معلومة

فحوصات للكشف عن ارتباط الحمض النووي الريبي بالبروتين

فحوصات للكشف عن ارتباط الحمض النووي الريبي بالبروتين


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في مشروع أعمل عليه ، نحن نصمم نظامًا حيث ترتبط جزيئات RNA معينة بالبروتينات - جزء مهم من هذا هو اختبار ما إذا كان RNA يرتبط عندما نقوم بتعديل البروتينات بطريقة ما. ما هي الاختبارات الموجودة لاختبار ما إذا كان الحمض النووي الريبي (RNA) محددًا (أو غير محدد) مرتبطًا بالبروتين؟


أود أن أوصي بمقايسة تحول الحركة الكهربي (EMSA) ، أحد الإجراءات التي يمكن العثور عليها هنا.


فك تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي

بفضل التقدم المستمر في التسلسل الجيني ، حدد العلماء تقريبًا كل نيوكليوتيدات A و T و C و G في شفرتنا الجينية. ولكن لكي نفهم تمامًا كيف يقوم الجينوم البشري بتشفيرنا ، نحتاج إلى المضي قدمًا خطوة أخرى ، وتحديد وظيفة كل قاعدة. هذا هو الهدف من مشروع Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) ، الممول من قبل المعهد القومي لأبحاث الجينوم البشري والذي تم إطلاقه في أعقاب مشروع الجينوم البشري في عام 2003. على الرغم من أن الكثير قد تم إنجازه بالفعل - رسم خرائط تفاعلات البروتين والحمض النووي وراثة الحالات اللاجينية المختلفة - يتطلب فهم وظيفة تسلسل الحمض النووي أيضًا فك شفرة الغرض من الحمض النووي الريبي المشفر بواسطته ، وكذلك البروتينات التي ترتبط بهذه RNAs.

تنظم بروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RBPs) التعبير الجيني عن طريق التحكم في عمليات ما بعد النسخ المختلفة - حيث توجه إلى أين تذهب الحمض النووي الريبي في الخلية ، ومدى ثباتها ، وما هي البروتينات التي سيتم تصنيعها. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب تصنيف علاقات بروتين الحمض النووي الريبي الحيوية هذه ، نظرًا لأن معظم التجارب الضرورية صعبة الإكمال ويصعب تفسيرها بدقة.

في دراسة جديدة ، يصف فريق من علماء الأحياء في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا والمتعاونين معهم خصوصية الربط لـ 78 RBPs بشريًا ، باستخدام طريقة غير متحيزة من خطوة واحدة تحدد بكفاءة ودقة طيف تسلسلات الحمض النووي الريبي والهياكل التي تفضلها هذه البروتينات. تشير النتائج التي توصلوا إليها إلى أن RBPs لا تتعرف فقط على أجزاء معينة من الحمض النووي الريبي ، ولكنها غالبًا ما تتأثر بالسمات السياقية أيضًا - مثل الهياكل المطوية للحمض النووي الريبي المعني ، أو النيوكليوتيدات التي تحيط بتسلسل ربط الحمض النووي الريبي.

يقول كريستوفر بيرج ، مدير برنامج الحوسبة وبيولوجيا الأنظمة ، وأستاذ علم الأحياء والهندسة البيولوجية ، وعضو خارج أسوار معهد كوخ لـ مركز أبحاث السرطان التكاملي ، وعضو مشارك في معهد برود لمعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وجامعة هارفارد ، وكبير مؤلفي الدراسة. "إذا كنت تريد حقًا فهم تنظيم الجينات بعد النسخ ، فأنت بحاجة إلى وصف تلك التفاعلات. هنا ، نستفيد من التسلسل العميق لإعطاء صورة أكثر دقة لما ترتبط به البروتينات بالضبط وأين ترتبط به ".

يعد دانيال دومينغيز ، باحث ما بعد الدكتوراة في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، وطالب الدراسات العليا السابق بيتر فريز ، وطالب الدراسات العليا الحالي ماريا ألكسيس ، المؤلفين الرئيسيين للدراسة ، والتي تعد جزءًا من مشروع ENCODE وتظهر في الخلية الجزيئية في 7 يونيو.

طريقة للجنون

منذ اللحظة التي يولد فيها الحمض النووي الريبي (RNA) ، يتم تغطيته بواسطة RBPs التي تتحكم تقريبًا في كل جانب من جوانب دورة حياته. تحتوي RBPs بشكل عام على مجال ربط ، وهي بنية مطوية ثلاثية الأبعاد يمكن أن ترتبط بتسلسل نوكليوتيد معين على RNA يسمى عزر. نظرًا لوجود أكثر من 1500 من بروتينات RBP المختلفة الموجودة في الجينوم البشري ، فقد احتاج علماء الأحياء إلى طريقة لتحديد البروتينات المرتبطة بأشكال الحمض النووي الريبي بشكل منهجي.

بعد النظر في عدد من الأساليب المختلفة لتحليل تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي مباشرة في الخلية (في الجسم الحي) ومعزولة في أنبوب اختبار (في المختبر) ، استقر علماء الأحياء على طريقة في المختبر تُعرف باسم RNA Bind-n-Seq ( RBNS) ، تم تطويره قبل أربع سنوات بواسطة باحثة ما بعد الدكتوراة السابقة في مختبر Burge والمؤلفة المشاركة نيكول لامبرت.

على الرغم من أن لامبرت قد اختبر سابقًا مجموعة فرعية صغيرة فقط من البروتينات ، إلا أن RBNS تجاوز المناهج الأخرى لأنها كانت طريقة كمية كشفت عن تفاعلات بروتين RNA منخفضة وعالية التقارب ، ولم تتطلب سوى خطوة إجرائية واحدة ، وفحصت تقريبًا كل عزر RNA ممكن. حسنت هذه الدراسة الجديدة إنتاجية الفحص ، واستكشفت بشكل منهجي الخصائص الملزمة لأكثر من 70 RBPs بشريًا بدقة عالية.

يقول دومينغيز: "حتى مع تلك العينة الأولية الصغيرة ، كان من الواضح أن RBNS هو السبيل للذهاب ، وعلى مدى السنوات الثلاث والنصف الماضية كنا نبني تدريجيًا على هذا النهج". "نظرًا لأن RBP واحد يمكنه الاختيار من بين مليارات جزيئات RNA الفريدة ، فإن نهجنا يمنحك الكثير من القوة لاكتشاف كل تلك الأهداف المحتملة ، مع مراعاة البنية الثانوية للحمض النووي الريبي والميزات السياقية. إنه اختبار عميق ومفصل للغاية ".

أولاً ، قام الباحثون بتنقية RBPs البشرية ، وخلطوها مع RNAs الاصطناعية التي تم إنشاؤها عشوائيًا والتي يبلغ طولها 20 نيوكليوتيد تقريبًا ، والتي تمثل تقريبًا جميع RNAs التي يمكن لـ RBP الارتباط بها. بعد ذلك ، استخرجوا RBPs جنبًا إلى جنب مع RNAs المرتبط بهم وقاموا بترتيبها. بمساعدة المتعاونين معهم من جامعة كاليفورنيا في سان دييغو وجامعة كونيتيكت هيلث ، أجرى الفريق فحوصات إضافية لاستنباط ما قد تبدو عليه تفاعلات بروتين RNA في خلية فعلية ، واستنتاج الوظيفة الخلوية لـ RBPs.

توقع الباحثون أن ترتبط معظم RBPs بعنصر RNA فريد ، لكن لدهشتهم وجدوا عكس ذلك: يبدو أن العديد من البروتينات ، بغض النظر عن الفئة الهيكلية ، تفضل نماذج تسلسل نيوكليوتيدات قصيرة مكشوفة مماثلة.

يقول ألكسيس: "تعبر الخلايا البشرية عن مئات الآلاف من النصوص المميزة ، لذلك قد تعتقد أن كل RBP سيربط تسلسل RNA مختلفًا قليلاً من أجل التمييز بين الأهداف". "في الواقع ، قد يفترض المرء أن وجود نماذج RBP مميزة من شأنه أن يضمن أقصى قدر من المرونة. ولكن ، كما اتضح ، قامت الطبيعة ببناء العديد من البروتينات الزائدة عن الحاجة ، ويبدو أنها تربط نفس التسلسلات الخطية القصيرة ".

زخارف زائدة عن الحاجة مع أهداف ووظائف مميزة

اقترح هذا التداخل في تفضيل ربط RBP للعلماء أنه يجب أن يكون هناك بعض المؤشرات الأخرى إلى جانب تسلسل النموذج الذي يشير إلى RBPs التي يستهدفها RNA. اتضح أن هذه الإشارات نشأت من تباعد الزخارف وكذلك القواعد النوكليوتيدية التي تحيط بمواقع الربط الخاصة بها. بالنسبة إلى RBPs الأقل شيوعًا التي استهدفت تسلسلات RNA غير الخطية ، يبدو أن الطريقة الدقيقة التي يطوي بها RNA تؤثر أيضًا على خصوصية الربط.

السؤال الواضح إذن هو: لماذا تطورت الممارسات التجارية التقييدية للاعتماد على السمات السياقية بدلاً من مجرد منحها زخارف مميزة؟

تبدو إمكانية الوصول واحدة من أكثر الحجج منطقية. استنتج الباحثون أن الوصول إلى مقاطع الحمض النووي الريبي الخطية أسهل ماديًا لأنه لا يتم إعاقتها بواسطة خيوط أخرى من الحمض النووي الريبي ، ووجدوا أنه من المرجح أن تكون الأشكال الأكثر سهولة مرتبطة. الاحتمال الآخر هو أن وجود العديد من البروتينات التي تستهدف نفس الحافز يخلق بعض المنافسة بين البروتينات. إذا زاد أحد البروتينات من استقرار الحمض النووي الريبي وأخرى ينقصه ، فإن أيهما يرتبط الأقوى سيمنع الآخر من الارتباط على الإطلاق ، مما يتيح تغييرات أكثر وضوحًا في نشاط الجين بين الخلايا أو حالات الخلية. في سيناريوهات أخرى ، يمكن للبروتينات ذات الوظائف المتشابهة التي تستهدف نفس الفكرة أن توفر التكرار لضمان حدوث التنظيم في الخلية.

يقول دومينغيز: "إنه بالتأكيد سؤال صعب ، وقد لا نتمكن أبدًا من الإجابة عليه حقًا". "نظرًا لتكرار RBPs على مدار الوقت التطوري ، ربما كان تغيير التعرف على السمات السياقية حول شكل RNA أسهل من تغيير شكل RNA بأكمله. وهذا من شأنه أن يمنح فرصًا جديدة لـ RBPs لتحديد أهداف خلوية مختلفة. "

تمثل هذه الدراسة واحدة من أولى المساهمات في المختبر لمشروع ENCODE. بينما تكشف الاختبارات في الجسم الحي عن معلومات خاصة بخط الخلية أو الأنسجة المعينة التي أجريت فيها ، فإن RBNS سيساعد في تحديد القواعد الأساسية لتفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي (RNA) - ومن المحتمل أن تنطبق عبر العديد من أنواع الخلايا والأنسجة.

تم تمويل البحث من قبل مشروع ENCODE للمعاهد الوطنية للصحة ، ومنحة NIH / NIGMS ، وزمالة الدراسات العليا في علوم وهندسة الدفاع الوطني ، وجائزة Kirschstein National Research Service ، وصندوق Burroughs Wellcome لما بعد الدكتوراة ، وزمالة ما بعد الدكتوراه الفردية من المعاهد الوطنية للصحة.


الملخص

يُعتقد عادةً أن البروتينات المرتبطة بـ RNA (RBPs) هي بروتينات تربط الحمض النووي الريبي من خلال واحد أو عدة مجالات ربط RNA كروية (RBDs) وتغير مصير أو وظيفة RNAs المرتبطة. تم اكتشاف عدة مئات من هذه الأنواع من RBPs والتحقيق فيها على مر السنين. ضاعفت الدراسات الحديثة على مستوى البروتين عدد البروتينات المتورطة في ارتباط الحمض النووي الريبي بأكثر من الضعف وكشفت عن المئات من RBPs الإضافية التي تفتقر إلى RBDs التقليدية. في هذه المراجعة ، نناقش هذه RBPs الجديدة والفهم الناشئ لأنماطها غير المتوقعة لربط الحمض النووي الريبي ، والتي يمكن التوسط فيها من خلال المناطق المضطربة جوهريًا ، وواجهات تفاعل البروتين والبروتين والنوى الإنزيمية ، من بين أمور أخرى. نناقش أيضًا أهداف RNA والوظائف الجزيئية والخلوية لـ RBPs الجديدة ، بالإضافة إلى احتمال أن يتم تنظيم بعض RBPs بواسطة RNA بدلاً من تنظيم RNA.


TEMED * (ن,ن,ن& # x02032 ،ن& # x02032-Tetramethylethylenediamine) [Sigma ، رقم الكتالوج T9281]. تخزين محكم الغلق في 4 & # x000b0C.

بيرسلفات الأمونيوم * [سيجما ، رقم الكتالوج A3678]. تخزينها في مجفف في 4 & # x000b0C.

مونومر الأكريلاميد * ، درجة الرحلان الكهربي [سيجما ، رقم الكتالوج A3553]. يحفظ مبردا في 4 & # x000b0C. احم من الضوء.

N، N & # x02032-methylene bisacrylamide * [شركة USB ، رقم الكتالوج 75821]. يحفظ مبردا في 4 & # x000b0C. احم من الضوء.

الكواشف الأخرى يجب أن تكون & # x0201cm درجة البيولوجيا الجزيئية & # x0201d أو أفضل.


طرق الكشف عن تفاعلات البروتين وتحليلها

تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) هي أساس العديد من العمليات الخلوية المهمة مثل نقل الإشارات والنقل الجزيئي ومسارات التمثيل الغذائي المختلفة ، في حين أن مثبطات مضخة البروتون الشاذة هي أساس العديد من الأمراض المرتبطة بالتجمع ، مثل مرض الزهايمر ، وقد تؤدي إلى الإصابة بالسرطان. لذلك ، تم دراسة مثبطات مضخة البروتون على نطاق واسع في مجال العلوم الحيوية والبحوث الطبية. هنا ، نراجع الأساليب المعاصرة الرئيسية المستخدمة للكشف عن تفاعل البروتين البروتين وتحليله.

الجدول 1: ملخص لطرق اكتشاف PPI الشائعة
تقنية مبدأ
Coimmunoprec ترسيب
(عنوان IP مشترك)
تجربة ترسيب مناعي مصممة لتنقية مستضد بروتين الطعم مع شريكها المرتبط باستخدام جسم مضاد محدد ضد الطعم.
المنسدلة المقايسات طريقة كروماتوغرافيا تقارب تتضمن استخدام طُعم موسوم أو مُصنَّف لإنشاء مصفوفة تقارب محددة من شأنها تمكين ربط وتنقية بروتين فريسة من عينة محللة أو خليط آخر يحتوي على بروتين.
الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) مراقبة التكوين المعقد من خلال التنشيط النسخي لجينات المراسل.
النشاف الغربي الأقصى استراتيجية مماثلة للنشاف الغربي مع اختلاف رئيسي واحد. يتم استبدال مسبار الجسم المضاد في اكتشاف النشاف الغربي النموذجي ببروتين الطعم المسمى بالمسبار.
كتلة تنقية التقارب الترادفي
التحليل الطيفي
(تاب- MS)
يعتمد TAP-MS على وضع العلامات المزدوجة للبروتين محل الاهتمام في موضعه الكروموسومي ، متبوعًا بعملية تنقية من خطوتين وتحليل طيفي شامل.
مصفوفات البروتين الدقيقة يسمح التحليل القائم على ميكروأري بالتحليل المتزامن لآلاف المعلمات في تجربة واحدة.
قياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) يؤدي التغيير في عدد الجزيئات المرتبطة بطرف المستشعر الحيوي إلى حدوث تحول في نمط التداخل يمكن قياسه في الوقت الفعلي.
رنين البلازمون السطحي (SPR) تتغير زاوية SPR مع مؤشرات الانكسار السطحي ، والتي تتناسب بشكل مباشر مع الكتلة الجزيئية للجزيء الحيوي المرتبط بسطح المعدن.

ترسيب Coimmunoprec (Co-IP)

يعد الترسيب المناعي المشترك (Co-IP) أسلوبًا شائعًا لتحديد تفاعلات البروتين والبروتين ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية والتحقق من صحتها. باستخدام الأجسام المضادة المستهدفة الخاصة بالبروتين لالتقاط البروتينات المرتبطة بالبروتين المستهدف بشكل غير مباشر ، يتم تطبيق Co-IP لفحص تفاعلات البروتين البروتين الجديدة أو تأكيد وجود تفاعلات البروتين البروتين.

في بروتينات Co-IP تتفاعل في حالة عدم تغيير طبيعة والتي تكاد تكون فسيولوجية. ومع ذلك ، قد لا يتم الكشف عن تقارب منخفض أو تفاعل عابر بين البروتينات. من ناحية أخرى ، لا يمكن أن تحدد نتيجة Co-IP ما إذا كان التفاعل مباشرًا أم غير مباشر ، حيث لا يمكن استبعاد إمكانية مشاركة بروتينات إضافية.

المقايسات المنسدلة

المقايسة المنسدلة هي طريقة في المختبر تستخدم لتحديد التفاعل المادي بين بروتينين أو أكثر. يمكن استخدامه لتأكيد تفاعلات البروتين البروتين الموجودة المكتشفة بواسطة تقنيات أخرى أو الفحص الأولي لتحديد تفاعلات البروتين البروتين الجديدة.

يتمثل المبدأ الأساسي للمقايسة المنسدلة في استخدام بروتين مدمج بالعلامة (مثل علامة GST وعلامة وعلامة البيوتين) المثبت لراتنج التقارب كبروتين الطعم. يمكن التقاط البروتينات المرتبطة ببروتين الطُعم (بروتين الفريسة) و "سحبها" عندما يتدفق البروتين المستهدف أو محلول الخلية. من خلال الشطف والتحليل اللاحقين باستخدام Western Blot أو قياس الطيف الكتلي ، يمكن تأكيد تفاعل متوقع أو يمكن اكتشاف تفاعلات غير معروفة سابقًا.

الخميرة ثنائية الهجين (Y2H)

يعد النظام ثنائي الهجين أحد أكثر الطرق استخدامًا لفحص أو تأكيد تفاعلات البروتين والبروتين. مطلوب مجالان بروتين في اختبار Y2H اللذان سيكون لهما وظيفتان محددتان: (1) مجال ربط الحمض النووي (DBD) الذي يساعد على الارتباط بالحمض النووي ، و (2) مجال التنشيط (AD) المسؤول عن تنشيط نسخ الحمض النووي. كلا المجالين مطلوبان لنسخ الجين الناقل. يسمح تحليل Y2H بالتعرف المباشر على PPI بين أزواج البروتين. ومع ذلك ، قد تحمل الطريقة عددًا كبيرًا من التفاعلات الإيجابية الخاطئة. من ناحية أخرى ، قد لا يتم تتبع العديد من التفاعلات الحقيقية باستخدام مقايسة Y2H ، مما يؤدي إلى نتائج سلبية خاطئة.

النشاف الغربي الأقصى

النشاف الغربي الأقصى هو طريقة بيولوجية جزيئية تعتمد على تقنية النشاف الغربي لاكتشاف تفاعل البروتين والبروتين في المختبر. في حين أن النشاف الغربي المعتاد يستخدم جسمًا مضادًا للكشف عن بروتين مهم ، فإن النشاف في أقصى الغرب يستخدم بروتينًا غير مضاد للجسم ، والذي يمكن أن يربط البروتين محل الاهتمام. وهكذا ، في حين يتم استخدام النشاف الغربي للكشف عن بروتينات معينة ، يتم استخدام النشاف في أقصى الغرب للكشف عن تفاعلات البروتين البروتيني.

مطياف الكتلة لتنقية التقارب الترادفي (TAP-MS)

تم تطوير علامات TAP لدراسة PPIs في ظل الظروف الجوهرية للخلية. تعتمد هذه الطريقة على وضع العلامات المزدوجة للبروتين المعني في موضعه الكروموسومي ، متبوعًا بعملية تنقية من خطوتين. يمكن بعد ذلك فحص البروتينات التي تظل مرتبطة بالبروتين المستهدف وتحديدها من خلال SDS-PAGE متبوعًا بتحليل قياس الطيف الكتلي ، وبالتالي تحديد متعاون PPI للبروتين الأصلي محل الاهتمام.

سرعان ما أصبحت المصفوفات الدقيقة للبروتين وسيلة قوية لاكتشاف البروتينات ، ومراقبة مستويات تعبيرها ، وسبر تفاعلات البروتين ووظائفه. المصفوفة الدقيقة للبروتين هي قطعة من الزجاج تم لصق جزيئات مختلفة من البروتين عليها في مواقع منفصلة بطريقة منظمة. شهدت المصفوفات الدقيقة للبروتين تقدمًا هائلاً واهتمامًا في الوقت الحالي وأصبحت واحدة من المجالات النشطة الناشئة في التكنولوجيا الحيوية ، والهدف من تطوير مصفوفات البروتين الدقيقة هو تحقيق تحليل بروتين عالي الكفاءة وحساس ، وتنفيذ عدد كبير من التحديدات بالتوازي عن طريق عملية آلية.

البيولوجيا تقدم خدمة إنتاج البروتين المطمئنة ، ما عليك سوى أن تقدم لنا طلبًا ، وبعد ذلك ستحصل على البروتين بالنقاء الذي تريده. مزيد من التفاصيل لمتابعة

سرينيفاسا راو ، ك. سرينيفاس ، ج.ن.سوجين ، وجي إن سوناند كومار. كشف التفاعل بين البروتين والبروتين: الطرق والتحليل. Int J Proteomics، 2014: 147648.

تي بيرجارد ، إس لينس ، وبي جيمس. طرق الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين وتحليلها ، Proteomics ، 2007 ، 7 (16): 2833-2842.

Phizicky E. M. and Fields S. تفاعلات البروتين والبروتين: طرق الكشف والتحليل. ميكروبيول القس 1995 .59 (1): 94-123.


استراتيجيتان لقياس ثوابت التوازن

يتوفر خياران عامان لقياس الصلات. 1) في تجربة التوازن، يحدد المرء مدى التفاعل كدالة لتركيز أحد المواد المتفاعلة. يعطي تحليل هذه البيانات ثابت التوازن. 2) في أ التجربة الحركية، يحدد المرء معدلات التفاعلات الأمامية والعكسية كدالة لتركيز أحد المواد المتفاعلة. يعطي تحليل هذه البيانات ثوابت المعدل للتفاعلات الأمامية والعكسية. تعطي نسبة ثوابت المعدل هذه ثابت التوازن.

يعتبر النهج الحركي أكثر كشفًا ، لأنه لا يعطي فقط المعلمة الديناميكية الحرارية ، ثابت التوازن ، ولكن أيضًا ثوابت المعدل ، التي تميز ديناميكيات النظام. لاحظ أن الشارع هو طريقة واحدة من ثوابت المعدل إلى ثوابت التوازن. تكشف معرفة التقارب فقط من تجربة التوازن ولا شيء حول معدلات ردود الفعل الأمامية أو العكسية. على الرغم من أن التجارب الحركية أقوى بشكل عام من تجارب التوازن ، إلا أنها تتطلب غالبًا المزيد من الكواشف والمقايسات الأكثر تعقيدًا.


طرق تتبع الحمض النووي الريبي داخل الخلايا

يسمح تتبع الحمض النووي الريبي للباحثين بتصور جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا والأنسجة ، مما يوفر معلومات مكانية وزمانية مهمة فيما يتعلق بديناميات الحمض النووي الريبي ووظيفته. طرق مثل الفلورسنت فى الموقع يعتمد التهجين (FISH) والمنارات الجزيئية على قليل النوكليوتيدات التكميلية لتسمية وعرض النصوص الذاتية. تعمل الطرق الأخرى على إنشاء نسخ خيمرية اصطناعية مقترنة ببروتينات الغلاف المشتقة من البكتيريا (مثل MS2 ، λN) لتمييز الجزيئات في الخلايا الحية. في مناهج أخرى ، يتم التعرف على الحمض النووي الريبي الداخلي من خلال الحمض النووي الريبي التكميلي المركب ببروتينات كاس غير التحفيزية. كل تقنية لها مجموعتها الخاصة من نقاط القوة والقيود التي يجب مراعاتها عند التخطيط للتجربة. هنا ، نناقش آليات ومزايا ونقاط ضعف فى الموقع التهجين ، والمنارات الجزيئية ، وعلامات MS2 والأنظمة المشتقة من Cas ، وكذلك كيفية استخدام تتبع RNA لدراسة جوانب مختلفة من البيولوجيا الجزيئية.

1 المقدمة

تمتلك جزيئات الحمض النووي الريبي مجموعة واسعة من الأدوار في الخلية. تعمل RNAs المشفرة (messenger (m) RNAs) كقوالب لترجمة البروتينات ، بينما تنظم RNAs غير المشفرة (بما في ذلك microRNAs (miRNAs) و RNAs طويلة غير مشفرة (lncRNAs) برامج التعبير الجيني على العديد من المستويات [1 ، 2]. تتحكم الحمض النووي الريبي في جميع جوانب التمثيل الغذائي للخلايا ، وبالتالي فقد ثبت أنها منظمات أساسية للعمليات الفسيولوجية والمرضية [3،4].

سمحت التطورات الحديثة في التكنولوجيا الحيوية للحمض النووي الريبي للباحثين باستجواب الترنسكريبتوم بشكل جماعي. المصفوفات الدقيقة هي طرق سريعة وفعالة من حيث التكلفة لقياس مستويات الحمض النووي الريبي في مجموعات مختلفة ، ويمكن لتسلسل الحمض النووي الريبي (تسلسل الحمض النووي الريبي) توضيح هوية الحمض النووي الريبي على مستوى الخلية أو الأنسجة [5-7]. يمكن للترسيب المناعي (IP) لمجمعات البروتينوكليوبروتين (RNP) الأصلية أو المتصالبة (RIP و CLIP ، على التوالي) تحديد أهداف بروتين معين مرتبط بالـ RNA وتوفير نظرة ثاقبة لتفاعلات بروتين RNA مع البروتين [8]. لقد حولت هذه الأساليب مجال RNA. ومع ذلك ، لا توفر أي من هذه التقنيات معلومات عن الديناميات المكانية أو الزمنية للحمض النووي الريبي في الخلية ، بما في ذلك موقعها أثناء معالجة الحمض النووي الريبي أو نقله أو تخزينه أو ترجمته أو تدهوره. لدراسة هذه المعلمات ، يجب على الباحثين بطريقة ما تسمية الحمض النووي الريبي محل الاهتمام وتحليله باستخدام الفحص المجهري.

أدى التقدم في توطين الحمض النووي الريبي على المستوى دون الخلوي إلى تحسين فهمنا للأمراض الفيروسية والأمراض التنكسية العصبية من خلال توصيف الآليات المرضية التي يتوسطها الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال ، كشف تحليل تهريب الحمض النووي الريبي لفيروس التهاب الكبد C (HCV) أن الخلايا المضيفة تزيد من إنتاج الإنترفيرون من النوع الأول عن طريق تعبئة RNAs الفيروسية في exosomes ثم يتم نقلها إلى الخلايا المتغصنة القريبة ، مما يؤدي إلى تنشيط TLR-7 المضاد للفيروسات. استجابة [9]. كشفت دراسات أخرى أن تصدير الحمض النووي الريبي من النواة قد تم تثبيطه عن طريق تكوين مجاميع بروتينية سامة [10] ، وهي ملاحظة قد تكون ذات صلة بأمراض الزهايمر وهنتنغتون ، على سبيل المثال ، لأنها مدفوعة بتراكم البروتينات السامة. .

يعد توطين الحمض النووي الريبي مهمًا أيضًا لتأسيس قطبية الخلية وعدم تناسقها أثناء التطور. يتم تحقيق الزخرفة التنموية عن طريق تقييد ترجمة mRNA إلى جانب واحد من الخلية ، مما يؤدي إلى توطين منتجات البروتين المعنية بشكل فعال في الأجزاء الفرعية الخلوية. هذا واضح في ذبابة الفاكهة البويضات ، حيث يتم تنظيم بيكويد يؤسس توطين الرنا المرسال مناطق الرأس والصدر في البويضة [12]. كما تم تحديد آليات مماثلة في Xenopus وتطور الزرد [13 ، 14].

في الثدييات البالغة ، يوجد أحد الأمثلة البارزة على نقل الرنا المرسال بعيد المدى في الخلايا العصبية في شكل حبيبات بروتين نووي مرسال (mRNP) [15]. يتم تخزين حبيبات mRNP في "النقاط الفعالة متعدية" داخل الخلايا العصبية [16]. يؤدي إزالة الاستقطاب العصبي إلى تحريك حبيبات التخزين لتشكيل تعدد اللغات المترجمة بنشاط [17]. تمت دراسة الأدوار البيولوجية المعقدة لمجمعات mRNP على مدار العشرين عامًا الماضية ، مما يكشف عن روابط مهمة لبقاء الخلايا العصبية ووظيفتها [15 ، 18 ، 19].

لدراسة توطين ونقل الحمض النووي الريبي الخلوي ، تم تطوير عدة طرق لتتبع الحمض النووي الريبي والتي أحدثت ثورة في هذا المجال. تصف هذه المراجعة الأكثر شيوعًا بين هذه التقنيات على وجه التحديد ، نناقش منهجيات وسم الحمض النووي الريبي الداخلي باستخدام علامات أوليغومير الفلورية (الفلورسنت) فى الموقع التهجين (FISH)) أو منارات ، لتتبع الحمض النووي الريبي الفردي عن طريق صنع الحمض النووي الريبي الوهمي الذي يحمل عناصر يمكن تتبعها (مثل MS2 ، boxB ، RNA aptamers) ، ولتحديد الحمض النووي الريبي الذاتية من خلال الحمض النووي الريبي التكميلي المركب مع Cas9 / Cas13 غير التحفيزي (الجدول 1). نناقش أيضًا كيف تساعد هذه التقنيات في توضيح بيولوجيا الحمض النووي الريبي المهمة.

الجدول 1. نظرة عامة على تقنيات تتبع الحمض النووي الريبي. يستخدم RNA FISH أوليغومرات مضادة للاندماج مرتبطة بالفلور لتتبع النصوص المستهدفة في الخلايا الثابتة. تتشابه المنارات الجزيئية من الناحية المفاهيمية ، ولكن إضافة جهاز تقطير يقلل من ضوضاء الخلفية من المجسات غير المقيدة ، مما يحسن فائدتها في تجارب الخلايا الحية. تتضمن علامات MS2 والطرق المشابهة القائمة على aptamer استنساخ متواليات فريدة (دبابيس الشعر MS2 ، تسلسل RNA aptamer ، وما إلى ذلك) في 3′UTR من نص الاهتمام ، ثم يتم التعرف على هذا التسلسل وربطه ببروتين ذي علامات فلورية أو جزيء آخر باستخدام مباشر. أو الخلايا الثابتة. يستخدم تتبع الحمض النووي الريبي ببروتينات Cas بروتينات Cas غير النشطة تحفيزيًا الموسومة ببروتين فلوري. تحدد هذه البروتينات الفلورية RNAs المستهدفة بناءً على استهداف sgRNA اعتمادًا على بروتين Cas المستخدم ، وقد تكون هناك حاجة أيضًا إلى أوليغومرات إضافية تسمى PAMmers.

2. الفلورسنت RNA فى الموقع التهجين (RNA FISH) ومنارات RNA

فى الموقع التهجين هو تقنية بيولوجية جزيئية قوية كانت موجودة في كل مكان في مجال أبحاث الأحماض النووية منذ ظهورها لأول مرة في الستينيات [20]. أليغنوكليوتيدات مضادة المعنى (ASOs) مع تسميات تصوير إشعاعي ذاتي مثل 3 H أو 32 P سمحت للباحثين باستهداف تسلسلات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي التي كانت مكملة للقليل ، مما يسمح بتصور هذه التسلسلات داخل الخلايا أو الأنسجة الثابتة [21]. على مر السنين ، تطورت هذه التقنية مع إدخال طرق جديدة للكشف ، مثل وضع العلامات على الذهب جنبًا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني أو مراسلي الكروموجينيك المرتبط بالإنزيم [21].

2.1. RNA FISH

تم تقديم FISH في عام 1980 من قبل مختبر van Duijin [22] ، وتم اعتماده على نطاق واسع لدراسة توطين الحمض النووي أثناء التطور ، والعدوى الفيروسية والاستجابات الخلوية والجزيئية الأخرى. تم تطويره مبدئيًا لتحديد مناطق الحمض النووي الجينومي التي كانت مكملة بشكل خاص لتحقيقات الحمض النووي الريبي الاصطناعية المضادة للحساسية (الشكل 1)أ) ، سرعان ما تم تكييف FISH للكشف عن أنواع مختلفة من جزيئات الحمض النووي الريبي [23-25]. كان التقدم الرئيسي في تقنية RNA FISH هو تطوير جزيء واحد FISH (smFISH) ، حيث تقوم عدة مجسات الفلورسنت المتتالية بتهجين الحمض النووي الريبي بطريقة "تبليط" ، ويؤدي وجود مجسات متعددة إلى تضخيم الإشارة (الشكل 1ب) [26]. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للكشف عن النسخ منخفضة النسخ ، حيث أن العدد الكبير من المجسات المرتبطة بنسخة يمكن أن تضيء جزيء RNA واحد مع العديد من الفلوروفورات.

الشكل 1. RNA FISH. (أ) يتم تصنيع أوليجومرات قصيرة بتسلسل استهداف مضاد للحمض النووي الريبي ذي الأهمية. أوليغومرات مضادة المعنى (ASOs) مترافقة مع الأصباغ الفلورية التي يمكن أن تثيرها بالفحص المجهري متحد البؤر أو الفلورسنت. في الوقت الحاضر ، يتم توفير أوليغومرات RNA FISH على شكل "كوكتيل" من ASOs المختلفة التي يمكنها تجانب الحمض النووي الريبي المستهدف. (ب) تهجين ASOs إلى الحمض النووي الريبي المستهدف باستخدام تسلسل الاستهداف المضاد للدلالة. عن طريق تبليط الحمض النووي الريبي ذي الأهمية مع ASOs ، يتم تضخيم الإشارة لتسهيل اكتشاف النسخ المنخفضة أو المنتشرة في الخلية. (ج) مثال على RNA FISH في خلايا هيلا تم تصويره بالمجهر متحد البؤر (صورة غير منشورة من المؤلفين). جابده تم الكشف عن mRNA (أخضر فاتح) ، الموسومة بـ Quasar 670 ASOs ، في السيتوبلازم. ملاط 1 (أحمر) ، الموسومة بـ Quasar 570 ASOs ، موضعية في بقع نووية.

بينما يسمح RNA FISH بتتبع جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا ، فهو أيضًا أداة قيمة لتحديد التوزيع المكاني وعدد النسخ من الحمض النووي الريبي المستهدف. RNA-seq والنسخ العكسي (RT) متبوعًا بمقايسات تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) يمكن أن تحدد بشكل مباشر النصوص في الأنسجة أو الخلايا المفردة [6،27،28] ، لكنها عادةً لا تبلغ عن التوطين والتعبير من الحمض النووي الريبي (RNA) محدد في الأجزاء تحت الخلوية مثل النواة. وبالتالي ، فإن القياس الكمي بواسطة RNA FISH مفيد بشكل فريد لتحديد رقم النسخة وموقعها. اليوم ، يعتبر RNA FISH أحد المعايير الذهبية لتوطين الحمض النووي الريبي.

تم استخدام FISH منذ ظهوره لدراسة تهريب الحمض النووي الريبي الخلوي. تحليل FISH للفرد β-أكتين (ACTB) كشفت mRNAs أن توطينهم في الصفائح الرائدة في الخلايا الليفية يساهم في حركية الخلية [29]. بصورة مماثلة، β-أكتين ينظم نقل الرنا المرسال عبر البروتين المرتبط بالرمز البريدي 1 في مخاريط النمو العصبي اتجاه نمو محور عصبي ، كما يتضح من FISH إلى جانب التلوين المناعي [30]. كما أجريت التجارب المذكورة أعلاه والتي تضمنت تهريب الحمض النووي الريبي HCV [9] ومنع تصدير الحمض النووي الريبي النووي [10] باستخدام تقنية FISH.

يمكن مضاعفة RNA FISH لتحديد النصوص المختلفة في نفس العينة. استخدم Kosman وزملاؤه [31] هذا النهج لاكتشاف توطين خمسة نصوص فريدة في ذبابة الفاكهة الأجنة. القيد الرئيسي لهذا النهج هو عدد مرشحات المجهر المتاحة ، حيث أن طيف الانبعاث لكل فلوروفور فريد. على الرغم من أن طرق FISH مثالية لـ فى الموقع تحليل العينات الثابتة ، فهي غير قابلة لتصور الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية. الحاجة إلى إصلاح العينات للتحليل تجعل من المستحيل دراسة ديناميات الحمض النووي الريبي تحت الخلوية في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تثبيت وتحضير العينات بمواد كيميائية قوية مثل بارافورمالدهيد أو حمض الهيدروكلوريك إلى تغييرات كيميائية حيوية داخل الخلايا ، أو تعطيل الهياكل الخلوية أو تغيير طبيعة البروتينات والعضيات [32]. للتخفيف من هذه المخاوف وتمكين تحليل الخلايا الحية ، تم تطوير المنارات الجزيئية ، التي تستخدم طرقًا مثل FISH ، لتصور الحمض النووي الريبي في الخلايا الثابتة والحية.

2.2. منارات جزيئية RNA

المبدأ الأساسي للمنارات الجزيئية هو نفسه FISH: لتوظيف oligos ذات العلامات الفلورية التي تربط النصوص التكميلية ذات الأهمية في الخلية. يكمن الاختلاف الرئيسي في اقتران الفلوروفور بمخمد [33]. المبردات هي مركبات تمتص الطاقة المنبعثة من الفلوروفور وتبددها كحرارة بدلاً من الضوء ، مما يقلل بشكل كبير من إشارة الخلفية للمسبارات غير المنضمة [33]. الشكل الأكثر استخدامًا للمنارات الجزيئية هو الحلقة الجذعية (الشكل 2أ) [34]. يشكل التسلسل المستهدف (15-20 نانومتر) حلقة محاطة بتسلسل متناظر على كل طرف ، وغالبًا ما يتم ربط الطرف 5 بحبيبات الفلور ، في حين أن الطرف 3 يحتوي على فاصل ملتصق [33]. عندما لا يكون المرشد مرتبطًا بهدف تكميلي ، فإن المتواليات المتناظرة تشكل جذعًا حادًا ، مما يجعل الفلوروفور والمخمر قريبين بما يكفي لقمع الفلورة ، ومع ذلك ، فإن الارتباط بالتسلسل المستهدف يتسبب في حدوث دبوس الشعر وحامل الفلور المرتبط والمخمر منفصلة ، مما أدى إلى انبعاث مضان (الشكل 2ب) [33]. يؤدي عدم وجود إشارة عندما تكون المنارات غير منضمة إلى تقليل الضوضاء. وبالتالي ، يمكن إدخال المنارات في الخلايا الحية ، مما يسمح للمرء بمراقبة أهداف RNA الخاصة به في الوقت الفعلي. نظرًا لأن أهداف الحمض النووي الريبي (RNA) مرتبطة بأوليغومرات تحمل علامات الفلوروفور المضادة للتحسس ، فإن مضاعفة الإرسال باستخدام المنارات الجزيئية أمر ممكن [35]. يمكن إدخال المنارات في الخلايا باستخدام التثقيب الكهربائي ، أو الحقن المجهري ، أو نفاذية الغشاء بوساطة السموم ، أو حتى من خلال مسدسات الغاز الحيوي المعدني الثقيل. كل طريقة لها حدودها الخاصة ، ولكنها مجتمعة تمكن من تصور الحمض النووي الريبي في نماذج الخلايا المختلفة [36 ، 37].

الشكل 2. منارات جزيئية. (أ) هيكل المنارة الجزيئي الأكثر شيوعًا هو مسبار نمط حلقة جذعية. هيكل حلقة الساق يجعل الصبغة الفلورية قريبة من جزيء التبريد. يمتص هذا المخمد الطاقة المنبعثة من الصبغة ويطلقها على شكل حرارة ، مما يقلل ضوضاء الخلفية الفلورية. تحتوي الحلقة على تسلسل الاستهداف الذي سيتم تهجينه مع RNA ذي الأهمية. (ب) ينفصل دبوس الشعر عندما يتم تهجين تسلسل الاستهداف إلى الحمض النووي الريبي المستهدف. هذا الفصل ينقل الصبغة الفلورية خارج نطاق التبريد ، مما يسمح بانبعاث الفلورة القابلة للاكتشاف.

2.3 RNAscope

بينما يتم استخدام تصور RNA بشكل شائع في البحوث الطبية الحيوية الأساسية ، لا يتم استخدام هذه التقنيات على نطاق واسع في التشخيص ، حيث يُفضل تحليل RT-qPCR للكشف عن النسخ الورمية أو الفيروسية [38]. ومع ذلك ، كما هو موضح أعلاه ، تفتقر الأساليب القائمة على PCR إلى الدقة المكانية ، ويمكن أن تتعطل حساسيتها بواسطة عينات الأنسجة غير المتجانسة. تم تطوير RNAscope لتحسين القدرات التشخيصية لاكتشاف الحمض النووي الريبي. تمثل هذه التقنية تحسينًا على FISH أحادي الجزيء الذي يسهل اكتشاف النسخ منخفضة النسخ في عينات الأنسجة [39]. على الرغم من أنه تم تصميمه لاكتشاف الحمض النووي الريبي في عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين ، إلا أنه يمكن تكييفه مع الأبحاث الخلوية والجزيئية الأساسية أيضًا.

Instead of using antisense oligomers directly conjugated to a fluorophore, RNAscope amplifies fluorescence by first assembling a scaffold on the RNA of interest, the foundation of which consists of Z-shaped probes (figure 3). These probes have a targeting sequence of 18–25 nucleotides that are complementary to the target. Attached to this probe is a spacer sequence, connected to a 14-nucleotide long tail sequence. Targeting sequences are designed so that two probes will hybridize directly adjacent to each other similarly, the two tails form a continuous 28-nucleotide hybridization site. The coupled tails form a sequence recognized and bound by the preamplifier, a backbone-like structure containing 20 binding sites. These binding sites are complementary to amplifiers, which attach and complete the scaffold. Once the amplifiers are bound, up to 20 dye molecules can bind each amplifier to produce a robust fluorescent signal within the cell or tissue [39]. Given that many common dyes, such as Alexa 488 or Alexa 647, are compatible with RNAscope, imaging can be done on most fluorescent or confocal microscopes.

Figure 3. RNAscope probe design. Two Z-shaped probes bind adjacent sequences on the RNA of interest, forming a platform-like structure across the tail sequences. Here, the preamplifier binds, and can only bind when two Z probes are bound. Amplifiers bind the preamplifier, serving as scaffolds for the fluorescent probes to bind. Each set of Z probes provides binding sites for hundreds of fluorescent probes, dramatically amplifying fluorescence on a single molecule. Z probes can be tiled along an RNA molecule to further improve detection.

Z probes must bind directly adjacent to the target transcript to fully assemble the RNAscope scaffold, reducing much of the background fluorescence and improving the signal-to-noise ratio substantially. In addition, one set of Z probes can contain up to 400 dyes, and therefore designing multiple Z probes to tile the RNA of interest dramatically increases the ability to detect single RNA molecules. When detecting rare or isolated transcripts in large tissue sections, one set of RNAscope probes will provide a strong signal for detection in contrast, standard RNA FISH would require tiling of oligomers, which entails designing dozens of oligomer sequences for a single target RNA. Depending on the length of the RNA of interest, this may not even be possible, making RNAscope a more suitable approach. The short length of the Z-probe targeting sequences (two 18–25 bp sequences) makes them suitable for targeting miRNAs, and perhaps circular RNAs at splice junctions as well. RNAscope can be multiplexed to up to four independent targets in a single sample [39], limited mainly by the number of available dyes. However, this technique is mainly designed for use in tissue, and as such, it is currently restricted for use in paraffinized samples.

3. Bacteriophage-derived RNA tags

The methods described so far rely on complementary base-pairing of oligomers to the target transcript. One drawback of these approaches is that if the target sequence is unavailable, either because it is embedded in a hairpin, bound to another nucleic acid, or associated with an RNA-binding protein (RBP), then hybridization cannot occur [40]. In addition, the abundance of endogenous transcripts might be low, further limiting the sensitivity of the approach. To overcome these limitations, researchers have developed labelling systems based on the addition of a bacteriophage-derived RNA tag to study the dynamics of an individual RNA in live cells. First demonstrated in yeast [41], the technique has been developed to study RNA mobilization within cells and interaction with different عبر-acting factors, including RBPs, miRNAs and lncRNAs [42,43].

3.1. MS2/MS2-BP and boxB/λN

The MS2 tagging system is based on the coat protein of the MS2 bacteriophage, which contains an RNA-binding site with high binding affinity for RNA stem-loop structures found only in the bacteriophage RNA [44]. Bacteriophages normally use this coat protein to ensure encapsidation of the viral RNA genome [45]. As these hairpin structures do not exist in mammalian RNA, the MS2 coat protein does not interact with proteins or RNAs synthesized by the cell. However, introducing a plasmid that transcribes a transcript of interest bearing multiple MS2 hairpins (often inserted in the 3′-untranslated region (UTR) of the chimeric mRNA) enables the coat protein to bind these exogenous transcripts with high affinity and specificity (figure 4). Fusing a fluorescent protein such as GFP to the MS2 coat protein (generically MS2-XFP) further enables the easy observation of the RNA in the cell [39]. The signal may be amplified by including additional hairpins to the 3′UTR, thereby increasing the number of MS2-binding sites. Most constructs have 6 to 24 MS2 hairpins attached, to form a longer chimeric RNA. A similar system has been developed to exploit another bacteriophage tractable tag, the boxB sequence, which is recognized by the bacteriophage protein λN. Tagging methods have been developed that track a λN-XFP fusion protein interacting with a boxB motif inserted in a chimeric transcript of interest [46], but they have been used less frequently than the MS2 system in recent years.

Figure 4. MS2 RNA tagging. (أ) MS2 experiments require generation of two constructs. One construct encodes the RNA of interest (or a certain region, such as only the 3′UTR) with MS2 hairpins encoded downstream. When transcribed, the MS2 hairpins will form in the 3′ end of the transcript and be recognized by the MS2 binding proteins (BPs). MS2-BPs are expressed from the other construct and generally include a fluorescent protein such as GFP. (ب) Following transfection, both constructs are transcribed and the MS2-BPs are translated. The ectopic transcript of interest is detected and bound by the fluorescent MS2-BPs. The number of hairpins encoded in the plasmid will determine the number of MS2-BP binding sites cloning more hairpins will amplify the signal and improve detection. Since unbound MS2-BPs will still fluoresce in the cell, determining proper plasmid transfection ratios is essential for maximizing signal-to-noise ratios.

The MS2 system has been employed to study RNA localization in a multitude of biological contexts. Sheth and Parker [47] used it to demonstrate that yeast RNA decay intermediates are localized in cytoplasmic processing bodies (PBs). Similar experiments were used later to gain evidence that miRNAs and Argonaute suppress mRNA translation in mammalian PBs [48]. يعيش ذبابة الفاكهة oocytes expressing ectopic nos-MS2 and MS2-GFP were used to demonstrate the timing of mRNA transport in developing oocytes and the role of the cytoskeleton in transcript trafficking [49]. MS2-tagged Pkp4 3′UTR constructs were used to demonstrate the preferential recruitment of RNAs found in adenomatous polyposis coli-containing ribonucleoprotein (APC-RNP) complexes to granules that contained mutant forms of the protein FUS and have been linked to amyotrophic lateral sclerosis [50,51]. Recent research by Morisaki and colleagues [52] used MS2-mRNA tagging as part of an experiment to track single-transcript translation في الجسم الحي. mRNAs were tracked with MS2, and the nascent FLAG-tagged polypeptides were tagged with fluorescently labelled anti-FLAG Fab fragments. Importantly, neither the tags nor the fluorescent proteins disrupted normal protein or transcript distribution.

In each of these studies, RNA localization relative to subcellular structures was tracked by its association with fluorescently tagged proteins and/or immunostaining of protein markers. The MS2 system enables studies of association of an RNA of interest with an endogenous protein more easily than FISH, since fixation is often not required.

3.2 Advantages and drawbacks of bacteriophage tags

MS2 tagging is best suited to track RNA in live cells, a virtually impossible task with FISH. An important advantage of the MS2 system is that, in theory, the MS2 RNA tag should not impact upon the natural function of the endogenous RNA. By contrast, when a transcript of interest is detected via associated (tagged) antisense oligomers, there is a chance that the oligomers may cover an RBP binding site, disrupting normal processes such as trafficking or loading into an RNP complex. Conversely, in live cells, antisense oligomers may directly interfere with mRNA translation or other RNA functions. In addition, in fixed cells, antisense oligomers recognizing the same site as an RBP may be masked when the RBP is bound, thereby preventing visualization. While careful oligomer design can avoid some of this interference, unknown interactions between oligomers and RBPs can create further artefacts. By contrast, since MS2 hairpins are generally added to the distal end of the 3′UTR, and the coat protein will bind these hairpin repeats exclusively, there is less concern of accidentally interrupting cellular processes during experimentation.

Despite these advantages, there are limitations to this technique as well. While cloning extra hairpin repeats may enhance detection, replication and transcription of long sequences of palindromic DNA repeats can be unstable and lead to slips in the DNA polymerase, which may result in loss or extra insertions of these hairpins [53]. In addition, one must create a new construct for each chimeric transcript of interest, which requires separate cloning efforts for each construct. Unbound MS2-XFP molecules can also cause high levels of background noise. To improve signal-to-noise ratios, cells must receive a ‘correct’ amount of MS2-tagged RNA relative to MS2-XFP plasmids [54]. The MS2 system requires transfection or electroporation of a minimum of two plasmids (one expressing the MS coat protein, the other the MS2-tagged RNA), and the optimization of transfection can be challenging. Finally, given that MS2-XFP will bind any RNA with the MS2 hairpin structure, two different MS2-RNAs expressed in a single cell cannot be distinguished, so the system is not amenable to multiplexing. If detection of multiple RNAs is required, then MS2 detection methods must be combined with other systems like molecular beacons (above), the boxB/λN system, or perhaps a CRISPR/Cas-derived method (below).

4. Cas-derived systems and live-cell RNA tracking

CRISPR/Cas-based technologies are well known for their immense potential in genome editing and genetic engineering [55]. The technology was recently expanded to include fluorescently tagged Cas proteins to bind and track RNA in living cells.

4.1. كاس 9

The most widely studied Cas protein is Cas9 from الأبراج العقدية [56,57]. Recently, the Yeo lab demonstrated that catalytically inactive Cas9 (dCas9) may be exploited to track endogenous mRNAs in the cytoplasm during the assembly of stress granules, cytoplasmic ribonucleoprotein aggregates that form transiently in response to damaging signals (figure 5) [58,59]. Being catalytically inactive, dCas9 is unable to cleave the target RNA, and instead remains bound to it however, it only binds nucleic acids that present a protospacer adjacent motif (PAM). For DNA, the PAM must be on the non-target strand (reviewed in [60]) since mammalian RNA is single-stranded, Yeo and colleagues [58] developed PAMmers, short oligonucleotides that contain a sequence complementary to the target RNA, effectively replacing the non-target strand. In this manner, PAMmers associate with the dCas9–sgRNA complex and bind to the transcript of interest. Using FISH as a control, dCas9 was shown to bind mRNA with high specificity and without affecting its transcription, half-life or translation [58]. When not bound to sgRNA, the fluorescent dCas9 proteins are restricted to the nucleus, due to dual nuclear-localization signals (NLSs) at the C-terminus, reducing cytoplasmic signal when not actively in use. The dCas9 system demonstrated less noise than FISH and was effective in tracking endogenous RNA targets in live cells [58].

Figure 5. dCas RNA tracking methods. (أ) Two plasmids are required for dCas experiments. One plasmid encodes the catalytically inactive Cas protein, with mutations to inhibit any nuclease activity. Cas is also modified with two nuclear localization signals and a fluorescence domain, such as GFP or mCherry. The other plasmid contains the sgRNA scaffold, and will synthesize the sgRNA when transcribed. The targeting sequence in determined by the sequence of the sgRNA. If dCas9 from S. المقيحة is used, a separate oligomer called a PAMmer must also be transfected into the cell. The PAMmer is not necessary when using dLwaCas13a protein. (ب) Structure of a fully assembled dCas9 complex. The target RNA is identified by the sgRNA targeting sequence. dCas9 requires a PAM sequence to be present on the off-target strand. Since RNA is single stranded, the PAMmer binds downstream to provide a PAM sequence for dCas9 to recognize and bind. (ج) The NLSs improve signal-to-noise ratio by sequestering unbound dCas proteins. When dCas is free, or only bound to the sgRNA, the protein is held in the nucleus due to the double-NLS tag. Only fully assembled complexes, which consist of dCas, the sgRNA, the target RNA and the PAMmer (if necessary), are exported to the cytoplasm. In principle, any fluorescence observed in the cytoplasm is true signal.

Limitations of this method include the necessity of developing PAMmers, which increases the complexity of implementation of this method, requiring the transfection of (i) a plasmid expressing dCas9 (which is quite large, 10–14 kbp), (ii) the sgRNA, and (iii) the PAMmer oligomers (figure 5أ). Exposing cells to this volume of foreign nucleic acids could be stressful [61]. More complex experiments, such as those requiring additional fusion proteins to study colocalization, face further challenges of optimization of DNA quantities and ratios to maintain acceptable transfection efficiencies while preserving cell homeostasis. Given that this RNA tracking system was reported recently, there are no resources available to design sgRNAs or PAMmers targeting a specific RNA, so its implementation has been slow. It may be possible to overcome some of these limitations by delivering the RNA-tracking components directly to the cell as pre-formed dCas9–sgRNA RNPs. The pre-assembly of PAMmers, sgRNA and Cas proteins to streamline the targeting has already been demonstrated for genome editing, so it may translate easily to dCas–sgRNA complexes as well [62].

4.2 Other Cas proteins

Another Cas system, Cas13a, isolated from ليبتوتريشيا وادي (LwaCas13a) [63], has recently been proposed for tracking RNA in live cells. LwaCas13a is capable of targeting ssRNA, thus eliminating the need for PAMmers and making sgRNA the only determinant for RNA targeting. Fluorescently tagged, catalytically inactive LwaCas13a (dLwaCas13a-XFP) effectively tracked endogenous RNAs in living cells. As with the dCas9 system, the dLwaCas13a system has an NLS, which restricts the fluorescent dCas13a protein to the nucleus unless bound to both the sgRNA and the target RNA, upon which it is exported to the cytoplasm [63]. This technique appears to be superior to the dCas9 system, as dLwaCas13a does not require a PAMmer and thus the smaller ‘transfection load’ allows greater efficiency and more complex experimental designs. Online resources are being developed for data analysis [63]. However, neither method can currently multiplex endogenous tracking targets, since each dCas9 or dCas13a complex will bind sgRNAs indiscriminately

The use of dLwaCas13a technique has several shortcomings. The first is that several sgRNAs need to be tested to optimize sequence recognition. With the catalytically active LwaCas13a, the guide position had a dramatic impact on the level of knockdown, and shifting the guide position a few bases reduced gene knockdown [63]. It is possible that this limitation may also be seen with the catalytically inactive variant, reducing its specificity. In addition, binding of the sgRNA–Cas complex to the target transcript may disrupt RBP binding, should sgRNA target sequence overlap with the RBP binding site.

A recent study [64] demonstrated that Cas9 from بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية (SauCas9) can bind and cleave ssRNA, requiring only the sgRNA, not a PAMmer. While the study only demonstrates the cleavage capacity of SauCas9, an inactive variant with a fluorescent tag would likely be capable of binding and tracking RNA in live cells. In this case, the tagged variant would function in a similar manner to the dLwaCas13a system. Given how well characterized Cas9 systems are, this may potentially become a next robust method of Cas-derived RNA tracking.

5. Additional considerations

We have described several popular RNA visualization methods that rely either on fluorescent RNAs (FISH, molecular beacons, RNAscope) or fluorescent proteins recognizing unique RNA tags (MS2/λN and catalytically inactive Cas).

5.1 Further strengths and limitations

As discussed above, FISH and molecular beacons employ fluorophore-labelled antisense oligos that bind target RNAs based on complementary sequences [22,26]. The use of FISH is limited to fixed cells, while molecular beacons overcome this limitation through coupled quenchers that reduce background noise when deployed to living cells. Neither method, however, can be used in complex living organisms, as there are no effective means of introducing the probes into large regions of living tissue, such as the brain however, molecular beacons may be used in live single-cell organisms. If used in fixed samples, both hybridization techniques are applicable to cells and tissue samples, but RNAscope is predominantly used for detecting transcripts in paraffin-embedded tissues for clinical diagnostics [39]. Since both techniques bind complementary sequences on target transcripts, their success depends on the accessibility of these sequences if the target is hidden in structural motifs such as hairpins, or covered by an RBP, then both techniques lose sensitivity. The use of tiling oligomers can increase detection, as more fluorophores can interact with the transcript of interest. Given that the RNAscope method inherently amplifies the signal from a single probe without the need of tiling, they are better suited for detection of rare or isolated transcripts. FISH, RNAscope and molecular beacons are also the only techniques discussed here that can detect multiple RNAs (known as multiplex detection) in a single assay if probes are labelled with different fluorophores.

RNA tagging using chimeric fluorescent RBPs relies on the addition of RNA sequences in رابطة الدول المستقلة (e.g. MS2, boxB) or عبر (gRNA). When using bacteriophage RNAs (MS2, boxB), one plasmid expressing the fluorescently tagged MS2 or λN proteins and another plasmid expressing the RNA of interest tagged with MS2 or boxB hairpin repeats are introduced into cells. The fluorescent proteins then bind the RNA tags, permitting the localization of exogenous transcripts in live cells. Since this assay does not depend on complementary oligomers, there is less risk of RNA structure or binding proteins decreasing the sensitivity and lower concern with background. The sensitivity for a single transcript can be increased by cloning additional MS2/boxB tags into the chimeric RNA, creating more RBP recognition sites. Bacteriophage-derived RNA tracking methods require transfection of two plasmids (the phage-tagged RNA and the tag-binding protein), and transfection ratios must be optimized to achieve an acceptable signal : noise ratio. The plasmids are typically introduced through transient transfection without stable incorporation into the genome, so this method is mainly useful for cultured cells and single-cell organisms, such as yeast. Following transfection and assay execution, samples may be fixed for static imaging as well.

Similarly, fluorescent, nuclease-deficient Cas proteins (e.g. dCas9-GFP) can be directed by sgRNAs to target RNAs in live cells in the presence of an additional oligomer, a PAMmer [58,63]. A variation of this method includes use of fluorescent dLwaCas13a, which also requires a sgRNA, but does not need a PAMmer. The NLSs in Cas proteins restrict unused Cas proteins to the nucleus, and only fully formed Cas–target complexes are exported to the cytoplasm, reducing cytoplasmic noise and increasing sensitivity. Whether MS2, λN, or Cas proteins are the chosen tagged fluorescent proteins, the need for plasmid transfections increases the complexity of the assay and may prevent the testing of additional components (e.g. siRNAs or additional plasmids) in these cells. Other limitations include detection of multiple target RNAs at the same time using the same approach, analysis of cells that cannot be transfected, and analysis of RNA in archival samples. Fluorescent Cas-derived systems face many of the same limitations as the bacteriophage-derived methods: the need to transfect multiple plasmids, the limitation of use in living cells or single-cell organisms, and the restriction to track single transcripts. It does not, however, require extensive optimization of transfection, as the dual-NLS tags on the fluorescent Cas proteins will restrict them to the nucleus until the entire complex forms. This feature reduces the background signal in the cytoplasm and facilitates the detection of حسن النية transcript signals [63,64].

5.2 Fluorescent RNA aptamers

RNA aptamers are remarkably specific RNA structures that are capable of binding myriad targets [65]. Aptamers are generated through artificial selection, a process known as SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment), allowing identification of RNAs that bind many ligands, such as proteins, other RNAs, and even small molecules like fluorophores [66].

These aptamers are chosen by rounds of artificial selection for RNAs that bind dyes such as the synthetic GFP mimic DFHBI (Spinach) or thiazole orange (TO) derivatives. When these dyes are not bound to aptamers, excited energy is released through molecular movement, such as bond rotation [67]. However, the dyes cannot move when bound to the RNA aptamer, so this energy must be released through light emission (figure 6). This process inherently reduces the background noise produced by free dyes, which overcomes one of the biggest challenges posed by bacteriophage-derived RNA tagging systems. Once the aptamer sequence has been identified through SELEX, this sequence can easily be cloned into a plasmid to produce the aptamer.

Figure 6. Fluorescent RNA aptamers. (أ) Structure of an RNA aptamer. Following SELEX for an aptamer that binds the desired dye, this sequence is cloned into the 3′UTR of the transcript of interest. (ب) Most dye molecules, such as DFHBI (Spinach), do not fluoresce when not bound to the aptamer. Energy is released through bond rotation and other molecular motion. When the dye is bound by the aptamer, motion is restricted. Therefore, energy must be emitted as light, improving signal-to-noise ratio and confidence in molecular detection.

Application of these aptamers is remarkably flexible. The aptamer sequence can be cloned into the 3′ region of an RNA of interest, similar to an MS2 hairpin, but the sequence is much shorter, generally in the range 20–80 nts [67]. Once cloned, these tagged RNAs can be used in both fixed- and live-cell experiments. For fixed-cell experiments, transfected cells express the plasmids for several hours to days, then they are fixed and stained with the dye of choice [68]. These samples are still suitable for immunofluorescent staining as well, making the RNA aptamer approach compatible with analysis of RNA–protein complexes. Live-cell experiments involve transfection of RNA-aptamer transcripts that have been produced في المختبر and pre-incubated with dye [68]. Following aptamer-dye transfection, transcripts can be tracked في الجسم الحي with minimal background signal.

Despite the introduction of fluorescent Spinach RNA aptamers in 2011 [69], there has been little use of fluorescent RNA aptamers in the RNA field. Cytotoxicity caused by malachite green aptamers and poor signal-to-noise ratios from Spinach aptamers have been limitations to early RNA aptamer technology [67]. Recently, however, improvements on an existing RNA Mango aptamer have made the aptamer approach to RNA visualization more appealing [68]. These RNA Mango aptamers bind TO-biotin, where the TO dye is conjugated to a biotin molecule by a polyethylene glycol chain, with nanomolar affinity. The high affinity, combined with the low background noise of unbound dyes, makes the RNA Mango system effective for localizing RNAs of interest in fixed or live cells. Beyond imaging, RNA aptamers have been used as fluorescent biosensors, able to detect small molecules like ADP or potassium ions [70,71]. Since TO is biotinylated, this system can also be used to purify the RNAs and proteins binding TO [72]. RNA Mango is fairly inexpensive, but investigations into multiple RNAs of interest will require cloning of new constructs to introduce the aptamer sequence to the target RNA 3′UTR. Resources for RNA Mango aptamers are already available, and given its versatility, it is likely that this technology will see widespread adoption soon.

5.3 Fluorescent فى الموقع RNA sequencing

While RNA FISH can provide insight into transcript quantity, detection is limited by the targeting sequence chosen. Accordingly, antisense probes may not detect splice variants or transcripts with single nucleotide polymorphisms (SNPs). Recent work from the Church lab has introduced novel methods for fluorescent فى الموقع sequencing (FISSEQ) of RNAs in fixed cells and tissues [73]. Samples are fixed onto slides and the RNA is converted to cDNA via فى الموقع reverse transcription. During circularization, amines incorporated into the cDNA are used to cross-link and prevent diffusion. The cDNA is circularized and amplified by rolling-circle amplification cross-linking of amines produces cDNA libraries فى الموقع. The cDNA is then subjected to sequencing through SOLiD sequencing, a sequence-by-ligation approach (reviewed in [74]).

This technique preserves the cytoskeleton and overall sample structure, and it can detect biologically active RNAs, so researchers can detect functional differences between cell types or regions of tissue. It can be used in cells, formalin-fixed tissues, ذبابة الفاكهة embryos, and organoids derived from induced pluripotent stem cells [73]. The entire procedure is performed on a confocal, wide-field epifluorescent or spinning disk microscope however, sequencing can take several weeks, and this method may not be available to researchers who use core microscope facilities. The authors initially achieved approximately 200 mRNA reads per cell, but suggested optimization that could increase this yield to approximately 5000 reads per cell, primarily through depletion of endogenous rRNAs [73]. At the time it was developed, the technique was able to detect up to 8102 genes, as seen in fibroblasts in a wound-healing assay [75] no technique described here can determine localization of this many transcripts at once. The authors indicated that FISSEQ may not accurately detect transcripts that are bound to RBPs or locked into complexes, likely because any such complexes become fixed during sample preparation.

5.4. Studying RNA localization to understand RNA function

Given their functional diversity, RNA studies have taken centre stage in cellular biology. mRNAs encode proteins needed for cellular processes, while non coding RNAs can perform structural and regulatory functions, such as chromatin organization, ribosome assembly, and transcriptional control, post-transcriptional RNA regulation and post-translational control of protein levels and function [76–78]. The advent of new methods to study the transcriptome, particularly RNA-seq, has uncovered RNAs involved in many physiological processes and pathologies [9,11,12,79,80]. While we can gain extensive information on RNA identity and abundance, we lack the spatio-temporal resolution to understand how RNA molecules interact with cellular machineries and structures. In this regard, the use of RNA tracking techniques such as those described here can begin to address these critical questions.

One area that may benefit from RNA tracking is the field of extracellular vesicles (EVs, including exosomes and microvesicles) [81,82]. These tiny membrane-enclosed structures were once thought to play a role in eliminating cytoplasmic components [83], but have recently been implicated in cancer metastasis, innate immunity and delivery of therapeutic molecules [9,84,85]. They contain many proteins and nucleic acids, including miRNAs (e.g. let-7) and lncRNAs (MALAT1) [86,87], but little is known about how their cargo is sorted, as well as how EVs are trafficked in and out of cells [88]. Tracking of RNAs to follow their journey from synthesis to packaging followed by secretion and eventual delivery to recipient cells may provide important insight into the machinery and pathways involved in EV metabolism.

5.5. RNA localization in disease processes

RNAs of many types (mRNAs, miRNAs and lncRNAs) are known to play key roles in cancers [79,80], and have been used as prognostic markers. For example, the lncRNAs MALAT1 و HOTAIR are metastasis markers in cancer such as lung, breast and nasopharyngeal carcinomas [89–91]. Although they are potential targets for therapeutic intervention in cancer, their specific role in malignancies is unknown, and hence designing small molecules that will disrupt or restore their function is challenging [92]. It is difficult to intervene upon potential oncogenic targets if their cancer-causing function is not fully known [93,94]. Therefore, understanding the spatio-temporal roles of these RNA molecules is a key step towards distinguishing healthy from cancerous cells. Drug screens may also uncover small molecules that target the RNAs and disrupt their function, and thus it may be beneficial to observe the function of these transcripts before and after treatment to understand the effect of the intervention.

5.6. الاتجاهات المستقبلية

Outside of biomedical applications, there are many mysteries surrounding RNA, particularly non coding RNAs. The project ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) aims to identify all functional regions in the human genome and characterize their purpose in the cell [95]. This project revealed that approximately 75% of the human genome is transcribed, while a mere 1.22% of the genome consists of protein-coding exons [95,96]. In addition to challenging the ‘junk DNA’ hypothesis that had existed for years, the sheer volume of noncoding RNAs transcribed at some point in some tissue suggested that many of these transcripts serve some function. Understanding the biological value of these uncharacterized transcripts includes elucidating the subcellular compartments in which they reside. The localization of a noncoding RNA in the nucleus, for instance, may suggest a role in gene organization, transcription and/or early processing. The localization of a noncoding RNA in the cytoplasm may suggest a role in the regulation of stability, translation, storage, and/or mobilization of mRNAs or other cytoplasmic molecules. Further evidence will be needed to fully characterize the impact of noncoding RNAs, but understanding their spatial distribution is an unbiased first step in elucidating their functions.

Despite important advances in the field, however, there are still some restrictions to the application of RNA tracking methods. The systems described here generally require a known RNA sequence, either by creating complementary nucleic acids that seek out the transcript of interest, or by developing vectors that encode chimeric (tractable) versions of the RNA. Therefore, most of the current tracking technologies are not adequate for discovering new RNAs and are limited to studying the function of known RNAs.

There is rising recognition that coding and noncoding RNAs play pivotal functions in all cellular processes, including chromatin organization, transcriptional control, regulation of post-transcriptional events (mRNA transport, stability, storage, and translation), and post-translational processes like protein stability and multiprotein assembly. Along with these expanding functions, evidence is also accumulating that RNA dysregulation can lead to major disease categories including cancer, neurodegeneration, cardiovascular disease and metabolic syndrome. As our ability to track RNAs improves, we will gain insight into their mechanisms of action, expanding our functional understanding of RNAs and enabling the development of therapeutic venues.


Materials & Methods

  • black, 384-well, low flange microplates from Corning, UK
  • TAMRA-conjugated peptides provided by NKI Protein Facility (Amsterdam)
  • LC1 protein was recombinantly produced, according to reference 1
  • Multi-mode microplate reader from BMG LABTECH, Germany

الإعداد التجريبية
1 nM labelled peptides were mixed to assay buffer: 15 mM KH2ص4 pH 7.2, 5% glycerol, 1 mg/ml BSA. Mix was then distributed equally across the plate. For each experiment, triplicates were prepared: starting concentration of protein LC1 was 4 μM, and then this was serially diluted 1:1 using the mix in the other wells. For competitive assays, constant enzyme concentration (around Kd) were mixed with 1 nM labelled ligand in the same assay buffer as above. Competitors were then titrated in using serial 1:1 dilutions as described for direct binding assay. The typical concentration range started from 10 μM.


CLARIOstar instrument settings

Detection Mode: Fluorescence Polarization, Endpoint
No. of flashes: 50
Excitation: 540-20
Emission: 590-20
Target temperature: 25°C

Focus and Gain adjustments for both channels were set on a reference well containing just labelled ligand. It was chosen to set the adjusted polarization to a reference value of 35 mP. Typical adjustment values for gain were between 1600 and 2000.


Filter-Binding Assay for Analysis of RNA–Protein Interactions

One of the oldest and simplest (and still very useful) methods for detecting RNA–protein interactions is the filter-binding assay. If a mixture of RNA and protein is passed through a nitrocellulose filter, the protein will be retained and the RNA will pass through. But if the protein is capable of binding RNA, then RNA will be retained on the filter as well. This protocol requires a purified protein (or chromatographic fractions) of interest and 32 P-labeled RNA. To perform the assay, the protein sample is serially diluted to several concentrations. It is then mixed with a fixed amount of radioactive RNA and allowed to bind under desired conditions for 30–60 min. The binding reactions are then applied to a 96-well dot-blot apparatus with low vacuum to trap the complexes on three membranes: The top membrane traps aggregates, the middle membrane (nitrocellulose) binds proteins and RNA–protein complexes, and the bottom membrane (which is charged) collects free RNA. After washing and drying, the membranes are exposed to phosphor-imaging screens for quantitation. Alternatively, single, larger filters (that can be counted in a scintillation counter) and a filter manifold can be used.


RNA Fluorescence Assay

With our well-established RNA assay platform, the experienced scientists at Creative Biolabs are dedicated to helping you detecting RNA for your projects. Based on our deep understanding of RNA fluorescence assay, our scientists have built up best-fit solutions for RNA fluorescence assay and will achieve the best outcome for our customers all over the world.

RNA Fluorescence Assay

Nucleic acid detection and quantitation are essential to the performance of many molecular biology protocols. Accurate RNA quantitation is a critical step in obtaining successful results using complex molecular biology techniques, such as reverse transcription PCR and differential display PCR. The fluorescent-based RNA assay should be useful in determining yields of purified cellular RNAs and في المختبر transcribed RNA and for subsequent manipulations and analyses, such as Northern blotting, RNase protection assays, cDNA library preparation, and reverse transcription PCR.

The use of fluorescent nucleic acid stains for the determination of nucleic acids in solution has become a commonly employed technique with greater sensitivity and less contaminant interference than 260 nm absorbance measurements. The dye-based assay is suitable for high-throughput automation, as the procedure consists of a single-step sample mixing with a short incubation period, and the dye is spectrally compatible with a variety of excitation sources employed in many commercially available detection systems.

The Strategy of RNA Fluorescence Assay

A variety of dyes, including ethidium bromide, SYBR Green II stain, YOYO-1, methylene blue, acridine orange, are available for sensitive fluorescence-based detection of RNA in the solution. The fluorescence assay allows detection of as little as 1.0 ng/ml RNA in a standard fluorometer, filter fluorometer, or fluorescence microplate reader. The dye-based system provides concentrated RNA dye, dilution buffer, and RNA standard. Fluorescence measurements can be performed using any fluorescence reader capable of measuring excitation and emission at the appropriate wavelengths.

Fluorescent RNA-binding reagent exhibits fluorescence enhancement and high quantum yield upon binding nucleic acids. The unbound dye is essentially nonfluorescent and has a large extinction coefficient. Meanwhile, the linear quantitation range for fluorescent RNA-binding reagent extends over three orders of magnitude in RNA concentration. The fluorescence RNA assay enables highly specific fluorescence quantification of RNA over a broad range of concentrations using a single assay. Utilizing simple mix-and-read protocols and incorporating fluorescence-based detection reagents, these assays are designed for accuracy and convenience.

Fig.1 RNA Fluorescence Assay.

Advantages of RNA Fluorescence Assay

  • Sensitive quantitation of purity and concentration of RNA in solution
  • A variety of fluorescent dye for RNA quantitation
  • Simple mix-and-measure assay and widest dynamic range
  • Selectively and accurately quantify in the presence of common contaminants
  • More sensitive than absorbance methods for low-concentration samples
  • Easy to use, rapid, and readily adaptable for automation

Creative Biolabs is one of the well-recognized experts in supporting RNA fluorescence assay projects. With over a decade of extensive experience and advanced technology, our scientists are proud to tailor and conduct the best-fit proposal to meet your specific project requirements. Please feel free to contact us for more information and a detailed quote.


شاهد الفيديو: علم الأحياء تحت المجهر: ما الحمض النووي والحمض النووي الريبي (ديسمبر 2022).