معلومة

اختبار التكميل المساعد مع الخميرة

اختبار التكميل المساعد مع الخميرة


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إذا نمت السلالات المساعدة على الحد الأدنى من الوسائط ، فهل تكمل بعضها البعض أم لا؟ أيضا ، هل التكملة هي نفسها تكامل بعضها البعض؟


إذا كانت سلالة الخميرة A مساعدة في التغذية لـ AA 1 وسلالة الخميرة B مساعدة التغذية لـ AA 2 ، فلن يكون أي منهما قادرًا على النمو في الحد الأدنى من المتوسط ​​بمفرده. لكنها مجتمعة تكمل نقص AA1 في السلالة A عن طريق السلالة B والعكس صحيح. هذا هو مكمل التمثيل الغذائي.


اختبار التكميل

سيراجع محررونا ما قدمته ويحددون ما إذا كان ينبغي مراجعة المقالة أم لا.

اختبار التكميل، وتسمى أيضا اختبار رابطة الدول المستقلة، في علم الوراثة ، اختبار لتحديد ما إذا كانت طفرتان مرتبطتان بنمط ظاهري معين يمثلان شكلين مختلفين من نفس الجين (الأليلات) أو اختلافات في جينين مختلفين. يعد اختبار التكميل مناسبًا للصفات المتنحية (الصفات غير موجودة عادة في النمط الظاهري بسبب إخفاء بواسطة أليل سائد). في الحالات التي يكون فيها كائنان أصليان يحمل كل منهما جينين متحولين في حالة متنحية متماثلة اللواقح ، مما يتسبب في التعبير عن السمة المتنحية ، يمكن أن يحدد اختبار التكميل ما إذا كان سيتم التعبير عن السمة المتنحية في الجيل التالي.

عندما تحدث طفرتان في جينات مختلفة ، يقال إنهما مكملان ، لأن حالة الزيجوت المتغاير تنقذ الوظيفة المفقودة في الحالة المتنحية متماثلة اللواقح. ومن ثم ، فإن المصطلح اختبار التكميل يستخدم لوصف عملية اختبار وظيفة الجين في الأليلة المتنحية. الاسم البديل اختبار رابطة الدول المستقلة يصف المكونين المركزيين للاختبار. الشروط رابطة الدول المستقلة و عبر تشير إلى العلاقة بين الطفرتين ، مع رابطة الدول المستقلة تستخدم لوصف الطفرات التي تحدث في نفس الكروموسوم و عبر تستخدم لوصف الطفرات التي تحدث في الكروموسومات المختلفة. يعمل جزء رابطة الدول المستقلة من اختبار التكميل بشكل أساسي كعنصر تحكم ويتضمن إنشاء متغاير الزيجوت (كروموسوم واحد متحور وواحد من النوع البري ، أو كروموسوم عادي) بحيث يحمل أحد الوالدين الطفرتين. في اختبار رابطة الدول المستقلة ، يتم دائمًا إنتاج بروتين وظيفي بغض النظر عما إذا كانت كلتا الطفرتين على نفس الجين أو على جينات مختلفة. يتضمن الاختبار العابر تكوين زيجوت متغايرة مع طفرات مختلفة من آباء مختلفين. في هذه الحالة ، يتم إنتاج بروتين وظيفي فقط إذا كانت الطفرات على جينات مختلفة.

تمت مراجعة هذا المقال وتحديثه مؤخرًا بواسطة كارا روجرز ، كبير المحررين.


7.11 هـ: التكملة

  • بمساهمة من Boundless
  • علم الأحياء الدقيقة العام في Boundless

يشير التكميل إلى العلاقة بين سلالتين مختلفتين من الكائن الحي التي تحتوي كلاهما على طفرات متنحية متماثلة اللواقح تنتج نفس النمط الظاهري (على سبيل المثال ، تغيير في بنية الجناح في الذباب) ولكنهما لا يتواجدان في نفس الجين (المتماثل).

هذه السلالات هي تكاثر حقيقي لطفراتها. إذا ، عندما يتم عبور هذه السلالات مع بعضها البعض ، تظهر بعض النسل انتعاشًا للنمط الظاهري من النوع البري ، يُقال إنها تُظهر تكملة وراثية و rdquo. عندما يحدث هذا ، تزود كل سلالة و rsquos أحادية العدد أليلًا من النوع البري لـ & ldquocomplement & rdquo الأليل المتحور للسلالة الأخرى و rsquos فرداني الصبغة ، مما يتسبب في حدوث طفرات متغايرة الزيجوت في النسل في جميع الجينات ذات الصلة. نظرًا لأن الطفرات متنحية ، فإن النسل سيعرض النمط الظاهري من النوع البري.

يشير اختبار التكميل (يُسمى أحيانًا اختبار a & ldquocis-trans & rdquo) إلى هذه التجربة التي طورها عالم الوراثة الأمريكي إدوارد ب. لويس. يجيب على السؤال: & ldquo هل تنقذ نسخة من النوع البري من الجين X وظيفة الأليل الطافر الذي يُعتقد أنه يحدد الجين X؟ & rdquo. إذا كان هناك أليل ذو نمط ظاهري يمكن ملاحظته يمكن توفير وظيفته من خلال نمط وراثي من النوع البري (أي أن الأليل متنحي) ، فيمكن للمرء أن يسأل عما إذا كان يمكن توفير الوظيفة المفقودة بسبب الأليل المتنحي بواسطة نمط وراثي متحور آخر. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيجب أن يكون الأليلين معيبين في نفس الجين. يكمن جمال هذا الاختبار في أن السمة يمكن أن تكون بمثابة قراءة لوظيفة الجين حتى بدون معرفة ما يفعله الجين على المستوى الجزيئي.

شكل: اختبار التكميل: مثال على اختبار التكميل. سلالتان من الذباب ذات عيون بيضاء بسبب طفرتين جسميتين متنحيتين مختلفتين تقطعان خطوات مختلفة في مسار استقلابي واحد ينتج الصباغ. الذباب من السلالة 1 لديه طفرات تكميلية للذباب من السلالة 2 لأنه عندما يتم عبورهم يكون النسل قادرًا على إكمال المسار الأيضي الكامل وبالتالي تكون عيونهم حمراء.

ينشأ التكامل لأن فقدان الوظيفة في الجينات المسؤولة عن الخطوات المختلفة في نفس المسار الأيضي يمكن أن يؤدي إلى نفس النمط الظاهري. عندما يتم تربية السلالات معًا ، يرث النسل نسخًا من النوع البري لكل جين من أي من الوالدين. نظرًا لأن الطفرات متنحية ، فهناك استعادة للوظيفة في هذا المسار ، لذلك يستعيد النسل النمط الظاهري من النوع البري. وبالتالي ، يتم استخدام الاختبار لتحديد ما إذا كان هناك نمطين ظاهريين متنحيين متنحيين مشتقين بشكل مستقل بسبب طفرات في نفس الجين أو في جينين مختلفين. إذا كان لكل من السلالتين الأم طفرات في نفس الجين ، فلن يتم توريث أي إصدارات طبيعية من الجين من قبل النسل الذي يعبر عن نفس النمط الظاهري للطفرة وفشل التكميل.

بعبارة أخرى ، إذا كان الجمع بين جينومين أحادي الصبغيات يحتويان على طفرات متنحية مختلفة ينتج نمطًا ظاهريًا متحورًا ، فهناك ثلاثة احتمالات: تحدث الطفرات في نفس الجين.تؤثر طفرة واحدة على التعبير عن الطفرة الأخرى التي قد تؤدي إلى منتج مثبط. إذا كان الجمع بين اثنين من الجينوم أحادي العدد يحتويان على طفرات متنحية مختلفة ينتج النمط الظاهري من النوع البري ، فيجب أن تكون الطفرات في جينات مختلفة.


اختبار علامات التحديد المساعدة للاستخدام في الطحلب فيسكوميتريلا يوفر رؤى جديدة في آليات إعادة التركيب المستهدف

الطحلب باتينز فيسكوميتريلا هي فريدة من نوعها بين النباتات في أن إعادة التركيب المتماثل يمكن استخدامه لضرب الجينات ، تمامًا كما هو الحال في الخميرة. علاوة على ذلك ، يمكن إنقاذ البلازميدات المحولة فيسكوميتريلا الرجوع الى الإشريكية القولونيةتشبه الخميرة. في هذه الدراسة ، قمنا باختبار ما إذا كان يمكن استخدام أداة مهمة ثالثة من علم الوراثة الجزيئي للخميرة ، وهي علامات الانتقاء المساعدة ، في فيسكوميتريلا. تم صنع سلالتين من الطحالب المساعدة عن طريق ضرب PpHIS3 ترميز الجين إيميدازوليجليسرول-فوسفات ديهيدراتاز ، و PpTRP1 الجين المشفر لأيزوميراز فسفوريبوزيلانثرانيلات ، مما يعطل التخليق الحيوي للهيستيدين والتربتوفان ، على التوالي. النتيجة PpHIS3Δ و PpTRP1Δ سلالات الضربة القاضية لم تكن قادرة على النمو في وسط ينقصه الهيستيدين أو التربتوفان. ال PpHIS3تم استخدام سلالة Δ لاختبار اختيار المحولات من خلال تكملة علامة مساعدة. وجدنا أن PpHIS3Δ يمكن استكمال السلالة بالتحول ببلازميد يعبر عن PpHIS3 الجين من CaMV 35S المروج ، مما يسمح للسلالة بالنمو في المتوسط ​​الذي يفتقر إلى الهيستيدين. يمكن لكل من البلازميدات الخطية والبلازميدات فائقة الالتفاف الدائرية أن تكمل العلامة المساعدة ، ويمكن إنقاذ البلازميدات من كلا النوعين من المحولات مرة أخرى إلى بكتريا قولونية. كانت البلازميدات التي تم إنقاذها من المحولات الدائرية متطابقة مع البلازميد الأصلي ، في حين أن البلازميدات التي تم إنقاذها من المحولات الخطية كانت لها عمليات حذف ناتجة عن إعادة التركيب بين التماثلات الدقيقة في البلازميدات. تظهر نتائجنا أن الاستنساخ عن طريق تكملة علامة مساعدة في التغذية يعمل في فيسكوميتريلا، مما يفتح الباب لاستخدام علامات الانتقاء المساعدة في علم الوراثة الجزيئية الطحلبية. سيسهل هذا تكييف الطرق المعتمدة على بلازميد المكوك من الوراثة الجزيئية للخميرة لاستخدامها في فيسكوميتريلا.

الكلمات الدالة: Physcomitrella patens auxotrophic Selection marker المكمل imidazoleglycerol-phosphate dehydratase phosphoribosylanthranilate isomerase plasmid الإنقاذ المكوك البلازميد.

الأرقام

تستخدم البلازميدات لصنع ...

تستخدم البلازميدات لجعل التغذية PpHIS3 Δ و PpTRP1 Δ سلالات بالضربة القاضية ...

التحقق من تفاعل البلمرة المتسلسل لـ ...

التحقق من تفاعل البلمرة المتسلسل لـ PpHIS3 Δ و PpTRP1 Δ بالضربة القاضية. PCRs ...

تفاعلات البلمرة المتسلسلة على الجينوم ...

تفاعلات البلمرة المتسلسلة على الحمض النووي الجيني من PpHIS3 Δ و PpTRP1 Δ…

الأنماط الظاهرية لـ PpHIS3 Δ الضربة القاضية ...

الأنماط الظاهرية لـ PpHIS3 Δ سلالات بالضربة القاضية. ال PpHIS3 Δ سلالات B8 و J7 ...

الأنماط الظاهرية لـ PpTRP1 Δ الضربة القاضية ...

الأنماط الظاهرية لـ PpTRP1 Δ سلالات بالضربة القاضية. ال PpTRP1 Δ سلالات (B4 و N4 و ...

تحول PpHIS3 Δ…

تحول PpHIS3 Δ سلالة بالضربة القاضية ببلازميد pHGZ404 دائري أو خطي. ...

التحقق من تفاعل البلمرة المتسلسل لـ ...

التحقق من تفاعل البلمرة المتسلسل لوجود البلازميد PpHIS3 علامة في ...

تفاعل البلمرة المتسلسل للتأكيد ...

تفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد تكوين المتسلسلة للبلازميدات pHGZ404 في المحولات عن طريق ...

تفاعل البلمرة المتسلسل للتحقق ...

تفاعل البلمرة المتسلسل للتحقق من التكامل في BS213 المكان. كانت تقارير PCR ...

تكامل pHGZ404 كونكاتيمرز في ...

تكامل pHGZ404 كونكاتسرز في المعطلة PpHIS3 Δ الموضع عن طريق إعادة التركيب المتماثل ...

فحص لمقاومة G418 في ...

الفحص لمقاومة G418 في محولات مختلفة من PpHIS3 Δ سلالة مع ...

تجربة تفاعل البلمرة المتسلسل من أجل ...

تجربة تفاعل البلمرة المتسلسل للتحقق من وجود nptII علامة…

تجربة فقدان البلازميد للتحقق ...

تجربة فقدان البلازميد للتحقق من الاحتفاظ بمقاومة G418 في محولات مختلفة ...

هياكل البلازميدات التي كانت ...

هياكل البلازميدات التي تم إنقاذها من الطحالب المتحولة مرة أخرى الإشريكية القولونية.…


Apolinario E ، Nocero M ، Jin M ، Hoffman CS (1993) الاستنساخ والتلاعب في شيزوساكارومايس بومب له 7 + الجين كعلامة انتقائية جديدة للدراسات الجينية الجزيئية. جين العملة 24: 491-495

Bahler J، Wu JQ، Longtine MS، Shah NG، McKenzie A، Steever AB، Wach A، Philippsen P، Pringle JR (1998) وحدات غير متجانسة لاستهداف الجين القائم على PCR الفعال والمتعدد الاستخدامات في شيزوساكارومايس بومب. الخميرة 14: 943-951

Banszky L ، Simonics T ، Maraz A (2003) استقلاب الكبريتات في مقاومة السيلينات شيزوساكارومايس بومب المسوخ. J Gen Appl Microbiol 49: 271–278

Baroni M و Livian S و Martegani E و Alberghina L (1986) الاستنساخ الجزيئي وتنظيم التعبير عن جين MET2 لـ خميرة الخميرة. الجين 46: 71-78

Burke JD ، Gould KL (1994) الاستنساخ الجزيئي وتوصيف Schizosaccharomyces pombe his3 الجين لاستخدامه كعلامة اختيار. مول جينيه 242: 169-176

Chen D، Toone WM، Mata J، Lyne R، Burns G، Kivinen K، Brazma A، Jones N، Bahler J (2003) الاستجابات النسخية العالمية لخميرة الانشطار للإجهاد البيئي. خلية مول بيول 14: 214-229

كوتاريل جي (1995) خميرة الخميرة تكمل جينات HIS3 و LYS2 شيزوساكارومايس بومب له5-303 و lys1-131 الطفرات ، على التوالي: علامات اختيار جديدة ومتجهات مكوكية متعددة الأغراض جديدة ، pSP3 و pSP4. جينات العملة 28: 380–383

Dang VD ، Valens M ، Bolotin-Fukuhara M ، Daignan-Fornier B (1996) استنساخ جينات ASN1 و ASN2 التي تشفر تركيبات الأسباراجين في خميرة الخميرة: التنظيم التفاضلي بواسطة عامل ربط الصندوق CCAAT. مول ميكروبول 22: 681-692

Davis L ، Smith GR (2001) إعادة التركيب العضلي وفصل الكروموسوم في شيزوساكارومايس بومب. Proc Natl Acad Sci USA 98: 8395-8402

Deng L ، و Sugiura R ، و Takeuchi M ، و Suzuki M ، و Ebina H ، و Takami T ، و Koike A ، و Iba S ، و Kuno T (2006) المراقبة في الوقت الفعلي لنشاط الكالسينورين في الخلايا الحية: دليل على مسارين متميزين من الكالسيوم 2+ في الخميرة الانشطارية. خلية مول بيول 17: 4790-4800

Fujita Y ، Giga-Hama Y ، Takegawa K (2005) تطوير نظام التحول الجيني باستخدام علامات جديدة قابلة للاختيار لخميرة الانشطار شيزوساكارومايس بومب. الخميرة 22: 193 - 202

Fujita Y، Ukena E، Iefuji H، Giga-Hama Y، Takegawa K (2006) يتسبب تراكم الهوموسيستين في حدوث خلل في التخليق الحيوي للبورين: مزيد من التوصيف شيزوساكارومايس بومب الميثيونين auxotrophs. علم الأحياء الدقيقة 152: 397-404

Giga-Hama Y، Kumagai H (1999) نظام التعبير للجينات الأجنبية باستخدام الخميرة الانشطارية شيزوساكارومايس بومب. Biotechnol Appl Biochem 30 (جزء 3): 235-244

Grimm C، Kohli J، Murray J، Maundrell K (1988) الهندسة الوراثية لـ شيزوساكارومايس بومب: نظام لتعطيل الجينات واستبدالها باستخدام جين ura4 كعلامة انتقائية. مول جينيه 215: 81-86

جورتين د ، تراوتمان إس ، ماكولوم د (2002) الحركية الخلوية في حقيقيات النوى. ميكروبيول مول بيول القس 66: 155 - 178

Hayles J ، Nurse P (1992) علم الوراثة من الخميرة الانشطارية شيزوساكارومايس بومب. Annu Rev Genet 26: 373-402

Hentges P، Van Driessche B، Tafforeau L، Vandenhaute J، Carr AM (2005) ثلاثة أشرطة علامات جديدة للمضادات الحيوية لاضطراب الجينات وتبديل العلامات شيزوساكارومايس بومب. الخميرة 22: 1013-1019

Hoffman RL ، Hoffman CS (2006) استنساخ شيزوساكارومايس بومب lys2 + الجين وبناء أدوات وراثية جزيئية جديدة. جين العملة 49: 414-420

Hoheisel JD و Maier E و Mott R و McCarthy L و Grigoriev AV و Schalkwyk LC و Nizetic D و Francis F و Lehrach H (1993) خرائط Cosmid و P1 عالية الدقة تغطي جينوم 14 ميغا بايت من الخميرة الانشطارية س. بومبي. الخلية 73: 109-120

Ito H ، Fukuda Y ، Murata K ، Kimura A (1983) تحويل خلايا الخميرة السليمة المعالجة بالكاتيونات القلوية. J Bacteriol 153: 163–168

Iwaki T ، Takegawa K (2004) مجموعة من أشرطة علامة loxP لاضطراب الجينات المتعددة بوساطة Cre في شيزوساكارومايس بومب. Biosci Biotechnol Biochem 68: 545-550

Kaur R ، Ingavale SS ، Bachhawat AK (1997) اضطراب الجينات المباشر بوساطة PCR في شيزوساكارومايس بومب. الأحماض النووية الدقة 25: 1080-1081

Keeney JB ، Boeke JD (1994) التكامل المستهدف الفعال في ليو1-32 و ura4-294 في شيزوساكارومايس بومب. علم الوراثة 136: 849-856

Lorenz MC ، Muir RS ، Lim E ، McElver J ، Weber SC ، Heitman J (1995) اضطراب الجينات مع منتجات PCR في خميرة الخميرة. الجين 158: 113-117

Ma Y و Kuno T و Kita A و Asayama Y و Sugiura R (2006) Rho2 هو هدف لـ Farnesyltransferase Cpp1 ويعمل في بداية إشارة Pmk1 MAP Kinase في خميرة الانشطار. خلية مول بيول 12: 5028-5037

Maftahi M ، Nicaud JM ، Levesque H ، Gaillardin C (1995) تحليل تسلسل لجزء 24.7 كيلو بايت من كروموسوم الخميرة الرابع عشر يحدد ستة جينات معروفة ، وعضو جديد في عائلة ناقلات hexose وعشرة إطارات قراءة مفتوحة جديدة. الخميرة 11: 1077-1085

Masselot M ، Robichon-Szulmajster H (1975) التخليق الحيوي للميثيونين في خميرة الخميرة. I. التحليل الجيني للطفرات المساعدة. مول جينيه 139: 121-132

Maundrell K (1993) نواقل التعبير القابلة للقمع للثيامين pREP و pRIP للخميرة الانشطارية. الجين 123: 127-130

Millar JB و Buck V و Wilkinson MG (1995) Pyp1 و Pyp2 PTPases تنزع الفسفرة من كيناز MAP الذي يتحكم في حجم الخلية عند الانقسام في خميرة الانشطار. جينات ديف 9: 2117-2130

Moreno S، Klar A، Nurse P (1991) التحليل الجيني الجزيئي لخميرة الانشطار شيزوساكارومايس بومب. طرق الإنزيمول 194: 795-823

Mortimer RK، Hawthorne DC (1966) رسم الخرائط الجينية في السكريات. علم الوراثة 53: 165 - 173

Rothstein RJ (1983) خطوة واحدة اضطراب الجينات في الخميرة. طرق الإنزيمول 101: 202-211

Shiozaki K ، Russell P (1995) التحكم في دورة الخلية المرتبط بالبيئة خارج الخلية عن طريق مسار كيناز MAP في الخميرة الانشطارية. طبيعة 378: 739-743

Sugiura R ، Toda T ، Shuntoh H ، Yanagida M ، Kuno T (1998) بمب 1 + ، وهو مثبط لنقص الكالسينيورين ، يقوم بترميز فوسفاتاز كيناز MAP الجديد في الخميرة الانشطارية. EMBO J 17: 140–148

تاكاهاشي K، Yanagida M (2000) دورة الخلية. يلتقي النسخ المتماثل بالتماسك. Science 289: 735-736

Thomas D ، Surdin-Kerjan Y (1997) استقلاب الأحماض الأمينية الكبريتية في خميرة الخميرة. ميكروبيول مول بيول القس 61: 503-532

Toda T، Dhut S، Superti-Furga G، Gotoh Y، Nishida E، Sugiura R، Kuno T (1996) الخميرة الانشطارية pmk1 + الجين يشفر متجانس بروتين كيناز جديد ينشط الميتوجين والذي ينظم سلامة الخلية ويعمل بالتنسيق مع مسار بروتين كيناز سي. خلية مول بيول 16: 6752-6764

واديل إس ، جينكينز جونيور (1995) arg3 + ، نظام علامة اختيار جديد لـ شيزوساكارومايس بومب: تطبيق ura4 + كعلامة تكامل قابلة للإزالة. الأحماض النووية الدقة 23: 1836-1837

Wood V، Gwilliam R، Rajandream MA، Lyne M، Lyne R، Stewart A، Sgouros J، Peat N، Hayles J، Baker S، Basham D، Bowman S، Brooks K، Brown D، Brown S، Chillingworth T، Churcher C ، Collins M ، Connor R ، Cronin A ، Davis P ، Feltwell T ، Fraser A ، Gentles S ، Goble A ، Hamlin N ، Harris D ، Hidalgo J ، Hodgson G ، Holroyd S ، Hornsby T ، Howarth S ، Huckle EJ ، Hunt S و Jagels K و James K و Jones L و Jones M و Leather S و McDonald S و McLean J و Mooney P و Moule S و Mungall K و Murphy L و Niblett D و Odell C و Oliver K و O'Neil S و Pearson D ، Quail MA ، Rabbinowitsch E ، Rutherford K ، Rutter S ، Saunders D ، Seeger K ، Sharp S ، Skelton J ، Simmonds M ، Squares R ، Squares S ، Stevens K ، Taylor K ، Taylor RG ، Tivey A ، Walsh S ، Warren T، Whitehead S، Woodward J، Volckaert G، Aert R، Robben J، Grymonprez B، Weltjens I، Vanstreels E، Rieger M، Schafer M، Muller-Auer S، Gabel C، Fuchs M، Dusterhoft A، Fritzc C، Holzer E ، Moestl D ، Hilbert H ، Borzym K ، Langer I ، Beck A ، Lehrach H ، Reinhardt R ، Pohl TM ، Eger P ، Zimmermann W ، Wedler H ، W ambutt R، Purnelle B، Goffeau A، Cadieu E، Dreano S، Gloux S، Lelaure V، Mottier S، Galibert F، Aves SJ، Xiang Z، Hunt C، Moore K، Hurst SM، Lucas M، Rochet M، Gaillardin C ، Tallada VA، Garzon A، Thode G، Daga RR، Cruzado L، Jimenez J، Sanchez M، del Rey F، Benito J، Dominguez A، Revuelta JL، Moreno S، Armstrong J، Forsburg SL، Cerutti L، Lowe T، McCombie WR، Paulsen I، Potashkin J، Shpakovski GV، Ussery D، Barrell BG، Nurse P، Cerrutti L (2002) تسلسل الجينوم شيزوساكارومايس بومب. Nature 415: 871–880

يوشيدا تي ، تودا تي ، ياناجيدا م (1994) جين شبيه بالكالسينورين ppb1 + في الخميرة الانشطارية: عيوب متحولة في الحركة الخلوية ، قطبية الخلية ، التزاوج وموضع جسم عمود الدوران. J Cell Sci 107 (Pt 7): 1725-1735

Zhao Y و Lieberman HB (1995) شيزوساكارومايس بومب: نموذج للدراسات الجزيئية للجينات حقيقية النواة. خلية الحمض النووي بيول 14: 359-371


أنواع الخميرة

الشكل 2. تصنيف وسائط نمو الخميرة المعقدة

الشكل 3. تصنيف وسط نمو الخميرة الاصطناعية

يمكن استخدام الحد الأدنى من الوسائط الاصطناعية مع المكملات الغذائية الوسيطة المتسربة لإنشاء وسائط انتقائية لتنمية ثقافات الخميرة المساعدة.

علاوة على ذلك ، يمكن تفريخ سلالات الخميرة باستخدام وسائط تبوغ محددة. يمكن أيضًا استخدام وسائط المؤشر لتمييز سلالات الخميرة التي إما تخمر أو لا تخمر سكريات معينة ، مثل الجالاكتوز أو المالتوز.


ظهور الخميرة

أطلقت ناسا قمرًا صناعيًا إلى مداره يوم الخميس يحمل مختبرًا دقيقًا مليئًا بالخميرة لاختبار ما إذا كانت بعض الكائنات الحية أكثر مقاومة للعقاقير في الفضاء الخارجي. وفقا ل نيويورك تايمز، "[y] شرق يستخدم غالبًا لدراسة الأسئلة البيولوجية الأساسية." لماذا الخميرة في متناول اليد؟

لأن خلاياه تشبه الخلايا البشرية ولكنها تنمو بشكل أسرع. الاستخدام الأكثر شيوعًا للخميرة ، بصرف النظر عن خبز الخبز وتخمير الجعة ، هو اختبار كيفية تأثير عقار معين أو مادة كيميائية أو إنزيم على الكائنات الحية أحادية الخلية. مثل الخلايا البشرية ، تمتلك خلايا الخميرة بنية نموذجية حقيقية النواة ، بما في ذلك النواة والسيتوبلازم والميتوكوندريا. * تشترك الخميرة أيضًا في العديد من الجينات مع الخلايا البشرية ، لذلك إذا كنت تريد معرفة ما يفعله دواء معين بجين بشري معين ، فيمكنك غالبًا اختباره على خلايا الخميرة أولاً. (هذا ليس خيارًا دائمًا: تحتوي الخميرة على حوالي 6000 جين ، بينما يحتوي الجينوم البشري على حوالي 25000 جين). وبينما تقسم الخلايا البشرية بمعدل مرة واحدة كل 12 ساعة تقريبًا ، تنقسم الخميرة مرة كل ساعتين أو نحو ذلك. وهذا يعني أنه يمكن للعلماء تنمية الثقافات وإتمام التجارب مع الخميرة بشكل أسرع عدة مرات من المواد البشرية.

الخميرة هي أيضا مرنة بشكل لا يصدق. هناك الآلاف من الأنواع والسلالات المختلفة ، لكل منها تركيبته الجينية الخاصة. يستخدم العديد من الباحثين خميرة الخميرة، أو خميرة الخبز البسيطة. ولكن من أكثر الخصائص جاذبية للخميرة أنه يمكنك تخصيصها حسب الطلب. لنفترض أنك تريد دراسة جين معين: يمكنك شراء سلالة بهذا الجين "تم إزالتها" أو التخلص منها ، لترى ما سيحدث عندما تختفي. (لجميع احتياجات سلالة الخميرة ، اذهب هنا.) على سبيل المثال ، تشترك خلايا الخميرة والخلايا السرطانية في جين يستهدف بعض الأدوية ويضخها للخارج ، مما يجعلها مقاومة للعلاج. عندما تزيل الجين ، تتوقف الخلية عن الضخ. يمكنك أيضًا التخلص من جينات الخميرة الفردية واستبدالها بالجينات البشرية. (عادة ما تنمو الخميرة بنفس السرعة). ويجب في النهاية اختبار الأدوية المخصصة للإنسان على خلايا الأنسجة البشرية أيضًا. لكن يمكن للباحثين حل الكثير من مكامن الخلل مع الخميرة وحدها.

ميزة أخرى لاستخدام الخميرة: إنها آمنة. العمل مع العديد من الكائنات الحية ، وخاصة البكتيريا ، يجب أن يستخدم العلماء طرقًا مضادة للتلوث مثل خزانة التدفق الصفحي. من ناحية أخرى ، فإن معظم الخميرة غير ضارة. من المسلم به أن بعض السلالات يمكن أن تسبب تهيجًا خفيفًا للجلد (فكر في "عدوى الخميرة") ، وهناك بعض السلالات التي يمكن أن تكون قاتلة إذا تم تناولها أو استنشاقها. لكن هذه الأنواع لا تُستخدم في الأبحاث اليومية.

أخيرًا ، الخميرة مفيدة لأننا نعرف الكثير عنها بالفعل. هناك تأثير كرة الثلج: كلما زاد البحث الذي يتم إجراؤه على الخميرة ، يمكن أن تكون الأبحاث المستقبلية أكثر استنارة وتحكمًا. لعبت الخميرة دورًا في الاكتشافات العلمية منذ أوائل القرن العشرين. في عام 1907 ، فاز العالم الألماني إدوارد بوخنر بجائزة نوبل في الكيمياء لأبحاثه المتعلقة بمستخلص الخميرة والتخمير. في عام 2006 ، فاز روجر د. في عام 1996 ، أصبحت الخميرة أول حقيقيات النوى يتم تسلسل جينومها بالكامل ، مما يجعلها أكثر فائدة للاختبارات العلمية.

هل لديك سؤال حول أخبار اليوم؟ اسأل الشرح.

الشرح يشكر جون آريس من جامعة فلوريدا ، ويوري تشيرنوف من جامعة جورجيا للتكنولوجيا ، وباربرا هوبس من جامعة كولجيت.

تصحيح ، 8 مايو 2009: ذكرت هذه المقالة في الأصل أن الخلايا البشرية لها جدران خلوية. (ارجع إلى الجملة المصححة.)


محتويات

للحصول على مثال بسيط لاختبار التكميل ، افترض أن أحد علماء الوراثة مهتم بدراسة سلالتين من الذباب أبيض العينين من النوع Drosophila melanogaster ، والمعروف أكثر باسم ذبابة الفاكهة الشائعة. في هذا النوع ، يكون للذباب البري عيون حمراء ولون العين مرتبط بجينين ، A و B. كل واحد من هذه الجينات يحتوي على أليلين ، سائد يرمز لبروتين عامل (أ و ب على التوالي) ومتنحي يرمز لبروتين معطل (أ و ب على التوالى). نظرًا لأن كلا البروتينين ضروريان لتكوين تصبغ أحمر في العين ، إذا كانت الذبابة متماثلة اللواقح لأي منهما أ أو ب، سيكون لها عيون بيضاء.

بمعرفة ذلك ، قد يقوم عالم الوراثة بإجراء اختبار تكميلي على سلالتين تم الحصول عليهما بشكل منفصل من الذباب الأبيض العينين النقية التكاثر. يتم إجراء الاختبار عن طريق عبور ذببتين ، واحدة من كل سلالة. إذا كان للنسل الناتج عيون حمراء ، يقال إن السلالتين مكملتان إذا كان للنسل عيون بيضاء ، فإنهما لا يكونان كذلك.

إذا كانت السلالات مكملة ، فإننا نتخيل أن إحدى السلالات يجب أن يكون لها نمط وراثي aa BB والأخرى AA bb ، والتي عند التهجين ينتج عنها النمط الجيني AaBb. بمعنى آخر ، كل سلالة متماثلة اللواقح لنقص مختلف ينتج نفس النمط الظاهري. إذا لم تكمل السلالات ، يجب أن يكون لكلاهما أنماط وراثية aa BB أو AA bb أو aa bb. بمعنى آخر ، كلاهما متماثل الزيجوت لنفس النقص ، والذي من الواضح أنه سينتج نفس النمط الظاهري.

يمكن أيضًا إجراء الاختبارات التكميلية باستخدام حقيقيات النوى أحادية الصيغة الصبغية مثل الفطريات والبكتيريا والفيروسات مثل العاثية. [1] أدت الأبحاث التي أُجريت على فطر Neurospora crassa إلى تطوير مفهوم إنزيم الجين الواحد الذي وفر الأساس للتطور اللاحق للوراثة الجزيئية. [2] [3] كان اختبار التكميل أحد الأدوات الرئيسية المستخدمة في عمل Neurospora المبكر ، لأنه كان من السهل القيام به ، وسمح للباحث بتحديد ما إذا كان أي طفرين تغذويين معيبين في نفس الجينات ، أو جينات مختلفة.

تم استخدام اختبار التكميل أيضًا في التطور المبكر لعلم الوراثة الجزيئي عندما كانت العاثية T4 أحد الأشياء الرئيسية للدراسة. [4] في هذه الحالة ، يعتمد الاختبار على العدوى المختلطة للخلايا البكتيرية المضيفة بنوعين مختلفين من طفرات البكتيريا. كان استخدامه مفتاحًا لتحديد معظم جينات الفيروس ، وقدم الأساس لدراسة العمليات الأساسية مثل تكرار الحمض النووي وإصلاحه ، وكيفية بناء الآلات الجزيئية.

التغاير هو ميل الأفراد المهجنين إلى تجاوز والديهم النقيين في الحجم والحيوية. هذه الظاهرة معروفة منذ زمن طويل في الحيوانات والنباتات. يبدو أن التغاير يرجع إلى حد كبير إلى التكامل الجيني ، أي إخفاء الأليلات المتنحية الضارة في الأفراد الهجين.

بشكل عام ، الجانبان الأساسيان للتكاثر الجنسي في حقيقيات النوى هما الانقسام الاختزالي، و التهجين. تم اقتراح هذين الجانبين ليكون لهما ميزتان انتقائيتان طبيعيتان ، على التوالي. الانقسام الاختزالي يُقترح أن يكون قابلاً للتكيف لأنه يسهل الإصلاح التأثيلي لأضرار الحمض النووي التي يصعب إصلاحها بخلاف ذلك. التهجين يُقترح أن يكون قابلاً للتكيف لأنه يسهل التكميل ، أي إخفاء الأليلات المتنحية الضارة [5] (انظر أيضًا Heterosis). تم اقتراح فائدة إخفاء الأليلات الضارة كعامل رئيسي في الحفاظ على التكاثر الجنسي بين حقيقيات النوى. علاوة على ذلك ، فإن الميزة الانتقائية للتكامل الذي ينشأ من التهجين قد تفسر إلى حد كبير التجنب العام للزواج الداخلي في الطبيعة (على سبيل المثال ، انظر مقالات التعرف على الأقارب ، الاكتئاب الداخلي وسفاح المحارم المحرمات). [ بحاجة لمصدر ]

تستخدم من قبل علم الوراثة الكمية للكشف عن الطفرات المتنحية. هنا يأخذ المرء أوجه القصور ويعبرها إلى النمط الفرداني الذي يعتقد أنه يحتوي على متحولة متنحية.

هناك استثناءات لهذه القواعد. قد يفشل اثنان من الطفرات غير الأليلية أحيانًا في التكميل (يُطلق عليه "عدم التكامل غير الأليلي" أو "عدم التكامل غير المرتبط"). هذا الموقف نادر ويعتمد على الطبيعة الخاصة للطفرات التي يتم اختبارها. على سبيل المثال ، قد تكون طفرتان سلبيتان مهيمنتان صناعياً. الاستثناء الآخر هو الاستثناء ، حيث تكمل التركيبة غير المتجانسة من أليلين مع طفرات في أجزاء مختلفة من الجين بعضها البعض لإنقاذ النمط الظاهري من النوع البري.

عندما يتم قياس التكامل بين طافرين معيبين في نفس الجين ، وجد بشكل عام أنه لا يوجد تكامل أو أن النمط الظاهري للتكامل هو وسيط بين الأنماط الظاهرية من النوع الطافرة والبرية. تم إثبات التكامل داخل الجين (ويسمى أيضًا التكامل بين الأليلات) في العديد من الجينات المختلفة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية بما في ذلك الفطريات نيوروسبورا كراسا, خميرة الخميرة و شيزوساكارومايس بومب البكتيريا السالمونيلا تيفيموريوم وجراثيم الفيروس T4. [6] في العديد من هذه الدراسات ، تم عزل العديد من الطفرات المعيبة في نفس الجين ورسم خرائط لها بترتيب خطي على أساس ترددات إعادة التركيب لتشكيل خريطة جينية للجين. بشكل منفصل ، تم اختبار المسوخ في مجموعات زوجية لقياس التكامل. أدى تحليل النتائج من مثل هذه الدراسات إلى استنتاج مفاده أن التكامل داخل الجين ، بشكل عام ، ينشأ من تفاعل مونومرات عديد الببتيد المعيبة بشكل مختلف لتشكيل مجموعة تسمى "مولتيمر". [7] يبدو أن الجينات التي تقوم بتشفير عديد ببتيدات مكونة متعددة المفاعلات شائعة. يتمثل أحد التفسيرات للبيانات في أن مونومرات عديد الببتيد غالبًا ما يتم محاذاة في المولد المتعدد بطريقة تميل إلى تشكيل عديد الببتيدات الطافرة المعيبة في المواقع القريبة في الخريطة الجينية لتشكيل مولتيمر مختلط يعمل بشكل سيء ، في حين تميل عديدات الببتيدات الطافرة المعيبة في المواقع البعيدة إلى تشكيل جهاز متعدد المقاطع يعمل بشكل أكثر فعالية. تمت مناقشة القوى الجزيئية المسؤولة على الأرجح عن التعرف على الذات والتشكيل المتعدد بواسطة Jehle. [8]


Adrio JL، Veiga M، Casqueiro J، L & amp # x00F3pez M & amp Fern & amp # x00E1ndez C (1993) عزل Phaffia rhodozyma المسوخات المساعدة عن طريق طرق التخصيب. ج. الجنرال. أبل. ميكروبيول. 39: 303-312

Adrio JL & amp Veiga M (1995) تحول الخميرة المنتجة لأستازانتين Phaffia rhodozyma. التكنولوجيا الحيوية. التقنيات 9: 509-512

Adrio JL، L & amp # x00F3pez M & amp Casqueiro J (1995) النمط النووي الكهربي للخميرة المنتجة لأستازانتين Phaffia rhodozyma. بالعملة. جينيه. 27: 447 - 450

عزل GH ، Schuman DB & amp Johnson EA (1989) لـ Phaffia rhodozyma المسوخ مع زيادة محتوى أستازانتين. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 55: 116-124

Andrewes AG ، Phaff HJ & amp Starr MP (1976) Carotenoids of Phaffia rhodozyma، خميرة تخمير حمراء مصطبغة. كيمياء النبات 15: 1003 - 1007

Brandiss MC (1979) عزل وتوصيف أولي لـ خميرة الخميرة برولين auxotrophs. J. باكتيريول. 138: 816-822

Brandiss MC & amp Magasanik B (1980) Proline: وسيط أساسي في تدهور الأرجينين في خميرة الخميرة. J. باكتيريول. 143: 1403-1410

Chun SB، Chin JE، Bai S & amp An GH (1992) سلالة تحسين Phaffia rhodozyma عن طريق اندماج البروتوبلاست. FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 93: 221 - 226

Cifuentes V و Hermosilla G و Mart & amp # x00EDnez C و Le & amp # x00F3n R و Pincheira G & amp Jim & amp # x00E9nez A (1997) علم الوراثة والتنميط النووي الكهربي من سلالات متحولة من النوع البري وأستازانتين Phaffia rhodozyma. أنتوني فان ليفينهوك 72: 111-117

Girard P ، Falconnier B ، Bricout J & amp Vladescu B (1994) & amp # x03B2-carotene المنتجة للطفرات Phaffia rhodozyma. ميكروبيول. التكنولوجيا الحيوية. 41: 183 - 191

Golubev W (1995) الحالة المثالية لـ Rhodomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma). الخميرة 11: 101-110

Hermosilla G، Le & amp # x00F3n R، Mart & amp # x00EDnez C & amp Cifuentes V (1995) تكوين وتجديد البروتوبلاست في Phaffia rhodozyma. Bolet & amp # x00EDn Micol & amp # x00F3gico. 10: 71-75.

Johnson EA و Conklin D & amp Lewis MJ (1977) الخميرة Phaffia rhodozyma كمصدر للصبغات الغذائية للسالمون والقشريات. J. صدر السمك. المجلس يمكن. 34: 2417-2421

Johnson EA & amp Lewis M (1979) تكوين أستازانتين بواسطة الخميرة Phaffia rhodozyma. J. الجنرال ميكروبيول. 115: 173 - 183

Jones EW & amp Fink GR (1982) تنظيم التخليق الحيوي للأحماض الأمينية والنيوكليوتيدات في الخميرة. في: Strathern J، et al. (إد) البيولوجيا الجزيئية للخميرة السكريات: التمثيل الغذائي والتعبير الجيني (ص 181). مختبر كولد سبرينج هاربور ، كولد سبرينج هاربور ، نيويورك

Lacroute F ، Pi & amp # x00E9rard A ، Grenson M & amp Wiame JM (1965) التركيب الحيوي لفوسفات الكاربامويل في خميرة الخميرة. J. الجنرال ميكروبيول. 40: 127 - 142

Le & amp # x00F3n R، Hermosilla G، Martinez C & amp Cifuentes V (1994) Mutag & amp # x00E9nesis en Phaffia rhodozyma. اكتا ميكروبيول & amp # x00F3gica 5: 93-101

لويس إم جيه ، راجوت إن ، بيرلانت إم سي وأمبير ميراندا (1990) اختيار أستازانتين الذي ينتج طفرات من Phaffia rhodozyma مع & amp # x03B2-ionona. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 56: 2944 - 2945

Messenguy F (1976) تنظيم التخليق الحيوي للأرجينين في خميرة الخميرة: عزل مسود ، متحولة تأسيسية لتخليق ornithine carbamoyltransferase. J. باكتيريول. 128: 49-55

Miller MW و Yoneyama M & amp Soneda M (1976) فافيا، إلى جنس الخميرة الجديد في ديوتيروميكوتينا (الكريات المتفجرة). كثافة العمليات J. Syst. باكتيريول. 26: 286 - 291

Moat A، Peters N & amp Srb A (1958) اختيار وعزل طفرات الخميرة المساعدة بمساعدة المضادات الحيوية. J. باكتيريول. 77: 673 - 677

Nagy A، Garamszegi N، V & amp # x00E1gv & amp # x00F6lgyi C & amp Ferency L (1994) النمط النووي الكهربي لل Phaffia rhodozyma سلالات. FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 123: 315-318

Palagyi Z, Nagy A, V & #x00E1gv & #x00F6lgyi C & Ferenczy L (1995) A new mutation protocol for obtaining auxotrophic mutants of the yeast Phaffia rhodozyma. التكنولوجيا الحيوية. Techniques 9: 401–402

Phaff HJ & StarmerWT (1989) Yeast associated with plants, insects and soil. In: Rose A & Harrison J (Eds) The Yeasts, vol. 2. (pp 123–180). Academic Press, London

Poulter R, Hanrahan V, Jeffery K, Markie D, Shepherd MG & Sullivan PA (1982) Recombination analysis of naturally diploid المبيضات البيض. J. Bacteriol. 152: 969–975

Poulter RTM & Rikkerink EHA (1983) Genetic analysis of red, adeninerequiring mutants of المبيضات البيض. J. Bacteriol. 156: 1066–1077

Rose M, Winston F & Hieter P (1990) Methods in yeast genetics. A laboratory course manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York

Rubinstein L, Altamirano A, Ducrey-Santopietro L, Baigori M & de Figueroa LC (1996) Transformation of Phaffia rhodozyma by electroporation. التكنولوجيا الحيوية. Techniques 10: 929–932

Sanderson GW & Jolly SO (1994) The value of Phaffia yeast as a feed ingredient for salmonid fish. Aquaculture 124: 193–200

Schroeder WA & Johnson EA (1993) Antioxidant role of carotenoids in Phaffia rhodozyma. J. Gen. Microbiol. 139: 907–912

— (1995) Singlet oxygen and peroxyl radical regulate carotenoid biosynthesis in Phaffia rhodozyma. J. بيول. تشيم. 270: 18374–18379

Snow R(1966) An enrichment method for auxotrophic yeast mutants using the antibiotic nystatin. Nature 21: 206–207

Sullivan PA(1982) Recombination analysis of naturally diploidالمبيضات البيض. J. Bacteriol. 152: 969–975

Torrissen OJ, Hardy RW & Shearer KD (1989) Pigmentation of salmonids carotenoid deposition and metabolism. Aquatic Sci. 1: 209–225

Varga J, V & #x00E1gv & #x00F6lgyi C, Nagy A, Pfeiffer I & Ferenczy L (1995) Isoenzyme, restriction fragment length polymorphism and random amplified polymorphic DNA characterization of Phaffia rhodozyma Miller et al. Int. J. Syst. Bacteriol. 45: 173–177

Vogel HJ (1956) A convenient growth medium for Neurospora (medium N). ميكروبيول. جينيه. ثور. 13: 42–43

Wery J, Dalderup MJM, Linde JT, Boekhout T & van Ooyen AJJ (1996) Structural and phylogenetic analysis of the actin gene from the yeast Phaffia rhodozyma. Yeast. 12: 641–651

Wery J, Gutker D, Renniers ACHM, Verdoes JC & van Ooyen AJJ (1997) High copy number integration into the ribosomal DNA of the yeast Phaffia rhodozyma. Gene 184: 89–97

Whelan WL, Partridge RM & Magee PT (1980) Heterozygosity and segregation in المبيضات البيض. مول. Gen. Genet. 180: 107–113

Whelan WL & Magee PT (1981) Natural heterozygosity in المبيضات البيض. J. Bacteriol. 145: 896–903


ال TRP1 marker has been commonly used for gene disruption experiments and subsequent phenotypic analysis. However, introduction of the TRP1 gene into a trp1 strain markedly affects growth under many conditions used for phenotypic profiling. Therefore, its use in the past should be revisited and utilization of this marker should be avoided in future analyses.

الخميرة في مهدها خميرة الخميرة is one of the best genetically tractable eukaryotic systems because it allows powerful and simple experimental approaches based on both classical and molecular genetics. Genetic modifications such as the targeted inactivation of genes or their controlled expression from centromeric or episomal vectors require the use of selectable marker genes for efficient detection and selection of transformed cells (Botstein & Davis, 1982). The use of auxotrophic markers, mainly URA3, LEU2, TRP1, HIS3, MET15 أو LYS2, has been virtually unavoidable for many years and, even after the relatively recent appearance of dominant drug-based resistance markers, such as geneticin (Wach وآخرون., 1994) or nourseothricin (Goldstein & McCusker, 1999), genetic manipulations in S. cerevisiae involving auxotrophic markers are very common. Frequently, auxotrophic markers are used to carry out gene disruption experiments, followed by the characterization of the phenotypes of the resulting strains. This is always made on the basis that the introduction of the selectable marker does not affect the traits under investigation.

During the course of a phenotypic analysis of several S. cerevisiae strains defective in two alcohol dehydrogenases, an increased tolerance was observed to different metals in an adh6::TRP1 disruptant that was confirmed in two additional adh6::TRP1 strains on different genetic backgrounds. However, different tests allowed to recognize that the observed phenotypes were not caused by the deletion of ADH6 but, instead, originated from the use of a TRP1-based disruption cassette, which converted a trp − strain into trp + . Interestingly, a classic paper describing the construction of the BY strain series alluded only to the well-known cold-sensitive phenotype of trp − strains (Brachmann وآخرون., 1998). A thorough literature search yielded several reports pointing out phenotypic traits attributable to the TRP1 deletion. However, even after recent systematic and refined fitness studies (Giaever وآخرون., 2002), the available information was rather fragmentary, scattered and difficult to identify. Therefore, it was decided to specifically evaluate up to which extent the use of this marker in gene disruption experiments could produce artifactual results.

To this end, a first set of experiments were performed to evaluate the effect of loss of TRP genes using the BY4741 strain (a prototroph for tryptophan) and their isogenic trp1 إلى trp5 غير مرتبطة KanMX deletion mutants (Winzeler وآخرون., 1999), which lack individual genes required for the synthesis of tryptophan from chorismate. These strains were grown on YPD and different dilutions of the cultures were spotted on YPD plates and grown under different conditions. As shown in Fig. 1a, trp1 mutants display sensitivity to high pH. This phenotype is shared with similar potency by trp2 و trp3 strains and with less intensity by trp4 و trp5 الخلايا. Existing reports disagree in this regard, as the alkaline phenotype of trp1 has been observed in some cases (Giaever وآخرون., 2002) but not in others (Serrano وآخرون., 2004 Sambade وآخرون., 2005). In a previous work (Sambade وآخرون., 2005), it was described that the entire collection of tryptophan biosynthetic mutants failed to grow on pH 7.5 plus 60 mM CaCl2. It is shown here that trp mutants, with the remarkable exception of trp3, are slightly sensitive to this cation even at standard pH. Because the traits described above are also found in mutants with impaired vacuolar function, trp1-5 cells were stained with the lipophylic fluorescent dye FM4-64 in order to visualize vacuolar morphology. However, deletion of TRP1-5 does not result in aberrant morphology of vacuoles.

Effect of the presence or the absence of the TRP1 gene on diverse phenotypic traits. (a) The indicated strains were grown on YPD plates for 2 days in the presence of the indicated compounds. Ca, CaCl2 300 mM Caf, Caffeine 7 mM Rap, rapamycin 10 ng mL −1 , Cu, CuSO4 5 mM Fe, (NH4)2Fe(SO4)2 10 mM Zn, ZnCl2 6 mM Spm, spermine 0.5 mM Hyg B, hygromycin B 25 μg mL −1 TMA, tetramethylammonium 0.5 M. (b) The indicated strains were grown in liquid cultures as in (Calero وآخرون., 2000) for 13–14 h in the presence of different concentrations of SDS and the A660 nm of the culture determined. Data are ratios between SDS-treated and untreated cells expressed as percentage and correspond to the means±SEM from three experiments. (c) Wild-type strain JA100 (trp1) was transformed with low-copy plasmid YCp22 bearing the TRP1 marker and spotted on the indicated YPD plates. Caf, caffeine 5 mM Rap, rapamycin 5 ng mL −1 , Cu, CuSO4 4 mM Fe, (NH4)2Fe(SO4)2 10 mM Zn, ZnCl2 4 mM. Plates were incubated for 2 days, except the iron-containing plates (3 days). In panels A and C, two dilutions (1 : 10) are shown. (d) Use of the TRP1 marker masks the alkaline pH sensitive phenotype of a CK2-deficient mutant. The gene CKB1 was disrupted in the DBY746 background with equivalent HIS3 (Bidwai وآخرون., 1995) or TRP1 (de Nadal وآخرون., 1999) markers and the alkaline pH phenotype of the mutants was tested. Note that the genetic background differs from that of Fig. 1a. The presence of the HIS3 marker did not affect pH tolerance (not shown). Growth was scored after 60 h.

Effect of the presence or the absence of the TRP1 gene on diverse phenotypic traits. (a) The indicated strains were grown on YPD plates for 2 days in the presence of the indicated compounds. Ca, CaCl2 300 mM Caf, Caffeine 7 mM Rap, rapamycin 10 ng mL −1 , Cu, CuSO4 5 mM Fe, (NH4)2Fe(SO4)2 10 mM Zn, ZnCl2 6 mM Spm, spermine 0.5 mM Hyg B, hygromycin B 25 μg mL −1 TMA, tetramethylammonium 0.5 M. (b) The indicated strains were grown in liquid cultures as in (Calero وآخرون., 2000) for 13–14 h in the presence of different concentrations of SDS and the A660 nm of the culture determined. Data are ratios between SDS-treated and untreated cells expressed as percentage and correspond to the means±SEM from three experiments. (c) Wild-type strain JA100 (trp1) was transformed with low-copy plasmid YCp22 bearing the TRP1 marker and spotted on the indicated YPD plates. Caf, caffeine 5 mM Rap, rapamycin 5 ng mL −1 , Cu, CuSO4 4 mM Fe, (NH4)2Fe(SO4)2 10 mM Zn, ZnCl2 4 mM. Plates were incubated for 2 days, except the iron-containing plates (3 days). In panels A and C, two dilutions (1 : 10) are shown. (d) Use of the TRP1 marker masks the alkaline pH sensitive phenotype of a CK2-deficient mutant. The gene CKB1 was disrupted in the DBY746 background with equivalent HIS3 (Bidwai وآخرون., 1995) or TRP1 (de Nadal وآخرون., 1999) markers and the alkaline pH phenotype of the mutants was tested. Note that the genetic background differs from that of Fig. 1a. The presence of the HIS3 marker did not affect pH tolerance (not shown). Growth was scored after 60 h.

It was observed that trp1-5 mutants are not particularly sensitive to cell wall-damaging agents such as calcofluor white (CFW) or Congo red, whereas they display a marked growth defect in the presence of sodiumdodecyl sulfate (SDS) at 10 μg mL −1 ( Fig. 1b), that is, a concentration threefold lower than that described in a recent report (Liu وآخرون., 2004). However, the reported growth defect at 1.5 M sorbitol could not be confirmed on YPD plates (Giaever وآخرون., 2002). عدم وجود TRP1-5 confers significant sensitivity to rapamycin, an inhibitor of the TOR pathway. This phenotype was recently described for the trp1, 3, 4 و 5 mutants (Liu وآخرون., 2004 Xie وآخرون., 2005). As shown in Fig. 1a, the trp3 mutation confers a marked phenotype of sensitivity to caffeine, whereas lack of TRP2 causes a lesser effect. This is in contrast with a previous report, in which no effect of caffeine was observed for trp1, 3, 4 أو 5 mutants (Liu وآخرون., 2004). The differential effect of rapamycin and caffeine on trp mutants is striking, because the Tor1 kinase has been recently proposed as a target of caffeine (Kuranda وآخرون., 2006). A remarkable finding is that cells lacking trp1 are somewhat sensitive to metal ions such as iron, copper or zinc. Similarly, trp1 cells are rather sensitive to spermine and Hygromycin B, but only slightly sensitive to TMA. As far as the authors know, these characteristics have not been reported in the past. In contrast, the growth of trp mutants does not differ from wild-type cells under other conditions tested, such as nonfermentable carbon sources (ethanol and glycerol), lithium (0–200 mM LiCl), sodium (0–1.2 M NaCl) or cesium cations (0–100 mM CsCl). A comprehensive catalogue of phenotypes for trp1 cells, tested in the authors' laboratory or/and collected from the literature, is shown in supplementary Table S1.

A second set of experiments were carried out to evaluate the effects of the introduction of the TRP1 gene, which is widely used as a selection marker in plasmid shuttle vectors. The presence of a centromeric YCplac22 (TRP1 marker) plasmid in a trp1 strain (JA100) made the cells more tolerant to alkaline pH, caffeine, rapamycin and diverse metals such as zinc, copper and iron ( Fig. 1c). These are phenotypes opposite to those observed upon disruption of TRP1 (see Fig. 1a). It is worth noting that in contrast to that observed in the BY4741 background, in this strain the presence or absence of TRP1 does similarly affect tolerance to both rapamycin and caffeine. In agreement with the previous results, the tolerance to sorbitol, CFW, Congo Red, LiCl, NaCl or CsCl was unaffected by the presence of TRP1.

In conclusion, the presence or absence of the TRP1 auxotrophic marker can substantially alter the phenotypic traits of a given strain. In contrast, the introduction of LEU2 أو URA3 markers did not affect any of the phenotypic traits investigated here (not shown). The ‘TRP1 effect’ probably has little repercussion when the marker is located in a plasmid carrying a gene to be phenotypically tested, because in this case the same strain carrying an empty plasmid is commonly used as a negative control. ومع ذلك ، عندما TRP1 marker is used in gene disruption experiments, often TRP1 و trp1 strains are compared. This may lead to ascribe a given phenotype to the disruption of the gene under study when, in fact, it is the result of the introduction of the marker. An example of this was hinted at by Bauer (2003) during the characterization of azr1 و pdr12 mutants. As a further example ( Fig. 1d), mutation of CKB1, encoding a regulatory subunit of the CK2 protein kinase using a ckb1::HIS3 disruption cassette in the DBY746 background, results in sensitivity to high pH (this was confirmed with a ckb1::KanMX cassette). However, the use of a ckb1::TRP1 cassette largely eliminates the alkaline pH sensitive phenotype caused by lack of Ckb1 ( Fig. 1d), most probably due to the increased tolerance caused by the presence of the TRP1 gene (see Fig. 1c). Therefore, the utilization of TRP1 as an auxotrophic marker in phenotypic studies should be avoided in future analyses, and it would be wise to revisit results obtained in the past involving its use.


Ashton, N. W., Champagne, C. E. M., Weller, T., and Verkoczy, L. K. (2000). The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements. فيتول جديد. 146, 391�. doi: 10.1046/j.1469-8137.2000.00671.x

Ashton, N. W., and Cove, D. J. (1977). The isolation and preliminary characterisation of auxotrophic and analogue resistant mutants of the moss, Physcomitrella patens. مول. Gen. Genet. 154, 87�. doi: 10.1007/BF00265581

Ashton, N. W., Grimsley, N. H., and Cove, D. J. (1979). Analysis of gametophytic development in the moss, Physcomitrella patens, using auxin and cytokinin resistant mutants. Planta 144, 427�. doi: 10.1007/BF00380118

Beggs, J. D. (1978). Transformation of yeast by a replicating hybrid plasmid. طبيعة سجية 275, 104�. doi: 10.1038/275104a0

Br࿌ker, G., Mittmann, F., Hartmann, E., and Lamparter, T. (2005). Targeted site-directed mutagenesis of a heme oxygenase locus by gene replacement in the moss Ceratodon purpureus. Planta 220, 864�. doi: 10.1007/s00425-004-1411-6

Cove, D. (2005). The moss Physcomitrella patens. Annu. Rev. Genet. 39, 339�. doi: 10.1146/annurev.genet.39.073003.110214

Dellaporta, S. L., Wood, J., and Hicks, J. B. (1983). A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol. بيول. اعادة عد. 1, 19�. doi: 10.1007/BF02712670

Hiwatashi, Y., Obara, M., Sato, Y., Fujita, T., Murata, T., and Hasebe, M. (2008). Kinesins are indispensable for interdigitation of phragmoplast microtubules in the moss Physcomitrella patens. الخلية النباتية 20, 3094�. doi: 10.1105/tpc.108.061705

Hommelsheim, C. M., Frantzeskakis, L., Huang, M., and Ülker, B. (2014). PCR amplification of repetitive DNA: a limitation to genome editing technologies and many other applications. علوم. اعادة عد. 4:5052. doi: 10.1038/srep05052

Ishikawa, M., Murata, T., Sato, Y., Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Imai, A., et al. (2011). Physcomitrella cyclin-dependent kinase A links cell cycle reactivation to other cellular changes during reprogramming of leaf cells. الخلية النباتية 23, 2924�. doi: 10.1105/tpc.111.088005

Jang, G., and Dolan, L. (2011). Auxin promotes the transition from chloronema to caulonema in moss protonema by positively regulating PpRSL1 و PpRSL2 في Physcomitrella patens. فيتول جديد. 192, 319�. doi: 10.1111/j.1469-8137.2011.03805.x

Kamisugi, Y., Cuming, A. C., and Cove, D. J. (2005). Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. الدقة الأحماض النووية. 33, e173. doi: 10.1093/nar/gni172

Kamisugi, Y., Schlink, K., Rensing, S. A., Schween, G., von Stackelberg, M., Cuming, A. C., et al. (2006). The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration. الدقة الأحماض النووية. 34, 6205�. doi: 10.1093/nar/gkl832

Kasahara, M., Kagawa, T., Sato, Y., Kiyosue, T., and Wada, M. (2004). Phototropins mediate blue and red light-induced chloroplast movements in Physcomitrella patens. نبات فيزيول. 135, 1388�. doi: 10.1104/pp.104.042705

Knight, C. D. (1994). Studying plant development in mosses: the transgenic route. Plant Cell Environ. 17, 669�. doi: 10.1111/j.1365-3040.1994.tb00158.x

Lang, D., Zimmer, A. D., Rensing, S. A., and Reski, R. (2008). Exploring plant biodiversity: the Physcomitrella genome and beyond. Trends Plant Sci. 13, 542�. doi: 10.1016/j.tplants.2008.07.002

Last, R. L., Bissinger, P. H., Mahoney, D. J., Radwanski, E. R., and Fink, G. R. (1991). Tryptophan mutants in أرابيدوبسيس: the consequences of duplicated tryptophan synthase beta genes. الخلية النباتية 3, 345�. doi: 10.1105/tpc.3.4.345

Last, R. L., and Fink, G. R. (1988). Tryptophan-requiring mutants of the plant Arabidopsis thaliana. علم 240, 305�. doi: 10.1126/science.240.4850.305

Muralla, R., Sweeney, C., Stepansky, A., Leustek, T., and Meinke, D. (2007). Genetic dissection of histidine biosynthesis in Arabidopsis. نبات فيزيول. 144, 890�. doi: 10.1104/pp.107.096511

Murén, E., Nilsson, A., Ulfstedt, M., Johansson, M., and Ronne, H. (2009). Rescue and characterization of episomally replicating DNA from the moss Physcomitrella. بروك. ناتل. Acad. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 106, 19444�. doi: 10.1073/pnas.0908037106

Nakagawa, T., Kurose, T., Hino, T., Tanaka, K., Kawamukai, K., Niwa, Y., et al. (2007). Development of series of gateway binary vectors, pGWBs, for realizing efficient construction of fusion genes for plant transformation. J. Biosci. Bioeng. 104, 34�. doi: 10.1263/jbb.104.34

Nishiyama, T., Fujita, T., Shin-I, T., Seki, M., Nishide, H., Uchiyama, I., et al. (2003). Comparative genomics of Physcomitrella patens gametophytic transcriptome and نبات الأرابيدوبسيس thaliana: implication for land plant evolution. بروك. ناتل. Acad. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 100, 8007�. doi: 10.1073/pnas.0932694100

Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., and Hasebe, M. (2000). Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. الدقة DNA. 7, 9�. doi: 10.1093/dnares/7.1.9

Olsson, T., Thelander, M., and Ronne, H. (2003). A novel type of chloroplast stromal hexokinase is the major glucose-phosphorylating enzyme in the moss Physcomitrella patens. J. بيول. تشيم. 278, 44439�. doi: 10.1074/jbc.M306265200

Orr-Weaver, T. L., Szostak, J. W., and Rothstein, R. J. (1981). Yeast transformation: a model system for the study of recombination. بروك. ناتل. Acad. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 78, 6354�.

Rensing, S. A., Lang, D., Zimmer, A. D., Terry, A., Salamov, A., Shapiro, H., et al. (2008). ال Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. علم 319, 64�. 1126/science.1150646

Rine, J. (1991). Gene overexpression in studies of Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 194, 239�.

Schaefer, D. G. (1994). Molecular Genetic Approaches to the Biology of the Moss Physcomitrella Patens. Ph.D. thesis, Université de Lausanne, Lausanne.

Schaefer, D. G. (2002). A new moss genetics: targeted mutagenesis in Physcomitrella patens. Annu. القس بيول النبات. 53, 477�. doi: 10.1146/annurev.arplant.53.100301.135202

Schaefer, D. G., Delacote, F., Charlot, F., Vrielynck, N., Guyon-Debast, A., Le Guin, S., et al. (2010). RAD51 loss of function abolishes gene targeting and de-represses illegitimate integration in the moss Physcomitrella patens. إصلاح الحمض النووي 9, 526�. doi: 10.1016/j.dnarep.2010.02.001

Schaefer, D. G., and Zr࿽, J.-P. (1997). Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195�. doi: 10.1046/j.1365-313X.1997.11061195.x

Schaefer, D. G., Zr࿽, J.-P., Knight, C., and Cove, D. (1991). Stable transformation of the moss Physcomitrella patens. مول. Gen. Genet. 226, 418�. doi: 10.1007/BF00260654

Sherwin, J. E., and Purves, W. K. (1969). Tryptophan as an auxin precursor in cucumber seedlings. نبات فيزيول. 44, 1303�. doi: 10.1104/pp.44.9.1303

Stinchcomb, D. T., Struhl, K., and Davis, R. W. (1979). Isolation and characterisation of a yeast chromosomal replicator. طبيعة سجية 282, 39�. doi: 10.1038/282039a0

Thelander, M., Nilsson, A., Olsson, T., Johansson, M., Girod, P.-A., Schaefer, D. G., et al. (2007). The moss genes PpSKI1 و PpSKI2 encode nuclear SnRK1 interacting proteins with homologues in vascular plants. Plant Mol. بيول. 64, 559�. doi: 10.1007/s11103-007-9176-5

Trouiller, B., Charlot, F., Choinard, S., Schaefer, D. G., and Nogué, F. (2009). Comparison of gene targeting efficiencies in two mosses suggests that it is a conserved feature of Bryophyte transformation. التكنولوجيا الحيوية. Lett. 29, 1591�. doi: 10.1007/s10529-007-9423-5

Van Craenenbroeck, K., Vanhoenacker, P., and Haegeman, G. (2000). Episomal vectors for gene expression in mammalian cells. يورو. J. Biochem. 267, k5665�. doi: 10.1046/j.1432-1327.2000.01645.x

Vieira, J., and Messing, J. (1987). Production of single-stranded plasmid DNA. Methods Enzymol. 153, 3�. doi: 10.1016/0076-6879(87)53044-0

Wu, S. Z., Ritchie, J. A., Pan, A. H., Qatrano, R. S., and Bezanilla, M. (2011). Myosin VIII regulates protonemal patterning and developmental timing in the moss Physcomitrella patens. مول. مصنع. 4, 909�. doi: 10.1093/mp/ssr068

Zhao, Y., Hull, A. K., Gupta, N. R., Goss, K. A., Alonso, J., Ecker, J. R., et al. (2002). Trp-dependent auxin biosynthesis in أرابيدوبسيس: involvement of cytochrome P450s CYP79B2 and CYP79B3. تطوير الجينات. 16, 3100�. doi: 10.1101/gad.1035402

Keywords : auxotrophic selection markers, complementation, imidazoleglycerol-phosphate dehydratase, phosphoribosylanthranilate isomerase, Physcomitrella patens, plasmid rescue, shuttle plasmid

Citation: Ulfstedt M, Hu G-Z, Johansson M and Ronne H (2017) Testing of Auxotrophic Selection Markers for Use in the Moss Physcomitrella Provides New Insights into the Mechanisms of Targeted Recombination. أمام. علوم النبات. 8:1850. doi: 10.3389/fpls.2017.01850

Received: 11 July 2017 Accepted: 11 October 2017
Published: 03 November 2017.

Andrew Wood, Southern Illinois University Carbondale, United States
Keiko Sakakibara, Rikkyo University, Japan
Mingfeng Cao, Iowa State University, United States

Copyright © 2017 Ulfstedt, Hu, Johansson and Ronne. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License (CC BY). يُسمح بالاستخدام أو التوزيع أو الاستنساخ في منتديات أخرى ، بشرط أن يتم اعتماد المؤلف (المؤلفين) الأصلي أو المرخص له وأن يتم الاستشهاد بالنشر الأصلي في هذه المجلة ، وفقًا للممارسات الأكاديمية المقبولة. لا يُسمح بأي استخدام أو توزيع أو إعادة إنتاج لا يتوافق مع هذه الشروط.


شاهد الفيديو: تجربة تبين اختلاف كثافة السوائل (شهر فبراير 2023).