معلومة

3.3C: الفحص المجهري للتداخل - علم الأحياء

3.3C: الفحص المجهري للتداخل - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أهداف التعلم

  • وصف المبادئ والأنواع المختلفة لمجهر التداخل

مصدر ضوء ستيريو

يستخدم الفحص المجهري للتداخل المنشور لتقسيم الضوء إلى حزمتين متباعدتين قليلاً ثم تمر عبر العينة. ومن ثم فهو يعتمد على قياس الفروق في معامل الانكسار عند إعادة توحيد الشعاعين. يحدث التداخل عندما يكون شعاع الضوء متخلفًا أو متقدمًا بالنسبة إلى الآخر.

هناك ثلاثة أنواع من الفحص المجهري للتداخل: التباين الكلاسيكي والتباين التفاضلي والتباين الفلوري. منذ تقديمه في أواخر الستينيات من القرن الماضي ، أصبح الفحص المجهري للتداخل التفاضلي (DIC) شائعًا في الأبحاث الطبية الحيوية لأنه ينتج صورًا عالية الدقة للهياكل الدقيقة من خلال تحسين الواجهات المتباينة. الصورة الناتجة عبارة عن مقطع بصري رقيق وتظهر ثلاثية الأبعاد مع ظل حولها. هذا يخلق تباينًا عبر العينة يكون ساطعًا من جانب وأغمق من الجانب الآخر.

مجهر التداخل

المجهر هو مجهر ضوئي ذو مجال ساطع مع إضافة العناصر التالية: مستقطب بين مصدر الضوء والمكثف ، ومنشور تقسيم شعاع مدينة دبي للإنترنت ، ومنشور يجمع شعاع مدينة دبي للإنترنت ، ومحلل. يؤدي التلاعب في المنشور إلى تغيير فصل الحزمة ، مما يغير تباين الصورة. عندما تمر الشعاعتان عبر نفس المادة عبر العينة ، لا يحدثان أي تداخل. عندما تمر الشعاعتان عبر مادة مختلفة عبر العينة كما هو الحال على الحواف ، فإنها تنتج التغيير عند الجمع.

تم تطوير مجهر تباين التداخل التفاضلي الفلوري (FLIC) من خلال الجمع بين الفحص المجهري الفلوري مع مدينة دبي للإنترنت لتقليل تأثيرات التبييض الضوئي على الفلوروكرومات المرتبطة بالعينة الملطخة. تم تجهيز نفس المجهر لتصوير عينة في وقت واحد باستخدام مدينة دبي للإنترنت والإضاءة الفلورية.

النقاط الرئيسية

  • يتفوق الفحص المجهري للتداخل على الفحص المجهري متباين الطور في قدرته على التخلص من الهالات والضوء الإضافي.
  • في الفحص المجهري التباين التفاضلي (DIC) ، يتم تحديد فرق المسار البصري بواسطة ناتج فرق معامل الانكسار (بين العينة والوسط المحيط بها) والسمك الذي يجتازه شعاع ضوئي بين نقطتين على المسار البصري.
  • الصور التي تنتجها مدينة دبي للإنترنت لها مظهر مميز للظلال.

الشروط الاساسية

  • photobleaching: تدمير مضان ضوئي كيميائي بواسطة ضوء عالي الكثافة
  • الفلوروكروم: أي من الأصباغ الفلورية المختلفة المستخدمة في تلطيخ المواد البيولوجية قبل الفحص المجهري

المجهر: أنواع المجهر

توضح النقاط التالية ثلاثة عشر نوعًا رئيسيًا من المجاهر. بعض الأنواع هي: مجهر بسيط 2. مجهر مركب 3. مجهر بحث 4. مجهر تشريح ثنائي العينين 5. مجهر تباين طوري 6. مجهر تداخل 7. التداخل التفاضلي التباين الصغير و shyscope 8. مجهر الفلورسنت 9. المجهر الإلكتروني 10. مجهر الكتروني ناقل الحركة وغيرها.

نوع # 1. مجهر بسيط:

1. المجهر البسيط هو عدسة محدبة ذات طول بؤري قصير.

2. يتم استخدامه لتكوين صورة افتراضية لكائن يتم وضعه داخل بؤرته الرئيسية.

3. تتكون من عدسة محدبة واحدة أو مجموعة من العدسات التي تعمل كعدسة محدبة.

4. تقوم العدسة المحدبة بتكبير الكائن وتساعد أيضًا على إنتاج صورة مكبرة لجسم قريب يبدو أنه يقع على مسافة رؤية واضحة.

5. تحت مجهر بسيط ، يتم تشكيل الصورة المكبرة (الشكل 143) للجسم على شبكية عين المشاهد.

6. يمكن لعدسة بسيطة تكبير كائن ثلاث مرات فقط OX). للحصول على تكبير أكثر من 3X ، يتم استخدام مزيج من عدة عدسات. يعمل هذا المزيج من عدة عدسات (تسمى العناصر) كعدسة محدبة واحدة ، ويمكن الحصول على تكبير يبلغ حوالي 20X.

7. المجاهر البسيطة المُحسَّنة ، التي يستخدمها علماء الأحياء أثناء العمل الميداني ، قد تكبر شيئًا حتى 100 مرة. في مثل هذه المجاهر ، يتم استخدام عدسات متعددة و shyelement. وهي تتألف من مزيج من عدسة مقعرة مزدوجة من الزجاج التاجي مثبتة بين عدستين محدبتين مزدوجتين من زجاج الصوان. وهذا ما يسمى aplanarlens أو ثلاثي الوني. تم لصق ثلاث من هذه العدسات المستوية معًا وتعمل كعدسة واحدة.

مجهر تشريح (الشكل 144) هو مثال على مجهر بسيط يستخدم إما لتشريح المادة أو لعرض الصورة المكبرة للمادة. تتكون من وحدة عدسة واحدة فقط. قد تكون وحدة العدسة هذه عبارة عن عدسة مكبرة عادية.

يتم استخدامه إما لتشريح المادة أو لتكبير أقل ، أي فقط 6X ، 12X أو 20X نادرًا. وهي تستخدم بشكل أساسي لفصل الأجنة ، والدراسات التصنيفية ، وما إلى ذلك. ولها قدم قاعدية وطرف. & # 8216stage & # 8217 ، المكون من لوح زجاجي بسيط ، متصل بالطرف.

لأغراض ضبط الضوء ، يتم توصيل المرآة بالطرف الموجود أسفل المسرح. يمكن تحريك المرآة عموديًا بمساعدة برغي ضبط. يوجد على طرف الطرف ذراع مطوي ، يتم تركيب عدسة تكبير محددة عليه (6X ، 12X ، إلخ). يتم تحريك الذراع المطوية لإبقاء العدسة في الموضع المطلوب على المسرح.

يتم وضع المادة المراد عرضها أو تشريحها تحت مجهر تشريح على المسرح. توضع العين بالقرب من العدسة. يتم إمالة الذراع المطوية لجلب العدسة فوق المادة. يتم ضبط الضوء بواسطة حركة المرآة. يتم التركيز بمساعدة مسمار الضبط لهذا المجهر.

نوع # 2. المجهر المركب:

يشتمل المجهر المركب (الشكل 145) على نوعين (أهداف وعينية) أو ثلاثة أنواع (مكثف ، أهداف ، عدسة عينية أو عينية). يقوم المكثف ، الموجود فوق المرآة وأسفل المنصة ، بجمع أشعة الضوء وتركيزها في مستوى الجسم.

يتم تثبيت الأهداف (10x ، 40X ، 100X) على أنف دوار. يتكون كل هدف من مجموعة من العناصر مدمجة معًا لتعمل كعدسة واحدة. تجمع الأهداف أشعة الضوء من الجسم وتشكل صورة حقيقية مكبرة على مسافة ما فوقها (الشكل 146).

تقع العدسات أو العدسات في الجزء العلوي من أنبوب الجسم. عادة ما تحتوي العدسة على عدسات 5X أو 10X أو 15X. تقوم العدسة بتكبير الصورة التي شكلها الهدف (الشكل 146). يُطلق على المجهر ذو العين الواحدة أو العدسة العينية المجهر الأحادي بينما يسمى المجهر الذي يحتوي على عينين بالمجهر ثنائي العين.

1. سميت الأداة بهذا الاسم لأنها تتكون من نظامي عدسات أو أكثر (الشكل 145).

2. في الجزء العلوي توجد العدسة العينية. يمكن قلبه أو إزالته. في الجزء العلوي من العدسة العينية مكتوب 5X أو 10X للدلالة على 5 مرات أو 10 مرات التكبير ، على التوالي.

3. يوجد أسفل العين مباشرة أنبوب للجسم ، يحتوي الطرف السفلي منه على قطعة دائرية تسمى قطعة الأنف. يحتوي على ثلاث عدسات تسمى العدسات الموضوعية. يمكن تدوير قطعة الأنف لتغيير موضع الأهداف.

4. المنصة المسطحة الموجودة أسفل الأهداف تسمى المرحلة.

5. يوجد على ذراع المجهر مقابض تسمى مقبض الضبط الخشن ومقبض الضبط الدقيق.

6. من بين الأهداف الثلاثة ، الأقصر هو هدف الطاقة المنخفضة. لديها أكبر عدسة ولكن قوتها المكبرة هي الأقل من العدسات الموضوعية. على الهدف يمكن أيضًا كتابة 10X كما في عدسة العين. هذا يعني أنه في حالة استخدام عدسة عين 10x ، يكون التكبير 10 X 10 & # 8211 100 مرة.

7. الهدف الآخر هو هدف ذو قوة عالية. تكبيره يساوي الرقم المكتوب عليه مضروبًا في قوة العين ، أي 5X أو 10X (الهدف × العين).

8. الهدف الثالث هو الغمر بالزيت. بشكل عام ، يحتوي على شريط أسود حول الطرف السفلي. يتم استخدام قطرة زيت على الشريحة وقت الدراسة بهدف الغمر بالزيت. يمكن تقدير تكبيره كهدف بصري.

يعد استخدام الزيت أمرًا ضروريًا للحفاظ على أشعة الضوء متوافقة بشكل صحيح مع الهدف الصغير.

9. تحت المرحلة مباشرة يوجد المكثف. وتتمثل وظيفتها في جمع الضوء من المرآة وتوجيهه إلى العدسة الشيئية. يمكن خفض المكثف أو رفعه بواسطة مقبض موجود على جانب واحد من المجهر أسفل المرحلة.

10. يحتوي المكثف على مصراع يسمى غشاء القزحية.

11. يوجد أسفل المكثف مباشرة مرآة لها سطح مسطح وآخر مقعر؟ استخدم السطح المقعر في ضوء النهار. يتم استخدام السطح المستوي للمرآة عند استخدام المصباح الكهربائي.

1. نظف العدسات العينية والموضوعية بورق العدسة ولا تقم بإزالتها.

2. أثناء دراسة شيء ما ، تعلم إبقاء إحدى يديك على مقبض التركيز الدقيق والتركيز باستمرار لأعلى ولأسفل.

3. أثناء دراسة أي نوع من التحضير ، لا تقم بإمالة المجهر.

4. اترك هدف الطاقة المنخفضة في مكانه بعد الانتهاء من جميع الملاحظات.

5. لفحص كائن ، استخدم دائمًا الطاقة المنخفضة أولاً ثم الأهداف الأخرى.

6. لا تسمح مطلقًا للعدسة الموضوعية بضرب المسرح أو الانزلاق أثناء التركيز.

7. استخدم دائمًا الضبط الدقيق مع هدف الطاقة العالية.

8. يجب تغطية جميع المستحضرات التي يتم تركيبها على الماء مسبقًا بغطاء.

9. تجنب عادة إزالة أجزاء المجهر.

10. لا تستخدم هدف الغمر بالزيت بدون زيت.

11. يجب أن يكون الحجاب الحاجز مفتوحًا على مصراعيه أثناء استخدام هدف الغمر بالزيت.

نوع # 3. مجهر البحث:

1. هو مجهر مركب به عدسات عالية الجودة وبعض المرافق الإضافية مثل العدسة الغاطسة بالزيت ، والإضاءة المدمجة ، والعرض المجهر والتركيب لكاميرا التصوير.

2. الهدف 100X يسمى عدسة الغمر بالزيت. يمكن استخدامه فقط عن طريق إدخال قطرة من زيت الغمر بين الهدف وغطاء الزجاج. إذا لم يتم استخدام الزيت ، ستظهر صورة الجسم غير واضحة. الجاذبية النوعية لزيت الغمر تعادل الزجاج.

3. في مرفق الإضاءة المدمج ، يتم استبدال مرآة المجهر بمصباح كهربائي موجود في غرفة مزودة بغشاء.

4. يعني العرض ثنائي العينين أنه بدلاً من عين واحدة يمكن للباحث استخدام كلتا العينين معًا للعرض. بالنسبة لهذا المرفق ، تم تجهيز هذا المجهر بعدستين بدلاً من واحدة.

5. مجاهر مرفقة بكاميرا التصوير مزودة بأنابيب ثلاثية العين. من بين هذه الأنابيب الثلاثة ، يتم تزويد اثنين بنظرين للعرض بالمنظار بينما يستوعب الأنبوب الثالث كاميرا لالتقاط الصور.

6. باستخدام هدف 10x بصري و 100 X ، يمكن الحصول على أقصى تكبير 1500 مرة تحت مجهر البحث.

نوع # 4. مجهر تشريح مجهر:

1. في هذا المجهر يتم تركيب نظامين مجهريين إلى جانب (الشكل 147).

2. مجموعتا العدسات وأهداف هذا المجهر تنتج صورتين تم تركيبهما بواسطة منشورين موجودين داخل الجسم.

3. وجود مساحة كافية بين الهدف والمرحلة. وهذا يساعد في سهولة تشريح المادة والدراسة المناسبة لها.

4. يستخدم هذا المجهر لإجراء تشريح دقيق للعينات ودراسة حواملها الإجمالية لأن الصورة ثلاثية الأبعاد متاحة بسبب مرفق الرؤية المجهر.

5. الحد الأقصى للتكبير الذي تم الحصول عليه بواسطة هذا المجهر هو 150X.

نوع # 5. مجهر تباين الطور:

1. اكتشفه البروفيسور فريتس زرنيك من هولندا. بدأ إنتاجه التجاري لأول مرة في ألمانيا في عام 1942. واعترافًا باكتشافه لتباين الطور ، حصل Zernike على جائزة نوبل في الفيزياء عام 1953.

2. يتم دراسة الخلايا الحية وغير المصبوغة فقط تحت مجهر تباين الطور. يرجع السبب في ذلك إلى أن الخلايا الحية لا تكون ملونة عادةً (أي أنها كائنات طور نقية) ، ولكن الضوء الذي تنتقل بواسطة هياكلها المختلفة سيكون له اختلافات في الطور ناتجة عن كل من الاختلافات في معامل الانكسار الناتج عن التغيرات في تركيز البروتوبلازم والاختلافات في السماكة .

3. هذا مجهر ضوئي مصمم خصيصًا حيث يتم تركيب لوحة الطور الحلقي والحجاب الحاجز الحلقي (الشكل 148).

4. الحجاب الحاجز الحلقي يقع أسفل المكثف. يتكون من قرص دائري به أخدود حلقي دائري. يُسمح لأشعة الضوء بالمرور عبر الأخدود الحلقي. من خلال الأخدود الحلقي للحجاب الحاجز الحلقي ، تسقط أشعة الضوء على العينة أو الشيء المراد دراسته.

في المستوى البؤري الخلفي للهدف يطور صورة. يتم وضع لوحة الطور الحلقي في هذا المستوى البؤري الخلفي. لوحة الطور هذه إما عبارة عن لوحة طور سالبة لها منطقة دائرية سميكة أو لوحة طور موجبة لها أخدود دائري رفيع. تسمى هذه المنطقة السميكة أو الرفيعة في لوحة الطور المنطقة المترافقة. لوحة الطور عبارة عن قرص شفاف.

5. بمساعدة الحجاب الحاجز الحلقي ولوحة الطور ، يتم الحصول على تباين الطور في هذا المجهر. يتم الحصول على ذلك عن طريق فصل الأشعة المباشرة عن الأشعة المنعرجة. تمر أشعة الضوء المباشر عبر الأخدود الحلقي بينما تمر أشعة الضوء المنعرجة عبر المنطقة خارج الأخدود.

6. اعتمادًا على مؤشرات الانكسار المختلفة لمكونات الخلية المختلفة ، يظهر الكائن المراد دراسته درجة مختلفة من التباين في هذا المجهر.

7. ليس هناك حاجة إلى إعداد خاص للتثبيت أو التلوين ، وما إلى ذلك لدراسة كائن تحت مجهر تباين الطور. هذا يوفر الكثير من الوقت للباحث لأنه يمكن رؤية صورة واضحة للخلايا الحية أو غير الملوثة بسهولة تحت هذا المجهر.

8. تطبيقات الفحص المجهري الطوري في البحث البيولوجي عديدة.

من خلال هذا ، يمكن للمرء أن يدرس:

(ط) العمليات الفعلية للانقسام والانقسام الاختزالي في الخلايا الحية

(2) الآثار الفعلية للعديد من المواد الكيميائية على الخلايا الحية

(3) سلوك العديد من الكائنات المجهرية (مثل البروتوزوان) تجاه العوامل الكيميائية والفيزيائية المختلفة و

(4) العمليات المتعلقة بنفاذية غشاء البلازما ، إلخ.

نوع # 6. مجهر التداخل:

1. هذا نوع محسّن من مجهر تباين الطور الذي يعرض التداخل بين الضوء المرسل والذي لا ينتقل عبر العينة.

2. تشير ألوان التداخل التي تم إنتاجها في هذا المجهر إلى اختلافات في معامل الانكسار.

3. ينقسم الضوء في هذا المجهر إلى شعاعين ، أحدهما يمر عبر العينة والآخر يمر عبر شعاع مرجعي. ثم يتم عمل الشعاعين للتدخل في مستوى الصورة. تظهر مناطق العينة التي لها مسارات بصرية متشابهة في الصورة ملونة أو ساطعة بشكل مشابه.

4. يختلف عن مجهر تباين الطور ، في مجهر التداخل ، يتم فصل الموجة المركزية والموجة المنعرجة تمامًا أثناء المرور عبر لوحة الطور.

5. في هذا المجهر ، يتم تثبيت لوحة الطور الحلقي أسفل مكثف المرحلة الفرعية بينما يتم تثبيت لوحة الطور فوق العدسة الشيئية في الهدف. تستخدم العدسة العينية لمراقبة الصورة.

6. يمكن استخدام هذا المجهر لقياس سمك الخلية ومكوناتها. يتم استخدامه أيضًا لتحديد الوزن الجاف للأجسام المجهرية مثل البروتينات والحمض النووي وما إلى ذلك.

نوع # 7. التداخل التفاضلي التباين الصغير و shyscope:

1. يسمى أيضًا مجهر DIC أو مجهر نومارسكي ، وهو نسخة محسنة من مجهر التداخل.

2. في النظام البصري لهذا المجهر ، يتم استخدام شعاع ضوئي واحد فقط.

3. بالمرور من خلال الكائن والهدف والمنشور الانكساري الخاص ، يتم تقسيم شعاع الضوء الفردي إلى أشعة متداخلة.

4. يوجد أيضًا مستقطب ومرشحات محلل ومنشور تعويضي في هذا المجهر.

5. تباين ممتاز بين حواف الخلايا وعضياتها تحت هذا المجهر ، وتأثيرها البصري ثلاثي الأبعاد.

6. على غرار مجهر تباين الطور ، يتم دراسة الخلايا أو المواد غير الملوثة فقط بواسطة هذا المجهر.

نوع # 8. مجهر نيون:

1. هذا نوع متقدم من المجهر الضوئي يتم فيه تشعيع العينة بأطوال موجية والتي ستثير الجسيمات الفلورية الطبيعية أو التي يتم إدخالها بشكل مصطنع. يمتص المرشح البصري لهذا المجهر الأطوال الموجية المثيرة ولكنه ينقل الصورة الفلورية التي يمكن دراستها بشكل طبيعي.

2. هو مجهر يستخدم لرصد التألق في الخلايا والأنسجة. (الإسفار هو فينو وشيمينون يتم فيه تحويل الطول الموجي للضوء فوق البنفسجي غير المرئي إلى طول موجي للضوء في النطاق المرئي).

3. يتكون المجهر الفلوري من (1) مصباح ، (2) النظام البصري ، و (3) نظام للمراقبة.

4. يستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV) كمصدر للإضاءة في هذا المجهر. للحصول على الأشعة فوق البنفسجية ، يتم استخدام مصابيح أقواس الزئبق عالية الضغط أو مصابيح أقواس الزينون أو مصابيح الهالوجين التنجستن. يتم أيضًا تركيب زوج من المحولات (المرشحات التكميلية) فيه. نظرًا لأن الأشعة فوق البنفسجية ضارة بالعين البشرية ، فإن عدسة العين المستخدمة في هذا المجهر مصنوعة من الزجاج العادي. يساعد هذا في منع وصول الأشعة فوق البنفسجية إلى العين ، ولكن يمكن ملاحظة التألق بسهولة.

5. يمكن لهذا المجهر الكشف عن المواد الفلورية (مثل الأصباغ) بسهولة في الخلايا ، حتى لو كانت موجودة في آثار.

6. كما أنها تستخدم في دراسة الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتينات والكروموسوم النطاقات ، وتوطين كروموسوم Y في الإنسان ، والكشف عن الهيتروكروماتين وفي العديد من دراسات علم المناعة.

نوع # 9. المجهر الإلكتروني:

1. المجهر الإلكتروني هو أداة تستخدم الطول الموجي القصير لحزمة الإلكترون ، بدلاً من موجات الضوء ، للحصول على تكبير ودقة عالية جدًا للهياكل الدقيقة التي لا يتناسب معها المجهر الضوئي. يحتوي على مسدس كهربائي ينكسر شعاعه ويركز على عينة بواسطة نظام عدسة إلكتروني. يتم تكبير صورة العينة وعرضها على خشبة المسرح أو شاشة الفلورسنت.

2. على أساس العديد من الأبحاث السابقة في الفيزياء ، كان Knoll و Ruska (1931) من برلين أول من طور مجهر إلكتروني. بمساعدة المجهر الإلكتروني ، يمكنهم تكبير الأشياء حتى 12000 مرة.

بواسطة نوع مُحسَّن من المجهر الإلكتروني تم تطويره بواسطة Borries and Ruska (1938) ، تمكنوا من الحصول على صور ذات تكبير 20000 مرة. في هذا القالب كان تكبير الملف الموضوعي 100 وملف جهاز العرض 200. دقة هذا المجهر كانت 100 درجة.

المجاهر الإلكترونية مع 4-1 OÅ أو حتى دقة أفضل متوفرة الآن.

3. يمكن تحقيق تكبير يصل إلى 1 ، 60000 مرة عن طريق تحويل الملفات الوسيطة بين ملف الهدف وجهاز الإسقاط بالمجهر الإلكتروني.

4. بعض الاختلافات الأساسية (الشكل 149) بين المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني مذكورة في الجدول 13.1.

بعض الاختلافات بين الميكروسكوب الخفيف و shyscope والمجهر الإلكتروني:

1. يستخدم الضوء المرئي في هذا المجهر.

2. يقع مصدر الإضاءة والتألق في الأسفل.

3- بالنسبة للتكبير في هذا المجهر ، يتكون نظام العدسة من عدسات زجاجية ،

4. العدسات قوس العين ، موضوعية وتكثف وتقلل.

5. إما أن تكون الصورة مرئية بالعين أو مسجلة على صورة وفيلم شيجرافي بكاميرا في هذا المجهر.

1. تستخدم الإلكترونات في المجهر الإلكتروني.

2. يقع مصدر الإضاءة في الجزء العلوي في هذا المجهر.

3. يتكون نظام العدسة من ملفات كهرومغناطيسية في هذا المجهر.

4. يحتوي هذا المجهر على ملفات جهاز عرض ، وأداة shytive ومكثف.

5.يتم تسجيل الصورة في المجهر الإلكتروني إما على شاشة فلورية وشفافة أو يتم تسجيلها على فيلم فوتوغرافي.

يتكون المجهر الإلكتروني من مسدس كهربائي وعمود مجهر وملفات كهرومغناطيسية وشاشة فلورية وبعض الملحقات الأخرى الموضحة أدناه:

(أ) يقع مسدس الإلكترون في الجزء العلوي من جسم المجهر. إنه مصدر الإلكترونات. وهي مكونة من خيوط تنجستن محاطة بدرع منحاز بشكل سلبي بفتحة. يتم سحب شعاع الإلكترون من خلال هذه الفتحة.

(ب) يتكون العمود المجهر أو العمود المركزي من أنبوب معدني مفرغ. إنه يحمي الشخص الذي يقوم بتشغيل المجهر من الأشعة السينية التي تتولد عندما تصطدم الإلكترونات بسطح الأنبوب المعدني.

(ج) تشتمل الملفات أو العدسات الكهرومغناطيسية على ملفات جهاز الإسقاط وموضوع ومكثف. في كل ملف ، يتم لف ملفات الأسلاك الكهربائية على أسطوانة معدنية مجوفة. يعمل المجال المغناطيسي ، الناتج عن تمرير التيار الكهربائي عبر الملف المغناطيسي ، كعدسة مكبرة.

(د) يتم استخدام شاشة الفلورسنت لمراقبة الصورة المكبرة للجسم. يظل مغلفًا بمادة كيميائية ، والتي ، عند الإثارة ، تشكل الصورة كما تظهر على شاشة التلفزيون.

(هـ) تشمل بعض الملحقات الأساسية الأخرى للميكروسكوب الإلكتروني محولات الجهد العالي (لتطوير تيار عالي الجهد لمسدس الإلكترون والملفات الكهرومغناطيسية) ، ومضخات تفريغ (للحفاظ على فراغ عالٍ داخل عمود المجهر) ، ونظام تبريد مائي (للوقاية من ارتفاع درجة حرارة الأجزاء المختلفة) ، ومضخة دائرية ، ومحطة تبريد وأيضًا نظام ترشيح & # 8217.

كل هذه الأجزاء تتطلب ترتيبات متقنة وتساهم في الحجم الهائل للميكروسكوب الإلكتروني.

6. يحدث تكوين الصورة في هذا المجهر عن طريق تشتت الإلكترونات. تصطدم الإلكترونات بالنواة الذرية وتتشتت. تشكل هذه الإلكترونات المشتتة صورة الإلكترون. من خلال الإسقاط على شاشة فلورية أو فيلم فوتوغرافي ، يتم تحويل صورة الإلكترون هذه إلى صورة مرئية للكائن.

7. شعاع الإلكترون في هذا المجهر مصنوع من خلال تسريع الإلكترونات من خلال فرق جهد يتراوح بين 1-1500 كيلو فولت في مسدس إلكتروني.

8. يتم دراسة العينات المجففة فقط بواسطة المجهر الإلكتروني. لا يمكن دراسة الخلايا الحية بهذا المجهر لأنها تمتلك الماء الذي يسبب تشتت الإلكترونات على نطاق واسع.

9. يتم قطع المقاطع الرقيقة جدًا (سمك 10-50 نانومتر) ، والتي تكون أرق 200 مرة من تلك المستخدمة بشكل روتيني للفحص المجهري الضوئي ، من أجل الفحص المجهري الإلكتروني. يتم قطع هذه بمساعدة سكاكين الماس أو الزجاج من مشراح فائق.

نوع # 10. مجهر الإرسال الإلكتروني أو TEM:

1. مجهر الإرسال الإلكتروني أو TEM (الشكل 8) هو شكل من أشكال المجهر الإلكتروني حيث يُسمح للإلكترونات بالانتقال عبر الكائنات.

2. يتم إضاءة العينة المراد دراستها بالتساوي بواسطة حزمة عريضة من الإلكترونات عند 40-100 كيلو فولت ، ويتم تشكيل الصورة مباشرة عن طريق تركيز تلك الإلكترونات التي تمر أكثر أو أقل غير مبعثرة عبر العينة إما على شاشة فلورية أو على شاشة فيلم فوتوغرافي.

3. هذا المجهر ذو دقة وضوح جيدة تبلغ 0.3 نانومتر أو أقل ولكنه عادة غير مناسب للعينات الحية.

نوع # 11. مسح المجهر الإلكتروني أو SEM:

1. هذا أيضًا شكل من أشكال المجهر الإلكتروني حيث يتم عمل شعاع دقيق للغاية من الإلكترونات عند 3-30 كيلو فولت لمسح منطقة محددة أو محددة من العينة. هذا في الواقع مزيج من تقنية المجهر الإلكتروني والإلكترونيات التلفزيونية.

2. العينة المراد فحصها عادة ما تكون جسمًا صلبًا. يتم جمع وتحليل الإلكترونات الثانوية ، المنبعثة من السطح أو بالقرب منه. بعد التحليل ، يشكلون إشارة تعدل شعاع أنبوب أشعة الكاثود (الشكل 151) الممسوحة بالتزامن مع حزمة ثانوية.

3. الصور المتكونة في هذا المجهر تشبه تلك التي تظهر في عدسة اليد. يمكن تكبيرها حوالي 100000 مرة.

4. هذا المجهر مفيد للغاية لدراسة الهياكل السطحية للعينات السميكة والخلايا والأنسجة والأغشية.

5. نظرًا لأن الإلكترونات الموجودة في هذا المجهر تشكل الصورة عن طريق انبعاثها من سطح العينة ، فإن الصورة توفر مظهرًا ثلاثي الأبعاد. تتكون هذه الصورة ثلاثية الأبعاد من إلكترونات ثانوية يتم جمعها أولاً وتضخيمها ثم استخدامها لتكوين الصورة على شاشة الفوسفور لأنبوب أشعة الكاثود.

6. يوجد على الأقل أنبوبان لأشعة الكاثود في هذا المجهر ، أحدهما يستخدم للمراقبة البصرية للعينة والآخر يستخدم للتصوير.

نوع # 12. مسح ناقل الحركة Electron Micro & shyscope أو STEM:

1. في مسح المجهر الإلكتروني النافذ أو STEM ، يتم مسح العينة بالطريقة نفسها كما هو الحال في مسح المجهر الإلكتروني أو SEM ولكن يتم جمع الإلكترونات المرسلة واستخدامها لتشكيل الصورة على الشاشة.

2. الميزة الرئيسية لهذا المجهر الإلكتروني هي أنه مزود بأنظمة الكشف. بفضل هذا المرفق ، يمكنه الكشف بشكل منفصل عن الإلكترونات المبعثرة والإلكترونات غير المبعثرة وأيضًا تلك الإلكترونات الموجودة نتيجة لتوليفة الإلكترونات المبعثرة وغير المبعثرة.

نوع # 13. مجهر الاستقطاب:

1. هذا نوع خاص من المجهر الضوئي مزود بمستقطب ومحلل.

2. يستخدم الضوء المستقطب في هذا المجهر لدراسة وجود المكونات ذات التوجه التفضيلي وشكلها واتجاه اتجاهها ومعامل انكسارها في الخلايا والأنسجة.

3. يعتمد مبدأ هذا المجهر على سلوك بعض مكونات الخلية عند ملاحظتها تحت الضوء المستقطب.

4. المستقطب والمحلل ، المكونان الرئيسيان لهذا المجهر ، إما مصنوعان من منشور نيكول أو قرص بولارويد. فوق المستقطب يتم تركيب المكثف. يقع المحلل فوق الهدف. يتم أيضًا إدخال المعوض أو لوحة الجبس بين المستقطب والمحلل.

5. يستخدم هذا المجهر أيضًا لكل من الدراسات الكمية والنوعية في العديد من التخصصات البيولوجية بما في ذلك علم الخلايا والتشريح وعلم الأنسجة وعلم الأمراض.


2.3 أدوات الفحص المجهري

فتح رواد الفحص المجهري الأوائل نافذة على العالم غير المرئي للكائنات الحية الدقيقة. لكن الفحص المجهري استمر في التقدم في القرون التي تلت ذلك. في عام 1830 ، ابتكر جوزيف جاكسون ليستر مجهرًا ضوئيًا حديثًا بشكل أساسي. شهد القرن العشرين تطور المجاهر التي استفادت من الضوء غير المرئي ، مثل الفحص المجهري الفلوري ، الذي يستخدم مصدر ضوء فوق بنفسجي ، والمجهر الإلكتروني ، الذي يستخدم أشعة إلكترونية قصيرة الموجة. أدت هذه التطورات إلى تحسينات كبيرة في التكبير والقرار والتباين. بالمقارنة ، كانت المجاهر البدائية نسبيًا لفان ليفينهوك ومعاصريه أقل قوة بكثير حتى من أكثر المجاهر الأساسية المستخدمة اليوم. في هذا القسم ، سنقوم بمسح النطاق الواسع للتكنولوجيا المجهرية الحديثة والتطبيقات الشائعة لكل نوع من أنواع المجهر.

المجهر الضوئي

تندرج العديد من أنواع المجاهر تحت فئة المجاهر الضوئية ، والتي تستخدم الضوء لتصور الصور. تتضمن أمثلة المجاهر الضوئية مجاهر المجال الساطع ، مجاهر المجال المظلم ، مجاهر تباين الطور ، مجاهر تباين التداخل التفاضلي ، مجاهر التألق ، مجاهر ليزر المسح متحد البؤر ، ومجاهر ثنائية الفوتون. يمكن استخدام هذه الأنواع المختلفة من المجاهر الضوئية لتكمل بعضها البعض في التشخيص والبحث.

مجاهر برايتفيلد

مجهر المجال البراق ، ربما يكون أكثر أنواع المجهر استخدامًا ، هو مجهر مركب به عدستان أو أكثر تنتج صورة داكنة على خلفية ساطعة. بعض مجاهر المجال الساطع هي أحادية العين (لها عدسة واحدة) ، على الرغم من أن معظم مجاهر المجال الساطع الأحدث هي مجهر (لها عدستان) ، مثل المجاهر الموضحة في الشكل 2.12 في كلتا الحالتين ، تحتوي كل عدسة على عدسة تسمى عدسة العين. تقوم العدسات العينية عادة بتكبير الصور 10 مرات (10⨯). في الطرف الآخر من أنبوب الجسم توجد مجموعة من العدسات الموضوعية على قطعة أنف دوارة. عادةً ما يتراوح تكبير هذه العدسات الموضوعية من 4 إلى 100 درجة ، مع تكبير كل عدسة على الغلاف المعدني للعدسة. تعمل العدسات العينية والموضوعية معًا لإنشاء صورة مكبرة. التكبير الكلي هو نتاج تكبير العين مرات التكبير الموضوعي:

على سبيل المثال ، إذا تم تحديد عدسة موضوعية بزاوية 40 درجة وكانت العدسة العينية 10 درجات ، فسيكون التكبير الكلي

العنصر الذي يتم عرضه يسمى عينة. توضع العينة على شريحة زجاجية ، ثم يتم قصها في مكانها على المسرح (منصة) من المجهر. بمجرد تأمين الشريحة ، يتم وضع العينة الموجودة على الشريحة فوق الضوء باستخدام مقابض المرحلة الميكانيكية x-y. تعمل هذه المقابض على تحريك الشريحة على سطح المسرح ، ولكنها لا ترفع أو تنزل المرحلة. بمجرد أن يتم توسيط العينة فوق الضوء ، يمكن رفع موضع المرحلة أو خفضه لتركيز الصورة. يستخدم مقبض التركيز الخشن للحركات واسعة النطاق مع عدسات موضوعية 4⨯ و 10⨯ ، ويستخدم مقبض التركيز الدقيق للحركات صغيرة النطاق ، خاصة مع العدسات الموضوعية 40⨯ أو 100⨯.

عندما يتم تكبير الصور ، فإنها تصبح باهتة نظرًا لوجود ضوء أقل لكل وحدة مساحة من الصورة. لذلك ، تتطلب الصور المكبرة للغاية التي تنتجها المجاهر إضاءة مكثفة. في مجهر المجال الساطع ، يتم توفير هذا الضوء بواسطة جهاز إضاءة ، والذي يكون عادةً مصباحًا عالي الكثافة أسفل المسرح. يمر الضوء المنبعث من خلال العدسة المكثفة (الموجودة أسفل المسرح) ، والتي تركز كل أشعة الضوء على العينة لزيادة الإضاءة إلى أقصى حد. يمكن تحسين موضع المكثف باستخدام مقبض تركيز المكثف المرفق بمجرد تحديد المسافة المثلى ، ولا ينبغي تحريك المكثف لضبط السطوع. إذا كانت هناك حاجة إلى مستويات إضاءة أقل من الحد الأقصى ، يمكن ضبط كمية الضوء التي تضرب العينة بسهولة عن طريق فتح أو إغلاق الحجاب الحاجز بين المكثف والعينة. في بعض الحالات ، يمكن أيضًا ضبط السطوع باستخدام المتغير المتغير ، وهو مفتاح باهتة يتحكم في شدة الإنارة.

ينشئ مجهر المجال الساطع صورة عن طريق توجيه الضوء من المنور في العينة ، ينتقل هذا الضوء أو يمتص أو ينعكس أو ينكسر بشكل تفاضلي بواسطة هياكل مختلفة. يمكن أن تتصرف الألوان المختلفة بشكل مختلف لأنها تتفاعل مع حوامل اللون (أصباغ تمتص وتعكس أطوال موجية معينة من الضوء) في أجزاء من العينة. في كثير من الأحيان ، يتم إضافة الكروموفورات بشكل مصطنع إلى العينة باستخدام البقع ، والتي تعمل على زيادة التباين والدقة. بشكل عام ، ستظهر الهياكل في العينة أغمق ، بدرجات مختلفة ، من الخلفية الساطعة ، مما يؤدي إلى إنشاء صور حادة للغاية عند التكبير حتى حوالي 1000 درجة. قد يؤدي التكبير الإضافي إلى إنشاء صورة أكبر ، ولكن بدون زيادة الدقة. هذا يسمح لنا برؤية الأشياء الصغيرة مثل البكتيريا ، والتي تكون مرئية عند حوالي 400 درجة أو نحو ذلك ، ولكن ليس الكائنات الأصغر مثل الفيروسات.

في حالات التكبير العالية جدًا ، قد تتأثر الدقة عندما يمر الضوء عبر كمية صغيرة من الهواء بين العينة والعدسة. ويرجع ذلك إلى الاختلاف الكبير بين مؤشرات الانكسار للهواء والزجاج ، حيث يشتت الهواء أشعة الضوء قبل أن تتمكن العدسة من تركيزها. لحل هذه المشكلة ، يمكن استخدام قطرة زيت لملء الفراغ بين العينة وعدسة الغمر بالزيت ، وهي عدسة خاصة مصممة للاستخدام مع زيوت الغمر. نظرًا لأن للزيت معامل انكسار مشابه جدًا لمؤشر الزجاج ، فإنه يزيد من أقصى زاوية يمكن للضوء الذي يغادر العينة أن يضرب العدسة عندها. هذا يزيد من الضوء الذي تم جمعه ، وبالتالي دقة الصورة (الشكل 2.13). يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الزيوت لأنواع مختلفة من الضوء.

اتصالات مايكرو

صيانة الميكروسكوب: أفضل الممارسات

حتى المجهر القوي جدًا لا يمكنه تقديم صور عالية الدقة إذا لم يتم تنظيفه وصيانته بشكل صحيح. نظرًا لأن العدسات تم تصميمها وتصنيعها بعناية لكسر الضوء بدرجة عالية من الدقة ، فحتى العدسة المتسخة قليلاً أو المخدوشة ستكسر الضوء بطرق غير مقصودة ، مما يؤدي إلى تدهور صورة العينة. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر المجاهر أدوات دقيقة إلى حد ما ، ويجب توخي الحذر الشديد لتجنب إتلاف الأجزاء والأسطح. من بين أمور أخرى ، تشمل العناية المناسبة بالمجهر ما يلي:

  • تنظيف العدسات بورق العدسات
  • عدم السماح للعدسات بالاتصال بالشريحة (على سبيل المثال ، عن طريق تغيير التركيز بسرعة)
  • حماية المصباح (إن وجد) من الكسر
  • عدم دفع الهدف إلى الانزلاق
  • عدم استخدام مقبض التركيز البؤري الخشن عند استخدام العدسات الموضوعية 40 درجة أو أكثر
  • فقط باستخدام زيت الغمر مع هدف زيتي متخصص ، وعادة ما يكون هدف 100 درجة
  • تنظيف الزيت من العدسات الغاطسة بعد استخدام المجهر
  • تنظيف أي زيت تم نقله عن طريق الخطأ من عدسات أخرى
  • تغطية المجهر أو وضعه في خزانة عندما لا يكون قيد الاستعمال

ارتباط بالتعلم

قم بزيارة المورد عبر الإنترنت المرتبط أدناه للمحاكاة والعروض التوضيحية التي تتضمن استخدام المجاهر. ضع في اعتبارك أن تنفيذ تقنيات وإجراءات محددة يمكن أن يختلف اعتمادًا على الأداة المحددة التي تستخدمها. وبالتالي ، من المهم التعلم والممارسة باستخدام مجهر حقيقي في بيئة معملية تحت إشراف خبير.

مجهر داركفيلد

مجهر المجال المظلم هو مجهر حقل مشرق يحتوي على تعديل صغير ولكنه مهم للمكثف. يتم وضع قرص صغير معتم (قطره حوالي 1 سم) بين الإنارة وعدسة المكثف. هذا الضوء المعتم ، كما يسمى القرص ، يحجب معظم الضوء من المصباح أثناء مروره عبر المكثف في طريقه إلى العدسة الموضوعية ، مما ينتج عنه مخروط مجوف من الضوء يركز على العينة. الضوء الوحيد الذي يصل إلى الهدف هو الضوء الذي انكسر أو انعكس بواسطة الهياكل في العينة. تظهر الصورة الناتجة عادةً كائنات ساطعة على خلفية داكنة (الشكل 2.14).

غالبًا ما ينتج عن الفحص المجهري Darkfield صورًا عالية التباين وعالية الدقة للعينات دون استخدام البقع ، وهو أمر مفيد بشكل خاص لعرض العينات الحية التي قد يتم قتلها أو تعرضها للخطر بسبب البقع. على سبيل المثال ، اللولبيات الرقيقة مثل اللولبية الشاحبة ، العامل المسبب لمرض الزهري ، يمكن رؤيته بشكل أفضل باستخدام مجهر darkfield (الشكل 2.15).

تأكد من فهمك

التركيز السريري

الجزء 2

يمكن أن تحدث التهابات الجروح مثل عدوى سيندي بسبب أنواع مختلفة من البكتيريا ، يمكن أن ينتشر بعضها بسرعة مع مضاعفات خطيرة. يعد تحديد السبب المحدد أمرًا مهمًا للغاية لاختيار دواء يمكن أن يقتل أو يوقف نمو البكتيريا.

بعد الاتصال بطبيب محلي حول حالة سيندي ، ترسل ممرضة المخيم عينة من الجرح إلى أقرب مختبر طبي. لسوء الحظ ، نظرًا لأن المخيم يقع في منطقة نائية ، فإن أقرب مختبر صغير وسيئ التجهيز. من المحتمل أن يستخدم المختبر الأكثر حداثة طرقًا أخرى لاستنبات البكتيريا ونموها والتعرف عليها ، ولكن في هذه الحالة ، يقرر الفني صنع حامل مبلل من العينة ومشاهدته تحت مجهر حقل مشرق. في التركيب المبلل ، تُضاف قطرة صغيرة من الماء إلى الشريحة ، ويتم وضع زلة غطاء فوق العينة لإبقائها في مكانها قبل وضعها أسفل العدسة الموضوعية.

تحت مجهر المجال الساطع ، بالكاد يستطيع الفني رؤية خلايا البكتيريا لأنها شبه شفافة مقابل الخلفية الساطعة. لزيادة التباين ، يقوم الفني بإدراج توقف ضوئي معتم فوق المصباح. تظهر صورة المجال المظلم الناتجة بوضوح أن خلايا البكتيريا كروية ومجمعة في مجموعات ، مثل العنب.

  • لماذا من المهم تحديد شكل وأنماط نمو الخلايا في العينة؟
  • ما هي أنواع الفحص المجهري الأخرى التي يمكن استخدامها بشكل فعال لعرض هذه العينة؟

انتقل إلى مربع التركيز السريري التالي. ارجع إلى مربع التركيز السريري السابق.

مجاهر تباين الطور

تستخدم مجاهر تباين الطور الانكسار والتداخل الناجم عن الهياكل في العينة لإنشاء صور عالية التباين وعالية الدقة دون تلطيخ. إنه أقدم وأبسط أنواع المجاهر التي تخلق صورة عن طريق تغيير الأطوال الموجية لأشعة الضوء التي تمر عبر العينة. لإنشاء مسارات طول موجة متغيرة ، يتم استخدام نقطة توقف حلقي في المكثف. ينتج عن التوقف الحلقي مخروط مجوف من الضوء يركز على العينة قبل الوصول إلى العدسة الشيئية. يحتوي الهدف على لوحة طور تحتوي على حلقة طور. نتيجة لذلك ، يمر الضوء الذي ينتقل مباشرة من المصباح عبر حلقة الطور بينما الضوء ينكسر أو ينعكس بواسطة العينة يمر عبر اللوحة. يؤدي هذا إلى خروج الموجات التي تنتقل عبر الحلقة بمقدار نصف الطول الموجي تقريبًا عن الطور مع الموجات التي تمر عبر الصفيحة. نظرًا لأن الموجات لها قمم وقيعان ، فيمكنها أن تضيف معًا (إذا كانت في طور معًا) أو تلغي بعضها البعض (إذا كانت خارج الطور). عندما تكون الأطوال الموجية خارج الطور ، فإن قيعان الموجة ستلغي قمم الموجة ، وهو ما يسمى التداخل المدمر. تظهر الهياكل التي تكسر الضوء ثم مظلمة على خلفية ساطعة للضوء غير المنكسر فقط. بشكل عام ، ستختلف الهياكل التي تختلف في الميزات مثل معامل الانكسار في مستويات الظلام (الشكل 2.16).

نظرًا لأنه يزيد من التباين دون الحاجة إلى البقع ، غالبًا ما يستخدم الفحص المجهري على تباين الطور لمراقبة العينات الحية. بعض الهياكل ، مثل العضيات في الخلايا حقيقية النواة والأبواغ في الخلايا بدائية النواة ، يتم تصورها جيدًا بشكل خاص باستخدام الفحص المجهري الطوري (الشكل 2.17).

مجاهر التداخل التفاضلي

مجاهر تباين التداخل التفاضلي (DIC) (المعروفة أيضًا باسم بصريات نومارسكي) تشبه مجاهر تباين الطور من حيث أنها تستخدم أنماط التداخل لتعزيز التباين بين الميزات المختلفة للعينة. في مجهر مدينة دبي للإنترنت ، يتم إنشاء حزمتين من الضوء يختلف فيهما اتجاه حركة الموجة (الاستقطاب). بمجرد أن تمر الحزم عبر العينة أو الفضاء الخالي من العينات ، يتم إعادة تجميعها وتسبب تأثيرات العينات اختلافات في أنماط التداخل الناتجة عن تجميع الحزم. ينتج عن هذا صور عالية التباين للكائنات الحية ذات المظهر ثلاثي الأبعاد. هذه المجاهر مفيدة بشكل خاص في تمييز الهياكل داخل العينات الحية غير الملوثة. (الشكل 2.18)

تأكد من فهمك

مجاهر الإسفار

يستخدم مجهر الفلورة الصبغيات الفلورية المسماة الفلوروكرومات ، والتي تكون قادرة على امتصاص الطاقة من مصدر الضوء ثم انبعاث هذه الطاقة كضوء مرئي. تشتمل الفلوروكرومات على مواد فلورية طبيعية (مثل الكلوروفيل) بالإضافة إلى بقع الفلورسنت التي تضاف إلى العينة لإحداث تباين. تعد الأصباغ مثل Texas red و FITC أمثلة على الفلوروكروم. وتشمل الأمثلة الأخرى صبغات الحمض النووي 4 'و 6'-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) والبرتقال أكريدين.

ينقل المجهر ضوء الإثارة ، بشكل عام شكل من أشكال الإشعاع الكهرومغناطيسي بطول موجي قصير ، مثل الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق ، نحو العينة التي تمتص حوامل اللون ضوء الإثارة وتنبعث منها الضوء المرئي بأطوال موجية أطول.ثم يتم تصفية ضوء الإثارة (جزئيًا لأن الأشعة فوق البنفسجية ضارة بالعينين) بحيث يمر الضوء المرئي فقط عبر عدسة العين. ينتج عن هذا صورة للعينة بألوان زاهية على خلفية داكنة.

المجاهر الفلورية مفيدة بشكل خاص في علم الأحياء الدقيقة السريرية. يمكن استخدامها لتحديد مسببات الأمراض ، للعثور على أنواع معينة داخل البيئة ، أو للعثور على مواقع جزيئات وهياكل معينة داخل الخلية. تم أيضًا تطوير مناهج للتمييز بين الخلايا الحية والميتة باستخدام الفحص المجهري الفلوري بناءً على ما إذا كانت تأخذ شكل فلوروكروم معين. في بعض الأحيان ، يتم استخدام الفلوروكروميات المتعددة في نفس العينة لإظهار هياكل أو ميزات مختلفة.

أحد أهم تطبيقات الفحص المجهري الفلوري هو تقنية تسمى التألق المناعي ، والتي تستخدم لتحديد بعض الميكروبات المسببة للأمراض من خلال مراقبة ما إذا كانت الأجسام المضادة مرتبطة بها. (الأجسام المضادة هي جزيئات بروتينية ينتجها الجهاز المناعي وترتبط بمسببات أمراض معينة لقتلها أو تثبيطها.) هناك طريقتان لهذه التقنية: مقايسة التألق المناعي المباشر (DFA) ومقايسة التألق المناعي غير المباشر (IFA). في DFA ، تكون الأجسام المضادة المحددة (على سبيل المثال ، تلك التي تستهدف فيروس داء الكلب) ملطخة بالفلوروكروم. إذا كانت العينة تحتوي على العامل الممرض المستهدف ، فيمكن للمرء أن يلاحظ ارتباط الأجسام المضادة بالعامل الممرض تحت المجهر الفلوري. وهذا ما يسمى بصمة الأجسام المضادة الأولية لأن الأجسام المضادة الملطخة تلتصق مباشرة بالعامل الممرض.

في IFA ، تكون الأجسام المضادة الثانوية ملطخة بالفلوروكروم بدلاً من الأجسام المضادة الأولية. لا ترتبط الأجسام المضادة الثانوية مباشرة بالعوامل الممرضة ، لكنها ترتبط بالأجسام المضادة الأولية. عندما ترتبط الأجسام المضادة الأولية غير الملوثة بالعامل الممرض ، يمكن ملاحظة ارتباط الأجسام المضادة الثانوية الفلورية بالأجسام المضادة الأولية. وبالتالي ، فإن الأجسام المضادة الثانوية ترتبط بشكل غير مباشر بمسببات الأمراض. نظرًا لأن العديد من الأجسام المضادة الثانوية يمكن أن ترتبط غالبًا بجسم مضاد أولي ، فإن IFA يزيد من عدد الأجسام المضادة الفلورية المرتبطة بالعينة ، مما يسهل تصور الميزات في العينة (الشكل 2.19).

تأكد من فهمك

مجاهر متحد البؤر

في حين أن الأشكال الأخرى من الفحص المجهري للضوء تخلق صورة يتم تركيزها إلى أقصى حد على مسافة واحدة من المراقب (العمق ، أو المستوى z) ، يستخدم مجهر متحد البؤر الليزر لمسح عدة مستويات z على التوالي. ينتج عن هذا العديد من الصور ثنائية الأبعاد عالية الدقة على أعماق مختلفة ، والتي يمكن إنشاؤها في صورة ثلاثية الأبعاد بواسطة الكمبيوتر. كما هو الحال مع المجاهر الفلورية ، تستخدم البقع الفلورية بشكل عام لزيادة التباين والدقة. يتم تحسين وضوح الصورة بشكل أكبر من خلال فتحة ضيقة تقضي على أي ضوء ليس من المستوى z. وبالتالي فإن المجاهر متحد البؤر مفيدة جدًا لفحص العينات السميكة مثل الأغشية الحيوية ، والتي يمكن فحصها حية وغير مثبتة (الشكل 2.20).

ارتباط بالتعلم

استكشف عرضًا دوارًا ثلاثي الأبعاد للبيوفيلم كما لوحظ تحت مجهر متحد البؤر. بعد الانتقال إلى صفحة الويب ، انقر فوق الزر "تشغيل" لبدء تشغيل الفيديو.

مجاهر ثنائية الفوتون

في حين أن المجاهر الفلورية الأصلية والمتحد البؤرية سمحت بتصور أفضل للميزات الفريدة في العينات ، لا تزال هناك مشاكل حالت دون التصور الأمثل. كانت الحساسية الفعالة للفحص المجهري الفلوري عند عرض العينات السميكة محدودة بشكل عام بسبب التوهج خارج التركيز ، مما أدى إلى ضعف الدقة. تم تقليل هذا القيد بشكل كبير في المجهر متحد البؤر من خلال استخدام ثقب متحد البؤر لرفض مضان الخلفية خارج التركيز مع أقسام بصرية رقيقة (& lt1 μm) غير واضحة. ومع ذلك ، حتى المجاهر (كنفوكل) تفتقر إلى الدقة اللازمة لعرض عينات الأنسجة السميكة. تم حل هذه المشكلات من خلال تطوير المجهر ثنائي الفوتون ، والذي يستخدم تقنية المسح ، والكروم الفلوري ، والضوء طويل الموجة (مثل الأشعة تحت الحمراء) لتصور العينات. تعني الطاقة المنخفضة المرتبطة بالضوء ذي الطول الموجي الطويل أن فوتونين يجب أن يضربا موقعًا في نفس الوقت لإثارة الفلوروكروم. تكون الطاقة المنخفضة لضوء الإثارة أقل ضررًا للخلايا ، كما أن الطول الموجي الطويل لضوء الإثارة يخترق بسهولة أكبر في العينات السميكة. وهذا يجعل المجهر ثنائي الفوتون مفيدًا لفحص الخلايا الحية داخل الأنسجة السليمة - شرائح المخ والأجنة والأعضاء الكاملة وحتى الحيوانات بأكملها.

حاليًا ، يقتصر استخدام المجاهر ثنائية الفوتون على المعامل السريرية والبحثية المتقدمة بسبب التكلفة العالية للأدوات. عادة ما يكلف مجهر واحد ثنائي الفوتون ما بين 300000 دولار و 500000 دولار ، كما أن أشعة الليزر المستخدمة لإثارة الأصباغ المستخدمة في العينات باهظة الثمن أيضًا. ومع ذلك ، مع تحسن التكنولوجيا ، قد تصبح المجاهر ثنائية الفوتون متاحة بسهولة أكبر في البيئات السريرية.

تأكد من فهمك

المجهر الإلكتروني

الحد الأقصى للدقة النظرية للصور التي تم إنشاؤها بواسطة المجاهر الضوئية محدود في النهاية بأطوال موجات الضوء المرئي. يمكن لمعظم المجاهر الضوئية أن تكبر فقط 1000 درجة ، وبعضها يمكن أن يكبر حتى 1500 درجة ، لكن هذا لا يبدأ في الاقتراب من القوة المكبرة للميكروسكوب الإلكتروني (م)، والذي يستخدم أشعة إلكترونية قصيرة الموجة بدلاً من الضوء لزيادة التكبير والدقة.

يمكن للإلكترونات ، مثل الإشعاع الكهرومغناطيسي ، أن تتصرف كموجات ، ولكن بأطوال موجية تبلغ 0.005 نانومتر ، يمكنها إنتاج دقة أفضل بكثير من الضوء المرئي. يمكن أن تنتج EM صورة حادة يمكن تكبيرها حتى 100000 درجة. وبالتالي ، يمكن لل EMs حل الهياكل تحت الخلوية وكذلك بعض الهياكل الجزيئية (على سبيل المثال ، خيوط مفردة من الحمض النووي) ومع ذلك ، لا يمكن استخدام المجهر الإلكتروني على المواد الحية بسبب الطرق اللازمة لإعداد العينات.

هناك نوعان أساسيان من EM: المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) (الشكل 2.21). يشبه TEM إلى حد ما مجهر الضوء الساطع من حيث الطريقة التي يعمل بها. ومع ذلك ، فإنه يستخدم شعاعًا إلكترونيًا من أعلى العينة يتم تركيزه باستخدام عدسة مغناطيسية (بدلاً من عدسة زجاجية) ويتم عرضه من خلال العينة على كاشف. تمر الإلكترونات عبر العينة ، ثم يلتقط الكاشف الصورة (الشكل 2.22).

لكي تمر الإلكترونات عبر العينة في TEM ، يجب أن تكون العينة رفيعة للغاية (سمكها 20-100 نانومتر). تم إنتاج الصورة بسبب التعتيم المتفاوت في أجزاء مختلفة من العينة. يمكن تعزيز هذا العتامة عن طريق تلطيخ العينة بمواد مثل المعادن الثقيلة ، والتي تكون كثيفة الإلكترون. يتطلب TEM أن تكون الحزمة والعينة في فراغ وأن تكون العينة رفيعة جدًا ومجففة. تتم مناقشة الخطوات المحددة اللازمة لإعداد عينة للمراقبة تحت EM بالتفصيل في القسم التالي.

تشكل SEM صورًا لأسطح العينات ، عادةً من الإلكترونات التي يتم إخراجها من العينات بواسطة حزمة من الإلكترونات. يمكن أن يؤدي ذلك إلى إنشاء صور مفصلة للغاية ذات مظهر ثلاثي الأبعاد يتم عرضها على الشاشة (الشكل 2.23). عادة ، يتم تجفيف العينات وتحضيرها بمثبتات تقلل من القطع الأثرية ، مثل الذبول ، التي يمكن إنتاجها عن طريق التجفيف ، قبل أن يتم تغليفها بطبقة رقيقة من المعدن مثل الذهب. في حين أن المجهر الإلكتروني للإرسال يتطلب أقسامًا رفيعة جدًا ويسمح للمرء برؤية الهياكل الداخلية مثل العضيات وداخل الأغشية ، يمكن استخدام الفحص المجهري الإلكتروني لعرض أسطح الأجسام الأكبر (مثل حبوب اللقاح) وكذلك أسطح عينات صغيرة جدا (الشكل 2.24). يمكن لبعض EMs تكبير صورة تصل إلى 2،000،000 درجة. 1

تأكد من فهمك

  • ما هي بعض مزايا وعيوب المجهر الإلكتروني ، مقابل الفحص المجهري الضوئي ، لفحص العينات الميكروبيولوجية؟
  • ما هي أفضل أنواع العينات التي يتم فحصها باستخدام TEM؟ SEM؟

اتصالات مايكرو

استخدام المجهر لدراسة الأغشية الحيوية

البيوفيلم عبارة عن مجتمع معقد من نوع واحد أو أكثر من الكائنات الحية الدقيقة ، يتشكل عادةً كطلاء لزج متصل بسطح بسبب إنتاج مادة خارج البوليمر (EPS) تلتصق بسطح أو عند السطح البيني بين الأسطح (على سبيل المثال ، بين الهواء و الماء). في الطبيعة ، الأغشية الحيوية وفيرة وتحتل في كثير من الأحيان منافذ معقدة داخل النظم البيئية (الشكل 2.25). في الطب ، يمكن أن تغطي الأغشية الحيوية الأجهزة الطبية وتوجد داخل الجسم. نظرًا لامتلاكها خصائص فريدة ، مثل زيادة المقاومة ضد الجهاز المناعي والأدوية المضادة للميكروبات ، فإن الأغشية الحيوية لها أهمية خاصة لعلماء الأحياء الدقيقة والأطباء على حد سواء.

نظرًا لأن الأغشية الحيوية سميكة ، لا يمكن ملاحظتها جيدًا باستخدام الفحص المجهري الضوئي لتقطيع الأغشية الحيوية لإنشاء عينة أرق قد تقتل أو تزعج المجتمع الميكروبي. يوفر الفحص المجهري متحد البؤر صورًا أوضح للأغشية الحيوية لأنه يمكن أن يركز على مستوى z واحد في كل مرة وينتج صورة ثلاثية الأبعاد لعينة سميكة. يمكن أن تساعد الأصباغ الفلورية في تحديد الخلايا داخل المصفوفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تقنيات مثل التألق المناعي والتهجين في الموقع (FISH) ، حيث يتم استخدام مجسات الفلورسنت لربط الحمض النووي.

يمكن استخدام المجهر الإلكتروني لمراقبة الأغشية الحيوية ، ولكن فقط بعد تجفيف العينة ، مما يؤدي إلى إنتاج قطع أثرية غير مرغوب فيها وتشويه العينة. بالإضافة إلى هذه الأساليب ، من الممكن متابعة التيارات المائية من خلال الأشكال (مثل المخاريط والفطر) للأغشية الحيوية ، باستخدام فيديو لحركة الخرز المطلي الفلوريسنت (الشكل 2.26).

الفحص المجهري للمسبار

مجهر مسبار المسح لا يستخدم الضوء أو الإلكترونات ، بل يستخدم مجسات حادة للغاية يتم تمريرها فوق سطح العينة وتتفاعل معها مباشرة. ينتج عن ذلك معلومات يمكن تجميعها في صور ذات تكبير يصل إلى 100،000،000 درجة. يمكن استخدام مثل هذه التكبيرات الكبيرة لمراقبة الذرات الفردية على الأسطح. حتى الآن ، تم استخدام هذه التقنيات في المقام الأول للبحث وليس التشخيص.

هناك نوعان من مجهر مسبار المسح: مجهر المسح النفقي (STM) ومجهر القوة الذرية (AFM). يستخدم STM مسبارًا يتم تمريره فوق العينة مباشرة حيث يؤدي انحياز الجهد المستمر إلى إنشاء احتمال لتيار كهربائي بين المسبار والعينة. يحدث هذا التيار عبر نفق الكم للإلكترونات بين المسبار والعينة ، وتعتمد شدة التيار على المسافة بين المسبار والعينة. يتحرك المسبار أفقياً فوق السطح ويتم قياس شدة التيار. يمكن أن يحدد الفحص المجهري النفقي بشكل فعال بنية الأسطح بدقة يمكن من خلالها اكتشاف الذرات الفردية.

على غرار STM ، تمتلك AFM مسبارًا رقيقًا يتم تمريره فوق العينة مباشرةً. ومع ذلك ، بدلاً من قياس التغيرات في التيار عند ارتفاع ثابت فوق العينة ، ينشئ AFM تيارًا ثابتًا ويقيس التغيرات في ارتفاع طرف المجس أثناء مروره فوق العينة. عندما يتم تمرير طرف المجس فوق العينة ، تتسبب القوى بين الذرات (قوى فان دير فال ، والقوى الشعرية ، والترابط الكيميائي ، والقوى الكهروستاتيكية ، وغيرها) في تحريكها لأعلى ولأسفل. يتم تحديد وقياس انحراف طرف المجس باستخدام قانون مرونة هوك ، ويتم استخدام هذه المعلومات لإنشاء صور لسطح العينة بدقة على المستوى الذري (الشكل 2.27).

يلخص الشكل 2.28 والشكل 2.29 والشكل 2.30 تقنيات الفحص المجهري للمجاهر الضوئية والمجاهر الإلكترونية ومجاهر المسح الضوئي على التوالي.

تأكد من فهمك

  • أيهما ذو تكبير أعلى أم مجهر ضوئي أم مجهر مسبار مسح؟
  • قم بتسمية ميزة واحدة وقيود واحدة للمسح المجهري للمسبار.

الحواشي

    "JEM-ARM200F مجهر إلكتروني ناقل الحركة ،" شركة JEOL USA Inc، http://www.jeolusa.com/PRODUCTS/TransmissionElectronMicroscopes٪28TEM٪29/200kV/JEM-ARM200F/tabid/663/Default.aspx#195028-specifications. تم الوصول إليه في 8/28/2015.

بصفتنا مشاركًا في Amazon ، فإننا نكسب من عمليات الشراء المؤهلة.

هل تريد الاستشهاد بهذا الكتاب أو مشاركته أو تعديله؟ هذا الكتاب هو Creative Commons Attribution License 4.0 ويجب أن تنسب OpenStax.

    إذا كنت تعيد توزيع هذا الكتاب كله أو جزء منه بتنسيق طباعة ، فيجب عليك تضمين الإسناد التالي في كل صفحة مادية:

  • استخدم المعلومات أدناه لتوليد اقتباس. نوصي باستخدام أداة استشهاد مثل هذه.
    • المؤلفون: نينا باركر ، مارك شنيغورت ، آنه هيو ثي تو ، فيليب ليستر ، بريان إم فورستر
    • الناشر / الموقع الإلكتروني: OpenStax
    • عنوان الكتاب: Microbiology
    • تاريخ النشر: 1 نوفمبر 2016
    • المكان: هيوستن ، تكساس
    • عنوان URL للكتاب: https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction
    • عنوان URL للقسم: https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-3-instruments-of-microscopy

    © أغسطس 20 ، 2020 OpenStax. محتوى الكتاب المدرسي الذي تنتجه OpenStax مرخص بموجب ترخيص Creative Commons Attribution License 4.0. لا يخضع اسم OpenStax وشعار OpenStax وأغلفة كتب OpenStax واسم OpenStax CNX وشعار OpenStax CNX لترخيص المشاع الإبداعي ولا يجوز إعادة إنتاجه دون الحصول على موافقة كتابية مسبقة وصريحة من جامعة رايس.


    الفحص المجهري للتداخل في بيولوجيا الخلية: المنهجية والتطبيقات

    منذ إدخاله في بيولوجيا الخلية بواسطة كورتيس في عام 1964 ، تم استخدام المجهر الانعكاسي للتداخل (IRM) من قبل عدد متزايد من الباحثين لدراسة تفاعلات الركيزة الخلوية في الخلايا الحية في الثقافة. باستخدام أهداف منع الانعكاس ، يمكن الآن الحصول على صور IRM عالية التباين بسهولة. من النظريات المختلفة حول تكوين الصورة في IRM التي تم طرحها ، يمكن ملاحظة أن نمط التداخل الصفري يتم إنشاؤه في فتحة عددية عالية الإضاءة. ينتج عن هذا معلومات عن قرب الاتصال بين الخلية والركيزة ، مع اضطراب طفيف فقط بسبب الانعكاسات من سطح الخلية الظهرية. لذلك ، يعد الاستخدام السليم لفتحات الإضاءة أمرًا بالغ الأهمية. ومع ذلك ، يجب تفسير صور IRM بحذر ، خاصةً تحت صفائح السيتوبلازم الرقيقة. لا يمكن استخدام IRM الكمي إلا باستخدام نموذج رياضي لقياس التداخل ذي الفتحة المضيئة المحدودة ومع قياس مستقل لسمك الخلية لقيم تصل إلى 1 ميكرون. تم تطبيق IRM نوعيًا على عدد كبير من أنواع الخلايا ، ويبدو أن هناك نوعين عالميين من الالتصاق. جهات الاتصال البؤرية هي مناطق صغيرة من أقرب موضع للركيزة الخلوية ، ربما للاتصال المباشر ، والتي ترتبط بالنهاية البعيدة لحزم خيوط الأكتين. إنها هياكل ارتباط ثابتة تثبت الخلية في مكانها وفي شكلها المنتشر. جهات الاتصال القريبة هي مناطق واسعة ذات مسافة منخفضة من الخلية إلى الركيزة. إنها التصاقات أضعف ولكنها ديناميكية للغاية تحافظ على الحركات السريعة للخلايا أو أجزاء الخلية فوق الركيزة. على الرغم من أن عددًا من الملاحظات المستقلة تشير إلى أن أنماط الالتصاق للخلايا المحولة بشكل خبيث تختلف عن تلك الخاصة بنظيراتها الطبيعية ، فلا يوجد ارتباط بسيط بين الورم الخبيث في الجسم الحي وتكوين التلامس المتغير في المختبر. يبدو أن نمط الالتصاق يتحدد بالحالة الحركية للخلايا وليس بنسيجها الأصلي. أخيرًا ، يمكن أيضًا استخدام IRM لتحسين التباين في صور الاستعدادات الثابتة.

    تنبيهات البريد الإلكتروني

    استشهد بها

    الفائز بجائزة JCS لعام 2020: تادايوشي موراكاوا

    تهانينا إلى تادايوشي موراكاوا ، الذي فاز بجائزة JCS لعام 2020 عن ورقته البحثية بعنوان "الشبكة الليزوزومية الأنبوبية المعتمدة على الالتهام الذاتي تزامن النشاط التدريجي المطلوب لإعادة تشكيل العضلات". اكتشف المزيد عن تادايوشي واقرأ ورقته البحثية الفائزة.

    ميزات FocalPlane. سلسلة ندوات عبر الإنترنت

    نحن & rsquore متحمسون للإعلان عن سلسلة ندوات الويب الجديدة "FocalPlane & hellip". لتغطية جميع جوانب الفحص المجهري ، انضم إلينا في أول ثلاثاء من كل شهر للاستماع إلى أحدث الأبحاث والمشاركة في جلسة شبكات افتراضية مع المتحدث بعد ذلك.

    6 يوليو
    المتحدث: إيفا نوجاليس

    3 أغسطس
    المتحدث: مايكل داستن

    تعرف على محرري JCS

    على الرغم من أن الاجتماعات الشخصية لا تزال معلقة ، إلا أننا نسعد دائمًا بالدردشة حول JCS و The Company of Biologists. المحررون لدينا في الخارج ، تقريبًا بالطبع ، خلال شهري مايو ويونيو:

    عالم الخلية الذي يجب مراقبته - Liang Ge

    الآن في سنته الرابعة من إدارة مختبره الخاص ، يخبرنا Liang Ge عن رحلته إلى أن يصبح باحثًا رئيسيًا في جامعة Tsinghua ، ويناقش الالتهام الذاتي و UPS ، ويشاركنا أفضل النصائح المتعلقة بالعلوم التي تلقاها.

    قراءة اتفاقية نشرها مع EIFL

    يسعدنا أن نعلن أن الباحثين في 30 دولة نامية وتلك التي تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقالية يمكنهم الاستفادة من النشر المفتوح الفوري والخالي من الرسوم في Journal of Cell Science بعد اتفاقية جديدة مع Electronic Information for Libraries (EIFL).

    لدينا الآن أكثر من 200 مؤسسة في أكثر من 20 دولة وستة اتحادات مكتبات تشارك في مبادرة القراءة والنشر. اكتشف المزيد واطلع على القائمة الكاملة للمؤسسات المشاركة.


    قام جودفري هونسفيلد وآلان كورماك بتطوير جهاز التصوير المقطعي المحوسب (CAT). بمساعدة الكمبيوتر ، يجمع الجهاز بين العديد من صور الأشعة السينية لتوليد مناظر مقطعية بالإضافة إلى صور ثلاثية الأبعاد للأعضاء والهياكل الداخلية.

    لاحظ جون فينابلز وسي جيه هارلاند أنماط التشتت الخلفي للإلكترون (EBSP) في المجهر الإلكتروني الماسح. يوفر EBSP معلومات هيكلية دقيقة كمية حول الطبيعة البلورية للمعادن والمعادن وأشباه الموصلات والسيراميك.


    نظرة عامة على الحديث

    يستقصي الفحص المجهري للاستقطاب تفاعل الجزيئات مع الضوء المستقطب وهو جيد بشكل خاص لفحص الهياكل جيدة الترتيب المكونة من البوليمرات ، مثل المغزل الانقسامي. تصف هذه المحاضرة مكونات مجهر الاستقطاب (مثل المستقطب والمحلل) والانكسار وكيفية استغلاله لتوليد الصور وتعديل مجهر الاستقطاب وأمثلة للصور وطرق جديدة مثل LC-Polscope.

    أسئلة

    1. صواب أم خطأ: يشع مصباح التنجستن ضوءًا مستقطبًا.
    2. أي من العبارات التالية ينطبق على الفحص المجهري للاستقطاب؟
      1. يتم توجيه المستقطب والمحلل بحيث تكون اتجاهات انتقالهما موازية لبعضها البعض.
      2. يمكن أن ينقسم الضوء المستقطب المستوي إلى موجتين انتشار مختلفتين تنتقلان بسرعات مختلفة عبر مادة الانكسار.
      3. عادة ما يتم وضع المعوض بعد المحلل وقبل العدسة / الكاميرا.
      4. يجعل المعوض جميع أجزاء العينة أكثر إشراقًا من الخلفية.
      1. لأنه أحد أكبر الهياكل في الخلية
      2. لأن الأنابيب الدقيقة موجهة في نفس الاتجاه وهناك فرق معامل الانكسار للضوء الذي يسافر بشكل موازٍ مقابل عمودي على محور المغزل.
      3. يحتوي توبولين على قيمة معامل انكسار كبيرة
      4. يقوم المغزل بإزاحة الطول الموجي للضوء المضيء قليلاً نحو اللون الأحمر.
      1. يجب أن يكون مصدر الإضاءة بطول موجي واحد للضوء الأخضر.
      2. إذا تم محاذاة المحور البطيء للعضلة مع المحور البطيء للوحة الحمراء ، فستظهر العضلة باللون الأزرق.
      3. يمكن استخدام الصفيحة الحمراء لتحديد المحور السريع والبطيء للألياف العضلية.
      4. إذا تم محاذاة المحور البطيء للعضلة مع المحور البطيء للوحة الحمراء ، فستظهر العضلات باللون الأصفر.

      الإجابات

      1. خاطئة.(يتم توجيه المذبذبات الجزيئية في خيوط التنغستن بشكل عشوائي وبالتالي ينبعث منها الضوء في جميع الزوايا.)
      2. ب
      3. ب
      4. أربعة
      5. ج

      الفحص المجهري الضوئي والفيديو

      المجهر الضوئي والفيديو ، الطبعة الثالثة يوفر رحلة خطوة بخطوة عبر الفلسفة وعلم النفس والبصريات الهندسية والفيزيائية المشاركة في تفسير الصور التي تشكلها المجاهر الضوئية. يتناول الكتاب التعقيدات اللازمة لإنشاء مجاهر ضوئية تسمح للمرء بتصور عينات شفافة ، وفي هذه العملية ، تحديد الخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة للعينات كميًا. يتضمن هذا الإصدار المحدث أحدث التطورات في مجال الفحص المجهري ، مما يضمن استمرار كونه الدليل الأكثر شمولاً وسهولة في الاستخدام وغنية بالمعلومات حول الفحص المجهري الضوئي. من خلال عرضه للبصريات الهندسية ، فإنه يساعد القارئ في فهم تكوين الصورة وحركة الضوء داخل المجهر.

      المجهر الضوئي والفيديو ، الطبعة الثالثة يوفر رحلة خطوة بخطوة عبر الفلسفة وعلم النفس والبصريات الهندسية والفيزيائية المشاركة في تفسير الصور التي تشكلها المجاهر الضوئية. يتناول الكتاب التعقيدات اللازمة لإنشاء مجاهر ضوئية تسمح للمرء بتصور عينات شفافة ، وفي هذه العملية ، تحديد الخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة للعينات كميًا. يتضمن هذا الإصدار المحدث أحدث التطورات في مجال الفحص المجهري ، مما يضمن استمرار كونه الدليل الأكثر شمولاً وسهولة في الاستخدام وغنية بالمعلومات حول الفحص المجهري الضوئي. من خلال عرضه للبصريات الهندسية ، فإنه يساعد القارئ في فهم تكوين الصورة وحركة الضوء داخل المجهر.


      التعليم في المجهر والتصوير الرقمي

      على مدى العقود العديدة الماضية ، أصبح الفحص المجهري الفلوري أداة أساسية لفحص مجموعة متنوعة من الجزيئات والمسارات والديناميكيات البيولوجية في الخلايا الحية والأنسجة والحيوانات بأكملها. على عكس التقنيات الأخرى (مثل المجهر الإلكتروني) ، فإن التصوير الفلوري متوافق مع الخلايا التي يتم الاحتفاظ بها في المزرعة ، مما يتيح المراقبة الضوئية القائمة على الحد الأدنى من التدخل للأحداث التي تحدث على مدى كبير من النطاقات الزمنية. من حيث الدقة المكانية ، يمكن للعديد من التقنيات ، بما في ذلك التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، والتصوير بالرنين المغناطيسي ، والتصوير المقطعي بالتماس البصري ، أن تولد صورًا للحيوانات والبشر بدقة تتراوح بين 10 سنتيمترات و 10 ميكرومتر ، في حين أن تقنيات المجهر الإلكتروني والمسح الضوئي تتميز بأعلى مستوى مكاني القرار ، وغالبًا ما يقترب من المستويات الجزيئية والذرية (انظر الشكل 1). بين هذين النقيضين في القدرة على التحليل يكمن المجهر الضوئي. بصرف النظر عن الفوائد المستمدة من القدرة على تصوير الخلايا الحية ، فإن العيب الأكثر أهمية لجميع أشكال الفحص المجهري الفلوري (بما في ذلك المجال الواسع والمسح بالليزر والقرص الدوار ومضاعف الفوتون والانعكاس الداخلي الكلي) هي حدود الدقة المكانية التي تم توضيحها أولاً ووصفها إرنست آبي في أواخر القرن التاسع عشر.

      حاليًا ، يمكن لتقنيات الفحص المجهري المتألق الحديثة والراسخة حل مجموعة متنوعة من الميزات في الخلايا والأنسجة المعزولة ، مثل النواة ، والميتوكوندريا ، ومركب جولجي ، والهيكل الخلوي ، والشبكة الإندوبلازمية. غالبًا ما تُستخدم أنماط التصوير المختلفة في التألق لتتبع البروتينات وإشارات الببتيدات ديناميكيًا ، وكذلك لمراقبة التفاعلات الأخرى في الخلايا الحية. ومع ذلك ، فإن الدقة المكانية المحدودة تمنع القدرة على حل الهياكل المهمة بما في ذلك الحويصلات المتشابكة أو الريبوسومات أو التفاعلات الجزيئية ، والتي تتميز جميعها بنطاقات حجم تقع تحت حدود الاكتشاف في الفحص المجهري الفلوري. يتحكم حد الانعراج في الفحص المجهري البصري بحقيقة أنه عند تصوير مصدر نقطي للضوء ، ينتج الجهاز بقعة بؤرية غير واضحة ومحدودة الحجم في مستوى الصورة لها أبعاد تتحكم في الحد الأدنى للمسافة التي يمكن عندها التمييز بين نقطتين . في المستوى الجانبي (x ، y) ، تتميز البقعة البؤرية بالتناقص التدريجي للحلقات الخارجية متحدة المركز ويشار إليها باسم قرص Airy ، بينما في البعد المحوري ، يُعرف النمط الإهليلجي بوظيفة انتشار النقطة (PSF). التعبيرات الرسمية التي قدمها Abbe للدقة الجانبية والمحورية في المجهر البصري هي:

      الدقة x، y = & # 955/2 [& # 951 & # 8226 sin (& # 945)] (1) Resolution z = 2 & # 955 / [& # 951 & # 8226 sin (& # 945)] 2 ( 2)

      حيث & # 955 هو الطول الموجي للضوء (الإثارة في التألق) ، & # 951 يمثل معامل الانكسار لوسط التصوير ، والمصطلح المشترك & # 951 & # 8226 sin (& # 945) يُعرف بالفتحة العددية الموضوعية (نسبة غير معلومة). تحتوي الأهداف المستخدمة بشكل شائع في الفحص المجهري على فتحة عددية أقل من 1.5 ، مما يقيد المصطلح & # 945 في المعادلات (1) و (2) إلى أقل من 70 درجة (على الرغم من أن الأهداف الجديدة عالية الأداء تقترب عن كثب من هذا الحد). لذلك ، فإن حد الدقة النظري عند أقصر طول موجي للإثارة العملية (حوالي 400 نانومتر) يبلغ حوالي 150 نانومتر في البعد الجانبي ويقترب من 400 نانومتر في البعد المحوري عند استخدام هدف له فتحة عددية تبلغ 1.40. من الناحية العملية لتصوير البروتين الفلوري الأخضر المحسن (EGFP) في الخلايا الحية ، تبلغ هذه القيم حوالي 200 و 500 نانومتر ، على التوالي (انظر الشكل 2 (أ)). وبالتالي ، لا يمكن حل الهياكل التي تقع بالقرب من 200 نانومتر في المستوى الجانبي باستخدام إما مجهر واسع المجال أو مضان متحد البؤر.

      ظل حد حيود آبي (أو على الأقل الاعتراف بهذا الحد) قائما لما يقرب من قرن قبل أن يبدأ علماء الميكروسكوب المبتكرون في دراسة كيفية تحسين أدواتهم لتجاوز الحواجز المادية من أجل تحقيق دقة أعلى. نظرًا لحقيقة أن الدقة المحورية أقل بكثير من الدقة الجانبية (بمعامل اثنين على الأقل) ، فإن الكثير من العمل الذي تم إجراؤه في الجزء الأخير من القرن العشرين تناول تحسينات في الأداء في البعد المحوري. اكتشف الباحثون أن أدوات المسح بالليزر المتحد البؤر أنتجت زيادات متواضعة جدًا في الدقة على حساب الإشارة إلى الضوضاء ، وأن التقنيات الأخرى المرتبطة بها (بما في ذلك تعدد الفوتون ، والإضاءة المهيكلة ، والقرص الدوار) يمكن استخدامها للتقسيم البصري ، ولكن دون تحسين كبير في القرار المحوري. من المفاهيم المهمة التي يجب ملاحظتها ، وواحدة من أكثر الحقائق التي لا تحظى بالتقدير والمرتبطة بالتصوير البصري في علم الأحياء ، أن دقة المجهر التي تم تحقيقها في كثير من الأحيان لا تصل إلى الحد المادي الذي يفرضه الانعراج. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن عدم التجانس البصري في العينة يمكن أن يشوه طور حزمة الإثارة ، مما يؤدي إلى حجم بؤري أكبر بكثير من مثالي محدود الانعراج. علاوة على ذلك ، يمكن أيضًا المساس بالدقة عن طريق المحاذاة غير الصحيحة للميكروسكوب ، واستخدام زيت غمر غير متوافق ، وغطاء غطاء له سمك خارج النطاق الأمثل ، وأطواق تصحيح معدلة بشكل غير صحيح.

      يتجلى جانب مهم آخر لحد الدقة الأساسي في الفحص المجهري البصري من خلال مدى الجزء غير المتلاشي لوظيفة النقل البصري للأداة (OTF) ، والتي يمكن حسابها باستخدام تحويل فورييه لوظيفة انتشار النقطة. يحدد OTF مدى فقدان الترددات المكانية التي تحتوي على معلومات حول العينة أو الاحتفاظ بها أو تخفيفها أو إزاحتها أثناء التصوير (الشكل 2 (ب)). لا يمكن استرداد معلومات التردد المكاني التي ضاعت أثناء عملية التصوير ، لذا فإن أحد الأهداف الأساسية لجميع أشكال الفحص المجهري هو الحصول على أعلى نطاق تردد ممكن من العينة. في الفحص المجهري التقليدي ، فإن المطلب السائد لتحقيق هذا الهدف هو التأكد من أن التألق المنبعث يتناسب خطيًا مع الكثافة المحلية لإضاءة الإثارة. على عكس حالة الضوء المنعكس والمرسل ، فإن انبعاث التألق غير متماسك بسبب النطاق الترددي الطيفي الكبير والطبيعة العشوائية للاسترخاء الإلكتروني لإنتاج فوتونات ثانوية.

      في أوائل التسعينيات ، تمكنت الأدوات التي تتميز بالأهداف المتعارضة التي طورها ستيفان هيل ، وماتس جوستافسون ، وديفيد أغارد ، وجون سيدات (التقنيات المسماة 4Pi و I 5 M) من تحقيق تحسين في الدقة المحورية إلى حوالي 100 نانومتر باستخدام تكوينات متحد البؤر وعريض المجال ، على التوالى. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه الأدوات كانت قادرة على إنتاج زيادة بمقدار خمسة أضعاف في الدقة المحورية ، إلا أن الدقة الجانبية ظلت غير محسنة. في وقت لاحق من التسعينيات ، تمكنت تقنية المجهر الجديدة بشكل أساسي التي ابتكرها ستيفان هيل من التغلب على حد الانحراف الجانبي لدقة آبي ، مما أدى في النهاية إلى ثورة في الفحص المجهري الفلوري. ونتيجة لذلك ، تم تقديم مجموعة واسعة من المنهجيات الجديدة والمثيرة مؤخرًا والتي يطلق عليها الآن بشكل جماعي الفحص المجهري فائق الدقة وتتميز بدقة أفقية ومحورية تقاس بعشرات النانومترات وحتى أقل. الخيط المشترك في كل هذه التقنيات الجديدة هو أنها قادرة على حل الميزات الواقعة تحت حد الانعراج عن طريق تشغيل الفلور وإيقافه بالتتابع في الوقت المناسب بحيث يمكن تسجيل الإشارات على التوالي.

      تم تحقيق أهم التطورات في التصوير فائق الدقة فيما يسمى بالمجهر للمجال البعيد والذي يتضمن إما تعديل الانتقال مكانيًا أو مؤقتًا بين حالتين جزيئيتين من الفلوروفور (مثل التبديل بين الحالة المظلمة والمشرقة) أو عن طريق تقليل ماديًا حجم وظيفة انتشار النقطة المستخدمة في إضاءة الإثارة. من بين الطرق التي تعمل على تحسين الدقة عن طريق تعديل PSF ، تتم الإشارة إلى أهم التقنيات من خلال الاختصارات STED (استنفاد الانبعاثات المحفز من مختبر Stefan Hell) و SSIM (الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية المشبعة الذي ابتكره Mats Gustafsson). تشمل التقنيات التي تعتمد على الكشف والتوطين الدقيق للجزيئات المفردة PALM (الفحص المجهري الموضعي النشط ضوئيًا الذي قدمه Eric Betzig و Harald Hess) و STORM (الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي الذي أبلغ عنه Xiaowei Zhang لأول مرة). كما سيتم مناقشته ، هناك العديد من الاختلافات في هذه التقنيات ، بالإضافة إلى الطرق المتقدمة التي يمكن أن تجمع أو حتى تحسن أداء مخططات التصوير الحالية. والأهم من ذلك ، أن تقنيات الدقة الفائقة الجديدة يتم تقديمها بسرعة مذهلة تقريبًا (مقارنة بالتطورات التقليدية في الفحص المجهري) وليس من غير المعقول أن نقترح أنه في مرحلة ما في المستقبل القريب ، قد يكون من الممكن تحقيق دقة نانومتر واحد في الأدوات التجارية .

      عودة إلى الأعلى ^ الفحص المجهري البصري القريب من المجال

      قبل مناقشة تقنية الدقة العالية للمسح المجهري البصري للمجال القريب (NSOM) بإيجاز ، من المهم التمييز بين مفاهيم المجال القريب والمجال البعيد ، والتي تم "استعارتها" من نظرية الإشعاع الكهرومغناطيسي المطورة لتقنية الهوائي و تطبق على الفحص المجهري. هناك اختلافان أساسيان بين المفاهيم التي تتضمن حجم منطقة العينة المضيئة والمسافة الفاصلة بين مصدر الإشعاع والعينة ، ولكن يتم تحديد الحد الفاصل بين المنطقتين بشكل غامض فقط. في مجهر المجال القريب ، يتم تصوير العينة داخل منطقة ذات نصف قطر أقصر بكثير من الطول الموجي للإضاءة. في المقابل ، يضع الفحص المجهري للمجال البعيد العينة عدة آلاف من الأطوال الموجية بعيدًا عن الهدف (غالبًا مليمتر أو أكثر) ومحدودة في الدقة من خلال حيود جبهات الموجة الضوئية أثناء مرورها عبر الفتحة الخلفية الموضوعية. تعتبر معظم المجاهر التقليدية ، بما في ذلك تلك المستخدمة في التصوير الضوئي المرسل (المجال الساطع ، مدينة دبي للإنترنت ، وتباين الطور) ، مضان واسع النطاق ، متحد البؤر ، ومضاعف الفوتون أدوات بعيدة المجال ومحدودة الانعراج.

      تلتف مجاهر المجال القريب على حاجز الحيود من خلال استغلال الخصائص الفريدة للموجات الزائلة. في الممارسة العملية ، يتم وضع فتحة الكاشف النانوي بجوار العينة على مسافة أقصر بكثير من الطول الموجي للإضاءة (مما يؤدي إلى ظهور مصطلح المجال القريب) للكشف عن موجات الضوء غير المنتشرة المتولدة على السطح. الدقة محدودة فقط بالحجم المادي للفتحة بدلاً من الطول الموجي للضوء المضيء ، بحيث يمكن تحقيق الدقة الجانبية والمحورية بمقدار 20 نانومتر و 2 إلى 5 نانومتر ، على التوالي. يتم إنشاء التباين من خلال معامل الانكسار ، أو التركيب الكيميائي ، أو الإجهاد المحلي ، أو خصائص انبعاث التألق للمجسات المستخدمة لتلطيخ العينة. ومع ذلك ، فإن الطابع الموجي الزائل لتقنية التصوير هذه يحيل تطبيق الفحص المجهري للمجال القريب في علم الأحياء إلى فحص أسطح الخلايا بدلاً من التحقيق في الأحداث الأكثر تعقيدًا وإثارة للاهتمام التي تحدث داخل السيتوبلازم. تنطبق قيود مماثلة على تقنيات الفحص المجهري للمسبار (مثل القوة الذرية).

      نظرًا لأنها لا تتطلب مضانًا ، فإن تقنيات الفحص المجهري قريب المدى واعدة لتصوير المواد غير المنبعثة ، مثل أسطح أشباه الموصلات أو الأغشية الرقيقة باستخدام آليات التباين التي تتضمن تشتت رامان أو التحليل الطيفي أو التداخل أو الضوء المستقطب أو الامتصاص أو أي نوع آخر من الإشارة الضوئية. تم تحقيق قرارات في المدى بين 2 و 15 نانومتر ، اعتمادًا على جودة الطرف وشدة المجال المحددة. ومع ذلك ، يجب أن تحتوي العينة على تضاريس متغيرة ببطء (خالية من الوديان أو التلال المفاجئة) من أجل تجنب الاصطدام بالمسبار والضرر المحتمل لكلا الكيانين. حصل إريك بيتزيج ، المخترع المشارك لـ PALM ، على أول صورة فائقة الدقة لعينة بيولوجية في عام 1992 باستخدام الفحص المجهري البصري للمجال القريب. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام NSOM للتحقيق في التنظيم النانوي للعديد من بروتينات الغشاء ، ولكن بشكل عام ، هذا النوع من النهج يمثل تحديًا ، وكما نوقش أعلاه ، فهو غير مناسب للتصوير داخل الخلايا.

      عودة إلى أعلى الصفحة ^ تحسينات الدقة المحورية: I 5 M و 4 Pi Microscopy

      يمكن أن يؤدي التداخل بين مصدرين أو أكثر من مصادر الضوء المثير إلى إنتاج نمط إضاءة دوري في مستوى العينة. ينتج عن تفاعل هذا النمط مع البنية الفرعية المفصلة بدقة لعينة الفلورسنت انبعاثًا يحتوي على معلومات دقة أعلى مما هو متاح باستخدام تقنيات الإضاءة المجهرية التقليدية. بدلاً من ذلك ، يمكن الحصول على تأثير دقة مماثل عندما يتم جمع انبعاث التألق بأهداف مزدوجة ودمجها للتدخل في مستوى صورة الكاميرا. لذلك في معظم الحالات ، تزاوج تكوينات الفحص المجهري للتداخل هدفين متعارضين يتم وضعهما على كل جانب من جوانب العينة (المحصورة بين أغطية رقيقة انظر الشكل 3 (أ)). يؤدي استخدام هدفين إلى زيادة الفتحة العددية (يوسع الزاوية الصلبة للفتحة) من المجهر لإنتاج دقة وضوح محسنة. في الحالة المثالية ، سيؤدي استخدام هدفين إلى وظيفة انتشار النقطة المتماثلة في الأبعاد المحورية والجانبية. على الرغم من أن الأسماء تشير إلى تناسق مثالي في وظيفة انتشار النقطة (الكرة الكاملة لها زاوية صلبة 4 & # 960) ، فإن تقنيات التداخل و 4Pi المجهري التي تمت مناقشتها أدناه النهج ولكنها لا تصل إلى هذه الهندسة تمامًا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لتعطل جودة نمط التداخل عند السفر عبر الأنسجة السميكة ، فإن هذه التقنيات تقتصر عمومًا على استخدامها مع العينات الرقيقة ، مثل الخلايا الملتصقة.

      حدث أول تحسن كبير في دقة المجاهر محدودة الانعراج في المجال البعيد خلال منتصف التسعينيات مع إدخال تقنيتين تعرفان باسم تداخل الصورة و 4Pi المجهري. تستخدم كلتا المنهجيتين هدفين متعارضين للفتحة العددية في تكوينات مضان متحد البؤر أو مجال الليزر لتوفير زيادة كبيرة (وصولاً إلى ما يقرب من 100 نانومتر) في الدقة المحورية (الشكل 3). التصوير المجهري لتداخل الصورة ، غالبًا ما يُشار إليه بالاختصار I n M ، هو أسلوب واسع النطاق يستخدم الأهداف المتجاورة لتصوير نفس مستوى العينة. أبسط نسخة ، I 2 M ، تجمع انبعاث الفلورة من خلال كلا الهدفين وتعيد تجميع الإشارات في مسار ضوء مشترك في الكاشف. نظرًا لحقيقة أن مسار الضوء لكل حزمة منشئة له نفس الطول ، فإن تداخل الإشارات ينتج نمطًا مميزًا على مستوى الصورة. يمكن معالجة سلسلة من الصور التي تم جمعها في مستويات بؤرية مختلفة (في خطوات 35 نانومتر تقريبًا) بعد الحصول عليها لاستخراج المعلومات المكانية عالية الدقة في الاتجاه المحوري. القرار الجانبي لم يتغير.

      في تعديل يذكرنا بالفحص المجهري لموجة التألق الدائمة (SWFM) ، تستخدم التقنية الأكثر تقدمًا لـ I 3 M الإضاءة من خلال كلا الهدفين لإنتاج أنماط الإثارة التي تحتوي على العقد والعقد المضادة في المستوى البؤري حيث تكون الحزم قادرة على التدخل بشكل بناء. نظرًا لحقيقة أن العينة مضاءة بشكل متساوٍ عبر مجال الرؤية بالكامل ، ولكن الإثارة تقتصر على الأقسام الفرعية المحورية ، فقد تم تحسين الدقة المحورية فقط. مزيج من تقنيات تداخل الصور الموصوفة أعلاه الموصوفة أعلاه I 5 M قادرة على تحقيق دقة محورية تزيد عن ثلاثة أضعاف في متحد البؤر وسبعة أضعاف في أوضاع التصوير واسعة النطاق. نظرًا لأنه يتم جمع جميع الصور من مجال رؤية كبير ، فإن الحصول على البيانات لكل إطار يكون أسرع بكثير مما هو معتاد في تقنيات مسح النقاط البؤرية. ومع ذلك ، من أجل الحفاظ على تردد أخذ العينات الذي يمليه معيار Nyquist (قياسين لكل وحدة دقة) ، يجب التقاط المقاطع البصرية المحورية بفواصل زمنية تتراوح من 35 إلى 45 نانومتر. وبالتالي ، فإن تجميع مكدس المقطع البصري يمكن أن يتطلب عدة دقائق. لقد قيدت الفصوص الجانبية الكبيرة التي تم إنتاجها في الفحص المجهري I 5 M (كما هو موضح في الشكل 3 (ب)) التقنية لاستخدامها فقط مع الخلايا الثابتة لأن وسط تصاعد معامل الانكسار العالي ضروري للتصوير.

      تستفيد تقنية الدقة العالية نسبيًا للفحص المجهري 4Pi أيضًا من الأهداف المتعارضة ، ولكن على عكس I 5 M ، ينتج عن تقارب إضاءة الإثارة بالليزر واجهات موجية يتم تجميعها بشكل متماسك في نقطة بؤرية مشتركة بدلاً من المستوى البؤري بأكمله. في بعض تطبيقات المجهر 4Pi ، يتم جمع واجهات الموجة الكروية لانبعاث التألق بشكل متماسك في الكاشف. نتيجة لذلك ، يزيد التداخل البناء في واجهة الموجة من الدقة المحورية إلى ما يقرب من 100 نانومتر ويولد وظيفة انتشار النقطة التي تكون أضيق بمقدار 1.5 مرة من الفحص المجهري متحد البؤر في الأبعاد الجانبية وسبعة أضعاف في الاتجاه المحوري. ومع ذلك ، نظرًا لحقيقة أن واجهة الموجة الموسعة لا تزال غير كروية تمامًا ، فإن البقعة البؤرية تعرض فصوصًا في البعد المحوري فوق المستوى البؤري وتحته. نتيجة لذلك ، غالبًا ما يستخدم الفحص المجهري 4Pi مع الإثارة ثنائية الفوتون ، مما يقلل من إشارة الفص بسبب تأثير التربيع (الشكل 3 (ج)). يعتبر التفكيك الرياضي لبيانات الصورة الأولية إلزاميًا أو اختياريًا ، اعتمادًا على تكوين المجهر.

      عودة إلى الأعلى ^ مفهوم RESOLFT

      تم تطوير الأساس النظري الضروري لتحقيق الدقة تحت حاجز الحيود ، والذي يتكون في الواقع من مجموعة من المفاهيم الفيزيائية ، من قبل ستيفان هيل ومشاركوه مع إدخالهم لفكرة انتقالات التألق الضوئي القابلة للانعكاس (أو القابلة للتحويل) (RESOLFT) . يركز هذا المخطط على مجسات الفلورسنت التي يمكن تبديلها ضوئيًا بشكل عكسي بين حالة الفلورسنت "تشغيل" وحالة "إيقاف التشغيل" المظلمة (أو بين أي حالتين A و B). إن الطبيعة الدقيقة لهذه الحالات متغيرة ويمكن أن تكون الأرض والحالات المفردة المثارة (S 0 و S 1) من الفلوروفور كما سيتم مناقشته أدناه للفحص المجهري STED ، والحالات المفردة المفعمة بالحيوية والحالات الثلاثية المظلمة المستخدمة في استنفاد حالة الأرض ( GSD) والفحص المجهري لجزيء عودة استنفاد الحالة الأرضية (GSDIM) ، أو الحالات الساطعة والمظلمة للفلوروفور القابل للانعكاس الضوئي (مثل Cy5 ، أو تأجيج البروتين الفلوري ، أو Dronpa). على النقيض من ذلك ، فإن العديد من البروتينات الفلورية المضيئة للميزة الضوئية ، مثل Eos و Kaede و Dendra2 و PA-GFP ، والتي يمكن تحويلها ضوئيًا بشكل دائم من عرض نطاق انبعاث إلى آخر من خلال التعديلات الجزيئية التساهمية إلى العمود الفقري متعدد الببتيد (وكانت بمثابة الأساس لتجارب PALM الأولى) ، ليست مجسات مناسبة لـ RESOLFT لأن التغييرات في حالة الفلورسنت لا يمكن عكسها. يتضمن مفهوم RESOLFT أيضًا تبديل حالات الأزمرة (مثل رابطة الدول المستقلة - ترانس) وغيرها من التحولات ثنائية الاستقرار بصريًا في الفلوروفور.

      بالنسبة لأي فئة من مجسات الفلوروفور أو فئة من مجسات الفلورسنت ، يكون عدد الحالات القابلة للتحويل محدودًا بشكل صارم ، لذا فليس من المستغرب أن العديد من تقنيات RESOLFT وتقنيات الدقة الفائقة أحادية الجزيء الموضحة أدناه تعتمد على آليات تبديل فلوروفور مماثلة. من أجل فهم هذه الخصائص المشتركة بشكل أفضل ، من المفيد إجراء فحص دقيق للمبادئ الأساسية وراء التحولات الضوئية غير المتماسكة. عندما ينتقل الجزيء الضوئي من حالة إلى أخرى ، فإن احتمال بقاء الجزيء في الحالة الأولى يتناقص بطريقة أسية مع زيادة شدة ضوء الإثارة. يستخدم مصطلح شدة التشبع لتحديد شدة الضوء التي يحدث عندها انتقال التبديل (على سبيل المثال ، عندما تنتقل 50 بالمائة من الجزيئات من الظلام إلى الساطع) وتتناسب عكسياً مع عمر الحالتين. في الحالات التي تتجاوز فيها شدة ضوء الإثارة شدة التشبع ، يصبح من المحتمل جدًا أن يبدأ أحد الفوتونات الواردة عملية التبديل الضوئي. ستوفر الفلوروفورات ذات الأعمار الطويلة في حالات التبديل الأولية والنهائية مزيدًا من الحرية في اختيار شدة الإثارة وغالبًا ما تظهر مستويات إجهاد أعلى (مقياس للقدرة على التبديل الضوئي بشكل متكرر قبل أن يتم تدميرها). تتميز مجسات الفلورسنت المختلفة المستخدمة في الفحص المجهري فائق الدقة بأعمار تختلف اختلافًا كبيرًا ، وكذلك شدة التشبع اللازمة لاستدعاء التبديل الضوئي.

      من بين الاختلافات بين مفهوم RESOLFT (الذي يشمل التقنيات ذات الصلة لـ STED و GSD) ومنهجية الجزيء الفردي التي يستخدمها PALM و STORM هي آليات التبديل وشدة ضوء الإثارة اللازمة لتحقيقات الفلورسنت الضوئية. تعد الشدة العالية للغاية ضرورية لإيقاف تشغيل الحالة المفردة المثارة باستخدام STED (باستخدام ما يسمى ليزر الاستنفاد) ، ولكن التحول إلى حالة ثلاثية متقاربة أو حالة مظلمة مماثلة (GSD) يتطلب شدة ضوء تتراوح بين ألف ومليون مرة. وبالمثل ، فإن شدة الإثارة الأقل قادرة على التبديل بين الحالات المظلمة والمشرقة المنتقلة للبروتينات الفلورية القابلة للتحويل الضوئي. وبالتالي ، يمكن لتقنيات التوطين أحادية الجزيء أن تستوعب مصادر الضوء الأقل قوة مع توفير مجالات رؤية أكبر بكثير. من أجل الحصول على إحداثيات الجزيئات التي تم تبديلها ضوئيًا ، يتم استهداف مناطق معينة من العينة إما عن طريق تحديد مناطق المسح (STED ، GSD ، RESOLFT) أو يُسمح لمركبات الفلور الفردية بالتشغيل والإيقاف العشوائي في جميع أنحاء مجال الرؤية (PALM و STORM ). تملي العوامل المختلفة المتضمنة في هذه التقنيات المعلمات التجريبية ، مثل سرعة التصوير وتعقيد الأداة وحساسية الكشف.

      يظهر في الشكل 4 العديد من المفاهيم الأكثر أهمية المحيطة بالتصوير الفائق الدقة باستخدام تقنيات RESOLFT. يصور مخطط طاقة Jablonski المبسط (الشكل 4 (أ)) الأرضية الإلكترونية المحتملة والحالات المثارة المرتبطة بالتحولات البصرية القابلة للانعكاس ، مثل رابطة الدول المستقلة - المشابهات العابرة المرتبطة ببروتينات الفلورسنت القابلة للتحويل الضوئي (كما هو موضح في الشكل 4 ( ج) لبروتين Kindling الفلوري). تبرز ملامح ليزر النضوب 1-5 في الشكل 4 (ب) المنطقة المكانية التي يوجد فيها الفلوروفور في الحالة A (أو الحالة "on") في المناطق التي تظهر فيها الموجة الدائمة لضوء النضوب شدة بين 10 (ملف تعريف 1) و 1000 (ملف التعريف 5) ضعف كثافة التشبع (كما هو موضح في المعادلة (3)) ، وعقدة صفرية عند xi. مع زيادة شدة الليزر المستنفد ، يتم تقليل المنطقة التي يكون فيها الفلوروفور قادرًا على الإقامة في الحالة A لتوليد زيادة لاحقة في الدقة الجانبية. يوضح تمثيل الإطار السلكي ثلاثي الأبعاد (الشكل 4 (د)) لمحات الليزر الاستنفاد والإثارة تعديل وظيفة نقطة الانتشار بواسطة تقنيات RESOLFT.

      يتم إجراء التبديل الضوئي المستهدف لـ RESOLFT (كما هو معمم لـ STED و GSD) عن طريق التحكم المكاني في توزيع كثافة ضوء الليزر المستنفد بحيث يمكن تشغيل عدد محدود من الجزيئات بينما تظل غالبية الجزيئات الأخرى في حالة إيقاف التشغيل. وبالتالي ، عندما يتم تحديد طول موجي محدد له شدة محددة (أعلى بكثير من كثافة التشبع) لإيقاف تشغيل الفلوروفور ، يتم استخدام هذا الضوء بطريقة معدلة مكانيًا لتقييد الفلوروفورات المتبقية في حالة التشغيل إلى حد حاد منطقة محددة. لذلك ، يتم تحديد الدقة (العرض الكامل بنصف أقصى FWHM) لوظيفة انتشار النقطة باستخدام هذه التقنيات بالمعادلة التالية:

      حيث & # 955 هو الطول الموجي لضوء الإثارة والمصطلح المشترك & # 951 & # 8226 sin (& # 945) هو الفتحة العددية الموضوعية ، كما هو موضح أعلاه لصيغة Abbe الكلاسيكية (المعادلة (1)). المتغير a هو معلمة تأخذ في الاعتبار شكل شعاع الليزر المنضب المعدل مكانيًا ، والذي يتجلى غالبًا في شكل شكل خط أو "دونات" به عقدة صفرية مركزية (انظر الشكل 4 (ب)). تحت الجذر التربيعي ، I max هي ذروة شدة ليزر الاستنفاد و I هي كثافة التشبع للفلوروفور الذي يتم تصويره. في الحالات التي يكون فيها I max يساوي صفرًا ، تقلل المعادلة (3) إلى حد انعراج Abbe. على العكس من ذلك ، عندما يكون الحد الأقصى أكبر بكثير من كثافة تشبع الفلوروفور (في الواقع ، تزداد قيمة الجذر التربيعي) ، تصبح وظيفة انتشار النقطة ضيقة جدًا ويتم تحقيق الدقة الفائقة. على سبيل المثال ، عندما يكون الحد الأقصى / I يساوي 100 ، يكون التحسن في الدقة حوالي عشرة أضعاف. وبالتالي ، بالاتفاق مع النظرية ، فإن دقة الانحراف الفرعي تحت مقاييس حد آبي مع الجذر التربيعي لشدة الضوء التي تستنفد الحالة الأرضية. يتم التحكم في دقة جميع الطرق التي تعتمد على القراءة المستهدفة لتحقيقات الفلورسنت ، بما في ذلك RESOLFT و STED و GSD و SSIM ، بواسطة المعادلة (3) بغض النظر عن آلية التبديل الفلورية أو المعلمات الهندسية للتشكيل المكاني (دونات أو الخط) التي تمليها تكوين المجهر.

      تتطلب تقنيات RESOLFT مسح العينة بعقدة صفرية في مجال الليزر المستنفد ، ولكن ليس بالضرورة باستخدام حزمة واحدة أو منطقة صفرية محصورة هندسيًا في نقطة. يمكن أيضًا استخدام العديد من الخطوط أو الأصفار المظلمة بالاقتران مع كاشف الكاميرا الرقمية لصفيف المنطقة التقليدي (CCD) ، بشرط أن تكون الأصفار أو الخطوط المظلمة متباعدة عن الحد الأدنى للمسافة التي يتطلبها حد دقة الانعراج. المسح فقط بالخطوط المظلمة يزيد من الدقة في اتجاه جانبي واحد ، لكن المسح المتكرر بعد تدوير النمط متبوعًا بفك الارتباط الرياضي يمكن أن يوفر دقة انحراف فرعي عبر المحور الجانبي. الشرط الأساسي لمسح العينة هو السبب الذي يجعل انتقالات RESOLFT (A / B أو تشغيل / إيقاف) قابلة للعكس. يجب أن تكون الجزيئات في حالة واحدة قادرة على العودة إلى حالتها الأخرى عندما يتم فحصها بواسطة العقدة الصفرية. لاحظ أن النضوب المشبع للجزيئات في الحالة المثارة باستخدام نقطة بؤرية للعقدة الصفرية ينتج وظيفة انتشار نقطة فائقة الدقة لا تقتصر على طول الموجة ولكن فقط من خلال شدة الليزر المستنفد.

      ميزة أخرى جذابة لمفهوم RESOLFT هي أن أبسط آلية لتحقيق الانتقال البصري المشبع هي إثارة الفلوروفور بشكل مكثف فيما يمكن اعتباره تطبيقًا "معكوسًا" للنهج. في هذه الحالة ، يتم استنفاد الحالة الأرضية (S 0) ومن المتوقع أن يقيم الفلوروفور إلى حد كبير في حالة الفلورسنت (S 1). لا تزال مبادئ RESOLFT نفسها التي تمت مناقشتها أعلاه سارية ، باستثناء أن الحالة العكسية أصبحت الآن متألقة بحيث يتم إنشاء مناطق مظلمة عالية التحديد محاطة بمناطق الفلورسنت الزاهية. والنتيجة هي صورة "سلبية" لتفاصيل العينة ، والتي يمكن عكسها لاحقًا لإنشاء الصورة النهائية من خلال المعالجة الرياضية بعد الاستحواذ. يمكن أن تكون المناطق المظلمة إما خطوطًا تم إنشاؤها بواسطة أنماط التداخل أو كعكات ثلاثية الأبعاد. في حالة الكعك ، ستكون النتيجة أحجامًا داكنة ثلاثية الأبعاد محصورة بجدران ذات تألق شديد. تستخدم الإضاءة الهيكلية المشبعة (SSIM) والمجهر المجهري لإثارة النمط المشبع (SPEM) هذا النهج مع الأشكال الهندسية على شكل خط لتحقيق صور فائقة الدقة. يتمثل القيد الأساسي لتقنية RESOLFT العكسية في الحسابات الإلزامية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية المطلوبة للحصول على الصورة النهائية.

      معروض في الشكل 5 صور عالية الدقة لحبات الفلورسنت 50 نانومتر جنبًا إلى جنب مع ملامح الكثافة التي تم إنشاؤها بواسطة طبقة موحدة من صبغة الفلورسنت مضاءة بواسطة شعاع غاوسي المعدل بنمط الخط في الفحص المجهري المشبع المنظم للإضاءة. في الفحص المجهري ويديفيلد ، تظهر حبات الفلورسنت دقة ضعيفة (الشكل 5 (أ)) وتظهر ككتلة غير واضحة. ينتج عن التصفية الرياضية لصورة المجال العريض (الشكل 5 (ب)) تحسنًا ضئيلًا ، لكن الإضاءة الخطية المنظمة (الشكل 5 (ج)) تنتج دقة أعلى. يتم تحقيق الزيادة الأكثر دراماتيكية في الدقة الجانبية باستخدام SSIM (الشكل 5 (د)) باستخدام ثلاثة أوامر توافقية (الشكلان 5 (هـ) و (و)) أثناء معالجة الصور. تظهر ملامح الكثافة من خلال صور الطبقة الرقيقة من صبغة الفلورسنت مع فترة تعديل 2.5 ميكرومتر في الشكل 5 (هـ) عند كثافات الطاقة العالية (المنحنى الأحمر) والمنخفضة (المنحنى الأصفر). يتبع المنحنى السفلي عن كثب نمط الإضاءة الجيبية لأن كثافة طاقة الذروة تقع تحت حد التشبع. في المنحنى العلوي ، تحث طاقة النبض الأعلى الفلورة على التشبع بالقرب من القمم. تُظهر تحويلات فورييه (الشكل 5 (و)) المقابلة لأنماط الإضاءة في الشكل 5 (هـ) العديد من التوافقيات الناتجة عن عدم الخطية لشدة الإضاءة المشبعة (المنحنى الأحمر) ، بينما يمكن اكتشاف أدنى توافقي فقط في الجزء السفلي نمط الطاقة (منحنى أصفر).

      يتم اختراق الإثارة الشديدة اللازمة للعديد من تقنيات RESOLFT من خلال حقيقة أن شدة الليزر العالية غالبًا ما تنتج معدلات مفرطة من التبييض الضوئي بحيث يجب اختيار الفلوروفور بعناية. لذلك ، على الرغم من أن عائلة طرق RESOLFT لا تخضع لحاجز الانعراج التقليدي ، فإن اعتماد شدة الليزر على كسب الدقة يثبت حاجزًا آخر يتحكم فيه مقدار طاقة الليزر التي يمكن أن يتحملها الفلوروفور. أفضل علاج لهذه المعضلة هو إزالة ضرورة الشدة القوية من خلال تنفيذ التحولات الجزيئية التي تحدث مع طاقة الليزر منخفضة النضوب. تملأ العديد من مجسات الفلورسنت ثنائية الاستقرار هذا المعيار ويمكنها التبديل بصريًا بين الحالات الفلورية وغير الفلورية من خلال آليات منخفضة الطاقة مثل رابطة الدول المستقلة المستحثة بالصور - الأزمرة العابرة (الشكل 4 (ج)). في الحالات التي تكون فيها كلتا الحالتين مستقرتين ، يمكن إكمال الانتقال البصري ذهابًا وإيابًا بين الحالات على نطاقات زمنية تعسفية أو طويلة جدًا ، مما يتيح انتشار الإضاءة في الوقت المناسب وتقليل الكثافة المطلوبة (بالإضافة إلى التبييض الضوئي القطع الأثرية) بعدة أوامر من حيث الحجم. لقد مكنت مثل هذه الإستراتيجية من موازاة أساليب RESOLFT للسماح باستخدامها في تصوير مجال واسع لمساحة كبيرة. لاحظ أنه كما هو موضح أعلاه ، تتمثل إحدى الأفكار الرئيسية وراء RESOLFT في أن التصوير عالي الدقة لا يتطلب بالضرورة شدة إضاءة عالية للغاية.

      عودة إلى أعلى الصفحة ^ الحل الفائق بواسطة PSF Engineering

      تعتمد تقنيات هندسة انتشار النقاط المصممة للتحايل على حاجز الانعراج على قراءة متسلسلة زمنيًا للتبديل الضوئي لمسبار الفلورسنت. كانت التقنية الأولى التي تم تطبيقها بنجاح على التصوير البيولوجي فائق الدقة للخلايا الثابتة هي طريقة RESOLFT المسماة استنفاد الانبعاث المحفز (STED). كما نوقش أعلاه ، يستخدم STED انتقالات معدلة مكانيًا وقابلة للتشبع بين حالتين جزيئيتين لهندسة تحسينات على وظيفة انتشار النقطة. في الفحص المجهري STED ، تضيء العينة بمصدرين خطيين متزامنين فائق السرعة يتكونان من نبضة ليزر إثارة متبوعة بنبض ليزر مستنفد متحرك باللون الأحمر يشار إليه باسم شعاع STED (انظر الشكل 6). بشكل عام ، يكون عرض نبضة ليزر الإثارة أقصر من عرض نبضة STED (على الرغم من أن كلاهما عادة ما يكون في نطاق 10 إلى 300 بيكو ثانية). يستفيد الليزر النبضي من المقاييس الزمنية للاسترخاء الجزيئي وتداخل الضوء المتماسك لإنتاج مناطق استنفاد متناظرة شعاعيًا. يُسمح للفلوروفورات الموضوعة داخل منطقة العقدة الصفرية لشعاع STED بالتألق عند التعرض لحزمة الإثارة ، في حين يتم نقل تلك الفلورية المعرضة لحزمة STED إلى حالة الأرض (غير الفلورية) عن طريق الانبعاث المحفز (الشكل 6 (ب)). يشكل النضوب غير الخطي (بعد منحنى أسي) لحالة الفلورسنت المثارة بواسطة حزمة STED أساسًا للتصوير بدقة أقل من حاجز الانعراج.

      يستفيد STED من مفهوم RESOLFT من خلال تعديل شكل وظيفة انتشار نقطة الإثارة بشكل كبير من خلال معالجة المرحلة وعرض النبض وشدة الإثارة وأشعة الليزر المستنفدة. على الرغم من أن كلا الليزرين لا يزالان مقيدين بالحيود حيث تمر حزمتهما عبر القطار البصري المجهر ، يتم تعديل نبضة STED بواسطة مُعدِّل طور لتضمين عقدة صفرية الكثافة في مركز التركيز بكثافة متزايدة بشكل أسي نحو المحيط. يؤدي هذا التكوين إلى ظهور شعاع على شكل دونات يحيط بالنقطة المحورية المركزية (ووظيفة انتشار النقطة) لليزر المثير. فقط في مركز التركيز الدقيق (العقدة) تكون شدة شعاع STED مساوية للصفر (الشكل 6 (ب)). يتم اختيار الطول الموجي ومدة نبضة حزمة STED لتتطابق مع الحد الأقصى للانبعاث وكثافة التشبع ، على التوالي ، من الفلوروفور قيد التحقيق. يحدث تعطيل الفلوروفور في جميع أنحاء الحجم البؤري باستثناء مركز التركيز. في طاقة الليزر عالية النضوب المستخدمة في STED (غالبًا ما تتجاوز 250 ميغاواط لكل سنتيمتر مربع) ، يتم دفع الفلوروفورز على الفور تقريبًا إلى الحالة الأرضية عن طريق الانبعاث المحفّز. يتيح تقليل طاقة الليزر بشكل كبير (كما هو موضح أدناه) تكوين حالة غير فلورية عبر عدد من الآليات الأخرى ، بما في ذلك دفع الفلور إلى حالة ثلاثية قابلة للاستقرار ، أو تشكيل حالات نقل الشحنة ، أو التبديل الضوئي.

      يتم عرض تكوين قطار بصري STED نموذجي في الشكل 6 (أ) يُظهر لوحة الطور وأشعة الليزر للإثارة والنضوب (أشعة حمراء وخضراء ، على التوالي) ، ومرايا ثنائية الألوان ، وعدسة أنبوبية ، وموضوع. يظهر أيضًا رسم ثلاثي الأبعاد يُظهر ملامح حزمة STED في مستوى العينة. يتم تحقيق الإثارة والنضوب باستخدام نبضات الليزر المتزامنة التي يركز عليها الهدف على مستوى العينة. يتم تسجيل انبعاث الإسفار على كاشف مضخم ضوئي (غير موضح). تتم محاكاة البقع البؤرية التي تنتجها أشعة الليزر STED ونضوب الليزر كنماذج خضراء وحمراء ، على التوالي ، في الشكل 6 (ب). يتم تثبيت بقعة الإثارة بالليزر الخضراء على ملف ليزر استنفاد STED الأحمر لتقليل حجم وظيفة انتشار النقاط الفعالة بشكل كبير. توضح مقارنة صور Widefield (الشكل 6 (ج)) و STED (الشكل 6 (د)) للأنابيب الدقيقة الملطخة بـ Alexa Fluor 594 الدقة المكانية المتزايدة التي توفرها منهجية هندسة وظيفة نقطة الانتشار.

      يعمل الحقل الموجي لليزر المستنفد على شكل دونات في STED بشكل فعال على تضييق وظيفة انتشار نقطة ليزر الإثارة لزيادة الدقة إلى ما بعد حد الانعراج ، والذي في أفضل الحالات يمكن أن يقترب من 20 نانومتر في البعد الجانبي. وبالتالي ، فإن شحذ النقطة البؤرية من خلال هندسة وظيفة انتشار النقطة يعادل توسيع نطاق تمرير التردد المكاني للميكروسكوب. من أجل الحصول على صورة كاملة ، يتم مسح الصفر المركزي الناتج عن ليزر STED بنقطية عبر العينة ، على غرار عمل المجهر متحد البؤر. من بين فوائد الفحص المجهري STED أن زيادة الدقة الفعالة تمليه تمامًا التكوين التجريبي وقوى الليزر المطبقة على العينة. علاوة على ذلك ، يتم تسجيل الصورة أثناء مسح الحزمة على طول العينة ولا تتطلب أي معالجة إضافية ، ويمكن أن تقترب أوقات الحصول على الصور من سرعة أي مجهر متحد البؤر مسح بالليزر. تتناسب زيادة الدقة الفعالة مع STED مع قوة ليزر الاستنفاد ، ولكن يمكن أن تصبح مشكلة في طاقة الليزر العالية للغاية والتي من المحتمل أن تؤدي إلى تبييض ضوئي سريع وتدمير للمسبار. بغض النظر ، تم استخدام مجموعة واسعة من الفلوروفور بنجاح مع STED (انظر الجدول 1) ، بما في ذلك البروتينات الفلورية ، وأصباغ ATTO ، و Alexa Fluors ، و DyLights ، والعديد من المواد التركيبية الأخرى.

      تم تنفيذ إصدارات متقدمة من STED لمعالجة التحسينات في الدقة المحورية للتصوير ثلاثي الأبعاد فائق الدقة للمجموعات. من خلال اقتران جهازي ليزر استنفاد STED بتكوين موضوعي متعارض 4Pi ، نجح Stefan Hell وزملاؤه في توليد دقة محسنة بشكل كبير في كل من الأبعاد الجانبية والمحورية. تم تسمية هذه التقنية بـ iso-STED نظرًا لحقيقة أنها تنتج وظيفة انتشار نقطة قابلة للضبط تقريبًا (كروية) مع دقة تقترب من 40 نانومتر على طول المحاور. يجب أن تكون هذه البقعة البؤرية المتماثلة مفيدة في الحصول على مقاطع بصرية عالية الدقة من أعماق الخلايا والأنسجة البيولوجية. يتكون تكوين الجهاز المعقد من ليزرات STED مزدوجة يتم دمجها وإرسالها إلى كلا الهدفين باستخدام جهاز إرسال الأشعة. يمكن أيضًا استخدام معالجة الصور الرقمية لتقليل تأثير الفصوص الجانبية والتحف الأخرى التي تضر بوظيفة انتشار النقطة.تم تصميم أداة STED أكثر إحكاما وبساطة تعتمد على مصدر ليزر فائق التفريغ للتصوير ثلاثي الأبعاد باستخدام عدسة واحدة لتجميع المقاطع الضوئية بدقة جانبية تبلغ 45 نانومتر ودقة محورية تبلغ حوالي 100 نانومتر.

      خصائص مجسات الفلورسنت المختارة للفحص المجهري STED


      الفلوروفور السابق & # 955
      (نانومتر)
      عرض النبض
      (بيكو ثانية)
      STED & # 955
      (نانومتر)
      عرض النبض
      (بيكو ثانية)
      الدقة
      (نانومتر جانبي)
      صبغات صناعية
      ATTO 425 440 130 532 1000 70-80
      ATTO 565 532 90 640 90 30-40
      ATTO 663 635 100 750 200 40
      أليكسا فلور 594 570 90 700 90 60
      594 570 90 700 90 60
      RH 414 554 0.25 745 13 30
      البروتينات الفلورية
      EGFP 490 100 575 200 70
      السترين 490 100 598 300 50
      EYFP 490 100 598 300 70

      الجدول 1

      تنطبق نفس مبادئ RESOLFT الموصوفة أعلاه للفحص المجهري STED أيضًا على الفحص المجهري لنضوب حالة الأرض (GSD) حيث يتم أيضًا تبديل مسبار الفلورسنت ضوئيًا إلى حالة إيقاف التشغيل باستخدام ليزر يتميز بعقدة صفرية مركزية. في GSD ، تتضمن آلية التبديل الضوئي وضع الفلوروفور على الرف في حالة ثلاثية داكنة ثابتة (T 1). عادةً ما يتم "حظر" التحولات الإلكترونية إلى مستويات الطاقة المستقرة من خلال قواعد اختيار ثنائي القطب الكهربائي نظرًا لمتطلبات دوران الدوران ، مما يعني أنها تحدث فقط باحتمالية منخفضة جدًا. بغض النظر ، يمكن ملء الحالة الثلاثية بإثارة الفلوروفور بشكل متكرر إلى الحالة المفردة المثارة الأولى (S 1) لزيادة احتمال تقاطع النظام غير الإشعاعي من S 1 إلى T 1. تظل الإلكترونات في حالة الاستقرار لفترات طويلة نسبيًا ، والتي يمكن أن تتراوح من ميكروثانية إلى ملي ثانية. طاقة الليزر المستنفدة اللازمة لدفع الفلوروفور إلى الحالة الثلاثية (عادة عدة كيلووات لكل سنتيمتر مربع) أقل بكثير من تلك المطلوبة للفحص المجهري STED.

      من بين أكبر التحديات التي تواجه تنفيذ الفحص المجهري GSD اختيار مجسات الفلورسنت المناسبة بسبب المشاركة المحتملة للحالات المظلمة الفلورية في التبييض الضوئي. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون تلك الفلوروفورات التي يمكن دفعها بشكل فعال إلى الحالة الثلاثية قادرة على التعافي بعد إزالة الليزر المستنفد. يعد الاسترداد الفلوري أمرًا بالغ الأهمية لأن GSD يعتمد على مسح العينة بطريقة مشابهة للفحص المجهري متحد البؤر و STED. باختصار ، يجب أن تكون الفلوروفورات المحصورة في الحالة الثلاثية قادرة على الاسترخاء إلى الحالة الأرضية قبل أن تنتقل حزمة النضوب إلى الموقع المكاني التالي. وبالتالي ، في الفحص المجهري GSD يجب أن يكون هناك توازن دقيق بين وقت الرف البصري ومعدل عبور النظام ونشاط التبييض الضوئي. كان عدد الفلوروفورات المحتملة والعروض التوضيحية لتصوير GSD محدودًا ، ولكن من الناحية النظرية هناك العديد من مجسات الفلورسنت التي يمكن تصويرها بنجاح باستخدام هذه التقنية.

      على غرار STED ، يتم تشكيل ليزر النضوب في الفحص المجهري GSD بمنحدر طور حلزوني على واجهة موجة مستقطبة دائريًا لإنشاء هندسة تشبه الدونات مع عقدة صفرية في المركز. المسح النقطي للعينة بأشعة الليزر المتراكبة (الإثارة والنضوب) يولد صورًا بدقة الحيود الفرعي. لاحظ أن هناك احتمالية لوضع الفلوروفورات على الرف في حالات مظلمة أخرى (بخلاف الثلاثي غير المستقر) باستخدام الفحص المجهري GSD ، لكن التقنية ستظل تنتج صورًا عالية الدقة ممتازة بشرط أن تتمكن الفلوروفور في النهاية من العودة إلى الحالة الأرضية. تنبع القدرة على استغلال تشبع الحالة الثلاثية باستخدام GSD باستخدام طاقة ليزر أقل استنفادًا بكثير من عمر ميلي ثانية للحالة المظلمة. علاوة على ذلك ، تسهل مستويات الإضاءة المنخفضة التي يستخدمها الفحص المجهري GSD استخدام الكاميرات الرقمية عند إجراء التصوير بمصفوفة متوازية من أصفار الكثافة. تم إثبات الرفوف البصرية في الحالة الثلاثية في المجسات الاصطناعية الشائعة ، مثل أصباغ ATTO ، والرودامين ، والكاربوسيانين ، و Alexa Fluors ، و BODIPYs ، و fluorescein. من بين وسائط التصوير التي وجد أنها مفيدة لـ GSD هي كحول البولي فينيل والمذيبات المائية والعديد من تركيبات الوسائط المتصاعدة المتاحة تجارياً.

      يوضح الشكل 7 وظائف انتشار النقاط الفعالة (الشكل 7 (أ)) ، والكثافة السكانية للحالات المثارة الإلكترونية (الشكل 7 (ب)) ، والصور النموذجية (الأشكال من 7 (ج) إلى 7 (و)) من أجل ويديفيلد و GSD المجهري. مع زيادة طاقة الليزر المستنفد في وضع GSD من واحد إلى 100 ملي واط (الشكل 7 (أ)) ، تنخفض وظيفة انتشار النقطة الفعالة إلى عرض كامل بنصف أقصى 90 نانومتر و 33 نانومتر و 12 نانومتر على التوالي. احتمالية السكان للحالة الأرضية (S 0 ، منحنى أحمر) مقابل الحالة المفردة الأولى المثارة (S 1 ، المنحنى الأخضر) والحالة الثلاثية الممنوعة (T 1 ، المنحنى الأزرق) كدالة لشدة إثارة الليزر للفلوروفور التقليدي (فلوريسئين) يرد في الشكل 7 (ب). لاحظ الزيادة الهائلة في عدد الحالات الثلاثية مع زيادة طاقة الليزر. تُظهر صور حبات الفلورسنت في مضان ويديفيلد (الشكل 7 (ج)) ومع GSD (الشكل 7 (د)) التحسن الهائل في الدقة ، كما تفعل صور الأنابيب الدقيقة (الشكل 7 (هـ) ، ويديفيلد والشكل 7 (و) ، GSD) المسمى مع فلوروفور اصطناعي.

      في تقنيات الإضاءة المهيكلة غير الخطية المسماة مجهر الإثارة المشبع بالنمط (SPEM) والمجهر الإشعاعي المهيكل المشبع (SSIM) ، تستنفد الحالة الأرضية (S 0) عن طريق الإثارة المشبعة (إلى الحالة S 1) من خلال مخطط RESOLFT عكسي تمكن من تسجيل الفلورة الناتجة عن هذا الانتقال على كاشف مجموعة المنطقة. يتم تنفيذ هذه التقنيات باستخدام مجموعة شبيهة بالشبكة من الحدود القصوى والحد الأدنى للكثافة على شكل خط بدلاً من تعديل الطور النموذجي على شكل كعكة الدونات الذي يستخدمه STED و GSD. ينتج عن الإثارة المشبعة مناطق مظلمة ضيقة على شكل خط في العقد الصفرية محاطة بمستويات عالية من إشارة التألق لتوليد بصمة "سلبية" للسمات التي يتم تصويرها. وبالتالي ، في SPEM و SSIM ، تكون حالة إيقاف المسبار الفلوري (بدلاً من الحالة قيد التشغيل) التي يتم تقييدها بواسطة العقدة الصفرية لتعديل الطور. يتم تدوير خطوط الشبكة عدة مرات لإنشاء بيانات لصورة واحدة ، والتي يتم استردادها رياضيًا أثناء معالجة ما بعد الاستحواذ.

      في SSIM و SPEM ، يتم إنتاج الإضاءة المهيكلة بواسطة حزمتين ضوئيتين متداخلتين قويتين من ليزر واحد يشكلان نمط شبكة موجة واقفة مسقطة عبر الأبعاد الجانبية للعينة. يتم استخدام أوامر الانعراج الأولى فقط (+1 و -1) لإنشاء نمط التداخل ويتم حظر الترتيب الصفري من مصدر الليزر مع توقف الحزمة. تشبع معظم المجسات الفلورية المكشوفة داخل العينة بسبب التعرض للإضاءة الشديدة ، تاركةً فقط أحجام ضيقة على شكل خط داكن (عقد صفرية) لها فترة تقارب 200 نانومتر عند حواف نمط التداخل. مع زيادة طاقة الإثارة ، تصبح الجدران المحيطة بالعقد أكبر بكثير ، مما يقلل من حجم وظيفة انتشار النقاط. يتم تنفيذ المنهجية على مجاهر واسعة النطاق وغير ممسوحة ضوئيًا عن طريق تغيير الطور للنمط لجعل معلومات الدقة الفائقة غير القابلة للحل مرئية في شكل ترددات متناسقة وتموج في النسيج الأساسي & # 233 هامش. نظرًا لحقيقة أن الدقة تتحسن فقط في الاتجاه العمودي على العقد الصفرية ذات الشكل الخطي ، يجب تغيير النمط في عدة اتجاهات لتغطية عدد كبير من الزوايا في المستوى البؤري.

      تشبه تقنيات الإضاءة المهيكلة غير الخطية الفحص المجهري STED من حيث أن الوقت اللازم لإجراء القياسات مستقل نظريًا عن كثافة العلامات ، كما أن الثبات الضوئي لتحقيقات الفلورسنت تملي الأداء. يتم وصف الآلية التي يتم بها زيادة الدقة في SSIM و SPEM من حيث مكونات فورييه والترددات المكانية. ومع ذلك ، على غرار تقنيات هندسة وظيفة الانتشار الأخرى لـ STED و GSD الموصوفة أعلاه ، يستفيد الفحص المجهري للإضاءة المهيكلة غير الخطية من تشبع الحالة المستقرة حيث يتم الحصول على معلومات عالية الدقة فقط بعد وصول النظام إلى ظروف التشبع بالفلور. بالإضافة إلى ذلك ، يتم قياس الدقة المكانية بمستوى التشبع لتوليد صور ذات دقة جانبية في محيط 50 نانومتر في ظل الظروف المثلى للإشارة إلى الضوضاء وانخفاض معدل التبييض الضوئي. نظرًا للوقت اللازم لتدوير نمط الشبكة المتوقع ، يجب أن تكون العينة ثابتة لفترات طويلة نسبيًا ، لكن الفلوروفور المناسب لـ SSIM و SPEM لا يتطلب خصائص تبديل ضوئي متخصصة.

      عودة إلى أعلى الصفحة ^ الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية فائقة الدقة

      في التطبيقات التقليدية للفحص المجهري المهيكل للإضاءة (على سبيل المثال ZEISS ApoTome) ، يتم إدخال شبكة تم إنشاؤها عن طريق تبخير المعدن على سطح نافذة زجاجية بصرية في مستوى الحجاب الحاجز الميداني في مسار الإضاءة لمجهر مضان وعرضها على عينة. يتم ترجمة صورة الشبكة المسقطة فوق العينة باستخدام لوحة زجاجية موازية للمستوى والتي تميل للخلف وللأمام في مسار الضوء. يتم الحصول على ما لا يقل عن ثلاث صور أولية للعينة مع هيكل الشبكة المتراكب في مواضع مختلفة. تتم معالجة هذه الصور لاحقًا في الوقت الفعلي باستخدام برنامج المجهر لإنشاء قسم بصري. المبدأ الأساسي هو أن الشبكة المسقطة تصبح مرئية في المستوى البؤري نتيجة لإثارة ميزات العينة بواسطة الضوء المنظم. في المناطق التي لا يصل فيها الضوء إلى العينة (في الواقع ، خطوط الشبكة المظلمة) ، لا يتم إنشاء أي تألق. يحدد البرنامج تباين الشبكة كدالة للموقع ويزيل معلومات الصورة خارج نطاق التركيز قبل تجميع الصور الثلاث في قسم بصري نهائي له دقة جانبية ومحورية تشبه الفحص المجهري متحد البؤر المسح بالليزر.

      يمكن زيادة الدقة الجانبية فوق حد Abbe الكلاسيكي بمعامل اثنين (حوالي 100 إلى 120 نانومتر) في الإضاءة المنظمة دون التخلص من أي ضوء انبعاث باستخدام إضاءة مُنظَّمة مكانيًا متولدة بالليزر مقترنة بمجهر مضان عريض في ما يسمى بالدقة الفائقة (SR ) SIM. على غرار تقنية الدقة الفائقة غير الخطية لـ SSIM الموصوفة أعلاه ، تقدم واجهات الموجة الضوئية الهيكلية الخطية SR-SIM معلومات عالية الدقة يتعذر الوصول إليها عادةً في شكل تموج في النسيج و # 233 هامش تحتوي على ترددات متناسقة من العينة غير المتوفرة في التقليدية المجهر مضان. وبالتالي ، إذا تم تراكب نمطين دقيقين بطريقة مضاعفة ، فسيظهر نمط ضربات (تموج في النسيج # 233 هامش) في منتجهم. في هذه الحالة ، أحد الأنماط هو توزيع الفلوروفور المكاني في العينة والآخر هو كثافة ضوء الإثارة المنظمة. كما هو موضح بمزيد من التفصيل أدناه ، من خلال جمع مجموعة من الصور مع نمط الشبكة الذي تم تدويره عبر 360 درجة في الفضاء الجانبي ، يمكن استرداد المعلومات عالية الدقة من العينة بعد اكتمال معالجة ما بعد الاستحواذ.

      يتم توضيح مفهوم تحسين الدقة باستخدام الإضاءة الهيكلية عالية الدقة بشكل تخطيطي في الشكل 8. يظهر نمطا خطين متراكبين (مضروبين) في الشكل 8 (أ) لإنتاج تموج في النسيج و # 233 هامش تتجلى كخطوط عمودية تقريبًا في منطقة التداخل . إذا تم عرض بنية العينة في مساحة متبادلة (في الواقع ، تحويل فورييه) ، كما تم تقديمه من خلال دائرة لها نصف قطر 2NA / & # 955 في الشكل 8 (ب) ، توجد معلومات دقة منخفضة بالقرب من الأصل ، بينما أعلى يتم توزيع معلومات الدقة للخارج تقترب من حدود الدائرة (تقريب حد الانعراج بحوالي 200 نانومتر). لذلك ، تشير الدائرة في الشكل 8 (ب) إلى المنطقة التي يمكن ملاحظتها من الفضاء المتبادل التي تحدد تفاصيل العينة المتاحة مع مجهر مضان تقليدي محدود الانعراج. لا تغير الإضاءة المهيكلة هذه المنطقة التي يمكن ملاحظتها فعليًا ، ومع ذلك ، فهي تنقل المعلومات الجديدة إلى المنطقة من الترددات المكانية الأعلى التي عادةً ما يتم استبعادها.

      في أبسط مثال ، تولد بنية الإضاءة التي تتكون من نمط شريطي جيبي تحويل فورييه الذي يحتوي على ثلاث نقاط غير صفرية فقط (انظر الشكل 8 (ج)). توجد نقطة واحدة في الأصل ويتم إزاحة النقطتين الأخريين عن الأصل في اتجاه يتم تحديده بواسطة اتجاه نمط الشبكة وبمسافة تتناسب مع تباعد الأسطر العكسي للشبكة. عندما تضيء العينة بواسطة الضوء المنظم الناتج عن نمط الشبكة ، ستظهر حواف تموج في النسيج # 233 تمثل المعلومات التي غيرت الموقع في الفضاء المتبادل. بالإضافة إلى معلومات العينة العادية المحدودة للحيود ، تحتوي المنطقة التي يمكن ملاحظتها الآن على معلومات جديدة عالية التردد تنشأ في منطقتي الإزاحة كما هو موضح في الشكل 8 (د). تمثل مناطق دوائر الإزاحة في الشكل 8 (د) التي تقع خارج الدائرة المركزية معلومات جديدة لا يمكن الوصول إليها باستخدام المجهر التقليدي. إذا تم إنتاج تسلسل من هذه الصور مع اتجاه مختلف للشبكة ومرحلة (الشكل 8 (هـ)) ، يمكن استرداد المعلومات من منطقة ضعف حجم المنطقة التي يمكن ملاحظتها عادة لزيادة الدقة الجانبية بمعامل اثنين.

      من حيث تكوين الجهاز ، ربما يكون الليزر هو الخيار الأنسب لإضاءة SR-SIM بشرط أن يكون الضوء مخلوطًا مكانيًا ومستقطبًا خطيًا. يجب أن يكون اتجاه خطوط الشبكة موازيًا لسمت متجه الاستقطاب لإضاءة الإثارة ، ويجب حظر جميع أوامر الانعراج باستثناء الأول (+1 و -1). عادةً ما ينحرف حوالي 80 بالمائة من الضوء إلى الطلبيات الأولى لإنتاج نمط عالي التباين له دورية تقارب 200 نانومتر. يجب أن يتراوح عمق التشكيل للنمط الشريطي المسقط على العينة بين 70 و 90 بالمائة ويتم تثبيت الشبكة على جهاز ترجمة ذو حلقة مغلقة قابلة للدوران. يجب أن تتوفر العديد من أحجام الشبكات لتتناسب مع مصادر الإثارة المتعددة لخطوط الليزر. بعض الأدوات التجارية قادرة على اختيار ثلاث أو خمس دورات شبكية (120 درجة أو 72 درجة) لتحسين سرعة التصوير أو الدقة ، على التوالي. بعد الاستحواذ ، تتم معالجة الصور الفرعية المتعددة لكل اتجاه شبكة وانتقال من خلال عدد من خطوات البرنامج لإنشاء الصورة النهائية. في وضع السرعة المُحسَّن ، يجب أن تكون أداة SR-SIM التجارية قادرة على تصوير الخلايا الحية للهياكل التي تفتقر إلى حركة كبيرة ، مثل الأكتين ، والكروموسومات الانقسامية ، والميتوكوندريا ، وجهاز جولجي.

      يعمل الإصدار الأصلي من الفحص المجهري عالي الدقة للإضاءة على تحسين الدقة الجانبية إلى ما يقرب من 100 نانومتر ، وكان رائدًا للتطورات المستمرة المصممة لزيادة الدقة المحورية أيضًا. يستخدم SR-SIM ثلاثي الأبعاد ثلاث حزم تم إنشاؤها بواسطة محزوز الحيود لتشكيل نمط تداخل ثلاثي الأبعاد في المستوى البؤري. من خلال جمع صور الإضاءة المنظمة من طائرات بؤرية متعددة ، تحافظ معالجة الصور على الدقة الجانبية 100 نانومتر ، ولكنها توسع الدقة المحورية إلى ما يقرب من 300 نانومتر (تقريبًا ضعف جودة الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر). يمكن تحسين الدقة المحورية بشكل أكبر باستخدام مزيج من SIM مع I 5 M من خلال استخدام هدفين متعارضين لتعظيم تجميع انبعاث التألق على زاوية أكبر. يجب أن يكون التكوين الناتج قادرًا على إنتاج دقة تبلغ 100 نانومتر على طول جميع المحاور.

      عودة إلى أعلى الصفحة ^ الفحص المجهري للتوطين أحادي الجزيء

      تم تصميم تقنيات الدقة الفائقة لـ 4Pi و I n M و STED و GSD و SSIM والإضاءة المهيكلة لتصوير مجموعة من الفلوروفورات الموزعة في جميع أنحاء العينة. على الرغم من أن هذه الطرق تتميز بدقة مختلفة ، إلا أنها جميعًا تثير العديد من الفلوروفورات داخل حدود وظيفة انتشار النقطة المعدلة التي يوفرها تكوين الجهاز المعين. على النقيض من ذلك ، فإن تقنيات الجزيء الفردي الخاصة بالمجهر الموضعي الفعال ضوئيًا (PALM) ، والفحص المجهري لإعادة الإعمار البصري العشوائي (STORM) ، والفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري (FPALM) تختلف اختلافًا جوهريًا في أنها تصور مجموعات فرعية متفرقة تحتوي على جزيئات فردية تفصلها مسافات تتجاوز حد قرار آبي. المبدأ الأساسي الذي تقوم عليه هذه التقنيات هو أنه يمكن تحديد موضع جزيء واحد بدقة تصل إلى عدة نانومترات (أو أفضل) إذا أمكن جمع عدد كافٍ من الفوتونات وكان هناك نقص في الجزيئات الإضافية (التي تنبعث منها بالمثل) ضمن نطاق تقريبًا 200 نانومتر. من بين أكثر الميزات المرغوبة في PALM و STORM والمنهجية ذات الصلة أن التقنيات لا تتطلب تعديل الخصائص البصرية لمجهر مقلوب قياسي ويمكن تنفيذها بأي أداة تجارية قادرة على أداء التصوير أحادي الجزيء.

      يوضح الشكل 9 الخطوات المتبعة في توطين الجزيئات المفردة بدقة عالية من خلال ملاءمة وظيفة انتشار النقطة إلى وظيفة غاوسي. في الشكل 9 (أ) ، يتم فرض وظيفة انتشار النقطة لمجهر مضان واسع المجال على تمثيل سلكي لمجموعة البكسل من كاميرا رقمية في رسمين تخطيطيين (أعلى اليسار) وثلاثي الأبعاد. تظهر وظيفة انتشار نقطة البكسل لفلوروفور واحد كما تم تصويره باستخدام EMCCD في الجزء العلوي الأيسر من الشكل 9 (ب) ، وتم نمذجتها بواسطة وظيفة غاوسية ثلاثية الأبعاد ، مع كثافة كل بكسل لونًا معينًا إلى مساحة مكانية الموقع على شبكة التصوير (الشكل 9 (ج)). في الحالات التي يتداخل فيها موقعان من جزيء واحد بسبب الانبعاث بواسطة الفلوروفور مع مسافة فصل أقصر من حد الانعراج ، يمكن تحديد النقطه الوسطى لكل فلوروفور بشكل فردي عن طريق طرح وظيفة انتشار نقطة واحدة من الفلوروفور من الأخرى (بعد أن تدخل حالة مظلمة أو مبيضة ضوئيًا) بسبب استراتيجية رسم الخرائط الزمنية لتوليد صور PALM.

      بالنسبة للعينات ذات العلامات الكثيفة (كما هو شائع بالنسبة للهياكل البيولوجية الموصوفة ببروتينات الفلورسنت أو التألق المناعي إلى جانب الأصباغ الاصطناعية) ، لا تُترجم دقة التوطين مباشرة إلى صور فائقة الدقة نظرًا لحقيقة أن الصور المتداخلة للانبعاثات الفلورية في وقت واحد تمنع توطينها الدقيق. للتحايل على "طبيعة المجموعة" لجميع العينات البيولوجية تقريبًا مع ملصقات الفلورسنت ، تم تصميم PALM و STORM لتحديد التوطين الدقيق لبواعث الجزيء الفردي الفردية عن طريق التبديل التسلسلي "تشغيل" في مجموعات فرعية محدودة من الجزيئات قبل محاولة تحديد إحداثيات. على عكس STED و GSD ، حيث يتم مسح وظيفة انتشار النقطة المحددة بدقة والتي تم إنشاؤها بواسطة الليزر المتراكب عبر العينة لإثارة جميع الجزيئات داخل الحجم البؤري ، تعتمد تقنيات الجزيء الفردي على التبديل الضوئي العشوائي حيث تظل معظم الجزيئات مظلمة. عند الإثارة باستخدام ليزر التنشيط بطاقة منخفضة ، يتم تشغيل نسبة صغيرة من الجزيئات عشوائياً ، وتصويرها ، وتحديد موقعها ، ثم تبييضها ضوئيًا لإزالتها من المجموعة (انظر الشكل 9). إن تكرار هذه العملية لدورات متعددة هو الفكرة الإبداعية الكامنة وراء الفحص المجهري أحادي الجزيء الذي يتيح إعادة بناء صورة فائقة الدقة.

      تم وصف مفهوم تحديد وتوطين الجزيئات الفردية لأول مرة من قبل Werner Heisenberg في الثلاثينيات من القرن الماضي وتم دعمه رسميًا بأساس رياضي متين خلال الثمانينيات والتسعينيات من قبل عدة مجموعات. بشكل أساسي ، في حقل العينة الجانبي الذي يحتوي على بواعث جزيء واحد ، يتوافق الجزء المركزي من كل بقعة محدودة الانعراج مسجلة على مستوى صورة كاميرا رقمية مع موضع الجزيء ويمكن توطينه بدقة نانومترية عالية من خلال جمع عدد كافٍ من الفوتونات . تعتمد طرق تحديد مركز التوطين على منحنى إحصائي مناسب لتوزيع الفوتون المقاس لوظيفة غاوسي. الهدف النهائي هو تحديد المركز أو القيمة المتوسطة لتوزيع الفوتون (& # 956 = س 0 ، ص 0) ، وعدم اليقين ، الخطأ المعياري للمتوسط ​​، & # 963 ، وفقًا للمعادلة:

      حيث N هو عدد الفوتونات التي تم جمعها ، و هو حجم البكسل للكاشف التصويري ، و b هو الانحراف المعياري للخلفية (والذي يتضمن انبعاث التألق في الخلفية مع ضوضاء الكاشف) ، و si هو الانحراف المعياري أو عرض التوزيع (في الاتجاه الأول). يشير الفهرس i إلى اتجاه x أو y. يشير المصطلح الأول تحت الجذر التربيعي على الجانب الأيمن من المعادلة (4) إلى ضوضاء الفوتون ، بينما يشمل المصطلح الثاني تأثير حجم البكسل المحدود للكاشف. يأخذ المصطلح الأخير في الاعتبار تأثير ضوضاء الخلفية. من خلال تطبيق هذه التقنيات البسيطة ، يمكن تحقيق دقة توطين تبلغ حوالي 10 نانومتر من خلال توزيع الفوتون لحوالي 1000 فوتون عندما تكون ضوضاء الخلفية ضئيلة. أدى توسيع هذه الرؤية إلى مجموعة من التجارب البارعة التي تدرس الهياكل المعزولة التي تفصل بينها أقل من حد الانعراج ، مثل المحركات الجزيئية ذات العلامات. يتمثل أحد التطورات التكنولوجية الرئيسية في دعم الدقة الفائقة المستندة إلى المسبار في التوافر على نطاق واسع وسهولة استخدام أنظمة الكاميرات ذات الأجهزة المزدوجة الشحنة المضاعفة للإلكترون (EMCCD) ، والتي لها حساسية للفوتون الفردي.

      كما هو موضح في المعادلة (3) ، فإن مفتاح النتائج عالية الدقة للتوطين الجزيئي في التصوير عالي الدقة لجزيء واحد هو تقليل ضوضاء الخلفية وتعظيم إخراج الفوتون من المسبار الفلوري ، وهي مهمة أسهل وصفًا من إنجازها. في أفضل السيناريوهات ، إذا أمكن جمع 10000 فوتون في غياب الخلفية قبل التبييض الفلوروفوري أو إيقاف تشغيله ، يمكن تحديد مركز التوطين بدقة تتراوح من 1 إلى 2 نانومتر تقريبًا. في المقابل ، إذا تم جمع 400 فوتون فقط ، فإن دقة التوطين تنخفض إلى حوالي 20 نانومتر أو أسوأ. تنشأ الخلفية في العينات فائقة الدقة من التألق الذاتي الطبيعي أو الناجم عن الكاشف (من المثبتات أو المواد الكيميائية تعداء) ، وكذلك من التألق المتبقي للمسبارات المحيطة التي دخلت الحالة المظلمة. وبالتالي ، بالنسبة لتقنيات التصوير فائقة الدقة أحادية الجزيء القائمة على المسبار مثل PALM ، يجب أن تعرض جزيئات الفلورسنت نسبة تباين عالية (أو نطاق ديناميكي) ، والذي يتم تعريفه على أنه نسبة التألق قبل وبعد التنشيط الضوئي. يرجع التباين في نسب التباين في البروتينات الفلورية والفلوروفورات الاصطناعية إلى الاختلافات في تحويلها الضوئي التلقائي في غياب التنشيط الخاضع للرقابة.

      تم عرض التصوير أحادي الجزيء في البداية في عام 1989 ، أولاً في درجات حرارة شديدة البرودة ولاحقًا في درجة حرارة الغرفة باستخدام الفحص المجهري البصري للمجال القريب. منذ ذلك الوقت ، تطورت المنهجية لتصبح تقنية مجهرية قياسية واسعة النطاق. تتيح المعرفة المسبقة بأن الصورة المحدودة للحيود لجزيء ما تنشأ من مصدر واحد تقدير موقع (مركز) هذا الجزيء بدقة تتجاوز بكثير حد الانعراج. تم تقديم تطبيق مبكر لهذا المفهوم بتقنية تُعرف باسم التصوير الفلوري بدقة نانومتر واحد (FIONA) التي تحدد وتتبع بواعث جزيء واحد من خلال إيجاد مركز وظيفة انتشار نقطة محدودة الانعراج. تم استخدام FIONA لإثبات حجم الخطوة بالنانومتر بدقة عالية للغاية لمحركات الميوسين لأنها تترجم طول خيوط الأكتين. عرض توضيحي آخر يسمى الفحص المجهري متعدد الجزيئات أحادية النانو المترجمة (NALMS) يستخدم التبييض الضوئي لإزالة جزيئات مفردة بشكل انتقائي من أجل قياس المسافات بين تحقيقات الفلورسنت المتطابقة التي تتداخل داخل بقعة محدودة الانعراج.

      كما تم الإبلاغ عن العديد من تقنيات الجزيء الفردي الأخرى ذات الاختصارات المثيرة للاهتمام. ترتبط تقنية تُعرف باسم التصوير عالي الدقة لجزيء واحد مع التبييض الضوئي (SHRImP) بـ FIONA وتستخدم التبييض الضوئي لاثنين أو أكثر من الفلوروفورات المتقاربة المتقاربة لتحديد موضعها بالتتابع باستخدام تقنيات توطين جزيء واحد بدءًا من الفلوروفور الأخير الذي تم ابيض. وبالمثل ، تم تقديم إصدار ثنائي اللون من FIONA باستخدام علامات ائتمانية لقياس التسجيل بين قناتين من قنوات الكشف تحت اسم تحديد موقع جزيء واحد عالي الدقة (SHREC). إن تطبيق الربط المستمر المحدد أو غير المحدد لمجسات الفلورسنت القابلة للانتشار على هدف بيولوجي ثابت متبوعًا بالتبييض الضوئي للتصوير عالي الدقة قد أطلق عليه اسم تراكم النقاط للتصوير في التضاريس النانوية (PAINT). ركزت التحقيقات الأخرى على استخدام النقاط الكمومية الفردية لدراسات التوطين بناءً على دخولها العشوائي في الحالات المظلمة ، في حين كان فصل وتوطين الفلوروفورات الفردية المختلفة في ملفاتها الطيفية هدفًا للعديد من التجارب المصممة لعزل جزيئات مفردة بدقة عالية.

      معروض في الشكل 10 عدة أمثلة للصور فائقة الدقة التي تم إنشاؤها باستخدام PALM إلى جانب البروتينات الفلورية ، و dimer ترادفي Eos (tdEos) و Eos أحادي الإصدار 2 (mEos2). تُظهر الأشكال من 10 (أ) إلى 10 (ج) أن tdEos مدمجًا في إشارة استهداف ميتوكوندريا قصيرة في انعكاس داخلي إجمالي واسع النطاق (الشكل 10 (أ)) بالإضافة إلى المنطقة المعبأة في الشكل 10 (أ) الموسعة إلى حجم PALM الصورة (الشكل 10 (ب)) ، وصورة PALM ذات الدقة الفائقة (الشكل 10 (ج)). وبالمثل ، يتم التقاط صور tdEos المندمجة بالفينكولين في التصاقات بؤرية في حقل عريض (الشكل 10 (د)) ، وتوسيعها (الشكل 10 (هـ)) ، و PALM (الشكل 10 (و)). لاحظ الهيكل المفصل بدقة للالتصاق البؤري في صورة PALM فائقة الدقة. يتم تقديم اندماج mEos2 مع سيتوكراتين الإنسان في widefield (الشكل 10 (ز)) ، وتم توسيعه (الشكل 10 (ح)) ، و PALM (الشكل 10 (1)) لتوضيح الزيادة الهائلة في الدقة التي يوفرها تصوير PALM. في جميع الحالات ، يتم حل الميزات التي يتراوح حجمها من 30 إلى 50 نانومتر بدقة توطين عالية.

      العيب الرئيسي لتقنيات الجزيء المفرد الموصوف أعلاه هو أنها مفيدة فقط عندما تكون مجسات الفلورسنت معزولة جيدًا عن بعضها البعض ، عادةً عند كثافات تتراوح بين 10 و 100 جزيء لكل ميكرومتر مربع. يضمن هذا التباعد الكبير بين الجزيئات أن التوزيع النقطي لكل مسبار يمكن تركيبه بدقة. ومع ذلك ، لا تحدد أي من هذه الطرق آلية جزيئية مميزة تتيح القراءة المتسلسلة للأفراد من مجموعة كبيرة من الفلوروفورز ، ولم يكن الأمر كذلك حتى تم تطبيق التبديل الضوئي (أو التحويل الضوئي) بين حالتين مختلفتين من حالات الانبعاث في التصوير PALM و STORM الذي أدى إلى الدقة الفائقة العشوائية أصبح الفحص المجهري حقيقة واقعة. توضح هذه التقنيات أنه يمكن استخدام التصوير أحادي الجزيء لدراسة تركيزات كثيفة من مجسات الفلورسنت (في نطاق 100000 لكل ميكرومتر مربع) مع تحقيق دقة تقاس بعشرات النانومتر. وهكذا ، مع بروتينات الفلورسنت الضوئية المضيئة أو أصباغ الكاربوسيانين القابلة للتحويل الضوئي ، يتم استخدام ليزر التنشيط المطبق بطاقة منخفضة لتحفيز تبديل الانبعاث بحيث يكون لأي جزيء معين احتمال ضئيل في أن يتم تنشيطه ضوئيًا ، ولكن تظل غالبية السكان في الأصل ( مظلمة أو أصلية) حالة الانبعاث.

      في PALM و STORM وتقنيات توطين الجزيء الواحد ذات الصلة ، يجب أن تؤدي الحالة المنشطة للجزيئات القابلة للتحويل إلى انبعاث فوتونات كافية لتمكين التوطين الدقيق قبل إعادة دخول المجسات إلى الحالة المظلمة أو إلغاء تنشيطها عن طريق التبييض الضوئي. يعد التأكد من أن الجزيئات التي يتم تنشيطها بشكل متناثر بعيدة عن حد Abbe أمرًا بالغ الأهمية لتمكين التسجيل المتوازي للعديد من الأفراد ، ولكل منهم إحداثيات مميزة تنتج نقاط حيود فريدة على كاشف مصفوفة المنطقة للكاميرا الرقمية. كما هو موضح أعلاه ، فإن النقط الوسطى المستمدة من صور هذه الجزيئات الفردية تنتج إحداثيات جزيئية لها دقة بناءً على عدد الفوتونات المنبعثة. بمجرد التحقق من المواضع الجزيئية ، يتم تسجيل الإحداثيات كعلامة تجزئة في البعد الجانبي وتتكرر العملية. نظرًا لحقيقة أن عدد الفوتونات المنبعثة يختلف لكل جزيء ، يمكن إنشاء حد أدنى للسطوع (على سبيل المثال ، تلك الجزيئات التي تصدر أكثر من 25 فوتونًا) لتحقيق الدقة المطلوبة.

      تتضمن الاختلافات في PALM و STORM تقنية تعرف باسم PALM مع اكتساب يعمل بشكل مستقل (PALMIRA) حيث يتم تشغيل الكاميرا بسرعة عالية دون مزامنة ليزر التنشيط أو دورات التبديل بين إيقاف التشغيل وإيقاف التشغيل لمجسات الفلورسنت. تتطلب PALMIRA استخدام الفلوروفورات القابلة للتحويل العكسي ، ولكنها تسرع بشكل كبير سرعات الحصول على الصور (بحوالي 100 ضعف). طريقة أخرى يشار إليها باسم استنفاد الحالة الأرضية مع عودة جزيء واحد (GSDIM) تملأ الحالة المظلمة للفلوروفور الاصطناعي عن طريق دفعها إلى حالة ثلاثية قابلة للاستقرار (على غرار الفحص المجهري GSD) ، متبوعة بمراقبة بواعث عندما تعود عشوائياً إلى الأرض حالة. وقد ظهر عدد من التقنيات المماثلة التي تستفيد من هذه الظاهرة والظواهر ذات الصلة ، بما في ذلك الفحص المجهري الوامض والعديد من المشتقات الأخرى التي يُشار إليها بتيار لا نهاية له على ما يبدو من الاختصارات الجديدة. تتمثل أهم الإمكانات التي توفرها هذه الأساليب الجديدة في قدرتها على إنشاء صور فائقة الدقة باستخدام مجسات الفلورسنت الاصطناعية القياسية ، مثل الفلوريسين وأليكسا فلور 488 و ATTO 650 و Cy5 والعديد من الأصباغ المماثلة في وجود كاسحات الأكسجين والثيول الأليفاتية.

      على الرغم من أن تقنيات الدقة الفائقة أحادية الجزيء قد أثبتت أنها دقيقة للغاية في قدرتها على توطين المجسات الفلورية في الأبعاد الجانبية ، إلا أن تحقيق دقة مماثلة في البعد المحوري أثبت أنه أكثر صعوبة. تتكيف النسخة ثلاثية الأبعاد من STORM (3D-STORM) مع عدسة أسطوانية لتحريف وظيفة انتشار نقطة التألق أحادي الجزيء في الاتجاه الجانبي اعتمادًا على موضعها على طول المحور z. تستخدم FPALM ذات السطحين (BP) تكوينًا للتصوير ثنائي المستوى لعرض صورة للجزيء نفسه في مستويين بؤريين مختلفين. تعمل تقنية تسمى وظيفة انتشار نقطة اللولب المزدوج (DH-PSF) على هندسة وظيفة انتشار نقطة المجهر إلى فصين ، يتم تدويرهما فيما يتعلق بالصورة اعتمادًا على موضعهما المحوري. أخيرًا ، يجمع مقياس التداخل PALM (iPALM) الضوء من بواعث فردية باستخدام أهداف مزدوجة متجاورة ، ويعيد توحيد الانبعاث ، ويستخدم تداخل الفوتونات بناءً على موقعها في المستوى البؤري لتحديد الموضع المحوري. على الرغم من أن معظم هذه التقنيات المصممة لزيادة الدقة المحورية لا ترقى إلى مستوى أدائها في الأبعاد الجانبية ، فإن iPALM قادر في الواقع على إنتاج دقة محورية قابلة للمقارنة أو أفضل من PALM في البعد الجانبي.

      لا تزال تقنيات التوطين الجزيئي عالية الكثافة في مهدها حيث يتم تطوير أمثلة جديدة والإبلاغ عنها بشكل منتظم ، ومع ذلك ، فإن العديد من المفاهيم التي تمت مناقشتها أعلاه تحمل وعدًا كبيرًا لتصبح في نهاية المطاف أدوات يومية في بيولوجيا الخلية والتخصصات ذات الصلة. في هذه المرحلة ، تهتم العديد من الأمثلة المنشورة لمنهجية التحليل الفائق للمجموعة وجزيء واحد في المقام الأول بإثبات المبدأ أو إدخال تحقيقات الفلورسنت الجديدة. الجزيئات المستهدفة المفضلة في هذه التحقيقات هي الأكتين والأنابيب الدقيقة ، وهي اختبارات دقة ممتازة نظرًا لأنها تتميز بهياكل خلوية متميزة وذات مواصفات جيدة وتحتوي عادةً على العديد من الخيوط بقطر 25 نانومتر أو أقل وتقع على مسافات مختلفة عن بعضها البعض. يتم الإبلاغ عن أمثلة على التصوير ثنائي اللون والخلايا الحية بشكل غير متكرر ، ولكن من المحتمل أن تصبح جميع الطرق الموصوفة هنا أكثر دقة وبالتالي فهي مفيدة للتحقيق في مجموعة واسعة من الظواهر البيولوجية.

      النطاق الواسع لتقنيات الدقة الفائقة المتاحة اليوم ينقل التصوير البصري للعينات البيولوجية إلى المجال الذي يحتفظ به تقليديًا بواسطة المجهر الإلكتروني ، ولكن هناك ما يبرر بعض الحذر عند تفسير الهياكل والتوزيعات الجزيئية التي يتم ملاحظتها. يجب أن يكون التركيز الرئيسي هو التأكد من أن التقنيات تعمل كما هو معلن عنها ولا تخلق مصنوعات جديدة يجب تفسيرها والتخفيف منها. في معظم الحالات ، تم تطوير التقنيات والبرامج والأجهزة الموصوفة في الفقرات أعلاه من قبل عدد قليل من العلماء اللامعين والمبدعين ، لذلك هناك مجال كبير لتوسيع هذا المجال الجنيني. بالنسبة للعديد من أدوات الدقة الفائقة ، تكون الأجزاء المكونة متاحة تجاريًا أو يمكن تصنيعها بسهولة ، وهو ما يتلخص أساسًا في مسألة المصاريف. في حالة PALM وتقنيات التوطين الجزيئي الأخرى ، كانت الأجهزة متاحة لبعض الوقت في شكل أنظمة TIRF تجارية ، لكن الشركات المصنعة لديها بالفعل أنظمة تسليم مفتاح في العرض. وبالمثل ، فإن تقنيات مجموعة STED والإضاءة المهيكلة و 4Pi متاحة تجارياً ويجب أن تظهر أدوات إضافية في السنوات القليلة القادمة. يجب أن تكون هذه الأحداث نعمة لعلماء الأحياء الخلوية غير القادرين على بناء أدواتهم و / أو برمجياتهم الخاصة ، لكنهم يريدون إجراء تجارب بدقة عالية.

      المؤلفون المساهمون

      ماتس جي إل جوستافسون ، إريك بيتزيج ، وهارالد إف هيس - معهد هوارد هيوز الطبي ، حرم أبحاث مزرعة جانيليا ، أشبورن ، فيرجينيا ، 20147.

      جورج إتش باترسون - قسم البيوفوتونيك ، المعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية ، المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، ماريلاند ، 20892.

      جينيفر ليبينكوت شوارتز - برنامج بيولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي ، معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، ميريلاند ، 20892.

      مايكل دبليو ديفيدسون - المختبر الوطني للحقل المغناطيسي العالي ، 1800 إيست بول ديراك دكتور ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي ، فلوريدا ، 32310.


      التصوير اللطيف

      يوفر التصوير الزمني والوقت المتألق للخلايا الحية نظرة ثاقبة للديناميات داخل الخلايا والجزيئية ، وتكاثر الخلايا ، وحركة الخلية والعديد من الجوانب الأخرى. في حالة الخلايا السرطانية ، يمكن أن يؤدي هذا ، على سبيل المثال ، إلى فهم أفضل لمقاومة الأدوية لتطوير علاجات جديدة. ومع ذلك ، يمكن للضوء أن يتفاعل مع الجزيئات داخل الخلايا أو الفلوروفور لإنتاج الجذور الحرة ، وقد يؤدي التصوير طويل المدى للخلايا إلى السمية الضوئية.

      يلتقط التصوير السريع واللطيف العمليات الديناميكية ، ولكنه يقلل أيضًا من التعرض للضوء. للتصوير بالخلايا الحية على المدى الطويل ، على مدار ساعات أو أيام أو حتى أسابيع ، من الضروري تمكين منصة التصوير لالتقاط المعلومات مع الحفاظ على التوازن الخلوي واستقرار النظام.


      التطبيقات مجهر الإسفار

      يستخدم الفحص المجهري الفلوري على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي وفي البيئة الميكروبية (لتعداد البكتيريا في البيئات الطبيعية).

      تظهر عينة ملطخة بالأجسام المضادة الفلورية العديد ، التوكسوبلازما ص. تاشيزويت
      (رصيد الصورة: CDC)