمحسّنة لاستهداف 16 sgRNAs CCR5. كان للبنية المثالية النموذجية طفرة T → G في الموضع 4 وتمديد الطباعة على الوجهين بمقدار 5 نقاط أساس. في 15 من أصل 16 sgRNAs ، زاد الهيكل المُحسَّن من كفاءة الضربة القاضية بشكل كبير وبالنسبة لـ sp10 و 14 و 15 و 17 و 18 فعلوا ذلك بشكل كبير (الشكل 3 أ الشكل S6 في ملف إضافي 1).

يتفوق هيكل sgRNA المُحسَّن على الإصدار الأصلي. أ CCR5 تم تحديد كفاءة الضربة القاضية لاستهداف sgRNAs المشار إليه CCR5 مع بنية sgRNA محسّنة أو الهيكل الأصلي. تم تحديد كفاءة الضربة القاضية بنفس الطريقة كما في الشكل 1 ب. تم زرع البيانات الأولية في الشكل S6 في ملف إضافي 1. ب CD4 تم تحديد كفاءة الضربة القاضية لـ sgRNAs المشار إليها التي تستهدف CD4 الجين ، مع نسختين من بنية sgRNA في خلايا Jurkat. تم تحليل الخلايا للتعبير عن CD4 عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد 72 ساعة من تعداء العدوى. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S7 في ملف إضافي 1. ج طفرات T → C و T → G متفوقة على طفرة T → A. أحد عشر sgRNAs استهداف CCR5 تم اختيارهم بشكل عشوائي. تم تحديد كفاءة الضربة القاضية لـ sgRNAs مع طفرات مختلفة في الموضع 4 في تسلسل Ts المستمر كما في الشكل 1 ج. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S9 في ملف إضافي 1. تمثل الرسوم البيانية التكرارات البيولوجية من واحدة من ثلاث تجارب مستقلة ذات نتائج مماثلة ، والتي تظهر على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (ن = 3). تم حساب الأهمية باستخدام Student ر-اختبار: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.005 ****ص & lt 0.001

لاستبعاد احتمال أن تكون الزيادة في كفاءة الضربة القاضية باستخدام بنية sgRNA المحسّنة مقصورة على خلايا TZM-bl أو CCR5 الجين ، قمنا أيضًا باختبار ثمانية sgRNAs تستهدف CD4 الجين في خلايا Jurkat. تمشيا مع النتائج التي لوحظت في خلايا TZM-bl لـ CCR5 الجين ، فإن تصميم sgRNA المحسّن زاد أيضًا بشكل كبير من كفاءة التخلص من CD4 الجين في خط خلية Jurkat (الشكل 3 ب الشكل S7 في ملف إضافي 1). وبالتالي ، يبدو أن بنية sgRNA المُحسَّنة تزيد بشكل عام من كفاءة الضربة القاضية.

بلغ التأثير المفيد لتمديد الإرسال على الوجهين ذروته عند حوالي 5 نقاط أساس من الطول الإضافي (الشكل 2 أ). لاختبار ما إذا كان تمديد الإرسال على الوجهين بمقدار 5 نقاط أساس أفضل من تمديده بمقدار 4 نقاط أساس أو 6 نقاط أساس ، قمنا بتوسيع الإرسال على الوجهين بمقدار 4 نقاط أساس أو 6 نقاط أساس وقارننا كفاءات الضربة القاضية الناتجة لـ 16 sgRNAs في الشكل 3 أ. كما هو مبين في الشكل S8 في الملف الإضافي 1 ، يبدو أن تمديد الإرسال على الوجهين بمقدار 4 نقاط أساس أو 6 نقاط أساس يؤدي إلى كفاءة خروج قاضية مماثلة لـ 5 نقاط أساس في معظم الحالات.

سابقًا ، Chen et al. [10] أظهر أن تحور T → A في الموضع 4 مع تمديد الازدواج بمقدار 5 نقاط أساس عزز بشكل كبير كفاءة التصوير لبروتين الاندماج dCas9-GFP في الخلايا. أظهرت نتائجنا أن تمديد الازدواج بمقدار 4-6 نقطة أساس وتحوير T → C أو G في الموضع 4 زاد بشكل كبير من كفاءة الضربة القاضية. لمقارنة تأثير تصميمين لـ sgRNA على زيادة كفاءة الضربة القاضية ، اخترنا عشوائياً استهداف عشرة sgRNAs CCR5 وقارنوا كفاءاتهم بالضربة القاضية مع الطفرات المختلفة. كما هو مبين في الشكل 3 ج ، فإن كل طفرات T → C ومعظم (تسعة من عشرة) من طفرات T → G كان لها كفاءة خروج قاضية أعلى بكثير من طفرة T → A. من الجدير بالذكر أنه على الرغم من أن طفرة T → C كان لها في معظم الحالات مستوى مماثل من كفاءة الضربة القاضية مثل طفرة T → G ، إلا أنها كانت تتمتع بكفاءة خروج قاضية أعلى بشكل ملحوظ في sp11 (+11٪ ، ص = 0.006) و sp19 sgRNAs (+6٪ ، ص = 0.026) (الشكل 3 ج ، الشكل S9 في ملف إضافي 1) ، مما يشير إلى أن طفرة T → C قد تكون الخيار الأفضل.

إنشاء طفرة تحول الإطار باستخدام sgRNA بشكل عام غير كافٍ للتحقيق في فقدان وظيفة الجينات غير المشفرة ، مثل RNAs الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) أو جينات microRNA. تتمثل الإستراتيجية الأفضل في استئصال كل أو جزء من الجين المعني ، الأمر الذي يتطلب قطع موضعين في وقت واحد وربط نقطتي التوقف معًا. كفاءة توليد هذا النوع من طفرة الحذف منخفضة جدًا مع قوالب تصميم sgRNA الحالية ، ومع ذلك ، تم تحسين كفاءة الحذف بشكل كبير (حوالي عشرة أضعاف) في جميع الأزواج الأربعة من sgRNAs التي تم اختبارها هنا (الشكل 4). إذا تم استخدام بنية sgRNA الأصلية ، حيث تراوحت كفاءة الحذف من 1.6 إلى 6.3٪ (الشكل 2 ج) ، لحذف الجينات المستهدفة ، فسيتعين على المرء فحص مئات المستعمرات لتحديد المستعمرات بالحذف ، وهو أمر شاق. مهمة. باستخدام sgRNAs المُحسَّنة ، حيث تراوحت كفاءة الحذف من 17.7-55.9٪ (الشكل 4) ، سيكون عدد المستعمرات التي يجب فحصها لتحديد تلك التي تم حذفها ضمن حدود الجدوى. وبالتالي ، فإن قالب sgRNA المحسن من شأنه تبسيط إجراء تحرير الجينوم ، وبالتالي تعزيز فائدته المحتملة.

يتم زيادة كفاءة حذف الجينات بشكل كبير باستخدام sgRNAs الأمثل. أ ال CCR5 حذف الجينات. ب استهداف أزواج سجرنا CCR5 مع الهياكل الأصلية أو المُحسَّنة تم نقلها بشكل مشترك إلى خلايا TZM-bl باستخدام بلازميد معبر عن Cas9. تم تحديد كفاءة حذف الجينات من خلال تضخيم CCR5 جزء الجين. لاحظ أن الأجزاء المقطوعة من CCR5 ، بحجم أصغر من النوع البري CCR5 ، هي نتيجة لحذف الجينات باستخدام sgRNAs المقترنة. تشير الأرقام الموجودة أسفل كل حارة إلى النسبة المئوية للحذف

من المحتمل أن يؤدي تحور Ts المتجاورة إلى زيادة إنتاج sgRNAs. وبالتالي ، لفهم كيف تزيد التعديلات من كفاءة الضربة القاضية ، قمنا بقياس مستوى الحمض النووي الريبي لهياكل sgRNA المختلفة. أولاً ، فحصنا ملف CCR5 كفاءة الضربة القاضية لـ sgRNA مع ازدواج ممتد أو تسلسل مستمر متحور لـ Ts أو مع كليهما. تمشيا مع دراستنا السابقة ، زاد كلا التعديلين بشكل فردي من كفاءة الضربة القاضية ، وفي نفس الوقت زادوا من كفاءة الضربة القاضية (الشكل 5 أ الشكل S10 في ملف إضافي 1). بعد ذلك ، قمنا بقياس مستويات sgRNA في الخلايا المنقولة. أدى تحوير التسلسل المستمر لـ Ts إلى زيادة كبيرة في مستوى sgRNA ، ويبدو أن تمديد الازدواج أدى أيضًا إلى زيادة طفيفة في مستوى sgRNA (الشكل 5 ب). للتأكد مما إذا كانت زيادة إنتاج sgRNA أو بنية sgRNA أو كليهما مسؤولة عن زيادة فعالية الضربة القاضية ، قمنا بنقل خلايا CD4 + T المنشطة مع بروتين Cas9 المحمّل مسبقًا بـ sgRNAs المنسوخة في المختبر ، والذي يستبعد تأثير تغيير مستوى الحمض النووي الريبي لأنه في هذه الحالة كمية من يبقى sgRNA كما هو. في التجارب الأولية ، كانت النتائج باستخدام sgRNAs المنسوخة في المختبر متغيرة للغاية ، لأن هذه الجزيئات تشكل ثنائيات إلى نطاقات متغيرة تتداخل مع وظائفها (الشكل 5 ج). يمكن لـ Cas9 الارتباط بالمونومرات فقط ولكن ليس الثنائيات ، حيث لا يتم الحفاظ على بنية sgRNA. لم تكن نسبة المونومرات إلى الثنائيات ثابتة بين العينات ، مما أدى إلى نتائج متغيرة للغاية. ومع ذلك ، تم حل هذه المشكلة من خلال خطوة تسخين وتبريد سريع (الشكل 5 ج) ، كما أوضحنا سابقًا بالنسبة للرناوات الصغيرة الأخرى ذات الهياكل المزدوجة [12]. مع أحادي sgRNAs النقية ، يبدو أن Cas9 محمّل مسبقًا بـ sgRNAs مع ازدواج ممتد يتمتع بكفاءة خروج قاضية أعلى (الشكل 5d الشكل S11 في الملف الإضافي 1) ، مما يشير إلى أن التغيير الهيكلي لتوسيع وحدة الطباعة على الوجهين يمكن أن يؤدي في حد ذاته إلى زيادة وظائف Cas9. بعد ذلك ، قمنا بنقل sgRNAs في المختبر إلى خلايا تعبر بشكل ثابت عن Cas9 وأظهرنا أن تمديد الازدواج في حد ذاته يزيد من كفاءة الضربة القاضية (الشكل 5 هـ الشكل S11 في الملف الإضافي 1) ، على الأرجح بسبب التغيير الهيكلي وليس بسبب التغييرات في الحمض النووي الريبي المستويات.

كيف تزيد التعديلات من كفاءة الضربة القاضية. أ تم تحديد كفاءة الضربة القاضية لـ sp3 من الشكل 2 أ مع التعديلات المشار إليها كما في الشكل 1 ب. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S10 في ملف إضافي 1. موت متحولة ا أصلي. ب تم تحديد مستويات sgRNA بواسطة PCR في الوقت الحقيقي. تم تطبيع مستوى التعبير النسبي إلى U6 صغير RNA. ج في المختبر نسخ sgRNA شكلت ثنائيات (اللوحة العلوية) ، والتي يمكن تحويلها إلى مونومرات بخطوة تسخين وتبريد سريع (اللوحة السفلية). د تم نسخ sp7 من الشكل 3 ب في المختبر وتحميله مسبقًا في Cas9. تم إمداد المعقد بالكهرباء في خلايا CD4 + T. الأولية المنشطة. تم تحديد كفاءة الضربة القاضية كما في الشكل 3 ب. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S11 في ملف إضافي 1. ه تم تحويل sp7 في المختبر إلى خلايا TZM-Cas9. تم تحديد كفاءة الضربة القاضية كما في الشكل 3 ب. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S11 في ملف إضافي 1. تمثل الرسوم البيانية تكرارات بيولوجية من واحدة من ثلاث تجارب مستقلة ذات نتائج مماثلة ، والتي تظهر على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (ن = 3). تم حساب الأهمية باستخدام Student ر-اختبار: *ص & lt 0.05 **ص & لتر 0.01

لقد أجرينا جميع تجاربنا مع تعداء البلازميد العابر ، حيث يمكن أن يختلف رقم نسخة Cas9 و sgRNA اختلافًا كبيرًا. يجب أن يوفر التعدد المنخفض للعدوى (MOI) لناقل الفيروس البطيء الذي يؤوي Cas9 أو sgRNA أرقامًا متسقة نسبيًا من Cas9 و sgRNA في الخلايا المصابة. لذلك ، لتحديد وظائف sgRNA بشكل أكثر صرامة ، أنشأنا أولاً خطوطًا خلوية تعبر بثبات عن Cas9 عن طريق إصابة خلايا TZM-bl أو JLTRG-R5 بالفيروس البطيء الذي يحتوي على كاسيت Cas9 معربًا واختيار الخلايا التي تعبر بثبات عن Cas9. ثم أصابنا هذه الخلايا بالفيروس البطيء الذي يؤوي sgRNAs مع هياكل مختلفة في وزارة الداخلية المنخفضة. كانت النتائج مشابهة للتجارب التي أجريت على البلازميدات في كلا خطي الخلايا. في الواقع ، كان الفرق بين الهياكل الموضحة لعدوى الفيروسة البطيئة أكبر مما لاحظناه مع البلازميدات (الشكل 6 الشكل S12 في الملف الإضافي 1) ، مما يشير إلى أن sgRNAs المُحسَّنة تتفوق بالفعل على sgRNA شائعة الاستخدام (+ 85 نيوكليوتيدات). تشير هذه النتائج أيضًا إلى أن sgRNAs المُحسَّنة ستؤدي بشكل أفضل للفحوصات المجمعة على مستوى الجينوم المستندة إلى CRISPR-Cas9 ، والتي تستخدم الفيروس البطيء لتوصيل sgRNAs في وزارة الداخلية المنخفضة [13-20].

اختبار تأثير التعديلات عن طريق العدوى الفيروسية البطيئة. خلايا TZM-bl (أ) أو خلايا JLTRG-R5 (ب) بالفيروس البطيء المعبر عن Cas9 ، وتم اختيار الخلايا التي تعبر بشكل ثابت عن Cas9. تم تعبئة شرائط التعبير عن sgRNA المشار إليها (sp3 من الشكل 2 أ) في الفيروس البطيء واستخدامها لإصابة الخلايا التي تعبر بشكل ثابت عن Cas9 عند وزارة الداخلية = 0.5. تم تحديد كفاءة الضربة القاضية كما في الشكل 1 ب في الأيام المحددة. يتم عرض البيانات الأولية في الشكل S12 في ملف إضافي 1. ا أصلي، موت متحولة


الاستنتاجات

لقد جادلت بأن فرضية عالم الحمض النووي الريبي ، رغم أنها غير كاملة بالتأكيد ، هي أفضل نموذج لدينا حاليًا للتطور المبكر للحياة. في حين أن الفرضية لا تستبعد عددًا من الاحتمالات لما - إن وُجد - سبق الحمض النووي الريبي ، إلا أن تطور تخليق البروتين المشفر قد رسم ، للأسف ، حجابًا على التاريخ السابق للبروتينات. يختلف الوضع في حالة RNAs غير المشفرة مثل RNA الريباسي و tRNA ، حيث كانت هذه قادرة على التكاثر قبل تطور تخليق البروتين الريبوسومي.

كما أشرنا سابقًا [5] ، فإن الاقتراح القائل بأن عالم الحمض النووي الريبي تطور في ظروف حمضية [5 ، 6] يقدم حلاً معقولاً لانتقاد تشارلز كورلاند [57] بأن فرضية عالم الحمض النووي الريبي لا تشير إلى مصدر طاقة محتمل. كما لاحظ دي دوف [87] ، "يُفسر الاستخدام الواسع النطاق للقوة الدافعة للبروتون لتوصيل الطاقة في جميع أنحاء العالم الحي اليوم على أنه إرث لبيئة حيوية عالية الحموضة ويمكن اعتباره دليلًا على وجود مثل هذا البيئة "[87]. على الرغم من أن راسل ومارتن وآخرين [23-26] قد جادلوا بأن البروتونات والتدرجات الحرارية بين التدفق الخارج من الفتحات الحرارية المائية تحت سطح البحر (درجة الحموضة 9-11) والمحيطات الأكثر برودة وأكثر حمضية قد تكون تشكل المصادر الأولى للطاقة في أصل الحياة ، يبدو أن الافتقار إلى استقرار الحمض النووي الريبي في درجة الحموضة القلوية ([5] والمراجع الداخلية) يجعل مثل هذه الفتحات موقعًا غير محتمل لتطور عالم الحمض النووي الريبي.

على الرغم من أنه من الممكن ، يبدو من غير المحتمل أن "عدم التطابق" الموجود في جينات الحمض النووي الريبي (tRNA) في Ferroplasma acidarmanus و Picrophilus torridus (نوعان من البكتيريا القديمة ذات درجة حموضة داخلية حمضية) [5] يتم تصحيحها عن طريق تحرير C إلى U RNA الذي يحدث ، على سبيل المثال ، مع بعض - وليس الأخرى - الحمض الريبي النووي النقال للنباتات [88 ، 89]. لم يتم العثور حتى الآن على مثل هذا التعديل على عدم تطابق زوج قاعدة AC للهيكل الثانوي في البكتيريا البدائية ، ومع ذلك ، في نوع أثري واحد (Methanopyrus kandleri) ، يخضع زوج قاعدة AC ذو البنية الثلاثية الموجود في 30 من 34 tRNAs الخاص به لتحرير C إلى U محفزًا بواسطة أ سيتيدين ديميناس CDAT8 [90]. M. kandleri هو كائن حي فريد يحتوي على العديد من البروتينات "اليتيمة". لا يحتوي CDAT8 ، الذي يحتوي على مجال دي أميناز السيتيدين ومجال ربط الحمض النووي الريبي المفترض ، على متماثلات في الأنواع السمكية الأخرى ، بما في ذلك F. acidarmanus و P. torridus (L Randau، pers. commun. [90]). ومع ذلك ، فإن الدليل القاطع على أن أزواج القاعدة A-C في هذين النوعين لم يتم تعديلها سيتطلب بالطبع على سبيل المثال تسلسل [كدنا] من الحمض النووي الريبي.


نقاش

يعد تنظيم استقرار VEGF mRNA ذا أهمية خاصة ، ليس فقط لأن VEGF عضو في فئة mRNAs المستقرة بنقص الأكسجة ، ولكن أيضًا بسبب أهميته كهدف محتمل للعلاج المضاد لتولد الأوعية (Kim وآخرون.، 1993 ميلور وآخرون.، 1994). يتطلب تصميم العوامل لتثبيط أو تعزيز نشاط VEGF توضيح الآليات المحددة التي تتحكم في تعبيرها. لهذا السبب ، هناك اهتمام كبير بتحديد المحددات في VEGF mRNA المتضمنة في قدرته في ظل ظروف سمية طبيعية واستقراره استجابة لنقص الأكسجة.

في هذه الدراسة درسنا دور المناطق المختلفة في VEGF mRNA في تنظيم قابليتها في الجسم الحي. استخدام مراسل مرنا مدفوعة من fos المروج سمح لنا بتحديد تأثير مناطق مختلفة من VEGF mRNA على استقرار الجين المراسل ، بدلاً من استخدام وسائل غير مباشرة مثل التغييرات في مستويات الحالة المستقرة للأنزيمات المراسل أو استخدام مثبطات غير محددة للنسخ. في جميع بنياتنا ، حافظنا على السياق الموضعي والتحولي للمنطقة المدرجة في المراسل mRNA. وجدنا أن VEGF mRNA يحتوي على عدة عناصر مزعزعة للاستقرار وظيفية بشكل مستقل وأن التدهور السريع لـ VEGF mRNA تحت نورموكسيا يرجع إلى العمل المشترك لهذه العناصر. لم يكن عمر النصف المعياري للـ mRNA المعاد بناؤه مختلفًا اختلافًا كبيرًا عن تلك المحسوبة لكل مجموعة زوجية من المناطق الثلاث ، مما يشير إلى أن أي منطقتين من المناطق الثلاث كافية لتلخيص قابلية الرنا المرسال ، ومع ذلك ، يمكن أن تعكس هذه النتيجة الحقيقة أن fos المروج ، الذي ينتج نبضًا نصيًا لمدة 30 دقيقة (ريفيرا وآخرون.، 1990) ، لا يمكنها حل فترات نصف العمر بشكل كبير & lt1 h.

ثبت أن عددًا من mRNAs الأخرى تحتوي على عناصر مزعزعة للاستقرار في كل من 3′UTR ومنطقة الترميز ، بما في ذلكfos و myc mRNAs (Kabnick and Housman، 1988Shyu وآخرون.، 1989 Wisdom and Lee ، 1991 Herrick and Ross ، 1994) ومع ذلك ، فإن قدرة VEGF 5′UTR على زعزعة استقرار المراسل mRNA في دراساتنا تشير إلى وجود عنصر مزعزع للاستقرار أيضًا في 5′UTR. إن وجود عنصر مزعزع للاستقرار في 5′UTR أمر غير معتاد للغاية ، على الرغم من أننا نلاحظ أن أول 40 قاعدة من fos إن الرنا المرسال قادرة على زعزعة الاستقرار الضعيف لمراسل الجلوبين mRNA (كابنيك وهوسمان ، 1988). وجدنا أن VEGF 5′UTR ومنطقة الترميز و 3 UTR كانت أيضًا مزعزعة للاستقرار في خلايا NIH3T3 ، مما يشير إلى أن النشاط المزعزع للاستقرار لكل منطقة لم يقتصر على خلايا BALB / c3T3 المستخدمة في دراستنا. على الرغم من أن آلية زعزعة الاستقرار التي يروج لها كل عنصر من العناصر المزعزعة للاستقرار في VEGF mRNA لا يزال يتعين تحديدها ، فإن وجود العديد من العناصر المزعزعة للاستقرار في VEGF mRNA يشير إلى أن مسارات التدهور المتعددة قد تطورت لضمان الدوران السريع للـ mRNA في ظل ظروف سمية طبيعية ، لقد أصبح واضحًا أيضًا أن عددًا من خطوط الخلايا المشتقة من الورم تعبر بشكل أساسي عن مستويات مرتفعة من VEGF الناتجة عن الاستقرار المستمر لـ mRNA (أبيض وآخرون.، 1995 إيليوبولوس وآخرون.، 1996 ليفي وآخرون.، 1996 أ ، ب). يشير وجود العديد من عناصر عدم الاستقرار في VEGF mRNA وقدرة أي منطقتين من المناطق الثلاث على تلخيص قابلية الحمض النووي الريبي المرسال إلى أن الاستقرار المستمر لـ VEGF mRNA في هذه الخلايا المشتقة من الورم قد يكون بسبب التنشيط التأسيسي لـ مسار استقرار بدلاً من فقدان وظيفة مسارين متميزين للتدهور.

على عكس التأثيرات المضافة للمناطق الفردية في زعزعة استقرار الرنا المرسال ، وجدنا أن استقرار نقص الأكسجة في VEGF mRNA يحدث فقط في حالة وجود منطقة 5′UTR ، ومنطقة الترميز ، و 3 UTR في mRNA. بناءً على نتائج دراسة سابقة لوحظ فيها استقرار نقص الأكسجة في VEGF 3′UTR في نظام استخراج خالٍ من الخلايا (Levy وآخرون.، 1996 أ ، ب) ، كان توقعنا أن 3′UTR ستكون كافية لمنح التنظيم الصحيح لمراسل الرنا المرسال في الجسم الحي ، ومع ذلك ، فإن ملاحظتنا في الخلايا السليمة توضح أن تنظيم استقرار VEGF mRNA أكثر تعقيدًا مما اقترحته الدراسات السابقة وينطوي على تعقيد كبير في التفاعلات الجزيئية. قد يكون هذا بسبب الحاجة إلى ثلاثة بروتينات ربط RNA متميزة يتفاعل كل منها مع عنصر منفصل ، أو يمكن أن يعكس الحاجة إلى تكوين بنية RNA معينة من تسلسلات RNA مختلفة يتعرف عليها بروتين واحد.

تعد القدرة على تلخيص التثبيت الناقص الأكسجين أمرًا مهمًا لعدد من الأسباب. سيسمح بمزيد من التحديد للعناصر المطلوبة لتحقيق الاستقرار وبالتالي يوفر طريقًا لعزل العوامل المشاركة في تثبيت mRNA. كما أنه يوفر القدرة على دراسة تأثير الظروف أو العوامل المختلفة على استقرار الرنا المرسال مباشرة ، دون تعقيد التغييرات المرتبطة بالنسخ من محفز VEGF. علاوة على ذلك ، فإن عرضنا للحاجة إلى تعاون عناصر متعددة لتحقيق الاستقرار بنقص الأكسجة في VEGF mRNA يمكن أن يكون له آثار مهمة على العلاج المضاد لتكوّن الأوعية. يجب أن يمنع تثبيط وظيفة أي من العناصر المتعاونة تراكم الرنا المرسال استجابة لنقص الأكسجة.

على الرغم من أن VEGF 3′UTR ليس كافيًا لمنح استقرار نقص الأكسجة ، تظهر نتائجنا أن العناصر الموجودة في 3′UTR ضرورية لتحقيق الاستقرار. هذا مدعوم من قبل دراسات أخرى تظهر أن عناصر الحمض النووي الريبي في 3′UTR تلعب دورًا في استقرار نقص الأكسجة. التعبير المضاد للحساسية لـ HuR ، وهو بروتين يرتبط بمنطقة بعيدة غنية بالاتحاد الأفريقي في VEGF 3′UTR ، يمنع التثبيت الناقص للأكسجين في VEGF mRNA (Levy). وآخرون.، 1998). يعتبر HuR عضوًا في عائلة بروتينات الربط التي تشبه Elav وقد تورط في وظيفة العناصر المزعزعة للاستقرار AU (ماير وآخرون.، 1997). بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط أحد البروتينات المحفزة بنقص الأكسجة بالعنصر الغني بالبيريميدين في VEGF 3′UTR في المختبر أيضًا بعنصر مشابه موجود في الإريثروبويتين والتيروزين هيدروكسيلاز الرنا المرسال (Czyzyk-Krzeska and Beresh، 1996 Iliopoulos وآخرون.، 1996 ليفي وآخرون.، 1996a، b McGary وآخرون.، 1997). يؤدي تحور هذا العنصر في erythropoietin mRNA إلى زعزعة استقرار mRNA في الجسم الحي في ظل ظروف سامة ويمنع استقرار نقص الأكسجة في mRNA (McGary وآخرون., 1997).

وجدنا أن VEGF mRNA الداخلي المنشأ أظهر نمطًا من تحفيز المصل والانحلال في ظل ظروف سامة ، مما يشير إلى أن محفز VEGF يخضع أيضًا لنبض نسخ استجابة لتحفيز المصل (الشكل 8). كما شوهد نمط مماثل من نسخ VEGF استجابةً للمصل في الخلايا الليفية البشرية (Enholm وآخرون.، 1997). The pattern of decay of the endogenous mRNA under hypoxia was consistent with stabilization of the mRNA, although nuclear run-on experiments are required to verify that the shut-off of transcription under hypoxia and normoxia occurs at the same rate. Nevertheless, the degree of hypoxic stabilization (twofold) of the endogenous mRNA determined from these apparent half-lives was similar to that determined from the reconstructed mRNA. If the pulse of transcription generated from the VEGF promoter in response to serum stimulation is similar under normoxia and hypoxia, this method may allow the direct determination of the effect of various agents on stabilization of the endogenous VEGF mRNA.

The degree of complexity of the molecular interactions required for the regulation of stability of some mRNAs is only now becoming apparent. Our finding that multiple regions are required for VEGF mRNA stabilization parallels similar findings with the interleukin (IL)-2 and IL-11 mRNAs. Stabilization of the IL-2 mRNA in T cells by the c-Jun amino-terminal kinase (JNK) pathway requires elements at the junction of the 5′UTR and coding region as well as elements in the 3′UTR (Chenوآخرون., 1998), and stabilization of the IL-11 mRNA in bone marrow stromal cells in response to phorbol ester requires all three regions of the mRNA (Yang وآخرون., 1996) however, the VEGF mRNA appears to be unique in the complexity of the interactions required for both its lability and stabilization. Such complexity most likely reflects the need for expression of the molecule to be very tightly regulated and is most apparent in the failure in vascular development in mice carrying a single defective VEGF gene (Carmelietوآخرون., 1996 Ferrara وآخرون., 1996). This heterozygous lethality is unprecedented in an autosomal gene and indicates that the level of VEGF is critical for correct embryonic vascular development. The ability to regulate the stability of the VEGF mRNA allows a level of control in addition to regulation of transcription, and this may be important for coordinating expression of VEGF with the many other factors that also play a role in the angiogenic process (Folkman and Shing, 1992).


المواد والأساليب

Plasmids and DNA analysis

The lentiviral vector plasmid pSIN-EGFP containing an EGFP الجين IRES و Puromycin gene was generated from pSIN-EF2-Lin28-Puro (Addgene plasmid #16580) using EcoRI and BamHI restriction enzyme sites. SaCas9 plasmid was a gift from Feng Zhang (Addgene plasmid #61591) VPR expression plasmid (GP230) and mCherry reporter plasmid (ZP30) were gifts from Dr. Yang, Hui (Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS). CRISPR-Cas9 plasmids were constructed as described online (http://www.genome-engineering.org/crispr/). The oligonucleotide sequences for sgRNA construction are summarized in S2 Table. Plasmid DNA and genomic DNA were isolated by standard techniques. The DNA sequencing confirmed the desired specific sequence in the constructs.

Cells and cell culture

HEK-293 cells were obtained from ATCC (CAT#CRL-1573) and grown at 37°C in 5% CO2 in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Life Technologies, Carlsbad, CA), 10% heat-inactivated fetal bovine serum, penicillin/streptomycin. HEK-293 cells expressing EGFP were described previously [29]. Drug-resistant single colonies of transduced HEK-293 cells were isolated and named 293-SC1. To maintain EGFP expression, the medium for 293-SC1 culture includes puromycin.

Construction of SaCas9 library

The library was generated by error-prone PCR (primers sequence in S1 Table). Specifically, Plasmid (pX601) harboring SaCas9 coding sequence was digested with AgeI/HindIII or HindIII/BamHI, respectively. The AgeI/HindIII or HindIII/BamHI fragments were mutated by random mutagenesis kit (CAT#101005, TIANDZ) and then purified, in-fusion with linearized pX601 backbone without the corresponding fragment. The individual colonies from LB plate were then manually picked. The plasmids from individual colonies were isolated. The concentration of each plasmid was adjusted as 100 ng/μL.

Targeted deep sequencing

Off-target sites (S1 Table) were predicted by Cas-OFFinder software [40], and off-target sites with fewer than 5 mismatched nucleotides were screened. In addition, the off-target sites of OT1 and OT2 for EMX1_1 were reported [5]. Off-target sites for chr2:156,968,467–156,968,493, DLGAP2، و DUS2 were screened by algorithm for fewer than 2 mismatched nucleotides in whole genome. Targeted deep sequencing experiments were performed with WT SaCas9 and Mut268 for different loci at human genome. Briefly, 1.8 × 10 5 HEK-293 cells were transfected with 750 ng of all-in-one expression plasmids. Seventy-two hours after transfection, genomic DNA was extracted using standard phenol/chloroform extraction protocols. For the construction of the NGS library, the primary PCR was performed to amplify 100 to 230 bp on/off-target sites from approximately 60 ng of genomic DNA using Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme Biotech Co., Ltd). The secondary amplification was to fix barcodes, index, and adaptor sequences into the primary PCR products (S2 Table). Amplification products were purified (Thermo Fisher Scientific) and pooled into one tube. After the removal of adaptors and low-quality reads, paired-end reads were merged and then mapped to the template. Base substitution and in/del were analyzed using open-sourced “CRISPResso” software (version 1.0.10) with read quality above Q30 [41].

PEM-seq for SaCas9

The protocol has been previously described [42]. Specifically, 3.2 μg pX601 plasmids were transfected into HEK-293 cells in 6-cm dishes. Cell were harvested 48 h post transfection followed by standard PEM-seq procedure. Hiseq reads were processed by “SuperQ” pipeline, and off-target hotspots were identified by “MACS2” callpeaks الوضع. MACS2 results were further filtered to remove sites with fewer than 2 junctions and no target site-similar sequence by “Bedtools” and “Needle.”

T7EI assay for gene editing

Briefly, 293-SC1 were plated at a density of 1.8 × 10 5 cells per well in a 12-well plate on day 0 and transfected with 750 ng CRISPR-SaCas9-sgRNA plasmids with Turbofect on day 1. Fresh medium was added to the transfected 293-SC1 cells on day 2. Cells were harvested on day 3. For T7EI assay, 150 ng purified PCR products were mixed with 1.5 μL 10× NEB#2 buffer and ultrapure water to a final volume of 14.5 μL and were subjected to re-annealing process to enable heteroduplex formation. After re-annealing, products were treated with 0.5 μL T7 Endonuclease I for 45 min.

Transcriptional activation assay

The ChIP-seq assay was performed as described previously [7]. For the fluorescence reporter assay, 1.0 × 10 5 HEK-293 cells of each well (24-well plates) were seeded on day 0. On day 1, each well of was transfected with 375 ng of dCas9-VPR plasmid, 150 ng of plasmid containing sgRNA, and 250 ng of miniCMV-mCherry plasmid. Fresh medium was added to the transfected cells on day 2. Cells were harvested for FCM on day 3.

النشاف الغربي

HEK-293 cells were plated at a density of 5.0 × 10 5 cells per well in a 6-well plate on day 0 and transfected with 1.5 μg plasmids (pX601, Mut268, and efSaCas9) via TurboFect transfection reagent on day 1. Fresh medium was added after 12 h. Cells were harvested on day 3. Proteins were analyzed on SDS-PAGE after quantification. Membranes were blotted with antibodies directed at the following proteins: HA (Mouse-1F5C6, Proteintech Cat#66006-2-Ig, 1:2,500 dilution) and β-Actin (Mouse-8H10D10, Cell Signaling Technology Cat#3700, 1:1,000). An HRP-conjugated secondary antibody (Goat, Abcam Cat#ab97023, 1:5,000) was used for chemiluminescent detection.


مقدمة

The aim of this book is to provide the fundamentals for data analysis for genomics. We developed this book based on the computational genomics courses we are giving every year. We have had invariably an interdisciplinary audience with backgrounds from physics, biology, medicine, math, computer science or other quantitative fields. We want this book to be a starting point for computational genomics students and a guide for further data analysis in more specific topics in genomics. This is why we tried to cover a large variety of topics from programming to basic genome biology. As the field is interdisciplinary, it requires different starting points for people with different backgrounds. A biologist might skip sections on basic genome biology and start with R programming, whereas a computer scientist might want to start with genome biology. In the same manner, a more experienced person might want to refer to this book when needing to do a certain type of analysis, but having no prior experience.


The online version of this book is licensed under the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


The Intrinsic Determinants of Axon Regeneration in the Central Nervous System

Kin-Sang Cho , . Dong Feng Chen , in Neural Regeneration , 2015

5.3.4 KLF-9

As a repressor , KLF-9 exerts its effects through its SID, which recruits the mSin3a repressor complex. Overexpression of KLF-9 causes dramatic reduction in neurite length to less than 40% of the control length. The expression profile of KLF-9 also supports its role as a neurite growth repressor in the adult, as messenger RNA expression of KLF-9 increases 250-fold from E19 to P21. Although KLF-9 has a marked effect on neurite growth, its developmental role is more confined. KLF-9 knockout mice do not show any deficits in axon targeting or dendrite growth. However, these knockout mice show deficiencies in dentate granule neuron maturation in the hippocampus, and they display behavioral deficits in rotorod and contextual fear-conditioning tests [71] .


10.4: RNA Structure - Biology

Recent paper

Recent breakthroughs in genomics and in biotechnology provide new unprecedented capabilities to study RNA structure and function at a whole transcriptome scale and at high resolution and throughput. These advances warrant the development of innovative computational methods to process, interpret, and analyze these massive amounts of genomic data. Computational approaches can also leverage this new wealth of information to improve upon current structure analysis capabilities and thereby enhance our ability to address a range of biological questions.

Our interdisciplinary approach draws on methods and principles from machine learning, statistics, applied math, and biophysics. Through collaborations as well as in-house wet lab studies, we are interested in applying our methods to the engineering of novel RNAs for a range of biotechnology and therapeutic applications and to improving our understanding of the relationship between RNA sequence, structure, and function.

We develop computational methods for inferring RNA dynamics from experiments and theory, with applications ranging from basic research to bimolecular engineering and synthetic biology.

Feb. 2018: New paper on reconstruction of complex RNA structure landscapes in Nature Communications. ———————————————- March 2018: PATTERNA, a new algorithm that mines RNA structures from large-scale structure profiling datasets, in Genome Biology.


الشكل 4

Figure 4. Targeting the RIB1 gene with the scgRNA/dCas9 system. (A) Overview of the tested target sequences (R1–R4). Arrowheads indicate the position of the PAM sequence and the positions of the last nucleotide of the PAM sequences in respect to the TSS. Riboflavin productivities after 23 and 53 h of (B) MS2 VP64 and (C) NAC strains cultivated using glucose surplus conditions. (D) Log2 fold changes of relative transcript levels of the RIB1 gene compared to the wt measured after 23 h of cultivation using MeOH conditions. Riboflavin productivities measured after 23 and 53 h of (E) MS2 VP64 and (F) NAC strains cultivated using MeOH conditions. The number of biological replicates is indicated on top of each bar. Error bars indicate the standard deviation of the biological replicates for B, C, E, and F and the sum of squared errors of the Ct values of the target gene and the housekeeping gene of all technical replicates (4 per biological replicate) for D.


شاهد الفيديو: علم الجينات يثبت ان العرب يعيشون في شمال افريقيا والشرق الاوسط اي بالمغرب العربي والمشرق العربي (ديسمبر 2022).