معلومة

ما هي آلية تكامل الجينات المعدلة وراثيا (من ناقل التعبير إلى الجينوم المضيف)؟

ما هي آلية تكامل الجينات المعدلة وراثيا (من ناقل التعبير إلى الجينوم المضيف)؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كيف يتكامل الجين المحور (في المتجه) مع جينوم المضيف؟ (على سبيل المثال في طريقة حبة الزجاج ، لا بيولوجية ولا agrobacterium).

لقد قطعت بالفعل بعض الأجزاء (NdeI-PciI) من المتجه (pUC18) وأتساءل عما إذا كانت تؤثر على إجراء التكامل. هل هناك أي إجراء يشبه إعادة التركيب مثل البوابة؟


ما هو مضيفك في هذه الحالة؟ للاندماج في جينوم البكتيريا ، ستحتاج إلى استخدام ناقل "تكامل". سيتم الحفاظ على معظم النواقل التجارية (مثل pUC18) دون الاندماج في جينوم المضيف.

فيما يلي وصف لمتجه التكامل من Bacillus Genetic Stock Center لإعطائك فكرة عن كيفية دمج الحمض النووي الغريب في جينوم Bacillus:

نواقل التكامل هي بلازميدات تتميز بالنسخ المتماثل الشرطي المقترن بعلامة اختيار. إذا تم تحويل البلازميد إلى مضيف مناسب في ظل الظروف التي تحدد وجود البلازميد ولكنها تقيد تكراره ، فإن جميع المحولات ستدمج البلازميد في كروموسومها (أو بعض الحمض النووي المقيم الآخر القادر على التكاثر في ظل الظروف الانتقائية). في الممارسة العملية ، عادة ما تحدد العلامة المختارة مقاومة المضادات الحيوية. عادةً ما يعني التكرار الشرطي أن للبلازميد وظائف النسخ المتماثل التي تعمل في E. coli ولكن ليس في البكتيريا موجبة الجرام ، مثل B. subtilis. في بعض الأحيان يتم استخدام النمط الظاهري للنسخ المتماثل الحساس لدرجة الحرارة بدلاً من ذلك. يستهدف التكامل موضعًا معينًا على الكروموسوم من خلال تضمين متواليات متطابقة على البلازميد. إذا كان هناك تسلسل متماثل واحد ، فسيقوم تقاطع واحد بدمج الكروموسوم بأكمله في الموقع المستهدف بواسطة آلية من نوع كامبل. إذا كان هناك تسلسلان متماثلان ، وكانا قريبين نسبيًا من بعضهما على الكروموسوم ، فإن التقاطع المزدوج سينتج عنه شريط يتكامل بين أهداف الكروموسومات. (مصدر)

بالنسبة لمعظم الأعمال المخبرية الروتينية في البيولوجيا الجزيئية ، ليست هناك حاجة لدمج الجينات في جينوم الإشريكية القولونية. يستخدم التكامل عادة لتوليد سلالات خلوية "خروج المغلوب" لدراسة وظيفة الجينات في البكتيريا محل الاهتمام.


الفصل الخامس - التعبير المستمر من نواقل الحمض النووي

تمتلك نواقل الحمض النووي القدرة على أن تصبح أدوات طبية قوية لعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان. ومع ذلك ، فقد طور جسم الإنسان مجموعة من الاستراتيجيات الدفاعية لاكتشاف وإسكات الحمض النووي الغريب أو في غير محله ، والذي يصادف عادةً أثناء العدوى أو تلف الكروموسومات. يجب أن يتغلب ناقل العلاج الجيني البشري ذو الصلة سريريًا على هذه الحماية أو يتجنبها مع تقديم مستويات مستدامة من منتج الجين العلاجي دون المساس بحيوية المضيف المتلقي. تؤدي العديد من نواقل الحمض النووي غير الفيروسية إلى تشغيل آليات الدفاع هذه ، ثم يتم تدميرها أو جعلها صامتة. وبالتالي ، بدون تعديل أو تصميم مدروس ، فإن المنفعة السريرية لناقل الحمض النووي النموذجي محدودة بشكل أساسي بسبب الطبيعة العابرة لتعبير الجينات المحورة. يعد تطوير نواقل الحمض النووي الآمنة والمستمرة في التعبير شرطًا أساسيًا أساسيًا للتطبيق السريري الناجح ، وبالتالي يظل أحد المهام الاستراتيجية الرئيسية لأبحاث العلاج الجيني غير الفيروسي.

في هذا الفصل سوف نصف فهمنا الحالي للآليات التي يمكن أن تدمر أو تهدم نواقل الحمض النووي ومناقشة الاستراتيجيات ، التي تم استخدامها لتحسين قوتها ومستوى ومدة التعبير الجيني.


الانقسام في الجسم الحي للمانحين الجينات يعزز التكامل المستهدف بوساطة نوكلياز †

يرغب المؤلفون في أن يكون معروفًا ، في رأيهم ، أنه ينبغي اعتبار المؤلفين الأولين مؤلفين أول مشتركين.

الملخص

يشيع استخدام تكامل الحمض النووي المستهدف للتخلص من تأثيرات الموضع على تعبير الجينات المحورة. يمكن أن يستهدف التكامل مواقع محددة في الجينوم عبر كل من العمليات القائمة على التنادد والتماثل. يبدأ كلا المسارين عملية التكامل مع كسر خاص بالموقع في الكروموسوم ، عادةً من نوكلياز إصبع الزنك (ZFN). لقد وصفنا سابقًا تقنية تكامل مستهدفة فعالة ومستقلة عن التماثل والتي تلتقط قطع قصيرة (& lt100 bp) من الحمض النووي في فواصل الكروموسومات التي أنشأتها ZFNs. نوضح هنا أن تضمين موقع هدف نوكلياز على البلازميد المتبرع متبوعًا بانقسام نوكلياز في الجسم الحي لكل من المتبرع والكروموسوم يؤدي إلى تكامل فعال لجزيئات الحمض النووي الكبيرة الحجم المتحولة الجينات في كسر الكروموسومات المزدوجة حبلا. تم إثبات التكامل المستهدف الناجح عبر الخطية للمانحين في الجسم الحي في خمسة مواقع متميزة في نوعين من خلايا الثدييات ، مما يبرز عمومية النهج. أخيرًا ، نظهر أن خلايا CHO ، وهي من النوع الخلوي المتمرد للتكامل القائم على التماثل ، بارعة في التقاط المتبرعين المحولين الخطي في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، نظهر الضربة القاضية للهامستر فوت 8 الجين عبر التكامل المتزامن ZFN- أو TALE بوساطة نوكلياز لكاسيت الجسم المضاد. تمكن نتائجنا من إضافة الجينات المحورة المستهدفة الفعالة إلى الخلايا والكائنات الحية التي تحقق نتائج سيئة مع الأساليب التقليدية التي يحركها التماثل. التكنولوجيا الحيوية. بيونج. 2013110: 871–880. © 2012 Wiley Periodicals، Inc.

يمكن العثور على معلومات دعم إضافية في النسخة عبر الإنترنت من هذه المقالة.

اسم الملف وصف
bit_24733_sm_SupplFig1.tif4.9 ميجا بايت الشكل التكميلي 1
bit_24733_sm_SupplFig2.tif418.5 كيلوبايت الشكل التكميلي 2
bit_24733_sm_SupplFig3.tif695.8 كيلوبايت الشكل التكميلي 3
bit_24733_sm_SupplTabs.doc94.5 كيلوبايت الجداول التكميلية
bit_24733_sm_SupplFigsLegend.doc20.5 كيلوبايت أسطورة الأرقام التكميلية

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


الملخص

تعد خلايا الثدييات المؤتلفة هي المضيف الرئيسي لإنتاج علاجات البروتين. بالإضافة إلى التعبير العالي لجين المنتج ، يجب أن يحتوي المنتج المفرط أيضًا على سمات نمطية متفوقة تتعلق بعملية التمثيل الغذائي وإفراز البروتين والتحكم في النمو. إن إدخال الجينات التي تمنح سمات الإنتاجية المفرطة ذات الصلة هو استراتيجية تستخدم بشكل متكرر لتعزيز الإنتاجية. تم تنفيذ معظم جهود هندسة الخلايا هذه باستخدام أنظمة التعبير التأسيسي. ومع ذلك ، تستجيب الخلايا للإشارات البيئية المختلفة والأحداث الخلوية ديناميكيًا وفقًا للاحتياجات الخلوية. يسمح استخدام الأنظمة المحفزة بالتعبير المعتمد على الوقت ، ولكنه يتطلب معالجة خارجية. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون تعبير الجينات المتحولة & # x27s متزامنًا مع إيقاع الخلية المضيفة ، وعلى مستويات مناسبة للهدف. تحقيقًا لهذه الغاية ، حددنا الجينات بديناميكيات تعبير مختلفة ونطاقات شدة باستخدام بيانات النسخ المجمعة. يمكن استخدام معززاتهم لدفع التعبير عن الجينات المحورة باتباع الديناميكيات المرغوبة. لقد عزلنا محفز جين البروتين المتفاعل مع Thioredoxin (Txnip) وأظهرنا قدرته على دفع التعبير الجيني بالتنسيق مع نمو الخلية. لقد استخدمنا أيضًا محفز الهامستر الصيني هذا لتصميم التعبير الديناميكي عن ناقل الفركتوز GLUT5 الفأري في خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) ، مما يمكنهم من استخدام السكر وفقًا للاحتياجات الخلوية بدلاً من الزائدة كما هو معتاد في الثقافة. وبالتالي ، تم إنتاج كمية أقل من اللاكتات ، مما أدى إلى معدل نمو أفضل ، ومدة استزراع مطولة ، ومعيار أعلى للمنتج. يوضح هذا النهج مفهومًا جديدًا في الهندسة الأيضية يمكن استخدامه لتحقيق تحكم ديناميكي في السلوكيات الخلوية لتحسين خصائص العملية.


المطالبات

1. ناقل جيني مُكيَّف للتعبير العابر لجين متحور في خلية عضو محيطي يشتمل على تسلسل تنظيمي مرتبط عمليًا بجين متحور حيث يمنع التسلسل التنظيمي أو يقلل من التعبير عن الجين المحول المذكور في خلايا النسب المكونة للدم.

2. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يشتمل التسلسل التنظيمي على واحد أو أكثر من التتابعات المستهدفة لتسلسل miRNA.

3. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يكون الناقل ناقلًا معيبًا في تكامل الفيروس الارتجاعي.

4. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يكون المتجه عبارة عن ناقل بطني معيب في التكامل (ناقل IDLV).

5. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 4 حيث يشتق ناقل IDLV من فيروس نقص المناعة البشرية.

6. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يتم اختيار كل تسلسل مستهدف واحد أو أكثر بشكل مستقل من تسلسل مستهدف بواسطة miR-142 و miR-155 و miR-223.

7. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يكون التسلسل المستهدف عبارة عن تسلسل مستهدف بواسطة miR-142.

8. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يكون التسلسل المستهدف عبارة عن تسلسل مستهدف بواسطة miR-155.

9. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يكون التسلسل المستهدف عبارة عن تسلسل مستهدف بواسطة miR-223.

10. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 7 حيث يشتمل التسلسل التنظيمي على أربع نسخ من التسلسل المستهدف miR-142.

11. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يكون التسلسل المستهدف مكملًا جزئيًا أو كليًا لتسلسل miRNA.

12. الناقل وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يكون منتج الجينات المحورة عبارة عن بروتين علاجي.

13. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يكون منتج الجين العابر عبارة عن مستضد.

.14 ​​المتجه وفقًا لعنصر الحماية 13 حيث يتم اختيار مولد الضد من المجموعة التي تتكون من مولد ضد داخلي ، ومولد ضد خارجي ، ومستضد متباين ، ومستضد ذاتي.

15. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 14 حيث يكون المستضد عبارة عن مستضد خارجي.

16. الناقل وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يرتبط الجين العابر بشكل عملي بمحفز معين للأنسجة.

17. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 16 حيث يكون المحفز النوعي للأنسجة محفزًا خاصًا لخلية في عضو طرفي.

18. الناقل وفقًا لعنصر الحماية 17 حيث يتم اختيار العضو المحيطي من المجموعة التي تتكون من الكبد والعضلات والغدة الصعترية والطحال والغدد الليمفاوية.

19. الناقل وفقًا لعنصر الحماية 16 حيث يكون المحفز الخاص بالأنسجة محفزًا خاصًا بالكبد.

20. المتجه وفقًا لعنصر الحماية 16 حيث يكون المحفز الخاص بالأنسجة عبارة عن محفز مختار من مجموعة محفز الألبومين ومحفز الثيرتين العابر ومروج alpha1-antitrypsin ومحفز apoE / alpha1-antitrypsin الاصطناعي ومحفز ET التخليقي.

.21 المتجه وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يكون المتجه على شكل جسيم ناقل فيروسي.

22. مجموعة من تركيبات الدنا لإنتاج جسيم ناقل وفقًا لعنصر الحماية 21 يشتمل على جينوم ناقل قابل للتعبئة ، و gag ، و pol ، و env أو بدائل وظيفية له.

23. مجموعة من تراكيب الحمض النووي وفقًا للادعاء رقم 22 حيث تقوم البنى المذكورة بترميز تكامل معيب.

24. مجموعة من تركيبات الحمض النووي وفقًا لعنصر الحماية رقم 22 حيث تشتمل التركيبات المذكورة على مواقع LTR المعدلة حيث تمنع مواقع LTR المعدلة تكامل جينوم ناقل الفيروسة البطيئة.

25. التركيبة الصيدلانية المشتملة على الناقل أو الجسيم كما هو مذكور في عنصر الحماية 1.

26. خلية مصابة أو منقولة بالناقل أو الجسيم حسب عنصر الحماية 1.

27. المتجه أو الجسيم وفقًا لعنصر الحماية 1 لاستخدامه في إحداث أو تعزيز التحمل المناعي ضد مولد ضد في موضوع ما.

28. المتجه أو الجسيم وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث يكون المستضد عبارة عن مستضد خارجي يتم إعطاؤه كجزء من علاج استبدال البروتين.

29. ناقل أو جسيم وفقًا للمطالبة 1 لاستخدامه في علاج أو منع مرض مختار من المجموعة التي تتكون من أمراض المناعة الذاتية ، وأمراض الحساسية ، والأمراض المناعية ، والكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف.

30. طريقة للحث على التسامح في موضوع تشمل إدارة المتجه أو الجسيم وفقًا لعنصر الحماية 1 للموضوع ، حيث يكون التسامح للمنتج الذي يعبر عنه الجين المحور.


تطبيق تحرير الجينات CRISPR / Cas9 في تطوير لقاحات الطيور

تم تطبيق العديد من الأساليب لتعديل النواقل الفيروسية لبناء لقاح مؤتلف مرشح ضد فيروسات الدواجن (Baron et al. ، 2018). الأساليب الحالية المتاحة لتعديل اللقاحات الناقلة للفيروسات غير فعالة ، وتستغرق وقتًا طويلاً ، وتتطلب عمالة كثيفة خاصة لإجراءات التنقية (Zou et al. ، 2017). وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى تقنية تحرير جينوم أكثر فعالية وموثوقية لتطوير لقاحات فيروسية. يعد أسلوب تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 هو الخيار الأفضل لأنه لم يوفر فقط سهولة بديلة ونهجًا بسيطًا مقارنة بالنهج التقليدية ، ولكنه يوفر فرصة لتوليد لقاحات مؤتلفة متعددة التكافؤ توفر الحماية المتزامنة ضد أمراض الطيور الرئيسية.

حتى الآن ، تم استخدام CRISPR / Cas9 بنجاح في الطفرات المستهدفة للعديد من النواقل الفيروسية بما في ذلك فيروس الهربس في تركيا (HVT) (Tang et al. ، 2018 ، 2020 Chang et al. ، 2019) ، فيروس التهاب الحنجرة والحنجرة المعدية (ILTV) (Atasoy et ، 2019) وفيروس التهاب الأمعاء البط (DEV) (Zou et al. ، 2017 Chang et al. ، 2018). تم تحرير جينومات الناقلات الفيروسية المؤتلفة هذه لإيواء مستضدات محددة والتعبير عنها كلقاحات محتمل ضد الأمراض المتعددة مثل NDV (Atasoy et al. ، 2019) ، AIV (Zou et al. ، 2017 Chang et al. ، 2019) ، MD (Tang et al.، 2018، 2020) و ILTV (Tang et al.، 2020). وبالمثل ، فإن في المختبر تم تقييم فعالية واستقرار هذه اللقاحات المؤتلفة من خلال ممرات خلوية متعددة مقارنة بالطرق الكلاسيكية حيث قد ينتج عدم استقرار الجينات المحورة من عدة مقاطع (Zou et al. ، 2017 Tang et al. ، 2018 ، 2020 Atasoy et al. ، 2019 Chang et al. . ، 2019). لتحديد استقرار هذه التركيبات / الكاسيتات أثناء المرور المستمر للخلايا للفيروسات المؤتلفة لما لا يقل عن 15 مقطعًا وتم تأكيد ثبات الإدخال والتعبير عن طريق التكتل المناعي الغربي ، والتألق المناعي ، والكشف الجزيئي (Tang et al. ، 2018 ، 2020 Atasoy et آل ، 2019 تشانغ وآخرون ، 2019). لذلك ، أظهرت هذه الدراسات إمكانات CRISPR / Cas9 كأداة فعالة وسريعة وبسيطة لتطوير لقاحات الطيور. تم تلخيص نظرة عامة على تطبيقات CRISPR / Cas9 في بناء لقاحات فيروسات الطيور في الجدول 2 ومناقشتها على وجه التحديد أدناه لكل فيروس.

الجدول 2. نظرة عامة على تطبيقات كريسبر / كاس 9 في صناعة اللقاحات الفيروسية للطيور.

فيروس مرض نيوكاسل (NDV)

يعد فيروس مرض نيوكاسل (NDV) أحد أهم مسببات الأمراض الفيروسية التي تصيب الطيور والتي تتسبب في خسائر اقتصادية كبيرة على مستوى العالم (Alexander، 2001 Zahid et al.، 2020). إن علم الوراثة والبيولوجيا NDV معقدان للغاية ، حيث يوجد أكثر من 20 نمطًا وراثيًا متميزًا من الناحية التطورية مقترحًا حاليًا استنادًا إلى التصنيف التصنيفي (ديميتروف وآخرون ، 2019). على الرغم من الجهود المستمرة لصياغة لقاح فعال ND ، لا تزال التحسينات مطلوبة. في هذا الخط ، يقدم نظام NHEJ-CRISPR / Cas9 جنبًا إلى جنب مع نظام Cre / lox نهجًا قويًا لتعزيز وتطوير لقاحات ND الجديدة. لقد أظهرنا سلامة وفعالية فيروس التهاب الحنجرة والحنجرة المعدية (ILTV) كناقل للقاح يؤوي الجين الانصهار (F) لـ NDV السريع ويسلط الضوء على تعدد استخدامات NHEJ-CRISPR / Cas9 ونظام Cre / Lox (Atasoy et al. ، 2019 ). في هذه التجارب ، حذفنا ثيميدين كيناز (المعارف التقليدية) وفريدة من نوعها قصيرة 4 (الولايات المتحدة 4) الجينات من جينوم ILTV واستبدالها بجين مراسل GFP وجين F من NDV ، على التوالي باستخدام نظام NHEJ-CRISPR / Cas9 لبناء لقاح مرشح ثنائي التكافؤ ضد اثنين من فيروسات الجهاز التنفسي الرئيسية للطيور (ILTV و NDV). وهكذا ، خلصنا إلى أن إدخال الجينات المحورة في جينوم ILTV باستخدام CRISPR / Cas9 والاستئصال اللاحق لجينات العلامة باستخدام نظام Cre & # x02013Lox هو نهج فعال للتعبير عن الجينات بثبات دون التسبب في أي تأثير ضار لتكرار ناقل اللقاح الفيروسي (Atasoy et al. . ، 2019).

فيروس انفلونزا الطيور (AIV)

يتسبب الانتشار الواسع لفيروسات إنفلونزا الطيور الشديدة الإمراض (AIVs) في خسائر اقتصادية كبيرة في صناعة الدواجن ، في حين أن خطر الجائحة المستمر ينجم عن الانتقال العرضي لهذه الفيروسات إلى البشر (بيريس وآخرون ، 2007). تعمل استراتيجيات التطعيم الحالية لفيروس نقص المناعة البشرية كإجراء وقائي ضد عدوى الفيروس في الطيور ، بدلاً من القضاء عليها (Collett et al. ، 2020 Irshad et al. ، 2020). ومع ذلك ، على الرغم من الفعالية الحالية لاستراتيجيات التطعيم هذه ، فإن الطيور معرضة للإصابة بفيروسات الإنفلونزا أ (كوليت وآخرون ، 2020). تم استخدام كريسبر / كاس 9 في تطوير لقاحات قائمة على الفيروسات ضد أنواع فرعية معينة من فيروس أنفلونزا الطيور. أظهرت الدراسة السابقة استخدام نظام CRISPR / Cas9 كأداة فعالة وقوية في هندسة الجينوم المستهدفة لفيروس التهاب الأمعاء البط (DEV) لتوليد لقاح مرشح يعبر عن بروتين هيماجلوتينين (HA) لفيروس إنفلونزا الطيور H5N1 الشديد الإمراض (Zou et al. . ، 2017). علاوة على ذلك ، يحتوي لقاح DEV المؤتلف هذا أيضًا على جينين آخرين [بروتينات ما قبل الغشاء (PrM) وجينات بروتين سكري (E) المغلف] لفيروس تمبوسو البط (DTMUV) ، مما ينتج عنه لقاح ثلاثي التكافؤ مرشح ضد عدوى H5N1 و DEV و DTMUV في البط.

يحقق Cas9 المرتبط بـ CRISPR هندسة جينوم خاصة بالموقع ويمكنه إدخال فاصل مزدوج (DSB) في موقع كروموسومي محدد بواسطة دليل RNA (Cong et al.، 2013 Jinek et al.، 2013 Mali et al.، 2013 أ). يمكن إصلاح DSB إما عن طريق الانضمام إلى طرف غير متماثل (NHEJ) أو مسار الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). يستخدم مسار HDR متواليات DNA المتبرع المتماثل من كروماتيدات شقيقة أو DNA غريب لإنتاج عمليات إدخال دقيقة ، واستبدالات بسيطة بين مواقع DSB أو اثنين من DSBs وتعديلات أخرى بينما ينشئ مسار NHEJ عمليات الحذف والإدراج الصحيحة (Tang et al. ، 2019) . يعد مسار NHEJ نوعًا رئيسيًا من آليات إصلاح الحمض النووي ، مقسمًا إلى مسارات كلاسيكية وبديلة تربط الحمض النووي المكسور معًا بنجاح (Mao et al. ، 2008). يمكن أن تؤدي الدقة المنخفضة NHEJ & # x00027s ، والتي من المحتمل أن تكون عرضة للخطأ ، إلى حذف القاعدة أو الإدراج (indel) بعد الإصلاح ، مما يؤدي إلى طفرة تغيير الإطارات (Bernheim et al. ، 2017). NHEJ هو مسار الإصلاح السائد المستند إلى DSB ويمثل معظم إصلاحات DSB لدورة الخلية (Arnoult et al. ، 2017).

وفي الوقت نفسه ، تم استخدام نهج الإصلاح الموجه للتماثل الموجه (HDR) الخالي من الأخطاء CRISPR / Cas9 لتوليد لقاح ثنائي التكافؤ HVT-AIV وتم اختيار HVT-HA المؤتلف من خلال تطوير اختبار امتزاز دقيق وسهل وسريع لخلايا الدم الحمراء بدلاً من استخدام الأساليب التقليدية (Chang et al. ، 2019). أسفرت هذه العملية عن دقة تقريبية & # x0007E6٪ لإدخال H7N9 HA مما يشير إلى أن NHEJ توسط في إسكات غالبية فيروسات HVT السلبية لـ GFP (Chang et al. ، 2019). يمكن أن تمر أجهزة DSB بوساطة CRISPR / Cas9 عبر كل من NHEJ و HDR ، ولكن في معظم الحالات يفضل NHEJ (Frit et al. ، 2014) ، وبالتالي يمكن تبرير إمكانية الصمت بوساطة NHEJ.بينما يعد HDR مسارًا صادقًا ويمكنه تحفيز آلية إصلاح خالية من الأخطاء ، إلا أن هناك حاجة إلى تعزيز كفاءته.

فيروس مرض ماريك & # x00027s (MDV)

فيروس مرض ماريك & # x00027s (MDV) هو مرض تكاثر لمفاوي للدجاج يتم التحكم فيه بشكل أساسي عن طريق التطعيم منذ عام 1969 (Okazaki et al. ، 1970). فيروسات الهربس في تركيا و # x00027s (HVT) ، والتي تنتمي إلى فيروس الهربس Meleagrid 1 ، تم استخدامه على نطاق واسع لأكثر من 40 عامًا كلقاح ضد مرض ماريك (MD) (Okazaki et al. ، 1970). في الآونة الأخيرة ، يتم استخدام HVT كناقل فيروسي لتوفير مناعة وقائية ضد MD والأمراض الفيروسية الأخرى من خلال إيواء والتعبير عن مستضدات فيروسية أجنبية لأمراض فيروسية أخرى (Li et al.، 2011 Vagnozzi et al.، 2012 Esaki et al.، 2013 Chang وآخرون ، 2019). أحدثت تقنية CRISPR / Cas9 ثورة في بناء لقاح HVT وإمكانات HVT كناقل للقاحات متعددة التكافؤ. نجح Tang et al. في إنتاج HVT مؤتلف مع إدخالات جينية ثلاثية تؤدي إلى تطوير لقاح فيروسي مؤتلف يمكن أن يحفز الحماية ضد ثلاثة أمراض فيروسية رئيسية للطيور (ILTV و IBDV و AIV و MDV Table 2 Tang et al.، 2020). وبالمثل ، فإن Chang et al. استخدم HDR-CRISPR / Cas9 لتطوير لقاح HVT مؤتلف ثنائي التكافؤ يعبر عن مستضد هيماجلوتينين (HA) لفيروس الأنفلونزا A (Chang et al. ، 2019).

فيروس التهاب الحنجرة والحنجرة المعدية (ILTV)

فيروس التهاب الحنجرة والحنجرة المعدية (ILTV) هو مرض تنفسي يؤثر على صناعة الدواجن وله تأثير اقتصادي في جميع أنحاء العالم (Gowthaman et al. ، 2020). التهاب الحنجرة والحنجرة المعدية (ILT) التي تسببها نوع فيروسات الهربس المرارة 1 (GaHV-1) ويمكن أن ينتقل عن طريق الطيور المصابة و fomites (Davison et al. ، 2009). التطعيم باستخدام لقاحات فيروسية موهنة ومؤتلفة هو تدبير التحكم الأساسي المستخدم في المناطق الموبوءة (Collett et al. ، 2020). في محاولة لتطوير سلالات لقاح أكثر استقرارًا ، تم تطبيق تقنية CRISPR / Cas9 بنجاح لتوليد ناقل فيروسي مؤتلف يعبر عن مستضد ILTV (الجدول 2). تانغ وآخرون. استخدموا أسلوب تحرير الجينات CRISPR / Cas9 لضرب شريط التعبير ILTV للبروتين السكري D-glycoprotein I (gD-gI) في منطقة معينة داخل جينوم HVT (Tang et al. ، 2020). أظهرت هذه النتائج أن نهج تحرير الجينات CRISPR / Cas9 كان قادرًا على قطع جينوم HVT في منطقة معينة وإدخال كاسيت التعبير ILTV gD-gI من خلال نظام إصلاح NHEJ المستقل عن التماثل. نجح المؤلفون أيضًا في إدخال مستضدين آخرين & # x02014AIV H9 HA و IBDV VP2 في مواقع مختلفة من جينوم HVT المؤتلف ، وتطوير لقاح HVT مؤتلف ثلاثي التكافؤ مستقر.


طرق الاستنساخ

ال تقنية GATEWAY Cloning يعتمد على نظام إعادة التركيب الخاص بالموقع الذي تستخدمه الملتهمة لدمج الحمض النووي الخاص بها في بكتريا قولونية كروموسوم. كلا الكائنات الحية لها مواقع إعادة تركيب محددة تسمى AttP في phage l موقع و Attسلة مهملات بكتريا قولونية. يتم تحفيز عملية التكامل (lysogeny) بواسطة إنزيمين: البروتين phage l المشفر Int (Integrase) و بكتريا قولونية بروتين IHF (عامل مضيف التكامل). عند التكامل ، إعادة التركيب بين Attب (25 nt) و Attتولد مواقع P (243 NT) Attلتر (100 نانومتر) و Attمواقع R (168 nt) التي تحيط بالعاثية المتكاملة DNA (انظر الشكل 1).

هذه العملية قابلة للعكس ويتم تحفيز الاستئصال مرة أخرى Int و IHF بالاشتراك مع بروتين phage l Xis. ال Attالأرض Attتعيد مواقع R المحيطة بالعاثية التي تم إدخالها موقع الحمض النووي - على وجه التحديد أثناء حدث الختان لإصلاح Attموقع P في فج l و Attموقع ب في بكتريا قولونية كروموسوم.

ال ردود فعل البوابة نكون في المختبر إصدارات التكامل والتفاعلات الختان. لجعل ردود الفعل اتجاهية تم تطوير موقعين مختلفين قليلاً ومحددين ، Att1 و Att2 لكل موقع إعادة التركيب. هذه المواقع تتفاعل بشكل خاص مع بعضها البعض. على سبيل المثال في رد فعل BP Attيتفاعل B1 فقط مع AttP1 مما أدى إلى AttL1 و AttR1 و AttB2 فقط مع Attإعطاء P2 AttL2 و AttR2. رد الفعل العكسي (رد فعل LR) يظهر نفس الخصوصية.

الهدف النهائي لردود فعل GATEWAY هو استنساخ التعبير. غالبًا ما تكون هذه عملية من خطوتين:

الخطوة 1 استنساخ الجين المراد تحويله إلى ملف ناقل الدخول باستخدام رد فعل BP.
الخطوة 2 استنساخ الجين المعني من Entry Clone (الخطوة 1) إلى a ناقل الوجهة باستخدام رد فعل LR إنتاج استنساخ التعبير.

دعونا نلقي نظرة فاحصة على رد فعل LR من الخطوة 2 (انظر أيضًا الشكل 2). يتم استنساخ الجين المعني في ملف ناقل الدخول ويحيط بها AttL1 و Attمواقع إعادة التركيب L2. ال ناقل الدخول صامت نسبيًا ويحتوي على الجين الخاص بمقاومة الكاناميسين (Km r). لإنتاج استنساخ التعبير يجب استنساخ الجين إلى أ ناقل الوجهة يحتوي على جميع معلومات التسلسل اللازمة للتعبير ، وجين مقاومة الأمبيسلين (Ap r) ، وموقعين لإعادة التركيب (أتR1 و AttR2) الذي يحيط بجين من أجل الاختيار السلبي ، اتفاقية مكافحة التصحرB (البروتين المشفر سام بالنسبة للمعيار بكتريا قولونية سلالات).

يتم خلط اثنين من البلازميدات و مزيج إنزيم LR C LONASE يضاف. رد الفعل اتجاهي ومحدد ، بحيث Attيتفاعل L1 فقط مع AttR1 و AttL2 مع AttR2. ينتج عن إعادة التركيب بنائين: المقصود استنساخ التعبير ومنتج ثانوي (موضح في الشكل 2 على أنه ناقل المانحين). يخضع استنساخ التعبير المنتج لنوعين من الاختيار: مقاومة المضادات الحيوية والاختيار السلبي بواسطة بروتين ccdB السام. نتيجة لذلك ، يتم الحصول على مستويات عالية من الحيوانات المستنسخة الإيجابية (نموذجيًا أكثر من 99٪) بعد التحول إلى استنساخ قياسي أو إجهاد تعبير مثل DH5 a أو BL21 (DE3).

واحدة من المزايا الرئيسية لبرنامج تقنية GATEWAY Cloning هو أنه بمجرد أن تقوم بعمل استنساخ الدخول يمكن بسهولة استنساخ الجين محل الاهتمام في مجموعة متنوعة من نواقل الوجهة باستخدام رد فعل LR (انظر الشكل 3).

إذا كنت تريد معرفة المزيد عن تقنية GATEWAY Cloning انتقل إلى موقع Invitrogen.


محتويات

تحرير النسخ

يُطلق على إنتاج نسخة RNA من خيط DNA اسم النسخ ، ويتم إجراؤه بواسطة بوليميراز RNA ، الذي يضيف ريبونوكليوتيد واحدًا في كل مرة إلى خيط RNA متزايد وفقًا لقانون التكامل لقواعد النيوكليوتيدات. هذا الحمض النووي الريبي مكمل للقالب 3 ′ → 5 جديلة DNA ، [7] باستثناء أن الثايمينات (T) يتم استبدالها بـ uracils (U) في الحمض النووي الريبي.

في بدائيات النوى ، يتم إجراء النسخ بواسطة نوع واحد من بوليميراز الحمض النووي الريبي ، والذي يحتاج إلى ربط تسلسل DNA يسمى صندوق Pribnow بمساعدة بروتين عامل سيجما (عامل σ) لبدء النسخ. في حقيقيات النوى ، يتم إجراء النسخ في النواة بواسطة ثلاثة أنواع من بوليميرات الحمض النووي الريبي ، يحتاج كل منها إلى تسلسل DNA خاص يسمى المحفز ومجموعة من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي - عوامل النسخ - لبدء العملية (انظر تنظيم النسخ أدناه) . بوليميراز الحمض النووي الريبي هو المسؤول عن نسخ جينات الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي). RNA polymerase II (Pol II) ينسخ جميع جينات ترميز البروتين ولكن أيضًا بعض RNAs غير المشفر (على سبيل المثالأو snRNAs أو snoRNAs أو RNAs الطويلة غير المشفرة). يقوم RNA polymerase III بنسخ 5S rRNA ، ونقل جينات RNA (tRNA) ، وبعض RNAs الصغيرة غير المشفرة (على سبيل المثال، 7SK). ينتهي النسخ عندما يواجه البوليميراز تسلسلاً يسمى المنهي.

تحرير معالجة مرنا

بينما يؤدي نسخ جينات ترميز البروتين بدائية النواة إلى إنشاء مرسال RNA (mRNA) جاهز للترجمة إلى بروتين ، فإن نسخ الجينات حقيقية النواة يترك نسخة أولية من RNA (pre-RNA) ، والتي يجب أن تخضع أولاً لسلسلة من التعديلات لتصبح ناضجة الحمض النووي الريبي. تختلف الأنواع والخطوات المتضمنة في عمليات النضج بين preRNAs المشفرة وغير المشفرة بمعنى آخر. على الرغم من أن جزيئات preRNA لكل من mRNA و tRNA تخضع لعملية الربط ، فإن الخطوات والآليات المعنية مختلفة. [8] تم وصف معالجة الحمض النووي الريبي غير المشفر أدناه (نضوج الحمض النووي الريبي غير المحفور).

تشمل معالجة premRNA 5 ′ السد، وهي مجموعة من التفاعلات الأنزيمية التي تضيف 7-ميثيل جوانوزين (م 7 جم) إلى نهاية 5 لما قبل الرنا المرسال وبالتالي تحمي الحمض النووي الريبي من التدهور بواسطة نوكليازات خارجية. ثم يتم ربط غطاء m 7 G بواسطة مغاير مغاير معقد ملزم (CBC20 / CBC80) ، والذي يساعد في تصدير mRNA إلى السيتوبلازم ويحمي أيضًا الحمض النووي الريبي من التقطيع.

تعديل آخر هو 3 ′ الانقسام وعديد الأدينيل. تحدث في حالة وجود تسلسل إشارة polyadenylation (5′- AAUAAA-3 ′) في pre-mRNA ، والذي يكون عادةً بين تسلسل تشفير البروتين والمُنهي. يتم شق pre-mRNA أولاً ثم سلسلة من

تتم إضافة 200 أدينين (أ) لتكوين ذيل بولي (أ) ، والذي يحمي الحمض النووي الريبي من التدهور. يرتبط ذيل poly (A) ببروتينات ربط poly (A) متعددة (PABPs) ضرورية لتصدير mRNA وإعادة بدء الترجمة. في العملية العكسية للامتصاص ، يتم تقصير ذيول بولي (A) بواسطة نوكلياز خارجي CCR4-Not 3′-5 ، مما يؤدي غالبًا إلى تحلل النص الكامل.

تعديل مهم جدا لحقيقية النواة pre-mRNA هو الربط RNA. تتكون غالبية حقيقيات النوى pre-mRNAs من مقاطع متناوبة تسمى exons و introns. أثناء عملية التضفير ، يحفز المركب التحفيزي لبروتين الحمض النووي الريبي المعروف باسم spliceosome تفاعلين استرة ، والتي تزيل الإنترون وتحررها في شكل هيكل ، ثم تلصق exons المجاورة معًا. في بعض الحالات ، يمكن إزالة بعض الإنترونات أو الإكسونات أو الاحتفاظ بها في الرنا المرسال الناضج. هذا ما يسمى بالربط البديل يخلق سلسلة من النسخ المختلفة التي تنشأ من جين واحد. نظرًا لإمكانية ترجمة هذه النسخ إلى بروتينات مختلفة ، فإن التضفير يزيد من تعقيد التعبير الجيني حقيقي النواة وحجم بروتين النوع.

قد تكون المعالجة المكثفة للحمض النووي الريبي ميزة تطورية أتاحتها نواة حقيقيات النوى. في بدائيات النوى ، يحدث النسخ والترجمة معًا ، بينما في حقيقيات النوى ، يفصل الغشاء النووي العمليتين ، مما يتيح وقتًا لحدوث معالجة الحمض النووي الريبي.

تحرير نضج الحمض النووي الريبي غير المشفر

في معظم الكائنات الحية ، يتم نسخ الجينات غير المشفرة (ncRNA) على أنها سلائف تخضع لمزيد من المعالجة. في حالة الرنا الريباسي (الرنا الريباسي) ، غالبًا ما يتم نسخها على أنها ما قبل الرنا الريباسي تحتوي على واحد أو أكثر من الرنا الريباسي. يتم شق وتعديل الرنا الريباسي المسبق (2′-O-methylation وتشكيل pseudouridine) في مواقع محددة بواسطة ما يقرب من 150 نوعًا مختلفًا من أنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة المقيدة بالنواة ، والتي تسمى snoRNAs. ترتبط SnoRNAs بالبروتينات وتشكل snoRNPs. في حين أن جزء snoRNA الأساسي مع الحمض النووي الريبي المستهدف وبالتالي وضع التعديل في موقع دقيق ، فإن جزء البروتين يؤدي التفاعل التحفيزي. في حقيقيات النوى ، على وجه الخصوص snoRNP المسمى RNase ، يشق MRP الـ 45S pre-rRNA في الرنا الريباسي 28S و 5.8S و 18S. تشكل عوامل معالجة الرنا الريباسي والـ RNA مجاميع كبيرة تسمى النواة. [9]

في حالة نقل الحمض النووي الريبي (tRNA) ، على سبيل المثال ، تتم إزالة التسلسل 5 بواسطة RNase P ، [10] بينما تتم إزالة الطرف 3 بواسطة إنزيم tRNase Z [11] والذيل غير المصنوع من 3 CCA يضاف بواسطة nucleotidyl transferase. [12] في حالة الحمض النووي الريبي الصغير (ميرنا) ، يتم نسخ الجزيئات الجزيئية أولًا كنصوص أولية أو pri-miRNA بغطاء وذيل بولي-أ ومعالجتها إلى هياكل قصيرة ذات حلقة جذعية مكونة من 70 نيوكليوتيد تُعرف باسم pre-miRNA في نواة الخلية بواسطة إنزيمات دروشا وباشا. بعد تصديرها ، تتم معالجتها بعد ذلك لتنضج miRNAs في السيتوبلازم عن طريق التفاعل مع endonuclease Dicer ، والذي يبدأ أيضًا في تكوين مجمع الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) ، والذي يتكون من بروتين الأرجونوت.

حتى snRNAs و snoRNAs نفسها تخضع لسلسلة من التعديلات قبل أن تصبح جزءًا من مركب RNP الوظيفي. يتم ذلك إما في النيوكليوبلازم أو في الأجزاء المتخصصة التي تسمى أجسام كاجال. قواعدها ميثلة أو pseudouridinilated بواسطة مجموعة صغيرة Cajal محددة الجسم RNAs (scaRNAs) ، والتي تشبه هيكليا snoRNAs.

تحرير تصدير RNA

في حقيقيات النوى ، يجب تصدير الحمض النووي الريبي الأكثر نضجًا إلى السيتوبلازم من النواة. بينما تعمل بعض RNAs في النواة ، يتم نقل العديد من RNAs عبر المسام النووية إلى العصارة الخلوية. [13] يتطلب تصدير الحمض النووي الريبي الارتباط ببروتينات معينة تعرف باسم exportins. جزيئات التصدير المحددة هي المسؤولة عن تصدير نوع معين من الحمض النووي الريبي. يتطلب نقل mRNA أيضًا الارتباط الصحيح مع Exon Junction Complex (EJC) ، مما يضمن اكتمال المعالجة الصحيحة لـ mRNA قبل التصدير. في بعض الحالات ، يتم نقل الحمض النووي الريبي أيضًا إلى جزء معين من السيتوبلازم ، مثل المشبك ، ثم يتم سحبها بواسطة البروتينات الحركية التي ترتبط من خلال البروتينات الرابطة بتسلسلات محددة (تسمى "الرموز البريدية") على الحمض النووي الريبي. [14]

تحرير الترجمة

بالنسبة لبعض الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي غير المشفر) ، يكون الحمض النووي الريبي الناضج هو المنتج الجيني النهائي. [15] في حالة الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) ، يعد الحمض النووي الريبي (RNA) ناقلًا لتشفير المعلومات لتخليق بروتين واحد أو أكثر. الرنا المرسال الذي يحمل تسلسل بروتين واحد (شائع في حقيقيات النوى) هو أحادي الإلكترون بينما يحمل الرنا المرسال العديد من متواليات البروتين (شائع في بدائيات النوى) يُعرف باسم polycistronic.

يتكون كل مرنا من ثلاثة أجزاء: منطقة 5 غير مترجمة (5′UTR) ، منطقة ترميز بروتين أو إطار قراءة مفتوح (ORF) ، ومنطقة 3 غير مترجمة (3′UTR). تحمل منطقة الترميز معلومات عن تخليق البروتين المشفر بواسطة الشفرة الجينية لتشكيل ثلاثة توائم. يُطلق على كل مجموعة ثلاثية من النيوكليوتيدات في منطقة الترميز اسم كودون ويتوافق مع موقع ربط مكمل لثلاثي أضداد الكودون في نقل الحمض النووي الريبي. تحمل الحمض النووي الريبي الذي يحمل نفس تسلسل مضاد الكودون دائمًا نوعًا متطابقًا من الأحماض الأمينية. ثم يتم ربط الأحماض الأمينية ببعضها البعض بواسطة الريبوسوم وفقًا لترتيب ثلاثة توائم في منطقة الترميز. يساعد الريبوسوم على نقل الحمض النووي الريبي (RNA) للارتباط بـ RNA المرسال ويأخذ الحمض الأميني من كل RNA الناقل ويصنع منه بروتينًا بدون بنية. [16] [17] يُترجم كل جزيء mRNA إلى العديد من جزيئات البروتين في المتوسط

تحدث الترجمة في بدائيات النوى عمومًا عند نقطة النسخ (النسخ المشترك) ، غالبًا باستخدام مرسال RNA لا يزال في طور الإنشاء. يمكن أن تحدث الترجمة في حقيقيات النوى في مناطق مختلفة من الخلية اعتمادًا على المكان الذي من المفترض أن يكون فيه البروتين المكتوب. المواقع الرئيسية هي السيتوبلازم للبروتينات السيتوبلازمية القابلة للذوبان وغشاء الشبكة الإندوبلازمية للبروتينات التي يتم تصديرها من الخلية أو إدخالها في غشاء الخلية. يتم التعرف على البروتينات التي من المفترض أن يتم التعبير عنها في الشبكة الإندوبلازمية جزئيًا خلال عملية الترجمة. يخضع هذا لجسيم التعرف على الإشارة - وهو بروتين يرتبط بالريبوسوم ويوجهه إلى الشبكة الإندوبلازمية عندما يجد ببتيد إشارة على سلسلة الأحماض الأمينية النامية (الوليدة). [20]

طي التحرير

يوجد كل بروتين على شكل بولي ببتيد غير مطوي أو ملف عشوائي عند ترجمته من سلسلة من الرنا المرسال إلى سلسلة خطية من الأحماض الأمينية. يفتقر هذا البولي ببتيد إلى أي بنية ثلاثية الأبعاد متطورة (الجانب الأيسر من الشكل المجاور). ثم يطوي البولي ببتيد في هيكله ثلاثي الأبعاد المميز والوظيفي من ملف عشوائي. [21] تتفاعل الأحماض الأمينية مع بعضها البعض لإنتاج هيكل ثلاثي الأبعاد واضح المعالم ، وهو البروتين المطوي (الجانب الأيمن من الشكل) المعروف بالحالة الأصلية. يتم تحديد البنية ثلاثية الأبعاد الناتجة عن طريق تسلسل الأحماض الأمينية (عقيدة Anfinsen). [22]

البنية ثلاثية الأبعاد الصحيحة ضرورية للوظيفة ، على الرغم من أن بعض أجزاء البروتينات الوظيفية قد تظل مكشوفة. [23] يؤدي الفشل في الانثناء إلى الشكل المقصود عادةً إلى إنتاج بروتينات غير نشطة بخصائص مختلفة بما في ذلك البريونات السامة. يُعتقد أن العديد من الأمراض التنكسية العصبية وغيرها من الأمراض تنتج عن تراكم خطأ في طي الطي البروتينات. [24] العديد من الحساسية ناتجة عن طي البروتينات ، لأن الجهاز المناعي لا ينتج أجسامًا مضادة لهياكل بروتينية معينة. [25]

تساعد الإنزيمات التي تسمى المرافقون البروتين المتشكل حديثًا على تحقيق (طي) البنية ثلاثية الأبعاد التي يحتاجها ليعمل. [26] وبالمثل ، تساعد مرافقات الرنا الرنا في الوصول إلى أشكالها الوظيفية. [27] مساعدة طي البروتين هو أحد الأدوار الرئيسية للشبكة الإندوبلازمية في حقيقيات النوى.

تحرير النقل

يجب نقل البروتينات الإفرازية لحقيقيات النوى أو بدائيات النوى لدخول المسار الإفرازي. يتم توجيه البروتينات التي تم تصنيعها حديثًا إلى قناة نقل الحركة SecYEG بدائية النواة Sec61 أو بدائية النواة عن طريق الببتيدات الإشارة. كفاءة إفراز البروتين في حقيقيات النوى تعتمد بشكل كبير على إشارة الببتيد الذي تم استخدامه. [28]

تحرير نقل البروتين

يتم توجيه العديد من البروتينات إلى أجزاء أخرى من الخلية غير العصارة الخلوية ومجموعة واسعة من تسلسلات الإشارات أو (ببتيدات الإشارة) تستخدم لتوجيه البروتينات إلى حيث يفترض أن تكون. في بدائيات النوى ، عادة ما تكون هذه عملية بسيطة بسبب التقسيم المحدود للخلية. ومع ذلك ، يوجد في حقيقيات النوى مجموعة كبيرة ومتنوعة من عمليات الاستهداف المختلفة لضمان وصول البروتين إلى العضيات الصحيحة.

لا تبقى جميع البروتينات داخل الخلية ويتم تصدير العديد منها ، على سبيل المثال ، الإنزيمات الهاضمة والهرمونات وبروتينات المصفوفة خارج الخلية. في حقيقيات النوى ، تم تطوير مسار التصدير جيدًا والآلية الرئيسية لتصدير هذه البروتينات هي الانتقال إلى الشبكة الإندوبلازمية ، يليها النقل عبر جهاز جولجي. [29] [30]

يشير تنظيم التعبير الجيني إلى التحكم في كمية وتوقيت ظهور المنتج الوظيفي للجين. يعد التحكم في التعبير أمرًا حيويًا للسماح للخلية بإنتاج المنتجات الجينية التي تحتاجها عندما تحتاجها بدورها ، وهذا يمنح الخلايا المرونة للتكيف مع بيئة متغيرة ، وإشارات خارجية ، وتلف الخلية ، ومحفزات أخرى. بشكل أكثر عمومية ، يمنح تنظيم الجينات التحكم في الخلية في جميع الهياكل والوظائف ، وهو أساس التمايز الخلوي والتشكل والتنوع والقدرة على التكيف لأي كائن حي.

تُستخدم العديد من المصطلحات لوصف أنواع الجينات اعتمادًا على كيفية تنظيمها ، وتتضمن ما يلي:

  • أ الجين التأسيسي هو جين يتم نسخه باستمرار على عكس الجين الاختياري ، والذي يتم نسخه فقط عند الحاجة.
  • أ الجين التدبير المنزلي هو جين مطلوب للحفاظ على الوظيفة الخلوية الأساسية وبالتالي يتم التعبير عنه عادةً في جميع أنواع الخلايا في الكائن الحي. تشمل الأمثلة الأكتين و GAPDH و يوبيكويتين. يتم نسخ بعض جينات التدبير المنزلي بمعدل ثابت نسبيًا ويمكن استخدام هذه الجينات كنقطة مرجعية في التجارب لقياس معدلات التعبير عن الجينات الأخرى.
  • أ الجين الاختياري هو جين يتم نسخه عند الحاجة فقط على عكس الجين التأسيسي.
  • ان الجين المحرض هو جين يكون تعبيره إما مستجيبًا للتغير البيئي أو يعتمد على الموضع في دورة الخلية.

يمكن تعديل أي خطوة للتعبير الجيني ، من خطوة نسخ DNA-RNA إلى التعديل اللاحق للترجمة للبروتين. يساهم استقرار منتج الجين النهائي ، سواء كان RNA أو بروتينًا ، في مستوى تعبير الجين - ينتج عن المنتج غير المستقر مستوى تعبير منخفض. بشكل عام ، يتم تنظيم التعبير الجيني من خلال التغييرات [31] في عدد ونوع التفاعلات بين الجزيئات [32] التي تؤثر بشكل جماعي على نسخ الحمض النووي [33] وترجمة الحمض النووي الريبي. [34]

بعض الأمثلة البسيطة على أهمية التعبير الجيني هي:

  • السيطرة على تعبير الأنسولين بحيث يعطي إشارة لتنظيم نسبة الجلوكوز في الدم. في إناث الثدييات لمنع "جرعة زائدة" من الجينات التي تحتوي عليها. تتحكم مستويات التعبير في التقدم من خلال دورة الخلية حقيقية النواة.

تعديل تنظيم النسخ

يمكن تقسيم تنظيم النسخ إلى ثلاثة طرق رئيسية للتأثير الجيني (التفاعل المباشر لعامل التحكم مع الجين) ، تفاعل التعديل لعامل التحكم مع آلية النسخ والتفاعل الجيني (التغييرات غير المتسلسلة في بنية الحمض النووي التي تؤثر على النسخ) .

التفاعل المباشر مع الحمض النووي هو أبسط طريقة وأكثرها مباشرة التي يغير بها البروتين مستويات النسخ. غالبًا ما تحتوي الجينات على العديد من مواقع ربط البروتين حول منطقة الترميز مع وظيفة محددة لتنظيم النسخ. هناك العديد من فئات مواقع الربط التنظيمي للحمض النووي المعروفة باسم المعززات والعوازل وكاتم الصوت. تتنوع آليات تنظيم النسخ بشكل كبير ، من حجب مواقع الربط الرئيسية على الحمض النووي لبوليميراز الحمض النووي الريبي إلى العمل كمنشط وتعزيز النسخ من خلال مساعدة ربط بوليميراز الحمض النووي الريبي.

يتم تعديل نشاط عوامل النسخ بشكل أكبر عن طريق الإشارات داخل الخلايا التي تسبب تعديل البروتين بعد الترجمة بما في ذلك الفسفرة أو الأسيتيل أو الغليكوزيلات. تؤثر هذه التغييرات على قدرة عامل النسخ على الارتباط ، بشكل مباشر أو غير مباشر ، بالحمض النووي المعزز ، لتجنيد بوليميريز الحمض النووي الريبي ، أو تفضيل استطالة جزيء الحمض النووي الريبي المركب حديثًا.

يسمح الغشاء النووي في حقيقيات النوى بمزيد من التنظيم لعوامل النسخ من خلال مدة وجودها في النواة ، والتي يتم تنظيمها من خلال التغييرات القابلة للعكس في هيكلها وعن طريق ربط البروتينات الأخرى. [35] قد تسبب المحفزات البيئية أو إشارات الغدد الصماء [36] تعديلًا في البروتينات المنظمة [37] مما يؤدي إلى سلسلة من الإشارات داخل الخلايا ، [38] والتي تؤدي إلى تنظيم التعبير الجيني.

في الآونة الأخيرة ، أصبح من الواضح أن هناك تأثيرًا كبيرًا للتأثيرات المحددة غير المرتبطة بتسلسل الحمض النووي على النسخ. يشار إلى هذه التأثيرات على أنها وراثية جينية وتتضمن البنية عالية الترتيب للحمض النووي ، وبروتينات ربط الحمض النووي المحددة غير المتسلسلة والتعديل الكيميائي للحمض النووي. بشكل عام ، تغير التأثيرات اللاجينية إمكانية وصول الحمض النووي إلى البروتينات وبالتالي تعدل النسخ.

في حقيقيات النوى ، ينظم هيكل الكروماتين ، الذي يتحكم فيه كود هيستون ، الوصول إلى الحمض النووي مع تأثيرات كبيرة على التعبير الجيني في مناطق euchromatin و heterochromatin.

المعززات وعوامل النسخ ومركب الوسيط وحلقات الحمض النووي في نسخ الثدييات تحرير

يتم تنظيم التعبير الجيني في الثدييات من خلال العديد من العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة ، بما في ذلك المحفزات الأساسية والعناصر القريبة من المحفز التي تقع بالقرب من مواقع بدء النسخ للجينات ، في اتجاه المنبع على الحمض النووي (نحو المنطقة 5 'من حبلا الإحساس). يتم تحديد الوحدات التنظيمية المهمة الأخرى لرابطة الدول المستقلة في مناطق الحمض النووي البعيدة عن مواقع بدء النسخ. وتشمل هذه المعززات وكواتم الصوت والعوازل وعناصر الربط. [39] من بين هذه المجموعة من العناصر ، تلعب المحسنات وعوامل النسخ المرتبطة بها دورًا رائدًا في تنظيم التعبير الجيني. [40]

المعززات هي مناطق الجينوم التي تعتبر عناصر تنظيم الجينات الرئيسية. تتحكم المعززات في برامج التعبير الجيني الخاصة بنوع الخلية ، غالبًا عن طريق التنقل عبر مسافات طويلة لتقترب ماديًا من محفزات الجينات المستهدفة. [41] معززات متعددة ، كل منها في الغالب عند عشرات أو مئات الآلاف من النيوكليوتيدات البعيدة عن الجينات المستهدفة ، تلتف إلى محفزات الجينات المستهدفة وتنسق مع بعضها البعض للتحكم في التعبير عن الجين المستهدف المشترك. [41]

يُظهر الرسم التوضيحي التخطيطي الموجود على اليسار مُحسِّنًا يلتف حوله ليقترب من محفز الجين المستهدف. يتم تثبيت الحلقة بواسطة دايمر لبروتين موصل (على سبيل المثال dimer من CTCF أو YY1) ، مع تثبيت أحد أعضاء الثنائى على شكل الربط الخاص به على المحسن والعضو الآخر مثبت على شكل الربط الخاص به على المحفز (يمثله متعرج أحمر في الرسم التوضيحي). [42] العديد من عوامل النسخ الخاصة بوظيفة الخلية (هناك حوالي 1600 عامل نسخ في خلية بشرية [43]) ترتبط بشكل عام بزخارف معينة على مُحسِّن [44] ومجموعة صغيرة من عوامل النسخ المرتبطة بالمُحسِّن ، عند التقريب إلى محفز بواسطة حلقة DNA ، يتحكم في مستوى نسخ الجين المستهدف. الوسيط (مركب يتكون عادة من حوالي 26 بروتينًا في بنية متفاعلة) يرسل إشارات تنظيمية من عوامل النسخ المرتبطة بالحمض النووي المحسن مباشرة إلى إنزيم RNA polymerase II (pol II) المرتبط بالمحفز. [45]

تُنسخ المُحسّنات ، عندما تكون نشطة ، بشكل عام من كلا خيوط الحمض النووي مع بوليميرات RNA التي تعمل في اتجاهين مختلفين ، مما ينتج عنه جزيئين من eRNA كما هو موضح في الشكل. [46] قد يرتبط المُحسِّن غير النشط بعامل نسخ غير نشط. قد تؤدي الفسفرة لعامل النسخ إلى تنشيطه وقد يؤدي عامل النسخ النشط هذا إلى تنشيط المُحسِّن المرتبط به (انظر نجمة حمراء صغيرة تمثل فسفرة عامل النسخ المرتبط بالمُحسِّن في الرسم التوضيحي). [٤٧] يبدأ المُحسِّن المنشط في نسخ الحمض النووي الريبي الخاص به قبل تنشيط نسخ الحمض النووي الريبي المرسال من الجين المستهدف. [48]

مثيلة الحمض النووي ونزع الميثيل في تنظيم النسخ تحرير

مثيلة الحمض النووي هي آلية واسعة الانتشار للتأثير اللاجيني على التعبير الجيني ويمكن رؤيتها في البكتيريا وحقيقيات النوى ولها أدوار في إسكات النسخ الوراثي وتنظيم النسخ. تحدث المثيلة غالبًا على السيتوزين (انظر الشكل). تحدث مثيلة السيتوزين بشكل أساسي في تسلسل ثنائي النوكليوتيد حيث يتبع السيتوزين الجوانين ، وهو موقع CpG. يبلغ عدد مواقع CpG في الجينوم البشري حوالي 28 مليون. [49] اعتمادًا على نوع الخلية ، تحتوي حوالي 70٪ من مواقع CpG على سيتوزين ميثيل. [50]

يلعب ميثيل السيتوزين في الحمض النووي دورًا رئيسيًا في تنظيم التعبير الجيني. مثيلة CpGs في منطقة محفز للجين عادة ما تكبح نسخ الجين [51] بينما تزيد مثيلة CpGs في جسم الجين من التعبير. [٥٢] تلعب إنزيمات TET دورًا مركزيًا في نزع ميثيل السيتوزينات الميثيلية. يؤدي نزع الميثيل من CpGs في محفز الجينات بواسطة نشاط إنزيم TET إلى زيادة نسخ الجين. [53]

تنظيم النسخ في التعلم والذاكرة تحرير

في الجرذ ، تكييف الخوف السياقي (CFC) هو تجربة تعليمية مؤلمة. يمكن أن تؤدي حلقة واحدة فقط من CFC إلى ذاكرة خائفة تدوم مدى الحياة. [54] بعد حدوث نوبة من مركبات الكلوروفلوروكربون ، يتم تغيير مثيلة السيتوزين في مناطق المحفز لحوالي 9.17٪ من جميع الجينات في الحمض النووي لعصب قرن آمون للفئران. [55] الحصين هو المكان الذي يتم فيه تخزين الذكريات الجديدة في البداية. بعد CFC ، زاد النسخ من حوالي 500 جين (غالبًا بسبب إزالة الميثيل من مواقع CpG في منطقة المروج) ونقص النسخ من حوالي 1000 جين (غالبًا بسبب تكوين 5-methylcytosine حديثًا في مواقع CpG في منطقة المروج). يبدو أن نمط الجينات المستحثة والمكبوتة داخل الخلايا العصبية يوفر أساسًا جزيئيًا لتشكيل أول ذاكرة عابرة لهذا الحدث التدريبي في قرن آمون في دماغ الفئران. [55]

على وجه الخصوص ، جين العامل العصبي المشتق من الدماغ (BDNF) يُعرف باسم "جين التعلم". [56] بعد CFC كان هناك تنظيم BDNF التعبير الجيني ، المرتبط بانخفاض مثيلة CpG لبعض المحفزات الداخلية للجين ، وكان هذا مرتبطًا بالتعلم. [56]

تنظيم النسخ في السرطان تحرير

تحتوي غالبية المحفزات الجينية على جزيرة CpG بها العديد من مواقع CpG. [57] عندما يتم ميثلة العديد من مواقع CpG المحفز للجين ، يصبح الجين صامتًا. [58] سرطانات القولون والمستقيم عادة ما يكون لها 3 إلى 6 طفرات للسائقين و 33 إلى 66 طفرات متنقلة أو راكب. [59] ومع ذلك ، قد يكون إسكات النسخ أكثر أهمية من الطفرة في التسبب في تطور السرطان. على سبيل المثال ، في سرطانات القولون والمستقيم ، يتم إسكات حوالي 600 إلى 800 جين نسبيًا بواسطة مثيلة جزيرة CpG (انظر تنظيم النسخ في السرطان). يمكن أن يحدث القمع النسخي في السرطان أيضًا عن طريق آليات الوراثة اللاجينية الأخرى ، مثل التعبير المتغير عن الرنا الميكروي. [60] في سرطان الثدي ، قد يحدث كبت نسخ BRCA1 بشكل متكرر عن طريق microRNA-182 مفرط التعبير عنه عن طريق فرط ميثيل محفز BRCA1 (انظر التعبير المنخفض عن BRCA1 في سرطان الثدي والمبيض).

تعديل تنظيم ما بعد النسخ

في حقيقيات النوى ، حيث يلزم تصدير الحمض النووي الريبي قبل أن تصبح الترجمة ممكنة ، يُعتقد أن التصدير النووي يوفر تحكمًا إضافيًا في التعبير الجيني. تتم جميع عمليات النقل داخل وخارج النواة عبر المسام النووية ويتم التحكم في النقل من خلال مجموعة واسعة من البروتينات المستوردة والمصدرة.

لا يمكن التعبير عن ترميز الجين لبروتين ما إلا إذا بقي الرنا المرسال الذي يحمل الشفرة على قيد الحياة لفترة كافية ليتم ترجمتها. في خلية نموذجية ، يكون جزيء الحمض النووي الريبي مستقرًا فقط إذا كان محميًا بشكل خاص من التدهور. يعتبر تدهور الحمض النووي الريبي (RNA) له أهمية خاصة في تنظيم التعبير في الخلايا حقيقية النواة حيث يتعين على mRNA السفر لمسافات كبيرة قبل أن تتم ترجمته. في حقيقيات النوى ، يتم تثبيت الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق بعض التعديلات اللاحقة للنسخ ، ولا سيما غطاء 5 ′ والذيل متعدد الأدينيلات.

يستخدم التحلل المتعمد للـ mRNA ليس فقط كآلية دفاع من الحمض النووي الريبي الأجنبي (عادةً من الفيروسات) ولكن أيضًا كطريق للـ mRNA زعزعة الاستقرار. إذا كان جزيء mRNA يحتوي على تسلسل مكمل لـ RNA صغير متداخل ، فسيتم استهدافه للتدمير عبر مسار تداخل RNA.

ثلاث مناطق رئيسية غير مترجمة و microRNAs Edit

غالبًا ما تحتوي ثلاث مناطق رئيسية غير مترجمة (3′UTRs) من الرنا المرسال (mRNAs) على متواليات تنظيمية تؤثر بعد النسخ على التعبير الجيني. غالبًا ما تحتوي هذه 3′-UTR على مواقع ربط لـ microRNAs (miRNAs) وكذلك للبروتينات التنظيمية. من خلال الارتباط بمواقع محددة داخل 3′-UTR ، يمكن أن تقلل miRNAs من التعبير الجيني للعديد من mRNAs إما عن طريق تثبيط الترجمة أو التسبب مباشرة في تدهور النسخة. قد يحتوي 3′-UTR أيضًا على مناطق كاتم للصوت تربط بروتينات الكابح التي تمنع التعبير عن mRNA.

غالبًا ما يحتوي 3′-UTR على عناصر استجابة microRNA (MREs). MREs هي سلاسل ترتبط بها miRNAs. هذه هي الزخارف السائدة في 3′-UTRs. من بين جميع الأشكال التنظيمية داخل 3′-UTRs (على سبيل المثال ، بما في ذلك مناطق كاتم الصوت) ، تشكل MREs حوالي نصف الأشكال.

اعتبارًا من عام 2014 ، أدرج موقع miRBase الإلكتروني ، [61] وهو أرشيف لتسلسلات miRNA وشروحه ، 28645 إدخالًا في 233 نوعًا بيولوجيًا. من بين هؤلاء ، كانت 1،881 ميلًا في مواقع ميرنا البشرية المشروحة. تم توقع أن تحتوي miRNAs في المتوسط ​​على حوالي أربعمائة mRNAs مستهدفة (تؤثر على التعبير عن عدة مئات من الجينات). [62] فريدمان وآخرون. [62] قدر أن & gt45000 مواقع مستهدفة من mRNA داخل mRNA 3′UTRs البشرية محفوظة فوق مستويات الخلفية ، و GT60٪ من جينات ترميز البروتين البشرية كانت تحت ضغط انتقائي للحفاظ على الاقتران مع miRNAs.

تظهر التجارب المباشرة أن ميرنا واحد يمكن أن يقلل من استقرار مئات من الرنا المرسال الفريدة. [63] أظهرت تجارب أخرى أن ميرنا واحد قد يثبط إنتاج مئات البروتينات ، لكن هذا القمع غالبًا ما يكون خفيفًا نسبيًا (أقل من ضعفين). [64] [65]

يبدو أن تأثيرات خلل تنظيم الحمض النووي الريبي في التعبير الجيني مهمة في السرطان. [66] على سبيل المثال ، في سرطانات الجهاز الهضمي ، تم تحديد تسعة جزيئات من الحمض النووي الريبوزي على أنها متغيرة جينيًا وفعالة في تنظيم إنزيمات إصلاح الحمض النووي. [67]

يبدو أن تأثيرات خلل تنظيم الحمض النووي الريبي في التعبير الجيني مهمة أيضًا في الاضطرابات العصبية والنفسية ، مثل الفصام والاضطراب ثنائي القطب والاكتئاب الشديد ومرض باركنسون ومرض الزهايمر واضطرابات طيف التوحد. [68] [69]

تعديل التنظيم متعدية

التنظيم المباشر للترجمة أقل انتشارًا من التحكم في النسخ أو استقرار الرنا المرسال ولكن يتم استخدامه أحيانًا. يُعد تثبيط ترجمة البروتين هدفًا رئيسيًا للسموم والمضادات الحيوية ، لذلك يمكنها قتل الخلية عن طريق تجاوز التحكم الطبيعي في التعبير الجيني. تشمل مثبطات تخليق البروتين المضاد الحيوي نيومايسين والريسين التوكسين.

تعديلات ما بعد الترجمة تحرير

التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) هي تعديلات تساهمية للبروتينات. مثل تضفير الحمض النووي الريبي ، فهي تساعد على تنويع البروتين بشكل كبير. عادة ما يتم تحفيز هذه التعديلات بواسطة الإنزيمات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن غالبًا عكس عمليات مثل الإضافات التساهمية إلى مخلفات السلسلة الجانبية للأحماض الأمينية بواسطة إنزيمات أخرى. ومع ذلك ، فإن بعضها ، مثل الانقسام البروتيني للعمود الفقري للبروتين ، لا رجوع فيه. [70]

تلعب PTMs العديد من الأدوار المهمة في الخلية. [71] على سبيل المثال ، تشارك الفسفرة بشكل أساسي في تنشيط وإلغاء تنشيط البروتينات وفي مسارات الإشارات. [72] تشارك PTM في تنظيم النسخ: وظيفة مهمة للأستلة والميثلة هي تعديل ذيل الهيستون ، والذي يغير كيفية الوصول إلى الحمض النووي للنسخ. [70] يمكن رؤيتها أيضًا في جهاز المناعة ، حيث يلعب الارتباط بالجليكوزيل دورًا رئيسيًا. [73] نوع واحد من PTM يمكن أن يبدأ نوعًا آخر من PTM ، كما يمكن رؤيته في كيفية انتشار البروتينات في كل مكان للتحلل من خلال التحلل البروتيني. [70] يعتبر تحلل البروتين ، بخلاف المشاركة في تكسير البروتينات ، مهمًا أيضًا في تنشيطها وإلغاء تنشيطها ، وفي تنظيم العمليات البيولوجية مثل نسخ الحمض النووي وموت الخلايا. [74]

يعد قياس التعبير الجيني جزءًا مهمًا من العديد من علوم الحياة ، حيث يمكن أن توفر القدرة على تحديد المستوى الذي يتم فيه التعبير عن جين معين داخل خلية أو نسيج أو كائن حي الكثير من المعلومات القيمة. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي قياس التعبير الجيني إلى:

  • التعرف على العدوى الفيروسية للخلية (التعبير البروتيني الفيروسي).
  • تحديد قابلية الفرد للإصابة بالسرطان (التعبير عن الجين الورمي).
  • اكتشف ما إذا كانت البكتيريا مقاومة للبنسلين (تعبير بيتا لاكتاماز).

وبالمثل ، يعد تحليل موقع تعبير البروتين أداة قوية ، ويمكن القيام بذلك على نطاق عضوي أو خلوي. يعتبر التحقيق في التوطين مهمًا بشكل خاص لدراسة التطور في الكائنات متعددة الخلايا وكمؤشر على وظيفة البروتين في الخلايا المفردة. من الناحية المثالية ، يتم قياس التعبير عن طريق الكشف عن منتج الجين النهائي (بالنسبة للعديد من الجينات ، هذا هو البروتين) ومع ذلك ، غالبًا ما يكون من الأسهل اكتشاف أحد السلائف ، عادةً mRNA واستنتاج مستويات التعبير الجيني من هذه القياسات.

تحرير مرنا الكمي

يمكن قياس مستويات الرنا المرسال كميًا عن طريق النشاف الشمالي ، والذي يوفر معلومات عن الحجم والتسلسل حول جزيئات الرنا المرسال. يتم فصل عينة من الحمض النووي الريبي على هلام الاغاروز وتهجينها إلى مسبار الحمض النووي الريبي المسمى إشعاعيًا والذي يكمل التسلسل المستهدف. ثم يتم الكشف عن الحمض النووي الريبي ذي العلامات الإشعاعية بواسطة جهاز تصوير شعاعي. نظرًا لأن استخدام الكواشف المشعة يجعل الإجراء يستغرق وقتًا طويلاً ويحتمل أن يكون خطيرًا ، فقد تم تطوير طرق بديلة للوسم والكشف ، مثل كيماويات الديجوكسيجينين والبيوتين. تتمثل العيوب المتصورة في النشاف الشمالي في الحاجة إلى كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي وأن القياس الكمي قد لا يكون دقيقًا تمامًا ، لأنه يتضمن قياس قوة النطاق في صورة هلام. من ناحية أخرى ، تسمح معلومات حجم mRNA الإضافية من اللطخة الشمالية بالتمييز بين النصوص المقسمة بالتناوب.

نهج آخر لقياس وفرة mRNA هو RT-qPCR. في هذه التقنية ، يتبع النسخ العكسي PCR الكمي. يولد النسخ العكسي أولاً قالب DNA من mRNA يسمى هذا القالب أحادي الجديلة cDNA. يتم بعد ذلك تضخيم قالب (كدنا) في الخطوة الكمية ، والتي خلالها يتغير التألق المنبعث من تحقيقات التهجين المسمى أو الأصباغ المقحمة مع تقدم عملية تضخيم الحمض النووي. باستخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه بعناية ، يمكن لـ qPCR إنتاج قياس مطلق لعدد نسخ mRNA الأصلي ، عادةً في وحدات من النسخ لكل نانوليتر من الأنسجة المتجانسة أو النسخ لكل خلية. يعتبر qPCR حساسًا للغاية (من الممكن نظريًا اكتشاف جزيء mRNA واحد) ، ولكن يمكن أن يكون مكلفًا اعتمادًا على نوع المراسل المستخدم المسمى تحقيقات oligonucleotide المسمى الفلوريسنت أكثر تكلفة من الأصباغ الفلورية غير المحددة المقسمة.

لتوصيف التعبير ، أو تحليل الإنتاجية العالية للعديد من الجينات داخل عينة ، يمكن إجراء PCR الكمي لمئات الجينات في وقت واحد في حالة المصفوفات منخفضة الكثافة. النهج الثاني هو ميكروأري التهجين. قد تحتوي مجموعة أو "شريحة" واحدة على مجسات لتحديد مستويات النسخ لكل جين معروف في جينوم كائن أو أكثر. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام تقنيات "قائمة على العلامات" مثل التحليل التسلسلي للتعبير الجيني (SAGE) و RNA-Seq ، والتي يمكن أن توفر مقياسًا نسبيًا للتركيز الخلوي لمختلف الرنا المرسال. ميزة الأساليب القائمة على العلامات هي "البنية المفتوحة" ، مما يسمح بالقياس الدقيق لأي نص ، بتسلسل معروف أو غير معروف. تسلسل الجيل التالي (NGS) مثل RNA-Seq هو نهج آخر ينتج كميات هائلة من بيانات التسلسل التي يمكن مطابقتها مع الجينوم المرجعي. على الرغم من أن NGS تستغرق وقتًا طويلاً نسبيًا ومكلفة وكثيفة الموارد ، إلا أنها يمكن أن تحدد تعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات ومتغيرات لصق والجينات الجديدة ، ويمكن أيضًا استخدامها لتوصيف التعبير في الكائنات التي لا يتوفر لها سوى القليل من معلومات التسلسل أو لا تتوفر معلومات متسلسلة على الإطلاق. .

ملفات تعريف RNA في Wikipedia Edit

تم العثور على ملفات تعريف مثل هذه لجميع البروتينات المدرجة في ويكيبيديا تقريبًا. تم إنشاؤها من قبل منظمات مثل معهد علم الجينوم التابع لمؤسسة أبحاث نوفارتيس والمعهد الأوروبي للمعلومات الحيوية. يمكن العثور على معلومات إضافية من خلال البحث في قواعد البيانات الخاصة بهم (للحصول على مثال لناقل GLUT4 المصور هنا ، انظر الاقتباس). [75] تشير هذه الملامح إلى مستوى تعبير الحمض النووي (وبالتالي إنتاج الحمض النووي الريبي) لبروتين معين في نسيج معين ، ويتم ترميزها بالألوان وفقًا لذلك في الصور الموجودة في صندوق البروتين على الجانب الأيمن من كل صفحة من صفحات ويكيبيديا.

تحرير كمية البروتين

بالنسبة لبروتينات ترميز الجينات ، يمكن تقييم مستوى التعبير بشكل مباشر من خلال عدد من الطرق مع بعض المقارنات الواضحة لتقنيات القياس الكمي لمركب الرنا المرسال.

واحدة من أكثر الطرق شيوعًا هي إجراء لطخة غربية ضد بروتين الفائدة. [76] هذا يعطي معلومات عن حجم البروتين بالإضافة إلى هويته. يتم فصل عينة (غالبًا محللة خلوية) على هلام بولي أكريلاميد ، ونقلها إلى غشاء ثم فحصها بجسم مضاد للبروتين محل الاهتمام. يمكن أن يكون الجسم المضاد إما مترافقًا مع حامل الفلور أو بيروكسيداز الفجل للتصوير و / أو القياس الكمي. الطبيعة القائمة على الهلام لهذا الاختبار تجعل القياس الكمي أقل دقة ، ولكن له ميزة القدرة على تحديد التعديلات اللاحقة على البروتين ، على سبيل المثال تحلل البروتين أو انتشاره ، من التغيرات في الحجم.

تحرير ارتباط بروتين مرنا

يسمح التحديد الكمي للبروتين و mRNA بوجود ارتباط بين المستويين. إن السؤال عن مدى ارتباط مستويات البروتين بمستويات النسخ المقابلة لها هو موضع نقاش كبير ويعتمد على عوامل متعددة. يمكن أن يؤثر التنظيم في كل خطوة من خطوات التعبير الجيني على الارتباط ، كما هو موضح لتنظيم الترجمة [19] أو استقرار البروتين. [77] يمكن لعوامل ما بعد الترجمة ، مثل نقل البروتين في الخلايا عالية القطبية ، [78] أن تؤثر أيضًا على الارتباط المقاس لبروتين الرنا المرسال.

تحرير الترجمة

لا يقتصر تحليل التعبير على التحديد الكمي ويمكن أيضًا تحديد التوطين. يمكن الكشف عن الرنا المرسال باستخدام خيط مرنا مكمل موسوم بشكل مناسب ويمكن الكشف عن البروتين عن طريق الأجسام المضادة الموصوفة. ثم يتم ملاحظة العينة المجسدة عن طريق الفحص المجهري لتحديد مكان mRNA أو البروتين.

من خلال استبدال الجين بنسخة جديدة مدمجة في بروتين فلوري أخضر (أو ما شابه) ، يمكن قياس التعبير بشكل مباشر في الخلايا الحية. يتم ذلك عن طريق التصوير باستخدام مجهر مضان. من الصعب جدًا استنساخ بروتين مدمج في GFP في موقعه الأصلي في الجينوم دون التأثير على مستويات التعبير ، لذلك لا يمكن استخدام هذه الطريقة في كثير من الأحيان لقياس التعبير الجيني الداخلي. ومع ذلك ، فإنه يستخدم على نطاق واسع لقياس التعبير عن الجين الذي يتم إدخاله بشكل مصطنع في الخلية ، على سبيل المثال عن طريق ناقل التعبير. من المهم أن نلاحظ أنه من خلال دمج البروتين المستهدف في مراسل الفلورسنت ، يمكن تغيير سلوك البروتين بشكل كبير ، بما في ذلك توطينه الخلوي ومستوى التعبير.

يعمل اختبار الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم عن طريق استخدام الأجسام المضادة المثبتة على لوح ميكروتيتر لالتقاط البروتينات المهمة من العينات المضافة إلى البئر. باستخدام جسم مضاد للكشف مترافق مع إنزيم أو فلوروفور ، يمكن قياس كمية البروتين المرتبط بدقة عن طريق الكشف عن قياس الألوان أو قياس الألوان. تشبه عملية الكشف إلى حد كبير عملية لطخة غربية ، ولكن من خلال تجنب خطوات الهلام يمكن تحقيق تقدير كمي أكثر دقة.

نظام التعبير هو نظام مصمم خصيصًا لإنتاج منتج جيني مفضل. عادة ما يكون هذا بروتينًا على الرغم من أنه قد يكون أيضًا من الحمض النووي الريبي ، مثل الحمض الريبي النووي النقال أو الريبوزيم. يتكون نظام التعبير من جين ، عادةً ما يتم ترميزه بواسطة DNA ، والآلية الجزيئية المطلوبة لنسخ الحمض النووي إلى mRNA وترجمة mRNA إلى بروتين باستخدام الكواشف المتوفرة. بالمعنى الأوسع يشمل هذا كل خلية حية ولكن المصطلح يستخدم بشكل أكثر شيوعًا للإشارة إلى التعبير كأداة معملية. لذلك غالبًا ما يكون نظام التعبير مصطنعًا بطريقة ما. ومع ذلك ، فإن أنظمة التعبير هي عملية طبيعية في الأساس. تعد الفيروسات مثالًا ممتازًا حيث تتكاثر باستخدام الخلية المضيفة كنظام تعبير للبروتينات الفيروسية والجينوم.

تحرير التعبير المحرض

في الطبيعة تحرير

بالإضافة إلى هذه الأدوات البيولوجية ، يُشار إلى بعض التكوينات التي يتم ملاحظتها بشكل طبيعي للحمض النووي (الجينات ، والمحفزات ، والمعززات ، والمثبطات) والآلات المرتبطة نفسها باسم نظام التعبير. يستخدم هذا المصطلح عادة في الحالة التي يتم فيها تشغيل الجين أو مجموعة الجينات في ظل ظروف محددة جيدًا ، على سبيل المثال ، نظام التعبير البسيط لمفتاح القامع في Lambda phage ونظام مشغل lac في البكتيريا. يتم استخدام العديد من أنظمة التعبير الطبيعي أو تعديلها واستخدامها بشكل مباشر لأنظمة التعبير الاصطناعي مثل نظام التعبير Tet-on و Tet-off.

يُنظر إلى الجينات أحيانًا على أنها عقد في الشبكة ، حيث تكون المدخلات عبارة عن بروتينات مثل عوامل النسخ ، والمخرجات هي مستوى التعبير الجيني. تؤدي العقدة نفسها وظيفة ، وقد تم تفسير تشغيل هذه الوظائف على أنها تؤدي نوعًا من معالجة المعلومات داخل الخلايا وتحدد السلوك الخلوي.

يمكن أيضًا بناء شبكات الجينات دون صياغة نموذج سببي واضح. هذا هو الحال غالبًا عند تجميع الشبكات من مجموعات بيانات التعبير الكبيرة. [79] يتم حساب التباين والترابط في التعبير عبر عينة كبيرة من الحالات والقياسات (غالبًا بيانات النسخ أو البروتينات). يمكن أن يكون مصدر التباين إما تجريبيًا أو طبيعيًا (قائم على الملاحظة). هناك عدة طرق لإنشاء شبكات التعبير الجيني ، ولكن أحد الأساليب الشائعة هو حساب مصفوفة من جميع ارتباطات التعبير الزوجي عبر الظروف أو النقاط الزمنية أو الأفراد وتحويل المصفوفة (بعد تحديد قيمة حدية معينة) إلى يمثل التمثيل الرسومي الذي تمثل فيه العقد الجينات أو النصوص أو البروتينات والحواف التي تربط هذه العقد قوة الارتباط (انظر [1]). [80]

تُستخدم التقنيات التجريبية التالية لقياس التعبير الجيني ويتم سردها بترتيب زمني تقريبًا ، بدءًا من التقنيات الأقدم والأكثر رسوخًا. يتم تقسيمهم إلى مجموعتين بناءً على درجة تعددهم.


مناقشة

للسماح ببحوث وظيفية دقيقة في الجينات المجهولة وإنشاء مستقر وفعال ب. موري مفاعل حيوي لغدة الحرير ، وعيوب تأثيرات الموضع والطفرات الإدراج التي تسببها PiggyBacيجب التغلب على التكامل العشوائي الوسيط. لذلك ، استخدمنا مزيجًا من تقنيات المعالجة الجينية المختلفة ونظام التعبير بسلسلة Fibroin H المحسن لتطوير استراتيجية عامة وفعالة لإنشاء نظام تعبير مستقر وقابل للاستبدال وعالي الكفاءة للتعبير عن الجينات في دودة القز. لتطوير هذه الاستراتيجية ، أدخلنا أولاً في جينومات دودة القز شريطًا خارجيًا للتعبير عن الجينات المستهدفة يعبر بكفاءة وانتقائية عن البروتين المستهدف في غدد الحرير لدودة القز ، باستخدام المركب PiggyBac- المتجه المشتق PB-TP ، والذي تم دمجه بشكل عشوائي أثناء التحول الأولي للخط الجرثومي. تم وصف هيكل ناقل PB-TP أعلاه. ويشار إلى أن هذا المتجه المركب له نوعان بري كامل الطول PiggyBac الأسلحة R1 (1050 نقطة أساس) و L1 (678 نقطة أساس) واثنان تقصير PiggyBac الأسلحة L2 (309 نقطة أساس) و R2 (238 نقطة أساس) ، يشفر أربعة الينقولات المحتملة (الشكل التكميلي S1). تم الإبلاغ عن أن القصير PiggyBac يمكن استخدام هياكل الذراع لتحسين كفاءة التعبئة لـ PiggyBac في جينومات D. melanogaster 49 و ب. موري 50. لذلك ، تم تطوير L2 و R2 لتحسين كفاءة إعادة تعبئة R1 – L2 و R2 – L1 في B. موري في الجسم الحي، وبالتالي تحسين كفاءة حذف R1 – L2 و R2 – L1 من موضع الإدراج الصبغي الأولي. أظهرت العديد من الدراسات السابقة أيضًا أنه ليس فقط TIRs ولكن أيضًا التسلسلات المرافقة لـ PiggyBac، وخاصة مواقع TTAA ، مطلوبة لنقلها بنجاح 51. لذلك ، تم إنشاء مواقع TTAA في نهاية 3 من متواليات L2 و R2 في المتجه المركب (كما هو موضح في تسلسل التمهيدي في الجدول التكميلي S1). لتحقيق التكامل الدقيق للجينات الخارجية الأخرى في نفس الموقع الجيني مثل الجين المستهدف مع phiC31 بوساطة RMCE ، اثنان AttP تم إدخال المواقع ، التي تحيط بكاسيت التعبير الجيني المستهدف ، في نفس الاتجاه.

في هذه الدراسة ، أنشأنا أربع سلالات مختلفة معدلة وراثيًا ، TS1-RgG1 ، TS1-RgG4 ، مع الإدخال العشوائي لـ transposon R1 – L1 في جينوم دودة القز وعرض شرانق سلالات TS1-RgG المختلفة محتويات EGFP نقية تتراوح من 0.9٪ إلى 16٪ (وزن / وزن). تشير هذه النتيجة إلى أن الجين المحور الذي تم إدخاله في مواضع صبغية مختلفة يؤثر بشكل كبير على تعبير البروتين الخارجي في دودة القز. على حد علمنا ، يعتبر TS1-RgG2 حتى الآن أكثر سلالات دودة القز المعدلة وراثيًا كفاءة في إنتاج بروتين خارجي في غدة الحرير 18،20،52،53،54،55. تم الانتهاء من الإزالة اللاحقة لجميع تسلسلات الترانسبوزون التي تحتوي على كاسيت التعبير الجيني PBase وجميع جينات العلامة لـ TS2-RgG2 بالتعبير الناجم عن الصدمة الحرارية عن الترانسبوزيز. في الجسم الحي، الذي يولد TS3-g2 ، والذي يحتوي فقط على ملف AttP-محاطة بكاسيت التعبير Fibroin H-chain المحسن في جينومها. لا تمنع هذه الطريقة إعادة تعبئة الجين المستهدف فحسب ، بل تقضي أيضًا على الآثار الضارة للجينات المحددة للواسمات في أي تطبيق مستقبلي للحشرة المعدلة وراثيًا ، والتي قد تؤثر على التعبير عن الجينات المستهدفة ، ونمو الأفراد المحولين وراثيا. ، نقل الجينات الأفقي ، أو أي من مشاكل الأمن البيئي المحتملة الأخرى المرتبطة بالحشرات المعدلة وراثيا 21. أظهرت نتائج التسلسل عدم وجود بصمة أو أي تغييرات هيكلية ، مثل الحذف أو الانقلاب أو إعادة الترتيب ، في موقع الاستئصال أو عناصر TTAA أو AttP مواقع في جينومات أفراد TS3-g2. أكدت نتائج أخرى الاستقرار الجيني للتكامل والتعبير عن EGFP الجين في ذرية TS3-g2. في دراسة مستقبلية ، سيتم وضع جينات مختلفة ذات أهمية على وجه التحديد في نفس الموضع الجيني لدودة القز TS3-g2 باستخدام تفاعل RMCE بوساطة phiC31. سيحقق ذلك تعبيرًا عالي الكفاءة ومستقرًا للبروتينات الخارجية المختلفة في ديدان القز المعدلة وراثيًا ، بوساطة محفز سلسلة Fibroin H. لأن إعادة التركيب phiC31-Integrase بوساطة بين ملفات AttP و أتب المواقع أحادية الاتجاه ، فهي تضمن استقرار الجينات المحورة بعد تفاعل RMCE 56. يمكن استخدام دودة القز TS3-g2 التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة لإنشاء مفاعل حيوي عالي الكفاءة لغدة الحرير المعدلة وراثيًا لإنتاج البروتينات الخارجية. الأهم من ذلك ، يمكن استخدامها أيضًا لتحسين حرير الشرنقة الطبيعية وإنتاج ألياف حرير جديدة ذات قوة شد عالية ، التصاق عالي وخصائص ممتازة أخرى مع التعبير الخاص بغدة الحرير للبروتينات ذات الصلة بنيوياً (مثل بروتين دراجلين العنكبوت 57 ، 58). في الواقع ، هناك محفزات أخرى خاصة بغدة الحرير (مثل فيبل 59,60 , fhx 52 و Ser1 يمكن أيضًا استخدام المروجين 61) أو المروجين الخاصين بالأنسجة (مثل الدهون - 62 ، المعى المتوسط ​​- 63 والمروجات الخاصة بخلايا الدم 64) لإنشاء أنظمة التعبير الجيني المستقرة والقابلة للاستبدال وذات الكفاءة العالية في دودة القز باستخدام هذه الإستراتيجية العامة ( شكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، FLP /FRT و كري /loxP تم استخدام الأنظمة بنجاح لتفاعلات RMCE في D. melanogaster 22،29،65. علاوة على ذلك ، وصف Schetelig and Handler مؤخرًا نظام Cre-madiatied RMCE الذي يتميز بكفاءة عالية في D. melanogaster ولأول مرة في ذبابة غير دروسية ، الذبابة التفتريتية ، Anastrepha Suspensa 66. بالمقارنة مع نظام RMCE بوساطة phiC31 ، تتمتع RMCE بوساطة FLP و Cre بالميزة الرئيسية التي سمحت بأحداث إدراج / حذف متعددة للجينات المحورة في موضع واحد 65،66. في العمل المستقبلي ، يمكن أيضًا دمج أنظمة RMCE بوساطة FLP و Cre مع تقنيات معالجة الجينوم المختلفة الموضحة أعلاه وتقديمها كأداة قوية للمقارنات الجينية الوظيفية ولتطوير سلالات دودة القز المعدلة وراثيًا الأكثر تقدمًا للاستخدام التطبيقي.

في هذه الدراسة ، تم حقن خليط من ناقل PB-TP والبلازميد المساعد pHA3PIG في بيض G0 لإنشاء أفراد TS1 مع تحول أولي في السلالة الجرثومية. يمكن أيضًا تكوين الأفراد المعدلين وراثيًا عن طريق حقن ناقل PB-TP وحده ، بدون البلازميد المساعد ، لأن ذبابة الفاكهة hsp70 المروج في ناقل PB-TP يحث على تعبير بروتين عابر عالي الكفاءة في أجنة العديد من أنواع الحشرات المختلفة ، بما في ذلك D. melanogaster 10 , أنوفيليس ستيفنسي 40 و ب. موري 67. يتم ترميز التركيبة الهيكلية لأربعة الينقولات المختلفة في ناقل PB-TP المركب ، ولكن كان من المتوقع تحول الخط الجرثومي للبنية R1 - L1 فقط أثناء التحول الأولي. لذلك ، يحركها محفز A3 هو دودة القز السيتوبلازمية Pbase تم استخدام ناقل التعبير الجيني ، pHA3PIG ، كبلازميد مساعد لإنتاج PBase ، مما سيزيد من كفاءة التحول الأولي المتوقع ، وبالتالي تعزيز احتمال إنتاج أفراد TS1-RgG.

هنا ، استخدمنا أيضًا hsp70 المروج للحث PBase التعبير الجيني في أفراد TS2-RgG2 في الجسم الحي مع HST. طريقة HST أبسط من طريقة الحقن المباشر والعيب الرئيسي لطريقة التهجين الجنسي هو أن PBase يتم إدخال تسلسل الجينات في جينوم النسل الهجين ، مما يسمح بالتعبير المستمر عن PBase ، والذي يمكن أن يقلل من كفاءة حذف R1 – L2 و R2 – L1. أظهرت الدراسات السابقة أن hsp70 يحث المروج بشكل أفضل على التعبير عن جينات المصب عندما تتعرض ديدان القز إلى HST المستمر والمتكرر عند 42 درجة مئوية في مراحل نموها 68،69. تتطور دودة القز الجنينية من زيجوت وحيدة الخلية إلى يرقة ، وتعتبر المرحلة اليرقية الرابعة لدودة القز فترة حرجة في تكوين الخلايا المنوية الثانوية أو تطور البويضات الأولية 70. لذلك ، تم تطبيق HST المستمر والمتكرر عند 42 درجة مئوية لعلاج ديدان القز المعدلة وراثيا في المرحلة الجنينية أو المرحلة اليرقية في المرحلة الرابعة في هذه الدراسة. تشير النتائج إلى أن HST في المرحلة الجنينية أو اليرقية يؤثر على النمو الطبيعي لديدان الحرير المعدلة وراثيًا وأن HST في مرحلة اليرقات يسبب أعلى معدل وفيات (الجدول 4). بالمقارنة مع نسل الأفراد في المجموعات الضابطة غير HST ، كانت كفاءة حذف R1-L2 و / أو R2-L1 أعلى بشكل ملحوظ في نسل أفراد TS2-RgG2 في مجموعات HST ، خاصة في نسل المجموعات ذات HST في المرحلة الجنينية (الجدول 5). كانت كفاءة الحذف لـ R2 – L1 تصل إلى 80 ٪ في نسل أفراد TS4-gG-2 مع HST المطبق في المرحلة الجنينية (الجدول التكميلي S3 والشكل 5 أ). تشير كل هذه النتائج إلى أن HST المستمر والمتكرر عند 42 درجة مئوية في المرحلة الجنينية لديدان القز المعدلة وراثيًا هي الطريقة الأكثر فعالية لإزالة الينقولات من نسلها.

ومع ذلك ، لوحظ أيضًا عدد قليل من الحضنات الإيجابية لـ G3 gG من أفراد TS2-RgG2 وحضنات G5 إيجابية g من أفراد TS4-gG في المجموعات غير HST ، والتي تُعزى إلى التعبير الخلفي لـ PBase تحت سيطرة hsp70 محفز ، على الرغم من أن نشاط الخلفية كان منخفضًا جدًا في ديدان القز المعدلة وراثيًا في الجسم الحي (الجدول 5 والجدول التكميلي S3). تتوافق هذه النتائج مع نتائج دراسة سابقة أبلغت عن تعبير الخلفية لـ a بومبيكس جين المستقبل النووي Ftz-F1 (بمفتز- F1) تحت سيطرة ذبابة الفاكهة hsp70 المروج في دودة القز المعدلة وراثيا 68. على الرغم من أن النشاط الأساسي لـ hsp70 كان المروج منخفضًا عند 25 درجة مئوية ، وتؤكد دراستنا أن ذبابة الفاكهة hsp70 المروج هو محفز محفز فعال للغاية لتنظيم التعبير عن الجينات الخارجية في ديدان الحرير المعدلة وراثيا.

في السنوات الأخيرة ، تم استخدام طرق تحرير الجينوم ، مثل نوكلياز إصبع الزنك (ZFN) ، ونوكلياز المستجيب المشابه للنسخ (TALEN) والمتكررة المنتظمة المتناظرة القصيرة (CRISPR) RNA الموجهة من Nuclease Cas9 ، بنجاح لاستهداف وتشق الجينات في دودة القز 71،72،73. ومع ذلك ، فإن طول جزء الحمض النووي المدمج في جينوم دودة القز عن طريق التحرير الجيني بوساطة TALEN باستخدام أليغنوكليوتيدات الحمض النووي أحادي الجديلة محدود للغاية 74 والفعالية الوحيدة المبلغ عنها GFP كاسيت التعبير (A3-GFP-SV40T) كانت الضربة القاضية لا تزال محدودة للغاية في دودة القز عندما توسطت بواسطة ZFN (0.008٪ فقط ، 1/11770) 75. يوضح الشكل 7 طريقة فعالة لتعديل الجينات المحورة التي تم إدخالها مسبقًا ولدمج أجزاء كبيرة من الحمض النووي في جينوم دودة القز باستخدام مزيج من PiggyBac- طريقة خالية من الينقولات ، ونظام RMCE بوساطة phiC31 و FLP /FRT النظام. phiC31 /Att تم عرض نظام يسمح بدمج DNA يصل إلى 100 كيلو بايت في مواقع متلقية محددة في D. melanogaster 76 ، لذلك يمكن استخدام هذه الطريقة للتغلب على عيوب أنظمة تحرير الجينوم هذه. علاوة على ذلك ، يجب أن يتغلب نظام SSR وطرق تحرير الجينوم الموصوفة أعلاه على كل من الإدخال العشوائي للترانسبوزونات والمشاكل المرتبطة بتكامل أجزاء كبيرة من الحمض النووي باستخدام أنظمة تحرير الجينوم.

استراتيجية لتكامل الجينات الخاصة بالموقع عبر RMCE بوساطة phiC31 واستئصال العلامة اللاحقة من الموقع المستهدف باستخدام FLP /FRT النظام.

احتوى إنتاج واختيار سلالات دودة القز المعدلة وراثيًا على نسخة واحدة من الجين المستهدف 1 (Traget 1) دون أي جينات منقولة وعلامة (Marker 1 و Marker 2) في جينوماتها (Target loci) باستخدام PiggyBac- مشتق من البلازميد وكما هو موضح في الطرق والموضح في الشكل 1. إعادة التركيب بين اثنين أتب/AttP أزواج من متجه المانحين والمواقع المستهدفة بوساطة phiC31 Integrase (Int) أسفرت عن تكامل نسخة واحدة من جين taget 2 (الهدف 2) ، و Marker 1 وشريط التعبير FLP recombinase المحرض (IP) (Ter يشير إلى تسلسل الإنهاء) في الموقع المستهدف لجينوم دودة القز. التعبير المحرض اللاحق لـ FLP recombinase (FLP) في الجسم الحي، والتي يمكن أن تحفز إعادة التركيب بين اثنين FRT المواقع والاستئصال الناتج للعلامة 1 وكاسيت التعبير FLP recombinase من المواقع المستهدفة لجينوم دودة القز.

في الختام ، لقد طورنا استراتيجية فعالة وعامة لإنتاج نظام تعبير عن التحوير مستقر وقابل للاستبدال وعالي الكفاءة في ب. موري. استراتيجيتنا تقضي بشكل فعال على إعادة تعبئة PiggyBacالجينات المحورة المتكاملة بوساطة في دودة القز. كما أنه قابل للتطبيق على الحشرات الأخرى من قشريات الأجنحة لتحسين السلامة البيئية للسلالات المعدلة وراثياً المعدة للإطلاق في برامج المكافحة الحيوية. نظرًا لأن دودة القز حشرة مهمة تجاريًا وتستخدم على نطاق واسع كنموذج تجريبي لحشرات قشريات الأجنحة ، يمكن استخدام السلالات المعدلة وراثيًا التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة ليس فقط لتحسين تعبير البروتين الخارجي ولتحسين خصائص حرير الشرنقة الطبيعي ، ولكن أيضًا في الوظائف البحث الجينومي ، مثل التحقيق في وظائف الجينات المختلفة في نفس المواقع في جينوم دودة القز. استخدام PiggyBac- طريقة خالية من الينقولات جنبًا إلى جنب مع نظام RMCE بوساطة phiC31 في ب. موري أو أي أنواع أخرى لم يتم الإبلاغ عنها حتى الآن. في دراسة مستقبلية ، سنقوم بدمج استراتيجيتنا مع أنظمة تحرير الجينوم الموصوفة أعلاه لإنشاء تقنيات معالجة الجينوم في دودة القز وأنواع أخرى من lepidopteran.


العناصر القابلة للتحويل ومقال بيولوجيا الجينوم

الينقولات هي عناصر دنا متحركة ، جينات قافزة يمكنها التنقل داخل الجينوم أو عبر الانتقال الأفقي. تم العثور عليها في كل من الجينومات المؤيدة وحقيقية النواة. وصفتها باربرا مكلينتوك لأول مرة بأنها "عناصر تحكم" وتم استبدالها لاحقًا بالعناصر القابلة للتحويل (TEs). أدى عملها الرائد لفهم طبيعة أنماط ألوان الفسيفساء لبذور الذرة وتوارثها غير المستقر إلى اكتشاف عناصر Activator (AC) و Dissociator (Ds) في الذرة. هذه طريقة ممهدة لفهم الطبيعة الديناميكية للجينوم وآلية التحكم في التعبير الجيني (مكلينتوك ، 1950). تطورت أكثر من 45٪ من الجينومات البشرية من الينقولات (لاندر وآخرون ، 2001) مما يجعلها مثيرة جدًا للدراسة وتعطينا الفرصة لفهم القوى التطورية التي شكلت جينومنا خلال مسار التطور. يوفر التكرار العالي لـ TEs للتبديل ، في حدود 103 إلى 105 تقريبًا لكل عنصر لكل جيل ، مادة كافية للتطور ليكون لها تأثير كبير على تكوين أنواع جديدة من خلال سلسلة من التعبئة أو الخسارة (Bi & eacutemont and Vieira ، 2006). بصرف النظر عن دورها في التطور ، تظهر TEs الآن كنواقل واعدة تستخدم على نطاق واسع في تطبيقات العلاج الجيني والتحول.

هيكل TEs والنسخ

تنقسم Eukaryotic TEs على نطاق واسع إلى فئتين رئيسيتين بناءً على آلية التحويل. عناصر الفئة 1 هي الينقولات العكسية التي تستخدم وضع نقل النسخ واللصق بوساطة الحمض النووي الريبي وعناصر الفئة 2 هي الينقولات الحمض النووي التي تستخدم نقل القطع واللصق على أساس الحمض النووي (الشكل 1 أ). تمثل Retrotransposons 42 ٪ تقريبًا من الجينوم البشري (Lander et al. ، 2001) ، يتم نسخ الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي بواسطة عنصر النسخ العكسي المشفر والذي يدمجها في موقع جينومي جديد. يتم تقسيمها أيضًا إلى عناصر التكرار الطرفي الطويل (LTR) وعناصر غير LTR. يتم تصنيف الفيروسات القهقرية الذاتية البشرية (HERVs) ، والتي تشبه الفيروسات القهقرية في الهيكل والآلية ، ضمن LTR بسبب جين غلاف غير وظيفي يمنع انتقالها الخلوي الإضافي. غالبية عناصر الفئة الأولى الموجودة في الجينوم البشري هي بشكل أساسي عناصر متناثرة طويلة غير LTR (LINEs أو L1s) (Lander et al. ، 2001). نادرًا ما يحدث النشاط العابر من خلال آلية التحويل retero الخاصة بهم التي تحشد العناصر النووية القصيرة غير المستقلة (SINES) مثل Alu و SVA ، والتي تشكل جينات خادعة مُعالجة (Boeke and Corces، 1989 Ostertag and Jr، 2001 Wei et al.، 2001) . على الرغم من أن الغالبية العظمى من الينقولات العكسية غير نشطة ، فإن الجينوم البشري المتوسط ​​يتكون من 80-100 عنصر L1 نشط (Brouha et al. ، 2003).

الشكل 1. أنواع العناصر القابلة للنقل وآلية تعبئة الينقولات. تنقسم العناصر القابلة للتحويل إلى مجموعتين رئيسيتين: (أ) ترانسبوسون DNA يشفر جينًا واحدًا واحدًا ، وهو transposase ، محاطًا بتكرار مقلوب طرفي (IR). يتعرف إنزيم transposase r على الـ IRs ، ويخرج العنصر ويدرجه في موضع جينومي جديد في مكان آخر. يتم إغلاق مواقع الدمج والاستئصال بمساعدة إنزيم إصلاح الحمض النووي المضيف. (B) و (C) Reteroelements (التكرار الطرفي الطويل (LTR) والنوع غير LTR) يتحركان عبر RNA-intermediate ويرمز نسخة عكسية (RT) ، إنجاريز (IN) و نوكلياز داخلي (EN). تحتوي كل مجموعة من هذه المجموعة على عناصر مستقلة وغير مستقلة. لا تقوم العناصر غير المستقلة بتشفير المكونات الوظيفية المطلوبة للتبديل ، ولكنها تعتمد بدلاً من ذلك على الإجراء العابر لنظيرها المستقل لتعبئتها. تم التعديل بعد (Levin and Moran، 2011)

في الطبيعة ، توجد الينقولات إما كنسخة وظيفية كاملة ترميز جميع المكونات (تسلسل ترانسبوزيز والتعرف عليها) أو كنسخة غير مستقلة مع تسلسل التعرف المراد تعبئته في ترميز بواسطة نسخة مستقلة. يعد نسخ الترانسبوزون الخطوة الأساسية والأكثر أهمية نحو التحويل. إما أنها تعتمد على المروج الجوهري أو المحفز الجيني المجاور. تستخدم عناصر Reterovirus و LTR الخاصة بها LTR كمحفز / إشارة محسّن قوية للنسخ المطلوب للانتشار الناجح إلى الجيل التالي في الكائن الحي (Boeke and Corces ، 1989) وقد ثبت أن العناصر غير LTR مثل L1 لها جوهرها. المروج في منطقتهم غير القابلة للترجمة 5 بوصات (UTR) (Swergold ، 1990).

يتكون ترانسبوسون الحمض النووي من ترميز الجين transposase المحاط بتكرارين مقلوبين طرفيين (IRs). يتعرف إنزيم transposase على التكرارات المقلوبة الطرفية (IRs) ويربطها ، ويقطع الحمض النووي ويعيد إدخاله في موقع جينومي جديد. يمكن تقسيم الينقولات حقيقية النواة إلى ثلاث فئات رئيسية بناءً على آلية التحويل.

تنقولات كلاسيكية للحمض النووي المزدوج الجديلة والقطع واللصق

الهليترونات التي تتبدل باستخدام آلية تكرار الدائرة المتدحرجة (Kapitonov and Jurka ، 2001)

يقوم مافريكس بتشفير بوليميراز الحمض النووي الخاص به ونقله من خلال عملية النسخ واللصق (Pritham et al. ، 2007).

تنتمي ترانسبوزونات الحمض النووي الموجودة في الجينوم البشري إلى عائلة Tc-1 / mariner super (أي بحار ، MER2-Tigger ، Tc2) ، عائلة hATsuper (أي MER-1-charlie ، Zaphod) ، وبعض العناصر المشابهة لـ PiggyBac. تم تقسيم الفئتين الرئيسيتين إلى عائلات فائقة ثم إلى عائلات على أساس آلية التحويل والتشابه المتسلسل والعلاقات الهيكلية. (بيس وفيشوت ، 2007). تتميز معظم الينقولات DNA بوجود محفز داخلي خاص بها أو تعتمد على التعبير عن الجينات المجاورة لنسخ الترانسبوزونات الخاصة بها من أجل التحويل. أمثلة على ترانسبوزونات الحمض النووي التي تنتقل مع المروج الخاص بها تشمل عناصر p في الذباب (Kaufman et al. ، 1989) وعناصر Ac و mutator في النباتات (Fridlender et al. ، 1998) (Raina et al. ، 1993). لا يتم الحفاظ على نشاط المروج دائمًا بين أفراد نفس العائلة. في حالة Tc-1 / mariner ، يكون لعناصر Pot2 في النباتات نشاط محفز خاص بها من حيث المعنى والاتجاه المضاد للمعنى (Kimura and Yamaguchi ، 1998) و Tc3 في C.elegans (Moldt et al. ، 2007) وأعضاء آخرين مثل حيث تعتمد الينقولات Tc1 على النسخ المصادف للقراءة من المروجين الجينومي المجاور. (Sijen and Plasterk ، 2003).

آلية المضيف تنظم التعبير TEs

غالبًا ما يُطلق على TEs اسم "عناصر أنانية" أو "طفيلية لأن نجاحها يتناسب عكسًا مع لياقة المضيف (Slotkin and Martienssen ، 2007). غالبًا ما يُعتبر نشاط TEs ضارًا بالمضيف ، حيث أنها مطفرة للغاية ويمكن أن يؤدي إدخالها إلى تغيير تنظيم الجينات المرافقة والتعبير عنها بعدة طرق. على الرغم من أن معظم الينقولات غير نشطة بسبب الطفرات ، إلا أنها يمكن أن تظل سليمة ولكنها صامتة في جينومات المضيف. لتقليل الطبيعة الضارة للنقولات ، طور جينوم المضيف عددًا من آليات `` الدفاع '' اللاجينية والتي تعد مسارات مترابطة مثل RNAs الصغيرة غير المشفرة ، ومثيلة الحمض النووي وتعديلات الكروماتين لحماية الآثار الضارة لـ TEs.

piRNA و RNAi إسكات TEs

الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNAs) عبارة عن امتداد قصير من 21-30 جزيء RNAs نيوكليوتيد مشقوق بواسطة عائلة بروتينات مقامة بواسطة آلية تسمى تداخل RNA (RNAi). تشكل بروتينات الأرجونوت المكونات المحفزة لمركب الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC). Tc1 هي الأسرة الأكثر وفرة من الينقولات في C. elegans التي يتم إسكاتها بواسطة RNAi في خط الجراثيم (Sijen and Plasterk ، 2003). الأهم من ذلك ، أن الطفرات في بروتينات عائلة الأرجونوت والقواطع تتسبب في إعادة تعبئة TEs في العديد من الأنواع حقيقية النواة. تساهم siRNAs الذاتية ، الموجودة في الثدييات ، على نطاق واسع من خلال نشاط TEs (واتانابي وآخرون ، 2006). يتم إسكات الينقولات العكسية L1 التي تمثل 17 ٪ من الجينوم البشري بواسطة RNAi عن طريق الإحساس والنشاط المضاد للمعنى لمحفزه (Yang and Kazazian ، 2006). الحمض النووي الريبي المتفاعل مع Piwi (piRNAs) هو فئة جديدة من RNAs الصغيرة التي يبلغ طولها 30 nt في الطول المعبر عنها أثناء تطور الخلايا الجرثومية الذكرية المرتبطة بـ MIWI ، وهو عضو من فصيلة PIWI الخاصة بتكوين الحيوانات المنوية من عائلة بروتين Argonaute لتكوينها الحيوي و / أو استقرارها (Grivna) وآخرون ، 2006). يتم ترتيب PiRNAs في مجموعات في الفئران والبشر مما يوحي بوظيفة مشتركة في تطوير الخلايا الجرثومية (Aravin et al. ، 2007). أظهر جين Drosophila piwi أنه مهم جدًا للخلايا الجذعية الجرثومية (GSCs) والتي يتم حفظها بشكل كبير في C. elegans والبشر. علاوة على ذلك ، يتم إسكات جميع عناصر Gypsy و P & amp I في خط جرثومة ذبابة الفاكهة ، حيث يتم التعبير عن بروتينات الأرجونوت Piwi بنشاط (Cox et al. ، 1998) (Rehwinkel et al. ، 2006). قد تساعد السمات الهيكلية لـ TEs في التمييز بين نسخها من الجين المضيف للاستهداف المحدد بواسطة مسار piRNA و RNAi.

الشكل 1. صغير الحمض النووي الريبي (sRNA) بوساطة مسارات إسكات الجينات. مشغلات dsRNA (التي يمثلها دبوس الشعر) ، والتي يتم اشتقاقها من التكرارات الطرفية المقلوبة من ترانسبوزون DNA تتم معالجتها وتشكيلها إلى 21-24 نيوكليوتيد (nt) siRNAs بواسطة عائلة Dicer من البروتينات. تقوم هذه البروتينات siRNA بتوجيه بروتينات الأرجونوت إلى الحمض النووي الريبي المرسال التكميلي (mRNAs) والتوسط في تدهورها أو قمعها الترجمي. يتم معالجة الحمض النووي الريبي المتفاعل مع السلالة الجرثومية من الحمض النووي الريبي طويل الشريطة المفردة ، وغالبًا ما تكون نسخًا مضادة للترانسبوزونات. يسمح ربط البيرنا الناضج ببروتينات PIWI أو Aubergine (AUB) بتوجيهه إلى التسلسلات التكميلية في TE mRNA. الانقسام الداخلي للنووية في mRNA ، و 10 nt من نهاية 5 ² من RNA الصغير ، و 3 ² الانقسام / المعالجة يحرران piRNA ترانسبوسون ثانوي ، والذي يرتبط ببروتين Argonaute 3 (AGO3). يؤدي ارتباط هذا المركب بالتسلسلات التكميلية في السلائف الأصلية piRNA ، متبوعًا بالانقسام الداخلي للنووية ، إلى تجديد piRNA مضاد المعنى والذي يمكن توجيهه إلى TE mRNA على مستوى النسخ وما بعد النسخ. تم التعديل بعد (Levin and Moran، 2011)

مثيلة الحمض النووي وتعديلات الكروماتين

تعمل مثيلة الحمض النووي كعلامة جينية مهمة تلعب دورًا محوريًا في تنظيم التعبير الجيني وأثناء التطور. يتم محو أنماط مثيلة الحمض النووي التي يتم تعيينها في الخلية الجرثومية أثناء تكوين الأمشاج إلى حد كبير في عملية التطور الجنيني وإعادة ضبط أمبير بعد الزرع (Gaudet et al. ، 2004). يمكن ميثلة مخلفات السيتوزين في الحمض النووي في النباتات وكذلك في الحيوانات. يتم إجراؤها عمومًا بواسطة عائلة من إنزيمات ميثيل ترانسفيرازات الحمض النووي. في الفأر ، مثيلة الجسيمات من النوع A intracisternal intracisternal ، تكبح تعبيرها في عملية التطور الجنيني. لكن تعطيل DNMT1 ، DNA methyltransferase المسؤول عن الحفاظ على مثيلة الحمض النووي ، يؤدي إلى مستويات مرتفعة من عناصر IAP (Walsh et al. ، 1998).

الشكل 1. المحفزات التنموية للتبديل. يمكن أن تنتج أحداث تكامل عنصر السلالة الجرثومية القابل للنقل (TE) عن تنقل TE في الخلايا التي تؤدي إلى الأمشاج أو من حركة TE بعد الإخصاب أثناء التطور المبكر. يمكن للتنقل الجنيني TE في الخلايا التي لا تساهم في الخط الجرثومي أو التنقل في مراحل التطور اللاحقة ، من حيث المبدأ ، أن يؤدي إلى أحداث تكامل جسدية TE. تم التعديل بعد (Levin and Moran، 2011)

تلعب مثيلة الحمض النووي دورًا مهمًا في تكثيف الكروماتين والتعبئة من خلال تعديلات على ذيول هيستون أمينو (N) التي تغير من تقاربها مع عوامل النسخ. يتم إثراء المناطق التي يهيمن عليها TE في النيوكليوسومات من أجل مثيلة هيستون H3 في ليسين 9 (H3K9) المرتبط بقمع النسخ (Martens et al. ، 2005). في نبات الأرابيدوبسيس ، يمكن إحداث مثيلة الحمض النووي الريبي الموجه بواسطة الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل بواسطة RNAi. يقوم DICER-LIKE 3 (DCL3) بتجنيد المكونات التي تشير إلى مثيلة الحمض النووي بطريقة مستقلة عن نشاطها التحفيزي وتولد أكبر 24-26 نيوكليوتيد siRNA الذي يشكل معقدًا مع Argonaute4 (AGO4) ، وهذا الصمت عن طريق مثيلة الحمض النووي غير المتكافئة (Qi) وآخرون ، 2006). إن إسكات الجين النسخي (TGS) بوساطة RNAi غير مفهوم بشكل جيد في الثدييات ، لكن من المعروف أن siRNAs التي يتم إدخالها بشكل مصطنع يمكنها ربط DNA methyltransferase Dnmt3a لتوجيه مثيلة الحمض النووي في الخلايا البشرية (Weinberg et al. ، 2006).

التكيف المشترك لـ TEs لوظائف المضيف

خلال مسار التطور ، أدى الوجود الوفير لليقولات مع قدرتها على إحداث الطفرات إلى تدجينها (Miller et al. ، 1999). من المعروف أنها تشارك في الشبكات التنظيمية مثل توفير إشارة مُحسِنة يمكنها إعادة توصيل التعبير الجيني للمضيف. لقد ثبت الآن تجريبيًا أن ما يقرب من 25 ٪ من المروجين البشريين يحتويون على تسلسل من TEs (جوردان وآخرون ، 2003). ساهم عنصر قابل للتحويل خاص بالمشيمة (MER20) في أصل شبكة تنظيم الجينات الخاصة بالمشيمة في الثدييات من خلال زيادة مسار إشارات cAMP في خلايا انسجة بطانة الرحم (Lynch et al. ، 2011). يرتبط الحفاظ على تيلومير ذبابة الفاكهة السليمة بالتحويلات النهائية للنقولات الخلفية المتخصصة TART (الينقولات العكسية المرتبطة بالتيلومير) و HeT-A (Levis et al. ، 1993). تطورت العناصر الرجعية للفيروسات القهقرية الداخلية من الفئة الأولى (ERV) من LTR بحيث تحتوي على 1500 موقع ربط لـ p53 تمثل 30 ٪ من جميع مواقع الربط p53. تعتبر عناصر ERV هذه خاصة بالرئيسيات وتمنحنا فهمًا شاملاً للفيروسات القهقرية الذاتية التي تشكل شبكة النسخ لبروتين مثبط الورم البشري p53 (Wang et al. ، 2007). إعادة التركيب V (D) J هو إعادة ترتيب متخصصة للحمض النووي للمتغير (V) ، والتنوع (D) ، والانضمام إلى (J) المقاطع الجينية التي لعبت دورًا مهمًا في تطوير الجهاز المناعي للفقاريات. بروتينات RAG1 و RAG2 هي المكونات الأساسية التي تتفاعل لتشكيل recombinase المسؤول عن أنشطة الانضمام والنقل. تسلسل إشارة إعادة التركيب (RSS) المتاخمة للقطاعات V (المتغير) و D (التنوع) و J (الانضمام) مسؤولة عن الانقسام المحدد للتسلسل والانضمام بواسطة مجمع البروتين RAG1 / 2 (Gellert ، 2002). تذكرنا الآلية بأكملها إلى حد كبير بتفاعل التحويل ويمكن لـ RAG1 / 2 تحفيز نقل جزء من الحمض النووي المحاط بـ RSS في المختبر (Agrawal et al. ، 1998). تم تطوير النواة التحفيزية لـ RAG1 من عناصر Transib ، وهي مجموعة من الينقولات DNA المحددة في اللافقاريات وتوضح بنية RSS خصائص التشابه التسلسلي مع TIR لـ Transib Transib (Kapitonov and Jurka ، 2005). جنبًا إلى جنب مع كل هذه النتائج ، تمثل إعادة التركيب V (D) J التكيف المشترك الناجح وتدجين الأمبير من الينقولات مع الماكينة المضيفة.

نظام ترانسبوسون Tc1 / عائلة مارينر والجمال النائم (SB)

عائلات Tc1 / Mariner هي أكثر فصائل ترانسبوزون DNA انتشارًا الموجودة في حقيقيات النوى التي تتراوح من النباتات إلى البشر (Plasterk ، 1999) وهي تختلف في الطول من 1.3 إلى 2.4 كيلو بايت وتشفر إنزيم ترانسبوزيز واحد (Ivics et al. ، 1997 Robertson ، 1993) تم العثور عليه كعنصر متكرر في C.elegans (van Luenen et al. ، 1993) وعندما تم الكشف عن التحويل ، تم تسميته Tc1 (بالنسبة إلى transposon Caenorhaditis رقم 1). تم العثور على الأعضاء الآخرين من عائلة الملاح في الغالب في أنواع مختلفة من الذباب (Bigot et al. ، 1994 Capy et al. ، 1994) ولكن تم الإبلاغ عنها منذ ذلك الحين في البشر. يتميز بروتين transposase الخاص بالعائلة بوجود عنصر DDE أو DDD الموجود في معظم الترانسبوزيز والتكامل ، مع تكرار مقلوب طرفي وتكامل تفضيلي لتسلسل TA (Vos and Plasterk ، 1994). لسوء الحظ ، فإن معظم أفراد عائلة Tc1 / Mariner غير نشيطين ، ويتم تقديمهم عن طريق & quot ؛ التعطيل الرأسي & quot (Lohe et al. ، 1995). علاوة على ذلك ، تم استخدام العنصر الداخلي الشبيه بـ Tc1 (TcE) من ذبابة الفاكهة hydei ، بنجاح لتكوين السلالة الجرثومية في الذبابة Ceratitis capitata (Loukeris et al. ، 1995). نتج عن إعادة البناء الجزيئي من عناصر Tc1 / mariner المتعددة غير النشطة في الأسماك إحياء الينقولات النشطة المسمى Sleeping Beauty (SB). SB هو الينقولات الأكثر نشاطًا ودراسة في الفقاريات لسببين رئيسيين. لقد أعطت فرصة لفهم تنظيم ترانسبوسون المضيف وناقلات غير فيروسية قيّمة لاستخدامها في تكوّن الفقاريات والعلاج الجيني. يتكون نظام SB transposon من مكونين رئيسيين ، الينقولات مع التكرارات الطرفية المقلوبة (IRs) على كلا الجانبين مع احتواء كل منهما على موقعي ربط transposase (DRs) و transposase. يبلغ طول الـ IRs 230 نقطة أساس مع تكرارين غير كاملين 32 نقطة أساس (DR) غير متساويين على كلا الجانبين مع منطقة الأشعة تحت الحمراء اليسرى التي تحتوي على منطقة UTR والتي يمكن أن تعمل كمُحسِّن لنسخ SB transposase بترتيبها الأصلي. يتكون SB من 340 من الأحماض الأمينية مع مجال ربط الحمض النووي الشبيه بالطرف N والذي يتعرف على IRs وإشارة التعريب النووي المتداخلة (NLS) المتضمنة في النقل النووي والطرف C مع توقيع DDE المميز مسؤول عن النشاط التحفيزي المتضمن في انقسام الحمض النووي ، ونقل الخيوط والانضمام إلى التفاعل (Ivics et al. ، 1997).

الشكل 1. هيكل Sleeping Beautytransposase. يتألف الجمال النائم من أزواج مثل مجال ربط الحمض النووي وإشارة التوطين النووي (NLS) والمجال التحفيزي الطرفي C.

يبدأ تبديل SB النموذجي بربط transposase بـ IRs متبوعًا بالتكوين المعقد المشبكي حيث يتم جمع طرفي الينقولات بالقرب من بعضهما البعض. ثم يتم استئصاله من موضع المتبرع وإعادة دمجه في موضع جديد مما يؤدي بدوره إلى حدوث طفرة في بصمة القدم بمقدار 5 نقاط أساس في موقع المتبرع (Ivics et al. ، 1997).

الشكل 1. تمثيل تخطيطي للتبديل القص واللصق. يُحاط جين transposase (الصندوق الأزرق) بالتكرارات المقلوبة (أسهم IR الرمادية). إن transposase (الدائرة الخضراء) ، وهو البروتين الوحيد اللازم لتفاعل التحويل ، يرتبط بالتكرارات المقلوبة ، ويحفز استئصال العنصر القابل للنقل من موضع المتبرع (الخطوط الخضراء) ويتوسط تكامل العنصر في موضع DNA جديد ( خطوط صفراء). يتم إصلاح فواصل الحمض النووي في موقع التكامل والمانح بواسطة آلية إصلاح الحمض النووي المضيف.

يتم وضع الخطوات التفصيلية من خلال رسم تخطيطي. يمكن لـ SB Transposase التعرف على الـ IRs إما في رابطة الدول المستقلة أو في الترتيب العابر مما يجعل من الممكن فصل جين transposase فعليًا عن الـ IRs. يجعل الترتيب العابر من السهل استنساخ أي جين مهم بين الـ IRs (الشكل) مع ترانسبوزيز الذي يحركه مروج قوي ، وبالتالي سيكون بمثابة قيمة لهندسة الجينوم. لكن كفاءة تفاعل التحويل كنظام مكون من مكونين يمكن أن تكون محدودة بظاهرة تسمى منع الإفراط في الإنتاج والتي تنتشر على نطاق واسع في عائلة Tc1 / mariner وسعة شحن إدخال الحمض النووي المستنسخ بين الـ IRs (Grabundzija et al. ، 2010).

الشكل 1. نظام Sleeping Beautytransposon. (أ) الترتيب الطبيعي لليرقان الجميل النائم. يُحاط جين transposase (الصندوق الأزرق) بالتكرارات المقلوبة (الأسهم الرمادية IR) التي تحتوي على مواقع ربط transposase (الأسهم البيضاء DR). (ب) الترتيب المختبري لنظام ناقل سليبينج بيوتي جين. يتم استبدال منطقة ترميز transposase بجين مهم (الصندوق الأخضر).يتم توفير transposase على ناقل بلازميد منفصل يتم التعبير عنه من مروج مناسب (السهم الأزرق).

حددت الدراسة المنهجية لنظام ناقل الترانسبوزون الأكثر كفاءة بين عائلة Tc1 / mariner مثل Tc1 و Tc3 و Himar1 و Mos1 مع اختبار استنبات خلايا الثدييات الداخلية أن SB هو النظام الأكثر كفاءة (Fischer et al. ، 2001). لدى SB تفضيل موقع مستهدف لـ AT-تكرار متناوب ، ATATATAT ، حيث يكون TA المركزي هو الموقع المستهدف الكنسي ويخضع أمبير عند النقل لنسخ TA ثنائي النوكليوتيد في الموقع المستهدف الذي تم إصلاحه بواسطة آلات إصلاح المضيف. إنه أكثر أنظمة الترانسبوزون نشاطًا لعائلة Tc1 / Mariner المستخدمة في معالجة الجينوم وتطبيقات العلاج الجيني المختلفة في الفقاريات (تمت مراجعته في M & aacutet & eacutes et al. ، 2007). تؤدي إعادة البناء الجزيئي عن طريق التطور في المختبر إلى توليد أشكال جديدة مفرطة النشاط من SB حيث يكون SB100x هو أكثر نقل الجينات المستقر نشاطًا ودعمًا بنسبة 35-50٪ في الخلايا الأولية البشرية وتكوين مستقر بنسبة 45٪ في ملقحات الفأر (M & aacutet & eacutes et al. ، 2009)

عوامل المضيف وتنظيم الجمال النائم

SB Transposon لديها مجموعة واسعة من النشاط في الفقاريات بكفاءة مختلفة وأمبير بين خلايا الأنسجة المختلفة من نفس النوع. يمكن أن يُعزى التفسير المحتمل لمثل هذا الاختلاف في الكفاءة إلى تفاعل آلية التحويل مع العوامل المضيفة. ومع ذلك ، إذا كانت البروتينات المضيفة تشارك بالفعل في تفاعل التحويل ، فيجب حفظها في الفقاريات. تم تحديد بروتين ثني الحمض النووي المحفوظ بدرجة عالية والذي ينتمي إلى مجموعة البروتينات عالية الحركة ، HMGB1 ، لأول مرة كعامل مساعد في نقل SB الضروري لمجمعات الترانسبوزون في DRs الداخلية (زايد ، 2003). يؤدي تبديل SB إلى فواصل حبلا مزدوجة للحمض النووي ، والتي تبين أنه يتم إصلاحها بواسطة آلات إصلاح المضيف. يتفاعل بروتين Ku70 ، وهو بروتين مهم يشارك في مسار إصلاح الانضمام غير المتماثل ، جسديًا مع SB transposase ، مما ينشئ رابطًا وظيفيًا بين إصلاح الحمض النووي المضيف الآلات و transposase. (Izsv & aacutek et al. ، 2004).

التعديل اللاجيني لعنصر SB القابل للنقل بواسطة مثيلة CpG ضمن تسلسل الترانسبوزون يعزز تردد التحويل لـ SB ينقل (Yusa et al. ، 2004). SB ، من خلال تفاعله مع مضيف آخر مشفر بروتين Miz-1 ، ينظم عامل النسخ تعبير cyclin D1 في الخلايا البشرية ويحفز تباطؤ G1 ، والذي يمكن اعتباره عملًا أنانيًا لحدث التحويل الأقصى (Walisko et al. ، 2006).

يستحث HMG2L1 نسخ الينقولات 5 ²-UTR

بروتينات المجموعة عالية الحركة (HMGB) هي واحدة من ثلاث عائلات فائقة لبروتين الكروموسومات HMG والتي يمكن تصنيفها إلى مجموعتين فرعيتين رئيسيتين: تحتوي بروتينات المجموعة 1 على أكثر من مجال HMGB واحد مع ذيل C حمضي طويل بدون خصوصية تسلسل معين. تحتوي بروتينات المجموعة 2 على مجال HMGB واحد فقط مع درجة معينة من خصوصية التسلسل ويمكن أن تعمل كعامل نسخ (Bustin ، 1999). من المهم ملاحظة أن HMG2L1 ينتمي إلى المجموعة الفرعية الثانية من بروتينات HMGB. لقد ثبت أن HMG2L1 ينظم بشكل سلبي إشارات Wnt من خلال التفاعل مع بروتين ربط NLK جديد (Yamada et al. ، 2003). أظهرت دراسات أخرى دورها في التخفيف من تمايز العضلات الملساء (Zhou et al. ، 2010). في البحث عن بروتينات مضيفة أخرى عن طريق شاشة خميرة هجينة يمكن أن تتفاعل مع SB Transposase ، نتج عن بروتين آخر عالي الحركة HMG2L1 (بروتين مجموعة عالية الحركة 2-like 1) يتفاعل هذا مع SB transposase ثم يرتبط بـ 5 ' وبالتالي ، فإن المنطقة غير المترجمة ، تقود تعبيرها على الرغم من وجود SB transposase ، يتم تنظيم HMG2L1 سلبًا عن طريق تثبيط التغذية المرتدة (Walisko et al. ، 2008).

الأهداف والغايات

غالبًا ما يُنظر إلى العناصر القابلة للتحويل على أنها طفيليات DNA أنانية نادرًا ما يتم إشراكها بواسطة الجينوم لتؤدي دورًا مفيدًا. لكن المستوى العالي من التحويل قد يؤثر سلبًا على ملاءمة المضيف ، مما يشير إلى وجود رقابة صارمة في تنظيم العنصر القابل للنقل داخل البيئة الخلوية. إن الناقلة النائمة (SB) هي عضو في عائلة Tc1 / الملاح الفائقة من ترانسبوزونات الحمض النووي ، ويتم تعبئتها عبر آلية القص واللصق. في هذه الدراسة ، تم استخدام العنصر القابل للنقل Sleeping Beauty (SB) كأداة للتحقيق في تفاعلات خلية ترانسبوسون المضيفة في الفقاريات.

يتم تنظيم تبديل الجمال النائم (SB) بشكل كبير بواسطة العوامل الخلوية المضيفة. يتم التعبير عن ترانسبوزيز بواسطة مروجها الخاص الموجود في منطقة 5'UTR من الينقولات. والجدير بالذكر أن النسخ يتم تنظيمه بشكل كبير بواسطة بروتين خلوي ، HMG2L1. نظرًا لأن HMG2L1 عبارة عن بروتين ضعيف الخصائص ، فإن دراسة شبكة تفاعل البروتين التي تنظم نشاط بروتين HMG2L1 كانت ذات أهمية كبيرة ، حيث أن هذا بدوره يعدل النسخ والتعبير الناقل.

الجمال النائم (SB) يظهر ترانسبوسون انتقالاً فعالاً في خلايا الفقاريات وخلايا أنسجة مختلفة من نفس النوع ، ولكن بكفاءات مختلفة. التفسير المحتمل هو التعبير عن العوامل المضيفة وتنظيمها التي يمكن أن تنظم كفاءة التحويل. باستخدام الزرد ككائن نموذجي ، هدفت هذه الدراسة إلى فك شفرة التعبير النمائي لـ HMG2L1 ودوره في التنظيم الديناميكي لل transposase في التطور المبكر للخلايا الجنينية والجرثومية.

تم استخدام أنظمة التكامل القائمة على Sleeping Beauty (SB) على نطاق واسع للتلاعب الجيني للفقاريات. كان الهدف هو تسخير قوة الجينات المعدلة وراثيا المستندة إلى ترانسبوزون إلى جانب إعادة التركيب بوساطة تبادل الكاسيت (RMCE) لإنشاء نموذج جرذ معدل وراثيا ، حيث يمكن إعادة توجيه الجينات المعدلة وراثيا في المواضع الجينية التي تم وضع علامة عليها الينقولات للتحايل على مشاكل الحقن النووي القائم. جينات.


شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنح من مجلس السرطان في فيكتوريا ، أستراليا (1066554) والمجلس الوطني للبحوث الصحية والطبية (NHMRC) في أستراليا (1003667). تم دعم MHK و PKD من خلال الزمالات البحثية العليا من NHMRC. تم دعم ATP من قبل المجلس الوطني للبحوث الصحية والطبية (NHMRC) زمالة التطوير الوظيفي (1003856) ، ومنحة برنامج NHMRC (1054618) واستفاد من الدعم من دعم البنية التحتية التشغيلية لحكومة ولاية فيكتوريا وبرنامج دعم البنية التحتية لمعهد البحوث المستقل التابع للحكومة الأسترالية NHMRC . نعترف بالدكتورة كارول جينس (مركز بيتر ماك كالوم للسرطان ، ملبورن ، فيكتوريا ، أستراليا 3002) للحصول على المشورة والمناقشات حول تأثير مواقع تكامل الكروموسومات على تطور الخلايا ووظيفتها في الفئران المعدلة وراثيًا.


شاهد الفيديو: العبث بالموروث الجيني للإنسان. إلى أين وصلت قضية التوأم الصيني المعدل (ديسمبر 2022).