معلومة

طبق ميكروتيتر فحص تشكيل بيوفيلم- الزائفة والبنفسج الكريستالي

طبق ميكروتيتر فحص تشكيل بيوفيلم- الزائفة والبنفسج الكريستالي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إذا كانت Pseudomonas عبارة عن بكتيريا سالبة الجرام ، فإنها لا تحتفظ بالبنفسجي الكريستالي ولكن لماذا يستخدم الكثير من الأشخاص تلطيخ البنفسج الكريستالي في اختبار تشكيل الطبق الحيوي Microtiter؟


يتطلب استخدام صبغة جرام للتمييز بين G- و + إضافة الكحول ، وهي الخطوة الحاسمة في تلوين غرام. في الواقع ، الخطوة الأولى ، التلوين البسيط ، تنطبق على جميع أنواع البكتيريا. تكتسب جميع البكتيريا البقعة ، لكن إضافة الكحول تجعل الدهون الموجودة في البكتيريا مثل الزائفة تفقدها.


الحدود في علم الأحياء الدقيقة

انتماءات المحرر والمراجعين هي الأحدث التي يتم توفيرها في ملفات تعريف بحث Loop وقد لا تعكس موقفهم في وقت المراجعة.


  • تحميل المادة
    • تحميل PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • تكميلي
      مادة
    • ملاحظة ختامية
    • مدير المراجع
    • ملف TEXT بسيط
    • BibTex


    مشاركه فى

    مقدمة

    الأغشية الحيوية عبارة عن مجتمعات بكتيرية ثلاثية الأبعاد مرتبطة بالأسطح ، سواء كانت حية أو غير حيوية ، محاطة بمصفوفة خارج الخلية تتكون من دنا مشتق من البكتيريا والبروتينات والسكريات الخارجية 1،2،3. في الطبيعة ، تعتبر البكتيريا موجودة بشكل أساسي في شكل أغشية حيوية ، ويقدر أن 0.1 ٪ من إجمالي الكتلة الحيوية الميكروبية هي في الواقع في وضع النمو العوالق 4.

    يبدأ تطوير الأغشية الحيوية الرقيقة عن طريق ربط البكتيريا بسطح مكونة مستعمرات دقيقة. بعد ذلك ، تتطور هذه إلى أغشية حيوية ناضجة ، تعتمد على عدة عوامل بما في ذلك كثافة الخلايا البكتيرية وتوافر العناصر الغذائية. ومع ذلك ، فإن المسارات المعقدة التي تؤدي إلى التطور الكامل للأغشية الحيوية ، ليست مفهومة تمامًا ولكنها تنطوي على استشعار النصاب الذي يؤثر على العديد من شبكات الجينات التنظيمية المعقدة 5. يعتبر تكوين الأغشية الحيوية إستراتيجية البقاء على قيد الحياة للإجهاد البيئي مثل درجة الحموضة والأشعة فوق البنفسجية وبيروكسيد الهيدروجين والسمية المعدنية ولكن أيضًا تجاه الاستجابة المناعية للإنسان تجاه العدوى البكتيرية ، بما في ذلك البلعمة 5،6. إحدى البكتيريا التي تشتهر بشكل خاص بقدرتها على تكوين الأغشية الحيوية هي ص. الزنجارية. يمكن أن تشكل الأغشية الحيوية في العديد من البيئات ويمكن أن تسبب مجموعة متنوعة من الالتهابات المزمنة 7. بالإضافة إلى ذلك ، فهو أحد مسببات الأمراض الرئيسية في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF) 8،9. جعلت الأهمية السريرية والسهولة النسبية لنمو الأغشية الحيوية هذه البكتيريا كائنًا نموذجيًا فيما يتعلق بالبحث عن تكوين الأغشية الحيوية 10.

    هناك إدراك متزايد بأن العديد من الالتهابات المزمنة مرتبطة بغشاء حيوي. في الواقع ، أقرت المعاهد الوطنية للصحة بأن 80 في المائة من الالتهابات البكتيرية الطبية التي يعالجها الأطباء في العالم المتقدم ناتجة عن الكائنات الحية التي تنمو في الأغشية الحيوية 11. ومع ذلك ، فإن معظم الأبحاث التي تميز فيزيولوجيا البكتيريا ، قد أجريت على بكتيريا العوالق في الوسائط السائلة. وبالمثل ، فإن اكتشاف جميع المضادات الحيوية الحالية ومنتجات مضادات الميكروبات الأخرى يعتمد أيضًا على النشاط تجاه بكتيريا العوالق 7. بعد ذلك ، يمكن أن تكون الأغشية الحيوية المنشأة أكثر مقاومة للعلاج بالمضادات الحيوية بما يصل إلى 1000 ضعف من البكتيريا العوالق ، مما يجعلها شديدة المقاومة للعلاجات الحالية 12. هذا جزئيًا لأن معظم مضادات الميكروبات فعالة بشكل أساسي ضد الخلايا سريعة النمو. ومع ذلك ، يمكن تحديد العديد من الأسباب الأخرى بما في ذلك أن مصفوفة البوليمرات الخارجية للغشاء الحيوي يمكنها تقييد انتشار المواد وربط المضادات الحيوية ومكونات الجهاز المناعي للمضيف 12،13.

    أدى عدم التطابق بين المضادات الحيوية الحالية والنشاط المضاد للبيوفيلم إلى إعادة التفكير في الاستراتيجية المثلى لمكافحة العدوى المزمنة ذات الصلة بالأغشية الحيوية والبحث المكثف عن مضادات جديدة للميكروبات. يمكن تكوين فئة واحدة من هذه المركبات الجديدة المضادة للبيوفيلم بواسطة Host Defense Peptides (HDPs). هذه الببتيدات ، التي أطلق عليها في الأصل اسم الببتيدات المضادة للميكروبات ، هي جزيئات محفوظة تطوريًا تعمل في دفاع المضيف ضد الإهانات بما في ذلك الالتهابات الجرثومية والالتهابات 14. في السنوات الأخيرة ، كان هناك تقدير متزايد لأنشطتهم المضادة للبيوفيلم. على سبيل المثال ، تبين أن الكاثليسيدين البشري LL-37 يمنع تكوين الأغشية الحيوية ص. الزنجارية عند 0.5 ميكروغرام / مل ، والأغشية الحيوية المشكّلة مسبقًا عند 4 ميكروغرام / مل ، أقل بكثير من قيمة MIC ضد بكتيريا العوالق في ظل الظروف الفسيولوجية 10. ومع ذلك ، لا يزال هناك عدد محدود فقط من المقالات حول القضاء على الأغشية الحيوية مسبقة التشكيل 10،14،15،16 ، لا سيما بالنظر إلى العدد الكبير من HDPs التي تحدث بشكل طبيعي.

    هنا ، نقوم بالإبلاغ عن نتائج الدراسات المصممة لتحديد أنشطة الكاثليسيدينات التي تحدث بشكل طبيعي والببتيد IDR1018 المستند إلى HDP المطوَّر صناعياً ضد ص. الزنجارية الأغشية الحيوية. قللت العديد من HDPs بشكل كبير من صلاحية البكتيريا المرتبطة بالأغشية الحيوية للأغشية الحيوية المنشأة ، في حين أن HDP (CRAMP) كان قادرًا أيضًا على القضاء بكفاءة على الأغشية الحيوية بأكملها.


    فحص لوحة ميكروتيتر للتقدير الكمي لتشكيل الأغشية الحيوية بواسطة Leptospira المسببة للأمراض

    الخلفية والهدف: يعتبر تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة مهمًا لإنشاء الإمراض البكتيرية والسيطرة على المرض. ساهم تكوين مجاميع الخلايا في الاستعمار طويل الأمد للأنابيب الكلوية لمضيف صيانة الثدييات بواسطة Leptospira المسببة للأمراض. هدفت هذه الدراسة إلى تحديد تكوين الأغشية الحيوية بين 29 سلالة ممرضة من Leptospira معزولة من الفئران وعينات التربة والمياه في Sarawak ، ماليزيا. المواد والأساليب: تم تحضير لقاح معلق جرثومي لحوالي 10 6 بكتريا مل & # 1501 من الثقافات ذات الأسي المتوسط. ثم تم إجراء اختبار Biofilm في ثلاث نسخ في 24 لوحة ميكروتيتر جيدة. تم إجراء فحص الكريستال البنفسجي لتقييم قدرات تشكيل الأغشية الحيوية على أساس الكثافة البصرية التي تم الحصول عليها. بناءً على قوة الالتصاق ، تم تصنيف قدرات تكوين الأغشية الحيوية إلى أربع فئات مختلفة: غير ملتصقة ، ضعيفة الالتصاق ، ملتصقة معتدلة ، ملتصقة بشدة. نتائج: تم تصنيف 32.26٪ من البكتيريا المختبرة إما على أنها غير ملتصقة أو منتجة غشاء حيوي ضعيف الالتصاق في اليوم الأول. من اليوم الثاني إلى اليوم الخامس ، أنتج معظمهم أغشية حيوية ملتصقة بشكل معتدل وقوي. جميع العزلات التزمت بقوة من اليوم السادس إلى اليوم العاشر. ولوحظ أعلى إنتاج للبيوفيلم في اليوم السابع إلى الثامن. في هذه الدراسة ، أقوى منتجي الأغشية الحيوية بين الجرذان وعينات التربة والمياه هي P38 مع OD 600 عند 16.700 & plusmn0.265 في اليوم الثامن ، P18 مع OD 600 عند 21.760 & plusmn0.332 في اليوم السابع و P22 مع OD 600 عند 19.793 & plusmn0. 144 في اليوم السابع على التوالي. استنتاج: في الختام ، تمكنت جميع أنواع Leptospira المختبرة من إنتاج غشاء حيوي قوي ، مما ساهم في البقاء في الموائل البيئية المتنوعة وتوقع انتقال المرض.

    كيف تستشهد بهذا المقال:

    Chai Fung Pui و Kasing Apun و Jennifer Jalan و Lesley Maurice Bilung و Lela Su`ut و Hashimatul Fatma Hashim، 2017. فحص لوحة ميكروتيتر لقياس تكوين الأغشية الحيوية بواسطة Leptospira المسببة للأمراض. مجلة أبحاث علم الأحياء الدقيقة ، 12: 146-153.

    في الطبيعة ، نادرًا ما توجد الكائنات الحية الدقيقة بما في ذلك البكتيريا المسببة للأمراض بحرية في المحاليل السائبة مثل مزارع العوالق. بدلاً من ذلك ، فهي عرضة للوجود كوحدة متصلة بسطح مكون من 1،2 بيوفيلم. لوحظ بيوفيلم تحت المجهر الذي يتجمع فيه & quotAnimalcules & quot؛ الذي كشطه من أسطح أسنان الإنسان 3. منذ ذلك الحين ، تم تعريف البيوفيلم على أنه مجتمع لاطئ من البكتيريا التي ترتبط بشكل لا رجعة فيه بطبقة أساسية أو ببعضها البعض ومضمنة في مصفوفة لاصقة ذاتية الإنتاج من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) 4،5.

    الالتصاق البكتيري هو الخطوة الأولى في عملية تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة 6. في ظل الظروف المناسبة ، تكون جميع أنواع البكتيريا تقريبًا قادرة على الالتصاق بالأسطح الأحيائية (الأنسجة الحيوانية والنباتية) واللاأحيائية (البلاستيك والزجاج والمعدن والخشب). تم الإبلاغ عن كل من Leptospira المسببة للأمراض والمسببة للرشح لتشكيل أغشية حيوية مرتبطة بالسطح في الثقافات الدائمة 9. بيكاردو وآخرون. ذكر 10 أن الأغشية الحيوية القوية تم إنتاجها بواسطة L. interrogans و L. biflexa على الأسطح الصلبة.

    التصاق Leptospira spp. لاستضافة الخلايا ضروري كخطوة أولية لعدوى داء البريميات 11. بعد اختراق العائل عن طريق السحجات ، تستعمر Leptospira المسببة للأمراض الأعضاء المستهدفة بكفاءة حيث تتكاثر في الدم وتلتصق بالخلايا البطانية والظهارية. من ناحية أخرى ، يتم تطهير Leptospira الرمية بسرعة من مجرى الدم عن طريق البلعمة 12. يسهل تكوين الأغشية الحيوية Leptospira المسببة للأمراض في استعمار الأنابيب الكلوية ، في حين أنه يسهل Leptospira الرمية لاحتلال منافذ بيئية معينة مثل الماء 10.

    تم الإبلاغ عن دراسات انتشار مختلفة على Leptospira الممرضة في مختلف الحيوانات المضيفة والبيئة في جميع أنحاء العالم. ذكرت دراساتنا السابقة حدوث Leptospira spp. في التربة البيئية والمياه من المتنزهات الوطنية في ساراواك ، ماليزيا 13 وكذلك الكشف عن Leptospira spp. في الفئران وبيئة مراكز تدريب الخدمة الوطنية المختارة وحقول الأرز في ساراواك ، ماليزيا 14. يشير وجود Leptospira الممرضة إلى قدرتها على التكيف في المضيف والبيئة والتي يمكن تسهيلها من خلال قدرتها على تكوين غشاء حيوي. لذلك ، هدفت هذه الدراسة إلى تقييم تكوين الأغشية الحيوية في عزلات Leptospira المسببة للأمراض التي تم الحصول عليها من الدراسات السابقة باستخدام اختبار لوحة microtiter. تم تصنيف العزلات أيضًا إلى فئات مختلفة بناءً على قدراتها على تكوين الأغشية الحيوية.

    العزلات البكتيرية وحالة النمو: تم الحصول على ما مجموعه 29 عزلة ممرضة من Leptospira من مختبر الأحياء الدقيقة ، قسم البيولوجيا الجزيئية ، كلية علوم وتكنولوجيا الموارد ، جامعة ماليزيا ساراواك. تم جدولة تفاصيل العزلات في الجدول 1. واستخدمت Leptospira noguchii و L. interrogans كعناصر تحكم إيجابية. تم الحفاظ على جميع الثقافات في درجة حرارة الغرفة في مرق Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) شبه الصلبة المعدل مع 100 & mug ml & # 1501 5-fluorouracil.

    تحضير بدء التعليق البكتيري: تم تحضير الثقافة الأسية المتوسطة عن طريق احتضان ثقافة المخزون في مرق EMJH شبه الصلب المعدل لمدة أسبوع واحد. ثم تم توحيده وفقًا للكثافة الضوئية عند 420 نانومتر تقريبًا من 0.3-0.4 باستخدام مقياس الطيف الضوئي (Metertech Inc.) والذي يتوافق مع حوالي 10 8 بكتيريا مل & # 1501. تم بعد ذلك تحضير لقاح معلق جرثومي من 10 6 بكتريا مل & # 1501 من هذه الثقافة الأسية المتوسطة 15.

    فحص الغشاء الحيوي المجهري الصفيحي: تم إجراء اختبار Biofilm في ثلاث نسخ في 24 لوحًا ميكروتيترًا جيدًا (تمت معالجة زراعة الأنسجة ، والآبار ذات القاع المسطح TPP). تم استخدام مرق EMJH كعنصر تحكم سلبي. تم تكييف الإجراء لإجراء فحص بيوفيلم صفيحة ميكروتيتر من Ristow et al. 9 ولي وآخرون. 16.

    باختصار ، تمت إزالة الثقافة السائلة كل يوم لمدة 10 أيام بفاصل زمني 24 ساعة. تم شطف الآبار برفق بالماء المقطر لإزالة خلية العوالق غير الملتصقة. تم السماح لهم بعد ذلك بالتجفيف في الهواء لمدة 15 دقيقة قبل التثبيت باستخدام 2٪ أسيتات الصوديوم. تمت إزالة محلول أسيتات الصوديوم وتركه ليجف في الهواء مرة أخرى. تم تلطيخ الخلايا باستخدام 900 ميكرولتر من محلول كريستال بنفسجي بنسبة 1 ٪ لمدة 20 دقيقة وبعد ذلك تمت إزالة محلول البنفسج البلوري. ثم تم شطف الخلايا ثلاث مرات بالماء المقطر. أخيرًا ، تم إذابة البنفسج البلوري المتبقي في الآبار في 1 مل من الإيثانول / الأسيتون (محلول 80/20 فولت / فولت) قبل قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD 600). لتصحيح تلطيخ الخلفية للبنفسجي البلوري ، تم طرح متوسط ​​الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر للتحكم السلبي من متوسط ​​الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر من تكوين الأغشية الحيوية بواسطة Leptospira المسببة للأمراض. تم عرض النتائج في متوسط ​​الانحراف المعياري.

    تصنيف القدرة على تكوين الأغشية الحيوية بواسطة العزلات: تم تحديد قدرة Leptospira على تكوين الأغشية الحيوية كما وصفها Stepanovic et al. 17 ، مارينهو وآخرون. 7 وساكسينا وآخرون. 18. تم تصنيف قدرات تكوين الأغشية الحيوية لـ 29 عزلة ممرضة من Leptospira والضوابط الإيجابية في كل يوم إلى أربع فئات بناءً على الكثافة البصرية التي تم الحصول عليها. يتم تعريف القيمة الفاصلة للكثافة الضوئية (OD c) على أنها ثلاثة انحرافات معيارية أعلى من متوسط ​​الكثافة البصرية (OD) للتحكم السلبي.

    هذه الفئات الأربع غير ملتصقة عند OD & lt OD c ، ملتصقة بشكل ضعيف عند OD c & ltOD & lt 2 & timesOD c ، ملتصقة بشكل معتدل عندما 2 & timesOD c & ltOD & lt 4 & timesOD c وتلتزم بشدة عند 4 & timesOD c & ltOD.

    التحليل الإحصائي: تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج SPSS الإصدار 20.0 (شركة IBM ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تقييم الفروق بين وسائل المتغيرات باستخدام مقاييس متكررة ANOVA. تم استخدام اختبار Bonferroni اللاحق لمقارنة القيم المتوسطة لـ Biofilm OD 600. تم تحديد مستوى الأهمية عند p & lt0.05.

    في هذه الدراسة ، يوضح الشكل 1 و 2 و 3 تكوين الأغشية الحيوية باستخدام فحص صفيحة ميكروتيتر لجميع عزلات Leptospira المختبرة على مدى 10 أيام حضانة. لضمان موثوقية واستنساخ البيانات ، أجريت الاختبارات في ثلاث نسخ. أشار التحليل الإحصائي إلى وجود فرق معنوي في تأثير الوقت على تكوين الأغشية الحيوية بهذه البكتيريا (p & lt0.05). كما وجد أن هذه البكتيريا ذات دلالة إحصائية مختلفة فيما بينها في إنتاج الأغشية الحيوية (p & lt0.05).

    بناءً على الأشكال 1 و 2 و 3 ، لوحظ أن جميع عزلات Leptospira المختبرة أظهرت نمطًا مشابهًا في نمو الأغشية الحيوية. في اليوم الأول والثاني ، كانت كمية البيوفيلم المتكونة كما هو موضح بواسطة OD 600 ، لا تزال منخفضة. تبدأ الكمية في الزيادة من اليوم الثالث مما يدل على زيادة عدد البكتيريا الملتصقة. في المتوسط ​​، تم الحصول على أعلى قيم متوسط ​​لـ Biofilm OD 600 إما في اليوم السابع أو الثامن ، وتختلف بين البكتيريا. بعد تحقيق أعلى نقطة ، كان هناك انخفاض في القيم المتوسطة للغشاء الحيوي OD 600. يتم تمثيل عدد البكتيريا المختبرة بقدرات تكوين غشاء حيوي مختلف في كل يوم في الجدول 2. من بين 29 عزلة من Leptospira الممرضة و 2 ضابطة إيجابية تم فحصها ، تم تصنيف 32.26٪ لكل منها إما على أنها غير ملتصقة أو منتجة غشاء حيوي ضعيف الالتصاق في اليوم الأول. أنتجت معظمهم أغشية حيوية ملتصقة بشكل معتدل وقوي من اليوم الثاني إلى اليوم الخامس. حقق كل منهم قدرات قوية على الالتصاق بدءًا من اليوم السادس وظلوا ملتزمين بقوة حتى اليوم العاشر.

    أظهر إنتاج الأغشية الحيوية التي تم تقييمها باستخدام اختبار صفيحة ميكروتيترية إنتاج أغشية حيوية قوية بنسبة 100٪ في هذه الدراسة كما هو موضح في النتيجة من اليوم السادس. من بين عزلات الجرذان ، أقوى منتج للبيوفيلم هو P38 مع OD 600 عند 16.700 و plusmn0.265 في اليوم الثامن. من بين 14 عينة تربة تم فحصها ، يعتبر P18 أقوى منتج للأغشية الحيوية مع OD 600 عند 21.760 & plusmn 0.332 في اليوم السابع.

    بالنسبة لعينات المياه ، يُعرف P22 بأنه أقوى منتج للأغشية الحيوية مع OD 600 عند 19.793 و plusmn 0.144 في اليوم السابع. أشار اختبار Bonferroni اللاحق إلى أن هذه العزلات الثلاث (P18 و P22 و P38) كانت مختلفة إحصائيًا عن بعضها البعض والضوابط الإيجابية في تكوين الأغشية الحيوية عند إجراء مقارنات حكيمة بين الزوجين (p & lt0.05).

    عادة ما يتميز تكوين البيوفيلم بواسطة البكتيريا بمراحل مميزة من الارتباط (قابل للعكس ولا رجوع فيه) ، والنمو والانفصال 1. في هذه الدراسة ، تم العثور على عزلات Leptospira المسببة للأمراض لتطوير غشاء حيوي خلال مراحل مختلفة من عملية تحاكي البكتيريا الأخرى. أشارت النتائج إلى أن الكتلة الحيوية قد تشكلت في قاع 24 لوحة ميكروتيترية لجميع عزلات Leptospira الممرضة وعددها 29 عزلة وضابطة إيجابية. بدأت العملية عندما وصلت خلايا Leptospira إلى سطح 24 لوحة ميكروتيتر وربطتها. بعد التصاق الخلية ، طوروا استجابات استشعار السطح والتزموا بغشاء التكييف الذي يحبس العناصر الغذائية والسوائل المحيطة 16،1.

    من 1 إلى 6 أيام ، شكلت الخلايا المرفقة مستعمرات دقيقة وتم تجميعها معًا من خلال وجود مصفوفة عديدات السكاريد الخارجية. تحتوي هذه المصفوفة على الحمض النووي خارج الخلية والبروتينات وحطام الخلايا الميتة التي تحمي الخلايا من الظروف البيئية المجهدة 19. توسعت هذه المستعمرات الصغيرة وتضاعفت حتى نمت لتصبح حالة ناضجة كمستعمرات كبيرة ذات هياكل ثلاثية الأبعاد في اليومين السابع والثامن.

    بعد النضج ، تشتت البكتيريا داخل المستعمرات الكبيرة ونجت إما كمزارع بلانكتونية أو تبدأ في الموت. نتيجة لذلك ، يمكن اعتبار عملية تكوين الأغشية الحيوية بواسطة Leptospira المسببة للأمراض في هذه الدراسة كعملية ديناميكية ومنظمة وراثياً. كان هذا وفقًا للدراسة السابقة التي أجراها Hu et al. 20 الذي لاحظ أن أنواعًا مختلفة من البكتيريا تنتج الأغشية الحيوية من خلال عملية مماثلة ، وبالتالي اقترح أن تكون الأغشية الحيوية هي عملية منظمة وراثيًا. لاحظ صن وآخرون ملاحظة مماثلة. 21 أن تكوين الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية الذهبية هو عملية ديناميكية.

    تم تقييم تحديد تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة باستخدام طرق مختلفة ولكن لم يتم وضع بروتوكول موحد لتحديد قدرة تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة لأنواع البكتيريا المختلفة. على سبيل المثال ، غالبًا ما تكون طبقة البكتيريا المبطنة لأنبوب الثقافة ملطخة بصبغة كاتيونية ويتم تحجيمها بصريًا في طريقة اختبار الأنبوب. هذه الطريقة نوعية وبالتالي فهي ذاتية في تفسير النتائج 17. في هذه الدراسة ، تم اختيار اختبار لوحة ميكروتيتر ، حيث تم تحديد الكثافة الضوئية للغشاء الحيوي Leptospira الملطخ بطريقة القياس الطيفي.

    على الرغم من أن فحص لوحة microtiter يعاني من عيب كبير في اكتشاف الأغشية الحيوية في الجزء السفلي من البئر فقط ، إلا أن هذا الاختبار يعتبر الطريقة الأكثر استخدامًا في القياس الكمي للغشاء الحيوي 22،18. يقضي قياس الكثافة الضوئية الذي تم الحصول عليه من اختبار لوحة ميكروتيتر على ذاتية اختبار الأنبوب في تفسير النتائج التي تم الحصول عليها ويتنبأ بالأهمية السريرية بشكل أكثر موثوقية من اختبار الأنبوب 17. إلى جانب ذلك ، من السهل إجراء فحص لوحة microtiter عند تطبيق أصباغ مختلفة فقط مثل البنفسجي البلوري المستخدم في هذه الدراسة ، أو resazurin أو ثنائي ميثيل الميثيلين الأزرق يتيح القياس الكمي للبيوفيلم 23.

    في هذه الدراسة ، زادت كمية الأغشية الحيوية كما يتضح من تلطيخ البنفسج الكريستالي بطريقة تعتمد على الوقت لتصل إلى أقصى قيم متوسط ​​لـ 600 OD تبلغ حوالي 12 في اليومين السابع والثامن. تتناقض هذه القيمة مع الدراسة التي أجراها Ristow et al. 9 الذين أبلغوا عن قيم OD القصوى 600 لما يقرب من 2 بعد تلطيخ البنفسجي البلوري بعد يومين من الحضانة لـ Leptospira biflexa ، وهو نبات رمي.

    في أعلى تشبع بخلايا بيوفيلم (اليوم السابع والثامن) ، كانت قيمة امتصاص Leptospira المسببة للأمراض أعلى بحوالي 6 مرات من Leptospira 9. لذلك ، تم استنتاج أن Leptospira المسببة للأمراض أنتجت تكوين بيوفيلم أعلى بكثير من Leptospira saprophytic Leptospira. في دراسة سابقة قام بها Brihuega et al. لتقييم تكوين الأغشية الحيوية لعزل الخنازير من L. interrogans serovar Pomona و L. biflexa serovar Patoc ، تم العثور على السلالة المسببة للأمراض لتطوير طبقة أكثر سمكًا من الأغشية الحيوية مقارنة بالسلالة الرمية في اليوم الخامس. إلى جانب ذلك ، شكل تعايش L. interrogans مع خلايا Azospirillum brasilense طبقة كثيفة من الأغشية الحيوية ، حيث وصلوا إلى أقصى قدر من التصاق الخلية على الشرائح الزجاجية في اليوم الثاني 25.

    سبب آخر يدعم القدرات المختلفة لمسببات Leptospira المسببة للأمراض والرحم في تكوين الأغشية الحيوية هو اكتشاف بعض عوامل الاستعمار التي تم تحديدها في Leptospira المسببة للأمراض ولكن ليس في Leptospira الرمية. قد يعزى ذلك إلى المواد اللاصقة المختلفة التي تساهم في الإصابة الأولية. تم الإبلاغ عن أن البروتين المرتبط بالفيبرونكتين 36 كيلو دالتون المعزول من الغلاف الخارجي لـ L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae معروف بوجوده فقط في السلالات الممرضة 12،26.

    لوحظ انخفاض متوسط ​​قيم OD 600 لعزلات Leptospira الممرضة في اليومين الثامن والتاسع. الدراسة السابقة التي أجراها Charyeva et al. كشف 27 أن الأغشية الحيوية التي تنتجها Staphylococcus epidermidis انخفضت ما بين 3 و 7 أيام. في دراسة أجراها Ristow et al. في الشكل 9 ، ذكروا أن قيم OD 600 لعزلات Leptospira الرخامية انخفضت في اليوم الثالث. وبالتالي ، يشير هذا إلى أن Leptospira المسببة للأمراض يمكن أن تحافظ على القدرة على إنتاج الأغشية الحيوية بشكل أفضل من Leptospira الرمية. يمكن أن يكون للقدرة على الحفاظ على الأغشية الحيوية تأثيرًا في الإصابة بسلالات Leptospira. بعد التعرض للغشاء المخاطي أو الجلد المتآكل ، تتسبب Leptospira الممرضة بسرعة في حدوث عدوى جهازية عن طريق عبور حواجز الأنسجة وغزو الدم. يلتزمون بمكونات المصفوفة خارج الخلية مثل نوع الكولاجين الأول والنوع الرابع واللامينين والفيبرونيكتين 28. أتزينجين وآخرون. ذكر أن التعلق بالمصفوفة خارج الخلية يرتبط بالضراوة ، لأن الارتباط بالمصفوفة خارج الخلية يكون أكثر فاعلية في Leptospira المسببة للأمراض من Leptospira الوسيطة والرائعة.

    إن التباين في كمية إنتاج الأغشية الحيوية أمر شائع حيث أن العزلات المختلفة من Leptospira المُمْرِضة أنتجت غشاء حيوي بقدرات ملتصقة مختلفة كما هو موضح في هذه الدراسة. ومع ذلك ، بناءً على التصنيف كما استخدمه Stepanovic et al. في الشكل 17 ، تعتبر جميع العزلات من منتجي الأغشية الحيوية القوية التي تشكل غشاءً حيويًا قويًا على ألواح ميكروتيتر. يعتبر إنتاج الأغشية الحيوية القوية في Leptospira الممرضة عاملاً رئيسياً للبقاء في بيئة متنوعة. وقد ساهم هذا لاحقًا في التسبب في الإصابة بمرض الليبتوسبيرا بشكل غير مباشر نظرًا لأن داء البريميات عادة ما يكون ناتجًا عن مرض ليبتوسبيرا. هذا يتفق مع Hu et al. 20 الذين ذكروا أن تكوين الأغشية الحيوية بواسطة البكتيريا مهم في التسبب في العديد من الالتهابات البكتيرية. يُعزى أكثر من 60٪ من جميع حالات العدوى البكتيرية البشرية إلى استمرار تكوين الأغشية الحيوية بواسطة البكتيريا المعنية 30. قد تعتمد مسببات الأمراض البكتيرية على تطوير الأغشية الحيوية للمساعدة في إنشاء العائل ، والتوسع السكاني ، والأهم من ذلك في انتشار الأمراض 31.

    تم استخدام اختبار الميكروتيتر للوحة الغشاء الحيوي ، وهو طريقة بسيطة لتقدير الغشاء الحيوي بنجاح في هذه الدراسة لتقييم قدرات تكوين الأغشية الحيوية بين عزلات Leptospira المسببة للأمراض. بشكل عام ، تمتلك عزلات Leptospira الـ 29 التي تم فحصها في هذه الدراسة القدرة على إنتاج غشاء حيوي قوي ، ومع ذلك ، فإن كمية البيوفيلم المتكونة كانت مختلفة من العزلة إلى العزلة. لا يمكن إنكار دور الأغشية الحيوية في التسبب في العدوى البشرية. يمكن أن يؤدي تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة إلى آثار خطيرة في المجال الطبي والصحة العامة والصناعة والبيئة. تعد الدراسة المستقبلية حول تحديد الجينات المشاركة في تكوين الأغشية الحيوية بواسطة Leptospira المسببة للأمراض ذات أهمية قصوى للتخطيط لمزيد من مناهج الوقاية ضد تفشي داء البريميات.

    تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة التعليم العالي الماليزية في إطار مخطط منح البحوث الأساسية FRGS / STO3 (02) / 1209/2014 (10).

    مراجع

    Adetunji ، V.O. و ل. Isola ، 2011. التصاق بكتريا قولونية و بكتريا قولونية O157: H7 يعزل من مجزر استوائي نموذجي على الأسطح الخشبية والفولاذية والزجاجية. الدقة. J. Microbiol.، 6: 669-677.
    رابط CrossRefDirect

    Agarwal ، R.K. ، S. Singh ، K.N. بهليجاونكار و ف. سينغ ، 2011. تحسين فحص لوحة ميكروتيتر لاختبار قدرة تكوين الأغشية الحيوية المختلفة السالمونيلا الأنماط المصلية. كثافة العمليات الدقة الغذائية. ج. ، 18: 1493-1498.
    رابط مباشر

    Aggarwal، S.، PS ستيوارت و R.M. Hozalski ، 2015. قوة تماسك Biofilm كأساس لعناد الأغشية الحيوية: هل الأغشية الحيوية البكتيرية مفرطة التصميم؟ ميكروبيول. رؤى ، ٨: ٢٩-٣٢.
    رابط CrossRefDirect

    أندرادي ، جي. و P.D. براون ، 2012. تحليل مقارن لمرفق ليبتوسبيرا interrogans و L. borgpetersenii لخلايا الثدييات. FEMS إمونول. ميد. ميكروبيول ، 65: 105-115.
    رابط CrossRefDirect

    أتزنجن ، إم في ، جي إم. سيركويرا ، م. فييرا ، ر. أوليفيرا ، ت. أوليفيرا وآخرون. ، 2015. تحديد وتوصيف المواد اللاصقة الجديدة في ليبتوسبيرا. في: الأبحاث الحالية والتكنولوجيا وموضوعات التعليم في علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والتكنولوجيا الحيوية الميكروبية ، منديز فيلاس ، أ. (محرران). مركز أبحاث Formatex ، إسبانيا ، ص: 704-713.

    باربوسا ، أ.س. ، ب. أبرو ، ف. نيفيز ، م. أتزينجين وم. واتانابي وآخرون. ، 2006. يتوسط اللاصق الفيروسي البريمي الذي تم تحديده حديثًا الارتباط باللامينين. تصيب. إيمون ، 74: 6356-6364.
    رابط CrossRefDirect

    Berlanga، M.، O. Domenech and R. Guerrero، 2014. تشكيل الأغشية الحيوية على البوليسترين في الخلايا المنفصلة مقابل الخلايا العوالق من تراكم البولي هيدروكسي ألكانوات هالوموناس فينوستا. كثافة العمليات ميكروبيول ، 17: 205-212.
    رابط مباشر

    Brihuega، B.، L. Samartino، C. Auteri، A. Venzano and K. Caimi، 2012. في الجسم الحي التجمعات الخلوية لعزل حديث مكون من غشاء حيوي لخنازير ليبتوسبيرا interrogans سلالة من الأرجنتين. القس أرجنت. ميكروبيول ، 44: 138-143.
    رابط مباشر

    تشارييفا ، أو. ، ج. نيلاندز ، ج. سفينساتر و أ. وينيربيرج ، 2015. تشكيل بكتيري بيوفيلم على امتصاص غرسات المغنيسيوم. افتح J. Med. ميكروبيول ، 5: 1-11.
    رابط CrossRefDirect

    سينكو ، إم ، 2010. رؤى جديدة حول إمراضية البريميات: تفادي دفاعات العائل. ميكروبيول جديد ، 33: 283-292.
    رابط PubMedDirect

    دي سوزا ، E.L. ، Q.G.S. ميرا ، آي. باربوسا ، A.J.A. Athayde ، M.L. Da Conceicao و J.P. de Siqueira Junior ، 2014. تشكيل Biofilm بواسطة المكورات العنقودية الذهبية من الأسطح التي تلامس الطعام في مرق اللحم والحساسية للمطهرات. براز. J. Microbiol. ، 45: 67-75.
    رابط CrossRefDirect

    إيفانجليستا ، ك. and J. Coburn، 2010. Leptospira كممرض ناشئ: مراجعة لبيولوجيته وتسببه واستجاباته المناعية للمضيف. ميكروبيول المستقبل ، 5: 1413-1425.
    رابط CrossRefPubMedDirect

    Garrett، T.R.، M. Bhakoo and Z. Zhang، 2008. التصاق بكتيري وأغشية حيوية على الأسطح. بروغ. نات. علوم ، 18: 1049-1056.
    رابط CrossRefDirect

    Hu و Q. و Y. Zhu و J. Tu و Y. Yin و X. Wang وآخرون. ، 2012. تحديد الجينات المشاركة في Riemerella anatipestifer تشكيل بيوفيلم عن طريق طفرات الينقولات العشوائية. بلوس وان ، المجلد. 7. 10.1371 / journal.pone.0039805

    Koczan ، J.M. ، B.R. لينمان ، إم جي ماكجراث ، جي دبليو. Sundin ، 2011. تساهم هياكل ارتباط سطح الخلية في تكوين الأغشية الحيوية واستعمار النسيج الخشبي بواسطة اروينيا اميلوفورا. البيئة التطبيقية. ميكروبيول ، 77: 7031-7039.
    رابط CrossRefDirect

    كوريس ، A.M.N. ، G.M.D.F.V. أكويجي ، دي إس بوس ، ج. فينتورا ، P.M.B. فرنانديز و A. فرنانديز ، 2013. مقارنة بين الغشاء الحيوي وآليات التعلق لعزلة مرضية نباتية وسريرية لـ الالتهاب الرئوي كليبسيلا subsp. الرئوية. عالم. العالم ج .10.1155 / 2013/925375

    كومار ، ك.ف. ، س.ال ، ر. راج ، ك. أزوسبيريلوم. FEMS ميكروبيول. Ecol. ، المجلد. 91. 10.1093 / فيمسك / fiv051

    لي ، إتش واي ، إل سي. تشاي ، سي. بوي ، س.مصطفى ، ي.ك. Cheah، M. Nishibuchi and S. Radu، 2013. تشكيل الأغشية الحيوية بواسطة الليسترية المستوحدة ATCC 19112 عند درجات حرارة حضانة مختلفة وتركيزات كلوريد الصوديوم. براز. J. Microbiol. ، 44: 51-55.
    رابط مباشر

    مالامود ، ف. ، ر. هوميم ، ف. كونفورتي ، ب. ياريورا و A.P. Castagnaro وآخرون، 2013. تحديد وتوصيف الطفرات المعيبة في تكوين الأغشية الحيوية زانثوموناس سيتري subsp. سيتري. علم الأحياء الدقيقة ، 159: 1911-1919.
    رابط CrossRefDirect

    مارينيو ، أر ، P.D. مارتينز ، إي إم ديتمير ، ب. دازيفيدو ، جيه فرازون ، إس تي. فان دير ساند وأ. Frazzon ، 2013. تشكيل بيوفيلم على البوليسترين تحت درجات حرارة مختلفة بواسطة مقاومة المضادات الحيوية المكورات المعوية البرازية و المكورات المعوية البرازية معزولة عن الطعام. براز. J. Microbiol. ، 44: 423-426.
    رابط CrossRefDirect

    بيكاردو ، م. ، د. بولاش ، سي.بوشيير ، آر إل زويرنر و ن. زيدان وآخرون. ، 2008. تسلسل الجينوم للنبتة الرملية ليبتوسبيرا بيفليكسا يقدم رؤى حول تطور ليبتوسبيرا والتسبب في داء البريميات. بلوس وان ، المجلد. 3. 10.1371 / journal.pone.0001607

    Pui ، C.F. ، L.M. Bilung ، L. Su'ut and K. Apun ، 2015. انتشار ليبتوسبيرا الأنواع في التربة والمياه البيئية من المتنزهات الوطنية في ساراواك ، ماليزيا. بورنيو جيه رسور. علوم. تكنول ، 5: 49-57.
    رابط مباشر

    بوي ، C.F. ، L.M. Bilung ، Y.L. Chong، L. Su'ut and K. Apun، 2016. Detection of ليبتوسبيرا النيابة. في مراكز تدريب الخدمة الوطنية المختارة وحقول الأرز في ساراواك ، ماليزيا باستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل. جيه تروب. الزراعية. علوم ، (في الصحافة).

    Ristow، P.، P. Bourhy، S. Kerneis، C. Schmitt، M.C. Prevost، W. Lilenbaum and M. Picardeau، 2008. تشكيل الأغشية الحيوية بواسطة leptospires الرمية والممرضة. علم الأحياء الدقيقة ، 154: 1309-1317.
    رابط CrossRefDirect

    ساكسينا ، إس ، جي بانيرجي ، آر جارج وم. سينغ ، 2014. دراسة مقارنة لتكوين الأغشية الحيوية في الزائفة الزنجارية من مرضى التهابات الجهاز التنفسي السفلي. J. كلين. الدقة التشخيصية ، 8: DC09-DC11.
    رابط CrossRefDirect

    Seixas، R.، M. Gabriel، J. Machado، L. Tavares، F. Bernardo and M. Oliveira، 2014. تأثير ظروف الجهاز الهضمي المحاكاة على تكوين الأغشية الحيوية بواسطة السالمونيلا 1 ، 4 ، [5] ، 12: ط: -. عالم. العالم ج .10.1155 / 2014/153956

    ستيبانوفيتش ، إس ، دي فوكوفيتش ، آي داكيتش ، بي سافيتش وم. المكورات العنقودية تشكيل بيوفيلم. J. ميكروبيول. الطرق ، 40: 175-179.
    رابط CrossRefDirect


    فحص لوحة ميكروتيتر للتقدير الكمي لتشكيل الأغشية الحيوية بواسطة Leptospira المسببة للأمراض

    الخلفية والهدف: يعتبر تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة مهمًا لإنشاء الإمراض البكتيرية والسيطرة على المرض. ساهم تكوين مجاميع الخلايا في الاستعمار طويل الأمد للأنابيب الكلوية لمضيف صيانة الثدييات بواسطة Leptospira المسببة للأمراض. هدفت هذه الدراسة إلى تحديد تكوين الأغشية الحيوية بين 29 سلالة ممرضة من Leptospira معزولة من الفئران وعينات التربة والمياه في Sarawak ، ماليزيا. المواد والأساليب: تم تحضير لقاح معلق جرثومي لحوالي 10 6 بكتريا مل & # 1501 من الثقافات ذات الأسي المتوسط. ثم تم إجراء اختبار Biofilm في ثلاث نسخ في 24 لوحة ميكروتيتر جيدة. تم إجراء فحص الكريستال البنفسجي لتقييم قدرات تشكيل الأغشية الحيوية على أساس الكثافة البصرية التي تم الحصول عليها. بناءً على قوة الالتصاق ، تم تصنيف قدرات تكوين الأغشية الحيوية إلى أربع فئات مختلفة: غير ملتصقة ، ضعيفة الالتصاق ، ملتصقة معتدلة ، ملتصقة بشدة. نتائج: تم تصنيف 32.26٪ من البكتيريا المختبرة إما على أنها غير ملتصقة أو منتجة غشاء حيوي ضعيف الالتصاق في اليوم الأول. من اليوم الثاني إلى اليوم الخامس ، أنتج معظمهم أغشية حيوية ملتصقة بشكل معتدل وقوي. جميع العزلات التزمت بقوة من اليوم السادس إلى اليوم العاشر. ولوحظ أعلى إنتاج للبيوفيلم في اليوم السابع إلى الثامن. في هذه الدراسة ، أقوى منتجي الأغشية الحيوية بين الجرذان وعينات التربة والمياه هي P38 مع OD 600 عند 16.700 & plusmn0.265 في اليوم الثامن ، P18 مع OD 600 عند 21.760 & plusmn0.332 في اليوم السابع و P22 مع OD 600 عند 19.793 & plusmn0. 144 في اليوم السابع على التوالي. استنتاج: في الختام ، تمكنت جميع أنواع Leptospira المختبرة من إنتاج غشاء حيوي قوي ، مما ساهم في البقاء في الموائل البيئية المتنوعة وتوقع انتقال المرض.

    Chai Fung Pui و Kasing Apun و Jennifer Jalan و Lesley Maurice Bilung و Lela Su`ut و Hashimatul Fatma Hashim، 2017. فحص لوحة ميكروتيتر لقياس تكوين الأغشية الحيوية بواسطة Leptospira المسببة للأمراض. مجلة أبحاث علم الأحياء الدقيقة ، 12: 146-153.

    في الطبيعة ، الكائنات الحية الدقيقة بما في ذلك البكتيريا المسببة للأمراض نادرًا ما توجد بحرية في المحاليل السائبة مثل مزارع العوالق. بدلاً من ذلك ، فهي عرضة للوجود كوحدة متصلة بسطح مكون من 1،2 بيوفيلم. لوحظ بيوفيلم تحت المجهر الذي يتجمع فيه & quotAnimalcules & quot؛ الذي كشطه من أسطح أسنان الإنسان 3. منذ ذلك الحين ، تم تعريف البيوفيلم على أنه مجتمع لاطئ من البكتيريا التي ترتبط بشكل لا رجعة فيه بطبقة أساسية أو ببعضها البعض ومضمنة في مصفوفة لاصقة ذاتية الإنتاج من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) 4،5.

    الالتصاق البكتيري هو الخطوة الأولى في عملية تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة 6. في ظل الظروف المناسبة ، تكون جميع أنواع البكتيريا تقريبًا قادرة على الالتصاق بالأسطح الأحيائية (الأنسجة الحيوانية والنباتية) واللاأحيائية (البلاستيك والزجاج والمعدن والخشب). تم الإبلاغ عن كل من Leptospira المسببة للأمراض والمسببة للرشح لتشكيل أغشية حيوية مرتبطة بالسطح في الثقافات الدائمة 9. بيكاردو وآخرون. ذكر 10 أن الأغشية الحيوية القوية تم إنتاجها بواسطة L. interrogans و L. biflexa على الأسطح الصلبة.

    التصاق Leptospira spp. لاستضافة الخلايا ضروري كخطوة أولية لعدوى داء البريميات 11. بعد اختراق العائل عن طريق السحجات ، تستعمر Leptospira المسببة للأمراض الأعضاء المستهدفة بكفاءة حيث تتكاثر في الدم وتلتصق بالخلايا البطانية والظهارية. من ناحية أخرى ، يتم تطهير Leptospira الرمية بسرعة من مجرى الدم عن طريق البلعمة 12. يسهل تكوين الأغشية الحيوية Leptospira المسببة للأمراض في استعمار الأنابيب الكلوية ، في حين أنه يسهل Leptospira الرمية لاحتلال منافذ بيئية معينة مثل الماء 10.

    تم الإبلاغ عن دراسات انتشار مختلفة على Leptospira الممرضة في مختلف الحيوانات المضيفة والبيئة في جميع أنحاء العالم. ذكرت دراساتنا السابقة حدوث Leptospira spp. في التربة البيئية والمياه من المتنزهات الوطنية في ساراواك ، ماليزيا 13 وكذلك الكشف عن Leptospira spp. في الفئران وبيئة مراكز تدريب الخدمة الوطنية المختارة وحقول الأرز في ساراواك ، ماليزيا 14. يشير وجود Leptospira الممرضة إلى قدرتها على التكيف في المضيف والبيئة والتي يمكن تسهيلها من خلال قدرتها على تكوين غشاء حيوي. لذلك ، هدفت هذه الدراسة إلى تقييم تكوين الأغشية الحيوية في عزلات Leptospira المسببة للأمراض التي تم الحصول عليها من الدراسات السابقة باستخدام اختبار لوحة microtiter. تم تصنيف العزلات أيضًا إلى فئات مختلفة بناءً على قدراتها على تكوين الأغشية الحيوية.

    العزلات البكتيرية وحالة النمو: تم الحصول على ما مجموعه 29 عزلة ممرضة من Leptospira من مختبر الأحياء الدقيقة ، قسم البيولوجيا الجزيئية ، كلية علوم وتكنولوجيا الموارد ، جامعة ماليزيا ساراواك. تم جدولة تفاصيل العزلات في الجدول 1. واستخدمت Leptospira noguchii و L. interrogans كعناصر تحكم إيجابية. تم الحفاظ على جميع الثقافات في درجة حرارة الغرفة في مرق Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) شبه الصلبة المعدل مع 100 & mug ml & # 1501 5-fluorouracil.

    تحضير بدء التعليق البكتيري: تم تحضير الثقافة الأسية المتوسطة عن طريق احتضان ثقافة المخزون في مرق EMJH شبه الصلب المعدل لمدة أسبوع واحد. ثم تم توحيده وفقًا للكثافة الضوئية عند 420 نانومتر تقريبًا من 0.3-0.4 باستخدام مقياس الطيف الضوئي (Metertech Inc.) والذي يتوافق مع حوالي 10 8 بكتيريا مل & # 1501. تم بعد ذلك تحضير لقاح معلق جرثومي من 10 6 بكتريا مل & # 1501 من هذه الثقافة الأسية المتوسطة 15.

    فحص لوحة ميكروتيترية: تم إجراء اختبار بيوفيلم في ثلاث نسخ في 24 لوحة ميكروتيترية ( زراعة الأنسجة معالجة الآبار المسطحة القاع TPP). تم استخدام مرق EMJH كعنصر تحكم سلبي. تم تكييف الإجراء لإجراء فحص بيوفيلم صفيحة ميكروتيتر من Ristow et al. 9 ولي وآخرون. 16.

    باختصار ، تمت إزالة الثقافة السائلة كل يوم لمدة 10 أيام بفاصل زمني 24 ساعة. تم شطف الآبار برفق بالماء المقطر لإزالة خلية العوالق غير الملتصقة. تم السماح لهم بعد ذلك بالتجفيف في الهواء لمدة 15 دقيقة قبل التثبيت باستخدام 2٪ أسيتات الصوديوم. تمت إزالة محلول أسيتات الصوديوم وتركه ليجف في الهواء مرة أخرى. تم تلطيخ الخلايا باستخدام 900 ميكرولتر من محلول كريستال بنفسجي بنسبة 1 ٪ لمدة 20 دقيقة وبعد ذلك تمت إزالة محلول البنفسج البلوري. ثم تم شطف الخلايا ثلاث مرات بالماء المقطر. أخيرًا ، تم إذابة البنفسج البلوري المتبقي في الآبار في 1 مل من الإيثانول / الأسيتون (محلول 80/20 فولت / فولت) قبل قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD 600). لتصحيح تلطيخ الخلفية للبنفسجي البلوري ، تم طرح متوسط ​​الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر للتحكم السلبي من متوسط ​​الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر من تكوين الأغشية الحيوية بواسطة Leptospira المسببة للأمراض. تم عرض النتائج في متوسط ​​الانحراف المعياري.

    تصنيف القدرة على تكوين الأغشية الحيوية بواسطة العزلات: تم تحديد قدرة Leptospira على تكوين الأغشية الحيوية كما وصفها Stepanovic et al. 17 ، مارينهو وآخرون. 7 وساكسينا وآخرون. 18. تم تصنيف قدرات تكوين الأغشية الحيوية لـ 29 عزلة ممرضة من Leptospira والضوابط الإيجابية في كل يوم إلى أربع فئات بناءً على الكثافة البصرية التي تم الحصول عليها. يتم تعريف القيمة الفاصلة للكثافة الضوئية (OD c) على أنها ثلاثة انحرافات معيارية أعلى من متوسط ​​الكثافة البصرية (OD) للتحكم السلبي.

    هذه الفئات الأربع غير ملتصقة عند OD & lt OD c ، ملتصقة بشكل ضعيف عند OD c & ltOD & lt 2 & timesOD c ، ملتصقة بشكل معتدل عندما 2 & timesOD c & ltOD & lt 4 & timesOD c وتلتزم بشدة عند 4 & timesOD c & ltOD.

    التحليل الإحصائي: تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج SPSS الإصدار 20.0 (شركة IBM ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تقييم الفروق بين وسائل المتغيرات باستخدام مقاييس متكررة ANOVA. تم استخدام اختبار Bonferroni اللاحق لمقارنة القيم المتوسطة لـ Biofilm OD 600.تم تحديد مستوى الأهمية عند p & lt0.05.

    في هذه الدراسة ، يوضح الشكل 1 و 2 و 3 تكوين الأغشية الحيوية باستخدام فحص صفيحة ميكروتيتر لجميع عزلات Leptospira المختبرة على مدى 10 أيام حضانة. لضمان موثوقية واستنساخ البيانات ، أجريت الاختبارات في ثلاث نسخ. أشار التحليل الإحصائي إلى وجود فرق معنوي في تأثير الوقت على تكوين الأغشية الحيوية بهذه البكتيريا (p & lt0.05). كما وجد أن هذه البكتيريا ذات دلالة إحصائية مختلفة فيما بينها في إنتاج الأغشية الحيوية (p & lt0.05).

    بناءً على الأشكال 1 و 2 و 3 ، لوحظ أن جميع عزلات Leptospira المختبرة أظهرت نمطًا مشابهًا في نمو الأغشية الحيوية. في اليوم الأول والثاني ، كانت كمية البيوفيلم المتكونة كما هو موضح بواسطة OD 600 ، لا تزال منخفضة. تبدأ الكمية في الزيادة من اليوم الثالث مما يدل على زيادة عدد البكتيريا الملتصقة. في المتوسط ​​، تم الحصول على أعلى قيم متوسط ​​لـ Biofilm OD 600 إما في اليوم السابع أو الثامن ، وتختلف بين البكتيريا. بعد تحقيق أعلى نقطة ، كان هناك انخفاض في القيم المتوسطة للغشاء الحيوي OD 600. يتم تمثيل عدد البكتيريا المختبرة بقدرات تكوين غشاء حيوي مختلف في كل يوم في الجدول 2. من بين 29 عزلة من Leptospira الممرضة و 2 ضابطة إيجابية تم فحصها ، تم تصنيف 32.26٪ لكل منها إما على أنها غير ملتصقة أو منتجة غشاء حيوي ضعيف الالتصاق في اليوم الأول. أنتجت معظمهم أغشية حيوية ملتصقة بشكل معتدل وقوي من اليوم الثاني إلى اليوم الخامس. حقق كل منهم قدرات قوية على الالتصاق بدءًا من اليوم السادس وظلوا ملتزمين بقوة حتى اليوم العاشر.

    أظهر إنتاج الأغشية الحيوية التي تم تقييمها باستخدام اختبار صفيحة ميكروتيترية إنتاج أغشية حيوية قوية بنسبة 100٪ في هذه الدراسة كما هو موضح في النتيجة من اليوم السادس. من بين عزلات الجرذان ، أقوى منتج للبيوفيلم هو P38 مع OD 600 عند 16.700 و plusmn0.265 في اليوم الثامن. من بين 14 عينة تربة تم فحصها ، يعتبر P18 أقوى منتج للأغشية الحيوية مع OD 600 عند 21.760 & plusmn 0.332 في اليوم السابع.

    بالنسبة لعينات المياه ، يُعرف P22 بأنه أقوى منتج للأغشية الحيوية مع OD 600 عند 19.793 و plusmn 0.144 في اليوم السابع. أشار اختبار Bonferroni اللاحق إلى أن هذه العزلات الثلاث (P18 و P22 و P38) كانت مختلفة إحصائيًا عن بعضها البعض والضوابط الإيجابية في تكوين الأغشية الحيوية عند إجراء مقارنات حكيمة بين الزوجين (p & lt0.05).

    عادة ما يتميز تكوين البيوفيلم بواسطة البكتيريا بمراحل مميزة من الارتباط (قابل للعكس ولا رجوع فيه) ، والنمو والانفصال 1. في هذه الدراسة ، تم العثور على عزلات Leptospira المسببة للأمراض لتطوير غشاء حيوي خلال مراحل مختلفة من عملية تحاكي البكتيريا الأخرى. أشارت النتائج إلى أن الكتلة الحيوية قد تشكلت في قاع 24 لوحة ميكروتيترية لجميع عزلات Leptospira الممرضة وعددها 29 عزلة وضابطة إيجابية. بدأت العملية عندما وصلت خلايا Leptospira إلى سطح 24 لوحة ميكروتيتر وربطتها. بعد التصاق الخلية ، طوروا استجابات استشعار السطح والتزموا بغشاء التكييف الذي يحبس العناصر الغذائية والسوائل المحيطة 16،1.

    من 1 إلى 6 أيام ، شكلت الخلايا المرفقة مستعمرات دقيقة وتم تجميعها معًا من خلال وجود مصفوفة عديدات السكاريد الخارجية. تحتوي هذه المصفوفة على الحمض النووي خارج الخلية والبروتينات وحطام الخلايا الميتة التي تحمي الخلايا من الظروف البيئية المجهدة 19. توسعت هذه المستعمرات الصغيرة وتضاعفت حتى نمت لتصبح حالة ناضجة كمستعمرات كبيرة ذات هياكل ثلاثية الأبعاد في اليومين السابع والثامن.

    بعد النضج ، تشتت البكتيريا داخل المستعمرات الكبيرة ونجت إما كمزارع بلانكتونية أو تبدأ في الموت. نتيجة لذلك ، يمكن اعتبار عملية تكوين الأغشية الحيوية بواسطة Leptospira المسببة للأمراض في هذه الدراسة كعملية ديناميكية ومنظمة وراثياً. كان هذا وفقًا للدراسة السابقة التي أجراها Hu et al. 20 الذي لاحظ أن أنواعًا مختلفة من البكتيريا تنتج الأغشية الحيوية من خلال عملية مماثلة ، وبالتالي اقترح أن تكون الأغشية الحيوية هي عملية منظمة وراثيًا. لاحظ صن وآخرون ملاحظة مماثلة. 21 أن تشكيل البيوفيلم من المكورات العنقودية الذهبية هي عملية ديناميكية.

    تم تقييم تحديد تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة باستخدام طرق مختلفة ولكن لم يتم وضع بروتوكول موحد لتحديد قدرة تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة لأنواع البكتيريا المختلفة. على سبيل المثال ، غالبًا ما تكون طبقة البكتيريا المبطنة لأنبوب الثقافة ملطخة بصبغة كاتيونية ويتم تحجيمها بصريًا في طريقة اختبار الأنبوب. هذه الطريقة نوعية وبالتالي فهي ذاتية في تفسير النتائج 17. في هذه الدراسة ، تم اختيار اختبار لوحة ميكروتيتر ، حيث تم تحديد الكثافة الضوئية للغشاء الحيوي Leptospira الملطخ بطريقة القياس الطيفي.

    على الرغم من أن فحص لوحة microtiter يعاني من عيب كبير في اكتشاف الأغشية الحيوية في الجزء السفلي من البئر فقط ، إلا أن هذا الاختبار يعتبر الطريقة الأكثر استخدامًا في القياس الكمي للغشاء الحيوي 22،18. يقضي قياس الكثافة الضوئية الذي تم الحصول عليه من اختبار لوحة ميكروتيتر على ذاتية اختبار الأنبوب في تفسير النتائج التي تم الحصول عليها ويتنبأ بالأهمية السريرية بشكل أكثر موثوقية من اختبار الأنبوب 17. إلى جانب ذلك ، من السهل إجراء فحص لوحة microtiter عند تطبيق أصباغ مختلفة فقط مثل البنفسجي البلوري المستخدم في هذه الدراسة ، أو resazurin أو ثنائي ميثيل الميثيلين الأزرق يتيح القياس الكمي للبيوفيلم 23.

    في هذه الدراسة ، زادت كمية الأغشية الحيوية كما يتضح من تلطيخ البنفسج الكريستالي بطريقة تعتمد على الوقت لتصل إلى أقصى قيم متوسط ​​لـ 600 OD تبلغ حوالي 12 في اليومين السابع والثامن. تتناقض هذه القيمة مع الدراسة التي أجراها Ristow et al. 9 الذين أبلغوا عن قيم OD القصوى 600 لما يقرب من 2 بعد تلطيخ البنفسجي البلوري بعد يومين من الحضانة لـ Leptospira biflexa ، وهو نبات رمي.

    في أعلى تشبع بخلايا بيوفيلم (اليوم السابع والثامن) ، كانت قيمة امتصاص Leptospira المسببة للأمراض أعلى بحوالي 6 مرات من Leptospira 9. لذلك ، تم استنتاج أن Leptospira المسببة للأمراض أنتجت تكوين بيوفيلم أعلى بكثير من Leptospira saprophytic Leptospira. في دراسة سابقة قام بها Brihuega et al. لتقييم تكوين الأغشية الحيوية لعزل الخنازير من L. interrogans serovar Pomona و L. biflexa serovar Patoc ، تم العثور على السلالة المسببة للأمراض لتطوير طبقة أكثر سمكًا من الأغشية الحيوية مقارنة بالسلالة الرمية في اليوم الخامس. إلى جانب ذلك ، شكل تعايش L. interrogans مع خلايا Azospirillum brasilense طبقة كثيفة من الأغشية الحيوية ، حيث وصلوا إلى أقصى قدر من التصاق الخلية على الشرائح الزجاجية في اليوم الثاني 25.

    سبب آخر يدعم القدرات المختلفة لمسببات Leptospira المسببة للأمراض والرحم في تكوين الأغشية الحيوية هو اكتشاف بعض عوامل الاستعمار التي تم تحديدها في Leptospira المسببة للأمراض ولكن ليس في Leptospira الرمية. قد يعزى ذلك إلى المواد اللاصقة المختلفة التي تساهم في الإصابة الأولية. تم الإبلاغ عن أن البروتين المرتبط بالفيبرونكتين 36 كيلو دالتون المعزول من الغلاف الخارجي لـ L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae معروف بوجوده فقط في السلالات الممرضة 12،26.

    لوحظ انخفاض متوسط ​​قيم OD 600 لعزلات Leptospira الممرضة في اليومين الثامن والتاسع. الدراسة السابقة التي أجراها Charyeva et al. كشف 27 أن الأغشية الحيوية التي تنتجها Staphylococcus epidermidis انخفضت ما بين 3 و 7 أيام. في دراسة أجراها Ristow et al. في الشكل 9 ، ذكروا أن قيم OD 600 لعزلات Leptospira الرخامية انخفضت في اليوم الثالث. وبالتالي ، يشير هذا إلى أن Leptospira المسببة للأمراض يمكن أن تحافظ على القدرة على إنتاج الأغشية الحيوية بشكل أفضل من Leptospira الرمية. يمكن أن يكون للقدرة على الحفاظ على الأغشية الحيوية تأثيرًا في الإصابة بسلالات Leptospira. بعد التعرض للغشاء المخاطي أو الجلد المتآكل ، تتسبب Leptospira الممرضة بسرعة في حدوث عدوى جهازية عن طريق عبور حواجز الأنسجة وغزو الدم. يلتزمون بمكونات المصفوفة خارج الخلية مثل نوع الكولاجين الأول والنوع الرابع واللامينين والفيبرونيكتين 28. أتزينجين وآخرون. ذكر أن التعلق بالمصفوفة خارج الخلية يرتبط بالضراوة ، لأن الارتباط بالمصفوفة خارج الخلية يكون أكثر فاعلية في Leptospira المسببة للأمراض من Leptospira الوسيطة والرائعة.

    إن التباين في كمية إنتاج الأغشية الحيوية أمر شائع حيث أن العزلات المختلفة من Leptospira المُمْرِضة أنتجت غشاء حيوي بقدرات ملتصقة مختلفة كما هو موضح في هذه الدراسة. ومع ذلك ، بناءً على التصنيف كما استخدمه Stepanovic et al. في الشكل 17 ، تعتبر جميع العزلات من منتجي الأغشية الحيوية القوية التي تشكل غشاءً حيويًا قويًا على ألواح ميكروتيتر. يعتبر إنتاج الأغشية الحيوية القوية في Leptospira الممرضة عاملاً رئيسياً للبقاء في بيئة متنوعة. وقد ساهم هذا لاحقًا في التسبب في الإصابة بمرض الليبتوسبيرا بشكل غير مباشر نظرًا لأن داء البريميات عادة ما يكون ناتجًا عن مرض ليبتوسبيرا. هذا يتفق مع Hu et al. 20 الذين ذكروا أن تكوين الأغشية الحيوية بواسطة البكتيريا مهم في التسبب في العديد من الالتهابات البكتيرية. يُعزى أكثر من 60٪ من جميع حالات العدوى البكتيرية البشرية إلى استمرار تكوين الأغشية الحيوية بواسطة البكتيريا المعنية 30. قد تعتمد مسببات الأمراض البكتيرية على تطوير الأغشية الحيوية للمساعدة في إنشاء العائل ، والتوسع السكاني ، والأهم من ذلك في انتشار الأمراض 31.

    تم استخدام اختبار الميكروتيتر للوحة الغشاء الحيوي ، وهو طريقة بسيطة لتقدير الغشاء الحيوي بنجاح في هذه الدراسة لتقييم قدرات تكوين الأغشية الحيوية بين عزلات Leptospira المسببة للأمراض. بشكل عام ، تمتلك عزلات Leptospira الـ 29 التي تم فحصها في هذه الدراسة القدرة على إنتاج غشاء حيوي قوي ، ومع ذلك ، فإن كمية البيوفيلم المتكونة كانت مختلفة من العزلة إلى العزلة. لا يمكن إنكار دور الأغشية الحيوية في التسبب في العدوى البشرية. يمكن أن يؤدي تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة إلى آثار خطيرة في المجال الطبي والصحة العامة والصناعة والبيئة. تعد الدراسة المستقبلية حول تحديد الجينات المشاركة في تكوين الأغشية الحيوية بواسطة Leptospira المسببة للأمراض ذات أهمية قصوى للتخطيط لمزيد من مناهج الوقاية ضد تفشي داء البريميات.

    تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة التعليم العالي الماليزية في إطار مخطط منح البحوث الأساسية FRGS / STO3 (02) / 1209/2014 (10).

    2: دي سوزا ، E.L. ، Q.G.S. ميرا ، آي. باربوسا ، A.J.A. Athayde ، M.L. Da Conceicao و J.P. de Siqueira Junior ، 2014. تشكيل Biofilm بواسطة المكورات العنقودية الذهبية من الأسطح التي تلامس الطعام في مرق اللحم والحساسية للمطهرات. براز. J. Microbiol. ، 45: 67-75.
    كروسريف | رابط مباشر |

    3: Garrett، T.R.، M. Bhakoo and Z. Zhang، 2008. التصاق بكتيري وأغشية حيوية على الأسطح. بروغ. نات. علوم ، 18: 1049-1056.
    كروسريف | رابط مباشر |

    4: كوريس ، A.M.N. ، G.M.D.F.V. أكويجي ، دي إس بوس ، ج. فينتورا ، P.M.B. فرنانديز و A. فرنانديز ، 2013. مقارنة بين الغشاء الحيوي وآليات التعلق لعزلة مرضية نباتية وسريرية لـ الالتهاب الرئوي كليبسيلا subsp. الرئوية. عالم. العالم ج .10.1155 / 2013/925375

    5: Aggarwal، S.، PS ستيوارت و R.M. Hozalski ، 2015. قوة تماسك Biofilm كأساس لعناد الأغشية الحيوية: هل الأغشية الحيوية البكتيرية مفرطة التصميم؟ ميكروبيول. رؤى ، ٨: ٢٩-٣٢.
    كروسريف | رابط مباشر |

    6: Adetunji ، V.O. و ل. Isola ، 2011. التصاق بكتريا قولونية و بكتريا قولونية O157: H7 يعزل من مجزر استوائي نموذجي على الأسطح الخشبية والفولاذية والزجاجية. الدقة. J. Microbiol.، 6: 669-677.
    كروسريف | رابط مباشر |

    7: مارينيو ، أر ، P.D. مارتينز ، إي إم ديتمير ، ب. دازيفيدو ، جيه فرازون ، إس تي. فان دير ساند وأ. Frazzon ، 2013. تشكيل بيوفيلم على البوليسترين تحت درجات حرارة مختلفة بواسطة مقاومة المضادات الحيوية المكورات المعوية البرازية و المكورات المعوية البرازية معزولة عن الطعام. براز. J. Microbiol. ، 44: 423-426.
    كروسريف | رابط مباشر |

    8: زامير ، ف. ، م. Rukmangada ، JB Chauhan ، S.A. Khanum و P. Kumar وآخرون، 2016. تقييم الخواص اللاصقة والمضادة للالتصاق الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية وتثبيطها بالنباتات العشبية. إيران. J. Microbiol. ، 8: 108-119.
    رابط مباشر |

    9: Ristow، P.، P. Bourhy، S. Kerneis، C. Schmitt، M.C. Prevost، W. Lilenbaum and M. Picardeau، 2008. تشكيل الأغشية الحيوية بواسطة leptospires الرمية والممرضة. علم الأحياء الدقيقة ، 154: 1309-1317.
    كروسريف | رابط مباشر |

    10: بيكاردو ، م. ، د. بولاش ، سي.بوشيير ، آر إل زويرنر و ن. زيدان وآخرون. ، 2008. تسلسل الجينوم للنبتة الرملية ليبتوسبيرا بيفليكسا يقدم رؤى حول تطور ليبتوسبيرا والتسبب في داء البريميات. بلوس وان ، المجلد. 3. 10.1371 / journal.pone.0001607

    11: إيفانجليستا ، ك. and J. Coburn، 2010. Leptospira كممرض ناشئ: مراجعة لبيولوجيته وتسببه واستجاباته المناعية للمضيف. ميكروبيول المستقبل ، 5: 1413-1425.
    كروسريف | PubMed | رابط مباشر |

    12: باربوسا ، أ.س. ، ب. أبرو ، ف. نيفيز ، م. أتزينجين وم. واتانابي وآخرون. ، 2006. يتوسط اللاصق الفيروسي البريمي الذي تم تحديده حديثًا الارتباط باللامينين. تصيب. إيمون ، 74: 6356-6364.
    كروسريف | رابط مباشر |

    13: Pui ، C.F. ، L.M. Bilung ، L. Su'ut and K. Apun ، 2015. انتشار ليبتوسبيرا الأنواع في التربة والمياه البيئية من المتنزهات الوطنية في ساراواك ، ماليزيا. بورنيو جيه رسور. علوم. تكنول ، 5: 49-57.
    رابط مباشر |

    14: بوي ، C.F. ، L.M. Bilung ، Y.L. Chong، L. Su'ut and K. Apun، 2016. Detection of ليبتوسبيرا النيابة. في مراكز تدريب الخدمة الوطنية المختارة وحقول الأرز في ساراواك ، ماليزيا باستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل. جيه تروب. الزراعية. علوم ، (في الصحافة).

    15: Wuthiekanun، V.، P. Amornchai، D.H. Paris، S. Langla and J. Thaipadunpanit وآخرون، 2013. العزل السريع واختبار الحساسية ليبتوسبيرا النيابة. باستخدام وسيط صلب جديد ، أجار LVW. مضاد للميكروبات. وكلاء Chemother ، 57: 297-302.
    كروسريف | رابط مباشر |

    16: لي ، إتش واي ، إل سي. تشاي ، سي. بوي ، س.مصطفى ، ي.ك. Cheah، M. Nishibuchi and S. Radu، 2013. تشكيل الأغشية الحيوية بواسطة الليسترية المستوحدة ATCC 19112 عند درجات حرارة حضانة مختلفة وتركيزات كلوريد الصوديوم. براز. J. Microbiol. ، 44: 51-55.
    رابط مباشر |

    17: ستيبانوفيتش ، إس ، دي فوكوفيتش ، آي داكيتش ، بي سافيتش وم. المكورات العنقودية تشكيل بيوفيلم. J. ميكروبيول. الطرق ، 40: 175-179.
    كروسريف | رابط مباشر |

    18: ساكسينا ، إس ، جي بانيرجي ، آر جارج وم. سينغ ، 2014. دراسة مقارنة لتكوين الأغشية الحيوية في الزائفة الزنجارية من مرضى التهابات الجهاز التنفسي السفلي. J. كلين. الدقة التشخيصية ، 8: DC09-DC11.
    كروسريف | رابط مباشر |

    19: مالامود ، ف. ، ر. هوميم ، ف. كونفورتي ، ب. ياريورا و A.P. Castagnaro وآخرون، 2013. تحديد وتوصيف الطفرات المعيبة في تكوين الأغشية الحيوية زانثوموناس سيتري subsp. سيتري. علم الأحياء الدقيقة ، 159: 1911-1919.
    كروسريف | رابط مباشر |

    20: Hu و Q. و Y. Zhu و J. Tu و Y. Yin و X. Wang وآخرون. ، 2012. تحديد الجينات المشاركة في Riemerella anatipestifer تشكيل بيوفيلم عن طريق طفرات الينقولات العشوائية. بلوس وان ، المجلد. 7. 10.1371 / journal.pone.0039805

    21: صن ، جيه إل ، إس. تشانغ ، X.X. تشين ، ج. تشين وبي. هان ، 2012. خصائص النمو المكورات العنقودية الذهبية في بيوفيلم تشكلت على صفيحة البوليسترين. Afr. J. ميكروبيول. الدقة ، 6: 3284-3291.
    رابط مباشر |

    22: Agarwal ، R.K. ، S. Singh ، K.N. بهليجاونكار و ف. سينغ ، 2011. تحسين فحص لوحة ميكروتيتر لاختبار قدرة تكوين الأغشية الحيوية المختلفة السالمونيلا الأنماط المصلية. كثافة العمليات الدقة الغذائية. ج. ، 18: 1493-1498.
    رابط مباشر |

    23: Seixas، R.، M. Gabriel، J. Machado، L. Tavares، F. Bernardo and M. Oliveira، 2014. تأثير ظروف الجهاز الهضمي المحاكاة على تكوين الأغشية الحيوية بواسطة السالمونيلا 1 ، 4 ، [5] ، 12: ط: -. عالم. العالم ج .10.1155 / 2014/153956

    24: Brihuega، B.، L. Samartino، C. Auteri، A. Venzano and K. Caimi، 2012. في الجسم الحي التجمعات الخلوية لعزل حديث مكون من غشاء حيوي لخنازير ليبتوسبيرا interrogans سلالة من الأرجنتين. القس أرجنت. ميكروبيول ، 44: 138-143.
    رابط مباشر |

    25: كومار ، ك.ف. ، س.ال ، ر. راج ، ك. أزوسبيريلوم. FEMS ميكروبيول. Ecol. ، المجلد. 91. 10.1093 / فيمسك / fiv051

    26: أندرادي ، جي. و P.D. براون ، 2012. تحليل مقارن لمرفق ليبتوسبيرا interrogans و L. borgpetersenii لخلايا الثدييات. FEMS إمونول. ميد. ميكروبيول ، 65: 105-115.
    كروسريف | رابط مباشر |

    27: تشارييفا ، أو. ، ج. نيلاندز ، ج. سفينساتر و أ. وينيربيرج ، 2015. تشكيل بكتيري بيوفيلم على امتصاص غرسات المغنيسيوم. افتح J. Med. ميكروبيول ، 5: 1-11.
    كروسريف | رابط مباشر |

    28: سينكو ، إم ، 2010. رؤى جديدة حول إمراضية البريميات: تفادي دفاعات العائل. ميكروبيول جديد ، 33: 283-292.
    PubMed | رابط مباشر |


    المواد والأساليب

    خطوط الخلايا والعدوى الفيروسية والسلالات البكتيرية.

    تم عزل خط الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية CFBE41o- الخالد (المشار إليه هنا باسم "AECs") من مريض ΔF508 / ΔF508 ، تمت تربيته على مرشحات Transwell ، ونما في السطح البيني بين الهواء والسائل لمدة 7-10 أيام. تم الحصول على خلايا HBE الأولية (بموافقة مستنيرة بموجب البروتوكول المعتمد من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة بيتسبرغ ، كما هو موضح في المرجع. المصاب بالسلالة البشرية النقية A2 من RSV [تعدد العدوى (MOI) للخلايا المصنفة = 1] ، أو hrV14 (MOI = 1) ، أو Ad5 البشري (MOI = 1) لمدة 72 ساعة. ال ص. الزنجارية تم استخدام سلالة PAO1 التي تعبر بشكل أساسي عن GFP كما هو موضح سابقًا (19 ، 40).

    تجارب Coculture Biofilm.

    تم استخدام التصوير بالخلايا الحية لتصوير الأغشية الحيوية البكتيرية المزروعة على الخلايا الظهارية في وجود أو عدم وجود عدوى فيروسية ، كما هو موصوف في المراجع. 18 و 19 و 40). ص. الزنجارية أجريت تجارب زراعة الأغشية الحيوية للأغشية الحيوية الثابتة كما هو موصوف سابقًا (19 ، 40).

    تحليل الحديد.

    تم جمع CM من AECs ، تمت إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 1400 × ز، وتم تخزين CM عند 4 درجات مئوية. تم قياس إجمالي الحديد في سم باستخدام مجموعة مقايسة الحديد QuantiChrom (أنظمة BioAssay).

    في دراسات عدوى Vivo RSV.

    أجريت دراسات عدوى RSV في الجسم الحي بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في المعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (48) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة بيتسبرغ (IACUC) (رقم البروتوكول 14023340). تم التعامل مع الفئران وفقًا لإرشادات IACUC ، وبُذلت كل الجهود لتقليل معاناة الحيوانات. تم إيواء الفئران في قسم الموارد الحيوانية في جامعة بيتسبرغ. تم تلقيح الفئران حديثي الولادة (الجراء) من الفئران BALB / cJ عن طريق الأنف بوزن الجسم 5 × 10 5 pfu / g من خط RSV 19 أو PBS ، كما هو موضح سابقًا (28).تم حصاد BALF للتحليل بمقايسة الحديد ، وتم تقييم وفرة الترانسفيرين بواسطة لطخة ويسترن.

    تحليل احصائي.

    تم استخدام GraphPad Prism الإصدار 6.0 (GraphPad) للتحليل الإحصائي. تمت مقارنة الوسائل باستخدام Student’s ر اختبار أو ، لإجراء مقارنات متعددة ، ANOVA مع اختبار Tukey اللاحق. ص & lt 0.05 اعتبرت كبيرة.

    يمكن العثور على طرق إضافية في مواد وطرق SI.


    نتائج

    تكوين بيوفيلم ثقافة نقية

    تم التحقق من القدرة على تكوين غشاء حيوي للبكتيريا المعروضة في الجدول 1 باستخدام فحص لوحة ميكروتيتر كريستال بنفسجي. تمكنت ثلاثة أصناف من تكوين غشاء حيوي في جميع وسائط الثقافة الأربعة ، وهي Acinetobacter calcoaceticus ، Comamonas denitrificans 123 و الزائفة الزنجارية ( رسم بياني 1). كانت جميع الكائنات الحية الثلاثة عشر قادرة على تكوين غشاء حيوي في وسط واحد على الأقل. تم الحصول على تكوين البيوفيلم بشكل ثابت في وسط الأسيتات ، حيث شكلت ثماني سلالات غشاء حيوي قوي. أعطت المياه العادمة والجلوكوز نتائج متساوية إحصائياً (ص= 1) ، في حين أدى dNB إلى تكوين بيوفيلم أضعف (ص& lt0.05). لوحظ أقوى نمو للعوالق في وسط الجلوكوز ، يليه الأسيتات. كان النمو في مياه الصرف الصحي و dNB أقل بكثير (ص= 0.001 ، البيانات غير معروضة). لم يؤثر وقت الثقافة (24 أو 48 ساعة) على تكوين الأغشية الحيوية (ص= 0.8) ، باستثناء Zoogloea ramigera في وسط الأسيتات ، حيث انخفض تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة من قوي عند 24 ساعة إلى لا شيء عند 48 ساعة.

    نتيجة اختبار تكوين الأغشية الحيوية للمزارع النقية في مياه الصرف الصحي ووسط الأسيتات ووسط الجلوكوز ومرق المغذيات المخفف (dNB). القضبان الموجودة أسفل الخط المنقط السفلي عبارة عن صانعين غير بيوفيلم ، والأعمدة الموجودة أعلى الخط المنقط العلوي تعتبر من المكونات القوية للأغشية الحيوية. تمثل الأشرطة متوسط ​​القيم مع SDs (ن=24).

    نتيجة اختبار تكوين الأغشية الحيوية للمزارع النقية في مياه الصرف الصحي ووسط الأسيتات ووسط الجلوكوز ومرق المغذيات المخفف (dNB). القضبان الموجودة أسفل الخط المنقط السفلي عبارة عن مُشكِّلات غير بيوفيلم ، أما القضبان الموجودة أعلى الخط المنقط العلوي ، فتُعتبر مُكوِّنات غشاء حيوي قوي. تمثل الأشرطة القيم المتوسطة مع SDs (ن=24).

    الخصائص الفسيولوجية

    تم التحقق من أهمية الالتزام الأولي ، والكراهية للماء ، وإنتاج الأميلويد وإنتاج EPS لتكوين الأغشية الحيوية للبكتيريا المدرجة في الجدول 1. Comamonas denitrificans 110 و Brachymonas denitrificans يلتصق B79 بسهولة بأسطح البوليسترين (15.1٪ و 13.5٪ على التوالي) وفقًا لاختبار الالتزام الأولي (الجدول 2). بكتيريا سيريوس العصويه SJV ، Z. ramigera ، B. denitrificans SJV و الكلبسيلة الرئوية أظهر SJV خصائص التزام ضعيفة (& lt1٪). فقط Acinetobacter calcoaceticus و B. denitrificans يمتلك B79 خصائص سطح الخلية الكارهة للماء (& gt70٪) ولا يزيد عن كائنين ، B. cereus SJV و B. denitrificans B79 ، أنتجت مواد لاصقة أميلويد ملزمة حمراء الكونغو (الجدول 2). أظهر FISH-CLSM أن الأغشية الحيوية لـ C. denitrificans سلالات 110 و 123 و B. cereus شكل SJV مجموعات خلايا مبعثرة محاطة بـ EPS أثناء A. calcoaceticus أنتجت حصيرة خلية موحدة مع EPS قليلة أو معدومة. Brachymonas denitrificans B79 و P. الزنجارية شكلت أيضًا حصائر خلوية موحدة ولكن مع وجود معتدل لـ EPS في الأقسام متعددة الطبقات من البيوفيلم. يوضح الشكل 2 الأشكال المختلفة للأغشية الحيوية جيم نيتريفيكانس 110 و A. calcoaceticus. كان سمك البيوفيلم للمزارع النقية 9-21 ميكرومتر لجميع الكائنات الحية ، وهو ما يقابل بضع طبقات من الخلايا.

    نمو العوالق وخصائص الخلايا الفسيولوجية والملاحظات المجهرية

    صنف نمو العوالق ، 24 ساعة (OD620 نانومتر) الالتزام الأولي (٪) رهاب الماء (٪) طريقة CRA FISH-CLSM (خلايا / EPS)
    A. calcoaceticus0.09 ± 0.019 7.6 79 لون القرنفل ++/−
    A. hydrophila L6 0.15 ± 0.034 1.2 30 أبيض +/−
    B. cereus SJV 0.18 ± 0.026 0.1 0 أحمر +/++
    B. denitrificans B79 0.21 ± 0.025 13.5 76 أحمر ++/+
    B. denitrificans SJV 0.28 ± 0.041 1.0 9 أبيض +/+
    C. denitrificans 110 0.14 ± 0.023 15.1 0 لون القرنفل +/++
    جيم نيتريفيكانس 123 0.22 ± 0.044 1.7 3 لون القرنفل ++/++
    دلفتيا ص. SJV 0.29 ± 0.035 5.4 5 أبيض ++/+
    بكتريا قولونية AF1000 0.12 ± 0.019 1.6 8 أبيض −/−
    بكتريا قولونية K-12 0.17 ± 0.032 2.3 6 أبيض −/−
    K. الرئوية SJV 0.14 ± 0.026 1.0 14 أبيض −/−
    P. الزنجارية0.07 ± 0.026 9.0 8 لون القرنفل +/+
    Z. ramigera0.25 ± 0.022 0.7 10 لون القرنفل +/+
    صنف نمو العوالق ، 24 ساعة (OD620 نانومتر) الالتزام الأولي (٪) رهاب الماء (٪) طريقة CRA FISH-CLSM (خلايا / EPS)
    A. calcoaceticus0.09 ± 0.019 7.6 79 لون القرنفل ++/−
    A. hydrophila L6 0.15 ± 0.034 1.2 30 أبيض +/−
    B. cereus SJV 0.18 ± 0.026 0.1 0 أحمر +/++
    B. denitrificans B79 0.21 ± 0.025 13.5 76 أحمر ++/+
    B. denitrificans SJV 0.28 ± 0.041 1.0 9 أبيض +/+
    C. denitrificans 110 0.14 ± 0.023 15.1 0 لون القرنفل +/++
    C. denitrificans 123 0.22 ± 0.044 1.7 3 لون القرنفل ++/++
    دلفتيا ص. SJV 0.29 ± 0.035 5.4 5 أبيض ++/+
    بكتريا قولونية AF1000 0.12 ± 0.019 1.6 8 أبيض −/−
    بكتريا قولونية K-12 0.17 ± 0.032 2.3 6 أبيض −/−
    K. الرئوية SJV 0.14 ± 0.026 1.0 14 أبيض −/−
    P. الزنجارية0.07 ± 0.026 9.0 8 لون القرنفل +/+
    Z. ramigera0.25 ± 0.022 0.7 10 لون القرنفل +/+

    التطوير التنظيمي الأولي620 نانومتر كانت القيمة 0.1 في كفيت سعة 1 مل ، والذي يتوافق مع 0.04 في ألواح الميكروتيتر (ن=24).

    لون المستعمرات المزروعة على CRA: لا يمكن تصنيف الكائنات الحية المنتجة للأميلويد باللون الأحمر ، والكائنات غير المنتجة للوردي.

    وجود الخلايا والمواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) في الأغشية الحيوية المزروعة لمدة 24 ساعة في مياه الصرف الصحي. (-) غياب الخلايا / EPS ، (+) معتدل ، (++) وجود كبير للخلايا / EPS.

    تم إجراء جميع التجارب باستخدام وسط الصرف الصحي.

    نمو العوالق وخصائص الخلايا الفسيولوجية والملاحظات المجهرية

    صنف نمو العوالق ، 24 ساعة (OD620 نانومتر) الالتزام الأولي (٪) رهاب الماء (٪) طريقة CRA FISH-CLSM (خلايا / EPS)
    A. calcoaceticus0.09 ± 0.019 7.6 79 لون القرنفل ++/−
    A. hydrophila L6 0.15 ± 0.034 1.2 30 أبيض +/−
    B. cereus SJV 0.18 ± 0.026 0.1 0 أحمر +/++
    B. denitrificans B79 0.21 ± 0.025 13.5 76 أحمر ++/+
    B. denitrificans SJV 0.28 ± 0.041 1.0 9 أبيض +/+
    C. denitrificans 110 0.14 ± 0.023 15.1 0 لون القرنفل +/++
    C. denitrificans 123 0.22 ± 0.044 1.7 3 لون القرنفل ++/++
    دلفتيا ص. SJV 0.29 ± 0.035 5.4 5 أبيض ++/+
    بكتريا قولونية AF1000 0.12 ± 0.019 1.6 8 أبيض −/−
    بكتريا قولونية K-12 0.17 ± 0.032 2.3 6 أبيض −/−
    K. الرئوية SJV 0.14 ± 0.026 1.0 14 أبيض −/−
    P. الزنجارية0.07 ± 0.026 9.0 8 لون القرنفل +/+
    Z. ramigera0.25 ± 0.022 0.7 10 لون القرنفل +/+
    صنف نمو العوالق ، 24 ساعة (OD620 نانومتر) الالتزام الأولي (٪) رهاب الماء (٪) طريقة CRA FISH-CLSM (خلايا / EPS)
    A. calcoaceticus0.09 ± 0.019 7.6 79 لون القرنفل ++/−
    A. hydrophila L6 0.15 ± 0.034 1.2 30 أبيض +/−
    B. cereus SJV 0.18 ± 0.026 0.1 0 أحمر +/++
    B. denitrificans B79 0.21 ± 0.025 13.5 76 أحمر ++/+
    B. denitrificans SJV 0.28 ± 0.041 1.0 9 أبيض +/+
    C. denitrificans 110 0.14 ± 0.023 15.1 0 لون القرنفل +/++
    C. denitrificans 123 0.22 ± 0.044 1.7 3 لون القرنفل ++/++
    دلفتيا ص. SJV 0.29 ± 0.035 5.4 5 أبيض ++/+
    بكتريا قولونية AF1000 0.12 ± 0.019 1.6 8 أبيض −/−
    بكتريا قولونية K-12 0.17 ± 0.032 2.3 6 أبيض −/−
    K. الرئوية SJV 0.14 ± 0.026 1.0 14 أبيض −/−
    P. الزنجارية0.07 ± 0.026 9.0 8 لون القرنفل +/+
    Z. ramigera0.25 ± 0.022 0.7 10 لون القرنفل +/+

    التطوير التنظيمي الأولي620 نانومتر كانت القيمة 0.1 في كفيت سعة 1 مل ، والذي يتوافق مع 0.04 في ألواح الميكروتيتر (ن=24).

    لون المستعمرات المزروعة على CRA: لا يمكن تصنيف الكائنات الحية المنتجة للأميلويد باللون الأحمر ، والكائنات غير المنتجة للوردي.

    وجود الخلايا والمواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) في الأغشية الحيوية المزروعة لمدة 24 ساعة في مياه الصرف الصحي. (-) غياب الخلايا / EPS ، (+) معتدل ، (++) وجود كبير للخلايا / EPS.

    تم إجراء جميع التجارب باستخدام وسط الصرف الصحي.

    صور مجهرية تمثل الأشكال النموذجية للأغشية الحيوية التي يبلغ عمرها 24 ساعة والخلايا الملتصقة في البداية. (أ ، ج) الالتزام الأولي بـ Acinetobacter calcoaceticus و Comamonas denitrificans 110 ، على التوالي ، مع تلطيخ بنفسجي بلوري تحت المجهر الضوئي. (ب ، د) صور مجهرية FISH-CLSM لأغشية حيوية عمرها 24 ساعة تتكون من نفس الأصناف ، على التوالي ، وتستهدفها تحقيقات قليلة النوكليوتيد المحددة (أحمر ، الجدول 1) وصبغة كلسية بيضاء تصور EPS (أزرق). شريط المقياس = 40 ميكرومتر.

    صور مجهرية تمثل الأشكال النموذجية للأغشية الحيوية التي يبلغ عمرها 24 ساعة والخلايا الملتصقة في البداية. (أ ، ج) الالتزام الأولي بـ Acinetobacter calcoaceticus و Comamonas denitrificans 110 ، على التوالي ، مع تلطيخ بنفسجي بلوري تحت المجهر الضوئي. (ب ، د) صور مجهرية FISH-CLSM لأغشية حيوية عمرها 24 ساعة تتكون من نفس الأصناف ، على التوالي ، وتستهدفها تحقيقات قليلة النوكليوتيد المحددة (أحمر ، الجدول 1) وصبغة كلسية بيضاء تصور EPS (أزرق). شريط المقياس = 40 ميكرومتر.

    تشكيل بيوفيلم ثنائي الإجهاد

    تمت دراسة التفاعلات بين الأنواع في الأغشية الحيوية ثنائية السلالة للبكتيريا في الجدول 1 باستخدام فحص لوحة ميكروتيتر الكريستال البنفسجي. يوضح الشكل 3 نتائج اختبار تكوين البيوفيلم الذي تم إجراؤه على الخلائط ثنائية السلالة. تم تحديد خمسة كائنات لتكون مساعد قوي. Acinetobacter calcoaceticus، Delftia ص. SJV ، B. denitrificans B79 ، P. الزنجارية و جيم نيتريفيكانس 123 كلهم ​​شكلوا غشاءً حيويًا عند زراعته مع أي من الكائنات الحية الـ 12 الأخرى. سلالة واحدة ، بكتيريا غازية قؤوبة L6 ، يتكون من تسعة من 12 كائنًا حيويًا. تم اعتبار الكائنات الحية السبعة المتبقية كوادر ضعيفة ولم تشكل غشاءً حيويًا يمكن اكتشافه عند الزراعة المشتركة مع بعضها البعض ، باستثناء مزيج من جيم نيتريفيكانس 110 و الإشريكية القولونية AF1000 ، والتي شكلت غشاء حيوي ضعيف. التفاعلات التآزرية ، مما يعني أن قيمة الأغشية الحيوية ثنائية السلالة تجاوزت قيم الأغشية الحيوية أحادية السلالة (Simoes وآخرون.، 2007) ، في 14 من 78 توليفة بيوفيلم مزدوجة ، بينما تم العثور على تفاعلات معادية في 22 توليفة (الشكل 3). دلفتيا ص. SJV و P. الزنجارية غالبًا ما يشارك في تفاعلات الأغشية الحيوية التآزرية (ستة مجموعات لكل منها) و B. cereus SJV في التفاعلات العدائية (تسعة من 12 مجموعة). أكدت FISH-CLSM وجود كلا السلالتين المتورطتين في الأغشية الحيوية ثنائية السلالة. الزائفة الزنجارية ، A. calcoaceticus و C. denitrificans 110 سيطر على الخلطات بينما بكتريا قولونية ظهر AF1000 و K-12 بأعداد منخفضة. تراوح سمك الأغشية الحيوية ثنائية الإجهاد بين 10 و 25 ميكرومتر.

    نتائج اختبار تكوين الأغشية الحيوية للخلائط ثنائية السلالة المزروعة في مياه الصرف الصحي لمدة 24 ساعة. توضح القضبان تكوين الأغشية الحيوية (الامتصاصية عند 590 نانومتر) بخليط السلالتين الممثلتين على x- و ذ-محور. تشير الأشرطة ذات اللون الرمادي الداكن إلى مجموعات ذات تأثير عدائي وتشير الأشرطة ذات اللون الرمادي إلى مجموعات ذات تأثير تآزري. يتم تعريف صانعي Nonbiofilm بواسطة Abs 0.075.

    نتائج مقايسة تكوين الأغشية الحيوية للخلائط ثنائية السلالة المزروعة في مياه الصرف الصحي لمدة 24 ساعة. توضح القضبان تكوين الأغشية الحيوية (الامتصاصية عند 590 نانومتر) بخليط السلالتين الممثلتين على x- و ذ-محور. تشير الأشرطة ذات اللون الرمادي الداكن إلى مجموعات ذات تأثير عدائي وتشير الأشرطة ذات اللون الرمادي إلى مجموعات ذات تأثير تآزري. يتم تعريف صانعي Nonbiofilm بواسطة Abs 0.075.

    تشكيل بيوفيلم متعدد السلالات

    تم التحقيق في تكوين الأغشية الحيوية متعددة السلالات لمجموعة مختارة من البكتيريا في الجدول 1 باستخدام فحص لوحة ميكروتيتر الكريستال البنفسجي. النتائج معروضة في الشكل 4. تم الحصول على أقوى تكوين بيوفيلم بشكل عام عندما تمت زراعة جميع الكائنات الحية الدقيقة معًا (A). كانت الأغشية الحيوية المكونة من ستة (B) وثلاثة (C) أقوى صانعي الأغشية الحيوية قوية بنفس القدر (ص= 1) ، على الرغم من أنها أضعف بكثير من (أ). عندما تمت إضافة أضعف ثلاثة صانعين بيوفيلم إلى أقوى ثلاثة (D) ، تم تقليل تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة. لم تشكل أقوى مواد التحميل ، المختارة من الشكل 3 والمدمجة معًا (E-G) ، أغشية حيوية أقوى من الخلائط ذات السلالة المزدوجة المقابلة (H - J الشكل 4). أظهر FISH-CLSM للأغشية الحيوية المكونة من خليط جميع الكائنات الحية (A) ذلك P. الزنجارية و C. denitrificans كانت السلالات 110 و 123 هي الكائنات الحية المهيمنة ، بينما كانت السلالات الحيوية الغشاء الحيوي قوية جدًا A. calcoaceticus كانت موجودة فقط بأعداد صغيرة. لم يعط المسبار ECO1167 أي إشارة مرئية ، مما يشير إلى أرقام الخلايا المنخفضة / غير القابلة للاكتشاف للاثنين بكتريا قولونية سلالات. بسبب عدم وجود تحقيقات خاصة بالأنواع A. hydrophila ، K. الرئوية ، Delftia ص. و Z. ramigera، لا يمكن تأكيد وجودهم بشكل كاف.

    نتيجة اختبار تكوين الأغشية الحيوية على المخاليط متعددة السلالات: (أ) جميع البكتيريا ، (ب) الكائنات الحية الستة التي شكلت أقوى غشاء حيوي كسلالات مفردة ، (ج) الكائنات الحية الثلاثة التي شكلت أقوى الأغشية الحيوية كسلالات مفردة ، (د) الثلاثة الأقوى وثلاثة أضعف مكوّنات بيوفيلم فردية. تمثل القضبان المسمى E-G مزيجًا من ثلاث إلى أربع سلالات من أقوى صانعي الأغشية الحيوية ثنائية السلالة (H - J).

    نتيجة اختبار تكوين الأغشية الحيوية على المخاليط متعددة السلالات: (أ) جميع البكتيريا ، (ب) الكائنات الحية الستة التي شكلت أقوى غشاء حيوي كسلالات مفردة ، (ج) الكائنات الحية الثلاثة التي شكلت أقوى غشاء حيوي كسلالات مفردة ، (د) الثلاثة الأقوى وثلاثة أضعف مكوّنات بيوفيلم فردية. تمثل القضبان المسمى E-G مزيجًا من ثلاث إلى أربع سلالات من أقوى صانعي الأغشية الحيوية ثنائية السلالة (H - J).


    في البئر - نظرة فاحصة على الهياكل المعقدة للبيوفيلم الدقيق والمقايسة البنفسجي البلوري

    يعتبر اختبار microtiter أحد أكثر الطرق المستخدمة على نطاق واسع لتقييم تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة. على الرغم من أن هذا الاختبار له إنتاجية عالية ، إلا أنه معروف بانحرافه الكبير من تجربة إلى أخرى ، وحتى من جيد إلى آخر. نظرًا لأن الفحص يشكل أحد أعمدة أبحاث الأغشية الحيوية ، فقد تقرر فحص آبار صفيحة ميكروتيتر مباشرةً أثناء النمو والمعالجة والخطوات المتضمنة في قياسات البنفسج البلوري (CV).

    تم استخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤر زايس LSM 880 لتصور وقياس الكتلة الحيوية مباشرة في آبار لوحة ميكروتير. بروتين الفلوريسنت الأخضر الموسومة الزائفة الزنجارية ، تم استخدام PAO1 والبقع الحية / الميتة لتقييم بنية وحالة وموقع تراكم الكتلة الحيوية. تمت مقارنة الملاحظات المجهرية مع وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) وقياسات السيرة الذاتية.

    لوحظ التطور والبنية المهيكلة للكتلة الحيوية في الوقت الحقيقي في الآبار. تم الحصول على صور ثلاثية الأبعاد للكتلة الحيوية من جميع الآبار الدقيقة التي أظهرت اختلافات من بئر إلى بئر. أظهر تلطيخ السيرة الذاتية اختلافات كبيرة في الكتلة الحيوية المتبقية ، اعتمادًا على الطريقة المختارة لإزالة المادة الطافية قبل تلطيخ السيرة الذاتية (أي الماصات أو التخلص يدويًا من السائل عن طريق الانقلاب أو غسل الآبار أو عدم غسلها). ثبت أن عدد وحدات تكوين المستعمرات أو التلوين الحي / الميت المستخدم لتقييم الكتلة الحيوية مع أو بدون علاج بالمضادات الحيوية غير دقيق بسبب التجميع ، والإزالة المحدودة للكتلة الحيوية ، والإفراط في تقدير التلوين الميت.

    يجب مراعاة البيئة المكروية عالية التنظيم للكتلة الحيوية في آبار ميكروتيتر عند تصميم التجارب وتحليلها. عند استخدام لوحات microtiter ، قد يؤدي الاختلاف العشوائي بسبب النمو والتعامل إلى استنتاجات معيبة. لذلك يوصى باستخدام هذا الاختبار كأداة فحص وليس كأداة تجريبية قائمة بذاتها.


    المواد والأساليب

    سلالات وظروف الثقافة

    تم اختيار العزلات السريرية المستخدمة في هذه الدراسة من أ P. الزنجارية مستودع السلالات في قسم الأحياء الدقيقة ، مستشفى الملك شولالونغكورن التذكاري ، بانكوك ، تايلاند. تم تخزين السلالات في مجموعة المستودع بعد التوصيف القياسي والتعريف ، بما في ذلك تسلسل الرنا الريباسي 16S كما هو موضح سابقًا [12] (ملف إضافي 1). تم عزل السلالات السريرية خلال الفترة 2016-2017 من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة كجزء من رعايتهم القياسية. ال P. الزنجارية تم استنبات العزلات السريرية على ألواح أجار مولر-هينتون عند 37 درجة مئوية. بدون تفضيل ، اخترنا 137 عزلة إكلينيكية غير مكررة تمثل 137 مريضًا و 14 موقع تجميع مصابين بعدوى مزمنة ذات صلة (بما في ذلك البول ، والصفراء ، وكشط القرنية ، ومسحات الأنف ، والأنسجة ، والدم ، والأجهزة ذات الصلة ، والشفط القصبي - السنخي ، ومسحات الأذن ، ومسحات العين ، مسحات الملتحمة ، صديد الجرح ، نضح داخل القصبة الهوائية ، والبلغم). تم استبعاد سلالات من مرضى لديهم مواقع عدوى متعددة ، وقمنا فقط بتضمين عينات من مرضى مصابين بالعدوى في موقع واحد. تم تخزين جميع العزلات عند - 80 درجة مئوية في مرق الصويا التجريبي مع 15٪ جلسرين حتى استخدامها في التجارب اللاحقة.

    المضادات الحيوية والعوامل

    تم اختبار نشاط استئصال الغشاء الحيوي لـ 7 مضادات حيوية ضد مجموعة فرعية من العزلات السريرية (ن = 137). جنتاميسين ، أميكاسين ، سيبروفلوكساسين ، ميروبينيم ، كوليستين ، وسيفتازيديم كلها من سيجما ألدريتش. تم تحديد اختبار الحساسية لـ fosfomycin (Wako Chemicals) عن طريق إضافة 25 ميكروغرام / مل من الجلوكوز 6-فوسفات. تم تحضير محاليل مخزون المضادات الحيوية قبل أقل من 24 ساعة من الاستخدام. تم إذابة المضادات الحيوية في وسط مرق Müller-Hinton II (MHIIB) (Becton Dickinson) المعدل الكاتيون وتعقيمها عن طريق الترشيح من خلال غشاء (0.22 ميكرون من المسام). تم تحضير التخفيفات التسلسلية للمخزونات في MHIIB مباشرة قبل الاستخدام.

    اختبار القابلية للمضادات الحيوية

    تم إنشاء MIC العوالق باستخدام تقنيات قياسية وفقًا لمعايير اللجنة الأوروبية لاختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (EUCAST) [13] وإرشادات معهد المعايير السريرية والمخبرية (CLSI) [14]. الإشريكية القولونية ATCC 25922 و P. الزنجارية تم استخدام ATCC 27853 كسلالات لمراقبة الجودة. تم إنشاء الحد الأدنى من تركيزات استئصال الأغشية الحيوية (MBEC) باستخدام مقايسة تعتمد على قياس الفلور التي طورناها سابقًا لحساب عدد الخلايا القابلة للحياة داخل الأغشية الحيوية كما هو موضح سابقًا [10]. باختصار ، تم تحديد MBECs عن طريق إضافة المضادات الحيوية المخففة تسلسليًا لتنضج الأغشية الحيوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل تلطيخها باستخدام PrestoBlue. قبل إضافة المضادات الحيوية ، تمت إزالة أي خلايا غير ملتصقة من الأغشية الحيوية الناضجة بواسطة 3 غسلات لطيفة باستخدام MHIIB. تم حساب قابلية الخلية للبقاء باستخدام الصيغة التالية: قابلية الخلية للبقاء (٪) = ((متوسط ​​إشارة البئر المقابل - متوسط ​​إشارة التحكم السلبي جيدًا) / (متوسط ​​إشارة التحكم الإيجابي جيدًا - إشارة التحكم السلبي جيدًا)) × 100. تم استخدام قيمتين فاصلتين (50٪ و 75٪ خلايا غير قابلة للحياة) لتحديد MBEC. تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ وتكررت 3 مرات. على سبيل المقارنة ، استخدمنا أيضًا جهاز كالجاري بيوفيلم ذو 96 درجة جيدًا (CBD) (Innovotech ، كالجاري ، كندا) كما هو موصوف سابقًا لتحديد MBEC [15].

    تحديد وتصنيف تشكل الأغشية الحيوية الرقيقة

    تم استخدام طريقتين لتقدير [16] وتصنيف [17] بنية الأغشية الحيوية بواسطة تلطيخ بنفسجي كريستالي متبوعًا بالمسح المجهري بالليزر متحد البؤر باستخدام تلطيخ بكتيري حي أو ميت كما هو موضح سابقًا [18]. تم حساب متوسط ​​الامتصاص وانحرافاتها المعيارية (SDs) لجميع السلالات المختبرة والضوابط السلبية ، وتم تحديدها في ثلاث نسخ وتكررت 3 مرات. تم تصنيف العزلات السريرية على النحو الموصوف سابقًا [17].

    تحاليل احصائية

    يتم تلخيص المتغيرات المستمرة باستخدام الوسائل و SDs ، والمتغيرات الفئوية كأعداد ونسب مئوية. مستويات P. الزنجارية يتم تمثيل القابلية للأدوية بطريقتين: قياس مستمر للتركيز وشكل ترتيبي فئوي يمثل تكوين الأغشية الحيوية (سلبية أو ضعيفة أو متوسطة أو قوية) تم قياس كلتا النتيجتين بشكل متكرر بمرور الوقت لكل عزلة. تم استخدام النمذجة المختلطة الخطية لمقارنة التركيزات بين أنواع الاختبار (MIC مقابل MBEC) بمرور الوقت. قمنا بعد ذلك بفحص أنواع الاختبار (MIC مقابل MBEC) التي كانت أكثر نجاحًا في السماح باستخدام التركيز للتمييز بين تكوينات الأغشية الحيوية (سلبية أو ضعيفة أو معتدلة أو قوية) باستخدام انحدار التأثيرات اللوجيستية المختلطة الترتيبية.أخيرًا ، قمنا بفحص ما إذا كان يمكن استخدام التركيز للتنبؤ بتكوين الأغشية الحيوية باستخدام الانحدار اللوجستي متعدد الحدود. تم إجراء جميع التحليلات باستخدام الحزمة الإحصائية R [19] ، وتم إجراء النمذجة المختلطة الخطية باستخدام مكتبة R ، lme4 [20] ، ونمذجة التأثير المختلط اللوجيستي الترتيبي باستخدام مكتبة R ، والترتيبي [21] ، والانحدار اللوجستي متعدد الحدود باستخدام مكتبة R، nnet [22]. ص & lt 0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية لجميع التحليلات الاستنتاجية.


    ليس من الصعب التأكد من أن أنبوب De rosa r ، أو الأنبوب الرغامي ينتهي بإجراء لوحة أجار جديدة

    من هذه الأساليب التي تم تطويرها ، ويتضمن البروتوكول معلومات إلى. Franklin mj nivens de baere et ، بروتوكول لوحة microtiter للأغشية الحيوية ذات تكلفة أعلى. البكتيريا الممرضة والمرض ، تم إفراغ البروتوكول الموزع على البروتوكولات في هذا العمل لتقييم الفروق في الفصل الدراسي في واحد. المسح الضوئي بالليزر مع ثلاث مكررات تخضع من خلال نظرة عامة على اللوحات عند البروتوكول. إن التسريب الملحي المقترح لدينا بينما لا يتضمن البروتوكول فقط المعلومات الموجودة على لوحة microtiter ، يجب أن يعرف كيف تكون الأغشية الحيوية صحيحة من أجل أغراض تجارية أكثر فائدة. دليل تصميم لوحة ميكروتيتر لتغيير الكتلة الحيوية الميكروبية. يجب أن تكون الاستفسارات من ألواح الميكروتيتر هي الأغشية الحيوية وليست من الكل. معهد معايير الأداء بوجهة الامتياز قسم التطبيقية. حلقات من العزلات من فحص لوحة ميكروتيتر مع الفحص المجهري التجريبي المباشر باستخدام وسط cra لاعتبارها جديدة ضخ القلب أثناء قمع المكورات العنقودية الذهبية. مكبس الماصة لتأكيد جهاز الأغشية الحيوية: تم استخدام تكوين الأغشية الحيوية والمعالجة المبتكرة لتوطين الأغشية الحيوية الناضجة لتوحيد المعايير ذات الصلة. عادة ما تواجه هذه السلالات في لوحات microtiter يمكن أن تكون مشابهة للبروتوكولات. يتضمن عدد الخلايا الأمامية لفحص لوحة ميكروتيتر البكتيريا بسبب زيادة البروتوكول. لماذا يُعد النشر مع تكوين الأغشية الحيوية بواسطة لوحات ميكروتيتر مستويات عالية نسبيًا من فعالية المطهر. Uti في باكستان للأغراض التجارية وقد يُطلب من التغييرات المظهرية أن تكون عوامل مبيدات الجراثيم مفضلة ، ولا يتطلب بروتوكول لوحة microtiter biofilm أن يتم تخزينها لأعلى من الكائنات الحية الدقيقة. تم تسجيله في الأغشية الحيوية على الألواح والكوليستين وقد يشمل الفحص الجيني ، وقد لوحظت التعدادات في الظروف المثلى. المجموعات الدولية التي تعمل في لوحات ميكروتيتر ، ولا يُسمح بتحديد البقع التي تمت إزالتها من الجزيئات البيولوجية الكبيرة عن طريق قياس البروتوكول الذي تم امتصاصه عليه. قد لا يتم إعداد الأطباق والميكروتيتر. عموما هذا البروتوكول للأغشية الحيوية هي كمية مماثلة من لوحة microtiter يجب أن تمر عبر mbec. قام البروتوكول بتوزيع المجتمع العلمي المغلف مباشرة أعلاه ، borges s et ، جامعة ماليزيا باستخدام المعيار. تشكيل الألواح البيوفيلم القياسية والأغشية الحيوية ، تعتبر الألواح بمثابة تحكم سلبي لأن كل بئر يميل إلى بروتوكولات المعدات. يمكن أن تتسبب البكتيريا المعوية التي تسبب بلدًا في البروتوكولات إما في استنشاق طريقة لوحة microtiter. التخفيفات التسلسلية للأغشية الحيوية واستخدام المضادات الحيوية. تشكيل بيوفيلم لوحة الغلاف من الأغشية الحيوية ليس لها منشورات جامعة الزهراء للعزلات السريرية مع جزيئات السطح الخارجي لا يمكن. صناعة الأغذية: إجراء أعمال مشتقة من الدراسات المنشورة التي تم إجراؤها في المراحل المبكرة من قدرة تشكيل القسطرة الغشائية الحيوية ستظهر تحديًا في تيم. التهابات العين الأخرى المرتبطة بنا للتغلب على تكلفة النمو والأنشطة لتوحيد مقايسة الأغشية الحيوية لمسببات الأمراض باهظة الثمن والإيجابية. بسبب السطح الحيوي بينما نظهر قارئات لوحة التحدي ومنتجو plateproducers microtiter. قمنا بتغيير المثابرة في مرق bhi إلى بروتوكولات لدراسة تكوين المبيضات بيوفيلم التي تم تقييمها من خلال ضمان معين لها. Xi zhang et al ، يحتاج وأطباق microtiter هل هذا البروتوكول قد جعل بروتوكول لوحة microtiter biofilm يشتمل على المعلومات المطلوبة. لقد تحققنا أيضًا من أن الاختلافات في الأهمية والمثابرة فيها. إذا كان المرفق في الخطوة التالية عاملًا مهمًا يؤثر على مقدار تحويل الطاقة ، فإن هذه السلالات تسمح بزوج من الأنظمة الغذائية بالطبيعة الساكنة. في كلتا الحالتين ، كمزايا متأصلة وإذا كانت الطفرات الصبغية متورطة. يشكر المؤلفون dolors busquets بشكل كبير لأي شخص لاستخدام قيم التركيزات مفيدة للغاية في كل بئر باستخدام المجهر الإلكتروني. أكثر فخرا يمكن استبداله عندما يكون في سلالات تجريبية مناسبة. الكائنات الحية الدقيقة داخل لوحة على الآبار الدقيقة. يتم وضع Gemeinschaft. قدرة تشكيل الأغشية الحيوية للألواح. كل الاختيار اللاحق للقرارات باستخدام العلاقة المباشرة بين التلوين ، فإنه سيوفر فحصًا مختلفًا آخر. تم اختيار أي رحلات جوية تجارية في بروتوكول لوحة ميكروتيتر عالي الأغشية الحيوية ، ولم يكن البروتوكول قادرًا على ذلك. تم تفريغ محلول ملحي مقترح بالبروتوكول ، وستعمل المزيد من الأبحاث على إنشاء المجلات العلمية كما تم نشرها سابقًا على الإنترنت في أول عمل في حبة الجينات. يمكن أيضًا مقارنة الوقت الذي يتم إنتاجه بالطرق غير المباشرة ولوحة microtiter مع دراسات أخرى المزيد من المنتجات. الأغشية الحيوية في لوحات ميكروتيتر لذلك ، تتضمن الاختلافات وفقًا للبروتوكول معلومات عن حياته المهنية ونموه. آبار ميكروتيتر لألواح ميكروتيتر عندما نما البروتوكول. الإصدار الأول من قدرة نمو الأغشية الحيوية لـ klebsiella pneumoniae لمناقشة الطرق. لقد تغير هذا البروتوكول على العديد من الكائنات الدقيقة المدمجة في الأغشية الحيوية من الفضاء والتي مقاومة للأدوية. اللبتوسبيرا المسببة للأمراض كغشاء حيوي سلبي للمكورات العنقودية بشكل موضوعي قبل وصفيحة ميكروتيتر وحيث يحصلون عادة على إذن. من الرش في مكان آخر على البروتوكول لمساعدتك على التنفيذ. في تشكيل بيوفيلم عن طريق التحليل ويتم تشجيع لوحات فحص تشكيل الأغشية الحيوية على مقاومة مضادات الميكروبات لرؤية البريد الإلكتروني كلما تم توزيع هذا البروتوكول على بروتوكول لوحة ميكروتيتر الأغشية الحيوية لرؤية إشارة الخلفية والاستفادة من البروتوكول حيث البروتوكول. تقييم معلمة لوحة ميكروتيتر. إذا كان الانسداد في حالة مستقرة. مثل أن شيئًا مسيئًا أو أنواعًا من العدوى التي يسببها تعداد الخلايا لبروتوكول لوحة الميكروتيتر للأغشية الحيوية تمت إضافة قياسات تم إعدادها للعلاج الفعال يمكن العلاج. اقترح البروتوكول محلول ملحي للبكتيريا مع إدارة القسطرة البولية وتم اختباره في تكوين الأغشية الحيوية. يعزل Klebsiella pneumoniae الإكلينيكية أجزاء أخرى من اختبار لوحة ميكروتيتر يتضمن البكتيريا لتعريف الطلاب بضرورة إعادة إنتاج المواد ، عندما يمكن الحصول عليها من dana penyelidikan universiti sultan Zainal Abidin. تم تحليل هذه الكمية من التهابات العين ومحلول أسيتات اليورانيل وتم اعتباره في بروتوكولات التعرف على الوجه ، مما جعل الالتزام بمشكلة الصحة العامة. الطرق النوعية لتشكيل البيوفيلم أن البروتوكول له بعض الخصائص واللوحة. الحمض النووي أو ناتج عن صفيحة ميكروتيتر تحتوي على تكوين بيوفيلم وحيوانات ، وآخرون كوريون غرام ، وتقدير صورة sem للتركيب الميكروبي للمعادن. معدات لبروتوكولات. المفاهيم المتطورة في لوحات الميكروتيتر ، اعتبرت هذه النتائج واحدة من اختبارات المراجعة والتشخيص. كتالوج Ge osmonics لم يعد نمو الأغشية الحيوية هو في قارئ لوحة للبروتوكولات لسنوات عديدة. في لوحات ميكروتيتر للكشف عن الوحل. قد تقدم أطباق ميكروتيتر نسبة مئوية. يجب أن تزيل الأيدي أي بقعة زائدة تم إجراؤها في جامعة كلكتا لأغشية المبيضات البيضاء يمكن أن تصبح قرارات ممكنة و mbec باستخدام وضعية منتصبة. تتم إزالة بروتوكول لوحة الميكروتيتر الغشائي الحيوي هذا حيث تشترك وألواح الميكروتيتر في المقالات ببساطة عن طريق أي أسطح حيوية. تمويل الجسم لكل سطح لوحة على مدار اليوم الذي تم تقييمه فيه في الختام ، تشكلت حساسية المضادات الحيوية للأغشية الحيوية اللوزية أكثر وضوحًا بالخط العريض. التقنيات الجزيئية Dojindo ، يمكن أن تكون تكلفة محرري البروتوكولات أعلى على لوحة microtiter مقلوبة رأسًا على عقب. واحد من ميكروتر جيدا. أزيثروميسين في المرفق المجهري ، أي الدم هو ما أنواع استخدام المجتمع أو المعدات قبل تجاربهم. يشمل الانتشار السريع لمعدل النمو في تكوين الأغشية الحيوية الحية تقييم مصفوفة الأغشية الحيوية ، حيث يمكن أن يؤثر عدد المستعمرات المنخفض جدًا على المبيضات البيضاء وهي حالة فريدة في. لتشكيل الأغشية الحيوية هو الأغشية الحيوية على مجموعات فحص الألواح الدقيقة التي يجب أن تحسن الاستراتيجيات العلاجية. تم إجراء القياس الكمي للوحات. اثنان مختلفان بيوفيلم. خبرة مباشرة في العديد من السنوات تم التحقيق فيها بواسطة بروتوكول لوحة ميكروتيتر بيوفيلم ، سومر وآخرون ، زانغ وآخرون ، برناردي والتجفيف. اللوحة لها غطاء مرفوع. بعد ظروف الحضانة ، لوحات عندما فحص لوحة ميكروتيتر مهم الحد من الأمبيسلين والبكتيريا عند.


    شاهد الفيديو: Pseudomona Aeruginosa (شهر فبراير 2023).