معلومة

السلامة الحيوية Lentivector

السلامة الحيوية Lentivector


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تستخدم العدسات على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية ، والأكثر شيوعًا لنقل الجين المرغوب بطريقة مستقرة. يستفيد نظام النواقل هذا من قدرة الفيروسات على إدخال الجينوم الخاص بها في الخلية المضيفة. وهكذا يتم نقل العدوى بالنواقل البطيئة إلى خط خلية منتج (عادةً HEK) ويتم إنتاج فيروسات بالإدراج المطلوب. في النهاية سيتم حصاد هذه الفيروسات ونقل خطوط الخلايا المرغوبة.

لأسباب تتعلق بالسلامة الحيوية ، تم تصميم هذا النظام بطريقة تقلل من المخاطر التي يشكلها "نظام الفيروسات". وبالتالي ، فإن الفيروسات التي ينتجها هذا النظام غير قادرة على التكاثر ، وهذا يعني أنه على حد علمي ، فإن الفيروسات التي يتم تكوينها غير قادرة على تكوين المزيد في المضيف الثاني حيث لا يتم تجنيد الجينات المسؤولة. ومع ذلك ، من الواضح أن البلازميدات المستخدمة يمكن أن تتحد وتشكل إمكانية لإنشاء فيروس قادر على التكاثر. ومع ذلك ، وبقدر ما وجدت في الأدبيات ، فإن هذا لم يتم اكتشافه أبدًا ويقف كاحتمال نظري.

سؤالي الأول بالأرقام الفعلية ، ما هو احتمال حدوث مثل هذا الحدث (عدد حالات إعادة التركيب في مواقع محددة). في حالة حدوث ذلك ، من المحتمل أن يكون نظام lentivector خطيرًا ، حيث يعتمد هذا النظام على فيروس نقص المناعة البشرية في معظم الأوقات. بالإضافة إلى ذلك ، لا تستخدم هذه النواقل البروتين المغلف الداخلي لفيروس نقص المناعة البشرية ولكن بالأحرى VSV / G من فيروس التهاب الفم الحويصلي ، من أجل زيادة الانتثار والاستقرار.

بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن فيروس نقص المناعة البشرية مشتق ، فإن معظم جينات فيروس نقص المناعة البشرية مأخوذة من النواقل ، ولكن في رأيي فإن أهمها موجود. السؤال الثاني ، مع الأخذ في الاعتبار كل هذا ، هذا الفيروس النظري "المخلوق" سيكون قادرًا في النهاية على التسبب في مرض الإيدز أو أي تأثير ضار آخر؟ من الجدير بالذكر أنه الآن قادر على إصابة جميع الخلايا البشرية تقريبًا بسبب بروتين VSV ، فهل من الصحيح الاعتقاد بأن المرض سيكون أسوأ بكثير وأكثر عدوى بكثير من فيروس نقص المناعة البشرية الأصلي؟ لاحظ أنه حتى الاستقرار يزداد.

ومع ذلك ، يمكنني أيضًا أن أعتقد أن هذا الفيروس الجديد المؤتلف قد يتم تدميره بالفعل بواسطة جهاز المناعة ، على الرغم من زيادة الانتثار ، نظرًا لحقيقة أن فيروس التهاب الفم الحويصلي لا يسبب أمراضًا لدى البشر ، وربما يعمل هذا البروتين كمستضد ويمكنه تحفيز استجابة مناعية كافية.

الاخير، هل يمكن الكشف عن الفيروس المؤتلف النظري عن طريق اختبار فيروس نقص المناعة البشرية القياسي؟

لتبسيط الأمور ، أشير إلى الجيل الثالث من المتعدين


كم عدد عمليات إعادة التركيب المطلوبة لتحقيق فيروس نشط؟

لقد أدركت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) احتمالية تحويل النواقل البطيئة إلى فيروس بطيء مكرر بشكل نشط إذا خضعوا لإعادة التركيب مع النوع البري من فيروس نقص المناعة البشرية في مريض مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية. في هذه الحالة ، هناك حاجة إلى حدثين لإعادة التركيب لنقل تسلسل lentivector إلى تسلسل فيروس نقص المناعة البشرية (آلية النقل مماثلة لحالة الجيل الأول من lentivectors).

توضح هذه المقالة من VCU آلية أخرى يمكن أن يحدث من خلالها الجيل الاول نظم lentivector ، والتي تتكون من حدثين إعادة التركيب بين lentivector والبلازميد المساعد. لاحظ أن 3 جينات هفوة بول و الحسد موجودة على نفس البلازميد ، وهذا البلازميد محاط بـ LTRs. لا يعاني الجيل الثاني من النواقل البطيئة ، مثل نظام pLKO ، من هذه المشكلة ويتطلب فيروس نقص المناعة البشرية من النوع البري لإنتاج الفيروس البطيء المتكاثر بشكل نشط.

لتقليل احتمالية حدوث ذلك ، قسم الجيل الثاني والثالث من أنظمة lentivector الجينات إلى بلازميدات متعددة ، والتي تتطلب بعد ذلك المزيد من أحداث إعادة التركيب لإنتاج فيروسات قادرة على النسخ المتماثل. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استبدال ذيل polyA لـ 3 'LTR لتقليل احتمالية حدوث أحداث إعادة التركيب.

وفقًا لمقالة Addgene حول السلامة الحيوية في نبات lentivector ، فإن الجين المعني بنقل البلازميد (كلا الجيلين الثاني والثالث) له حذف في منطقة LTR 3 'مما يمنعه من أن يصبح نشطًا بشكل متكرر. لذلك ، فإن الاحتمال الوحيد لحدوث إعادة التركيب هو أن يخضع خط الخلية الذي يعبر عن الفيروس للتكرار مع سلالة فيروس نقص المناعة البشرية النشطة من النوع البري. مثال على ذلك هو بلازميد نقل pLKO ، الذي يحتوي على 3 'LTR مقطوع ، مما يمنع التسلسل من التكرار خارج بكتريا قولونية، والذي يكررها ليس باستخدام LTR ولكن بدلاً من ذلك باستخدام أصل البلازميد للنسخ المتماثل.

هل الفيروسات النشطة الناتجة عن إعادة التركيب أكثر خطورة في البرية من فيروس نقص المناعة البشرية من النوع البري؟

يصعب الرد على هذا ، لأن إعادة التركيب تسمح فقط بتكوين فيروس نشط ، لكنها لا تضمن أن يكون الفيروس خطيرًا. الفيروسات الخطيرة ممكنة من الناحية النظرية ، ولكنها تتطلب عمليات إعادة تركيب أكثر بكثير من الحد الأدنى 2 لكفاءة النسخ المتماثل في أنظمة الجيل الثاني من lentivector.

على سبيل المثال ، لا تقوم أنظمة lentivector عمومًا بتشفير البروتينات الفيروسية vpr ، vif ، nef و vpu. هذه البروتينات ضرورية لزيادة عدوى فيروس نقص المناعة البشرية في أنواع مختلفة من الأنسجة (ولكن ليس الخلايا المزروعة مثل HEK293). إن عدم وجود هذه البروتينات في جهاز lentivector المختص بالنسخ الافتراضي سيعوق بشكل كبير انتشاره في البرية. إن دمج هذه البروتينات أمر معقول ولكنه غير محتمل للغاية ، حيث ستكون هناك حاجة إلى المزيد من أحداث إعادة التركيب المتقاطع.

لاستخدام المثال الخاص بك ، فإن الحسد يوجد ترميز البروتين لطبقة البروتين VSV في غلاف البلازميد. نظرًا لأن العدس المختص الذي يتكون من حدثين لإعادة التركيب سيكون نمطًا زائفًا يحتوي فقط على فيروس نقص المناعة البشرية الحسد البروتينات ، سوف تحتاج إلى اكتساب المزيد من جين VSV لتحل محلها الحسد البروتينات ، لأن هذه الجينات غير موجودة في نفس المناطق. لا يوجد تجانس بين خيطي الحمض النووي ، الأمر الذي من شأنه أن يعيق بشكل كبير احتمالية دمج جين VSV بطريقة ما في فيروس نقص المناعة البشرية النشط.

إن إضافة العديد من البروتينات الخيمرية ومناطق LTR في الجيل الثالث من النواقل البطيئة تزيد الأمر تعقيدًا.

بشكل عام ، لم أتمكن من العثور على أي مصادر تقارن عدوى فيروس نقص المناعة البشرية المعدّل وراثيًا مقابل النوع البري. ومع ذلك ، على الرغم من أنه من الممكن نظريًا أن يكون للناقل المختص بالنسخ المعدّل وراثيًا أفضل انتارة من فيروس نقص المناعة البشرية من خلال الحصول على جين VSV ، فإن احتمال حدوث ذلك أقل بكثير من احتمال إنتاجه في المقام الأول.

هل يمكن الكشف عن عدوى فيروس نقص المناعة البشرية عن طريق اختبار فيروس نقص المناعة البشرية؟

فيما يتعلق بالسؤال الأخير حول ما إذا كان يمكن الكشف عن الفيروس بواسطة اختبار معياري لفيروس نقص المناعة البشرية ، فإن الإجابة هي أن الاكتشاف ممكن إذا كان الشخص المصاب بالناقلات البطيئة قد حصل على استجابة مناعية لبروتينات الكمامة الناقلة ، وكانت الأحمال المصابة بالعدوى هي: مرتفع بما فيه الكفاية.

اختبارات فيروس نقص المناعة البشرية خاصة بأجزاء مختلفة من الفيروس ، لكن معظمها يستهدف البروتين الفيروسي p24 ، وهو أحد مكونات أسكت بولي بروتين.

توجد أيضًا اختبارات فيروس نقص المناعة البشرية المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لكن هذه الاختبارات ستعتمد على البادئات المحددة المنتجة وما إذا كان RT-PCR سينتج أمبليكون بالنظر إلى التسلسل المحدد للبلازميدات.

نظرًا لأن جينات gag يتم ترميزها في معظم أنظمة lentivector ، فمن المحتمل جدًا أن يقوم أي شخص مصاب بالعدسة بالتعبير عن الأجسام المضادة تجاه p24 ، وبالتالي ينتج عنه نتيجة إيجابية لـ ELISA وكذلك اختبارات لطخة ويسترن بافتراض أن p24 و تكون كميات الأجسام المضادة عالية بما يكفي للوصول إلى نقطة القطع.

لم أتمكن من العثور على مستويات القطع المتاحة للجمهور لمستويات ELISA و Western blot ، ولكن إذا (من الناحية الافتراضية) تم حقن شخص بكمية من النواقل ، فمن المحتمل أن يكون اختبار فيروس نقص المناعة البشرية إيجابيًا. ومع ذلك ، نظرًا لأن العدس لا يتكاثر بشكل نشط ، فسيتم التخلص منه بسرعة بواسطة جهاز المناعة.


يؤدي الالتزام المطول بجزيئات الناقلات المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية إلى الخلايا المستهدفة المكونة للدم إلى انتقال ثانوي في المختبر وفي الجسم الحي

فيروس العوز المناعي البشري من النوع 1 المشتق من الفيروس البطيء الذي يحمل مغلف فيروس التهاب الفم الحويصلي G (VSV-G) يُظهر بروتين سكري مجموعة واسعة من المضيف ويمكن أن ينقل بشكل ثابت الخلايا الجذعية المكونة للدم. في ضوء المخاوف المتعلقة بالسلامة الحيوية وانتقال الخط الجرثومي المحتمل ، فقد تم استخدامها في الغالب لاستراتيجيات خارج الجسم الحي ، يعتقد أنها تضمن إزالة الجسيمات الزائدة المرتبطة بالسطح ومنع الانتشار في الجسم الحي. تكشف الدراسات المقدمة هنا بدلاً من ذلك عن التزام الجسيمات لفترات طويلة بعد التعرض خارج الجسم الحي ، على الرغم من إجراءات الغسيل المتسلسلة ، مع النقل اللاحق للخلايا المستهدفة الثانوية في زراعة المحاصيل المباشرة والمتحولة. استكشفنا المعلمات الحاسمة التي تؤثر على الاحتفاظ بالجسيمات ونقلها وأظهرنا أن التعلق بسطح الخلية يحمي بشكل انتقائي جزيئات الفيروس من تعطيل المصل بوساطة التكميل. علاوة على ذلك ، تُظهر الدراسات التي أجريت على متلقي الفئران غير المائل للنخاع أن زرع الخلايا المكونة للدم المعرضة للنواقل والمغسولة يؤدي إلى الانتشار الجهازي لجزيئات VSV-G / lentivector الوظيفية. نظهر العلامات الجينية عن طريق النقل غير المقصود للجزيئات المتجهة والتعبير المطول عن منتج الجينات المحورة في الأنسجة المتلقية. النتائج التي توصلنا إليها لها آثار على السلامة الحيوية وتصميم النواقل وأبحاث بيولوجيا الخلية.

الأرقام

تعبير GFP في خلايا 293T ...

تعبير GFP في خلايا 293T بعد زراعة مع خلايا الفئران WBM المعرضة للفيروس البطيء. 293 طن ...

نقل عدوى عدوى إلى ...

لا يتطلب نقل العدسة المعدية إلى الخلايا المستهدفة الثانوية اتصالًا بالخلية الخلوية ...

ناقل الجسيمات والثانوي ...

لا يمثل نقل الجسيمات المتجهية والتنقل الثانوي النقل الكاذب ويحدثان بشكل مستقل ...

جسيمات ناقلات مرتبطة بالهدف ...

جسيمات النواقل المرتبطة بالخلايا المستهدفة ، ولكن ليس تلك المعلقة ، هي إلى حد كبير ...

تعبير GFP في مضيف CD45.2 ...

تعبير GFP في مجموعات فرعية من الكريات البيض في الدم المحيطي CD45.2 المضيفة في ممثل ...

تعبير GFP في أنسجة الفئران ...

تعبير GFP في أنسجة الفئران من الحيوانات بعد 15 أسبوعًا من حقن GFP ...

استمرار تسلسل بروفال في ...

استمرار تسلسل بروفال في أنسجة المضيف. (أ) تضخيم تسلسل GFP بواسطة ...


تطوير النواقل Lentiviral مع التعبير الظهاري التنفسي المنظم في فيفو

سيكون تطوير نواقل نقل الجينات مع التعبير المنظم والخاص بالرئة أداة مفيدة لدراسة بيولوجيا الرئة وتطوير العلاجات الجينية. في هذه الدراسة ، قمنا ببناء سلسلة من النواقل الفيروسية البطيئة مع العناصر التنظيمية التي من المتوقع أن تنتج تعبيرًا عن التحوير خاصًا بالرئة: محفز البروتين الخافض للتوتر السطحي (SPC) للتعبير عن الخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني (AECII) ، بروتين خلية كلارا 10 كيلو دالتون (CC10) ) للتعبير عن خلية كلارا في مجرى الهواء ، ومروج Jaagskiete sheep retrovirus (JSRV) للتعبير في كلا النوعين من الخلايا. اقتصر التعبير الجيني من نواقل SPC و CC10 على خطوط خلايا AECII و Clara ، على التوالي ، بينما لوحظ التعبير من ناقل JSRV في أنواع متعددة من الخلايا التنفسية وغير التنفسية. بعد التسليم داخل القصبة من طاف lentivector للفئران ، لوحظ التعبير الجيني في AECII من lentivector SPC ، وفي خلايا Clara من lentivector المعزز CC10. لم يتم الكشف عن تعبير الجينات المعدلة وراثيا في الأنسجة غير التنفسية بعد التسليم الوريدي لناقلات CC10 و SPC lentiviral إلى متلقي الفئران. باختصار ، أدى دمج العناصر التنظيمية الجينومية من جينات SPC و CC10 إلى التعبير عن التحوير التنفسي المحدد في المختبر و في الجسم الحي. ستوفر هذه النواقل أداة مفيدة لدراسة بيولوجيا الرئة وتطوير العلاجات الجينية لاضطرابات الرئة.

ستعمل هذه النواقل على تحسين سلامة تطبيقات العلاج الجيني للرئة. ستكون مفيدة أيضًا للعلماء الأساسيين ، لتوجيه التعبير الجيني الخاص بالرئة و / أو تتبع ذرية الخلايا الجذعية المنقولة.

يتم أيضًا تقييم النواقل المستندة إلى الفيروس الصغير البشري غير الممرض ، الفيروس المرتبط بالغدية (AAV) ، لإيصال الجينات إلى الرئة (5). يمكن أن تتكامل نواقل AAV المؤتلفة في الخلايا ، ولكن يتم الاحتفاظ بها في كثير من الأحيان كحلقة يتم تخفيفها أو فقدها مع انقسام الخلية (5 ، 6). علاوة على ذلك ، فإن حجم إدخالها الصغير يجعل من الصعب إنتاج نواقل مؤتلفة مع وحدات نسخ كبيرة مثل مروج خاص بالظهارة يعبر عن منظم غشاء التليف الكيسي ، والذي يمكن أن يكون طوله 8 كيلو بايت أو أكثر.

كما تم استخدام أنظمة نقل الجينات غير الفيروسية باستخدام الجسيمات الشحمية أو الحمض النووي العاري لنقل الجينات إلى ظهارة الجهاز التنفسي (7 ، 8). تتمثل مزايا هذه الأنظمة في أنه يمكن نقل الكاسيتات المعدلة وراثيًا بدون تسلسل فيروسي ، ويمكن نقل جينات كبيرة أو متعددة بغض النظر عن حالة التكاثر ومستقبلات سطح الخلية للخلية المستهدفة. ومع ذلك ، فإن الكفاءة الإجمالية لنقل الجينات منخفضة ، ونادرًا ما تتكامل الجينات ، وتضيع النواقل في تكاثر الخلايا ، وبالتالي فإن هذا النهج ليس مفيدًا لتحقيق علاج جيني مستقر طويل الأمد.

بالنسبة للعلاجات الجينية طويلة المدى أو الدراسات البيولوجية ، يلزم وجود ناقل يمكن أن يندمج بكفاءة في جينوم الخلية المستهدفة (9). تندمج الفيروسات القهقرية من النوع "C" مثل فيروس ابيضاض الدم في الفئران مولوني ، أو الفيروسات البطيئة مثل HIV-1 ، بشكل ثابت في جينوم الخلية المستهدفة. يؤدي حذف تسلسلات الترميز للمنتجات الجينية الفيروسية إلى عدم كفاءة تكرار نواقل نقل الجينات ويجعل 6-8 كيلو بايت متاحًا لإدخال الجينات المرغوبة (10). يمكن لناقلات نقل الجينات Lentiviral أن تتحول وتندمج في الخلايا غير المنقسمة ، ومع ذلك ، فإنها بشكل عام تنقل الخلايا المنقسمة بشكل أكثر كفاءة (11-13).

تحتوي نواقل نقل الجينات Lentiviral ، مثل ناقل CCL الذي طوره Zufferey وزملاؤه ، على 10 ٪ من جينوم HIV-1 من النوع البري (14). يمكن للنواقل الفيروسية المؤتلفة ذات النمط الكاذب مع بروتين التهاب الفم الحويصلي G (VSV-G) أن تنقل مجموعة واسعة من الخلايا غير المنقسمة. أظهرت العديد من الدراسات نقل الجينات الفيروسية البطيئة للنواقل المستندة إلى HIV-1 أو FIV إلى ظهارة الجهاز التنفسي في الثقافات الظهارية المستقطبة الهادئة في المختبر (15 ، 16) أو الخلايا الظهارية الأنفية والمجرى الهوائي والشعب الهوائية والسنخية في الجسم الحي (16-20). يمكن الكشف عن الخلايا المنقولة لفترات طويلة من الزمن في الجسم الحي، مما يشير إلى أن هذه النواقل يمكن أن تندمج إما في خلايا طويلة العمر ، أو في أسلاف الجهاز التنفسي ، والتي تساهم في النسل لفترات طويلة من الزمن.

الشرط الثاني للعلاج الجيني هو التعبير الجيني المتسق والمنظم للنسب. في حين أن التعبير الجيني التأسيسي قد يكون مناسبًا لتطبيقات العلاج الجيني في أوجه القصور في جينات التدبير المنزلي ، مثل مرض التخزين الليزوزومي أو عيوب الإنزيم الأخرى ، فإنه لن يكون مقبولًا للاضطرابات الأخرى التي تتطلب تنظيم التعبير الجيني. هذا مهم بشكل خاص بعد تطور اللوكيميا في مرضى X-SCID الذين يتلقون الخلايا المكونة للدم المنقولة ارتجاعيًا مع cDNA المشترك ، بسبب عدم تنظيم الجينات الورمية الأولية في الجينوم من معززات الفيروسات القهقرية القوية من الناقل المتكامل (21).

بالنسبة لتعبير الجينات المحورة من نواقل الفيروسة البطيئة ، يمكن استخدام تصميم متجه معطل ذاتيًا حيث تتم إزالة المروج الفيروسي والمحسن في منطقة U3 من التكرار الطرفي الطويل (LTR) من ناقل البلازميد. أثناء التكامل ، يتم نسخ منطقة U3 من 3′LTR إلى 5′LTR ، مما يؤدي إلى القضاء على المروج الفيروسي 5 في العامل المتكامل (14 ، 22). يمكن التعبير عن الجينات المحورة من عناصر مروج / تنظيمية خاصة بالسلالة الداخلية. تم استخدام نواقل الفيروسة البطيئة للتعبير المنظم للجينات المعدلة في مجموعة متنوعة من السلالات مثل الخلايا الليمفاوية البائية (23) أو الخلايا الليمفاوية التائية (24 ، 25) أو كريات الدم الحمراء (26 ، 27) ومع ذلك ، لم يتم وصفها لأنواع الخلايا التنفسية.

في هذه الدراسات ، نصف تطوير وتقييم سلسلة من النواقل البطيئة التي يتم فيها التعبير عن جين متحور لبروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (EGFP) من المروجين والعناصر التنظيمية المتوقع أن توفر مجرى الهواء و / أو تعبيرًا محددًا للظهارة السنخية. المحفزات الخلوية التي تم تقييمها في هذه الدراسة هي من بروتين الفاعل بالسطح C (SPC) (28) أو بروتين إفرازي خلية كلارا 10 كيلو دالتون (CC10) (29) لتوفير النوع الظهاري السنخي الثاني (AECII) أو التعبير المقيد لخلايا كلارا ، على التوالى. تم أيضًا تقييم المروج من فيروس ارتجاعي الأغنام Jaagskiete (JSRV) ، والذي من المتوقع أن يظهر في كل من خلايا AECII و Clara (30). تم تقييم ملف النسب للتعبير الجيني من النواقل مع كل من هذه المروجين في خطوط الخلايا في المختبر وفي الرئتين بعد ذلك في الجسم الحي توصيل طاف فيروسي للفئران. تصف هذه الدراسة تطور نواقل الفيروس البطيء مع التعبير الجيني التحويلي الخاص بالجهاز التنفسي ، والذي سيسهل تطوير العلاجات الجينية للرئة ودراسة تطور الرئة والبيولوجيا.

كان العمود الفقري المتجه للفيروسات البطيئة المستخدمة في هذه الدراسة هو ناقل pCCL الذاتي التعطيل الذي قدمه الدكتور لويجي نالديني (CellGenesys ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا) (14). في هذا العمود الفقري ، تم حذف المعززات الفيروسية وصندوق TATA في منطقة المروج U3 من 3′LTR. يؤدي هذا إلى تعطيل المروج في الطور المتكامل ، حيث يتم نسخ منطقة U3 من 3′LTR إلى 5′LTR أثناء التكامل.

يحتوي العمود الفقري للمتجه الأساسي ، CCL-X-EGFP ، على موقع متعدد النسيلة (X) المنبع من جين مراسل EGFP حيث يمكن إدخال مروجي الاختبار. هذا العمود الفقري المتجه يعمل أيضًا كعنصر تحكم سلبي "غير محفز". تم التحقيق في مروج SPC البشري للتعبير الخاص بـ AECII (28). تم تقييم مروج الفئران CC10 للتعبير المحدد لمجرى الهواء في خلايا كلارا (29). كان مروجي CC10 و SPC من الدكتور جيفري ويتسيت (المركز الطبي لمستشفى الأطفال في سينسيناتي ، سينسيناتي ، أوهايو). للتعبير في كل من خلايا AECII و Clara ، قمنا بتقييم المروج من منطقة U3 من JSRV من دكتور هونغ فان (جامعة كاليفورنيا ، إيرفين ، كاليفورنيا). قام الدكتور دونالد ب. كون (مستشفى الأطفال في لوس أنجلوس ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا) بتوفير المحفز التأسيسي من معزز / محسن MND الناقل للفيروس القهقري في هذه الدراسات.

تم إنتاج المواد الطافية للفيروسات البطيئة ذات النمط الكاذب VSV-G عن طريق تعداء ثلاثية لخط خلية 293T للكلية الجنينية البشرية كما هو موضح سابقًا (23). باختصار ، تم بذر 5 × 10 6293 تي خلايا في بولي-إل-ليسين (سيغما-الدريتش ، سانت لويس ، مو) - تمت معالجتها بأطباق زراعة الأنسجة 10 سم طوال الليل.في اليوم التالي ، تم نقل الخلايا باستخدام 10 ميكروغرام من البلازميد المتجه ، و 10 ميكروغرام من بلازميد العبوة 8.9 (10) (الذي لا يعبر عن البروتينات الملحقة HIV-1) ، و 2 ميكروغرام من pMDG-VSV-G بلازميد باستخدام تعداء فوسفات الكالسيوم القياسي. بالنسبة للمستحضرات الطافية الفيروسية الأكبر حجمًا ، تم توسيع جميع مكونات ثقافة تعداء العدوى بواسطة سجل واحد لكل ألواح زراعة الأنسجة 500 سم 2 (Costar ، Lowell ، MA). بعد ستة عشر ساعة تمت إزالة الوسيط ، وغسلت الخلايا باستخدام PBS ثم تعريضها لـ 10 ملي مولار من زبدات الصوديوم (Sigma-Aldrich) لمدة 8 ساعات. تم جمع المادة الطافية بعد 72 إلى 96 ساعة من تعداء العدوى وتركيزها بالطرد المركزي عند 25000 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة في جهاز بيكمان كولتر: Optima L-90K Preparative Ultracentrifuge في دوار دلو متأرجح (SW32Ti) (Beckman Coulter ، Fullerton ، CA). نظرًا لأن المروجين من جميع النواقل الفيروسية لن يتم التعبير عنه في نوع خلية واحدة ، فقد تم تحديد التتر الخام بعد إضافة التخفيفات التسلسلية للمادة الطافية الفيروسية المكملة بـ 8 ميكروغرام / مل بوليبرين (Sigma-Aldrich) إلى نوع خلية يعبر عن كل مروج. تم معايرة نواقل SPC و JSRV على خلايا MLE-12 أو MLE-15 ومتجه CC10 على H441. تم حساب التتر الخام من خلال:

نظرًا لأن كفاءة التحويل لم تكن مكافئة بين جميع خطوط الخلايا ، فقد تم أيضًا نقل كل خط خلوي في وقت واحد باستخدام التحكم الإيجابي CCL-MND-EGFP ، لتطبيع العيار لكفاءة نقل الجينات على خلايا 293A (Invitrogen ، Carlsbad ، CA). تم استخدام التتر الطبيعي لحساب تركيز الفيروس وعمل التخفيفات لكل تجربة.

لتجارب النقل ، تم طلاء 1 × 10 5 خلايا في كل بئر من صفيحة معالجة بثقافة الأنسجة المكونة من 6 آبار. في اليوم التالي ، تم استبدال الوسيط بمادة طافية للفيروسات البطيئة واستُكمِل بـ 8 ميكروغرام / مل من البوليبرين. تم استبدال وسيط طاف المتجهات في صباح اليوم التالي بوسط نمو جديد. تم تمرير الخلايا حسب الحاجة وتم تحديد نسبة الخلايا التي تعبر عن EGFP عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد 5 إلى 7 أيام.

لتحليل التدفق الخلوي لتعبير الجينات المحورة EGFP ، تم تجريب الخلايا وغسلها في برنامج تلفزيوني وتعليقها في محلول ملحي هانكس الخالي من المؤشرات (Invitrogen). تم تحليل العينات على FACs Calibur باستخدام برنامج Cellquest (بكتون ديكسون ، سان خوسيه ، كاليفورنيا).

تم شراء الفئران الأنثوية الحامل C57B6J الموقوتة من مختبرات جاكسون (بار هاربور ، ME) ، وتم شراء العراة الرياضية التي يبلغ عمرها من 6 إلى 8 أسابيع من Harlan Sprague Dawley (إنديانابوليس ، إنديانا). تم الحفاظ على جميع الفئران في مرفق الحيوانات المركزي التابع لمعهد أبحاث سابان التابع لمستشفى الأطفال في لوس أنجلوس طوال مدة الدراسة. تمت الموافقة على جميع الدراسات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في مستشفى الأطفال في لوس أنجلوس.

في وقت القتل ، تم تخدير الفئران عن طريق التوصيل داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم (150 مجم / كجم). تم فتح تجاويف الصدر والبطن جراحيًا ، وقطع الشريان الكلوي ، وتم تغذية الحيوان بما لا يقل عن 10 مل من PBS من خلال البطين الأيمن للقلب. تم تضخيم الرئتين بمركب Tissue-Tek OCT (Fisher Scientific ، Tustin ، CA) من خلال قسطرة وريدية قياس 22 تم إدخالها في القصبة الهوائية. تم حصاد الرئة والقصبة الهوائية والقلب والغدة الصعترية والكلى والأمعاء والكبد والطحال والعضلات الهيكلية من أجل التألق المناعي EGFP وتحليل الحمض النووي الأولي. من أجل تحليل التألق المناعي ، تم تضمين قطع من الأنسجة في وسط OCT وتم تخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى تجزئة وتحليل التألق المناعي لتعبير EGFP كما هو موضح أدناه. تم جمع قسامات من الأنسجة أيضًا لتحليل الحمض النووي الأولي عن طريق التجميد المفاجئ في النيتروجين السائل والتخزين عند -80 درجة مئوية حتى الاستخراج.

لتقييم ملف النسب للتعبير الجيني في الأنسجة الأولية ، تم حقن الفئران بطاف لينتيفيرال إما عن طريق الوريد أو داخل الرغامى. تم إجراء الحقن في الوريد كما هو موصوف (32). باختصار ، تلقى كل يوم 0 حديثي الولادة C57B6J جرو 1 × 10 8 وحدات دولية (iu) مخففة إلى 50 ميكرولتر بمحلول ملحي معقم خالي من المواد الحافظة و 8 ميكروغرام / مل بوليبرين يتم تسليمها عبر وريد الوجه. كان وزن الجراء من 1.3 إلى 1.8 جرام في وقت الحقن ، مما أدى إلى جرعة متجهة من 5.5 إلى 7.7 × 10 7 وحدة دولية / جم. بعد الحقن ، تم إرجاع الجراء إلى عشهم ، وتم رعايتهم ، وفطمهم باتباع البروتوكولات القياسية.

للتوصيل داخل الرغامى لمزيج من الفيروس البطيء / عامل نمو الخلايا الكيراتينية (KGF) ، تم تحفيز التخدير باستخدام 5 ٪ أيزوفلوران والحفاظ عليه مع 2.5 ٪ أيزوفلوران في الفئران العارية من 6 إلى 8 أسابيع (Harlan ، Indianapolis ، IN). تم تمديد العنق وتنظيفه بمحلول الكلورهيكسيدين. تم عمل شق صغير في خط الوسط بمشرط معقم لكشف القصبة الهوائية. تم حقن إجمالي حجم 50 ميكرولتر يحتوي على 1 × 10 8 جسيم ناقل (معلق في محلول ملحي 0.9٪ مع 5 ملجم / كجم مؤتلف بشري [rh] KGF) في القصبة الهوائية باستخدام حقنة الأنسولين 0.5 سم مكعب مع إبرة 28-Ga (Becton -ديكسون). تلقت الفئران الضابطة توصيلًا داخل الرغامى من 50 ميكرولتر من محلول ملحي مختلط بـ 5 مجم / كجم rhKGF. بعد الحقن ، تمت معالجة الجرح بقطرتين أو قطرتين من بوبيفيكان (كمخدر موضعي) وإغلاقه بمادة لاصقة من الأنسجة. أعطيت الفئران المضادات الحيوية (مكسيم 200 ميكروغرام / مل في ماء معقم) لمدة شهر واحد والكيتوبروفين تحت الجلد في يوم الجراحة ، وفي اليوم التالي للجراحة. قُتلت الفئران من 1 إلى 6 أسابيع بعد الحقن لتحليل التعبير EGFP.

تم تقسيم الرئتين المجمدة عند 5 ميكرومتر على ناظم كريوستات CM1900 (لايكا ، بانوكبيرن ، إيل) ووضعت على شريحة زجاجية بلاس (فيشر ساينتيفيك ، توستين ، كاليفورنيا). تم إصلاح المقاطع المجففة باستخدام أسيتون مبرد مسبقًا (-20 درجة مئوية) 100٪ لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. كانت المقاطع ملطخة لتوطين خلايا AECII و Clara داخل الأنسجة وتقييم الأنساب التي كانت تعبر عن EGFP. تم حظر المقاطع باستخدام مصل الحمير الطبيعي بنسبة 5٪ يحتوي على 1٪ ألبومين مصل بقري و 0.1٪ تريتون X-100 و 0.05٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة قبل تطبيق الجسم المضاد الأولي. تم حظر العينات الملطخة بالأجسام المضادة الموجهة ضد CD45 بنفس المخزن المؤقت ، دون إضافة Triton X-100.

لتحديد خلايا AECII التي تعبر عن EGFP ، تم وضع علامات مزدوجة على أقسام الرئة باستخدام الماعز المضاد لـ GFP (1: 800 Abcam ، Cambridge ، MA) والأجسام المضادة المضادة للإنسان المؤيدة لـ SPC للأرانب ، والتي تتفاعل مع الماوس المؤيد لـ SPC (1: 1000 Chemicon، Temecula، CA) مع التخفيفات المصنوعة في المخزن المؤقت لحجب المصل. ضوابط سلبية متضمنة أقسام تعامل بنفس العينات المسمى باستثناء كونها محتضنة في منع المخزن المؤقت بدون الأجسام المضادة الأولية. تم غسل المقاطع بنسبة 0.05 ٪ توين 20 في PBS (PBST) ، وتم التعرف على الخلايا المناعية بعد حضانة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مضاد للأرنب IgG CY3 للحمار ومضاد للماعز IgG fluorescein isothiocyanate (FITC) (الكل) الأجسام المضادة الثانوية من مختبرات جاكسون إمونو ريساش ، ويست جروف ، بنسلفانيا). تم غسل المقاطع مرة أخرى باستخدام PBST والنواة ملطخة بـ DAPI (مجسات جزيئية ، يوجين ، أو). بعد الغسل النهائي مع تغيير واحد من PBST ، وغسل واحد في PBS ، تم تغطية المقاطع بكواشف طويلة الأمد للذهب المضاد (مجسات جزيئية) ، وإما تم تحليلها على الفور أو تخزينها عند -20 درجة مئوية.

لمزيد من توصيف سلالات الخلايا الإيجابية لـ GFP في أقسام الأنسجة السنخية ، تم تلطيخها بنفس التقنية الموضحة أعلاه ، ولكن تم تمييزها ثلاث مرات بـ: الماعز المضاد لـ GFP (1: 800) ، CD45 الفئران المضادة للفأر (1: 100 Caltag المختبرات ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، ومضادات الأرانب المؤيدة لـ SPC (1: 1000). تم استخدام IgG FITC المضاد للماعز على شكل حمار ، و IgG CY3 ضد الفئران ، و IgG CY5 ضد الأرانب كأجسام مضادة ثانوية.

لتحديد خلايا كلارا إيجابية EGFP في الممرات الهوائية ، تم تحضين أقسام الرئة بجسم ماعز مضاد لـ CC10 لـ CC10 (1: 1500 سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، سانتا كروز ، كاليفورنيا) والدجاج المضاد لـ GFP (1: 2000 Abcam) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. تم التعرف على الخلايا المناعية بعد وضع العلامات باستخدام IgG المضاد للحمار ، والجسم المضاد المترافق CY3 ، والجسم المضاد المترافق مع الحمير FITC المضاد للدجاج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

تم استخدام الضوابط السلبية مع كل تجربة ، وتضمنت فئران تحكم سلبية عولجت ببرنامج تلفزيوني ، بالإضافة إلى أقسام من كل عنصر تحكم وحيوان تجريبي محتضن بمخزن بدون جسم مضاد أولي. تم تصور جميع العينات من خلال مجهر مركب فلوري (Leica DMRXA) وتم التقاط الصور بكاميرا رقمية (Spectra cube) ، وتم الحصول عليها باستخدام برنامج EasyFISH (Applied Spectral Imaging ، Preston ، المملكة المتحدة).

تم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة Puregene DNA Isolation (Gentra Systems ، Minneapolis ، MN) باستخدام البروتوكولات الموصى بها من الشركة المصنعة. تم إجراء تحليل PCR القياسي لتسلسل الحمض النووي للتحكم الجيني EGFP و β-actin على خطوط الخلايا والأنسجة المنقولة من في الجسم الحي الحيوانات المعالجة طافًا لتأكيد احتوائها على متواليات طافية كما هو موصوف (33). تم تحديد متوسط ​​عدد النسخ المتجه في عينات الحمض النووي المتاحة عن طريق التحليل الكمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي ، بالمقارنة مع التخفيفات اللوغاريتمية التسلسلية للحمض النووي الجيني من استنساخ Jurkat يحمل نسخة واحدة لكل خلية كما هو موصوف (33).

تم إنشاء سلسلة من نواقل الفيروسة البطيئة حيث تم التعبير عن التحوير EGFP من إما مروج داخلي SPC أو CC10 أو JSRV. تمت مقارنة التعبير الجيني من هذه النواقل مع ناقل تحكم إيجابي مع المروج التأسيسي من منطقة U3 من الفيروس القهقري MND LTR (31). لا يوجد عنصر تحكم في المروج بمثابة عنصر تحكم سلبي لتجارب خط الخلية. تظهر المخططات التخطيطية لكل متجه في الشكل 1. تم حزم النواقل في جزيئات الفيروسة البطيئة المؤتلفة مع بروتين VSV-G كمغلف لنقل مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. نظرًا لعدم وجود خط خلية واحد يعبر عن جميع المروجين الذين تم تقييمهم في هذه الدراسة ، تم حساب التتر بعد تحويل كل ناقل إلى خط خلية معروف للتعبير عنه كما هو موضح أعلاه.

شكل 1. المخططات التخطيطية للفيروسات المتكاملة. النواقل هي نواقل الفيروسة البطيئة من الجيل الثالث ذاتية التعطيل على أساس سلسلة CCL من النواقل. السهام تمثل المروج النسخي.

في المجموعة الأولى من التجارب ، تم تقييم التعبير الجيني من كل من نواقل الاختبار والتحكم في خطوط الخلايا التي تمثل مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. تم تعريض قسامات من كل خط خلوي لجزيئات فيروسية ذات تركيز مكافئ من كل ناقل اختبار ومراقب. تم نقل خطوط الخلايا الملتصقة بـ 3 × 10 4 وحدة دولية / مل (تعدد العدوى [وزارة الداخلية]: 0.3) وتم نقل الخلايا المعلقة بـ 1 × 10 4 وحدة دولية / مل (وزارة الداخلية: 0.1). تم اختيار هذه التركيزات الفيروسية كتجارب بواسطة مختبرنا ، وقد أظهر آخرون (23) أن هذه الظروف تقلل من نسبة الخلايا ذات النسخ المتعددة من الناقل ، وبالتالي سهلت تحليل التعبير على الخلايا التي تحمل نسخة واحدة من طاهر الفيروس. يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي لخط خلية AECII (MLE-12) وخط خلية واحد غير تنفسي (293A) في الشكل 2. نظرًا لعدم تمتع جميع خطوط الخلايا بنفس كفاءة التحويل الإجمالية ، يتم تقديم البيانات على أنها النسبة النسبية للخلايا التي تعبر عن EGFP من متجه الاختبار إلى متجه التحكم MND التأسيسي لخط الخلية المحدد هذا. على سبيل المثال ، متجه اختبار يعبر عن نفس نسبة الخلايا مثل ناقل التحكم الإيجابي MND الذي يروج له في خط خلية معين له نسبة تعبير 1 (الشكل 3).

الشكل 2. تحليل التدفق الخلوي للتعبير الجيني EGFP في 293A (اللوحة العلوية) و MLE-12 (اللوحة السفلية) خطوط الخلايا المنقولة مع لوحة ناقلات الفيروسة البطيئة. تم نقل الخلايا مرة واحدة باستخدام طاف للفيروسات البطيئة وتم تقييمها عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد 5 إلى 7 أيام. يشير الرقم في المنطقة 2 (R2) إلى النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لـ EGFP.

لوحظ أعلى تعبير EGFP من مروج CC10 في خطوط خلايا كلارا Mtcc1-2 و H441. كان مستوى التعبير أعلى من متجه التحكم الإيجابي CCL-MND-EGFP بمتوسط ​​تعبيرات EGFP 1.3 و 1.5 لخلايا Mtcc1-2 و H441 ، على التوالي ، بالنسبة للتعبير من متجه MND ، والذي تم تعيينه عند 1 (ن = 4). كان التعبير الجيني أقل بكثير في خطوط الخلايا الظهارية التنفسية الأخرى غير Clara ، MLE-12 (0.09). ص & lt 0.01) ، MLE-15 (0.2 ص & lt 0.01) و A549 (0.1 ص & lt 0.01) باستخدام ثنائي الذيل ر الاختبارات (الشكل 3 أ). كان مستوى تعبير EGFP من مروج CC10 في جميع خطوط الخلايا غير التنفسية أقل أيضًا بشكل ملحوظ ، بنطاق من 0.001 إلى 0.14 (الكل ص & lt 0.001 ثنائي الذيل ر اختبار). تشير هذه البيانات إلى أن التعبير الجيني من ناقل CCL-CC10-EGFP منظم ، ومخصص للنسب لخطوط خلايا كلارا.

الشكل 3. ملخص التعبير الجيني في لوحة من خطوط الخلايا من (أ) CCL-CC10-EGFP ، (ب) CCL-SPC-EGFP و (ج) ناقلات CCL-JSRV-EGFP. يتم تقديم مستويات التعبير على أنها طبيعية للتعبير من ناقل التحكم الإيجابي CCL-MND-EGFP ± الخطأ المعياري للمتوسط. النجمة تشير إلى مستويات مختلفة من التعبير بين مجموعات الخلايا ذات الدلالة الإحصائية ص قيم & lt 0.05 (ذيلان ر test) مع محدد ر اختبار القيم الإحصائية الموضحة في النص.

كما هو متوقع ، لوحظت أعلى نسبة مئوية من الخلايا التي تعبر عن EGFP من مروج SPC في خطوط خلايا AECII ، والتي تعبر عن جين SPC الداخلي (الشكل 3B ن = 4). على سبيل المثال ، كانت مستويات تعبير EGFP النسبية في خطوط الخلايا الإيجابية لـ SPC MLE-12 و MLE-15 1.3 و 0.9 بالنسبة إلى النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن مروج MND (تم تعيينها عند 1.0). كانت النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن EGFP في خطوط غير AECII أقل إحصائيًا من التعبير الموجود في خطوط خلايا AECII. على وجه التحديد ، كان لخطوط خلايا كلارا تعبيرات نسبية قدرها 0.6 لـ H441 و 0.03 لـ Mtcc1-2 على التوالي ، والتي كانت أقل بكثير من متوسط ​​تعبيرات MLE-12 (ص & lt 0.001 ثنائي الذيل ر test) و MLE-15 (ص & lt 0.001 ثنائي الذيل ر اختبار).

كان تعبير EGFP النسبي من ناقل CCL-SPC-EGFP في جميع خطوط الخلايا الظهارية غير التنفسية أقل من 0.10 (الشكل 3 ب). أظهر التحليل الإحصائي أن هناك فرقًا كبيرًا بين تعبير EGFP في خطوط خلايا AECII MLE-12 و MLE-15 مقارنة بجميع خطوط الخلايا غير التنفسية (جميعها. ص & lt 0.002 ، ثنائي الذيل ر اختبار). بشكل جماعي ، توضح هذه البيانات أن تعبير EGFP التجريبي من مروج SPC خاص للغاية بخطوط خلايا AECII الإيجابية لـ SPC.

على عكس التعبير من SPC و CC10 lentivectors ، لوحظت مستويات معتدلة إلى عالية من التعبير الجيني من ناقل CCL-JSRV-EGFP في جميع خطوط الخلايا التنفسية وغير التنفسية التي تم اختبارها ، باستثناء 293A ، والتي كان لها تعبير منخفض جدًا (الشكل 3C ن = 4). لوحظ أعلى مستوى من التعبير في خلايا Jurkat (T-lymphoid) مع نسبة تعبير EGFP 1.1 ، مع مستويات معتدلة من التعبير لوحظ في جميع خطوط الخلايا الظهارية التنفسية (المدى: 0.4-0.8). تم الكشف عن مستويات معتدلة إلى منخفضة من التعبير في خطوط الخلايا من أصل العضلات ، والعصبية ، والكلى ، والدم (المدى ، 0.03-0.6). لم يكن هناك فرق كبير بين تعبير EGFP بين أي من خطوط الخلايا الظهارية التنفسية وخطوط الخلايا غير التنفسية (جميع ص القيم & GT 0.05 ثنائي الذيل ر اختبار) ، مشيرًا إلى أن ناقل CCL-JSRV-EGFP لم ينتج تعبيرًا خاصًا عن التحوير الظهاري التنفسي.

لتأكيد أن نقص التعبير الجيني من المروج لم يكن بسبب نقص النقل الأولي في هذه التجارب ، تم تقييم جميع العينات عن طريق تحليل PCR لتسلسلات EGFP الأولية. يتم عرض البيانات المأخوذة من تحليل PCR تمثيلي في الشكل 4 ، مما يدل على وجود تسلسلات EGFP الأولية في جميع خطوط الخلايا المنقولة. هذا يؤكد أن نقص تعبير EGFP الذي لوحظ في خطوط الخلايا غير التنفسية من SPC و CC10 لم يكن بسبب نقص نقل الجينات ، ولكن بسبب الاختلافات في تنظيم التعبير الجيني في أنواع الخلايا المختلفة.

الشكل 4. تحليل PCR لـ Proviral EGFP (اللوحة اليمنى) والرقابة الداخلية B-actin (اللوحة اليسرى) تسلسل الجينات على الحمض النووي المستخرج من الخلايا المنقولة بلوحة ناقلات الفيروسة البطيئة. لم يتم تعريض العينات الوهمية إلى طاف لينتيفيرال ، ولم يتم تعريض أي عينات مروج لطاف طاف للفيروس البطيء لا يحتوي على مروج لـ EGFP (كدنا).

لتقييم التعبير الجيني من نواقل العدسة CC10 و SPC في ظهارة الجهاز التنفسي الأولية ، تم حقن المواد الطافية للفيروسات البطيئة مباشرة في القصبة الهوائية للفئران العارية الأثيمية المتلقية. تم استخدام الفئران العارية في هذه الدراسات لتسهيل تنظيف منطقة الرقبة للجراحة وتصور القصبة الهوائية للحقن. في الدراسات الأولية ، تم إعطاء الفئران طاف طاف للفيروسات البطيئة داخل الرغامى دون علاج KGF ، ومع ذلك ، لم يلاحظ أي انتقال (لم تظهر البيانات). في حين أن نواقل الفيروسة البطيئة يمكن أن تنقل أنواع الخلايا غير المنقسمة ، فقد تم إثبات كفاءة أعلى في التنبيغ في العديد من أنواع الخلايا ، مع تحريض دورة الخلية (11-13). في جميع تجارب التوصيل داخل القصبة الهوائية المعروضة هنا ، عولجت الفئران بـ KGF من قبل ، وفي ذلك الوقت ، تناول الفيروس لزيادة دورة خلية كلارا (34) و AECII (35). وقد ثبت أن هذه الاستراتيجية تزيد من دورة الخلية ونقل الجينات الفيروسية إلى الرئتين في دراسات أخرى (36 ، 37). تم حصاد الرئتين والمسالك الهوائية للفئران المتلقية وتقييمها في 6 أسابيع بعد تسليم طاف ناقل لتعبير EGFP عن طريق تحليل التألق المناعي.

تم تحصين أقسام الأنسجة من متلقي ناقل الفيروسة البطيئة CCL-CC10-EGFP بأجسام مضادة لـ GFP. تم الكشف عن الخلايا المناعية EGFP في المسالك الهوائية للحيوانات المعالجة بـ CCL-CC10-EGFP ، مع وجود عدد قليل من خلايا مجرى الهواء الإيجابية لـ EGFP المناعي لكل عرض. لم يتم الكشف عن الخلايا الإيجابية EGFP في الفئران الضابطة السلبية التي تتلقى برنامج تلفزيوني. لتحديد نسب الخلايا الإيجابية لـ EGFP في المسالك الهوائية للفئران التجريبية ، تم تمييز أقسام الأنسجة بالأجسام المضادة الموجهة ضد البروتينات CC10 (المتقارن الأحمر Cy3) و EGFP (المتقارن الأخضر- FITC) (الشكل 5). أظهر هذا التحليل أن الخلايا المناعية لـ EGFP (لون أخضر) في المسالك الهوائية تم تحصينها أيضًا بأجسام مضادة لـ CC10 (أحمر). تظهر الصور المجهرية لتحليل التألق المناعي المزدوج التمثيلي على أقسام مجرى الهواء من حيوانات التحكم CCL-CC10-EGFP و PBS في الشكلين 5 أ و 5 ب ، على التوالي. ال اللوحات اليسرى عرض الصور المدمجة مع EGFP (لون أخضر) ، CC10 (أحمر) ، ونواة ملطخة DAPI (أزرق). ال الألواح الوسطى عرض DAPI و EGFP (لون أخضر) القنوات و اللوحة اليمنى يظهر فقط قنوات DAPI و CC10.

الشكل 5. تحليل التألق المناعي للرئتين بعد الولادة داخل الرغامى لمادة CCL-CC10-EGFP lentiviral supernatant (أ و ج) أو PBS (ب و د) للفئران. أ و ب هي تجميد أنسجة مجرى الهواء محصنة بالمناعة لـ EGFP (لون أخضر) و CC10 (أحمر) مع نوى ملطخة DAPI (أزرق). ج و د إظهار تجميد الأنسجة السنخية المناعية لـ EGFP (لون أخضر) ، الموالية- SP-C (زهري) ، ونواة ملطخة DAPI. يتم عرض الصور بكل الألوان (كل القنوات) مدمجة في ملف اللوحة اليسرى، ومع كل لون مناعي واحد مع DAPI إلى حق التابع صورة مدمجة. السهام تشير إلى خلايا موجبة مزدوجة. التكبير الأصلي لجميع الصور المجهرية: × 200.

حددنا بعد ذلك نسبة خلايا مجرى الهواء التي كانت إيجابية بالنسبة لـ EGFP من خلال حساب العدد الإجمالي لخلايا مجرى الهواء وخلايا مجرى الهواء الإيجابية EGFP في أقسام الأنسجة من مستلمين في 6 أسابيع بعد الحقن. في مستلم واحد (IT1-8) ، كانت 2.4٪ (10/422) من خلايا مجرى الهواء موجبة لـ EGFP ، بينما في المستلم الثاني (IT4-11) كانت 3.6٪ (18/496 خلية) من خلايا مجرى الهواء إيجابية لـ EGFP التعبير (الجدول 1).

الجدول 1. ملخص لتناسب الخلايا EGFP-POSITIVE في الهواء والأنسجة الفلكية بعد الإدارة داخل الأوعية للطبيب الباطني

تعريف الاختصارات: CC10 ، Clara cell 10-kD protein EGFP ، بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن GFP ، بروتين الفلورسنت الأخضر SPC ، بروتين السطحي C.

* تم حساب خلايا مجرى الهواء حصريا لهذا التحليل.

† تم حساب جميع الخلايا الموجودة في المنطقة السنخية لهذا التحليل ، وبالتالي تشمل AECI و AECII بالإضافة إلى خلايا الأوعية الدموية وخلايا الدم.

في متلقي الفيروس البطيء CCL-CC10-EGFP ، تم أيضًا اكتشاف الخلايا السنخية تلطيخًا إيجابيًا لـ EGFP. لتحديد سلالات الخلايا السنخية التي تعبر عن EGFP في هؤلاء المستلمين ، تم تصنيف عمليات التجميد ثلاثية مع الأجسام المضادة ضد EGFP (مترافق مع FITC الأخضر) ، CC10 لخلايا Clara (مترافق مع red-cy3) ، و pro-SPC لـ AECII (وردي- Cy5) مترافق). كانت الخلايا السنخية المناعية لـ EGFP أيضًا مناعية بالنسبة لـ SPC المؤيدة ، ولكنها سلبية للتعبير CC10 ، مما يشير إلى أن الخلايا السنخية التي تعبر عن ناقل CCL-CC10-EGFP كانت AECII (الشكل 5C). يشير هذا إلى أن محفز CC10 الأولي كان نشطًا في الخلايا الإيجابية المؤيدة لـ SPC في الجسم الحي. لم يتم الكشف عن الخلايا المناعية لـ EGFP في الأنسجة السنخية لفئران التحكم المعالجة ببرنامج تلفزيوني (الشكل 5 د). توضح هذه الدراسات أن نواقل الفيروسة البطيئة تحمل محفز CC10 تعبيرًا مباشرًا عن التحوير لكل من AECII في الأنسجة السنخية وخلايا كلارا في أنسجة مجرى الهواء في الجسم الحي.

في متلقي طاف ناقل CCL-SPC-EGFP داخل الرغامى ، لوحظت الخلايا المناعية لكل من EGFP والمؤيدة لـ SPC في الأنسجة السنخية في جميع النقاط الزمنية التي تم تقييمها. كان التشكل والتوطين ونمط تلطيخ نقطي مؤيد لـ SPC لخلايا EGFP المزدوجة والخلايا الإيجابية المؤيدة لـ SPC متسقة مع AECII. يوضح الشكل 6 صورة مجهرية للأنسجة السنخية (الشكل 6 أ × 200) ، وصورة عالية التكبير لخلية مزدوجة مؤيدة لـ SPC و EGFP إيجابية (الشكل 6B × 640) ، مما يشير إلى أن خلايا AECII كانت قادرة على التعبير عن EGFP من المروج lentiviral SPC. تباينت نسبة الخلايا الإيجابية لـ EGFP بين الحيوانات وأقسام الأنسجة وداخل منطقة كل قسم من الأنسجة ، حيث تميل الخلايا الإيجابية إلى التجمع داخل منطقة ما. يوضح الشكل 6C منطقة بها عدة خلايا AECII إيجابية EGFP متجمعة (× 200) ، ويظهر الشكل 6D صورة مجهرية عالية التكبير لنفس المنطقة (× 640). لتقدير متوسط ​​كفاءة التنبيغ ، حددنا نسبة الخلايا السنخية الإيجابية المؤيدة لـ SPC إيجابية EGFP في أقسام من ثلاثة متلقين في 6 أسابيع بعد الحقن. تراوحت نسبة جميع الخلايا السنخية التي كانت إيجابية لكل من EGFP والمؤيدة لـ SPC بين 2.3 ٪ و 4.6 ٪ (الجدول 1). ومع ذلك ، نظرًا لأن العدد الإجمالي للخلايا السنخية يشتمل على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا السنخية التي لا يُتوقع التعبير عنها من محفز SPC ، فمن المحتمل أن تمثل هذه النسب المئوية أقل من تمثيل النسبة الفعلية لـ AECII المنقولة التي تعبر عن جين التحوير EGFP.

الشكل 6. تحليل التألق المناعي لأنسجة الرئة للتعبير عن التحوير EGFP بعد التسليم داخل الرغامي لمادة CCL-SPC-EGFP lentiviral طاف للفئران. كانت عمليات التجميد ملطخة بالمناعة لـ EGFP (لون أخضر) والمؤيدة لـ SPC (أحمر) ونواة مع DAPI (أزرق). في أ، ال سهم يُظهر خلية مزدوجة إيجابية للتلوين المناعي المؤيد لـ SPC و EGFP (× 200). ب هو تكبير أعلى (× 640) من منطقة محاصر من عند أ. ج يُظهر مثالاً للمنطقة السنخية التي لديها مستوى عالٍ من توصيل AECII وتعبير EGFP (× 200). د يُظهر تكبير أعلى لـ منطقة محاصر في ج (× 640). يتم عرض جميع الصور مع دمج جميع الألوان في ملف اللوحة اليسرى (جميع القنوات) ، ومع كل لون واحد مناعي مع DAPI إلى حق التابع صورة مدمجة.

في نقاط زمنية مبكرة في بعض الحيوانات ، تم اكتشاف نشاط مناعي EGFP أيضًا في الخلايا السنخية سلبية للتلوين المؤيد لـ SPC ، مما يشير إلى أنها لم تكن AECII. تم ملاحظة هذه الخلايا الإيجابية لـ EGFP المؤيدة لـ SPC - سلبية فقط في النقاط الزمنية المبكرة (1 و 2 أسبوع) ولم يتم ملاحظتها في النقطة الزمنية اللاحقة (6 أسابيع). تم تحديد نسب هذه الخلايا المؤيدة لـ SPC السلبية على أنها مكونة للدم (CD45 إيجابية) بعد تلطيخ EGFP و Pro-SPC و CD45 (البيانات غير معروضة). لم يتم ملاحظة الخلايا المكونة للدم إيجابية EGFP (إيجابية CD45) في نقطة زمنية مدتها 6 أسابيع في أي متلقي. نظرًا لأن البلاعم تتغذى على الحطام ، فمن غير الواضح ما إذا كانت الضامة السنخية قد تم نقلها باستخدام الفيروس البطيء والتعبير عن EGFP من مروج SPC ، أو كانت تتناول EGFP الموجودة في التحضير الفيروسي و / أو التي تنتجها خلايا AECII المنقولة. نظرا لدينا في المختبر تدل البيانات على أن ناقل CCL-SPC-EGFP لا يعبر عن خطوط الخلايا المكونة للدم (الشكل 3) ، ونقص التعبير في نخاع العظم الأولي (البيانات غير معروضة) ، وحقيقة أن EGFP لم يتم اكتشافه في 6. نقطة زمنية الأسبوع ، من المحتمل أن الضامة السنخية قد تبتلع الحطام في المستحضر الفيروسي. ومع ذلك ، لا يمكن أن تستبعد الدراسات الحالية احتمال أن الضامة السنخية كانت تعبر عن الجينات المحورة.

في المجموعات التالية من التجارب ، تم تقييم تقييد النسب لناقلات الفيروسة البطيئة بعد إعطاء الوريد من طاف الفيروسة البطيئة من خلال الوريد الوجهي لفئران اليوم 0 C57B6J الوليدية. تم حقن كل فأر حديث الولادة بجزيئات فيروسية ∼ 1 × 10 8 من CCL-SPC-EGFP أو CCL-CC10-EGFP lentiviral supernatant. تم حصاد الأنسجة من الفئران المتلقية بعمر يصل إلى 14 شهرًا وقسامات مخزنة لاستخراج الحمض النووي وتحليل EGFP PCR ، والحفظ بالتبريد في مركب OCT من أجل التحليل المجهري المناعي والفلوري لـ EGFP. تم استخدام الفئران المعدلة وراثيًا من النوع C57B6J من النوع GFP كعناصر تحكم إيجابية وسلبية لهذه الاختبارات ، على التوالي.

في سبعة متلقين من طاف CCL-CC10-EGFP ، تم الكشف عن تسلسل بروفيرال في جميع الكبد ، ومعظم الطحال والقلوب والكلى من متلقي حديثي الولادة (الجدول 2). بعد ذلك ، تم تقييم مستوى التحويل عن طريق التحليل الكمي في الوقت الحقيقي PCR على العينات المتاحة. يتراوح عدد النسخ الأولية في الأنسجة من 0.060 إلى 0.175 نسخة لكل خلية في المتوسط ​​في الكبد (الأعلى). لوحظ انخفاض عدد النسخ في القلب (المدى ، 0.00025-0.09) ، والطحال (المدى ، 0.027-0.030) ، والكلى (المدى ، 0.00002-0.00006). مستوى نقل الجينات الذي لوحظ في هذه الدراسات يتوافق مع مستويات التنبيغ التي لوحظت في دراسات أخرى لحقن طاف الفيروسة البطيئة في الولدان (32). خضعت جميع أنسجة الكبد والقلب والطحال والكلى التي كانت إيجابية لتسلسل ما قبل الفيروس في أي من المقايسين لتحليل المجهري EGFP المناعي. تم تقييم قسمين من الأنسجة متباعدة جيدًا لكل نسيج ، ولم يتم الكشف عن تعبير EGFP في أي من الأقسام التي تم تحليلها (البيانات غير معروضة). بالنظر إلى أعداد النسخ التي تصل إلى 0.175 (بما يقابل ما يصل إلى 17.5٪ من الخلايا التي تحمل جينومًا أوليًا واحدًا) ، فإن هذه البيانات تدعم في المختبر توضح بيانات خط الخلية أن تعبير الجينات المعدلة وراثيًا لا يلاحظ في العديد من الأنسجة غير التنفسية من ناقل CCL-CC10-EGFP.

الجدول 2. ملخص التحليل القياسي المعياري لتحليل EGFP PCR في الأنسجة من الفئران المحقونة عن طريق الحقن بالإشراف الباطني

تعريف الاختصارات: + ، EGFP إيجابي - ، لم يكتشف EGFP CC10 ، بروتين Clara cell 10-kD NA ، العينة غير متوفرة SPC ، بروتين السطحي C.

في المستلمين الأربعة الوريديين لناقل CCL-SPC-EGFP ، كانت جميع عينات الحمض النووي من الطحال والكبد ، وثلاثة من القلب الأربعة ، وواحدة من أربع عينات من الكلى إيجابية لتسلسل EGFP (الجدول 2). تم إجراء تحليل PCR الكمي على عينات الحمض النووي المتاحة. تراوح متوسط ​​عدد النسخ الأولية بين 0.003 و 0.09 للقلب (ثلاث عينات) ، و 0.01 و 0.025 للطحال (ثلاث عينات) ، و 0.03 للكلى (عينة واحدة). تم تقييم قسمين من الأنسجة من جميع الأنسجة الإيجابية للفيروس للتعبير عن EGFP. كانت جميع أقسام الأنسجة سلبية للتعبير عن EGFP عن طريق تحليل التألق المناعي (البيانات غير معروضة). أظهرت هذه البيانات تباينًا في مستوى نقل الجينات إلى الأنسجة غير التنفسية باستخدام نهج الحقن الوريدي لحديثي الولادة. ومع ذلك ، فإن نقص التعبير الجيني الذي لوحظ في أي نسيج غير تنفسي يدعم في المختبر البيانات ، مما يشير إلى أن lentivector CCL-SPC-EGFP لا يتم التعبير عنه في الأنسجة غير التنفسية. بشكل جماعي ، فإن في المختبر و في الجسم الحي تشير البيانات المقدمة أعلاه إلى أن هذه النواقل تنتج تعبيرًا منظمًا خاصًا بالجهاز التنفسي.

سيكون التعبير عن الجينات الخاضعة للتنظيم النسب ضروريًا للعلاجات الجينية الفعالة وطويلة الأمد للاضطرابات التي تؤثر على الرئة. استخدمت معظم التجارب السريرية للعلاج الجيني الموجهة إلى الظهارة التنفسية حتى الآن محفزات تأسيسية مثل المروج من الفيروس المضخم للخلايا (CMV) أو المروج في LTR الفيروسي. ومع ذلك ، فقد أشارت الدراسات التي أجريت على الحيوانات على المدى الطويل إلى أنه بمرور الوقت ، يمكن إسكات تعبير الجينات المعدلة من المحفزات الفيروسية (38 ، 39) ، أو يمكن أن تتجاهل الجينات الخلوية بالقرب من موقع التكامل مما يؤدي إلى تكون الأورام (21). وبالتالي ، سيكون تنظيم التعبير الخاص بالنسب مفيدًا للعديد من تطبيقات العلاج الجيني لتجنب إسكات الناقل أو السمية المرتبطة بتعبير الجينات المحورة غير المنظم. ستكون النواقل الخاصة بالنسب أيضًا أدوات مفيدة لدراسة بيولوجيا الرئة ، لتتبع وتحديد نسل الخلايا الجذعية ، ومراقبة الإمكانات التفاضلية للخلايا الجذعية ، و / أو توصيل الجينات المحورة في أوقات محددة أو إلى سلالات محددة.

في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم ملف تعريف التعبير عن النسب لناقلات الفيروسة البطيئة بسلسلة من العناصر التنظيمية الخاصة بالظهارة التنفسية. في تجارب خط الخلية ، أنتج lentivector المعزز بواسطة SPC تعبيرًا خاصًا بـ AECII بينما كان lentivector المعزز بـ CC10 أعلى مستوى من التعبير في خطوط خلايا Clara. في المقابل ، أظهر lentivector الذي يروج له JSRV مستوى عالٍ من التعبير الجيني في العديد من أنواع الخلايا المختلفة. تتناقض هذه النتائج مع الدراسات التي تقيم محفز JSRV في تركيبات البلازميد والفيروسات القهقرية ، حيث يتم تنظيم التعبير إلى سلالات الخلايا AECII و Clara. سبب هذه الاختلافات في ملف تعريف التعبير من مروج JSRV بين ناقلات نقل الجينات المختلفة غير واضح. ومع ذلك ، فقد لاحظنا أيضًا ظاهرة مماثلة مع مروج CD11b ، الذي أنتج تعبيرًا منظمًا من نواقل البلازميد ، والفئران المعدلة وراثيًا (40 ، 41) ، والفيروسات الرجعية المتكاملة (42) ، ولكن تم تجاهلها والتعبير عنها في معظم أنواع الخلايا من lentiprovirus (43 ، و C. Lutzko ، بيانات غير منشورة). من الممكن أن تؤثر العناصر المتبقية في العمود الفقري للفيروس البطيء على بنية الكروماتين المحلي لزيادة توظيف آلية النسخ (44). الاحتمال الآخر هو أن مواقع ربط عامل النسخ المتبقية في الحد الأدنى من LTR يمكن أن تتعاون مع مروج JSRV لتعزيز التعبير الجيني من فيروسات العدسة القهقرية المتكاملة في أنواع الخلايا التي يكون فيها فيروس نقص المناعة البشرية من النوع البري نشطًا بشكل طبيعي. لدعم هذه الفرضية ، لوحظ أعلى مستوى من التعبير في Jurkat ، وهو خط خلية T-lymphoid حيث ينشط محفز HIV-1 من النوع البري. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتوضيح آلية عدم التنظيم مع مروج JSRV في العمود الفقري lentiviral.

نظرًا لأن ملف تعريف التعبير الجيني لخطوط الخلايا لا يعكس تمامًا الخلايا الأولية الطبيعية ، فقد قمنا أيضًا بتقييم التعبير الجيني من نواقل العدسة CC10 و SPC في الأنسجة التنفسية وغير التنفسية بعد الولادة داخل الرغامى والوريد لمستلمي الفئران. على الرغم من وجود العديد من الأظرف التي توفر مستويات أعلى من نقل الجينات إلى ظهارة الأنف أو المجرى الهوائي مثل baculovirus GP64 (20 ، 45) أو المغلفات الفيلوفيروسية (16 ، 17 ، 46) ، اخترنا استخدام VSV-G- طاف طاف للفيروسات البطيئة النمط الكاذب من أجل ال في الجسم الحي دراسات لأنها ستمكن من تحليل التنبيغ والتعبير لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، بسبب انتظامها الخلوي الواسع. لذلك ستوفر هذه الدراسة بيانات عن تقييد النسب لتعبير الجينات المحورة من متجهاتنا. بعد إدارة الفيروس البطيء CCL-CC10-EGFP في الجسم الحي، تم ملاحظة التعبير الجيني بشكل حصري في الرئة ، وليس القلب أو الكبد أو الطحال أو العضلات. من المثير للدهشة أن توصيف سلالات الخلايا التي تعبر عن التحوير EGFP في الرئة أظهر أن كل من خلايا كلارا و AECII كانت إيجابية لـ EGFP. في حين أن محفز CC10 يُستخدم بشكل شائع لتوجيه تعبير الجينات المحورة إلى خلايا كلارا ، فقد لاحظت دراسات أخرى على الفئران المعدلة وراثيًا أيضًا التعبير الجيني داخل الحويصلات (29) ، على الرغم من أن هؤلاء المؤلفين لم يكونوا قادرين على تحديد السلالات التي تعبر عن الجينات المحورة بسبب الدقة المنخفضة لـ المنهجية المتاحة في ذلك الوقت. وبالتالي ، تشير بياناتنا إلى أن دمج مروج CC10 في ناقلات الفيروس البطيء ينتج عنه تعبير خاص بالجهاز التنفسي ، والذي قد يكون مفيدًا لدراسة علم الأحياء التنفسي ، أو التسليم المنظم للجينات العلاجية إلى الشعب الهوائية والرئتين.

أظهر تحليل ملف تعريف التعبير الجيني من ناقل CCL-SPC-EGFP أن التعبير كان مقصورًا على AECII ، حيث لم يتم اكتشاف EGFP في خطوط الخلايا غير التنفسية في المختبرولا الطحال أو القلب أو الكبد بعد الولادة في الوريد. بينما لوحظت الخلايا المكونة للدم إيجابية لبروتين EGFP في الحويصلات الهوائية للفئران المتلقية في نقاط زمنية مبكرة ، لم يكن من الممكن اكتشافها قبل 6 أسابيع ، وربما كانت نتيجة البلعمة لبروتين EGFP في التحضير الفيروسي.

بينما طرق الحقن الوريدي وداخل الرغامى في الجسم الحي التسليم المستخدم في هذه الدراسة لا يؤدي إلى نقل الجينات إلى جميع الأنسجة ، فهي توفر بيانات عن تحليل التعبير الأولي في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة الأولية ، دون الحاجة إلى الوقت والمصاريف لتوليد الفئران المعدلة وراثيًا. على الرغم من أن الفئران المستخدمة في دراسات توصيل المادة الطافية داخل الرغامى كانت تعاني من نقص المناعة ، فمن المحتمل أن تكون هذه النتائج مماثلة لسلالات الفئران ذات الكفاءة المناعية مثل C57B6J ، حيث توجد العديد من الدراسات التي توضح التعبير طويل المدى بعد ذلك. في الجسم الحي تسليم النواقل التي تحتوي على EGFP (47 ، 48) أو EYFP ذات الصلة الوثيقة (20).

يتم تعديل ناقلات الفيروسة البطيئة بسهولة للتعبير عن الجينات ذات الأهمية ويتم إنتاجها بسهولة باستخدام عيارات عالية مناسبة لها في الجسم الحي الادارة. بينما كان المستوى العام لنقل الجينات إلى الشعب الهوائية والرئتين منخفضًا في هذه الدراسة ، كان المستوى كافياً لتقييم الأنساب التي تعبر عن التحوير EGFP بعناية. وصفت العديد من الدراسات الحديثة التوصيل الفعال لنواقل الفيروسة البطيئة الأخرى إلى رئتي الحيوانات عن طريق تغيير الغلاف الفيروسي (16-18) ، أو زيادة لزوجة المادة الطافية عن طريق إعادة تعليق الفيروس في 1٪ ميثيل سلولوز (49) أو LPC (19) لتقليل معدل التخليص عن طريق الشعب الهوائية. إن اقتران النواقل المنظمة للنسب الموصوفة هنا ، مع طرق التسليم الفعالة لنوع الخلية محل الاهتمام ، سيسهل تطوير علاجات جينية آمنة وفعالة لأمراض الجهاز التنفسي ، عن طريق إنتاج التعبير الجيني المنظم للنسب. ستكون هذه النواقل أيضًا ذات أهمية لعلماء الأحياء في الجهاز التنفسي ، لأنها ستمكّن من التسليم المنظم للجينات إلى الظهارة السنخية والمجرى الهوائي ، والتي يمكن تعديلها بسهولة للتعبير عن جين مهم على وجه التحديد في مجرى الهواء في خلايا كلارا أو الحويصلات الهوائية في AECII . علاوة على ذلك ، يمكن أيضًا استخدام هذه النواقل كأداة لتمييز وتتبع نسل الخلايا الجذعية التي تمايزت إلى سلالات تنفسية معينة في المختبر أو في الجسم الحي. باختصار ، النواقل الفيروسية البطيئة ذات ملامح التعبير المنظمة والسنخية والمخصصة للمجرى الهوائي ستكون مفيدة لتطوير علاجات جينية آمنة ودراسة بيولوجيا الرئة.

المؤلفون بالشكر الدكاترة. دونالد ب. كون وجاي كروكس وبولا كانون لإجراء مناقشات عميقة ومراجعة المخطوطة. يشكرون الدكتور جيفري ويتسيت على مروجي SPC و CC10 وخط خلايا MLE-15 ، والدكتور هونغ فان لمروج JSRV ، والدكتور دونالد ب. كون لمروج MND ، والدكتور فرانكو دي مايو لـ Mtcc1-2 الخلايا.


السلامة الحيوية Lentivector - علم الأحياء

قد يسمح نقل الجينات الفعال إلى الخلايا الليمفاوية T و B الهادئة للعلاج الجيني أو لأغراض العلاج المناعي بعلاج العديد من الاختلالات الجينية في نظام المكونة للدم ، مثل نقص المناعة ، وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة للسرطانات والأمراض المكتسبة. يمكن أن تنقل نواقل الفيروسة البطيئة (LVs) أنواعًا عديدة من الخلايا غير المتكاثرة ، باستثناء بعض أنواع الخلايا الهادئة المعينة مثل الخلايا التائية والخلايا البائية المريحة. في الخلايا التائية ، لا يحدث إكمال النسخ العكسي (RT) ، والاستيراد النووي ، والتكامل اللاحق لجينوم النمط الكاذب لفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSVG-LV) بكفاءة ما لم يتم تنشيطها عبر مستقبلات الخلايا التائية (TCR) أو سيتوكينات البقاء على قيد الحياة التي تحفزهم على الدخول في G1 ب مرحلة دورة الخلية. يعتبر نقل الفيروسة البطيئة للخلايا البائية مسألة أخرى لأنه حتى تحفيز مستقبلات الخلايا البائية التي تحفز الانتشار لا يكفي للسماح بنقل VSVG-LV الفعال. في الآونة الأخيرة ، تمكن LV الجديد الذي يحمل البروتينات السكرية لفيروس الحصبة (MV) على سطحه من التغلب على قيود النواقل في كل من الخلايا T و B الهادئة. الأهم من ذلك ، تم نقل الخلايا الساذجة وكذلك الذاكرة T و B بكفاءة بينما لم يتم اكتشاف أي تنشيط واضح أو دخول دورة الخلية أو تبديل النمط الظاهري ، مما يفتح الباب أمام العديد من تطبيقات العلاج الجيني والعلاج المناعي كما ورد هنا.


تعداء فيروسي

بالنسبة لأنواع الخلايا غير القابلة للترنس بوساطة الدهون ، غالبًا ما يتم استخدام النواقل الفيروسية. يوفر ترنسفكأيشن بوساطة الفيروس ، والمعروف أيضًا باسم التنبيغ ، وسيلة للوصول إلى أنواع الخلايا التي يصعب نقل العدوى من أجل زيادة إفراز البروتين أو ضربة قاضية ، وهي الطريقة الأكثر شيوعًا في البحث السريري (Glover et al. ، 2005 Pfeifer و Verma ، 2001). تم استخدام ناقلات الفيروس الغدي ، والفيروسات القهقرية ، والفيروسات البطيئة على نطاق واسع لتوصيل الجينات في زراعة خلايا الثدييات وفي الجسم الحي. تشمل الأمثلة الأخرى المعروفة لنقل الجينات الفيروسية الفيروس البكتيري والنواقل القائمة على الفيروس اللقاحي. لمزيد من المعلومات حول أنظمة التوصيل الفيروسية المختلفة ، انظر Viral Vectors.

في حين أن الفيروسات هي النظام المفضل لإيصال الجينات في التجارب السريرية نظرًا لارتفاع كفاءة نقل الكائنات الحية والتعبير الجيني المستمر بسبب اندماجها في جينوم المضيف ، إلا أن لديها عددًا من العيوب بما في ذلك قدرتها المناعية والسمية الخلوية ، وتحدي تقنيًا وإجراءات الإنتاج الشاقة بالنسبة للناقلات ، التكاليف المرتفعة بسبب متطلبات السلامة الحيوية ، سعة التعبئة المنخفضة (

10 كيلو بايت لمعظم النواقل الفيروسية مقارنة بـ

100 كيلو بايت للنواقل غير الفيروسية) ، والتنوع في العدوى لمستحضرات ناقلات الفيروس (Glover et al. ، 2005 Kim and Eberwine ، 2010 Vorburger and Hunt ، 2002).

يتضمن بروتوكول النقل النموذجي هندسة الفيروس المؤتلف الذي يحمل الجين المحول ، وتضخيم الجزيئات الفيروسية المؤتلفة في خط خلية التعبئة ، وتنقية ومعايرة الجزيئات الفيروسية المتضخمة ، والإصابة اللاحقة بالخلايا موضع الاهتمام. في حين أن كفاءات التنبيغ المحققة في الخلايا الأولية وخطوط الخلايا عالية جدًا (

90-100٪) ، فقط الخلايا التي تحمل المستقبلات الخاصة بالفيروس يمكن أن تصاب بالفيروس. من المهم أيضًا ملاحظة أن خط خلية التغليف المستخدم للتضخيم الفيروسي يحتاج إلى أن يتم نقله باستخدام طريقة تعداء غير فيروسية.


ناقلات الفيروسة البطيئة: أساسية إلى متعدية

لقد مر أكثر من عقدين منذ أن تم استخدام فيروس نقص المناعة البشرية المعدل وراثيًا لتوصيل الجينات. من خلال التحسينات المستمرة ، تطورت هذه الفيروسات المبكرة الحاملة للجينات إلى نواقل للفيروس البطيء أكثر أمانًا وفعالية. تقدم نواقل الفيروسة البطيئة العديد من الخصائص الجذابة كوسائل توصيل الجينات ، بما في ذلك: (1) توصيل الجينات المستدام من خلال تكامل الناقل الثابت في جينوم المضيف (2) القدرة على إصابة كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة (3) المناطق المدارية الواسعة للأنسجة ، بما في ذلك المهم أنواع الخلايا المستهدفة للعلاج الجيني والخلوي (4) عدم وجود تعبير عن البروتينات الفيروسية بعد نقل الناقلات (5) القدرة على توصيل عناصر وراثية معقدة ، مثل التسلسل متعدد الجينات أو المتواليات المحتوية على intron (6) ملف تعريف موقع تكامل أكثر أمانًا و ( vii) نظام سهل نسبيًا لمعالجة وإنتاج ناقلات الأمراض. وفقًا لذلك ، تستخدم تقنيات lentivector الآن على نطاق واسع في البيولوجيا الأساسية والدراسات متعدية من أجل الإفراط في التعبير الجيني المستقر ، وإسكات الجينات المستمر ، والتحصين ، في الجسم الحي التصوير ، وتوليد الحيوانات المحورة جينيا ، وتحريض الخلايا متعددة القدرات ، وتعديل الخلايا الجذعية وتتبع النسب ، أو تحرير الجينات الموجه بالموقع. علاوة على ذلك ، في عصر "-omics" الحالي عالي الإنتاجية ، فإن التوافر التجاري لناقلات الفيروسة البطيئة المعدة مسبقًا ، والتي تم تصميمها للتعبير عن أو إسكات الجينات على مستوى الجينوم ، يسرع من التوسع السريع لهذه التكنولوجيا الموجهة. في المراجعة الحالية ، نقوم بتقييم التطورات في تكنولوجيا ناقلات الفيروس البطيئة ، بما في ذلك علم الفيروسات البطني الأساسي ، وتصميمات النواقل لتحسين الكفاءة والسلامة البيولوجية ، وبروتوكولات إنتاج الناقل والعدوى ، وتسليم الجينات المستهدفة ، والتطبيقات المتقدمة للفيروسات البطيئة والقضايا المرتبطة بنظام النواقل.


السلامة الحيوية Lentivector - علم الأحياء

مراجعة ودليل النواقل الفيروسية والفيروسات القهقرية لتوصيل الحمض النووي

في السنوات الأخيرة ، أصبحت ناقلات الفيروسات القهقرية والفيروسات البطيئة أدوات حيوية بشكل متزايد لتوصيل الأحماض النووية إلى العديد من أنواع الخلايا في مجموعة متنوعة من الأنظمة التجريبية. بالإضافة إلى كونها مهمة في البيئات المختبرية لاستخدامها في كل من زراعة الأنسجة والنماذج الحيوانية ، فقد تم تطبيقها أيضًا في التجارب السريرية لعلاج الأمراض الوراثية. Zynteglo من Bluebird Bio هو علاج جيني للعلاج من الثلاسيميا بيتا المعتمد على نقل الدم ، حيث يتم نقل الخلايا الجذعية المكونة للدم الذاتية خارج الجسم الحي مع جين بيتا-غلوبين عن طريق ناقل بطني بطني نمط كاذب مع بروتين سكري لفيروس التهاب الفم الحويصلي.يتيح استخدام أنظمة الفيروسة البطيئة أو الفيروسات القهقرية تحقيق تكامل مستقر وراثي لتسلسل حمض نووي معين في جينوم الخلية المستهدفة. يسمح استخدام هذه الميزة للنواقل الفيروسية والفيروسات القهقرية بالتعبير الدائم نظريًا عن بنية الجين ، مثل siRNA أو تسلسل تشفير البروتين ، في مجموعة من الخلايا ، أو على مستوى خلية واحدة [6].

يتميز أعضاء عائلة Retroviridae ، والتي تشمل فيروسات القهقرية والفيروسات البطيئة ، بقدرتها على إعادة نسخ جينوم الحمض النووي الريبي الخاص بهم إلى نسخة cDNA ، والتي يتم دمجها بعد ذلك بشكل ثابت في جينوم الخلية المضيفة. غالبًا ما توصف الفيروسات القهقرية بأنها إما بسيطة (تسمى أحيانًا فيروسات الأورام أو الفيروسات القهقرية ، مثل فيروس سرطان الدم المورين & # 91MLV & # 93) أو معقدة (على سبيل المثال ، الفيروسات البطيئة). يتمثل الاختلاف الرئيسي بين هذه الأنواع الفرعية في وجود عدد من الجينات الإضافية والتنظيمية في الفيروسات القهقرية المعقدة ، ولكن ليست بسيطة (تمت مناقشتها بمزيد من التفصيل أدناه) [4 ، 7]. تحتوي الجسيمات الفيروسية لكلا المجموعتين (الشكل 1) على نسختين من الحمض النووي الريبي الموجب الذي تقطعت به السبل مع نسخة عكسية فيروسية مرتبطة (RT) تقع داخل نواة داخلية. يوجد أيضًا داخل هذه الحجرة بروتينات هيكلية وإنزيمية ، بما في ذلك nucleocapsid (NC) ، و capsid (CA) ، و Integrase (IN) ، و protease (PR). يُحاط اللب الداخلي بطبقة بروتين خارجية تتكون من بروتين المصفوفة (MA) ، والذي يتم تضمينه بدوره بواسطة غلاف مغلف بالبروتين السكري (ENV) مغطى بغشاء الخلية المضيفة المشتق من غشاء [4 ، 7]. Intasome ، وهو عبارة عن رباعي تكامل (IN) يتم تجميعه على نهايات الحمض النووي الفيروسي ، يلتقط نيوكليوسومات المضيف ويسمح بإعادة تركيب الحمض النووي الفيروسي في نقاط ساخنة معينة [8].

تحتوي كل من الفيروسات القهقرية البسيطة والمعقدة على نسختين من الحمض النووي الريبي الخطي غير المقسم أحادي السلسلة يبلغ طولهما 7-12 كيلو بايت لترميز الجينات الكمامة والبولية والجينية. يقوم Gag بتشفير بروتين متعدد يتم ترجمته من mRNA غير مقسم والذي يتم بعد ذلك شق بواسطة البروتياز الفيروسي (PR) في بروتينات MA و CA و NC. يقوم جين Env أيضًا بتشفير سلائف متعددة البروتينات التي يتم شقها بواسطة البروتياز الخلوي في السطح (SU) للبروتين السكري gp120 والغشاء (TM) glycoprotein gp41. بينما يتفاعل gp120 مع المستقبلات الخلوية والمستقبلات القلبية ، فإن gp41 يثبت المركب gp120 / gp41 في الغشاء الفيروسي ويحفز اندماج الغشاء مع الخلية المضيفة أثناء الدخول. يتم التعبير عن Pol على أنه Gag-Pol polyprotein نتيجة لتغيير الإطارات الريبوزومية أثناء ترجمة Gag mRNA ، ويشفر البروتينات الأنزيمية RT و PR و IN. ترتبط هذه البروتينات الثلاثة بالجينوم الفيروسي داخل الفيريون. يمتلك بروتين RT ثلاثة أنشطة متميزة: (أ) نشاط بوليميريز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي ، وهو المسؤول عن نسخ جينومات الحمض النووي الريبي (RNA) إلى نشاط واحد (cDNA (ب) RNase H و (ج) نشاط بوليميريز DNA المعتمد على الحمض النووي. PR يشق الكمامة والبروتينات المتعددة Gag-Pol ، مما يؤدي إلى نضوج فيريون وإنتاج فيريونات معدية بالكامل. IN هو المسؤول عن تكامل cDNA الفيروسي في جينوم الخلية المضيفة. بمجرد اندماج الجينوم الفيروسي يكون ملاصقا لكروموسوم الخلية المضيفة ويشار إليه على أنه طليعة الفيروس [1 ، 4 ، 7 ، 9].

السمة الرئيسية لجينومات الفيروسات القهقرية المعقدة التي تميزها عن تلك الموجودة في الفيروسات القهقرية البسيطة هي وجود مجموعة من الجينات الملحقة التي تشارك منتجاتها في تنظيم النسخ ، ونقل الحمض النووي الريبي ، والتعبير الجيني ، والتجميع. وتشمل هذه البروتينات Rev و Tat بالإضافة إلى البروتينات الإضافية Vpu و Vif و Vpr و Nef. Rev هو بروتين مرتبط بـ RNA يعزز التعبير الجيني في المرحلة المتأخرة. من المهم أيضًا نقل mRNAs غير المتشابكة أو المفردة التفرع ، والتي تشفر البروتينات الهيكلية الفيروسية ، من النواة إلى السيتوبلازم. Tat هو بروتين مرتبط بالـ RNA يعزز النسخ. يمنع بروتين Nef تنشيط الخلايا التائية. يعزز Vpu إطلاق الفيروس من سطح الخلية إلى السيتوبلازم أثناء الدخول [7]. يعد بروتين Vif ضروريًا لتكرار الفيروسات البطيئة نظرًا لقدرته على تقليل تنظيم استجابة المضيف المضادة للفيروسات [7 ، 10].

يحتوي جينوم الفيروس المتكامل (الشكل 2) على 5 'و 3' تكرارات طرفية طويلة (LTR) والتي تتكون كل منها من ثلاث مناطق: (أ) منطقة U3 ، التي تعمل كمروج وتحتوي على عناصر محسن النسخ وصندوق TATA (ب) ) منطقة R ، حيث يبدأ النسخ و (ج) منطقة U5 ، التي تشارك في النسخ العكسي وتحمل موقع ارتباط تمهيدي لـ tRNA. عناصر التسلسل الهامة الأخرى للطلاء الفيروسي هي إشارة الحزم (ψ ، psi) والمسالك البولي بورين (ppt) ، والتي تعمل كموقع لبدء تخليق الحمض النووي الخيطي الموجب أثناء النسخ العكسي [4 ، 7 ، 9].

على الرغم من الاختلافات في الجينوم ، فإن دورات النسخ المتماثل للفيروسات القهقرية البسيطة والمعقدة متشابهة جدًا (الشكل 3). تبدأ العدوى عندما يربط البروتين السكري المغلف gp120 المستقبل الخلوي ، مما يؤدي إلى تغيير في التوافق في ENV يكشف الوحدة الفرعية TM ، مما يؤدي إلى اندماج غلاف الفيريون والغشاء الخلوي والإفراج اللاحق عن النواة في السيتوبلازم [4]. يتم تحديد الانتفاخ الفيروسي عن طريق التعرف على مستقبلات خلوية معينة عن طريق الغلاف الفيروسي للبروتين السكري gp120 [9]. على سبيل المثال ، يتعرف فيروس نقص المناعة البشرية وفيروس نقص المناعة البشرية على CD4 على الخلايا اللمفاوية التائية المساعدة والضامة متبوعًا بالتفاعل مع المستقبل ، غالبًا CXCR4 أو CCR5 [1 ، 9]. أثناء وجوده في النواة الفيروسية ، يتم نسخ جينومات الحمض النووي الريبي (RNA) عكسيًا بواسطة RT إلى DNA مزدوج الشريطة [1 ، 2 ، 11].

وتجدر الإشارة إلى أن هذه هي النقطة التي تختلف فيها دورة التكاثر الفيروسي للفيروسات البطيئة عن دورة الفيروسات القهقرية البسيطة. إن dsDNA الفيروسي للفيروسات القهقرية البسيطة غير قادر على المرور عبر معقد المسام النووي ويتطلب انهيار الغشاء النووي أثناء الانقسام حتى يحدث تكامل الحمض النووي الريبي [4 ، 7]. أثناء الإصابة بالفيروس البطيء ، من ناحية أخرى ، يتم نقل مركب ما قبل الاندماج إلى النواة ، وبالتالي فإن الفيروسات البطيئة قادرة على الاندماج في كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة [4 ، 12]. هذه ميزة مهمة يجب مراعاتها عند اختيار المتجه المناسب لتطبيق معين ، حيث أن ناقلات الفيروسات القهقرية لن تدمج بكفاءة الجين المحول في الخلايا غير المنقسمة.

يتم تحقيق التكامل من خلال النشاط الأنزيمي للـ IN. تبدأ العملية بإزالة عدة نيوكليوتيدات من الطرف الثالث لكلا خيوط (كدنا). يشق الـ IN أيضًا الحمض النووي الخلوي ، ويتم ربط الـ cDNA الفيروسي بهذه الأجزاء المتدلية. تملأ الثغرات المفردة التي تقطعت بها السبل بواسطة آلية إصلاح الحمض النووي الخلوي [1]. يشار إلى الحمض النووي الفيروسي المتكامل باسم "طليلي الفيروس" ويتم نسخه ووراثته مع الكروموسوم المضيف. لفترة طويلة كان يعتقد أن التكامل لا يحدث بطريقة محددة التسلسل [9]. ومع ذلك ، تم العثور على إشارة مبكرة إلى أن التكامل قد يحدث بشكل غير عشوائي أثناء تجربة العلاج الجيني لـ X-SCID حيث تم دمج ناقل علاجي قائم على MLV بشكل انتقائي بالقرب من أحد الجينات الورمية الأولية في موضوعات متعددة. يبدو أن هذا كان عاملاً مساهماً في تطور سرطان الدم لدى بعض المرضى المتلقين ، وأثار مخاوف بشأن الآثار الجانبية المطفرة لإدخال الفيروسات القهقرية. منذ تسلسل الجينوم بأكمله ، تشير الدراسات الحديثة إلى أن هناك ، في الواقع ، أنماط تكامل خاصة بالفيروس قد تعتمد على بنية الكروماتين بدلاً من تسلسل الحمض النووي. على سبيل المثال ، تم إثبات مؤخرًا أن تكامل HIV-1 cDNA يتم إعاقته عندما يتم ضغط الكروماتين المستهدف [13]. من ناحية أخرى ، لوحظ بالفعل أن فيروس ساركوما الطيور (ASV) يتكامل بشكل أكثر كفاءة بعد تكثيف الكروماتين المستهدف. أيضًا ، بالنسبة لفيروس نقص المناعة البشرية -1 و -2 ، والنواقل المستندة إلى فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، والنواقل المستندة إلى فيروس نقص المناعة القرد (SIV) ، وفيروس نقص المناعة لدى القطط (FIV) ، تحدث حوالي 70٪ من أحداث التكامل داخل الجينات [13]. يبدو أن نواقل الفيروسة البطيئة تظهر تفضيلًا للتكامل في مواقع بعيدة عن مواقع بدء النسخ [11 ، 14]. في المقابل ، تحدث حوالي 20 ٪ من أحداث التكامل أثناء عدوى MLV (a γ-retrovirus) بالقرب من 5 'نهاية وحدات النسخ ، مع بعض التفضيل لجزر CpG والقرب من مواقع DNase I شديدة الحساسية. ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن HIV-1 و SIV و MLV و ASLV لديهم تفضيلات أساسية متماثلة تحيط بمواقع التكامل [13 ، 15]. ومما يزيد من تعقيد فهمنا لانتقائية موقع التكامل الأولي هو المساهمة المعقدة لعوامل الخلية المضيفة ، والتي تختلف اعتمادًا على الفيروس القهقرى المعني ونوع الخلية المصابة [13]. يمكن أن يكون للتحيزات في تكامل الموقع آثار مثيرة للاهتمام على مستوى السمية الجينية لمختلف ناقلات الفيروسة البطيئة أو الفيروسية القهقرية. والجدير بالذكر أن نواقل الفيروسة البطيئة تبدو ذات قدرة منخفضة على تكوين الأورام عند مقارنتها بنواقل الفيروسات القهقرية [11 ، 14].

يتم نسخ (كدنا) الفيروسي المتكامل بواسطة آلية النسخ الخلوي [4] باستخدام محفز / مُحسِّن فيروسي في 5 'LTR [16]. يتم نقل النصوص من النواة وترجمتها على غرار mRNAs الخلوية [16]. تقوم النسخ المبكرة بترميز Rev و Nef و Tat ، مع احتواء كل من Tat و Nef على إنترونات تمت إزالتها في mRNAs الناضجة [9]. يرتبط Tat بموقع عنصر استجابة المعاملات (TAR) الموجود في 5 'LTR لتحفيز نسخ النصوص الأطول [14]. Rev يرتبط بإنترونات mRNAs الفيروسية المنسوخة حديثًا. ينتج عن تراكم Tat و Rev تحول إلى النسخ المتأخر ، حيث يتم ترجمة mRNAs التي تتضمن أحد الإنترونات أو كليهما. تقوم هذه النسخ الأطول بترميز البروتينات الهيكلية [9].

في السيتوبلازم ، يرتبط اثنان من الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي بإنزيمات النسخ وتتجمع البروتينات الأساسية حولها ، وتشكل قفيصة الفيروس. عندما تهاجر نحو سطح الخلية ، تنقسم البروتينات Gag و Gag-Pol بواسطة البروتياز الفيروسي ، مما ينتج عنه جسيم مُعدٍ ناضج [9 ، 14]. ثم يتبرعم الجسيم الناضج من الغشاء الخلوي ، وبالتالي يكتسب غلافه [7].

في الآونة الأخيرة ، أنتجت العديد من المعامل فيروسات بطيئة لا تتكامل بواسطة آلية الفيروسات القهقرية التقليدية ، أو بدلاً من ذلك لا تتكامل على الإطلاق. هذا الأخير ، الذي يسمى ناقلات الفيروسة البطيئة المعيبة التكامل ، تحتوي على IN متحور الذي يفتقر إلى النشاط الأنزيمي. تنتج هذه النواقل الفيروسية البطيئة دوائر DNA شائكة مزدوجة الشريطة في نواة الخلية المضيفة. تم تطوير نواقل الفيروسة البطيئة المعيبة في التكامل جزئيًا بسبب المخاوف المحيطة بالتكامل العشوائي وتكوين الورم الإدراجي (الموصوف أعلاه) [15]. توجد أيضًا هجائن هجينة ناقلة للفيروسات lentiviral والتي تنتج جينات محورة متكاملة بشكل ثابت عن طريق التحويل. أخيرًا ، هناك نواقل الفيروسة البطيئة التي تدخل الجينات عن طريق إعادة التركيب المتماثل. يتميز هذا بتقليل فرصة حدوث الطفرات الإدراجية والسماح بالحفاظ على نمط التعبير الطبيعي لتسلسل "الاستبدال" [15].

تمثلت خطوة رئيسية أخرى إلى الأمام في تكنولوجيا ناقلات الفيروس البطيئة والفيروسات القهقرية في استخدامها في الحيوانات والبشر. يمكن تعديل الخلايا الأولية وراثيًا باستخدام نواقل الفيروسة البطيئة أو الفيروسات القهقرية (على سبيل المثال ، إدخال الخلايا السرطانية أو الخلايا الكبدية المنقولة بـ GFP) ثم إدخالها في الفئران. يمكن بعد ذلك تتبع الخلايا باستخدام تقنيات التصوير المختلفة [14]. يمكن أن تحل نواقل الفيروسة البطيئة أيضًا محل حقن DNA البلازميد في البويضات المخصبة كوسيلة لإنتاج حيوانات معدلة وراثيًا نظرًا لكفاءة نقل الجينات ، وقوة التعبير الجيني ، وزيادة معدل البقاء على قيد الحياة في العديد من الأنواع الحيوانية المختلفة [14 ، 17 ، 18]. كما أظهرت نواقل الفيروسة البطيئة نتائج واعدة في التطبيقات الطبية. ومع ذلك ، فإن المخاوف المتعلقة بالسلامة والسمية الجينية تشكل عقبة رئيسية أمام الاستخدام العلاجي الواسع النطاق للنواقل الفيروسية. هناك أيضًا تحديات في التصنيع ، مثل ضمان النقاء والعائد العالي المطلوبين لنواقل الفيروس البطيء من الدرجة السريرية [19]. كان هناك العديد من الوفيات نتيجة بروتوكولات العلاج الجيني التي تستخدم ناقلات الفيروس الغدي ، ناقلات الفيروس القهقرية ، أو ناقلات الفيروس المرتبطة بالغدة. كما ذكرنا سابقًا ، على الرغم من التجربة الناجحة باستخدام ناقلات الفيروسات القهقرية لتصحيح X-SCID ، مات العديد من المرضى في النهاية من اللوكيميا التي نتجت عن الطفرات الوراثية للجين المتحور [19]. يستمر التقدم في جعل هذه النواقل أكثر أمانًا وفائدة للتجارب السريرية. على سبيل المثال ، تم تحقيق تصحيح ناجح لمرض الخلايا المنجلية في نموذج حيواني مؤخرًا عن طريق تحويل الخلايا الجذعية المكونة للدم مع ناقل الفيروسة البطيئة [20]. ومن المثير للاهتمام أن الأبحاث الواعدة أظهرت مؤخرًا أيضًا أن النواقل المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية للعلاج الجيني قد تكون مفيدة في مكافحة عدوى فيروس العوز المناعي البشري نفسها [21 ، 22].

فتح تطوير طرق جديدة لتوصيل الحمض النووي طرقًا جديدة للتطبيقات العلاجية ، مثل استبدال الجينات. على وجه الخصوص ، تم اختبار طريقة جديدة باستخدام ناقل الفيروسة البطيئة G1XCGD للتعبير عن gp91phoxtransgene في الخلايا النخاعية بنجاح في نموذج الفئران [23]. تم زرع خلايا CD34 + المنقولة بالناقل البطيء في الفئران واستحثت مستويات ملحوظة علاجياً من نشاط NADPH في الخلايا النخاعية.

أيضًا ، قد يستفيد مرضى التليف الكيسي (CF) بشكل كافٍ من النهج العلاجي القائم على ناقلات الفيروسة البطيئة ، والتي تندمج في الجينوم وتنتج تعبيرًا جينيًا ثابتًا. حققت دراسة أجريت على خنازير التليف الكيسي ، وهو نموذج تجريبي من التليف الكيسي الحيواني ، تحسنًا في وظائف بروتين منظم توصيل الغشاء عبر التليف الكيسي (CFTR) باستخدام ناقل لفيروس نقص المناعة السنوري القائم على فيروس نقص المناعة [24]. وبالتالي ، تم تحقيق استعادة اضطراب قناة الأنيون بواسطة CFTR الذي يتم توصيله بالفيروس البطيء. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت نواقل الفيروسة البطيئة المستندة إلى مواقع دخول الريبوسوم ، والتي عبرت عن العوامل الوعائية والواقية للقلب ومحفز الانقباض SERCA2a ، تحسنًا كبيرًا في وظائف القلب عند إعطائها في الفئران المصابة باحتشاء عضلة القلب المستحث تجريبيًا [25].

أظهرت العديد من التجارب السريرية بالفعل فعالية أولية للنهج العلاجية القائمة على الفيروسة البطيئة. على وجه الخصوص ، تم الإبلاغ مؤخرًا عن تحسن كبير في أعراض مرض باركنسون من خلال تجربة ProSavin ، وهو ناقل لينتيفيرال ينقل الدوبامين [26].لقد ثبت أن ProSavin جيد التحمل في المرضى الذين يعانون من مرض باركنسون.

يجب توخي الحذر عند التعامل مع ناقلات الفيروسات البطيئة والفيروسات القهقرية لأنها تنشأ بشكل عام من مسببات الأمراض البشرية. تتمثل الاهتمامات الرئيسية عند العمل مع هذه النواقل في (أ) توليد فيروسات lentivirus قادرة على النسخ المتماثل والتلوث (ب) إمكانية تكون الورم و (ج) السمية المحتملة للجين المحور. يمتلك الجيل الثاني والثالث من أنظمة الفيروس البطيء ، اللذان يشكلان معظم أنظمة الفيروسة البطيئة المتاحة تجاريًا ، العديد من ميزات الأمان التي تخفف من هذه المخاطر [27]. في هذه الأنظمة ، يتم التعبير عن العبوة والبروتينات الأنزيمية من نواقل منفصلة ، مما يقلل من التماثل بين بنيات العبوة وبالتالي يقلل من فرصة إعادة التركيب المتماثل. علاوة على ذلك ، فإن العديد من نواقل نقل الفيروسة البطيئة تعطل نفسها بسبب الحذف في 3’LTR [28].

  • ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (على سبيل المثال ، معطف المختبر والقفازات ، تقترح بعض الشركات ارتداء القفازات المزدوجة)
  • العمل في غطاء التدفق الصفحي من الدرجة الثانية
  • تطهير جميع أسطح العمل (خاصة بعد الانسكاب أو الرذاذ أو إنتاج الهباء الجوي)
  • تطبيق احتواء BL2 أو BL2 المحسن

يتم توفير مزيد من المعلومات حول التعامل مع الفيروسات البطيئة والفيروسات القهقرية ، ووصف معايير مستوى السلامة الحيوية في المختبر ، من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومراكز مكافحة الأمراض بمكتب الصحة والسلامة: [29 ، 30].

تستغل أنظمة توصيل الجينات الفيروسية والفيروسات القهقرية جوانب تكاثر الفيروسات القهقرية لتوفير تكامل مستقر لتسلسل الحمض النووي المطلوب. في حين أن ترنسفكأيشن من الأحماض النووية ينتج فقط عن التعبير الجيني العابر ، فإن نشاط التكامل الفيروسي في الأنظمة القائمة على الفيروسات القهقرية والفيروسات البطيئة يسمح بالتكامل المستقر للجين المحور الذي يتم توريثه بعد ذلك ويتم التعبير عنه بشكل مستمر عبر الانقسامات الخلوية المتكررة. السمة الرئيسية لكل من ناقلات الفيروسة البطيئة والفيروسات القهقرية هي أنها تنتج جسيمات معيبة في النسخ المتماثل أو ذاتية التعطيل. هذا يسمح بتسليم التسلسل المطلوب ، دون استمرار تكاثر الفيروس في الخلايا المستهدفة. الأهم من ذلك ، نظرًا لأن بعضًا منها تم تطويره من فيروس بشري ، فإنه يزيل المخاطر المرتبطة باستخدام الممرض الحي. يتم إنتاج الفيروس المعيب للنسخ المتماثل من خلال التكامل العابر (الشكل 4) حيث يتم نقل خلايا التغليف مع ثلاثة بلازميدات منفصلة (الشكل 5) (انظر أدناه) التي تعبر معًا عن جميع البروتينات الفيروسية اللازمة لتوليد الجزيئات المعدية ، مثل وكذلك تسلسل الحمض النووي الذي سيتم تعبئته داخلها للتسليم. في حين أن العديد من أنظمة ناقلات الفيروسة البطيئة تعتمد على نقل اثنين من البلازميدات المساعدة (الجيل الثاني) مع بلازميد النقل ، فإن بعض الأنظمة الأحدث (الجيل الثالث) لديها تركيبات التغليف والغلاف على ثلاثة بلازميدات يتم دمجها مع بلازميد النقل. النقل النموذجي واثنين من البلازميدات المساعدة المستخدمة في إنتاج الفيروسات القهقرية أو الفيروسية البطيئة المعيبة في النسخ المتماثل هي:

يستخدم هذا المتجه لنقل الجينات ذات الأهمية إلى الخلايا المستهدفة. هناك حذف لمنطقة U3 وغيرها من التسلسلات النشطة نسبيًا من 3 'LTR ، مما يؤدي إلى كونها LTR ذاتية التعطيل (والتي يُعتقد أنها أكثر أمانًا من وجود LTR سليم / نشط والذي يمكن أن ينشط الجينات المجاورة للإدخال ). يدفع 5 'LTR التعبير عن الحمض النووي الريبي الجينومي المعبأ ، ويتم تحريك الجين المحور من مروج داخل المتجه [14].

Gag and Pol: هذه البروتينات الفيروسية ضرورية لنضج الفيريون. تنظم Tat و Rev نشاط النسخ والتصدير النووي للحمض النووي الريبي الجيني. تم حذف الجينات الملحقة لزيادة الأمان عن طريق تقليل احتمالية إعادة التركيب (انظر قسم الأمان أدناه) [14]. تمت إزالة Tat في الأجيال الجديدة من أنظمة الفيروسة البطيئة وتم وضع Rev على ناقل منفصل لزيادة السلامة.

يمكن نمذجة النواقل الفيروسية باستخدام بروتينات الغلاف من مسببات الأمراض الأخرى لتغيير استوائها. الأكثر شيوعًا هو المغلف المغلفي للبروتين السكري Glycoprotein لفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G) [31] ، على سبيل المثال ، AddGene pCMV-VSV-G plasmid (8454) [32] ، جنبًا إلى جنب مع AddGene psPAX2 plasmid (12260) ) [33-36]. عند الحديث عن فيروس التهاب الفم الحويصلي ، هناك مناسبات يُفضل فيها نظام النمط الكاذب لفيروس التهاب الفم الحويصلي على الفيروس البطيء ، على سبيل المثال ، لفحص دخول الفيروس التاجي إلى الخلايا المضيفة [37]. يتم اشتقاق بروتينات الغلاف الشائعة الأخرى من فيروس داء الكلب ، و MLV ، و إيبولا ، و baculovirus ، وفيروس الحصبة ، و filovirus. في حين أن النمط الكاذب لفيروس baculovirus GP64 والتهاب الكبد E1 و E2 يعزز النقل الكبدي ، فإن النمط الكاذب لمغلف الفيروسات الخيطية يعزز نقل الخلايا الظهارية أو البطانية لمجرى الهواء. ومن المثير للاهتمام أن التنميط الكاذب قد يؤثر أيضًا على تهريب الفيروس البطيء بالبروتينات السكرية لفيروس داء الكلب مما يتسبب في انتقال محوري رجعي [15].

ملحوظة: نظرًا لاختلافات الشكل الإسوي بين جينات γ-retroviral و lentiviral gag و pol و env ، فإن بلازميدات التعبئة والتغليف غير قابلة للتبديل مع بلازميدات النقل [38].

من الناحية الإجرائية ، يتمثل الاختلاف الرئيسي بين نواقل الفيروسة البطيئة والفيروسات القهقرية في أنه مع نواقل الفيروسة البطيئة ، عادةً ما يتم نقل نواقل التغليف والمغلف والنقل إلى خط خلية التغليف ، بينما مع ناقلات الفيروسات القهقرية فقط يتم نقل ناقل النقل إلى خط خلوي مستقر بالفعل يحمل المتجهين الآخرين. بالنسبة للفيروسات القهقرية ، يتم نقل ناقل النقل إلى خلايا Phoenix ، وهو خط خلوي يعتمد على Human Embryonic Kidney 293T الذي يحمل التركيبتين المساعدتين (env و gag-pol) على شكل حلقات. تحتاج هذه الخلايا فقط إلى نقل العدوى مع ناقل النقل من أجل إنتاج الفيروسات القهقرية (الشكل 4 ، على اليمين). يجب اختيار خلايا العنقاء بشكل مضاعف كل ثلاثة أشهر باستخدام Hygromycin B و Diphtheria Toxin لمدة أسبوع واحد لضمان وجود كل من التركيبات المساعدة في جميع الخلايا. تتوفر Phoenix-Eco و Phoenix-Ampho من خلال ATCC [39 ، 40] ، و Invitrogen. غلاف لينتيفيرال شائع الاستخدام الذي يعبر عن البلازميدات يتضمن Addgene pMD2.G (12259) ، على سبيل المثال [36 ، 41].

عادةً ما تعمل خلايا Human Embryonic Kidney 293T أو 293FT كخط تعبئة للفيروسات البطيئة. كما تم استخدام Phoenix-ECO [42]. تم تصميم خلايا 293FT لإنتاج عيارات عالية من الفيروس البطيء. لقد ثبت أن إنشاء خطوط خلايا التعبئة لناقلات الفيروسة البطيئة أكثر صعوبة نظرًا لصعوبة التغلب على سمية البروتياز (المشفر بواسطة جين pol) و VSV-G [15]. تم تطوير العديد من أنظمة إنتاج الفيروسات القهقرية البطيئة وهي متوفرة تجارياً (المدرجة أدناه في قسم الكواشف).

عند اختيار بلازميد النقل ، من المهم ملاحظة المحفز الذي يحرك الجين محل الاهتمام. تعمل محفزات RNA Pol II (مثل CMV) على دفع تعبير RNA لترميز البروتين. محفزات RNA Pol III (مثل H1 أو U6) ، محرك التعبير عن النصوص الأقصر ، مثل shRNAs.

  • تتمثل الخطوة الأولى في إنتاج ناقلات الفيروسة البطيئة في تعداء خلايا التغليف مع النقل ، والمغلف ، و gag-pol plasmids (أو تعداء منفرد لبلازميد النقل في حالة إنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية).
    ملاحظة: لا ينبغي السماح لخلايا التغليف بالوصول إلى نقطة التقاء لأن هذا يقلل من كفاءة تعداءها. على سبيل المثال ، حدث ترنسفكأيشن عند التقاء 70٪ [43].
    يمكن أن تؤثر جودة DNA البلازميد أيضًا على كفاءة تعداء. يمكن أن يساعد استخدام المجموعات التجارية ، مثل مجموعة البلازميد الخالية من السموم الداخلية QIAGEN ، إذا كانت جودة البلازميد مشكلة.
  • الخلايا المشتقة من HEK 293T قابلة للعدوى بشكل كبير إما عن طريق ترنسفكأيشن بوساطة فوسفات الكالسيوم أو المستندة إلى الدهون (انظر قسم الكواشف أدناه). اعتمادًا على بروتوكول تعداء الخلايا المستخدم ، قد تحتاج الخلايا إلى الغسيل ، متبوعًا بإضافة وسائط جديدة في غضون 12 إلى 18 ساعة. في حوالي 24 ساعة بعد تعداء العدوى ، يجب إزالة الوسائط واستبدالها بالوسائط ليتم تطبيقها على الخلايا المستهدفة. يُسمح الآن لخلايا التغليف بإنتاج الفيروس لمدة 48-72 ساعة القادمة. نظرًا لأن الفيروسات البطيئة أكثر استقرارًا عند 32 درجة مئوية من 37 درجة مئوية ، يمكن حضانة خلايا التعبئة عند درجة الحرارة هذه حتى يتم جمع الفيروس.
  • عادة ما ينتج أعلى تركيز للفيروس بين 48-72 ساعة. لجمع الفيروس ، قم بإزالة المادة الطافية من خلايا التغليف وضعها في أنبوب 15 مل. لإزالة الحطام الخلوي ، يمكن إما طرد المادة الطافية عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق أو يمكن ترشيحها من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر وتركيزها عبر ، على سبيل المثال ، مكثف Clontech Retro-X [44].
    ملحوظة: يمكن تخزين الفيروس المنقى في درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين الحاجة. ومع ذلك ، ينخفض ​​العيار بحوالي 50٪ مع كل دورة تجميد-تذويب.
  • يمكن إضافة الوسائط مرة أخرى إلى خلايا التغليف ويمكن تكرار الحصاد لمدة 96 ساعة بعد تعداء العدوى إذا كان هناك رغبة في المزيد من الفيروسات.
    ملحوظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن تحديد عيار الفيروس بطرق مختلفة ، كما تمت مناقشته لاحقًا.
  • يمكن الآن إضافة الوسيط المحتوي على الفيروس إلى الخلايا المستهدفة الفرعية. ستمتص الخلايا المنقسمة بنشاط الفيروسات بشكل أكثر كفاءة في حالة ناقلات الفيروسات القهقرية ، ويجب أن تنقسم الخلايا أو لن يصل البناء إلى النواة. بناءً على تجربتك ، يمكنك اختيار تعدد محدد للعدوى (MOI) أو يمكنك اختبار مجموعة من أحجام الفيروس المنقى لتحديد أيها يمنحك النتائج المناسبة.
  • يمكن تعزيز التنبيغ البطيء والفيروسات القهقرية عن طريق إضافة البوليبرين [36 ، 45] (سانتا كروز sc-134220 ميليبور سيجما TR-1003-G [46] ميليبور سيجما 107689 [47]) أو كبريتات البروتامين [41 ، 48]. يُعرف أيضًا باسم بروميد هيكساديميثرين ، ويستخدم هذا البوليمر الموجب لزيادة كفاءة نقل الفيروسات القهقرية. يُعتقد أنه يعمل عن طريق تحييد التنافر المشحون بالخلايا الفيروسية [49] وتعزيز امتصاص الفيروسات المستقل عن المستقبل [50]. بالنسبة للخلايا المعلقة (مقارنة بالخلايا الملتصقة) ، يمكن أن يسهل الدوران المغزلي عملية التنبيغ [44 ، 47] ، على الرغم من أنه قد يقلل من بقاء ، على سبيل المثال ، الخلايا التائية الحساسة [51]. قام Jung HY وآخرون بنقل عضيات ظهارية أولية للماوس معزولة حديثًا وخلايا / عضويات Caco2 مع فيروسات shRNA lentivirus وفيروسات ارتجاعية مفرطة في التعبير الجيني باستخدام كبريتات البروتامين [48].
  • يمكن أن يؤدي تضمين مثبط Rho kinase Y-27632 إلى تعزيز بقاء الخلايا والأشياء العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية أثناء انتقال الفيروس [44 ، 52].
  • قم بتغيير الوسائط في اليوم التالي
    ملحوظة: يمكن تغيير الوسائط في أقل من 4 ساعات إذا كانت سمية جزيئات الفيروسة البطيئة مصدر قلق.
    ملحوظة: النسخ العكسي وتكامل البناء يحدث في غضون 24-36 ساعة.
  • يمكن تكرار عملية التنبيغ إذا لزم الأمر. عند إزالة الوسيط المحتوي على الفيروس من خلايا التغليف ، يتم استبدال الوسائط الجديدة. يمكن جمع هذا بعد 24 ساعة واستخدامه لتكرار خطوة التحويل.
  • تحتوي بعض نواقل النقل أيضًا على علامة مثل مراسل الفلورسنت أو علامة اختيار الدواء.
  • يمكن استخدام الفرز FACS لإثراء الخلايا التي تعبر عن مراسل الفلورسنت (مثل GFP).
  • إذا كان يحتوي على علامة اختيار دواء ، فاتبع البروتوكول الخاص بالعقار المعين. على سبيل المثال ، عادةً ما يتم إجراء اختيار البوروميسين عند 1-10 ميكروغرام / مل ، اعتمادًا على حساسية الخلايا المستهدفة.

نظرًا لأن إنتاج وتطبيق النواقل الفيروسية والفيروسات القهقرية يحتويان على العديد من الخطوات ، فهناك العديد من النقاط التي قد يتم فيها إعاقة كفاءة الإنتاج أو النقل. سنناقش هنا بعضًا من أكثر المشكلات شيوعًا:

أحد الأسباب المحتملة لذلك هو الحفاظ على خلايا التغليف في نقطة التقاء ، مما يؤدي إلى انخفاض قصير المدى في إنتاج الفيروس. ضع في اعتبارك إذابة مجموعة جديدة من الخلايا. بدلاً من ذلك ، في حالة الفيروسات القهقرية ، قد تحتاج خلايا طائر الفينيق إلى الاختيار بشكل مضاعف باستخدام مادة hygromycin B وذيفان الخناق للتأكد من أن جميع الخلايا تعبر عن كل من تركيبات التغليف.

قد تحتاج نسبة البلازميدات التحويلية والمساعدات إلى تحسين نظامك الخاص. ستوصي معظم الشركات بنسبة لتبدأ بها ، ولكن قد تحتاج إلى تعديل.

في حين أن نواقل الفيروسة البطيئة والفيروسات القهقرية يمكن أن تستوعب إدخالات كبيرة نسبيًا مقارنة بأنظمة ناقلات فيروسية أخرى ، لا يزال هناك حد للتعبئة. يمكن أن تستوعب الجسيمات الفيروسية 8-10 كيلو بايت بين اثنين من LTRs. بناء الجينات المعدلة وراثيا أطول من هذا سيقلل بشكل كبير من كفاءة التعبئة والتغليف ، مما قد ينتج عنه عيار فيروسي أقل.

هناك طريقة أخرى للتغلب على انخفاض التتر وهي تركيز الفيروس. بعد التنقية لإزالة حطام الخلية ، يمكن تكوير المادة الطافية بواسطة تنبيذ فائق. يمكن بعد ذلك إعادة تعليق الفيروس الحبيبي في الحجم المطلوب من الوسائط أو المخزن المؤقت. توفر العديد من الشركات منتجات وكواشف لتركيز الفيروس (انظر الكواشف أدناه).

إذا كان إنتاج الخلايا المنقولة منخفضًا على الرغم من ارتفاع عيار الفيروس ، فمن الممكن أن يكون الحجم الإجمالي للوسائط المحولة على الخلايا المستهدفة مرتفعًا جدًا [53]. يمكن تنفيذ خطوة النقل في حجم من الوسائط التي تغطي الخلايا فقط ، مما يزيد من تعرض الخلايا للفيروس ، ويزيد من احتمالية تفاعلات الخلايا الفيروسية. يجب الحرص على عدم تجفيف مناطق الطبق ، على سبيل المثال عن طريق هز الطبق بشكل دوري أثناء النقل. يمكن رفع الحجم مرة أخرى بعد 4-6 ساعات لمنع جفاف الخلايا بين عشية وضحاها.

من الممكن أيضًا أن يكون قد تم جمع الفيروس في وقت مبكر جدًا. تبلغ ذروة إنتاج الفيروس ما بين 48-72 ساعة بعد تعداء العدوى.

بعض أنواع الخلايا ، مثل الخلايا الليفية الأولية أو الخلايا العصبية ، يصعب تحويلها بطبيعتها. يمكن أن تكون هذه مشكلة يصعب حلها ، وقد تتطلب إما تحسين بروتوكول النقل أو التحويل باستخدام عيار متزايد. يعد التنميط الكاذب للفيروس المحول لاستهداف مستقبلات أكثر وفرة على نوع خلية معين طريقة أخرى يجب مراعاتها.

قد لا يكون وسط خلية التغليف متوافقًا مع نمو الخلايا المستهدفة. إما أن تخفف الفيروس في وسط متوافق مع الخلية المستهدفة أو تركزه كما هو موصوف أعلاه وأعد تعليقه في وسط متوافق مع الخلايا المستهدفة.

  • ما مدى صعوبة الإدخال الذي تحاول استنساخه؟
  • هل الخلايا المستهدفة صعبة التحويل؟
  • سوف تحتاج التتر عالية الفيروسية؟
  • ما نوع الإدخال الذي ستقوم بالتعبير عنه؟

تم تحسين العديد من الكواشف وبلازميدات النقل لظروف معينة (إنتاج عيارات فيروسية عالية) أو تم تصميمها بخصائص معينة (مثل المروج المحددة أو المزدوجة أو المحفزة). ناقل التعبير الفيروسي البطيء شائع الاستخدام هو Takara Bio / Clonetech pLVX-Puro مع محفز CMV التأسيسي [54].

هناك العديد من الاختلافات في خلايا التعبئة المستندة إلى HEK-293 الموصوفة أعلاه والمتوفرة من المصادر التجارية:

شركة اسم ميزة المرجعي
كلونتيك / تاكارا بيوLenti-X 293 ت6 أضعاف إنتاج الفيروس أكثر من 293FT و 30 مرة أكثر من 293 خلية [32, 55]
جينيكوبوياLenti-Pac 293Taإنتاج عيار عالي
خلية بيولابس293LTV293 مشتق
تعلق قوي باللوحات
معدل نمو أسرع
إنتاج عيار عالي
الهيئة الفرعية للتنفيذ293TNقابل للعدوى بدرجة عالية
إنتاج عيار عالي
خلية بيولابستغليف البلاتين الفيروسيمشتق 293T
تنتج عيارًا عاليًا ثباتًا أطول دون اختيار الدواء
ثلاثة إصدارات: ecotropic (Plat-E) [56] ، و amphotropic (Plat-A) ، و Pantropic (Plat-GP)
[56, 57]
خلية بيولابس293RTV خط خلية التعبير والتعبئة الفيروسية
نمو أسرع للخلايا
ارتفاع عيار الفيروسات القهقرية
تعلق أكثر حزما باللوحات

يمكن الحصول على كواشف ترنسفكأيشن تجاريًا أو صياغتها في المختبر. بالإضافة إلى كواشف تعداء العدوى الأكثر شيوعًا: فوسفات الكالسيوم [44 ، 58] ، ليبوفيكتامين [59] ، فوجين [33] ، وما إلى ذلك ، هناك أيضًا العديد من الأطقم المصنعة تجاريًا التي تحتوي على بلازميدات النقل والمساعد وتروج لمردود أعلى من الفيروسات و نسبة مُحسَّنة من البلازميدات. تم تحسين معايير تعداء فوسفات الكالسيوم [60 ، 61] ، وقد تكون الحضانة المطولة بفوسفات الكالسيوم سامة.

يناقش القسم التالي بعض الكواشف الشائعة تعداء. توجد أيضًا مجموعات كاشف تعداء متخصصة ، على سبيل المثال ، كاشف ترنسفكأيشن Clontech / Takara Bio Xfect لترنسفكأيشن الخلايا الجذعية الجنينية للفأر [62] ، Jetprime [63] أو jetPEI [64] من Polyplus أو TransIT-LT1 [65] أو TransIT X2 [ 41] كاشف تعداء من Mirus.

Lipofectamine هو دهون كاتيونية مع مجموعة رأس موجبة الشحنة وسلسلة هيدروكربونية 1-2. تتفاعل مجموعة الرأس مع العمود الفقري للفوسفات في الحمض النووي. تسمح الشحنة السطحية الموجبة للجسيمات الشحمية بدمج مركب الجسيمات الشحمية / الحمض النووي مع الخلية سالبة الشحنة. كمثال ، Vodnala SK وآخرون خلايا تعبئة Platinum-E ecotropic (PlatE) المنقولة من Cell Biolabs و pCL-Eco plasmid باستخدام Lipofectamine في OptiMEM من Invitrogen [57]. يمكن أن يحسن كاشف PLUS من Thermo Fisher كفاءة كواشف تعداء ، مثل Lipofectamine [59].

شركة المنتج سمات
خلية بيولابسنظام ViraSafe ™ Lentivirus Expression الكاملأكثر أمانًا استنادًا إلى فيروس نقص المناعة البشرية بسبب انخفاض التداخل مع جينات فيروس نقص المناعة البشرية الأصلية نظام Pantropic (النمط الكاذب VSV-G) أو خارج الرحم (يصيب فقط خلايا الفئران أو الفئران غير المستقرة عند التجميد ، ولن تنجو من أنظمة الطرد المركزي الفائق)
جينيكوبياأطقم تغليف Lenti-Pac ™ Lentiviralأنظمة تغليف تعبيرات HIV و FIV
الأمثل مزيج البلازميد التعبئة والتغليف لينتيفيرال
يحتوي على كاشف تعداء EndoFectin ™
يزيد كاشف TiterBoost ™ من التتر 5-10 أضعاف
الهيئة الفرعية للتنفيذمزيج البلازميد التعبئة والتغليف pPACKH1فيروس نقص المناعة البشرية والقائم على FIV
مزيج محسن من السلامة القصوى من 3 بلازميدات مساعدة: pPACKH1-GAG و pPACKH1-REV و pVSV-G. pPACKH1-GAG
يصيب الخلايا الثديية وغير الثديية
إنفيتروجينViraPower ™ مزيج التعبئة والتغليف Lentiviralنظام لينتيفيرال القائم على فيروس نقص المناعة البشرية -1
مزيج محسن من 3 عبوات / بلازميدات مساعدة (pLP1 و pLP2 و pLP / VSVG)
ViraPower ™ Lentiviral Expression Kitناقل النقل القائم على pLenti
مزيج محسن من 3 عبوات / بلازميدات مساعدة (pLP1 و pLP2 و pLP / VSVG)
293FT خلايا تعبئة
نظام NativePure ™ Lentiviral Expressionللتعبير عن اندماج N- و C- طرفي biotinylated مع البروتين الذي يهمك
ميليبور سيغمامزيج التعبئة والتغليف Lentiviral [66] عيار عالي عند استخدامه مع MISSION shRNA plasmid
تم تحسين نسبة البلازميدات بالفعل (ربما خطوات أقل لإنتاج الفيروس فعليًا)
خلية بيولابسأنظمة كاملة للتعبير عن الفيروسات البلاتينيةالتعبير الفيروسي ونظام التعبئة والتغليف
ارتفاع التتر
إنتاج فيروسات بيئية أو مذبذبة أو بانتروبيك (تحتاج إلى خط خلوي محدد - ecotropic (Plat-E) و amphotropic (Plat-A) و Pantropic (Plat-GP))

فوجين هو كاشف تعداء غير شحمي يدعي أن لديه كفاءة عالية في تعداء العدوى مع سمية منخفضة. متوافق مع المصل ولا يتطلب تغيير الوسط بعد الاستخدام. إنه خليط خاص من الدهون موجبة الشحنة ومكونات أخرى تتفاعل مع الحمض النووي سالب الشحنة وتسمح بالدخول إلى الخلية. تشمل التطبيقات الحديثة [33 ، 67].

ملحوظة: عند الجمع بين الفوجين والبلازميدات ، يُقترح استخدام أنابيب البوليسترين وإضافة الفوجين أخيرًا لتجنب تفاعله مع الأنبوب.

يصف روش هذا بأنه "كاشف متعدد المكونات يشكل معقدًا من الحمض النووي ، ثم ينقل المركب إلى خلايا حيوانية أو حشرية." يسمح بنقل العدوى من الحمض النووي إلى مجموعة متنوعة من الخلايا بأقل سمية. وقد تم الاستشهاد به في الأدبيات [34].

يتم اشتقاق بلازميدات النقل من العديد من العمود الفقري. تحتوي النواقل النموذجية على بعض ، أو كل ، الميزات التالية التي تجعل النواقل أكثر أمانًا ، أو تزيد من التتر الفيروسي ، أو تعزز التعبير عن الإدخال.

اسم وظيفة
5’LTR5 'كرر المحطة الطرفية الطويلة
SIN / LTR3 'تكرار طرفية طويلة ذاتية التعطيل
أوريأصل النسخ المتماثل
مقاومة الأمبيسلين أو الكاناميسينالجين المقاوم للأمبيسيلين أو الكاناميسين لانتقاء البكتيريا
بسي (ψ)إشارة التعبئة والتغليف RNA
RREعنصر استجابة Rev
cPPTالجهاز البوليبورين المركزي
hPGKمحفز حقيقي النواة كيناز فوسفوجليسيرات الإنسان
عنصر WPREعنصر تنظيمي ما بعد النسخ من التهاب الكبد الوبائي
إشارة عديد الأدينيل SV40يتيح الإنهاء الفعال للنسخ ومعالجة النصوص المؤتلفة
PuroRجين المقاومة بوروميسين لانتقاء الثدييات
أصل pUCيسمح بتكرار النسخ العالي والحفاظ على البلازميد في خلايا الإشريكية القولونية
أصل SV40يوفر انتشارًا ثابتًا للبلازميد في خلايا التعبئة
F1 أوريأصل النسخ المتماثل

تقدم MilliporeSigma العديد من العمود الفقري لبلازميدات MISSION shRNA. لديهم مجموعة واسعة من خيارات علامات الفلورسنت أو الأدوية والأنظمة المحفزة. تستخدم نواقل shRNA محفز U6. أنها توفر كل من الضوابط الإيجابية والسلبية لجميع العمود الفقري. تم تطوير هذا بالتعاون مع علماء اتحاد الحمض النووي الريبي ، وتم تطوير ناقل القاعدة pLKO.1-puro في معهد Broad [68]. كل هذه نواقل الفيروسة البطيئة. تم نشر مجموعات مختلفة من البلازميدات وضوابط MISSION shRNA في أكثر من 1500 مقال في المجلات.

يستخدم المروج العمود الفقري علامات اختيار
تعبير shRNApLKO.1-CMV PLKO.1-UbCeGFP و tGFP و TagCFP و TagYFP و TagRFP و TagFP635 و TurboGFP و TagFP635 Puromycin و neomycin
محرضpLKO-puro-IPTG-1xLacOبوروميسين
pLKO-puro-IPTG-3xLacOبوروميسين
تعداء shRNA العابر أو المستقر وإنتاج الفيروس البطيءTRC2-pLKOبوروميسين

تقدم SBI نواقل الفيروسة البطيئة التي تعتمد على فيروس نقص المناعة البشرية و FIV ولديها العديد من المروجين ، اعتمادًا على نوع الخلية التي يتم نقلها: CMV (الفيروس المضخم للخلايا) لـ HeLa والعديد من أنواع الخلايا الأخرى وللتنقل HEK293 و HT1080 MSCV (فيروس الخلية الجذعية Murine) ، من أجل نقل الخلايا المكونة للدم والخلايا الجذعية UbC (Ubiquitin C) ، لتحويل معظم أنواع الخلايا PGK (Phosphoglycerate Kinase) ، لنقل معظم أنواع الخلايا و EF1 (عامل الاستطالة 1α) ، لتحويل معظم أنواع الخلايا [69] بالإضافة إلى ناقلات النقل المدرجة أدناه ، فإنها توفر العمود الفقري المحرض والمزدوج. تشمل العلامات المتاحة القابلة للتحديد GFP و RFP و Puromycin و Hygromycin و Neomycin و Zeocin.

يتم وصف ملخص للعمود الفقري والعلامات أدناه.

يستخدم المروج العمود الفقري
العمود الفقري / المروج لـ [كدنا]pCDF1-MCS2-EF1
pCDH-CMV-MCS2
pCDH-CMV-MCS-EF1
pCDH-MCS-T2A
pCDH-CMV-MCS
pCDH-EF1-MCS
pCDH-UbC-MCS
pCDH-MSCV-MCS
pPS-EF1-GFP-RFP
pPS-PGK-GFP-RFP
pPS-MSCV-GFP-RFP
العمود الفقري / المروج لـ shRNApSIH1-H1
pSIF-مرحبا
pGreenPuro
pFIV-H1
العمود الفقري / المروج لـ microDNApCDH-CMV-MCS-EF1
pMIF-cGFP-Zeo

تقدم Invitrogen نظام ViraPower ™ Lentiviral Expression. إن بلازميدات النقل هي نواقل قائمة على pLP أو pLenti وتكون مصحوبة بثلاثة بلازميدات تعبئة / مساعدة (pLP1 و pLP2 و pLP / VSVG) [70]. لديهم أنظمة lentiviral محسّنة للتعبير الجيني تحت سيطرة CMV أو UbC أو CMV / TO أو RSV أو EF-1α. وهي تشمل عدة نواقل للفيروسات البطيئة لإنشاء بروتينات Lumio أو V5 الموسومة بحلقة. تتمثل إحدى ميزات أنظمة Invitrogen في أنها توفر خيارات متعددة للاستنساخ بما في ذلك أنظمة Gateway (DEST ™) و TOPO® والقائمة على إعادة التركيب (pLenti6 / UbC / V5-DEST ™). تم نشر البلازميدات المختلفة المستندة إلى pLenti في أكثر من 2000 مقال صحفي.

يستخدم ناقلات العمود الفقري المروج المروجين طريقة الاستنساخ اختيار تحريض الوكيل
الهدف التعبير الجيني أو إنشاء البروتين الموسومplpRSV ، CMVغير متوفرGFPغير متوفر
pLenti7.3⁄V5-DEST ™CMV ، GFPبوابة
pLenti7.3⁄V5-TOPO®CMVTOPO® أو TOPO®-TAبلاستيدين
pLenti6.3⁄V5-DEST ™CMVبوابةبلاستيدين
pLenti6.3⁄V5-TOPO®CMVTOPO®-TAبلاستيدين
pLenti6.4⁄R4R2⁄V5-DEST ™EF-1α ، CMV ، لا شيء (بدون ترويج)بوابةبلاستيدين
pLenti6.2 / C ، N-Lumio ™ / V5-DESTCMVبوابةبلاستيدين
pLenti6.2⁄V5-DEST ™CMVبوابةبلاستيدين
pLenti6⁄V5 أو pDESTCMV، UbCاتجاه البوابة TOPO® أو بوابةزيوسين
pLenti4⁄V5-DEST ™CMVبوابةغير متوفر
نظام محرضمحرك pLenti6.3⁄ TO⁄ V5-DESTCMV / TOبوابةبلاستيدينالدوكسيسيكلين والتتراسيكلين
pLenti6 / TRCMVبوابةبلاستيدينالدوكسيسيكلين والتتراسيكلين

إنتاج الفيروسات القهقرية

تقدم Biolabs الخلوية مجموعة من نواقل التعبير الفيروسي [71] في مختلف البلازميدات في الخلفية التي يشتقها فيروس سرطان الدم الفئران (MLV). أنها توفر خطوط خلايا التغليف الفيروسية (293RTV) ومجموعات لتنقية الفيروسات وتركيزها: ViraBind ™ Concentration and Purification kits أو ViraBind ™ PLUS Concentration and Purfits. وقد ثبت أن نواقل pMXs و pMYs و pMCs فعالة في الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات. أنها توفر العديد من علامات التحديد: Hygromycin و Neomycin و Puromycin و Zeomycin و GFP. تم نشر ناقلات العمود الفقري المختلفة في أكثر من 500 مقالة في المجلات. على سبيل المثال ، قدم Yasuda S وآخرون RAD23B ومتغيراته لخلايا RAD23B-KO مع ناقل pMX-Puro (Cell Biolabs) [72].

يستخدم محفز العمود الفقري محدد قابل للتحديد
ناقل التعبيربابي
pMCs-CAG
pMXs-CMV
pMXs-EF1
pMXs-EF1α
pMXs-IRES
pMXs-SRα
pMXs-U6
pMYs-IRES
pWZL
هيغروميسين
نيومايسين
بوروميسين
زيوميسين
GFP

إنتاج الفيروسة البطيئة

تقدم شركة Cell Biolabs، Inc. ناقلات التعبير الفيروسي على أساس pSMPUW-IRES و pSMPUW-U6 حيث يمكن استنساخ الجين المعني مباشرة. وهي تشمل العلامات المحددة التالية: Blasticidin و Hygromycin و Neomycin و Puromycin و GFP. تحمل نواقل النقل هذه جينًا مقاومًا للكاناميسين ، و WPRE ، وموقع استنساخ متعدد (MCS) ، و cPPT ، و 3 'LTR ، و 5' CMV / LTR [73]. تمت الإشارة إلى ناقلات التعبير هذه في 6 مقالات في المجلات.

يستخدم محفز العمود الفقري علامة اختيار
نواقل التعبيرpSMPUW-IRES
pSMPUW-U6
بلاستيدين
هيغروميسين
نيومايسين
بوروميسين
GFP

Addgene هو مستودع غير ربحي للبلازميدات ويقدم مجموعة واسعة من نواقل نقل الفيروسة البطيئة والفيروسات الرجعية. يتم سرد عدد قليل من ناقلات الفيروسات القهقرية شائعة الاستخدام في الجدول 9. وبعض النواقل الأخرى من Addgene تشمل pBMN-PIB [56].

يستخدم العمود الفقري / الاختيار اختيار الدواء
ناقلات الفيروسات القهقرية للتعبير عن shRNApMKO.1 و pMKO.1بوروميسين ، نيومايسين ، زيوسين ، GFP
التعبير الفيروسيبابيهيغروميسين ، بوروميسين ، زيوسين ، GFP
التعبير الجيني الفيروسي للثدييات مع علامة اختيار GFPMSCV-IRES-GFPGFP

يتم تضمين نواقل الفيروسة البطيئة الشائعة المتوفرة من خلال Addgene في الجدول 10. تستخدم بلازميدات التعبئة Lentiviral PAX2 (12260) و pMD2.G (12259) من Addgene بشكل شائع [41 ، 74]. حصل Duncan A et al ، على سبيل المثال ، على p-Lenti-7xTcf-FFluc-SV40-mCherry من Addgene (24307) [75].

يستخدمالعمود الفقريالمرجعي
تعبير لينتيفيرال pWPXL ، pLenti-puro 39481 [76]
تعبير lentiviral shRNApLKO.1
تعبير shRNA lentiviral الذي يحفزه TetTet-pLKO 21915 [47]
تعبير (كدنا)FUGW
تعبير shRNA الشرطي تحت تحكم Cre-Loxبيكو
تعبير (كدنا)pLJM1-EGFP

تقدم SBI System Biosciences بديلاً للطرد المركزي منخفض السرعة لتركيز الفيروسات القهقرية مع Retro-Concentrin ™ الذي يترسب الفيروسات متبوعًا بالطرد المركزي منخفض السرعة. تستغرق العملية 12 ساعة على الأقل. ومع ذلك ، فإن إحدى المزايا هي أن الحبيبات الناتجة يتم تثبيتها للتخزين عند -80 درجة مئوية [77].

تقدم SBI System Biosciences أيضًا حل ترسيب فيروس Peg-it ™ [33]. تمت صياغة هذا المحلول باستخدام البولي إيثيلين جلايكول وتم تحسينه من أجل ترسيب الجسيمات الفيروسية. عند مزجه مع الوسائط التي تم جمعها من خلايا التغليف ، فإنه يتسبب في ترسب الجزيئات الفيروسية. يمكن بعد ذلك الطرد المركزي للخليط لتكوير الجسيمات. زادت التركيزات من 10 إلى 100 ضعف.

توفر شركة Cell Biolabs، Inc. مجموعات تنقية وتركيز للفيروس البطيء تكون إما قائمة على العمود أو الغسيل الكلوي أو المرشح. تسمح المجموعة القائمة على العمود بتركيز يصل إلى 500 ضعف بنقاوة أعلى من ذلك الطرد المركزي الفائق في 3-5 ساعات. يمكن لهذه الأساليب معالجة كميات أكبر من الأساليب القائمة على التصفية. تسمح المجموعة القائمة على غسيل الكلى بتركيز يصل إلى 10 9 TU / mL ، بنقاوة أعلى ، في حوالي 12-24 ساعة. تتعافى المجموعات القائمة على المرشح أكثر من 90٪ من الفيروس بجودة عالية في أقل من ساعتين.

تقدم GeneCopoeia محلول Lenti-Pac ™ Lentivirus Concentration الذي يسمح ، من خلال استخدام الكاشف الخاص به ، بزيادة تركيز الفيروسات بمقدار 10-100 ضعف في أقل من 3 ساعات بدون تنبيذ فائق.

تقدم الشركات الأخرى منتجات مماثلة أيضًا. يُعد مُكثّف Lenti-X من Clontech (631231) خيارًا شائعًا لتركيز الفيروسة البطيئة [59 ، 78].

توفر شركة Cell Biolabs، Inc. مجموعة قياس / معايرة للفيروسات البطيئة. هذا يقيس محتوى الحمض النووي الفيروسي للفيروس البطيء المنقى أو المادة الطافية غير المنقاة في 45-60 دقيقة. يتم التقاط الفيروس عن طريق حبيبات ثم تغيير طبيعتها ، وتتم قراءة الامتصاص ومقارنته بمنحنى قياسي (Lentivirus RNA Standard المزود مع المجموعة) لتحديد محتوى الحمض النووي.

كما أنها توفر مجموعة أخرى (QuickTiter ™ Lentivirus Titer Kit) تقيس بروتين مصفوفة p24 المرتبط بالفيروس بواسطة ELISA على لوحة مطلية بالأجسام المضادة لـ p24. يتم توفير معيار مستضد p24 للتقدير الكمي. استخدم Fanning S et al هذه المجموعة لتحديد عيارات متجهات التعبير pLV-hSyn-hSNC و pLV-hSyn-mGFP [79].

تقدم GeneCopoeia مجموعات المعايرة القائمة على qRT-PCR (Lenti-Pac ™ HIV و FIV qRT-PCR Lentivirus Kits Kits). أنها توفر الضوابط القياسية ، وكواشف استخراج الحمض النووي الريبي ، وكواشف qRT-PCR. يتم تحديد جينوم الحمض النووي الريبي البطيء بواسطة qPCR باستخدام تقنية SYBR الخضراء.

تقدم شركة Cell Biolabs، Inc. مجموعات (ViraDuctin ™ Lentivirus Transduction Kit و ViraDuctin ™ Retrovirus Transduction kit) التي تشتمل على كوكتيل خاص يشكل مجمعًا فائقًا مع جزيئات الفيروس البطيء ، مما يؤدي إلى زيادة 2 إلى 6 أضعاف في كفاءة النقل بالمقارنة مع بوليبرين.

تقدم SBI System Biosciences TransDux ™ ، وهو عبارة عن كاشف عدوى مع الحد الأدنى من السمية التي توفر كفاءة نقل متزايدة بشكل كبير على البوليبرين.

كما أنها توفر مجموعة LentiMag ™ التي تحتوي على تركيبة من الجسيمات النانوية المغناطيسية التي تم تطويرها لنقل خلايا الثدييات مع ناقلات الفيروسات القهقرية أو الفيروسة البطيئة. من خلال تشغيل مغناطيس تحت الخلايا التي يتم نقلها ، يصبح الفيروس المرتبط بالجسيمات النانوية المغناطيسية مركّزًا على الخلايا بسرعة كبيرة ، مما يزيد من كفاءة النقل.

تقدم العديد من الشركات المذكورة أعلاه وغيرها أيضًا جزيئات تحويل فيروسية جاهزة للاستخدام ذات عيار عالي ونقاء (AddGene و MilliporeSigma SBI System Biosciences وغيرها). على سبيل المثال ، استخدم De Cecco M et al pLKO-RB1-shRNA63 و pLKO-RB1-shRNA19 من T. والدمان عبر AddGene (25641 و 25640) [80]. حصل Duncan A وآخرون على مراسل pGF-CREB-mCMV-EF1α-Puro CREB وناقل التحكم في العمود الفقري للفيروس البطيء من System Biosciences (TR202va-p) [75]. حصل SE Sillivan et al على ما قبل miR-135b-5p والتحكم في ناقل CD513 lentiviral من System Biosciences [64].

يوفر معهد دانا فاربر للسرطان ومعهد برود مكتبة CCSB-Broad Lentiviral Expression لأكثر من 15000 من ORFs البشري في نظام لينتيفيرال جاهز للتعبير مع علامة C-terminal V5. قام Ebright RY وزملاؤه بإصابة الخلايا السرطانية المعزولة المعزولة بعدة تركيبات من المكتبة [59].

على الرغم من التقدم المعين في التطبيقات الحالية للنُهج القائمة على الفيروس البطيء ، فإن تعزيز تقنيات نقل الجينات يظل الهدف الأساسي لتطوير بروتوكولات علاجية أكثر كفاءة. أبلغت العديد من الدراسات عن طرق مختلفة لتعزيز كفاءة التنبيغ في الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC). أظهرت دراسة حديثة أن UM171 ، وهو منشط لـ HSCs ، يحفز بشكل كبير التنبيغ المعتمد على الفيروس البطيء لخلايا CD34 + [81]. أيضًا ، وفقًا لهوبر وآخرون ، فإن LentiBOOST ، وهو بوليوكسامير مانع للتسرب للأغشية ، يعزز أيضًا كفاءة نقل الفيروس البطيء في خلايا CD34 البشرية المأخوذة من الدم المحيطي [82] وخلايا الفئران التائية [51].

أيضًا ، تم مؤخرًا تقديم منصة جديدة للتعبير الجيني قصير المدى باستخدام الفيروسات البطيئة التي تعاني من نقص التكامل (IdLVs) ، والتي تعبر عن الجينات بشكل عابر فقط في الخلايا المنقسمة [83]. لاحظ المؤلفون تحسنًا في النشاط الوظيفي لـ HSCs عندما تم استخدام IdLVs لتسليم HOXB4 و Angptl3. تساعد هذه التقنية في تجنب الآثار الضارة الموجودة في التعبير التأسيسي.


التقييم الوظيفي للترميز والمتغيرات التنظيمية من DKK1 مكان

ال DKK1 الجين يشفر مثبطًا خارج الخلية لمسار Wnt مع وضع أساسي في نمو أنسجة العظام ، واستتباب العظام ، وعناصر حيوية مختلفة تمامًا من العظام مادة الاحياء. عدة BMD الجينوماكتشفت أبحاث الانتماء على مستوى العالم (GWASs) باستمرار الانتماء إلى SNPs داخل DKK1 منطقة الجينوم. لهذه الأسباب ، من المهم جدًا تقييم أداء الترميز والمتغيرات التنظيمية داخل الجين.

هنا ، درسنا الآن أداء المتغيرات التنظيمية المفترضة ، المكتشفة مسبقًا المتعلقة بـ BMD في العديد من الأبحاث التي أجراها الآخرون وأنفسنا ، بالإضافة إلى ستة متغيرات خطأ حالية داخل الجينسكان رال. باستخدام اختبار مراسل لوسيفيراز الخاص بمسار Wnt ، قررنا الآن أن المتغيرات p.Ala41Thr و p.Tyr74Phe و p.Arg120Leu و p.Ser157Ile تظهر انخفاضًا في القدرة التثبيطية لـ DKK1 على عكس WT. تتوافق هذه النتيجة النهائية مع النمط الظاهري للكتلة العظمية المرتفعة (HBM) لسيدتين من مجموعتنا اللتين تحملتا طفرات p.Tyr74Phe أو p.Arg120Leu.

من ناحية أخرى ، عن طريق التقاط التشكل الكروموسوم الدائري - (4C-) تجربة تسلسل ، اكتشفنا الآن أن المنطقة التي تحتوي على 24 متغيرًا من BMD-GWA ، موضوعة على 350 كيلو بايت. المصب من DKK1يتفاعل مع كل منهما DKK1 و ال لنكارود (منظم تنشيط LncRNA لـ DKK1 ، AKA LINC0148) في خلايا العظام. في الختام ، لقد أثبتنا الآن أن بعض متغيرات الترميز غير الشائعة هي طفرات فقدان الوظيفة الجزئية التي ستؤدي إلى النمط الظاهري لـ HBM ، في حين أن تعدد الأشكال على نطاق واسع والمتعلق بـ BMD في GWASs تنتمي إلى منطقة تنظيمية طويلة المدى مفترضة ، عبر آلية غير معروفة تتضمن لنكارود. © 2020 المؤلفون. جي بي إم آر بلس طبع بواسطة Wiley Periodicals LLC نيابة عن الجمعية الأمريكية لأبحاث العظام والمعادن.

/> خلايا الغدد الصماء العصبية الرئوية: علم وظائف الأعضاء واستتباب الأنسجة والمرض

علوم حيوية النظام

تقدم System Biosciences مجموعة واسعة من الخدمات المخصصة لدعم بحثك ، مما يسمح لك بقضاء وقت أقل في صنع الأدوات ، والمزيد من الوقت في اكتشاف الاكتشافات. استفد من خبرتنا في التقنيات التالية: • استنساخ ناقلات الفيروس البطيء والتعبئة عالية العيار • عزل Exosome وتسلسل NGS • خطوط الخلايا المخصصة المصممة هندسيًا من CRISPR / Cas9 • توليد خط خلوي مستقر (الإفراط في التعبير ، الضربة القاضية ، والأنظمة المحفزة) • دائرة مصغرة مخصصة • تحديد سمات MicroRNA qPCR للجينوم بأكمله أو اللوحة التي تختارها جميع الخدمات المنجزة في الموقع في أحدث مرافق SBI في بالو ألتو ، كاليفورنيا بواسطة علماء على مستوى الدكتوراه يتمتعون بسنوات من الخبرة في تقديم خدمات عالية الجودة للباحثين . اختر SBI لاحتياجات الخدمة المخصصة الخاصة بك - تسخير الابتكار لدفع الاكتشافات منذ عام 2003

الشهادات ومؤهلات أمبير

خدماتنا (32)

عزل وتوصيف exosome

تحليل المؤشرات الحيوية

الاستنساخ الجزيئي

التوليف الجيني المخصص والاستنساخ الفرعي (Syn2CloneTM)

هل سئمت القفز عبر أطواق الاستنساخ للحصول على البنية الخاصة بك؟ وفر على نفسك الوقت والجهد واطلب من فريق خبراء SBI بناء الهياكل المخصصة التي تحتاجها من خلال خدمة Syn2Clone الخاصة بنا. هذه خدمة متكاملة حيث تقدم تسلسل النسخ ونهتم بالباقي. يمكنك الحصول على إدراج كامل لمراقبة الجودة مستنسخ في مجموعة SBI الرائدة في الصناعة من النواقل التي يتم تسليمها في أقل من أسبوعين وبسعر ليس أكثر من ناقل فارغ.

تقدم SBI مجموعة واسعة من الخيارات لـ shRNAs الأحادية أو المتعددة و cDNAs و amp microRNAs ، بالإضافة إلى إنشاء النسخ المراسل للنسخ. اختر من بين مجموعة متنوعة من المروجين وجينات المراسل وأنظمة التوصيل بما في ذلك ناقلات Lentivector و Minicircle و PiggyBac.

تفاصيل الخدمة
• الوقت المستغرق لمشاريع Syn2Clone هو 2-6 أسابيع حسب حجم / تعقيد الإدخال
• يتم التحقق من تسلسل جميع التركيبات باستخدام خرائط بلازميد مشروحة
• اختر من المتجهات Lentivector أو Minicircle أو PiggyBac الممتازة من SBI
• خيارات تخصيص المتجهات لتعطيك بالضبط ما تحتاجه

إنتاج الفيروسة البطيئة

SBI هي الشركة الرائدة في صناعة Lentivirus
تقدم SBI خدمة Express Lentiviral Packaging لإنتاج جزيئات فيروسات عالية الجودة وعالية الجودة باستخدام بناء lentivector الخاص بك في أقل من 10 أيام. وفر على نفسك الوقت والجهد اللازمين لإعداد الفيروس الخاص بك ، واحصل على جزيئات الفيروسة البطيئة الجاهزة للتحويل من SBI - خبراء الفيروسة البطيئة. * (انظر عينة بيانات العدوى).
يجب أن تأتي جميع خدمات إنتاج الفيروسات المخصصة بمعلومات عن البلازميدات التي يجب تعبئتها.

الكمي من Lentivirus Titer
يمكن قياس عيارات الفيروس البطيء بطرق متعددة. تبالغ قياسات البروتين السطحي الفيروسي بواسطة ELISAs في تقدير مستويات العيار لأنها تكتشف جزيئات الفيروس النشطة والميتة. يقيس SBI عيار الفيروس عن طريق تحويل الخلايا المستهدفة في عدة عدوى متعددة (MOIs) مع تحليل qPCR اللاحق لتحديد العدد الدقيق للتكاملات الفيروسية البطيئة لكل جينوم الخلية المستهدفة. هذا العيار المحسوب هو الطريقة الأكثر دقة لقياس جزيئات الفيروس النشطة ويتم الإبلاغ عنها كوحدات معدية (IFU) لكل مل.

ضمانات خدمة تغليف فيروسات الجودة لدينا

  • إنتاج الفيروس في أحدث منشأة BSL-2 مع رقابة صارمة على الجودة وفقًا لمعايير NIH Biosafety Level 2
  • يتوفر الإنتاج التجريبي الصغير النطاق لاختبار العدوى في سلالات الخلايا التي تختارها
  • متسقة للغاية وموثوق بها باستخدام ناقلات SBI وخدمات الاستنساخ
  • عيارات الفيروس عند أو أعلى من مستويات العيار المطلوبة ، باستخدام ناقل SBI
  • يتم تشغيل عبوة فيروسات إضافية مضمنة إذا لم يتم تحقيق العيار المطلوب
  • مرونة مقاييس إنتاج الفيروسات لتلبية احتياجاتك البحثية
  • التتر الفيروس الدقيق كما هو محدد بواسطة qPCR لقياس الوحدات المعدية لكل مل (ifus / ml)
  • المساعدة التقنية من الخبراء التي قدمتها استجابة الموظفين العلميين ذوي الخبرة للهيئة الفرعية للتنفيذ في غضون 24 ساعة

تسلسل الحمض النووي الريبي

اكتشف المؤشرات الحيوية الجديدة للمريض الموجودة في الإكسوسومات
Exosomes عبارة عن حويصلات غشائية 60-150 نانومتر تفرزها معظم أنواع الخلايا في الجسم الحي وفي المختبر. توجد في الدم ، والبول ، والسائل الأمنيوسي ، وسوائل الاستسقاء الخبيثة ، وتحتوي على مجموعات فرعية متميزة من الرنا الميكروي ، و mRNAs ، و lncRNAs ، و ncRNAs الأخرى. وقد ثبت أن هوية ووفرة هذه الرناوات هي نهج قيم لاكتشاف التوقيعات المتسلسلة لتشخيص المرض والتنبؤ به. تعلن SBI عن خدمة تسلسل الحمض النووي الريبي الخارجي من الجيل التالي لتسريع اكتشافات العلامات الحيوية الخاصة بك. توفر خدمة Exo-NGS من SBI حلاً كاملاً من البداية إلى النهاية من أي سائل حيوي إلى بيانات RNA-Seq التي تم تحليلها ومواءمتها. نقوم بعزل exosomes وتنقية exoRNA وبناء مكتبات Illumina NGS. يتم بعد ذلك تسلسل هذه المكتبات باستخدام نهاية مقترنة 2x 75bp يتم تشغيل Illumina NGS لتوفير ثقة أكبر بهوية تسلسل الحمض النووي الريبي.

CRISPR / Cas9 Vector Construction

تحرير الجينوم باستخدام دليل RNAs
قدم الاكتشاف الأخير لمركب CRISPR / Cas9 للباحثين أداة لا تقدر بثمن لاستهداف وتعديل أي تسلسل جيني بمستويات عالية من الفعالية والخصوصية. النظام ، الذي يتكون من نوكلياز موجه من الحمض النووي الريبي (Cas9) ودليل RNA (جرنا) مكمل للتسلسل المستهدف ، يسمح بتقسيم محدد بالتسلسل للمواقع المستهدفة عبر الجينوم. يوفر SBI تصميم gRNA المخصص واستنساخه في أي ناقل SmartNuclease مع وقت استجابة مدته أسبوعان. اتصل بنا اليوم للبدء.

ناقلات الموارد البشرية المخصصة
السعر عند الطلب
استفد تمامًا من الطبيعة القوية لمنصات هندسة الجينوم CRISPR / Cas9 و TALEN باستخدام متجهات الموارد البشرية المتطابقة. تؤثر غالبية أحداث تحرير الجينوم على نسبة مئوية فقط من إجمالي عدد الخلايا المنقولة بالعدوى ، المقدرة بـ 1-80 ٪ للتعديلات أحادية أو ثنائية الأليلات اعتمادًا على النظام الأساسي ونوع الخلية وهدف الحمض النووي محل الاهتمام. نظرًا للاختلاف الواسع في النشاط ، فإن إجراء فحوصات النمط الظاهري المصب في خلفية من الخلايا البرية يعد أمرًا صعبًا ، خاصةً إذا كان النمط الظاهري المعني دقيقًا أو يصعب تمييزه. لذلك ، فإن الأدوات في شكل نواقل مانحة أو مستهدفة تحتوي على 1) علامات اختيار الفلوريسنت أو المضادات الحيوية و 2) جزء من الجينات التي تهم الضربة القاضية أو الضربة القاضية أو تصحيح تسلسل من النوع البري ستكون مفيدة للغاية للحصول على مجموعة متجانسة من الخلايا التي تم استهداف جينوماتها بنجاح. أنتجت SBI مجموعة من نواقل استهداف إعادة التركيب المتماثل المناسبة لغرض هندسة كل من الجينات المشفرة للبروتين وغير المشفرة بما في ذلك microRNAs والمواقع الجينية LncRNAs.


ناقلات الفيروسة البطيئة: أساسية إلى متعدية

لقد مر أكثر من عقدين منذ أن تم استخدام فيروس نقص المناعة البشرية المعدل وراثيًا لتوصيل الجينات. من خلال التحسينات المستمرة ، تطورت هذه الفيروسات المبكرة الحاملة للجينات إلى نواقل للفيروس البطيء أكثر أمانًا وفعالية. تقدم نواقل الفيروسة البطيئة العديد من الخصائص الجذابة كوسائل توصيل الجينات ، بما في ذلك: (1) توصيل الجينات المستدام من خلال تكامل الناقل الثابت في جينوم المضيف (2) القدرة على إصابة كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة (3) المناطق المدارية الواسعة للأنسجة ، بما في ذلك المهم أنواع الخلايا المستهدفة للعلاج الجيني والخلوي (4) عدم وجود تعبير عن البروتينات الفيروسية بعد نقل الناقلات (5) القدرة على توصيل عناصر وراثية معقدة ، مثل التسلسل متعدد الجينات أو المتواليات المحتوية على intron (6) ملف تعريف موقع تكامل أكثر أمانًا و ( vii) نظام سهل نسبيًا لمعالجة وإنتاج ناقلات الأمراض. وفقًا لذلك ، تستخدم تقنيات lentivector الآن على نطاق واسع في البيولوجيا الأساسية والدراسات متعدية من أجل التعبير الزائد المستقر للجينات المحورة ، وإسكات الجينات المستمر ، والتحصين ، والتصوير في الجسم الحي ، وتوليد الحيوانات المحورة جينيا ، وتحريض الخلايا متعددة القدرات ، وتعديل الخلايا الجذعية وتتبع النسب ، أو الجينات الموجهة للموقع التحرير. علاوة على ذلك ، في العصر الحالي عالي الإنتاجية & lsquo-omics & rsquo ، فإن التوافر التجاري لناقلات الفيروسة البطيئة المعدة مسبقًا ، والتي تم تصميمها للتعبير عن أو إسكات الجينات على مستوى الجينوم ، يسرع من التوسع السريع لهذه التكنولوجيا الموجهة. في المراجعة الحالية ، نقوم بتقييم التطورات في تكنولوجيا ناقلات الفيروس البطيئة ، بما في ذلك علم الفيروسات البطني الأساسي ، وتصميمات النواقل لتحسين الكفاءة والسلامة البيولوجية ، وبروتوكولات إنتاج الناقل والعدوى ، وتسليم الجينات المستهدفة ، والتطبيقات المتقدمة للفيروسات البطيئة والقضايا المرتبطة بنظام النواقل.

مجلة

مجلة الكيمياء الحيوية & - مطبعة بورتلاند

نشرت: 1 مايو 2012

الكلمات الدالة: استهداف الخلايا ، السبيل المركزي البولي (cPPT) ، العلاج الجيني ، HIV-1 ، الفيروس البطيء ، التعطيل الذاتي (SIN)