معلومة

هل يتحلل الكازين في الماء نفس الشيء مثل أحماض الكازامينو؟

هل يتحلل الكازين في الماء نفس الشيء مثل أحماض الكازامينو؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ربما يكون سؤال غبي ، لكن هذه تبدو متطابقة. إذا كان البروتوكول يستدعي أحدهما ، فهل يمكنني استخدام الآخر بدلاً من ذلك؟


تقريبًا ، نعم هما متشابهان ، لكن هناك اختلافات في المعالجة - الاختلاف الحقيقي هو التصفية. لن يتم ترشيح المنتج الذي يحتوي ببساطة على هيدروزيلات الكازين إلا بالكثير من الببتيدات (مثل منتجات بناء الجسم). بينما يجب أن تكون أحماض الكازامينو في الأساس أحماض أمينية نظيفة / خالية (مثل العناصر الغذائية للبكتيريا).

ستكون طرق التصنيع الفعلية مملوكة للشركة المصنعة ... ولكن يمكنك الوثوق في أنها تقوم بشكل أساسي بكل ما هو أفضل للحصول على الأحماض الأمينية الفردية و / أو أي شيء أرخص للحصول على منتج صالح للاستخدام.

لقد استخدمت كمال الأجسام والعديد من الأصناف الأخرى من منتجات الكازين لزراعة البكتيريا. لقد وجدت أنه على الرغم من أن العديد من المنتجات قد تنجز المهمة ، إلا أن هناك بعض العيوب الخطيرة لمنتجات الكازين غير المخصصة لنمو البكتيريا.

تشمل الاختلافات وضوح الوسائط ، وتنظيف الأواني الزجاجية / المخمر / المفاعل الحيوي ، وتفاقم الوسائط الهوائية ، والكائنات الحية الدقيقة. بعض الكائنات الحية الدقيقة لا تنمو بشكل جيد جدًا ، وعمومًا ، تلك التي قد لا تستطيع النمو بنفس الجودة أو بسرعة ... لذلك قد تكون نسبة 10٪ أو 20٪ من الكائنات الحية الدقيقة مهمة (أو ربما لا تنمو نظرًا لأن سعر الجودة قد يكون 10 مرات أعلى).

يجب أن يقيّم المزارع ميزات الجودة مقابل السعر. أنا شخصياً ، أحيانًا أقوم بتعقيم منتج الكازين الرخيص في وعاء واحد (سهل التنظيف) ثم قم بترشيحه في وعاء آخر (ثم تعقيمه مرة أخرى) من أجل نمو البكتيريا ... ولكن هذا لأن لدي حوالي ألف رطل من هيدروزيلات الكازين الخام ، وفقط كيلوغرام أو نحو ذلك من أحماض الكازامينو (لدراسات خاصة). هذه الطريقة لا تقضي على جميع المشاكل ولكنها تقلل بعضها.


عزل وفحص الفطريات الشعاعية المنتجة لمواد مضادة للميكروبات من بيئة حيوية مغربية متطرفة

1 فريق التكنولوجيا الحيوية والبيئة ومختبر الموارد الطبيعية والبيئة ، قسم الأحياء والجيولوجيا والكيمياء ، كلية تازة متعددة التخصصات ، جامعة سيدي محمد بن عبد الله ، فاس 30050 ، المغرب

سمية آيت عسو

2 فريق التكنولوجيا الحيوية الميكروبية ، معمل التكنولوجيا الحيوية ، كلية العلوم ، ظهر المحراز ، قسم الأحياء ، جامعة سيدي محمد بن عبد الله ، فاس 30050 ، المغرب

محمد الحسوني

2 فريق التكنولوجيا الحيوية الميكروبية ، معمل التكنولوجيا الحيوية ، كلية العلوم ، ظهر المحراز ، قسم الأحياء ، جامعة سيدي محمد بن عبد الله ، فاس 30050 ، المغرب


قصص ذات الصلة

أعلى تعليقات

تأتي قائمة مكونات اللقاح هذه من مركز السيطرة على الأمراض. هذا ما يعنيه الناس عندما يقولون أجروا أبحاثكم الخاصة.
تكشف قنبلة وثيقة CDC عن قائمة بجميع سواغ اللقاح ، بما في ذلك "خلايا الكلى القرد الأخضر الأفريقي" وخلايا الخلايا الليفية من الأجنة البشرية المجهضة ... انظر القائمة الكاملة
الإثنين 06 مارس 2017 بواسطة: مايك آدامز
الكلمات الدليليلة: خلايا كلى القرد الأفريقي، CDC، سواغات، خلايا جنينية، مكونات، سموم، لقاحات
46 ك
الآراء
الصورة: قنبلة وثيقة CDC تكشف عن قائمة بجميع سواغ اللقاح ، بما في ذلك "خلايا الكلى القرد الأخضر الأفريقي" وخلايا الخلايا الليفية من الأجنة البشرية المجهضة ... انظر القائمة الكاملة

(أخبار طبيعية) لا أحد تقريبًا لديه أي فكرة حقيقية عما يوجد في اللقاحات. عندما يسمحون لأنفسهم بالحقن باللقاحات ، فإنهم يتجاهلون حقيقة أنه يتم حقنها بخطوط خلايا جنينية بشرية مجهضة أو خلايا صديد الكلى القرد الأفريقي الأخضر المأخوذة من الرئيسيات المصابة بالمرض. (انظر الدليل من CDC أدناه.)

ومع ذلك ، من المدهش أن مراكز السيطرة على الأمراض (CDC) تعترف صراحة بكل هذا (وأكثر). في ملف PDF منشور على موقع CDC بعنوان "سواغ اللقاح وملخص الوسائط" ، يسرد مركز السيطرة على الأمراض جميع السواغات المستخدمة حاليًا في اللقاحات التي يتم حقنها في البالغين والأطفال في جميع أنحاء الولايات المتحدة. وفقًا لمركز السيطرة على الأمراض ، قائمة CDC ، الحالية اعتبارًا من 6 يناير 2017 ، تم "استخلاصها من إدراج حزم الشركات المصنعة".

تم العثور على القائمة الكاملة في مستند CDC هذا (PDF). في حالة قيام مركز السيطرة على الأمراض بإزالته - نظرًا لأنه عُرف عنهم فجأة أنهم مستندات "ثقب الذاكرة" التي لا يريدون أن يراها الجمهور - فقد نشرنا أيضًا نسخة على خوادم Natural News (PDF).

من المعروف على نطاق واسع أن خط الخلايا WI-38 "مشتق من أنسجة الرئة لجنين أنثى أبيض (قوقازي) مجهض" ، كما يعترف موقع ويكيبيديا المؤيد للقاح. كما يوضح معهد Coriell Institute للأبحاث الطبية حول خط خلايا MRC-5 / WI-38:

تم تطوير خط الخلايا MRC-5 في سبتمبر 1966 من أنسجة الرئة المأخوذة من جنين تم إجهاضه لمدة 14 أسبوعًا لأسباب نفسية من امرأة تبلغ من العمر 27 عامًا تتمتع بصحة جسدية. شكل الخلية يشبه الخلايا الليفية. النمط النووي هو 46 ، ذكر ثنائي الصبغيات عادي XY. التضاعف التراكمي للسكان للشيخوخة هو 42-48. إنزيم G6PD من النوع B.

أصبحت خلايا الأنسجة الجنينية البشرية قضية غضب لدرجة أن الفاتيكان أصدر بيانًا بشأن استخدامها ، تناولوا فيه ، "اللقاحات التي تحتوي على فيروسات حية تم تحضيرها من سلالات الخلايا البشرية من أصل جنيني ، باستخدام أنسجة من مجهضة. الأجنة البشرية كمصدر لهذه الخلايا ". يمكنك العثور على رد الفاتيكان على هذا الرابط ، حيث يناقشون القضايا الأخلاقية والمعنوية لـ "مبدأ التعاون المشروع في الشر".

أدناه ، ستجد القائمة الكاملة التي نشرها مركز السيطرة على الأمراض (CDC) ، تم إلغاء تكرارها وفرزها أبجديًا. لاحظ أن هذه المكونات تشمل معادن سامة (أملاح الألومنيوم) ، وخلايا حيوانية غريبة من البشر ، والقرود ، والأبقار ، والخنازير ، والدجاج ، والمكونات المشتقة من الكائنات المعدلة وراثيًا ، والعنصر المشع الباريوم ، والمواد الكيميائية للتلوين الاصطناعي ، والسموم المثيرة مثل الغلوتامات ، وعوامل التطهير الكيميائية (Triton X-100) ، سلالات بكتيرية خطيرة (E.coli) ، مواد كيميائية سامة مثل الجلوتارالدهيد ، الثيميروسال (الزئبق) وأكثر من ذلك بكثير.

لا أحد يستطيع دحض أي من هذا لأنه اعترف به من قبل CDC نفسها.

سيتم نشر المزيد من التحليل لسمية هذه المكونات في Vaccines.news و Natural News.

إليك ما يحدث لبعض الأطفال عند حقنهم بهذه السموم:

القائمة الكاملة لسواغ اللقاح التي نشرتها مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها ، اعتبارًا من 6 يناير 2017


الاستخدام الانتقائي للأحماض الأمينية الخارجية بواسطة Dehalococcoides ethenogenes Strain 195 وتأثيراته على نشاط النمو وإزالة الكلور

رسم بياني 1 . جزء الكتلة من الأحماض الأمينية البروتينية المنشأ غير المسماة (جزء M0) من سلالة D. ethenogenes 195 (▩) و E. coli K-12 MG1655 (□).

تأثير الأحماض الأمينية على الصفات الفسيولوجية لسلالة D. ethenogenes 195.

الصورة 2 . ملامح إزالة الكلور بواسطة D. سلالة ethenogenes 195 المعدلة بـ 0 (AA0) ، 1 (AA1) ، 4 (AA4) ، أو 20 (AA20) من الأحماض الأمينية بعد خمس ثقافات فرعية. البيانات المعروضة هي القيم المتوسطة من التجارب الحيوية الثلاثية ، حيث تمثل أشرطة الخطأ انحرافًا معياريًا واحدًا. تين. 3 . منحنيات النمو لسلالة D. ethenogenes 195 المعدلة بـ 0 (AA0) ، 1 (AA1) ، 4 (AA4) ، أو 20 (AA20) من الأحماض الأمينية بعد خمس ثقافات فرعية. البيانات المعروضة هي القيم المتوسطة من التجارب الحيوية الثلاثية ، حيث تمثل أشرطة الخطأ انحرافًا معياريًا واحدًا.

تجاوز القيود الجينية أثناء تطور الطفرات لمقاومة المضادات الحيوية

يمكن أن تمنع القيود الجينية العديد من المسارات الطفرية للأنماط الجينية المثلى في المناظر الطبيعية للياقة البدنية الحقيقية ، ولكن لا يزال يتعين تحديد المدى الذي يمكن أن يحد من التطور به. ومن المثير للاهتمام ، أن البكتيريا الطافرة ترفع فقط أنواعًا معينة من الطفرات ، وبالتالي يمكن أن تكون حساسة جدًا للقيود الجينية. لا يعتبر اختبار هذا الاحتمال مناسبًا سريريًا فحسب ، بل يمكنه أيضًا الإبلاغ عن التأثير العام للقيود الجينية في التكيف. هنا ، قمنا بتطوير 576 مجموعة من طافرين وواحد من النوع البري الإشريكية القولونية لمضاعفة تراكيز المضاد الحيوي سيفوتاكسيم. حملت جميع السلالات TEM-1 ، وهو إنزيم بيتا لاكتاماز معروف جيدًا بتوافره المنخفض للمسارات الطفرية. بشكل حاسم ، لا يرفع أحد الطفرات أيًا من طفرات الخطوة الأولى ذات الصلة المعروفة بتحسين نشاط سيفاتوكسيمز. على الرغم من ذلك ، أظهر كلا الطافرين قدرة مماثلة على تطوير مقاومة أكثر من 1000 ضعف. بدأ التكيف الأولي بالتوازي من خلال آليات المقاومة العامة للأدوية المتعددة. في المقابل ، تم تحقيق مقاومة عالية المستوى من خلال مسارات متباينة مع بداهة طافرة أدنى تستغل المسارات الطفرية البديلة في PBP3 ، هدف المضاد الحيوي. هذه النتائج لها آثار على إدارة الطفرات في العدوى السريرية ، وبشكل عام ، توضح أن حدود الانتقاء الطبيعي في الكائنات الحية الحقيقية يتم تخفيفها من خلال وجود مواقع متعددة تساهم في اللياقة.

1 المقدمة

من الرؤى المدهشة المكتسبة خلال العقد الماضي من البحث أن التفاعلات المعرفية شائعة في مناظر اللياقة البدنية التجريبية [1]. من الأمور ذات الأهمية الخاصة ملاحظة نوع خاص من الإبستاس يسمى "علامة الإبستاس" [2] ، والتي بموجبها تكون الطفرات مفيدة أو ضارة اعتمادًا على وجود أو عدم وجود الآخرين [3-8]. في ظل وجود اللافتات ، تعرض مجموعات الطفرات المجاورة قيم لياقة متناقضة ، مقدمة "الصلابة" في سطح مشهد اللياقة البدنية. يمكن أن يكون لهذه الميزة نتيجتان تطوريتان هامتان على الأقل. أولاً ، يولد مسارات طفرية لم تعد خطواتها الوسيطة مرتبة ترتيبًا تصاعديًا. لذلك ، يتناقص عدد المسارات التي يمكن الوصول إليها عن طريق الانتقاء الطبيعي [2] ويصبح التكيف الناجح مرهونًا بهوية طفرات الخطوة الأولى [7]. النتيجة الثانية الأكثر خطورة هي ظهور قمم اللياقة المتعددة ، والتي تتطلب شكلاً متطرفًا بشكل خاص من الإبستاس يُعرف باسم epistasis الإشارة التبادلية [9]. بشكل عام ، أدت هذه الملاحظات إلى التخمين بأن الانتقاء الطبيعي قد يكون مقيدًا بالقيود الجينية المنتشرة ، مما ساهم في تفسير الدرجة المدهشة من التكرار التي لوحظت في العديد من تجارب التطور الميكروبي [10،11].

إحدى الحالات التي يُفترض أنها مناسبة جيدًا للتحقيق في تأثير القيود الجينية على التكيف هي حالة الطفرات البكتيرية. كثيرًا ما يتم عزل البكتيريا ذات معدل الطفرات العالية في البيئات السريرية [12 ، 13] وفي تجارب التطور المخبرية [14 ، 15]. ظهورهم هو نتيجة نهائية للتركيب الجيني للاجنسيين ، والذي يسمح للأليلات الطافرة بالانتقال مع الطفرات المفيدة التي تحدث في نفس الجينوم [16 ، 17]. تشكل المطفرات قلقًا خطيرًا في حالات العدوى السريرية لأنها يمكن أن تطور بسهولة المزيد من التكيفات ، مثل تلك التي تعزز تهرب الجهاز المناعي [18] ، أو تزيد المقاومة للمضادات الحيوية [19] أو تخفف من تكلفة مقاومة المقاومة [20]. ومع ذلك ، تُظهر الطفرات المختلفة ميلًا مميزًا لرفع بعض أنواع التحولات أو الانقلابات أو انزياحات الإطارات فقط. وذلك لأن الأنماط الظاهرية للطفرات تنشأ من التغيرات في آليات تجنب الطفرات المحددة ، والتي يسمح خللها بتراكم فئات طفرات معينة [21].

هنا ، افترضنا أن مثل هذه الخصوصية الطفرية يمكن أن تجعل الطفرات حساسة بشكل خاص للقيود الجينية. من المتوقع أن يزيد كل نمط وراثي متحور من معدل حدوث مجموعة فرعية عشوائية من طفرات الخطوة الأولى المفيدة [22]. إذا لم تتضمن هذه المجموعة الفرعية أفضل الطفرات الممكنة ، يمكن إجبار مجموعات الطفرات على اتباع مسارات دون المستوى الأمثل - إما تؤدي إلى نفس ذروة اللياقة أو إلى ذروة لياقة مختلفة. علاوة على ذلك ، في الحالات التي كانت فيها الخطوات الأولية محدودة بشكل كبير ، قد لا تكون الطفرات التي تفشل في رفع طفرات الخطوة الأولى ذات الصلة أكثر قدرة على التكيف من نظيرتها من النوع البري. يمكن أن تحدث مثل هذه الظروف الصارمة عندما يتطلب التكيف استبدالات محددة جدًا للأحماض الأمينية ، كما لوحظ في بعض حالات مقاومة المضادات الحيوية [8،23].

لدراسة هذه الاحتمالات ، وصفنا تطور سلالات من النوع البري والطفرات الإشريكية القولونية نحو زيادة المقاومة للمضادات الحيوية من الجيل الثالث β-lactam cefotaxime (CTX). سعى تصميمنا التجريبي إلى تتبع الطفرات في الترميز الجيني لإنزيم β-lactamase TEM-1 (جيش تحرير بلوختيم -1). يتنوع الأليل الأصلي ، الذي تم تكييفه جيدًا مع التحلل المائي المبكر للبيتا لاكتام ، بشكل طبيعي من خلال تراكم الطفرات النقطية إلى مئات المتغيرات مع نشاط أكبر ضد المركبات اللاحقة من هذه العائلة [24]. تمت محاكاة هذا التطور الطبيعي على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التجارب المعملية ، مما أسفر عن نموذج TEM-1 باعتباره أحد أفضل النماذج المميزة لدراسة التطور الجزيئي [7،25–27].

في حالة الطفرات المحددة التي تمنح مقاومة CTX ، هناك عدة عشرات من البدائل المعروفة لزيادة النمط الظاهري للمقاومة [26]. على الرغم من العدد الهائل المحتمل للتوليفات بين هؤلاء ، إلا أنه تمت ملاحظة جزء صغير فقط بشكل متكرر في كل من الطبيعة وفي تجارب التطور المخبرية - علامة على القيود المعرفية [7،24]. ومن المثير للاهتمام ، أننا أدركنا أن بدائل مقاومة CTX الأكثر شيوعًا التي لوحظت في العزلات الإكلينيكية تنشأ من التحولات G: C → A: T ، وهي واحدة من اثنين من تغيرات النيوكليوتيدات السائدة في طيف السلالات التي تعاني من نقص في الإصلاح ، وهي أكثر أنواع البكتيريا القوية انتشارًا. الطفرات [28]. تتضمن هذه البدائل G238S و E104K الأعلى تصنيفًا ، والتي تظهر مجتمعة في العديد من أليلات TEM التي تحدث بشكل طبيعي ، والاستبدالات R164H و A237T [24،26]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن خاصية الانتقال الأخرى لهذه الطفرات (A: T → G: C) تولد أيضًا بدائل ذات صلة سريريًا ، مثل M182T و H153R و I173V [24،26]. قمنا بعد ذلك بفحص حالة الطفرات التي تعاني من نقص في MutT ، وهي ثاني أكثر أنواع البكتيريا الطافرة القوية انتشارًا [28]. في تناقض حاد ، لا يتطابق ارتفاع تحويلات A: T → C: G الخاصة بهذه الخلفية مع أي من طفرات مقاومة CTX الشائعة الموجودة في العزلات الطبيعية [26]. تم وصف البدائل ذات التأثير المتوسط ​​إلى المنخفض (S268R و E240A و E104A و F72V) ، ومع ذلك فقد لوحظت حصريًا في البيئات المختبرية [26].

لقد استنتجنا أن تطور مقاومة CTX يمكن أن يكون نموذجًا مناسبًا لفحص المدى الذي يمكن أن يؤدي فيه التوافر المحدود للمسارات الطفرية إلى إعاقة تطور الطفرات البكتيرية. تعد دراسة هذا الاحتمال وثيق الصلة بالموضوع ، ليس فقط بسبب الأهمية السريرية للطفرات ، ولكن لأنها يمكن أن تقدم أيضًا معلومات حول السؤال الأكثر عمومية حول تأثير القيود الجينية في التطور. وبالتالي قمنا بنشر 192 مجموعة مستقلة من بشكل متسلسلالمغفل الطفرة ، عدم تطابق إصلاح ناقص ΔmutH المتحور والبرية بكتريا قولونية في وجود تراكيز متزايدة بشكل دوري من CTX. بشكل حاسم ، توقعنا أن أداء Δالمغفل تعتمد على قدرتها على استغلال المسارات الطفرية النادرة المتوافقة مع طيفها الطفري الضيق. لقد توقعنا أيضًا أن أي اختلافات تعتمد على الطيف سيتم تسويتها من خلال زيادة عامة في عرض الطفرات المفيدة. الأساس المنطقي لذلك هو أن هذه الزيادة ستفضل أن تكون أفضل الطفرات متاحة للاختيار ، بغض النظر عن الخلفية الجينية. لاختبار ذلك ، في الإعداد التجريبي ، يحمل نصف السكان لكل سلالة نسخة كروموسومية واحدة من بلوختيم -1، بينما يحتوي النصف المتبقي على ما يقرب من 18 نسخة بلازميدية من هذا الأليل [29]. بشكل عام ، أنشأنا ستة إعدادات تجريبية (ثلاثة أطياف طفرية مع جرعتين من الجينات) ، لما مجموعه 576 مجموعة تجريبية.

2. النتائج

(أ) ديناميات التكيف مع زيادة تركيزات المضادات الحيوية

لاختبار ما إذا كانت الأطياف الطفرية المختلفة تمنح قدرة متباينة على تطوير مقاومة عالية المستوى ومتعددة الخطوات لـ CTX ، قمنا بتمرير بكتيريا من النوع البري والمتحور بشكل متسلسل لمضاعفة تركيزات الدواء بدءًا من 1/4 إلى 1024 ضعف التركيز المثبط الأدنى (MIC ) من سلالة الأجداد. بشكل عام ، تظهر النتائج أن الزيادة في العرض الطفري ، إما من خلال النمط الظاهري للطفرة أو عن طريق النسخ البلازميدية المتعددة من بلوختيم -1، يُترجم إلى جزء أكبر من التكرارات الباقية في نهاية التجربة (الشكل 1). من الناحية الكمية ، وجدنا علاقة خطية قوية بين العدد النهائي للناجين والمنتج المقدر لمعدل الطفرة و جيش تحرير بلوختيم -1 رقم النسخة (بيرسون ص = 0.87, ص = 0.026 مادة تكميلية إلكترونية ، الشكل S1). يشير هذا إلى أن ملف ΔmutT النمط الجيني ، على الرغم من عدم رفع الطفرات إلى مقاومة CTX النموذجية بلوخTEM-1 الطفرات ، لا يتم إعاقتها على نطاق واسع لتطوير مستويات عالية من المقاومة.

الشكل 1. التطور التجريبي للنوع البري والطفرة بكتريا قولونية لمقاومة CTX. يوضح الشكل عدد السلالات الباقية على قيد الحياة ضد تركيز المضادات الحيوية ، والتي تضاعفت كل يومين. المنحنيات المختلفة تتوافق مع النوع البري (المربعات السوداء) ، ΔmutH (دوائر حمراء) و Δالمغفل (مثلثات زرقاء) سلالات تحمل أحدهما (أ) أو متعددة (ب) نسخ من الترميز الجيني لـ β-lactamase TEM-1. بشكل عام ، زيادة إما في معدل الطفرات أو في بلوختيم-1 رقم النسخة يترجم إلى عدد أكبر من الناجين النهائيين. لاحظ أن الميزة المتوقعة لـ ΔmutH على Δالمغفل لم يتم إدراك الطفرات ، على الرغم من كونها الوحيدة التي ترفع الطفرات إلى البدائل المعروفة الأكثر فائدة في TEM-1 (انظر النص للحصول على التفاصيل).

في ال جيش تحرير بلوختيم -1 إعداد نسخة واحدة ، الميزة المتوقعة لـ ΔmutH على Δالمغفل لم يلاحظ النمط الجيني (الشكل 1أ). في الواقع ، كان العدد النهائي للناجين أكبر في Δالمغفل من ΔmutH الخلفية (9/96 مقابل 3/96) ، على الرغم من أن القيم ليست مختلفة إحصائيًا (اختبار فيشر الدقيق ، ص = 0.1332). من الجدير بالذكر أن 18mutH انقرض السكان قبل الأوان عند 2 مجم / لتر من CTX ، وهو انخفاض كبير في منحنى البقاء على قيد الحياة (اختبار التصنيف اللوغاريتمي ، ص & lt 0.001) والتي قد تعكس طريقًا تطوريًا مسدودًا مبكرًا مرتبطًا بطيفها الطفري. فيما يتعلق بلوختيم -1 إعداد النسخ المتعددة ، لم نجد أي تناقضات بين الخلفيات المتحولة (الشكل 1ب) ، ولا من حيث العدد النهائي للناجين (اختبار فيشر الدقيق ، ص = 0.5354) ولا في منحنيات البقاء (اختبار رتبة السجل ، ص = 0.808).

كما هو موضح في المقدمة ، الأكثر شيوعًا جيش تحرير بلوختيم -1 تنشأ بدائل مقاومة CTX بشكل أساسي من التحولات التي ترتفع فقط في ΔmutH النمط الجيني [21]. مع أخذ هذا في الاعتبار ، فإنه يكشف عن مقارنة أداء النوع البري الذي يأوي البلازميد (الشكل 1ب) مع أن كلا المجموعتين المتحورتين تحمل نسخة واحدة جيش تحرير بلوختيم -1 (شكل 1أ).يمنح عدد النسخ المتزايد القدرة على الوصول إلى مقاومة عالية مماثلة لقابلية التحوّل المفرط (7/96 مقابل 9/96 و 3/96 الاختبار الدقيق للناجين النهائيين فيشر ، ص & gt 0.3) ، على الرغم من أن منحنى بقاء النوع البري فريد بشكل ملحوظ (اختبار ترتيب السجل ، ص & lt 0.0001). يشير هذا إلى أن المسارات التطورية التي تتبعها السلالات المختلفة ليست مجرد نتيجة لتراكم السلالات المعروفة جيش تحرير بلوختيم -1 بدائل مقاومة CTX. إذا كان الأمر كذلك ، فمن المتوقع أن يعمل النوع البري بشكل أفضل من Δالمغفل سلالة ، لأن الأخير غير متحور لهذه البدائل النموذجية في حين أن الأولى يجب أن تنتجها بمعدل أعلى بحوالي 18 ضعفًا [29]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ΔmutH يجب أن يتمتع التركيب الوراثي بأفضل نتيجة ، لأنه يرفع التحولات المطلوبة بحوالي 100 إلى 300 ضعف [30 ، 31].

قد يفسر احتمالان غير متعارضين على الأقل هذه النتائج. أولاً ، كلاهما Δالمغفل ويمكن أن تحل السلالات من النوع البري محل غير الكنسي جيش تحرير بلوختيم -1 طفرات مقاومة CTX. وبالتالي ، قد يستفيد النوع البري من حقيقة أن الزيادة في عدد النسخ لا ترفع التحولين فحسب ، بل ترفع أيضًا جميع البدائل الأساسية الستة الممكنة. على الرغم من أن التأثير على كل نوع من أنواع الطفرات معتدل ، فإن الارتفاع الكلي في العرض الطفري يصبح مشابهًا للارتفاع ΔmutH معرفتي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التنوع الأليلي الأكبر المتولد قد يغذي التطور من خلال إعادة التركيب المتماثل بين البلازميد [32] (على الرغم من أن المادة التكميلية الإلكترونية ، فإن الشكل S1 لا يعطي دعمًا واضحًا لهذه الفرضية). بدوره ، Δالمغفل ترفع السلالة نوعًا واحدًا فقط من الاستبدال الأساسي (A: T → C: G transversions) ، لكنها تفعل ذلك بحوالي 500 إلى 10000 ضعف [30،33] وهي زيادة ضخمة قد تسمح لهذا النمط الجيني بالتراكم بشكل نادر. جيش تحرير بلوختيم -1 بدائل مقاومة CTX.

الاحتمال الثاني هو أن المواضع الصبغية الأخرى لعبت دورًا جوهريًا في اكتساب أنماط ظاهرية عالية المقاومة. يجب أن يؤدي توسيع حجم الهدف الطفري ، من حيث المبدأ ، إلى التخفيف من الاختلافات المعتمدة على الطيف ، مما قد يفسر عدم وجود ضعف ملحوظ في الكروموسومات. جيش تحرير بلوختيم -1-التشفير ΔmutT الطراز العرقى. تشمل المواضع المرشحة الجينات التي تتحكم في محددات مقاومة الأدوية المتعددة ، مثل مضخات التدفق وقنوات بورين وتلك المكوّنة للبروتينات الرابطة للبنسلين ، وهي الهدف من المضادات الحيوية بيتا لاكتام [34].

(ب) التوصيف المظهري للأنساب المتطورة

لاكتساب نظرة ثاقبة على آليات المقاومة المفترضة غير β-lactamase ، قمنا بتجميع مجموعة من 160 عزلة نسيلية واختبرناها ضد مجموعة من المواد الكيميائية والمضادات الحيوية وفيروسات العاثية. يتألف الجزء الأكبر من المجموعة من عزلات نقطة النهاية من: (1) السلالات التي نجت في نهاية التجربة (ن = 50) ، و (2) أعلى السلالات المقاومة داخل كل إعداد انقرض قبل نهاية التجربة (ن = 57). للتعويض عن انقراض معظم مجموعات الطفرات في وقت متأخر جدًا ، تم إكمال المجموعة بـ 43 نسخة من سلالات عشوائية معزولة بتركيزات منخفضة من CTX (أقل من أو تساوي 0.5 مجم لتر -1). تم تصميم بطارية المقايسات (انظر المواد والطرق) لفحص حالة AcrAB ، ومضخة التدفق الرئيسية المشاركة في تصدير β-lactam [35] والغشاء الخارجي porins OmpF و OmpC ، وهما المسارات الأولية لدخول هذه الأدوية [ 36]. لتقييم صحة الاختبارات ، حدد الموقع أكرا, أكرب, acrR, envZ ، ompR, ompF و ompC تم تسلسلها في سلالتين مستقلتين إيجابيتين لتعديلات التدفق والبورين. أكدت كلتا السلالتين حدوث طفرات نقطية غير مترادفة في العديد من هذه الجينات: أكرب و acrR في كلتا الحالتين ، جنبًا إلى جنب مع إنفز و ompC في حالة واحدة و ompR في الآخر (انظر المواد التكميلية الإلكترونية ، الجدول S1).

أظهرت المجموعة تواترًا عاليًا من الأنماط الظاهرية المتغيرة للبورين (79٪) وبدرجة أقل ، زيادة الأنماط الظاهرية للتدفق (43٪ شكل 2) - تركيبة تُلاحظ عادةً في العزلات المقاومة للأدوية المتعددة [37]. بشكل مثير للاهتمام ، وجدنا أن 20٪ من السلالات تظهر حساسية مفرطة للإريثروميسين ، وهو ركيزة معروفة من أكراب [38]. يمكن أن يكون هذا النمط الظاهري ناتجًا ثانويًا للطفرات التي تعمل على تحسين خصوصية AcrAB لـ CTX ، على حساب تقليل بثق الاريثروميسين [39]. بدلاً من ذلك ، يمكن أن ينشأ من طفرات في جهاز التوليف الببتيدوغليكان (بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر PBP3 ، الهدف الجزيئي لـ CTX) ، مع تأثيرات متعددة الاتجاهات في تنظيم الغشاء الخارجي مما يؤدي إلى الانتشار السلبي المعزز للعوامل الكارهة للماء مثل الإريثروميسين [40]. مهما كانت الآلية ، فقد أبلغنا عن هذا النمط الظاهري نظرًا لانتشاره ، والذي قد يكون أقل من الواقع نظرًا للتكرار المرتفع للأنماط الظاهرية المتزايدة للتدفق الملحوظ. 11٪ فقط من العزلات لم تظهر أي تغير واضح في أي من هذه الطرز المظهرية.

الشكل 2. الملامح المظهرية للحيوانات المستنسخة التمثيلية المتطورة. تمثل القضبان تواتر العزلات التي تظهر تغيرات في النفاذية (أسود) ، وتدفق (رمادي غامق) وقابلية فرط الحساسية للإريثروميسين (رمادي فاتح). الأشرطة البيضاء تتوافق مع العزلات بدون تعديلات. (أ) الملامح المظهرية للسلالات البرية والطفرة. تم العثور على الفروق فقط في فرط الحساسية الاريثروميسين لتكون ذات دلالة إحصائية (انظر النص الرئيسي). (ب) السمات المظهرية حسب تركيز المضاد الحيوي الذي تم عزل الحيوانات المستنسخة منه. لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية بين الاستنساخ المبكر والمتأخر. تشير هذه النتائج إلى أن المقاومة العامة للأدوية المتعددة تطورت مبكرًا وبالتوازي عبر الخلفيات المختلفة ، وبالتالي فهي ليست كافية لشرح أنماط البقاء النهائية.

لم يتم اكتشاف فروق ذات دلالة إحصائية بين الأنماط الجينية الثلاثة (اختبار فيشر الدقيق ، ص & GT 0.15 الشكل 2أ). الاستثناء الوحيد هو فرط الحساسية للإريثروميسين ، على الأقل 10 مرات أكثر تكرارا في أي من الطفرات مقارنة بالخلفية البرية (اختبار فيشر الدقيق ، ص = 0.00014) مما يشير إلى أن هذا النمط الظاهري قد ينشأ فقط من طفرات نقطية قليلة ومحددة للغاية. لم نجد أيضًا فروقًا ذات دلالة إحصائية بين الحيوانات المستنسخة المعزولة من تركيزات CTX المبكرة والمتأخرة (أقل من أو تساوي 0.5 مقابل أكثر من أو تساوي 16 مجم لتر -1 ، اختبار فيشر الدقيق ، ص & GT 0.3 الشكل 2ب). مجتمعة ، تشير النتائج إلى أن تكيفات التدفق والنفاذية قد تم الحصول عليها مبكرًا وبالتوازي عبر الأنماط الجينية المختلفة ، وبالتالي فهي ليست كافية لشرح أنماط البقاء النهائية.

(ج) التوصيف الوراثي للأنساب المتطورة

بالنظر إلى الأدلة المقدمة أعلاه ، فقد توصلنا إلى أن المقاومة عالية المستوى قد تكون نتيجة إما غير متعارف عليه جيش تحرير بلوختيم -1 بدائل أو مزيج من جيش تحرير بلوختيم -1 بدائل مع تعديلات في fts، الترميز الجيني للهدف الرئيسي لـ CTX (ترانسببتيداز PBP3). لاستكشاف هذه الاحتمالات ، قمنا بتسلسل كلا الموقعين من مجموعة فرعية من 70 سلالة من مجموعة العزلات المستخدمة في فحوصات النمط الظاهري (انظر المادة التكميلية الإلكترونية ، الجدول S2).

وجدنا 21 من أصل 70 سلالة إيجابية لغير المترادفات جيش تحرير بلوخTEM-1 الاستبدالات ، وكلها تنتمي إلى إعداد النسخ المتعددة (ن = 44 انظر المواد التكميلية الإلكترونية ، الجدول ق 2). فقدان أو عدم كفاية التعبير عن الكروموسومات جيش تحرير بلوخ الجين في إعداد نسخة واحدة (ن = 26) لأن جميع العزلات التي تم تحليلها احتفظت بمقاومة حساسة للمثبط للأمبيسيلين (البيانات غير معروضة). في المجموع ، حددنا 27 طفرة تقابل خمسة تغييرات فقط في الأحماض الأمينية (E104K ، H153R ، R164S ، M182T و G238S الشكل 3أ). أدت هذه الاستبدالات إلى ظهور خمسة أليلات مختلفة ، بما في ذلك أليلات TEM15 و TEM112 ثنائية الطور ، وأليل TEM52 ثلاثي الطور (انظر المواد التكميلية الإلكترونية ، الجدولين S2 و S3). تم بالفعل وصف كل هذه البدائل والأليلات في كل من الدراسات السريرية والتجريبية ، ويمكن قراءة التفاصيل المتعلقة بها في مكان آخر [24]. كان تغيير الأحماض الأمينية الأكثر شيوعًا في مجموعة البيانات الخاصة بنا هو G238S (20/27) ، بما يتفق مع انتشاره في التقارير السابقة [7،41]. كما هو متوقع ، نشأت معظم الطفرات من انتقالات G: C → A: T أو A: T → G: C. كان الاستثناء الوحيد هو R164S ، الناشئ عن تحويل C: G → A: T ، الذي تم اكتشافه فقط في عزلة واحدة من النوع البري. نتيجة لذلك ، ليس من المستغرب أن ΔmutH كانت الخلفية حيث لوحظ الجزء الأكبر من الاستبدالات (16/27 الشكل 3أ) ، وكذلك أظهر ذلك أعلى متوسط ​​عدد من الاستبدالات لكل تسلسل (1.25 مادة تكميلية إلكترونية ، الشكل S2).

الشكل 3. بدائل في TEM-1 و PBP3 الناتجة عن سلالات من النوع البري والطفرات. يوضح الرسم البياني وفرة بدائل الأحماض الأمينية المختلفة بين 70 عزلة من النوع البري (أسود) ،mutH (أحمر) و Δالمغفل السكان (الأزرق). (أ) البدائل في TEM-1. (ب) البدائل في PBP3 ، مجمعة عن طريق مطابقة تغير النوكليوتيدات الأساسي مع الطيف الطفري لـ Δالمغفل (A: T → C: G ، يسار) ، ΔmutH (G: C → A: T and A: T → G: C ، مركز) وخلفيات من النوع البري (أخرى ، على اليمين). لاحظ المستويات المتناقضة للخصوصية الجزيئية التي لوحظت في كلا البروتينين ، مما يشير إلى أن المسارات الطفرية مقيدة في TEM-1 أكثر من PBP3.

فحص fts كشف locus عن 54 من أصل 70 سلالة تعرض بدائل غير مترادفة ، مع درجة عالية بشكل ملحوظ من تعدد الأشكال. حددنا 92 طفرة نقطة (34 فريدة) ، تؤثر على 31 وظيفة ، وهو ما يمثل ما مجموعه 39 أليلات مختلفة (الشكل 3ب والمواد التكميلية الإلكترونية ، الجدولان S2 و S3). لقد ارتبطت بعض هذه المتغيرات بالفعل بمقاومة المضادات الحيوية بيتا لاكتام ، إما في السلالات المختبرية من بكتريا قولونية (A257V و N361S) [42،43] أو في الأنواع ذات الصلة مثل السالمونيلا المعوية (P311S) [44] و المستدمية النزلية (L369F) [45]. جميع البدائل باستثناء واحدة تم تعيينها داخل وحدة transpeptidase (D237 – V577) لبروتين PBP3 ، متجمعة في محيط الأشكال التحفيزية الثلاثة (STVK310 و SSN361 و KTG496) [46]. أثرت الطفرة الوحيدة التي لوحظت في الوحدة غير الحفزية (G57-D237) ، R167C ، على الموضع الأول للعنصر المحفوظ RYYPSG172. يُعتقد أن هذه الوحدة تعمل كمرافق داخل الجزيء ، وبالتالي يمكن أن تسهم الطفرات فيها في المقاومة من خلال التأثير على طي أو استقرار البروتين بأكمله [46]. تم الإبلاغ عن الطفرات في هذه الوحدة ، في الواقع ، في بكتريا قولونية لمنح مقاومة للسيفتازيديم ، وهو مضاد حيوي بيتا-لاكتام قريب جدًا من مركب CTX [47].

على عكس ما لوحظ في جيش تحرير بلوخ الموضع ، تراكمت كلا الطفرات بدائل خاصة للغاية في fts، بما في ذلك الأليلات ثنائية وثلاثية الطافرة حيث تتوافق جميع الطفرات مع كل طيف طفري محدد (الشكل 3 والمواد التكميلية الإلكترونية ، الجدولان S2 و S3). فيما يتعلق بهذا ، لم تنشأ سوى 7 من أصل 83 استبدالًا تم العثور عليها في كلا الطافرين عن تغييرات أساسية خاصة بالطيف ، مما يشير إلى أن هذه طفرات ذات تأثيرات مفيدة قوية. ومن المثير للاهتمام أن ملف Δالمغفل كانت الخلفية هي التي لوحظ فيها الجزء الأكبر من الاستبدالات (52/92) ، حيث أظهرت أعلى متوسط ​​عدد من الاستبدالات لكل عزلة (2.08 مادة تكميلية إلكترونية ، الشكل S2) وأعلى عدد إجمالي من الأليلات الطافرة الثلاثية (ثمانية في المجموع ، ستة فريدة انظر المواد التكميلية الإلكترونية ، الجدولين S2 و S3).

يشير سطرين من الأدلة إلى أن هذه الأشكال المتعددة الملاحظة في الموقع جيش تحرير بلوخ و fts من المرجح أن يفسر أنماط المقاومة عالية المستوى. من ناحية ، احتوت جميع السلالات المتسلسلة على بدائل في واحد على الأقل من هذين الجينين ، مع استثناء غير مفاجئ لخمسة نسخ من الخلفية البرية معزولة بتركيزات منخفضة (أقل من أو تساوي 0.5 مجم لتر مادة تكميلية إلكترونية ، الجدول S2). من ناحية أخرى ، على الرغم من أن بعض العزلات أظهرت تعديلات في كل من TEM و PBP3 (12/70) ، كان هناك ميل ذو دلالة إحصائية لنقص التغييرات في PBP3 عندما تكون بدائل TEM موجودة بالفعل (اختبار فيشر الدقيق ، ص & lt 0.0001). في الواقع ، كلما لوحظ أليل متحولة ثلاثية في أي من المواقع ، كانت التعديلات في الموقع الآخر غائبة تمامًا (المواد التكميلية الإلكترونية ، الجدول S2).

3. مناقشة

كان الدافع وراء هذا العمل هو السؤال عما إذا كانت حدود الانتقاء الطبيعي التي تفرضها القيود الجينية يمكن أن تصبح واضحة بشكل خاص في البكتيريا الطفرة. لاكتساب نظرة ثاقبة حول هذه المشكلة ، قمنا بمراقبة تطور اثنين من الطفرات المتميزة في نظام تجريبي حيث يقوم أحدهما فقط برفع الطفرات المفيدة المعروفة. في ظل هذه الظروف ، فإن أداء بداهة يعتمد المتحور الأدنى على قدرته على استغلال المسارات الطفرية الثانوية ، إن وجدت. في الحالة القصوى ، افترضنا أن أدائها يمكن أن يكون محدودًا مثل أداء النوع البري.

وجدنا أن كلا الطافرين لا يمكن تمييزهما من حيث قدرتهما على تطوير مقاومة عالية المستوى لـ CTX. في ضوء الاعتبارات المذكورة أعلاه ، يعتمد التفسير المعقول لهذه النتائج على الحجم الكبير على ما يبدو للهدف الطفري العالمي لتطور مقاومة CTX. يوفر هذا الحجم الكبير طرقًا تطورية بديلة متعددة ، وبالتالي يزيد من احتمال أن يثير طيف طفري معين طفرات مناسبة. أسباب هذا الحجم الهدف الطفري الكبير ذات شقين على الأقل. أولاً ، يمكن أن يستمر التكيف عن طريق التغييرات في مواقع أخرى غير جيش تحرير بلوخ، وعلى الأخص في fts. الثانية ، الهدف الطفري داخل fts يبدو أن الموضع واسع جدًا في حد ذاته. في هذا الصدد ، تجدر الإشارة إلى النسبة العالية لاستبدالات PBP3 التي لوحظت مرة واحدة فقط (22/34 مادة تكميلية إلكترونية ، الجدول S2) ، مما يشير إلى وجود العديد من الطفرات المحتملة الأخرى التي لم يتم أخذ عينات منها للتو [48]. يتوافق هذا مع حقيقة أن أكثر من 30 من استبدال PBP3 لم يتم اكتشافها هنا قد تم وصفها في مكان آخر لمنح مقاومة لمجموعة متنوعة من-lactams ، بما في ذلك CTX [42-45،49].

دراسة حديثة مع الزائفة الزنجارية ذكرت اختلافات طفيفة بين فرط التحولات والطفرات الناجمة عن الإجهاد في تعزيز التكيف ، وهي نتيجة مماثلة لنتيجة لدينا في أن كلا التجربتين اشتملت على أطياف طفرية مختلفة [50]. ومع ذلك ، فإن التأثير الضئيل على قابلية التطور الملحوظ هنا يكشف بشكل خاص ، لأن تصميمنا التجريبي تضمن عمداً كلاً من طافرة ضيقة الطيف ونموذج جيد التوصيف للتطور الجزيئي المقيد. تقودنا المقارنة مع الأدبيات إلى الاعتقاد بأن هذه النتيجة ربما لا تكون خاصة بظروفنا المحددة ، ولكنها بالأحرى يمكن أن تكون عامة إلى حد ما. بينما أظهر نظامنا ، في الواقع ، مرونة كبيرة في المسارات التطورية ، فإن هذه المرونة تشبه ما لوحظ عادةً في العديد من تجارب التطور البكتيري [51]: نادرًا ما يتم ملاحظة قيود التكيف الصعبة على مستوى النيوكليوتيدات [52] ، وحتى في الأمثلة التي أبلغت عن أعلى درجة من التقارب الجزيئي ، تضمن التكيف أكثر من موقع واحد وظهر قدرًا كبيرًا من التنوع داخل التركيز [53-55]. لذلك ، نظرًا لأن أحجام الأهداف الطفرية لا تبدو محدودة تمامًا ، فإننا نتوقع أن تكون تأثيرات الطيف على قابلية التطور متواضعة في أحسن الأحوال في معظم الحالات.

في سياق تطوري أوسع ، يساهم هذا العمل في طرح السؤال إلى أي مدى يمكن أن تعيق قسوة مناظر اللياقة البدنية الانتقاء الطبيعي. لقد وثقت العديد من التقارير كلاً من inter- [4،5،56] و intralocus [27،57،58] علامة epistasis في أنظمة نموذجية مختلفة. عززت هذه الملاحظات فكرة أن القيود الجينية يمكن أن تكون سائدة وبالتالي يمكن أن يستمر التكيف من خلال عدد قليل جدًا من المسارات الطفرية إلى الأنماط الجينية المثلى [8،11]. يشير هذا الاحتمال إلى أن التطور قد يكون قابلاً للتكرار إلى حد كبير ، وربما حتى يمكن التنبؤ به [11]. ومع ذلك ، فقد قيل إن القيود التكيفية يمكن أن تكون خاصة بمناظر اللياقة البدنية منخفضة الأبعاد ، والتي كانت حتى الآن هي الوحيدة القابلة للفحص التجريبي [11]. الأساس المنطقي لهذا هو أنه نظرًا لأن الأبعاد المتزايدة تعني أن الطرز الجينية لديها عدد أكبر من الجيران ، فإن ما قد يبدو مثل ذروة اللياقة المعزولة على نطاق ما يمكن في الواقع ربطها بأبعاد أعلى [59]. يمكن العثور على مثال على طول هذه الخطوط في حالة الاستبدال G238S في TEM-1 β-lactamase. في المختبر أظهرت التجارب أن هذا الاستبدال هو الخطوة الأولى للطفرة التي تمنح أعلى مقاومة لـ CTX [26]. والأكثر إثارة للاهتمام ، كشفوا أنه بمجرد أن يصبح ثابتًا ، فإن التفاعلات المعرفية تقيد بشدة الطفرات الأخرى التي يمكن استبدالها بعد ذلك [7]. على عكس هذه القيود ، كشفت نتائجنا عن وجود مسارات بديلة متعددة ناشئة عن مزيج G238S مع بدائل مختلفة في PBP3 (مادة تكميلية إلكترونية ، الجدول S2) توضح كيف تسهل الأبعاد العالية تجاوز القيود التكيفية المحلية في مناظر اللياقة البدنية الحقيقية.

بصرف النظر عن قابلية التطور ، هناك عواقب أخرى محتملة طويلة الأجل لاختلافات الطيف الطفري. تفرض التحيزات الطفرية بالقوة مستوى عالٍ من الاختلاف على المستوى الجزيئي. هذا التباين الشخصي ، على الرغم من أنه ربما يكون مكافئًا في الملاءمة في ظل الظروف الانتقائية ، قد يمنح خصائص مميزة في بيئات أخرى. في تجربتنا ، أظهر كل طفرة تفضيلًا ملحوظًا لتراكم تغييرات الأحماض الأمينية إما في TEM أو في PBP3 (الشكل 4). من السهل تخيل مزايا وعيوب مختلفة طويلة المدى لكل من آليتي المقاومة. بعض أليلات TEM المرصودة ، على سبيل المثال ، قادرة على التحلل المائي-lactam الذي لا يستهدف بشكل أساسي PBP3 ، وبالتالي منح المقاومة لنطاق أوسع من المركبات [60]. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن هذه الإنزيمات عادةً ما يتم ترميزها بالبلازميد في عزلات طبيعية ، فإنها يمكن أن تتحد بمعدل أعلى وتكون أيضًا أكثر قابلية للانتقال من خلال نقل الجينات الأفقي [61]. في المقابل ، لكونها جينًا أساسيًا ، فمن المحتمل أن تستلزم أليلات PBP3 تكاليف اللياقة في حالات أخرى. تم الإبلاغ عن مثل هذه التكاليف بالفعل في بعض الحالات ، بما في ذلك انخفاض النمو في درجات حرارة عالية [42] وضعف تكوين الأغشية الحيوية [62]. ومع ذلك ، يمكن أن يكون للتغييرات في بنية جدار الخلية أيضًا قيمة تكيفية: أظهر تقرير حديث أن بدائل PBP3 يمكن أن تزيد من قدرة إنفلونزا المستدمية لغزو الخلايا الظهارية [63].

الشكل 4. تأثيرات الطيف الطفري على تباعد المسارات الطفرية. تمثل القضبان عدد العزلات مع مجموعات مختلفة من البدائل في TEM-1 و PBP3.بيانات من السلالات الحاملة للبلازميد الباقية في نهاية التجربة (MIC أكثر من أو يساوي 64 مجم لتر -1). (أ) ΔmutH معرفتي. (ب) Δالمغفل معرفتي. للمساعدة في التخيل ، تتناسب ظلال الرمادي مع عدد العزلات. لاحظ كيف يوجه الطيف الطفري المجموعات السكانية من خلال مسارات تكيفية متباينة ، يقوم كل طفرة بتجميع البدائل بشكل تفضيلي إما في TEM-1 أو PBP3.

في حين أن هذه الاحتمالات المتباينة خاصة بتطور مقاومة بيتا-لاكتام ، يبدو من المعقول توقع تأثيرات مماثلة في الأنظمة الأخرى بشرط أن يستمر التكيف من خلال هدف طفري كبير بما فيه الكفاية. من منظور تطبيقي ، يضيف هذا طبقة إضافية من التعقيد إلى إدارة الطفرات في العدوى السريرية ، المعترف بها بالفعل كعامل خطر لتطوير مقاومة المضادات الحيوية [64]. يجب أن تأخذ الدراسات المستقبلية في الاعتبار العواقب طويلة المدى للتباعد الجزيئي عند تقييم مخاطر العلاج بالمضادات الحيوية في وجود الطفرات ، بما في ذلك جوانب مثل المقاومة التبادلية أو الفوعة أو القابلية للانتقال أو اللياقة في بيئات أخرى.

4. المواد والأساليب

(أ) الإجهاد والوسائط

جميع السلالات مشتقة من بكتريا قولونية AB1157 ، تم الحصول عليها من المجموعة المختبرية للدكتور بروس ر. ليفين. تحمل هذه السلالة بشكل طبيعي الترميز الجيني لـ β-lactamase AmpC ، والذي تم حذفه لمنع التداخل مع النظام التجريبي. الضربة القاضية للجينات أمبير, mutH و المغفل تم إجراؤها عن طريق توصيل P1 والإزالة اللاحقة بوساطة pCP20 لكاسيت مقاومة الكاناميسين من استنساخ Keio المناسب [65،66]. نسخة واحدة جيش تحرير بلوختيم -1 سلالات تم إنشاؤها عن طريق تحويل galK :: cfp / yfp ، بلوختيم -1 كاسيت من بكتريا قولونية MC4100 مقدم من الدكتور روي كيشوني [67]. النسخة المتعددة جيش تحرير بلوختيم -1 تم الحصول على سلالات بالتحول مع pBRACI البلازميد وهو مشتق من pBR322 والذي ، في محاولة لتقليل عبء اللياقة لحمل البلازميد [68] ، تم هضمه بالإنزيمات افاانا و PSTII لاستئصال كاسيت مقاومة التتراسيكلين. لاحظ أن هذه السلالات لا تحمل الامتداد جيش تحرير بلوختيم -1نسخة كروموسومية. تم تأكيد جميع الأنماط الجينية بواسطة PCR والهلام الكهربائي. تمت زراعة البكتيريا في نسخة معدلة من وسط M9 الأدنى ، على النحو الأمثل لدعم النمو الأقصى في الظروف التجريبية [66]. يتكون التعديل من مكمل أملاح M9 مع 1٪ جلوكوز (G8270 ، سيغما الدريتش) و 1٪ حمض هيدروليزات الكازين (أحماض كازامين ، بيكتون ديكنسون).

(ب) تجربة التطور

لكل من الأنماط الجينية الستة المستخدمة هنا ، تم نشر ما مجموعه 96 سلالة متوازية بشكل متسلسل في وجود تركيزات متزايدة من CTX (Claforan ، Sanofi-Aventis). نمت التجمعات بدون تهيج عند 37 درجة مئوية في أطباق ميكروترية 96 بئر (1.1 مل بئر عميق ، أكسجين) ، مغطاة بأغطية بلاستيكية فضفاضة للسماح بالتهوية. لتقليل التلوث المتبادل ، تم ترتيب المجموعات في نمط رقعة الشطرنج عبر كل لوحة ، بحيث تحتوي نصف الآبار على وسط معقم [67]. كانت نسبة آبار التحكم التي تلوثت بشكل يومي أقل من 0.5٪. كل 24 ساعة ، تم نقل 16 ميكرولتر من كل ثقافة إلى 800 ميكرولتر من الوسط ، مما يسمح بحد أدنى 5.7 جيل يوميًا (لاحظ أن هذا التقدير يمثل حدًا أقل ، بسبب الانخفاض في الكثافة السكانية النهائية على مدار التجربة ). تم إجراء المرور التسلسلي خلال 28 يومًا. تم تحديد الحد الأدنى للتركيز المثبط للسيفوتاكسيم (MIC) في الوسط التجريبي لجميع السلالات الأبوية ليكون 0.064 مجم لتر -1 بواسطة طريقة التخفيف الدقيق (CLSI ، 2006) ، بغض النظر عن النقل البلازميدي. تم إجراء أول مقطعين في غياب المضادات الحيوية. في اليوم الثالث ، تعرض السكان لـ 0.016 مجم لتر -1 من CTX (1/4 × MIC). تضاعف تركيز المضاد الحيوي بعد ذلك كل 48 ساعة ، حتى تم الوصول إلى تركيز نهائي قدره 64 مجم لتر −1 CTX (1024 × MIC). طوال فترة التجربة ، تم تقدير عدد السكان الناجين عن طريق الفحص البصري ، وتم تخزين اللوحات بانتظام عند -80 درجة مئوية.

(ج) التوصيف المظهري

بعد الانتهاء من تجربة التطور ، تم عزل الحيوانات المستنسخة المفردة من 160 سلالة تمثيلية عن طريق وضع خطوط على لوحات أجار مرق Luria (LB). تم نقل هذه العزلات إلى 96 طبق ميكروتيتر جيدًا ، وتم تحضينها طوال الليل وتخزينها عند -80 درجة مئوية لتحليلها لاحقًا. أجريت جميع الحضانات في مرق LB عند 37 درجة مئوية دون إثارة. يقيس التوصيف الظاهري القابلية لمجموعة من المواد الكيميائية والمضادات الحيوية وفيروسات العاثية. تم إجراء فحوصات في ثلاث نسخ بعد النمو بين عشية وضحاها لنسخة متماثلة من لوحات التجميع المجمدة. كانت هذه الثقافات الليلية 1: 100 مخففة وأعيد نموها لمدة 4 ساعات. تم بعد ذلك استخدام مكرر ذو 96 دبوسًا لنقل القسامات إلى أطباق بتري مربعة تحتوي على أجار LB مكمل بتركيزات مختلفة لكل عامل محدد. لفحص حالة مضخة AcrAB ، المضخة الرئيسية البثق β-lactams ، قدرنا MIC لثلاث ركائز معروفة مثل acriflavine و tetracycline و erythromycin (تم شراؤها كلها من Sigma-Aldrich) [35]. تم تحديد طفرات التدفق المتغير باستخدام معيار متحفظ: إما أن MIC لواحد منهم كان مرتفعًا أكثر من أو يساوي أربعة أضعاف ، أو MIC لاثنين على الأقل ارتفع أكثر من ضعف. لدراسة التعديلات في porins OmpF و OmpC ، الطريق الرئيسي لدخول المضاد الحيوي إلى الخلية [36] ، قمنا بتقييم المقاومة للعاثيات Tu1a و Tu1b ، التي تستخدم هذه البورينز ، على التوالي ، كموقع ارتباطها [69]. كان معيار المقاومة هو النمو على تعدد العدوى بما يكفي لمنع نمو سلالة السلف. كعناصر تحكم إيجابية ، المسوخ بالضربة القاضية المشتقة من Keio من الجينات acrR, ompF و ompC تم تضمينها بشكل روتيني في المقايسات المذكورة أعلاه.

(د) التوصيف الجيني

تضخيم PCR وتسلسل Sanger للكروموسومات جيش تحرير بلوخ تم إجراء الجين باستخدام أليغنوكليوتيدات 5′-TGAACA TTCCGA AATGCG C-3 و 5′-CCTTCG TTCACC GTCTTC A-3. بخصوص البلازميد جيش تحرير بلوخ تم إجراء استخراج وتنقية الجين و pBRACI باستخدام مجموعة Qiagen plasmid المصغرة ، وتم إجراء التسلسل باستخدام أليغنوكليوتيدات 5′-GCTCAG GACTGG TCTAAC-3 و 5′-CTTTGC GGTTAG ACTGGT C-3 ′. تضخيم وتسلسل fts تم إجراء الجين باستخدام أليغنوكليوتيدات 5′-GCCCAG CATGTT TCACAA GATG-3 و 5′-CGAGCA GAGATG CTGCGA A-3. تم أيضًا استخدام قليل النوكليوتيد الداخلي 5′-CATCGT GCCCTA ACAACA ACC-3 للتسلسل ، نظرًا للحجم الكبير للجين (حوالي 1.8 كيلو بايت). تم توفير خدمات التسلسل بواسطة Secugen (www.secugen.es) ، وتم إجراء تحليل التسلسل باستخدام Ridom T Race E dit (www.ridom.de/traceedit) وتم إجراء محاذاة التسلسل باستخدام MAFFT v.6 (mafft.cbrc.jp) / المحاذاة / البرمجيات).


مناقشة

كما لوحظ في عملنا السابق & # x00394لا& # x00394nqrf1 لم يكن قادرًا على النمو تحت ظروف الأكسدة في وسط M5 الأدنى مع أي منهما د ، ل- اللاكتات أو NAG كركيزة (Duhl et al. ، 2018). ومع ذلك ، فقد لاحظنا الآن أن إضافة 0.1٪ (وزن / حجم) tryptone إلى الوسيط مسموح & # x00394لا& # x00394nqrf1 ينمو. المكون الرئيسي للتربتون هو الأحماض الأمينية والببتيدات الحرة ، مما يشير إلى أن السلالة الطافرة تتطلب مكملات من الأحماض الأمينية ولا يمكنها إنتاج ما يكفي من الأحماض الأمينية من جديد لدعم النمو. جنبًا إلى جنب مع تراكم الأسيتات والبيروفات ، فإن متطلبات التربتون تشير إلى انخفاض نشاط دورة TCA لأن بعض تفاعلات TCA مطلوبة من أجل من جديد تخليق الأحماض الأمينية (Kanehisa and Goto ، 2000). ومع ذلك ، هناك محاذير لاستخدام التربتون لأنه عبارة عن هضم تريبتي غير محدد للكازين ويمكن أن يحتوي على مغذيات أخرى. لاحظنا أن المصادر الأخرى للأحماض الأمينية ، بما في ذلك الأحماض الكازامينية (الكازين المتحلل بالحمض) أو الأحماض الأمينية المحددة لم تنقذ نمو الطافرة. ومع ذلك ، فإننا نقترح أن الإنقاذ كان بسبب الببتيدات في التربتون ، وليس عن طريق العناصر الغذائية الأخرى. في حين أن هناك اختلافات طفيفة في محتوى الكربوهيدرات والمعادن بين التربتون وأحماض الكازامينو ، فإن هذه الاختلافات صغيرة مقارنة بالمحتوى الكلي من المعادن والكربوهيدرات في الوصفة المتوسطة الكلية (BD Biosciences ، 2006). علاوة على ذلك ، أشارت الأعمال السابقة إلى أن S. oneidensis MR-1 غير قادر على استخدام الأحماض الأمينية الفردية كمصادر للكربون ولكنه قادر على مجموعة متنوعة من الببتيدات المحددة (Serres and Riley ، 2006). هذا يشير إلى أن S. oneidensis يعتبر MR-1 أكثر فاعلية في امتصاص الببتيد من امتصاص الأحماض الأمينية الحرة ، وهو ما يفسر سبب إنقاذ التربتون لنمو الطفرات ، في حين أن أحماض الكازامينو لا تفعل ذلك.

إلى جانب عيب النمو الذي لوحظ في سلالة خروج المغلوب من نازعة الهيدروجين NADH ، كان هناك اكتشاف آخر لهذه الدراسة هو أن إجمالي أحجام تجمع NAD (H) يختلف اختلافًا كبيرًا بين WT و & # x00394لا& # x00394nqrf1. مع أي منهما د ، ل-اللاكتات أو NAG كمصادر للكربون ، لاحظنا زيادات مضاعفة تقريبًا في إجمالي تجمعات NAD (H). نفترض أن زيادة حجم تجمع NAD (H) ناتج عن تخليق NAD & # x0002B لمواجهة الزيادة في [NADH] داخل الخلية الناتجة عن الحد من نشاط نازعة الهيدروجين NADH. في S. oneidensis يتم تنظيم تخليق MR-1 و NAD & # x0002B بواسطة القامع NrtR. عندما ينخفض ​​[NAD & # x0002B] ، يتم تحرير NrtR من المروجين للسماح بالتعبير عن الجينات المرتبطة بالتوليف NAD & # x0002B (Rodionov et al. ، 2008). لأننا لاحظنا زيادة أحجام تجمع NAD (H) في & # x00394لا& # x00394nqrf1 سلالة متحولة ، نقترح أن [NADH] الزائد والمحدود [NAD & # x0002B] أدى إلى الإفراط في التعبير عن الجينات المشاركة في تخليق NAD & # x0002B.

تتأثر أيضًا دورة TCA والتفاعلات الأولية بالتغيرات في حالة الأكسدة الداخلية وحجم تجمع NAD (H). NADH هو مثبط لتخليق السترات ، والذي يحول أسيتيل CoA و oxaloacetate إلى سيترات لإدخال الكربون في دورة TCA (Weitzman and Jones ، 1968 Stokell et al. ، 2003). يشير هذا إلى أن زيادة NADH / NAD & # x0002B قد تمنع وظيفة دورة TCA من خلال التأثير على نشاط سينسيز السترات. علاوة على ذلك ، قد تتأثر التفاعلات المنبع لدورة TCA ، لأن نشاط نازعة هيدروجين البيروفات (Pdh) يتم تنظيمه أيضًا بواسطة NADH / NAD & # x0002B وتركيزات acetyl-CoA في S. oneidensis MR-1 (Pinchuk et al. ، 2011 Novichkov et al. ، 2013). سيؤدي انخفاض نشاط سينسيز السترات إلى زيادة تركيزات أسيتيل CoA ، مما قد يثبط وظيفة Pdh ، إلى جانب زيادة NADH / NAD & # x0002B. لقد تم أيضًا إثبات سابقًا أن نشاط Pdh يمكن أن يتأثر بكل من حجم تجمع NADH / NAD & # x0002B و NAD (H) (Shen and Atkinson ، 1970) ، مما يعني أن النشاط يتباطأ عند نسب NADH / NAD & # x0002B داخل الخلية يزيد. يدعم التحليل الأيضي للسلالة الطافرة الفرضية القائلة بأن أكسدة البيروفات ونشاط دورة TCA قد تم تثبيطهما في & # x00394لا& # x00394nqrf1 ويوضح كذلك البيانات السابقة التي لوحظت في الضربة القاضية الفردية لـ Nqr1 و Nuo (Duhl et al. ، 2018). لاحظنا إفراز مستويات عالية من البيروفات والأسيتات بواسطة & # x00394لا& # x00394nqrf1، وهو أمر متوقع إذا تم حظر التدفق خلال دورة TCA (الشكل 8). من المهم أيضًا ملاحظة أن جميع نازعات الهيدروجين الأربعة NADH لم يتم التخلص منها S. oneidensis MR-1 في هذه الدراسة. سعت هذه الدراسة إلى فهم أدوار نازعات الهيدروجين NADH المعبر عنها بالهواء المضغوط (Pinchuk et al. ، 2010 Duhl et al. ، 2018) ، على الرغم من أن نازعات الهيدروجين NADH الأخرى قد تلعب دورًا في تنظيم حالة الأكسدة والاختزال في & # x00394لا& # x00394nqrf1 سلالة متحولة.

الشكل 8. التأثير المقترح للتخلص من نازعات هيدروجين NADH في S. oneidensis MR-1 والتأثيرات اللاحقة على أكسدة NADH وحالة الأكسدة والاختزال وتثبيط دورة TCA داخل الخلية.

لفهم تأثيرات خروج نازعة هيدروجين إنزيم NADH بشكل أفضل على حالة الأكسدة الفسيولوجية في S. oneidensis MR-1 طوال فترة النمو ، استخدمنا نظام استشعار الأكسدة والاختزال المستند إلى Rex والذي طوره Liu et al. (2019). أحد القيود الرئيسية على مقايسات القياس الكمي القياسية NADH و NAD & # x0002B هي الحاجة إلى إزالة البكتيريا من بيئة نموها لإجراء عمليات الاستخراج. وجدنا أن إجراء حصاد الخلايا واستخراجها قد يتسبب في حدوث تحولات في الخلايا وحالة الأكسدة والاختزال # x00027. قبل التبريد بالمحلول الحمضي أو الأساسي في البروتوكول ، توقف اهتزاز الثقافات ونقل العينات إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل (كيرن وآخرون ، 2014) ، مما يؤدي على الأرجح إلى الحد من الأكسجين. لقد أظهرنا أن الخلايا من المحتمل أن تستنفد كل الأكسجين داخل الوسط أثناء خطوة الطرد المركزي ، مما يخلق بيئة محدودة الأكسجين يمكن أن تؤثر على حالة الأكسدة والاختزال في كليهما. S. oneidensis سلالات. على العكس من ذلك ، يتفاعل مستشعر الأكسدة والاختزال المستند إلى Rex مباشرةً مع NADH داخل الخلايا و NAD & # x0002B ويسمح بالقياسات النوعية في الوقت الفعلي لـ NADH / NAD & # x0002B عبر إخراج مراسل الفلورسنت (Liu et al. ، 2019). سمح لنا ذلك بتقييم NADH / NAD & # x0002B دون معالجة الخلايا بطريقة من شأنها التأثير على حالة الأكسدة والاختزال. تظهر بياناتنا أن المستشعر يعمل كما هو متوقع في S. oneidensis وذلك & # x00394لا& # x00394nqrf1 معارض زيادة إنتاج مضان مقارنة WT.

بينما أثر المستشعر على نمو السلالات ، ما زلنا قادرين على الحصول على قياسات نوعية لحالة الأكسدة الداخلية. ليس من الواضح سبب تأثير إضافة مستشعر Rex على النمو في S. oneidensis MR-1. في بكتريا قولونية، لا يبدو أن مستشعر Rex يؤثر على النمو (Liu et al. ، 2019). من الممكن أن يكون العبء الأيضي الناتج عن حمل نظام استشعار الأكسدة والاختزال قد تسبب في حدوث التغييرات ، وأن استخدام العمود الفقري أو المحفزات البلازميدية المختلفة سيقلل من تأثيرات المستشعر. ومع ذلك ، نعتقد أن ناتج المستشعر لا يزال مصدرًا قيمًا للمعلومات لهذه الدراسة لأسباب متعددة ، ولّد المستشعر الناتج المتوقع للانتقال الهوائي إلى اللاهوائي ، وظلت الأنماط الظاهرية الكلية والاختلافات بين WT والمتحول متشابهة مع المستشعر. أي ، لا تزال السلالة المتحولة تنمو إلى OD نهائي أقل600 وبمعدل أبطأ من WT عندما كان المستشعر موجودًا (الشكل 6 والجدول 3). علاوة على ذلك ، ظلت الاختلافات في استهلاك الركيزة وتراكم الأسيتات والبيروفات متشابهة عند وجود المستشعر ، مع فشل السلالة الطافرة في استخدام جميع مصادر الكربون المتاحة وتراكم الأسيتات والبيروفات. كان WT مع المستشعر قادرًا على استهلاك كل الركيزة المتاحة ولم يتراكم الأسيتات أو البيروفات. على الرغم من أن المستشعر يبدو أنه يؤثر على WT أكثر من المتحولة ، إلا أن التأثير العام على كلا السلالتين يبدو متشابهًا ، وتظل الأنماط الظاهرية الأساسية كما هي ، لذلك نعتقد أن ناتج المستشعر يعكس الاختلافات الحقيقية في NADH / NAD & # x0002B داخل الخلايا بين السلالات .

إجمالاً ، تشير بياناتنا إلى أن حذف NADH dehydrogenases أثر على أحجام تجمع NAD (H) ، و NADH / NAD & # x0002B ، والأنشطة الأيضية الأولية ، على وجه التحديد عن طريق تثبيط دورة TCA ومنع تخليق الأحماض الأمينية. لأننا أظهرنا أن حذف نازعة هيدروجين NADH من S. oneidensis أدى MR-1 إلى زيادة مستويات NADH / NAD & # x0002B ، وأحجام تجمع NAD (H) الأكبر ، والتحولات الأيضية داخل الخلية ، قد توفر خروج المغلوب NADH dehydrogenase وسيلة للهندسة الأيضية. عند هندسة المسارات في البكتيريا لتوليد منتجات تعتمد على العامل المساعد الأكسدة والاختزال ، فمن المفيد إجراء تعديلات على هذا الكائن الحي لتوليد مستويات أعلى من NADH (Berrios-Rivera et al. ، 2002). إذا لم تعد تركيزات الإنزيم تحد من معدل تكوين المنتج ، فقد يصبح توفر عوامل الأكسدة المساعدة للاختزال محدودًا (Berrios-Rivera et al. ، 2002 Balzer et al. ، 2013). على سبيل المثال ، كان من الضروري القضاء على المسارات التي تتنافس على NADH في بكتريا قولونية لتحسين إنتاج 1-بيوتانول (أتسومي وآخرون ، 2008). كما تم استخدام زيادة توليد NADH لتعزيز إنتاج التيار الكهربائي بواسطة S. oneidensis MR-1 (لي وآخرون ، 2018). تظهر هذه الدراسات أهمية توافر NADH عند هندسة المسارات المعتمدة على العامل المساعد الأكسدة والاختزال. لقد أظهرنا أن التخلص من نازعات الهيدروجين NADH والقضاء على المسار المنافس لـ NADH في S. oneidensis يزيد MR-1 من توافر NADH ، والذي يوفر إجهادًا خلفيًا محتملاً للهندسة الأيضية في S. oneidensis MR-1. مع توفر NADH الإضافي في سلالات NADH المتحولة من نازعة الهيدروجين ، يمكننا توجيه NADH إلى مسارات اصطناعية لتكوين المنتج ، حتى عند وجود الأكسجين ، كما يتضح من المستويات العالية من تراكم البيروفات والأسيتات بواسطة سلالة متحولة.


مناقشة

نقل البروتين عبر الغشاء

أدوار البروتينات عبر الغشاء والأيونات المرتبطة بها

كما هو موضح في القسمين الأخضر والبرتقالي من الشكل 4 ، متى L. helveticus باستخدام بروتينات مثل الكازين ، قام بتحللها أولاً إلى عديد الببتيدات. تم تنظيم DEPs لناقل ABC بشكل كبير. ناقل الكاسيت ABC أو ATP هو نوع من بروتين الغشاء الذي يستخدم الطاقة من التحلل المائي ATP لامتصاص العناصر الغذائية الأساسية. في المقابل ، يحمل المصدرون ركائز خارج الخلية عن طريق النقل النشط (Theodoulou and Kerr، 2015). تركيز Mn 2+ المنخفض في بروتين مغلف الخلية المستحث بالمجموعة B التجريبية (CEP) في L. helveticus (جو وآخرون ، 2009). البحث عن نمو L. helveticus كشفت CNRZ32 في وسائط الحليب الخالي من الدسم عن تنظيم CEPs مثل PrtH و PrtH2 و PrtM ، والبروتينات الجديدة PrtH3 و PrtH5 ، ونظام نقل Dtp ، والببتيدات مثل pep O2 مقارنةً بـ CNRZ32 المزروعة في MRS (Smeianov et al. ، 2007) . مقارنة بين L. helveticus كشف نمو CRL1062 و CRL974 في الوسائط التي تحتوي على الكازيتون أو أحماض الكازامين أو & # x03B2-casin أن كلا السلالتين أظهرتا أعلى معدلات نمو على casitone وأدنى مستويات نشاط PrtH في الوسائط الغنية بالببتيد (Hebert et al. ، 2000). بحث عن خصائص الحالة الكازينية لستة L. helveticus أظهرت سلالات الجبن أنه بعد الحضانة في الحليب ، أنتجت جميع السلالات CEPs التي يمكن أن تحلل الكازين مباشرة. في المقابل ، لم يكن لدى السلالات المحتضنة في MRS هذه القدرة (جنسن وآخرون ، 2009). تم تنظيم الجينات المحللة للبروتين في وسط خالٍ من الفيتامينات مع تحلل حمض الكازين مقارنة مع تلك التي تحتوي على الأحماض الأمينية الأساسية. هذه النتيجة تتفق مع تلك الواردة في التقارير السابقة.

الشكل 4. رسم تخطيطي لآلية استخدام الأحماض الأمينية (أ) والبروتينات (ب) بواسطة Lactobacillus helveticus CICC22171. يمثل اللون البرتقالي بنية الغشاء ، والتي تتضمن طبقة ثنائية الفوسفوليبيد ، وناقلات النقل السلبية والنشطة ، وناقلات الكاسيت (ABC) المرتبطة بـ ATP. تشير جرأة الأسهم وإضافة الركائز وإنزيمات المعالجة والمنتجات إلى تكثيف التفاعل.يمثل اللون الأخضر نقل مصادر النيتروجين ، ويمثل كروي الأحماض الأمينية ، ويمثل القطع الناقص الأخضر البروتينات. الأزرق هو القاعدة المركزية. الحلزون الأزرق هو DNA ، والخيط المستقيم هو mRNA ، والقطع الناقص الأزرق عبارة عن بروتين. يشير اللون الأحمر إلى استقلاب مصدر الكربون ونقل ATP وإنتاج الأحماض الأمينية. يظهر اللون الأصفر تحويل أيون الحديد لسلسلة الجهاز التنفسي الإلكترونية.

نادرا ما ينظر إلى زيادة في تنظيم DEGs المرتبطة بالنقل عبر الغشاء. في الواقع ، عادة ما يتم تنظيم النقل عبر الغشاء. يؤدي استبدال الأحماض الأمينية المشتقة من النيتروجين بالبروتينات إلى تقليل النقل النسبي عبر الغشاء وعمليات التمثيل الغذائي المرتبطة به. وهكذا ، يتم نقل الكازين إلى الخلايا عبر تنظيم ناقل ABC وتقليل تنظيم CEP المرتبط بـ Mn 2+.

ATP وخفض استخدام الطاقة أثناء النقل

يوضح الشكل 4 أنه تم تقليل تركيز Mg 2+ في B. لذلك ، استخدم البروتين بواسطة L. helveticus يقوي الترجمة. يلعب الحديد والهيم أدوارًا حيوية في سلسلة نقل الإلكترون (ETC). تفسر التركيزات المنخفضة Fe 2+ انخفاض الحاجة إلى التنفس الهوائي. تم تقليل كل من هدم ATP والتفسفر والتخليق ونقل البروتون المقترن بالتحلل المائي. نظمت DEPs تخليق ATP واستقلاب الطاقة وتضمنت H + -ATPase و ATP synthase ونشاط ربط النوكليوتيدات المرتبط بتوليف ATP. تضعف تركيزات Mn 2+ المنخفضة نشاط كاربوكسيكيناز الفوسفوينول بيروفات و phosphoenolpyruvate (PEP) (Park et al. ، 1999).

تم تقليل متطلبات التمثيل الغذائي لمصدر الطاقة والكربون وتم تخفيف هذه العمليات. غالبًا ما يكون الجلوكوز هو المصدر الرئيسي للكربون والطاقة لنمو البكتيريا. ككائن حي دقيق غير متجانسة ، L. helveticus يستخدم CICC22171 مسار التحلل السكري (EMP) كمصدر رئيسي للطاقة. هنا ، تم ضبط جينات الحمل المانوز لعائلة EMP و PTS في الوسائط التي تحتوي على الكازين. وبالتالي ، يمنع الكازين استخدام الجلوكوز. تشتمل DEPs الخاضعة للتنظيم في المواد السمية الثابتة للمانوز على بروتين خاص عبر الغشاء (Reizer and Saier ، 1997) يسمى حمال مانوز من عائلة PTS. يحدد مكون IID الخاص به الكربوهيدرات وينقلها ويفسفرتها. قد يعمل حمال المانوز لعائلة المواد السمية الثابتة في أنظمة نقل الجلوكوز والفركتوز (Saulnier et al. ، 2007). تم تنظيم المزيد من أنظمة نقل السكر (بما في ذلك عائلة المواد السمية الثابتة وحمالة عائلة المانوز أو الفركتوز) في L. كازي نمت تشانغ على الحليب أكثر من تلك التي نمت على حليب الصويا. وبالتالي ، يمكن للعديد من الكربوهيدرات أن تحافظ على نمو البكتيريا (وانج وآخرون ، 2013). مصدر الكربون البديل لـ L. اللاكتيس استبدل الجلوكوز عندما انخفض محتوى الأخير لأن الإنزيمات المشاركة في التمثيل الغذائي للكربون السريع تم تقليل تنظيمها (Redon et al. ، 2005). وبالتالي ، يمكن أن تستخدم بكتيريا حمض اللاكتيك مصادر الكربون البديلة من خلال تنظيم الجينات المرتبطة بها. تتطلب بكتيريا حمض اللاكتيك الطاقة من عملية التمثيل الغذائي للسكر للمساعدة في التنفس. وبالتالي ، يتأثر التنفس البكتيري بشدة بالظروف البيئية (Pedersen et al. ، 2012). يجب إجراء مزيد من الدراسات على السلاسل التنفسية للبكتيريا في مختلف الوسائط لتحسينها L. helveticus النمو والتمثيل الغذائي CICC22171.

أظهرت الدراسة الحالية أن التمثيل الغذائي للطاقة البكتيرية ينخفض ​​مع النقل النشط والجهاز التنفسي إلخ. يولد تحلل السكر هياكل عظمية من الأحماض الأمينية الكربونية. يشير الانخفاض الملحوظ في استخدام السكر إلى أن البروتين كمصدر للنيتروجين قلل من التركيب الحيوي للهيكل العظمي الكربوني في اكتوباكيللوس سلالات وتعويض نقص الأحماض الأمينية في الوسط.

التحلل المائي للبروتين داخل الخلايا

نسخ الحمض النووي وترجمة البروتين استعدادًا للتحلل المائي

يوضح القسم الأزرق من الشكل 4 أن النسخ كان الخطوة الأولى في التعبير الجيني وأن عامل سيجما كان حيويًا لهذه العملية. ينشط عامل سيجما النسخ الأولي عن طريق الارتباط العكسي بالموقع النشط لبوليميراز الحمض النووي الريبي (Helmann and Chamberlim ، 1988). إن إنزيم إنزيم إنزيم ريزومبيناز Phage هو عبارة عن recombinase خاص بالموقع ويتضمن عائلات التيروزين والسيرين (Stoll et al. ، 2002). يتوسط في إعادة تركيب الحمض النووي عن طريق التفاعلات التساهمية. تعمل عائلة التيروزين على الهيكل العظمي للحمض النووي عبر هيدروكسيل التيروزين ويربط سلسلة الحمض النووي بعد الكسر (Groth and Calos ، 2004). يؤثر Uracil-DNA glycosylase على إصلاح الحمض النووي عن طريق منع وتصحيح سوء الاقتران. يتعرف ويتحلل ن- روابط الجليكوزيد بين الديوكسيريبوز والقاعدة الخاطئة (ساكومي وسيكيغوتشي ، 1990). تقترن عوامل النسخ وظيفيًا بنظم عامل سيجما في البيئات القاسية وتعديل النسخ بشكل كبير (Binder et al. ، 2016). كانت عوامل الاستطالة Tu (EF-Tu) هي البروتينات الأكثر وفرة في الترجمة. يلعبون أدوارًا حيوية في استطالة تخليق البروتين في بدائيات النوى والميتوكوندريا والبلاستيدات والبلازميدات (فو وآخرون ، 2012). هنا ، تمت إعادة تنظيم عامل سيجما بعد أن تم استبدال مصدر النيتروجين في الوسط بكازين متحلل بحمض. تتماشى هذه النتيجة مع التنظيم الملحوظ للأنزيمات المختلفة المشاركة في النسخ. لذلك ، قد يحدث النسخ عندما تستخدم البكتيريا الكازين.

نوكلياز الرنا الريباسي المفترض قبل 16S موجود في العملية الفرعية للتكوين الحيوي للريبوسوم تحت تصنيف GO & # x201Cbiological. & # x201D قد يكون له نشاط هيدرولاز في نهاية 5 & # x2032 لما قبل 16S rRNA ومهاجمة روابط استر. يشارك فوسفوريلاز بيريميدين-نوكليوزيد بشكل رئيسي في أنظمة الأحماض النووية. قد يحفز التحلل المائي للنيوكليوسيد بيريميدين ويضيف مجموعات الفوسفات إلى المستقبل. يرتبط عامل الاستطالة المفترض Tu بمرحلة الاستطالة الترجمية. تعزز تركيزات المغنيسيوم المنخفضة 2+ تخليق الوحدات الفرعية للريبوسوم الكبيرة والصغيرة وتساعد في ترجمة البروتين (تشاكرابورتي وآخرون ، 2019). هنا ، انخفض مستوى Mg 2+ في B. وأكد هذا الاكتشاف أن البروتين المستخدم من قبل L. helveticus يمكن أن تحفز ترجمة البروتين. درست بعض الدراسات كيفية تأثير الكازين على التعبير الجيني أثناء L. helveticus (Chen et al.، 2019 Zhao et al.، 2019). ومع ذلك ، اختتم معظمهم بتحليل مستويات التعبير عن الإنزيمات المشاركة في التحلل المائي البكتيري ولم يعالجوا التغييرات التي تحدث في النسخ أو الترجمة. وبالتالي ، يمكن أن تضع نتائج العمل الحالي أساسًا لمزيد من التحقيقات في تأثيرات وسائط الكازين على تخليق البروتين في L. helveticus CICC22171 والآليات التنظيمية للإنزيمات والعوامل المشاركة في النسخ والترجمة.

كشفت البروتيوميات هنا أن إعادة التركيب بالعاثية- Integrase recombinase قد تم تنظيمها في سلالة CICC22171 المزروعة على وسائط الكازين. يشارك هذا الإنزيم في إعادة تركيب الحمض النووي. أفادت دراسة سابقة أنه تم تنظيم العديد من الجينات المرتبطة بالعاثيات والوحدات الفرعية الصغيرة والكبيرة لإنزيم الملتهمة وبروتينات الملتهمة في L. helveticus نمت CNRZ32 في وسط الحليب (سميانوف وآخرون ، 2007). ومع ذلك ، لم يتم تأكيد أي جينات تشفر انزيم فاجي لسلالة CICC22171. وبالتالي ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة للتحقق من صحة تحريض Prophage في إعادة تركيب الحمض النووي والتحلل الذاتي في L. helveticus CICC22171.

تم تحسين نشاط البروتين لتعزيز التحلل المائي داخل الخلايا

تم تحفيز تحلل البروتين للحصول على العناصر الغذائية الأساسية اللازمة للحفاظ على نمو البكتيريا في الوسائط التي تعاني من نقص في الأحماض الأمينية الحرة. تم تحلل البروتينات إلى ببتيدات ثم يتم نقلها إلى الخلايا. أنتج مركب endopeptidase Clp في البكتيريا ببتيدات منخفضة الوزن الجزيئي وأحماض أمينية متحررة من مصفوفة الكازين. ال L. helveticus نظام التحلل البروتيني فعال للغاية ويتكون من العديد من الإنزيمات بوظائف مختلفة. قد يختلف تخليق البروتين باختلاف التركيبة المتوسطة. أثبتت الدراسة الحالية أن الوسائط البكتيرية أثرت بشكل أساسي على استقلاب البروتين.

أثرت المكونات المتوسطة أيضًا على التعبير عن الجينات التي تشفر نقل البروتين وتحلل البروتين داخل الخلايا. دراسة عن L. helveticus أظهر CNRZ أن تعبير peptidase pepI كان أعلى في MRS من وسط الحليب الخالي من الدسم ، في حين أن العكس كان صحيحًا بالنسبة لـ peptidases pep N و pep X و pep R. ومع ذلك ، كانت مستويات التعبير عن peptidase pepC هي نفسها في كلا الوسطين. (سميانوف وآخرون ، 2007). تحقيق L. helveticus كشفت CRL1062 و CRL974 أن الببتيداز بيب N لم يتأثر بمصدر النيتروجين في الوسط حيث كانت مستويات تعبيره متشابهة في كل من MRS و casitone (Hebert et al. ، 2000). لذلك ، يختلف تأثير مصدر النيتروجين على نشاط الببتيداز باختلاف السلالة البكتيرية. في المقابل ، تحليل L. كازي كشفت Zhang المزروعة في حليب الأبقار وحليب الصويا أن أنظمة البروتيازوم ، ونقل قليل الببتيد ، وأنظمة الببتيداز تم تنظيمها في حليب الصويا. لهذا السبب ، يحتوي حليب الصويا على ما يكفي من الأحماض الأمينية الحرة لدعم نمو البكتيريا. ال L. helveticus كان للغشاء تأثير كبير ، بينما كان تأثير السيتوبلازم طفيفًا. وبالتالي ، كان هناك تأثير هوائي واضح. ومع ذلك ، فقد تم تعزيز النسخ الجيني ، وترجمة الحمض النووي الريبي ، والجينات ذات الصلة ، والتمثيل الغذائي عبر الغشاء ، بينما تم إعاقة استقلاب الطاقة. قد يؤدي تنظيم ناقل ABC إلى تحريك التحلل المائي خارج الخلية بحيث يمكن إكمال عملية التمثيل الغذائي للبروتين.


Bacto ™ Casamino Acids ، تقنيات الحياة

Avantor & reg ، إحدى شركات Fortune 500 ، هي مزود عالمي رائد للمنتجات والخدمات ذات المهام الحرجة للعملاء في مجال الأدوية الحيوية والرعاية الصحية والتعليم والحكومة والتقنيات المتقدمة وصناعات المواد التطبيقية. تُستخدم محفظتنا في كل مرحلة تقريبًا من مراحل أنشطة البحث والتطوير والإنتاج الأكثر أهمية في الصناعات التي نخدمها. تأتي إحدى أعظم نقاط قوتنا من امتلاك بنية تحتية عالمية ذات موقع استراتيجي لدعم احتياجات عملائنا. تمكننا بصمتنا العالمية من خدمة أكثر من 225000 موقع للعملاء وتمنحنا وصولاً مكثفًا إلى مختبرات البحث والعلماء في أكثر من 180 دولة. نضع العلم في حركة لخلق عالم أفضل. للحصول على معلومات ، قم بزيارة www.avantorsciences.com وتجدنا على LinkedIn و Twitter و Facebook.

& نسخ 2021 VWR International، LLC. كل الحقوق محفوظة.
& نسخ 2021 FORTUNE Media IP Limited جميع الحقوق محفوظة. مستخدمة بموجب ترخيص.

لا يدعم موقع الويب هذا إصدار Internet Explorer الخاص بك. نوصيك بالترقية إلى Internet Explorer 11 أو مستعرض آخر مدعوم ، والتحقق لمعرفة ما إذا كنت تستخدم IE11 في وضع عرض التوافق.


هل يتحلل الكازين في الماء مثل أحماض الكازامين؟ - مادة الاحياء

1 Departamento de Genética، Instituto de Ciências Biológicas، Universidade Federal de Minas Gerais، Belo Horizonte، Brazil

* المؤلف: [email protected]

2 Phoneutria Biotecnologia e Servi & ccedilos Ltda ، بيلو هوريزونتي ، البرازيل

وردت في 1 ديسمبر 2012 المنقحة 31 ديسمبر 2012 قبل 8 يناير 2013

الكلمات الدالة: ليباز استراز مياه الصرف الصحي معالجة مياه الصرف الصحي الكائنات الحية الدقيقة المحللة للدهون الأميليز البروتياز سلولاز

الملوثات العضوية الرئيسية في مياه الصرف الصحي البلدية هي البروتينات والسكريات المتعددة والدهون ، والتي يجب أن تتحلل بالماء إلى وحدات أصغر. يؤثر التركيز العالي للزيت والشحوم في مياه الصرف الصحي على عمليات معالجة المياه العادمة البيولوجية من خلال تكوين طبقة على سطح الماء ، مما يقلل من معدل نقل الأكسجين إلى العملية الهوائية. يجب أن تلعب البروتياز الميكروبية ، والليباز ، والأميليز ، والسيلولاز أدوارًا أساسية في عملية معالجة المياه العادمة البيولوجية. هدفت الدراسة الحالية إلى عزل الليباز وغيرها من الكائنات الحية الدقيقة المنتجة للإنزيم المائي وتقييم قدراتها على تحلل الدهون والزيوت العادمة في المختبر. قمنا أيضًا بتقييم التفاعلات الميكروبية كنهج لتعزيز نشاط تحلل الدهون. نحن نركز على نشاط الليباز لأن الزيوت والشحوم ليست ملوثات بيئية فحسب ، بل تشكل أيضًا قشرة صلبة غير مرغوب فيها على أنابيب محطات معالجة مياه الصرف الصحي. تم تحديد خمسة وثلاثين من الكائنات الحية الدقيقة المحللة للدهون من مياه الصرف الصحي وتقييمها من أجل ملامح الإنزيم المائي. تميزت Lipases بالتفصيل من خلال القياس الكمي وتقارب طول السلسلة والظروف المثلى للنشاط. يشير الثبات الجيد للليباز المعزول في وجود عوامل كيميائية ، واستقرار حراري ، ونطاق واسع من نشاط الأس الهيدروجيني والتسامح ، وتقارب أطوال مختلفة من سلاسل الإستر إلى أن بعض هذه الإنزيمات قد تكون مرشحة جيدة للتحليل المائي للمركبات العضوية الموجودة في مياه الصرف الصحي. قد يؤدي مزيج من الإنزيمات والبكتيريا المخمرة إلى تسهيل التحلل المائي الكامل للدهون الثلاثية والبروتينات و lignocellulose التي تحدث عادة في نفايات العمليات الصناعية. تحدد هذه الدراسة الإنزيمات والمخاليط الميكروبية القادرة على هضم المواد البوليمرية الطبيعية لتسهيل عملية تنظيف مياه الصرف الصحي.

لأكثر من قرن من الزمان ، تم استخدام معالجة المياه العادمة البيولوجية لتقليل الضرر الذي يلحقه الإنسان بالبيئة. يعتبر الزيت والشحوم (O & ampG) من المشاكل الرئيسية والملوثات في عمليات معالجة مياه الصرف الصحي البيولوجية. بسبب طبيعتها ، تشكل O & ampG طبقة على سطح الماء وتقلل من معدل نقل الأكسجين إلى عملية هوائية [1]. يتم تفريغ هذه الملوثات بشكل رئيسي من المطاعم والصناعات الغذائية والأسر [1،2]. يجب أيضًا تحلل البروتينات والسكريات المتعددة إلى وحدات أصغر بواسطة إنزيمات خارج الخلية في محطة معالجة مياه الصرف الصحي البلدية [3،4].

يلعب تكوين ونشاط المجتمع الميكروبي داخل محطة معالجة مياه الصرف الصحي دورًا كبيرًا في كفاءة ومتانة عملية التنقية [5]. يتم تقليل كفاءة العمليات البيولوجية التقليدية في معالجة مياه الصرف الصحي بسبب التركيزات العالية من O & ampG في النفايات السائلة [6]. في عملية الحمأة المنشطة ، تؤدي المستويات العالية من O & ampG إلى تقليل النشاط البيولوجي للكتل بسبب صعوبة الأكسجين والركيزة لاختراق الكتلة بسبب تكوين طبقة زيتية حولها [7]. علاوة على ذلك ، في حالة الهضم اللاهوائي ، فإن الكميات الزائدة من O & ampG تمنع عمل البكتيريا المسببة للأسيتات والميثانوجين [6،8،9]. حدد المجلس الوطني البرازيلي للبيئة (CONAMA) الحد الأقصى لمستوى تركيز الزيت المعدني المسموح به للتدفق في المسطحات المائية عند 20 مجم / لتر ، والحد الأقصى للزيوت النباتية والدهون الحيوانية إلى 50 مجم / لتر في المادة 34 ، القرار رقم 357 تم تأسيسه في 17 مارس 2005 [10].

تشمل الأساليب التقليدية لمعالجة النفايات السائلة الزيتية فصل الجاذبية ، وتعويم الهواء المذاب (DAF) ، وإزالة الاستحلاب ، والتخثر ، والتلبد. تتم إزالة الزيت الحر من مياه الصرف عن طريق الفصل بالجاذبية ، ومع ذلك ، لا يمكن لهذه العملية إزالة قطرات الزيت الصغيرة والمستحلبات. يمكن إزالة الزيت الذي يلتصق بسطح الجسيمات الصلبة عن طريق ترسيب الجسيمات [11]. يستخدم DAF الهواء المذاب لزيادة طفو قطرات الزيت الأصغر وتحسين الفصل. بالإضافة إلى ذلك ، تتم إزالة الزيت المستحلب بواسطة عمليات إزالة الاستحلاب الكيميائية أو الحرارية ، أو كليهما [11]. يتم تسخين المياه العادمة المحتوية على زيت مستحلب لتقليل اللزوجة وإبراز فروق الكثافة وإضعاف الأغشية البينية التي تعمل على استقرار مرحلة الزيت. بعد ذلك ، يؤدي التحميض وإضافة بوليمر كاتيوني إلى تحييد الشحنات السالبة ، ويؤدي ارتفاع الأس الهيدروجيني إلى المستوى القلوي إلى تلبد الأملاح غير العضوية. يتم فصل الكتل بالزيت الممتز وإزالة الماء من الحمأة [11]. في هذا السياق ، يمكن أن يؤدي استخدام الكائنات الدقيقة المحللة للدهون في معالجة مياه الصرف الصحي إلى القضاء على عملية المعالجة المسبقة هذه [12]. تشيجوسا وآخرون [13] أظهر أن نسبة الدهون في مياه الصرف الصحي المعالجة بثقافة مختلطة من تسع سلالات خميرة منتجة للليباز انخفضت بنسبة 94٪.

يمكن أيضًا معالجة النفايات السائلة الزيتية كمنهج للتوافق مع قرار CONAMA ، لكن تحقيق عمليات المعالجة المسبقة هذه يعتمد على تكاليف الإنزيم [14]. تتطلب العديد من العمليات الصناعية تكسير المواد الصلبة ومنع انسداد الدهون أو تصويرها في أنظمة النفايات قبل أن يتم إطلاق مياه الصرف الصحي في نظام الصرف الصحي. يمكن تحقيق ذلك 1) عن طريق تحلل البوليمرات العضوية بمزيج تجاري من الليباز والسليولاز والبروتياز والأميلاز والمغذيات غير العضوية أو 2) عن طريق معالجة مياه الصرف الصحي وتنظيف الخزانات وخزانات الصرف الصحي ومصائد الشحوم والأنظمة الأخرى. WW07P من إنتاج شركة واحة البيئة المحدودة وتحتوي على مجموعة من الكائنات الحية الدقيقة عالية الأداء التي تم تكييفها للاستخدام في المعالجة البيولوجية لمياه الصرف التي تحتوي على نسبة عالية من الدهون والزيوت. كما أنه يحتوي على مواد خافضة للتوتر السطحي قادرة على تسييل رواسب الدهون الثقيلة ، وبالتالي المساعدة في تحللها البيولوجي [15].

تشكل الليباز والإسترات فئة كبيرة من الإنزيمات الموجودة في كل مكان والتي تعبر عنها العديد من الكائنات الحية. تتمتع الكربوكسيل إستيراز (EC 3.1.1.1) بخصوصية ركيزة واسعة تجاه الإسترات والثيويستر. الاستراتز التي تتحلل بالماء من الجلسرينات طويلة السلسلة (تحتوي على أكثر من 10 ذرات كربون) تسمى الليباز (EC 3.1.1.3) ويمكن اعتبارها إنزيمات محللة للدهون ومحللة للأستيروليت [16]. معظم الليباز عبارة عن إنزيمات قابلة للذوبان في الماء تعمل على تحلل روابط استر من ركائز غير قابلة للذوبان في الماء [17]. لذلك ، تعمل الليباز على السطح البيني بين طور الركيزة والمرحلة المائية ، حيث يتم إذابة الإنزيم [18]. غالبًا ما يكون من الضروري الجمع بين اثنين أو أكثر من الليباز لإطلاق جزيء الجلسرين ، نظرًا لأن سلاسل الأسيل الثلاثة لجزيء ثلاثي الجلسرين نادرًا ما يتم إطلاقها بواسطة ليباز واحد [17].

إنزيمات α-amylases (إي سي 3.1.2.1.1) هي إنزيمات تحلل جزيئات النشا بالماء لتوليد بوليمرات أصغر تدريجيًا تتكون من وحدات الجلوكوز [19]. اليوم ، استبدل عدد كبير من الأميليز الميكروبي بالكامل تقريبًا التحلل الكيميائي للنشا. تتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام الكائنات الحية الدقيقة في إنتاج الأميليز في القدرة على إنتاج الإنزيم بكميات كبيرة وسهولة التلاعب بالميكروبات لتحقيق الإنزيمات بالخصائص المرغوبة. علاوة على ذلك ، فإن ثبات الأميلاز الميكروبي أعلى من استقراره في النبات والحيوان [20].

يستخدم البروتياز الميكروبي في معالجة النفايات من مختلف صناعات معالجة الأغذية والأنشطة المنزلية لإذابة النفايات البروتينية وتقليل الطلب على الأكسجين البيولوجي للأنظمة المائية [21 ، 22]. إن الإنزيمات المتحللة للماء ، مثل الليباز ، الأميليز ، والبروتياز ، لها تطبيق واعد في معالجة مياه الصرف الصحي للحلوى والآيس كريم ومنتجات الألبان واللحوم. إنزيمات معالجة مياه الصرف الصحي لا تتطلب تنقية وبالتالي يجب أن تقدم تكلفة إنتاج منخفضة [23]. أدت هذه الخصائص إلى زيادة الاهتمام بتقنية إنتاج الإنزيم والبحث عن كائنات دقيقة جديدة ذات قدرة متنوعة على إنتاج الإنزيمات [24-27].

تُستخدم السليولات الميكروبية على نطاق واسع في صناعة الورق والنبيذ والأعلاف الحيوانية والمنسوجات وكذلك لإنتاج الوقود الحيوي ، ومعالجة الأغذية ، واستخراج زيت الزيتون والكاروتين ، وإدارة النفايات [28].تحتوي النفايات المتولدة من الحقول الزراعية والصناعات الزراعية على كمية كبيرة من السليلوز غير المستغل ، مما يتسبب في تلوث البيئة. اليوم ، تُستخدم هذه النفايات لإنتاج منتجات قيمة ، مثل الإنزيمات والسكريات والوقود الحيوي والمواد الكيميائية وغيرها [29-33].

المواد الخافضة للتوتر الحيوي هي جزيئات برمائية تمتلك المجالات القطبية وغير القطبية التي لها خصائص فعالة على السطح. هناك نوعان رئيسيان من هذه الجزيئات: 1) تلك التي تقلل التوتر السطحي عند السطح البيني بين الهواء والماء (المواد الخافضة للتوتر السطحي) ، و 2) تلك التي تقلل من التوتر السطحي بين السوائل غير القابلة للامتزاج أو عند السطح البيني السائل الصلب (المستحلبات الحيوية) [34 ، 35]. عادةً ما تُظهر المواد الخافضة للتوتر السطحي قدرة استحلاب ، لكن المستحلبات الحيوية لا تقلل بالضرورة من التوتر السطحي [34 ، 35]. يتم تصنيع هذه الجزيئات الميكروبية ، وتشمل الأنواع المختلفة من المواد الحيوية الخافضة للتوتر السطحي الببتيدات الدهنية التي تم تصنيعها بواسطة العديد من أنواع العصيات ، والشحميات السكرية التي تم تصنيعها بواسطة Pseudomonas و Candida sp. [36-38].

يساعد استحلاب الدهون من خلال تكسير قطرات الدهون في حدوث التحلل المائي ، لأن الإنزيمات المحللة للدهون القابلة للذوبان في الماء لها تلامس سطحي أكبر مع الركيزة المراد تحللها. تُظهر المواد الخافضة للتوتر السطحي الطبيعية سمية منخفضة ، وقابلية للتحلل البيولوجي ، ومقبولية بيئية ، والتي توفر بديلاً للمواد الخافضة للتوتر السطحي التقليدية المعدة كيميائيًا. يمكن إنتاجها من ركائز مختلفة ولكن غالبًا ما يتم إنتاجها من مصادر متجددة ، مثل الزيوت النباتية وكذلك مخلفات التقطير ومنتجات الألبان [39]. وهي قابلة للتطبيق لحماية البيئة وإدارتها ، والمعالجة الحيوية للتربة [40] ، واستعادة النفط الخام ، وتنظيف المياه الجوفية الملوثة بالهيدروكربونات ، واستخلاص النفط المحسن [41] ، والعوامل المضادة للميكروبات في الرعاية الصحية [36] أو في مجموعة متنوعة من العمليات الصناعية التي تنطوي على الاستحلاب أو الرغوة أو التنظيف أو الترطيب أو التشتت أو الذوبان [42].

توجد الكائنات الحية الدقيقة المنتجة للليباز أيضًا في المصادر الملوثة بالدهون والزيوت. وبالتالي ، فهي تنشأ من مياه الصرف الصحي لصناعة الألبان ، والأسر المعيشية والتكنولوجيا الحيوية. قد تؤدي المنافسة الشديدة على مصادر الكربون المحدودة إلى تطور جينات جديدة و / أو مسارات كيميائية حيوية جديدة في البيئة المتخصصة لمياه الصرف الصحي [43]. لذلك ، في هذه الدراسة ، قمنا بعزل الليباز والكائنات الدقيقة الأخرى المنتجة للإنزيم المائي وتقييم قدراتها على تحلل الدهون والزيوت.

2.1. اختيار الكائنات الدقيقة المنتجة للليباز باستخدام التريبوترين كركيزة للنمو

تمتلك مجموعتنا حاليًا مخزونًا ميكروبيًا يتكون من أكثر من 1100 من الكائنات الحية الدقيقة المحللة للدهون والتي تم الحصول عليها بشكل عشوائي. من بين هذه المكتبة ، تم اختيار 35 سلالة لهذه الدراسة تم عزلها في الأصل من أربعة خزانات مختلفة للصرف الصحي. تم الحصول على عينات من مياه الصرف الصحي في منزلين مزرعة (A و C) ، صناعة الألبان (B) ، وصناعة التكنولوجيا الحيوية (D). تم نشر العينات أو تخفيفها في الماء المعقم فوق أجار سبيريت بلو (Himedia ، مومباي / الهند) مكملًا بنسبة 3 ٪ (ت / ت) مستحلب ثلاثي البوترين (20 ٪ تريبوترين 0.2 ٪ تريبوترين 0.2 ٪ توين 80). بعد الحضانة عند 25 درجة مئوية لمدة 1 - 7 أيام ، تم عزل وتنقية المستعمرات المحللة للدهون التمثيلية لكل نوع شكلي في نفس الوسط. تم الحفاظ على السلالات في وسط LB (10.0 جم / لتر ببتون ، 5.0 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، و 5.0 جم / لتر كلوريد الصوديوم) مكملًا بنسبة 50 ٪ (حجم / حجم) مصل بقري جنيني وحفظها عند & # 872280 & # 730 درجة مئوية.

2.2. تحديد المظهر الأنزيمي المتحلل للمركبات العضوية بين الكائنات الدقيقة المختارة المحللة للدهون

تم تلقيح السلالات المحللة للدهون في 2 مل من مرق LB في طبق من 96 بئر. بعد 24 ساعة عند 25 & # 730 درجة مئوية و 30 هرتز من التحريض ، تم تلقيح 2 & microl من الثقافة في الوسائط التالية: 1) تريبوترين-أغروس [1٪ (وزن / حجم) أغروس 50 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك pH 6،8 1 ملي كلوريد الكالسيوم2 0.6٪ (حجم / حجم) مستحلب ثلاثي البوتيرين - لاكتشاف الليباز] 2) كازين-أغاروز [1٪ (وزن / حجم) أغروس ، 1 ملي كلوريد الكالسيوم2، 10٪ (حجم / حجم) من محلول الكازين في 1X PBS pH 7.4 - لاكتشاف نشاط إنزيم الكازيناز] 3) نشا الذرة - الاغاروز [1٪ (وزن / حجم) agarose 50 ملي مولار Tris-HCl pH 6.8 ، 1 ملي CaCl2، 0.5٪ (وزن / حجم) نشا الذرة - لاكتشاف الأميلاز] 4) كاربوكسيميثيل سلولوز-أغروس [1٪ (وزن / حجم) أغروس ، 50 ملي مولار Tris-HCl pH 6.8 ، 1 ملي CaCl2، 0.5٪ (وزن / حجم) كربوكسي ميثيل سلولوز - لاكتشاف السليلوز المعدل من Akhtar et al. [44] و 5) وسائط الجيلاتين [2 مل من الوسائط / أنبوب الفحص: 50 مم Tris-HCl الأس الهيدروجيني 6.8 ، 1 مم CaCl2، 10٪ (وزن / حجم) جيلاتين - لاكتشاف البروتينات الخاصة بالجيلاتين] ، تم تكييف صياغة كل تلك الوسائط من Vuong et al. [45]. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة عند 25 & # 730 درجة مئوية ، تم الكشف عن الأنشطة الأنزيمية من خلال تقييم وجود هالة واضحة في اختبارات الوسائط المذكورة أعلاه باستثناء وسائط الجيلاتين (انظر أدناه). بالنسبة لوسائل الإعلام 1 ، تم الحصول على النتيجة عن طريق الملاحظة المباشرة. الوسائط 2-4 تتطلب الوحي قبل التحليل النهائي للنتائج على النحو التالي: 2) حضانة لمدة دقيقتين مع محلول HCl 1 N لترسيب الكازين المتبقي 3) 2 دقيقة حضانة مع 2٪ من محلول اليود لتلوين النشا المتبقي 4) 30 دقيقة حضانة مع أحمر الكونغو [0.25٪ (وزن / حجم) في 0.1 مولار Tris-HCl ، pH 8،0) متبوعًا بـ 5 دقائق في محلول تقطير (0.5 M NaCl ، 0.1 M Tris-HCl ، pH 8.0) [46]. كانت الكائنات الحية الدقيقة التي أنتجت بروتيازًا خاصًا بالجيلاتين قادرة على إسالة وسط الجيلاتين في الوسط 5.

لتقييم قدرة الاستحلاب للعزلات ، تم تلقيح 200 وماكرول من مزرعة ذات كثافة بصرية (OD 600 نانومتر) 0.5 في 35 مل من مرق LB مع 2٪ زيت فول الصويا. ثم تم تحضين الثقافة لمدة 35 يومًا عند 37 & # 730 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة. عندما حدث استحلاب الزيت في الوسائط ، اكتسب مظهرًا حليبيًا واتساقًا.

2.3 توصيف الليباز خارج الخلية

2.3.1. إنتاج المستخلص الأنزيمي خارج الخلية

نمت الخلايا (500 & microl) في وسط LB لمدة 24 ساعة تحت تقليب 30 هرتز عند 25 & # 730 درجة مئوية ثم زرعها على سطح غشاء غسيل الكلى المعقم (12000 Da) الذي كان له نفس القطر كطبق بتري. تم وضع الغشاء بعد ذلك على أجار سبيريت بلو الذي يحتوي على 0.6٪ (حجم / حجم) ثلاثي البوتيرين وحضنت في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 1-7 أيام (انظر قسم النتائج) [47]. تم غسل الأغشية بـ 2 مل من المخزن المؤقت (10 ملي مولار Tris-HCl pH 8.4 و 40 ملي مول كلوريد الصوديوم). بعد ذلك ، أجريت جميع الخطوات التجريبية على الجليد. تم طرد المعلق الخلوي عند 25000 جم لمدة 20 دقيقة عند 4 & # 730 درجة مئوية وترشيحه من خلال مرشح 0.22 وميكروم. بعد ذلك ، تم تطبيق 4 & microl من مستخلص الإنزيم على Tributyrin-agarose (الوسيط الموصوف سابقًا) وحضنت لمدة 24 ساعة عند 25 & # 730 درجة مئوية للتحقق من نشاط الليباز.

2.3.2. تحديد درجة الحموضة المثلى ودرجة حرارة العمل

تم اختبار الأس الهيدروجيني الأمثل باستخدام 2 مل من مرق ثلاثي البوترين الطازج بنسبة 0.3٪ [50 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك - تم تقييمه عند قيم الأس الهيدروجيني 4.3 و 6.8 و 9.8 و 12.3 - 1 ملي كلوريد الكالسيوم2، و 1.5٪ (حجم / حجم) مستحلب ثلاثي البوترين] و 75 وماكرول من المستخلص الأنزيمي في كفيت 1 سم. تم اختبار درجة الحرارة المثلى باستخدام 2 مل من نفس المرق عند درجة الحموضة المثلى و 75 وماكرول من المستخلص الأنزيمي. كانت درجات الحرارة المحللة 4 & # 730 درجة مئوية ، 25 & # 730 درجة مئوية ، 37 & # 730 درجة مئوية ، و 50 & # 730 درجة مئوية. تم قياس الانخفاض في OD عند 800 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي Shimadzu مزدوج الشعاع (UV-ISO-02 ، كيوتو ، اليابان) باستخدام عنصر تحكم سلبي كمعيار عند 0 و 3 و 21 ساعة من الحضانة.

2.3.3. القياس الكمي لنشاط الليباز في استرات P-Nitrophenyl

تم إجراء اختبار الليباز عن طريق قياس الزيادة في الامتصاصية عند 405 نانومتر في قارئ صفيحة حرارية (TP-reader) الناجم عن إطلاق p-nitrophenol بعد التحلل المائي لـ p-nitrophenyl-butyrate (C4) ، decanoate (C10) ، وبالميتات (C16) عند 25 & # 730 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند درجة الحموضة 8.0 كما هو موضح سابقًا [48] ، ولكن تم تعديله بإضافة 10 ملي مولار CaCl2 إلى المحلول B. تم استخدام عنصر تحكم خالٍ من الإنزيم كمرجع. تم تعريف وحدة واحدة من الليباز (U) على أنها كمية الإنزيم التي تطلق 1 & micromol p-nitrophenol لكل دقيقة في ظل ظروف الفحص.

2.3.4. اختبار نشاط الليباز في وجود العوامل الكيميائية والمقاومة الحرارية

لمزيد من التوصيف ، تم تقييم المقاومة الحرارية والكيميائية باستخدام p-NPB كركيزة. تمت إضافة المحلول B الموصوف أعلاه بأحد المركبات الكيميائية التالية: 0.25٪ (حجم / حجم) H2ا2، 0.1٪ (v / v) NaClO ، 0.1٪ (v / v) منظف سائل ، أو 10 ملي EDTA. للمقاومة الحرارية ، تم تحضين مستخلصات الإنزيم خارج الخلية لمدة 30 دقيقة عند 50 & # 730 درجة مئوية وتم تقييم النشاط المتبقي أيضًا باستخدام p-NPB كركيزة.

2.4 تحديد الكائنات الدقيقة

تم تحضير الحمض النووي الجيني من مجموعة من الخلايا التي نمت في أجار LB لمدة 24 ساعة. تم تعليق بيليه الخلية في 250 وماكرول من المحلول I (50 ملي مولار من الجلوكوز ، 25 ملي مولار من Tris-HCl pH 8.0 ، و 10 ملي مول EDTA). تم تحليل الخلايا عن طريق إضافة 25 وماكرول من المحلول II [200 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم و 1 ٪ (وزن / حجم) SDS] ، وخلطها لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، تمت إضافة 500 ومايكروول من المحلول I و 2.5 وماكرول من RNAse A (10 مجم / مل) واحتضانها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. تم تكييف هذه المنهجية من التحلل القلوي الذي تم وصفه لأول مرة بواسطة Birnboim & amp Doly [49]. تم بعد ذلك تنقية الحمض النووي باستخدام الفينول كلوروفورم باستخدام بروتوكول معمل قياسي وبعد هطول الأمطار ، تم تعليق الحمض النووي في 30 وميكروول من TE (10 ملي مولار من Tris-HCl pH 8.0 و 1 ملي مولار EDTA).

2.4.2. التضخيم الجيني RNA الريبوسوم

تم التعرف على العزلات البكتيرية عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي. تم إجراء تفاعل PCR كما تم وصفه سابقًا [50] باستخدام البادئات 8F (5'-AGAGTTGATYMTGGCTCAG-3 ') [51] و 907R (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') [52]. تم إجراء التعرف على الفطريات كما هو موضح سابقًا [53] عن طريق تسلسل D1D2 لـ 26S rDNA باستخدام البادئات NL1 (5'-GCATCAATAAGCGGAGGAAAAG) و NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG). تم تحليل تسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بروتوكولات معيارية مع فاصل صبغة نيوكليوتيد ديديوكسي (Big Dye مقابل 3.1— Applied Biosystems ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) والمحلل الوراثي 3130 (Applied Biosystems ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم فحص جميع تسلسلات الجينات 16S و 26S rRNA للتأكد من جودتها ومواءمتها وتحليلها باستخدام CodonCode Aligner v.3.7.1 (CodonCode Corp. ، Centerville ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت مقارنة جميع التسلسلات مع التسلسلات المرجعية في مشروع قاعدة بيانات الريبوسوم (RDP) باستخدام مطابقة التسلسل والتسلسلات في GenBank باستخدام BLASTN.

2.5 تحريض إنتاج الليباز والتأثير التآزري بين السلالات المختلفة

تم تحفيز اللقاح المسبق لخمس عزلات مختلفة باستخدام ثلاثي بوتيرين أو ترك دون علاج (مجموعة تحكم) لتقييم ما إذا كان التمثيل الغذائي الميكروبي قد زاد أم لا بواسطة هذا ثلاثي الجليسريد (ما قبل الحث). بعد ذلك ، تم تلقيح 100 وميكرول من اللقاح المسبق من كل عزلة في مرق LB يحتوي على 10 ميكرول ألمار الأزرق في أربع مجموعات معالجات مختلفة: 1) بدون مكملات ، 2) مكمل بـ 2٪ تريبوترين ، 3) مكمل بزيت فول الصويا 2٪ ، أو 4) مكمل بزيت فول الصويا 2٪ مستحلب بمستخلص بكتيري معقم يحتوي على الليباز لتقييم التآزر المحتمل بين السلالات المختلفة. أشارت مراقبة النسبة المئوية لتخفيض ألامار الأزرق إلى الظروف التي أظهرت فيها المزرعة ارتفاعًا في التمثيل الغذائي. أشار حساب الانحراف المعياري إلى الفروق بين القيم المقدرة والمتوسط. تم إجراء اختبار ANOVA الثنائي مع Bonferroni اللاحق باستخدام الإصدار 5.03 من GraphPad Prism لنظام التشغيل Windows [54].

تم اختيار مخزوننا من الميكروبات المحللة للدهون من خلال وجود هالة حول المستعمرات عند انتشار المياه العادمة فوق أجار سبيريت بلو المضاف إليه 3٪ (حجم / حجم) مستحلب تريبوترين. بسبب هذه الدهون الثلاثية تتكون من الجلسرين وثلاث سلاسل من أربع كربون ، يفضل اختيار الإسترات على الليباز. ومع ذلك ، نظرًا لأنه يمكن أيضًا تصنيف أي ليباز على أنه إستراز ، فقد أظهر البعض أيضًا نشاط تحلل الدهون بين الكائنات الحية الدقيقة المختارة.

يوفر تحليل تسلسل 16S / 28S rDNA تحديدًا جزيئيًا للعزلات. موقع جمع الكائنات الحية الدقيقة ، والتعرف عليها ، وإنتاج الفاعل بالسطح [القدرة على استحلاب 2٪ (حجم / حجم) زيت فول الصويا في وسط المزرعة] ، والملف الأنزيمي ضد agarose Tributyrin ، وكازين الاغاروز ، ووسائط الجيلاتين ، ونشا الذرة الاغاروز ، وكربوكسى ميثيل سلولوز الاغاروز. الجدول 1 . مجموعة

الجدول 1 . موقع التجميع ، والتعرف ، وأرقام دخول GenBank ، والملف الأنزيمي للعزلات.

(-) لا يوجد نشاط إنزيمي (+) نشاط إنزيمي منخفض (حجم المستعمرة / حجم الهالة * أقصى وقت تجريبي كان 36 يومًا.

قدم الموقعان A و B غلبة لأفراد عائلة Bacillaceae وفي الموقعين C و D ، لاحظنا Enterobacteriaceae و Pseudomonas و Bacillus spp. في الموقع D ، Pseudomonas sp. كانت سائدة.

تعتبر الليباز البكتيري خارج الخلية ذات أهمية تجارية ، حيث يمكن إنتاج آلاف وحدات الليباز من عدة لترات فقط من وسط المزرعة [55]. تكون الليباز البكتيري في الغالب خارج الخلية وتتأثر بشكل كبير بالعوامل الغذائية والفيزيائية ، مثل درجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، ومصادر النيتروجين والكربون ، ووجود الدهون ، والأملاح غير العضوية ، والإثارة ، وتركيز الأكسجين المذاب [55]. الليباز هي في الغالب إنزيمات محفزة وبالتالي يتم إنتاجها بشكل عام في وجود مصدر دهني ، أو أي محفز آخر ، مثل ثلاثي الجلسرين والأحماض الدهنية والإسترات القابلة للتحلل المائي والتوين والأملاح الصفراوية والجلسرين [55-57]. ومع ذلك ، فإن إنتاجها يتأثر بشكل كبير بمصادر الكربون الأخرى ، مثل السكريات ، وكحول السكر ، والسكريات المتعددة ، ومصل اللبن ، وأحماض الكازامينو ، وغيرها من المصادر المعقدة [58،59]. لذلك ، تم إنتاج 10 مل من المستخلص خارج الخلية لتوصيف الليباز لكل من العزلات الـ 35. على الرغم من استخدام محث في هذه الخطوة ، لا يمكن استعادة نشاط الليباز لعزلتين (A9 - Staphylococcus spp.- و B9 - Bacillus spp.) ، حتى مع تحريض التريبوترين (الجدول 2). في النظام البيئي لمصائد الشحوم ، يمكن أن يؤدي التعايش بين السلالات الميكروبية إلى توفير الاحتياجات الغذائية بسبب التحلل الجزئي للبوليمرات الحيوية الأخرى الموجودة بشكل طبيعي في مياه الصرف الصحي. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي المنافسة على العناصر الغذائية والتفاعل الميكروبي أيضًا إلى تحريض تعبير الليباز بحيث يظل نشطًا خلال الثقافات الفرعية القليلة الأولى. وجدنا أن كل سلالة تتطلب فترة حضانة مختلفة للتعبير عن الليباز خارج الخلية (الجدول 2). تمت مراقبة فترة الحضانة الدقيقة المطلوبة للتعبير عن الليباز فوق غشاء غسيل الكلى عن طريق الحضانة المتوازية في أجار الروح الأزرق المضاف إليه ثلاثي البوترين. تجدر الإشارة إلى أنه لم يتم تحديد حالة النمو الأمثل لكل سلالة على حدة.

الجدول 2 . موقع التجميع ، وفترة الحضانة على غشاء غسيل الكلى ، ودرجة الحموضة المثلى ، ودرجة الحرارة المثلى ، والقياس الكمي في وحدات الليباز باستخدام p-NPB (C4) و p-NPD (C10) و p-NPP (C16).

* مجموعة القيم التي يحتفظ فيها المستخلص بأكثر من 70٪ من نشاطه ** يتم تعريف وحدة واحدة من الليباز (U) على أنها كمية الإنزيم الذي يطلق 1 & micromol p-nitrophenol لكل دقيقة ، في ظروف الفحص *** أرقام تشير الأقواس إلى القيمة التي أظهر فيها الإنزيم نشاطًا أعلى - تشير أحيانًا إلى مجموعة من القيم.

بعد تأكيد نشاط الليباز ، تم تحديد درجة الحموضة ودرجة الحرارة المثلى للمستخلصات (الجدول 2). من بين المقتطفات ، كانت الليباز ميسوفيليك ذات الرقم الهيدروجيني الأمثل في النطاق الأساسي سائدة ، ولكن لوحظت أيضًا العوامل النفسية والحمضية. بشكل عام ، يكون للليباز البكتيري نشاط مثالي عند درجة الحموضة المحايدة أو القلوية [60-63]. تنشط الليباز من أنواع العصيات على نطاق واسع من الأس الهيدروجيني (الرقم الهيدروجيني 3-12) [64] ، وتشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن مستخلصات الليباز التي تنتجها أنواع العصيات غالبًا ما تقدم أكثر من قيمة pH مثالية. ومع ذلك ، على عكس نتائج الدراسة السابقة ، أظهرت الليباز التي تفرزها عزلاتنا التي تنتمي إلى جنس العصيات نشاطًا أقل في درجات الحرارة العالية ، مع نشاط مثالي في درجات الحرارة المتوسطة. فقط الليباز التي تفرزها بكتيريا B. cereus كانت أكثر مقاومة للحرارة ، ووصلت إلى النشاط الأمثل عند 50 & # 730 درجة مئوية. أظهرت بعض مستخلصات الليباز الخاصة بنا ثباتًا حراريًا يصل إلى 50 & # 730 درجة مئوية واحتفظت بأكثر من 70٪ من النشاط بعد المعالجة الحرارية لمدة 30 دقيقة ، بما في ذلك A5 (Terribacillus sp.) و A10 (عائلة Flavobacteriaceae) و B3 و B4 و B5 (Lysinibacillus spp. .) و B7 و B8 و C5 (Bacillus subtilis) و B10 (الارتباط المتبادل بين Bacillus sp. و Staphylococcus epidermidis) و B11 (Bacillus cereus) و C2 و D2 و D3 و D5 و D7 (Pseudomonas spp.) و D1 (Bacillus megaterium) (الجدول 3). تم بالفعل وصف المقاومة الحرارية للليباز من Bacillus و Pseudomonas [65-68].

الجدول 3 . النسبة المئوية لنشاط الليباز المتبقي بعد العلاجات المختلفة.

تظهر النتائج لنشاط الليباز بعد الحضانة في وجود 1 0.25٪ (حجم / حجم) H2ا2، 2 0.1٪ (حجم / حجم) NaClO ، 3 0.1٪ (حجم / حجم) منظف سائل ، 4 10 مم EDTA ، أو 5 بعد المعالجة الحرارية لمدة 30 دقيقة عند 50 & # 730 درجة مئوية. تم استخدام التحلل المائي لـ p-NPB (C4) لجميع القياسات. تم استخدام الضوابط مع عدم وجود علاج للمقارنة.

تتمتع الليباز البكتيري عمومًا بالنشاط الأمثل في نطاق درجة الحرارة من 30 & # 730 درجة مئوية - 60 & # 730 درجة مئوية ، ومع ذلك فقد أظهرت بعض التقارير أن الليباز البكتيري موجود بالنشاط الأمثل في كل من درجات الحرارة المنخفضة والعالية [60،61،63، 69]. تم إجراء تقدير كمية الليباز باستخدام pNP-butyrate (C4) و decanoate (C10) و palmitate (C16) في حالة ثابتة لجميع الإنزيمات ، عند 25 & # 730 درجة مئوية ودرجة الحموضة 8.0 (الجدول 2). كانت غالبية مستخلصات الليباز نشطة في إسترات قصيرة السلسلة ، وهو ما كان متوقعًا منذ أن تم الاختيار باستخدام التريبوترين. بالإضافة إلى ذلك ، تتوافق هذه النتائج مع حقيقة أن جميع الليباز هي أيضًا إسترات وتؤوي نشاط استيروليتيك. ومع ذلك ، فإن العزلات A2 و A10 و B4 و B5 و B6 و C1 و C2 و D2 و D3 و D4 و D5 و D6 و D7 أظهرت تقاربًا أكبر للإسترات طويلة السلسلة ، وبالتالي تميز مستخلص الليباز "الحقيقي" ، منذ " استرات تحلل الليباز الحقيقية مع أكثر من 10 ذرات كربون (الجدول 2).

هناك ثلاث فئات من الليباز الميكروبي: غير محدد ، محدد ، خاص بالأحماض الدهنية [55]. تعمل الليباز غير المحدد بشكل عشوائي على جزيئات ثلاثي الجليسريد ، مما يؤدي إلى الانهيار الكامل لحمض tofatty والجلسرين. الليباز الخاص هو 1 ، 3 ليباز خاص يتحلل بالماء فقط روابط الإستر الأولية ، والتي لوحظت في الليباز التي تنتجها بعض أنواع العصيات. المجموعة الثالثة ، الليباز الخاص بالأحماض الدهنية ، تشتمل على تلك التي لها تفضيل واضح للأحماض الدهنية [55]. على الرغم من إظهار النشاط على تريبوترين-أغروس ، فإن A7 المعزول (Bacillus pumillus) كان غير نشط عند تقييمه للتحلل المائي لـ pNP-ester مع 4 و 16 كربون وأظهر نشاطًا ضعيفًا لـ pNP-ester مع 10 ذرات كربون. يمكن تفسير ذلك من خلال حقيقة أن بعض الليباز لها تقارب مع ثلاثي الجلسرين ، حيث لا تظهر أي نشاط أو نشاط ضئيل ضد الدهون الأحادية والثنائية [17،70]. الاحتمال الآخر هو أن عزلة A7 كانت في الأصل قادرة على إنتاج أكثر من نوع واحد من الإستريز. ومع ذلك ، على مدار الممرات في المختبر ، بدأت السلالة في التعبير فقط عن الإستريز الذي يحلل إستر 10 ذرات كربون. وقد لوحظ هذا السلوك في بعض الأنواع في المختبر.بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن نظامنا لم يكن حساسًا بدرجة كافية لاكتشاف التعبير المنخفض بعد عدة مقاطع في وسائط الثقافة.

يمكن ملاحظة بعض أوجه التشابه البيوكيميائية بين الكائنات الحية الدقيقة بنفس التعريف. Lysinibacillus spp. أظهرت العزلات العديد من أوجه التشابه ، بما في ذلك التعبير عن الليباز النشط خلال 48 ساعة من الحضانة ، مع وجود درجة حموضة مثالية قلوية ودرجة حرارة مثالية 37 & # 730 درجة مئوية أعلى ، وعدم وجود نشاط الجيلاتيناز أو الكازيناز أو الأميليز. عشرين سلالة تنتمي إلى عائلة العصيات ، منها 15 تنتمي إلى جنس العصيات. كانت جميع السلالات التي تم تحديدها على أنها ب. أعربوا عن الليباز خارج الخلية بعد 24 ساعة من الحضانة على غشاء غسيل الكلى وكان للليباز نشاطهم الأمثل عند درجة الحموضة في النطاق القلوي. بالإضافة إلى ذلك ، هذه السلالات هي mesophilic / psicrophilic وتكون أكثر نشاطًا ضد الإسترات مع 4 ذرات كربون فقط. من بين السلالات الخمس التي تم تحديدها على أنها B. subtilis ، كانت جميعها منتجة للأميلاز والسليولاز. كانت خمسة منها أيضًا قادرة على إنتاج بروتياز خاص بالجيلاتين ، لكن 4 سلالات فقط كانت قادرة على إنتاج بروتياز خاص بالكازين أيضًا. كان لجميع ليباز B. subtilis الخمسة نشاط أفضل عند درجة حموضة قلوية وضد 4 إسترات كربون. من بين السلالات الخمس التي تم تحديدها على أنها Pseudomonas spp. جميعهم كانوا من منتجي الأميليز والسليوليز ، وكان 4 منهم لا يزالون قادرين على إنتاج بروتياز الجيلاتين والكازين. كل الليباز Pseudomonas قدم نشاطًا كبيرًا عند 37 & # 730 درجة مئوية وضد 10 استرات ذرات كربون ، مما يشير إلى وجود نوع واحد على الأقل من الليباز (الجدولان 1 و 2) .

للتقييم الأولي للاستخدام المحتمل للليباز في معالجة مياه الصرف الصحي ، تم تقييم المقاومة الحرارية والكيميائية للإنزيمات باستخدام p-NPB كركيزة (الجدول 3). يتم إطلاق الكثير من منتجات التنظيف والمركبات الكيميائية الأخرى يوميًا من مصائد الشحوم. لم يحتفظ أي من المستخلصات بأكثر من 70٪ من النشاط المتبقي في جميع الظروف التي تم تحليلها. أظهرت العزلة A2 (غير المصنفة Saccharomycetales) أفضل النتائج لجميع الظروف مجتمعة وحافظت على أكثر من 50 ٪ من النشاط المتبقي في وجود H2ا2، NaClO ، منظف سائل ، EDTA ، ومعالجة حرارية. المستخلصات الأخرى التي أظهرت نتائج جيدة شملت B6 (من Bacillus cereus) و B12 (من Acetobacter pasteurianus). أظهروا نشاطًا متبقيًا في أكثر من 20 ٪ من جميع الظروف. بالإضافة إلى مستخلص A2 ، يمكن أن تكون مجموعة المستخلصات مفيدة أيضًا لتطوير طريقة بيولوجية لتنظيف O & ampG من مصائد الشحوم ومعدات محطة معالجة مياه الصرف الصحي. قد يكون التثبيط القوي الناتج عن منظف 0.1٪ (حجم / حجم) ناتجًا عن تعطيل الإنزيم نتيجة لاختلال بنيته الثلاثية. عند غسل الأطباق أو الملابس أو الأرضيات ، يتم إطلاق تركيزات عالية من المنظفات والصابون في المجاري خلال فترة زمنية قصيرة. لذلك ، يعد اختيار إنزيم مستقر جانبًا مهمًا لمعالجة مياه الصرف الصحي. لذلك ، قمنا بتحليل قدرة العزلات على إنتاج العديد من الإنزيمات المتدهورة ووجدنا أن العزلات B2 و B8 و C4 و C5 و D1 و D2 و D7 قدمت مجموعة واسعة من القدرة في استخدام البوليمرات الحيوية الموجودة عادة في مياه الصرف الصحي (الجدول 3). جميع هذه العزلات تنتج البروتياز وإنزيم تحلل مائي واحد آخر على الأقل إلى جانب الليباز. من بين السلالات الـ 35 ، تمكن أكثر من 70٪ من إنتاج إنزيمين على الأقل أو أكثر. يسمح هذا النهج المتعدد باستخدام عدد قليل من العزلات في معالجة مياه الصرف الصحي ، حيث أن كل واحدة على حدة لديها القدرة على إفراز أكثر من إنزيم في وقت واحد. يمكن أن يقلل هذا أيضًا من متطلبات المكملات الغذائية للنظام. من بين الليباز خارج الخلية المنتج من 35 سلالة ، كان حوالي 45٪ مقاومة لـ 0.25٪ (حجم / حجم) H2ا2، ما يقرب من 20 ٪ كانت مقاومة لـ 0.1 ٪ (حجم / حجم) من NaClO أو 10 ملي مولار EDTA ، وأكثر من 50 ٪ كانت مقاومة لمنظف سائل 0.1 ٪ (حجم / حجم) (الجدول 3).

تشمل تقنيات المعالجة الحيوية في الموقع إدخال سلالات مختلفة من الكائنات الحية الدقيقة إلى مياه الصرف الصحي في مراحل مختلفة من معالجتها. تقدم جميع الطرق المعروفة تقريبًا لمعالجة الحمأة سلالات جرثومية في مرحلة تسجيل النمو. هذه الميكروبات في طور نشط من التكاثر ، لكن عملها يتطلب وقتًا لتحلل الركائز [71]. Estera et al. [72] سبق تطوير طريقة لتقليل وقت التحلل ، والتي تتضمن أولاً توفير خليط إنزيم قادر على هضم المواد البوليمرية الطبيعية ، وإضافة نوع واحد على الأقل من البكتيريا المخمرة إلى النظام القادر على تخمير المعلق الناتج . داش وآخرون. [71] وصف تركيبة لمعالجة مياه الصرف لإزالة الملوثات التي تتكون من تركيبة تآزرية من الميكروبات والإنزيمات والعوامل المساعدة / العناصر الغذائية. تم اختيار الميكروبات في التركيبة Pseudomonas aeruginosa و Pseudomonas fluorescens و Pseudomonas putida و Pseudomonas desmolyticum و Coriolus versicolour و Lactobacillus sp. تشمل الإنزيمات المنتجة البروتياز ، والليباز ، والأميلاز ، وأكسيداز الجلوكوز ، وغيرها. يُظهر هذا التكوين التآزر ويزيل الملوثات بشكل فعال من مياه الصرف الصحي. تعمل الإنزيمات عن طريق فصل الجزيئات إلى أشكال أبسط ، وتستخدم الميكروبات هذه الوسائط في عملية التمثيل الغذائي ، مما يؤدي إلى التحلل الكامل للملوثات في مياه الصرف الصحي. سوف تنمو الميكروبات بشكل أسرع بسبب زيادة توافر المواد الوسيطة ، وبالتالي ستنتج المزيد من الإنزيمات التي يمكن أن تزيد من تدهور الملوثات. وبالتالي ، فإن الإنزيمات والميكروبات مترابطة وتعمل معًا لتسهيل تدهور أسرع لجزيئات الملوثات [71].

الكائنات الحية الدقيقة المتنوعة قادرة على تحلل أنواع مختلفة من الزيت. ومع ذلك ، يمكن أن تكون عملية التحلل البيولوجي طويلة بسبب انخفاض قابلية الذوبان في الماء للزيت [73]. في الظروف الطبيعية أو المستحثة ، العديد من الكائنات الحية الدقيقة قادرة على إنتاج عوامل الاستحلاب ، مما يقلل من الوقت اللازم للتحلل البيولوجي لـ O & ampG من خلال تعزيز التوافر البيولوجي للركيزة الكارهة للماء [74]. تم الإبلاغ مؤخرًا عن تخليق الإستريز المرتبط بالخلية بالاشتراك مع توليد المواد النشطة السطحية ، مما يشير إلى الوظيفة المقترنة للاستحلاب مع نشاط تحلل الدهون [75،76]. تزيد المواد الخافضة للتوتر السطحي من امتصاص الكائنات الدقيقة عندما تنمو على ركائز غير قابلة للذوبان وتزيد أيضًا من كفاءة المعالجة الحيوية [77].

كما هو موضح بواسطة Gautam et al. [78] ، Saharam وآخرون. [79] ، وباتاناتو وآخرون. [80] ، العديد من الأنواع التي تنتمي إلى أجناس Pseudomonas قادرة على إنتاج فئات مختلفة من المواد الحيوية. في دراستنا ، وجدنا أن العديد من العزلات التي تنتمي إلى تلك الأجناس وفئة العصيات (A3 ، A4 ، A5 ، A6 ، A7 ، B3 ، B4 ، B5 ، B10 ، C2 ، C4 ، C5 ، D2 ، و D5) كانت قادرة على الاستحلاب. 2٪ زيت فول الصويا ، على الرغم من أننا لم نحدد فئة المواد الحيوية المنتجة (الجدول 1).

Acetobacter pasteurianus هو نوع من البكتيريا المسببة للأسيتات يرتبط عادة بإنتاج النبيذ والفساد [81]. ينتج حمض الخليك بسبب الأكسدة غير الكاملة لمصدر الكربون إلى CO2 [81]. في دراستنا ، ارتبطت العزلات B12 و B13 بمياه الصرف وإنتاج الليباز. هذه الإنزيمات المتحللة بشكل مائي مائي تفضيلي مع استرات 4 ذرات كربون وكانت نشطة في نطاق الأس الهيدروجيني الأساسي. على الرغم من أوجه التشابه هذه ، فقد أظهروا مقاومة كيميائية وحرارية مختلفة ، مما يشير إلى أنهم على الأرجح إنزيمات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، لم تكن هاتان السلالتان قادرتين على إنتاج أي نوع آخر من الإنزيم المائي أو الفاعل للتوتر السطحي من بين تلك التي تم تقييمها.

وفقًا للأدبيات ، فإن استحلاب الدهون سيفضل تحللها المائي ، نظرًا لأن الإنزيمات المحللة للدهون القابلة للذوبان في الماء لها تلامس سطحي أكبر مع الركيزة المراد تحللها بسبب تحلل قطرات الدهون. لتقييم سلوك بعض عزلاتنا ، خضعت خمس سلالات مختلفة الاستحلاب وملامح التحلل المائي لتقدير كمية التمثيل الغذائي عن طريق تقليل اللون الأزرق ، في أربعة ظروف مختلفة: 1) وسط استزراع المرق LB ، 2) مرق LB مع 2 ٪ تريبوترين ( الدهون الثلاثية من 4 ذرات كربون) ، 3) رطل مع 2٪ زيت فول الصويا ، و (4) رطل مع 2٪ مستحلب الدهون (الشكل 1). أشار المنحنى الأولي لتخفيض ألمار الأزرق إلى أفضل حجم لما قبل اللقاح وفترة الحضانة المثلى في وجود الكاشف لكل سلالة. توضح الرسوم البيانية في الشكل 1 أن وجود الدهون المستحلب في وسط الاستزراع لم يؤدي إلى زيادة معدلات التمثيل الغذائي لأي من الكائنات الحية الدقيقة ، بل انخفض معدل التمثيل الغذائي. ومع ذلك ، فإن الحث السابق لإنتاج الليباز عن طريق إضافة تريبوترين إلى وسائط ما قبل التلقيح أثبت فعاليته في زيادة التمثيل الغذائي في جميع الظروف التجريبية لسلالات A3 و B1. كان الموقف الوحيد الذي لم يكن فيه الحث فعالًا هو السلالة B13 ، حيث كان اللقاح الأولي الذي لم يتم تحريضه أكثر كفاءة في التمثيل الغذائي في جميع الظروف التجريبية. ومع ذلك ، نظرًا لأن إنتاج الليباز قد يتأثر بمصدر الكربون المستخدم في عملية الحث ، فإن غياب إنتاج الليباز للسلالة B13 في وجود التريبوترين له ما يبرره ، حيث لم يتم تقييم أي محفز آخر. تم زيادة التمثيل الغذائي للسلالات B1 و B12 بشكل ملحوظ في وجود تريبوترين مقارنة مع وجود زيت فول الصويا ، وكانت هذه النتائج متوافقة مع التحلل المائي لاسترات p-nitrophenol. كانت السلالات B12 و B13 أيضًا أكثر كفاءة في التحلل المائي

شكل 1 . تم تحدي الحالة الأيضية لخمسة سلالات مختلفة عندما تم تحفيز اللقاح المسبق أو عدم تحريضه ضد ثلاثي الجليسيريد البسيط ، أو خليط معقد من ثلاثي الجليسيريد ، أو مستحلب زيتي لخليط معقد من ثلاثي الجليسيريد. تم إجراء القياس الكمي لعملية التمثيل الغذائي عن طريق تحديد نسبة التخفيض بنسبة 10 ٪ (حجم / حجم) كاشف ألمار الأزرق.

نيتروفينول الزبدات وأكثر نشاطًا أيضيًا في وسط LB يحتوي على 2 ٪ تريبوترين. ولوحظت نتائج مماثلة للسلالة D4 ، والتي كانت أكثر كفاءة في التحلل المائي p-nitrophenol decanoate وأكثر نشاطًا استقلابيًا في وسائط LB التي تحتوي على 2 ٪ من زيت فول الصويا (الشكل 1).

السليلوز هو البوليمر العضوي الأكثر شيوعًا. إنها المادة الأكثر انتشارًا في نفايات الزراعة وأكثر البوليمرات الحيوية المتجددة وفرة على وجه الأرض [82]. تتمثل الإستراتيجية الواعدة في استخدام هذا المصدر النشط والمتجدد في التحلل المائي بوساطة الكائنات الحية الدقيقة للجنوسليلوز المهمل ، متبوعًا بتخمير المركب الناتج ، والذي ينتج المستقلبات المرغوبة أو الوقود الحيوي [82]. من بين الكائنات الحية الدقيقة المحللة للدهون التي اخترناها ، قدم 34.3 ٪ أيضًا نشاطًا مائيًا ضد السليلوز CM. بارمار وآخرون [83] أظهر أن خليطًا من الإنزيمات المتحللة للماء ، مثل السليلاز والبروتياز والليباز ، بنسب متساوية من حيث الوزن ، يقلل من إجمالي المواد الصلبة العالقة (TSS) بنسبة 30٪ - 50٪ ويحسن ترسيب المواد الصلبة في الحمأة. لوحظت زيادة في اختزال المواد الصلبة مع زيادة تركيز الانزيم. حدث هذا الانخفاض بسبب التحلل المائي للبوليمرات المتبقية ، مما يثبت أن التآزر الأنزيمي يمكن أن يقلل بشكل فعال من المواد العضوية في مصانع معالجة مياه الصرف الصناعي.

توفر الثقافات المعزولة عن التنوع الهائل للكائنات الدقيقة مصدرًا رئيسيًا للمواد البيولوجية للمحفزات الحيوية الصناعية والتطبيقات البيئية الأخرى. قدمت الليباز والاسترات التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة مقاومات وانجذابات مختلفة. تم وصف الإنزيمات بهدف تحديد المرشحين المناسبين لاستخدامها في معالجة مياه الصرف الصحي. يشير الثبات الجيد للليباز المعزول في وجود عوامل كيميائية ، واستقرار حراري ، ونطاق واسع من نشاط الأس الهيدروجيني والتسامح ، وتقارب أطوال مختلفة من سلاسل الإستر إلى أن بعض هذه الإنزيمات قد تكون مرشحة جيدة للتحلل المائي للمركبات العضوية والبوليمرات الموجودة في مياه الصرف الصحي لمختلف الصناعات. نظرًا لأن الإنزيمات البكتيرية قوية للغاية ، فهي نشطة على نطاق واسع من درجة الحموضة ودرجة الحرارة وتمتلك مجموعة متنوعة من خصائص الركيزة ، يمكن استخدامها بسهولة في عمليات معالجة الحمأة ، نظرًا لأنها تمتلك مقاومة كافية لبعض العناصر الكيميائية ويمكن إنتاجها في بتكلفة منخفضة. يساهم عدم وجود متطلبات التنقية في تقليل تكلفة استخدام هذه الإنزيمات في معالجة مياه الصرف الصحي. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن أن يؤدي الجمع بين اثنين أو أكثر من الإنزيمات إلى تسهيل عملية التحلل المائي الكامل للدهون الثلاثية والبروتينات و lignocellulose التي تحدث عادة في نفايات العمليات الصناعية. ومع ذلك ، فإن الاختيار الدقيق للسلالات التي سيتم استخدامها في معالجة مياه الصرف الصحي أمر ضروري ، لأنه قد يكون من الممكن استخدام سلالات أقل لتحقيق نفس الغرض ، حيث أظهرت العديد من السلالات القدرة على إنتاج إنزيمين أو أكثر. سيضمن هذا أن التحلل المائي لجميع المركبات التي يتم التخلص منها بشكل شائع في مياه الصرف سيتم تحقيقه بشكل كافٍ. من أجل إعطاء انعكاس أكثر واقعية لقدرات التحلل لهذه الكائنات الحية الدقيقة ، ستستخدم المزيد من الدراسات حالة محاكاة لمياه الصرف الصحي الشائعة كمزرعة لاختبار قدرات التحلل ، وكذلك التركيز على تحسين ظروف التحلل المائي بهدف استخدام استراتيجيات الإنزيم / الميكروبية المشتركة لتحسين عمليات معالجة مياه الصرف الصناعي.

نشكر CNPQ على الدعم المالي ، رقم المشاريع: 580311 / 2008-2 ، 560912 / 2010-2 ، 551113 / 2011-1 ، 300721 ​​/ 2012-9.


التأثيرات التحفيزية لتحلل الكازين والبرولين في تحريض الكالس في المختبر وتجديد النبات من خمسة أرز في المياه العميقة (Oryza sativa L.)

التأثيرات التفاعلية للأنماط الجينية مع تحريض الكالس و تجديد النبات تركيبات متوسطة على تحريض الكالس تمت دراسة استجابة تجديد النبتة لخمسة أصناف من أرز إنديكا في المياه العميقة وهي هابيجانج أمان -1 وهابيجانج أمان -2 وهابيجانج أمان -8 ومرابجال وجوش. تمت زراعة سكاتيلوم البذور الناضجة على وسائط قاعدية MS و LS مكملة بمجموعات مختلفة من 2،4-D ، وكازين هيدروليزات (CH) وبرولين. في السيرة الذاتية. تم العثور على HA-8 ، مزيج الوسط الأساسي من MS + 2 mg L -1 2،4-D المكمّل بـ 0.6 ٪ (وزن / حجم) CH ليكون الأفضل لتكوين الكالون حيث كان تردد النداء 87 ٪. تم زيادة معدل نمو الكالس بشكل متكرر عن طريق إضافة تركيزات مختلفة من CH مع تحريض الكالس وسائط. من ناحية أخرى ، عندما تم استكمال البرولين في تحريض الكالس الوسائط لم يكن لها تأثير متبقي على نمو الكالس. تم نقل الكالسي الجنيني على وسط تجديد قائم على MS و LS مكمل بـ 2 مجم L -1 BAP وكذلك تركيزات مختلفة من الكازين المائي والبرولين. أعلى معدل تكرار (80٪) لوحظ في السيرة الذاتية. HA-1 على الوسائط القاعدية LS المكملة بـ 2 مجم L -1 BAP فقط. ومع ذلك ، أظهرت الدراسة الحالية ذلك تجديد النبات الوسائط المكملة بالبرولين ليست مثبطة لـ تجديد النبات ولكن لها تأثير محفز ملحوظ نسبيًا على التجدد من الكالس. هنا يتم تقليل مزيج الكازين المائي بشكل كبير تجديد النبات . أظهر التحليل الشامل لتغيرات ترددات النداء وتجديد النبات تفاعلًا متناقضًا بين وسائط الثقافة والأنماط الجينية.

خالدة ومحمد الفرقان ، 2006. التأثيرات التحفيزية لتحلل الكازين والبرولين في تحريض الكالس وتجديد النبات من خمسة أرز عميق في المياه (Oryza sativa L.). البيوتكنولوجيا ، 5: 379-384.

من حقبة ما قبل التاريخ إلى العصر الحديث ، كان الأرز أهم مصدر لتغذية الإنسان وساعد في الحفاظ على زيادة عدد السكان وتطور الحضارة الإنسانية. يمكن أن تؤدي التطورات الحديثة السريعة والرائعة في الهندسة الوراثية إلى إنتاج نباتات أرز معدلة وراثيًا منتجات جديدة تمامًا. سيكون الأرز هو الخيار المثالي لهذا الغرض ، خاصة أن أرز المياه العميقة يدعم ملايين من مزارعي الكفاف في جنوب وجنوب شرق آسيا. إنه مرض متوطن في بنغلاديش. تطورت التقنيات في المختبر لزراعة الخلايا والأنسجة والأعضاء النباتية بشكل كبير خلال العقود القليلة الماضية بسبب الميزة الكبيرة للتكنولوجيا الحيوية النباتية. يوفر استخدام الأنسجة البائسة مثل الأجنة الناضجة وغير الناضجة والنورات الصغيرة وقاعدة الأوراق الناضجة في مرحلة محددة من التطور أساسًا لمعظم الأرز زراعة الأنسجة الأنظمة. تجدد النباتات من أصناف أرز الإنديكا الرئيسية المزروعة فقير بشكل عام (Abe and Futsuhara، 1984 Kavi Kishor and Reddy، 1986). سمة مهمة للنباتات المشتقة من الأجنة الجسدية ، في تماثلها واستقرارها الوراثي (فاسيل ، 1995). قد تؤثر التوليفات المختلفة للوسط على الاختلافات في تكوين الكالس و تجديد النبات . في هذا التحقيق تأثير مكملات تحريض الكالس و تجديد النبات تمت دراسة الوسائط مع الكازين المائي (CH) والبرولين. ملاحظة من قبل Murashige و Skoog (1962) أن وجود CH سمح بتنمية قوية للأعضاء على نطاق أوسع من مستوى IAA و Kinetin. البرولين هو نوع واحد من حمض أميني . توفر الأحماض الأمينية للخلايا النباتية مصدرًا متاحًا على الفور للنيتروجين ويمكن أن يكون الامتصاص أسرع بكثير من المكون العضوي في نفس الوسط (Thom ، 1981). تم الإبلاغ عن أن تأثير تعزيز تجديد النبات عن طريق معالجة الجفاف من دشبذ الأرز يتزامن مع انخفاض محتوى البرولين في الكالس. تم تطوير بروتوكول فعال وقابل للتكاثر للأرز من خلال التطور الجنيني الجسدي من الكالس (Al-Forkan et al. ، 2005). يعتمد عدد وكتلة وتشكل الكالس المتكون على صفيحة القدم على الوسط الذي تم اختباره. بذلت جهود وطنية ودولية في الماضي لتحسين زراعة الأرز في المياه العميقة. ومع ذلك ، مع الأخذ في الاعتبار حجم المشكلة المتعلقة بزراعة الأرز في المياه العميقة والمعاناة المستمرة لملايين المزارعين في بنغلاديش ، فقد تم إعطاء الأولوية لضرورة البحث لتطوير نظام من الخلية إلى النبات في أرز المياه العميقة. لن يكون التطبيق الناجح لتكنولوجيا نقل الجينات المتاحة على الأرز ممكنًا إلا عندما تكون أنظمة التجديد القابلة للتكاثر متاحة بشكل روتيني. في هذه الدراسة قابلة للتكرار وفعالة تجديد النبات تم إنشاء النظام.

أجريت التجربة في مختبر زراعة الأنسجة النباتية في قسم النبات ، جامعة شيتاغونغ ، بنغلاديش خلال الفترة 2004-2005. تم استخدام خمسة أصناف من أرز المياه العميقة (O. sativa L.) وهي Habiganj Aman-1 و Habiganj Aman-2 و Habiganj Aman-8 و Murabajal و Gheoch في هذه الدراسة. تم استخدام الوسائط القاعدية القائمة على MS (Murashige and Skoog ، 1962) و LS (Linsmaier and Skoog ، 1965) مع تركيبات هرمونية وإضافات مختلفة مع 30 جم L -1 سكروز و 0.8٪ (وزن / حجم) وسائط أجار صلبة لتعزيز الكالس. من قشرة البذور الناضجة لأصناف مختارة.تم تكميل الوسائط القاعدية MS و LS بتركيبات مختلفة من 2 مجم لتر -1 2،4-د 2 مجم لتر -1 2 ، 4-D + 0.25 مجم لتر -1 برولين + 0.1٪ (وزن / حجم) CH 2 مجم لتر -1 2 ، 4-D + 0.2٪ (وزن / حجم) CH ، 2 مجم L -1 2،4-D + 0.4٪ (وزن / حجم) CH و 2 مجم L -1 2،4-D + 0.6٪ (w / v) CH. MS و LS مقرها تجديد النبات تم أيضًا استكمال الوسائط بتركيبات وتركيزات مختلفة من منظمات نمو النبات والمواد المضافة مثل 2 مجم L -1 BAP (RM-1 ، RM-4) 2 مجم L -1 BAP + 0.25 مجم لتر -1 2،4-D + تم استخدام 0.25 مجم لتر -1 برولين (RM-2 ، RM-5) و 2 مجم L -1 BAP + 0.1٪ (وزن / حجم) CH (RM-3 ، RM-6) لهذا الغرض. في الأقواس RM-1 و RM-2 و RM-3 يشار إليها على أنها MS أساسها و RM-4 و RM-5 و RM-6 فيما بعد يشار إليها على أنها وسائط LS ، على التوالي.

تم تجفيف البذور يدويًا وتعقيمها بنقع البذور في 0.2٪ (وزن / حجم) HgCl 2 لمدة 15 دقيقة وغسلها جيدًا (5-6 مرات) بالماء المقطر الزجاجي المعقم. ثم توضع البذور في طبق بتري يحتوي على 20 مل تحريض الكالس متوسطة ومحتضنة عند 26 & plusmn2 & deg C في الظلام. بعد 14 يومًا ، تم حساب عدد الكالسي المستحث (من MSS) لكل طبق بتري ، وتسجيله وإزالة البراعم والجذور الطويلة. ثم تم استزراع البذور المرفقة مع الكالس المشتق من سكوتيلا طازجًا على الوسط الخاص بها لمدة 14 يومًا أخرى تحت نفس حالة النمو كما هو مذكور سابقًا. تم نقل الكالسي الجنيني المشتق من MSS إلى وسط التجديد حيث تم ترسيخ الوسائط شبه مع 1٪ (وزن / حجم) أجار وحضنت في الظلام عند 26 & plusmn1 & deg لمدة 10 أيام. بعد ذلك تم استزراع الكالي في نفس الوسط باستثناء الوسيط شبه متصلب بنسبة 0.8٪ (وزن / حجم) أجار وظل تحت فترة ضوئية 16 ساعة عند 26 & plusmn1 & deg لمدة ثلاثة أسابيع. تم تسجيل ترددات تجديد النبتة بعد 20 يوم من نقل الأنسجة إلى وسط التجديد عند النسبة المئوية للكالس المشتق من سكوتيلا ينتج كل منها نبتة واحدة أو أكثر. تم فصل كل لقطة (ارتفاع 2-3 سم) عن كالي فردي وتضاعفت كل لقطة بالنقل لمدة 20-30 يومًا على وسط التجديد. بعد ذلك تم استزراع المواد المجددة على وسط تأصيل MS + 1.5 مجم لتر -1 NAA. ثم تم نقل النبتات المتطورة جيدًا إلى الحالة الطبيعية في وعاء.

يتكون نوعان من الكاليس في منطقة سكوتيلا من البذور المستزرعة. كان أحد أنواع الكالس مدمجًا وعقديًا في البنية ويسمى الكالس الجنيني (الشكل 1 أ). كان النوع الآخر من الكالس هشًا وشفافًا ولزجًا ولم يشكل أبدًا أجنة ويسمى الكالس غير الجنيني. ومع ذلك ، فقد تكاثر هذا النوع من الكالس بشكل أسرع. تم الحصول على أعلى نسبة من إنتاج الكالس 87 و 82٪ على الوسائط القائمة على MS و LS ، على التوالي ، حيث يتم استكمال كل من الوسائط القاعدية بـ 2 مجم L -1 2،4-D + 0.6٪ (وزن / حجم) CH في cv. HA-8 (الجدول 1). تم تسجيل فروق ذات دلالة إحصائية في النسبة المئوية لإنتاج الكالس بين الوسائط مثل 2 ملجم لتر -1 2،4-د 2 ملجم لتر -1 2،4-د + 0.25 ملجم لتر -1 برولين + 0.1٪ (وزن / حجم) CH و 2 مجم L -1 2،4-D مع 2-6٪ (وزن / حجم) CH.

الجدول 1: مقارنة النسبة المئوية للكالس على الوسائط القائمة على MS أو LS المكملة بمجموعات مختلفة من منظمات نمو النبات والمواد المضافة

بشكل عام ، كان الكالاي من جميع الأصناف مضغوطًا ، مصفرًا وكبير الحجم ، منتشر جيدًا ، في بعض الأحيان جافًا ، جذريًا وقارديًا. مكملات تحريض الكالس وسط مع CH زيادة هائلة في إنتاج الكالس (الشكل 1 أ-ج و 2 أ-ج).

في الأوساط القائمة على MS و LS الخالية من الكازين ، والتي تتكون فقط من 2 ملجم لتر -1 2،4-د (الشكل 1 د) ، كان تواتر تكوين الكالي 36 و 33 ٪ والتي كانت أقل نسبيًا من الوسائط القائمة على MS و LS التي تم استكمالها بـ 0.6٪ (وزن / حجم) CH حيث كانت نسبة calli 85 و 80٪ في السيرة الذاتية. HA-1. عندما استكمل البرولين في تحريض الكالس وسط ليس له تأثير متبقي على نمو الكالس. الصنف HA-2 ، المزروع على وسائط MS و LS المضاف إليه 2 ملجم لتر -1 2،4-د + 0.25 ملجم لتر -1 برولين + 0.1٪ (وزن / حجم) CH تم إنتاج أقل نسبة مئوية من الكالسي مقارنة بالتركيزات الأخرى من وسائط CH ​​المضافة (الشكل 2 د). ومع ذلك ، استجابت جميع الأصناف بشكل أفضل على أساس MS تحريض الكالس متوسط ​​مقارنة مع LS تحريض الكالس متوسط ​​(الجدول 1). دشبذ مثقف من السيرة الذاتية. أنتج HA-1 أعلى نسبة (50٪) من النبات على وسط قائم على MS مكمل بـ 2 مجم L -1 BAP (RM-1 ، الشكل 4). من ناحية أخرى ، فإن السيرة الذاتية. أنتج Gheoch 25٪ من النبات على نفس الوسط. على عكس تلك السيرة الذاتية. أنتج HA-1 أعلى نسبة (80٪) من النباتات على وسيط RM-4 القائم على LS (الشكل 5). ومن المثير للاهتمام أن السيرة الذاتية. لم يستجب Gheoch على وسيط RM-3 و RM-6 المستند إلى MS و LS ، حيث تم استكمال الوسائط بـ 2 مجم L -1 BAP + 0.1 ٪ (وزن / حجم) CH (الشكل 4). أظهرت هذه النتائج أن جميع الأصناف استجابت بشكل سيئ من حيث الحجم تجديد النبات على CH أضاف وسائط RM-3 و RM-6. كانت هذه الأنواع من الكالس صفراء ومائية (الشكل 3 أ). تم تطوير اللقطة في وسائط CH ​​المكملة أحيانًا لتصبح بنية اللون وماتت أخيرًا. إضافة CH مع وسائط التجديد القائمة على MS و LS ، فإن تجديد النبات التردد انخفض بشكل كبير في جميع الأصناف.

البرولين له تأثير تحفيزي ملحوظ نسبيًا تجديد النبات من الكالس. تمت إضافة Proline في وسائط RM-2 و RM-5 المستندة إلى MS و LS ، السيرة الذاتية. أنتج HA-1 نسبة مئوية أعلى نسبيًا من النباتات 29٪ و 38٪ (الشكل 3 ب) ، على التوالي ، من وسائط RM-3 و RM-6 المضافة في CH. على وسط مكمل بالبرولين قائم على LS (RM-5) ، صنف. أنتجت HA-1 نباتات صحية خضراء عميقة مع العديد من البراعم (الشكل ثلاثي الأبعاد) بينما أنتجت نفس الأصناف نباتات ذات براعم أقل في RM-6 المتوسط ​​(الشكل 3 ج). النسبة المئوية ل تجديد النبات متنوع من التركيب الوراثي إلى التركيب الجيني بالإضافة إلى تركيبة مختلفة من الوسط.

وقد أظهرت دراسات سابقة أن التطور الجنيني وتجديد النبتة يتحددان جينيًا في الأرز (Abe and Futsuhara، 1985). أكدت الدراسة الحالية أن أعلى تكوين للكالس و تجديد النبات ربما تتأثر بتفاعل مكونات الوسائط. تم الإبلاغ عن أن الاختلاف في تكوين الكالس الجنيني يمكن أن يتأثر بالعديد من العوامل الأخرى بما في ذلك الاختلافات في تركيبة الوسائط وتركيزات منظمات النمو الداخلية وأيضًا إضافة spermidine و hydrolyzate الكازين الإنزيمي والبرولين وحمض الأسكوربيك والفحم المنشط (Minhas et آل ، 1999). يمكن أن يكون CH مصدرًا للكالسيوم والعديد من المغذيات الدقيقة والفيتامينات والأهم من ذلك خليط يصل إلى 18 حمض أميني س. خلص العديد من الباحثين إلى أن الميثان نفسه أكثر فعالية في زراعة النباتات من إضافة الرئيسي حمض أميني s ، التي توفرها & # 146s. وقد أدى ذلك إلى تكهنات بأن CH قد تحتوي على بعض عوامل تعزيز النمو غير المعروفة (Inoue and Maeda ، 1982) ، والتي عززت نمو الكالس. للسيرة الذاتية. Murabajal ، تردد أعلى من تجديد النبات تم الحصول عليه على وسيط RM-5 القائم على LS مقارنة بمتوسط ​​RM-6. توضح هذه النتيجة أن البرولين مادة مضافة أكثر صلة من CH. تشير العديد من الدراسات إلى أن وظيفة البرولين في التعديل التناضحي داخل الخلايا بين السيتوبلازم والفجوات (Bandurska ، 1993 Solomon et al. ، 1994) والهياكل داخل الخلايا (Van Rensburg et al. ، 1993) ، الجذور الحرة زبال (Smirnoff and Cumbes ، 1989) أو مركب قوي من الكربون والنيتروجين للتعافي السريع من الإجهاد (Jager and Meyer ، 1977). تأثر تجديد النبات أيضًا بالعديد من العوامل الأخرى بما في ذلك تكوين الوسط القاعدي وطبيعة منظمات نمو النبات المضافة في وسط التجديد. تردد عالي تجديد النبات تم الحصول عليها من السيرة الذاتية. HA-1 على وسط RM-4 ، والذي يحتوي فقط على 2 مجم L -1 BAP على عكس وسيط RM-6 ، والذي يحتوي على 2 مجم L -1 BAP + 0.1٪ (وزن / حجم) CH. يوضح هذا أن تركيز BAP هو منظم نمو أكثر صلة من توليفة من BAP و 0.1٪ CH. شي وآخرون (1995) ذكرت ذلك تجديد النبات القدرة على الكالس الذي تأثر بمجموعات منظم النمو المستخدمة في تحريض الكالس واسطة. في خليط معد من حمض أميني تشبه تلك الموجودة في CH ، غالبًا ما لوحظ التثبيط التنافسي بين بعض المكونات ، حيث انخفضت النسبة المئوية لـ CH تجديد النبات . في هذا التحقيق السيرة الذاتية. تم استزراع Gheoch على وسائط RM-3 و RM-6 القائمة على MS و LS ، والتي تحتوي على 2 مجم L -1 BAP + 0.1 ٪ (وزن / حجم) CH لم تنتج نباتات. أفاد Ansist and Northcote (1973) أن العلامة التجارية لـ CH المعروفة باسم NZ amine & # 146 TM يمكن أن تنتج مواد سامة إذا تم تسخين المحاليل المركزة أو تجميد المحاليل وإذابتها عدة مرات. لذلك تم إضافة CH في وسائل الإعلام لثقافات إطلاق النار ، وتم العثور عليها تجديد النبات ومحسّن تحريض الكالس . هذه النتيجة تتعارض مع ملاحظة Sheeja وآخرون (2004) حيث تحريض الكالس تم تقطيعه ولكن تم تعزيز تجديد النبات بإضافة الميثان في الوسط. قد يكون السبب المحتمل بسبب الاختلافات بين نباتات أحادية الفلقة ونباتات ثنائية الفلقة. من خلال مراقبة الاستجابة الشاملة ، يمكن استنتاج أن البرولين ليس مثبطًا لتجديد النبات ولكن CH يثبط تكوين وانتشار نمو النبات. علاوة على ذلك ، تأخرت عملية التجديد ، التي نجت ، لمدة 1-2 أسبوع اعتمادًا على تركيز CH. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات تظهر بوضوح أن تواتر تشكيل الكالس وفعال تجديد النبات تتأثر بشكل أساسي بالنمط الوراثي للنبات بما في ذلك تكوين وسط الاستزراع ومنظمات نمو النبات والمواد المضافة. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه التجربة بوضوح أنه يمكن إضافة CH مع تحريض الكالس وسط لتكوين الكالس القوي ويمكن إضافة البرولين مع تجديد النبات متوسط ​​الكفاءة تجديد النبات . يوصى باستخدام البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة للتردد العالي لـ تجديد النبات من أصناف أرز المياه العميقة وكذلك لإنتاج نباتات الأرز المعدلة وراثيًا بالصفات المرغوبة.

2: Abe، T. and Y. Futsuhara، 1985. تجديد فعال للنبات عن طريق التطور الجنيني الجسدي من أنسجة الكالس الجذرية للأرز (أرز أسيوي L.). J. Plant Physiol. ، 121: 111-118.
رابط مباشر |

3: Al-Forkan، M.، M.A. Rahim، T. Chowdhury، P. Akter and L. Khaleda، 2005. في المختبر نظام التكاثر والتجديد لبعض أنواع الأرز المقاوم للملوحة (أرز أسيوي L.) أصناف بنغلاديش. البيوتكنولوجيا 4: 230-234.
رابط مباشر |

4: Anstis and Northcote ، 1973. التكاثر النباتي عن طريق زراعة الأنسجة. 2nd Edn.، Exegetics Limited، UK.، pp: 285.

5: باندورسكا ، هـ. ، 1993. في المختبر و في الجسم الحي تأثير البرولين على نشاط اختزال النترات تحت الضغط التناضحي في الشعير. اكتا فيسيول. مصنع. ، 15: 83-88.
رابط مباشر |

6: إينو ، إم ، وإي مايدا ، 1982. إكثار النبات عن طريق زراعة الأنسجة. 2nd Edn.، Exegetics Limited، UK.، pp: 285.

7: Jager، HJ and H.R. Meyer، 1977. تأثير الإجهاد المائي على النمو واستقلاب البرولين في فاسولوس، فولغاريس L. Oecologia ، 30: 83-96.
رابط مباشر |

8: كافي كسهور ، بي. و ج. ريدي ، 1986. تجديد النباتات من الثقافات طويلة الأمد أرز أسيوي ممثل خلية النبات ، 5: 391-393.

9: Linsmaier، E.M. and F. Skoog، 1965. متطلبات عامل النمو العضوي لمزارع أنسجة التبغ. فيسيول. مصنع. ، 18: 100-127.
كروسريف | رابط مباشر |

10: مينهاس ، د. ، م. Raham and A. Grover، 1999. الحفاظ على نمو الكالس أثناء الزراعة الفرعية هو استجابة تعتمد على النمط الجيني في الأرز: الكالس المشتق من البذور الناضجة من صنف الأرز IR 54 يفتقر إلى القدرة على الاستزراع. بالعملة. علوم ، 77: 1410-1413.

11: Murashige، T. and F. Skoog، 1962. وسيلة منقحة للنمو السريع والمقايسات الحيوية مع مزارع أنسجة التبغ. فيسيول. بلانتا 15: 473-497.
كروسريف | رابط مباشر |

12: Sheeja ، T.E. ، A.B. موندال ور. Rathore ، 2004. التجديد الفعال للنباتات في الطماطم (Lycopersicon esculentum مطحنة.). عبادة الأنسجة النباتية ، 14: 45-53.
رابط مباشر |

13: سميرنوف ، ن. و ك. ج. كومبس ، 1989. نشاط الكسح الجذري للهيدروكسيل للمواد المذابة المتوافقة. كيمياء النبات ، 28: 1057-1060.
كروسريف | رابط مباشر |

14: Solomon، A.، S. Beer، Y. Waisel، G.P. جونز و إل جي. باليج ، 1994. آثار كلوريد الصوديوم على نشاط الكربوكسيل من روبيسكو من Tamarix jordanis في وجود وغياب المحاليل المتوافقة مع البرولين. فيسيول. مصنع. ، 90: 198-204.
رابط مباشر |

15: ثوم ، 1981. إكثار النبات عن طريق زراعة الأنسجة. 2nd Edn.، Exegetics Limited، UK.، pp: 285.