معلومة

أيهما يأتي أولاً ، PCR أم الهلام الكهربائي؟

أيهما يأتي أولاً ، PCR أم الهلام الكهربائي؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إذا كنت أرغب في اكتشاف ذبول مجموعة من المرضى لديهم جين سرطان غير طبيعي BCR-ABL ، كيف يمكنني الاستفادة من تقنيات PCR وتقنيات الترحيل الكهربائي الهلامي؟ لقد فقدت نوعًا ما محاولة تحديد أيهما يأتي أولاً وما هي الوظيفة الدقيقة لكل جهاز ، لقد قرأت عملية استنساخ الجينات بأكملها في كتاب علم الأحياء الخاص بي ولكني لم أستطع استيعابها لأنها معقدة للغاية.


يأتي PCR أولاً. إذا كان PCR يعمل بشكل صحيح ، فسيتم تضخيم منتج معين. لكن لا يمكنك رؤيته في أنبوب البلاستيك الصغير Eppendorf PCR. هذا هو سبب الرحلان الكهربائي. بعد تشغيل PCR ، تقوم بتشغيل المنتجات على هلام agarose لتصورها (بمساعدة بعض الصبغة الفلورية). جل الاغاروز هو فقط لمعرفة ما إذا كان تفاعل البوليميراز المتسلسل يعمل.


أول تفاعل البوليميراز المتسلسل والجيل في Biomakespace

اختتمنا مصطلح Michaelmas بجلستنا العملية الأولى في Biomakespace التي افتتحت حديثًا! كان هدفنا لهذا اليوم هو اختبار المرافق في Biomakespace من خلال تشغيل PCR متبوعًا بإجراء الفصل الكهربائي للحمض النووي - وكلاهما من تقنيات البيولوجيا الجزيئية المهمة جدًا.

PCR ، اختصارًا لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، هو تقنية مفيدة للغاية تمكننا من تضخيم منطقة معينة من جزيء قالب الحمض النووي بشكل كبير. النموذج الشائع الاستخدام هو الحمض النووي الجيني المستخرج من الأنسجة أو الخلايا ، ومع ذلك كنا نستخدم مجموعة مختارة من BioBricks متبقية من فرق Cambridge iGEM السابقة. تعد BioBricks مجموعة مختارة من "المكونات البيولوجية" المعيارية التي يتم إدخالها في جزيئات DNA دائرية أكبر تسمى البلازميدات. يتم توزيع BioBricks عادةً على شكل 2-3 نانوغرام عينات من الحمض النووي الجاف في 384 طبقًا بلاستيكيًا جيدًا والتي قمنا بحلها في الماء في اليوم.

نظرًا لأننا نخطط لاستخدام تجميع Gibson لبناء دوائر جينية حساسة للضوء في المدى التالي ، فقد أردنا عزل التسلسل الذي نحتاجه بشكل انتقائي عن بقية البلازميد وتخصيص النهايات. للقيام بذلك ، احتجنا إلى إضافة مواد أولية مختارة بعناية إلى عينات PCR. في الأسبوع الماضي (19/11/17) عقدنا اجتماعًا حيث ناقشنا بعض أساسيات اختيار البرايمر الجيد وصممنا مجموعة قليلة من البادئات التي من المتوقع أن تضخم التسلسلات التي أردناها - بفضل Jarrod Shilts لمساعدتنا في ذلك! الاشعال عبارة عن قطع صغيرة من الحمض النووي ، يبلغ طولها حوالي 20 نيوكليوتيد ، ويمكن طلبها حسب الطلب من شركات مختلفة. جاءنا على شكل كريات صغيرة من الحمض النووي المجفف في أنابيب قمنا بحلها وتخفيفها لتركيز العمل. كان لدينا بضع مجموعات من البادئات: مجموعة تهدف إلى الارتباط والتضخيم مباشرة من بداية ونهاية مناطق الترميز الخاصة بجينات BioBrick ، ​​ومجموعتان أخريان تم تضخيمهما من التسلسلات الشائعة المشتركة بين البلازميدات التي تم إدخال BioBricks فيها.

أثناء تشغيل PCR (على جهاز تدوير حراري قديم إلى حد ما) ، قمنا بإعداد الجل الذي كنا سنستخدمه لفصل وتصور أجزاء الحمض النووي التي كنا نأمل في توليدها. يعتمد الرحلان الكهربي للحمض النووي على حقيقة أن الحمض النووي مشحون سلبًا وبالتالي سينتقل من القطب السالب (القطب السالب) نحو القطب الموجب (القطب الموجب) عند وضعه في مجال كهربائي. يوفر الهلام بيئة تعمل على إبطاء قطع أكبر من الحمض النووي أكثر من الأصغر ، مما يعني أن الأصغر منها تهاجر بشكل أسرع وبالتالي ينفصل الحمض النووي حسب الحجم. عن طريق تحميل عينة علامة ، مع عدة قطع معروفة من الحمض النووي ، يمكن للمرء تقدير حجم الحمض النووي في ممرات الهلام الأخرى (مثل تلك التي تم تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل). كان علينا إجراء القليل من الأعمال اليدوية للحفاظ على الجل السائل في القالب أثناء ضبطه والذي يعمل مع القليل من التسرب فقط. قبل الصب مباشرة أضفنا صبغة تتألق عند ملامستها للحمض النووي. بعد تشغيل الجل ، مكنتنا هذه الصبغة من رؤية منتجات PCR الخاصة بنا على أنها عصابات ساطعة عندما كان الفلوروفور متحمسًا بواسطة مصباح الضوء الأزرق.

صورة الهلام ليست واضحة كما قد يرغب المرء (جزئيًا بسبب كاميرا الهاتف المراوغة!) ولكن هناك نطاقات واضحة جدًا تشير إلى أن معظم تقارير PCR الخاصة بنا كانت ناجحة! محتويات المسار: احتوت الممرات الخارجية على كل جانب على سلم محدد ، وتم تضخيم الممرات 2-7 باستخدام الاشعال مباشرة فوق مناطق ترميز الجينات (تم تصميمها الأسبوع الماضي) ، وكانت الممرات 8-13 عينات تم تضخيمها باستخدام بادئات البلازميد العامة المأخوذة من موقع مستودع BioBrick على الويب ، تم تضخيم الممرات 14-19 باستخدام بادئات بلازميد عامة مماثلة (تم تصميمها أيضًا الأسبوع الماضي).

عمل رائع لكل من ساعد في التصميم التمهيدي وساعد في العمل العملي! تشير النتائج إلى أن لدينا عدة مجموعات من البادئات والتي ستكون مفيدة كنقاط بداية لإنتاج بادئات متراكمة مطلوبة لإعداد تسلسلات لتجميع جيبسون. هناك عدد قليل من الممرات التي أسفرت عن نتائج غير متوقعة بالرغم من ذلك. على سبيل المثال ، الممران 13 و 19 ، اللذان يستخدمان نفس النموذج ، لا يعرضان نطاقات من أي من مجموعة التمهيدي العامة. على العكس من ذلك ، أظهر الممران 10 و 16 نطاقات تبدو أكبر قليلاً مما توقعنا. هذان شيئان قد يحتاجان إلى مزيد من التحقيق - شيء قد يكون لدى أحد مديري المشاريع لدينا وقت لقضاء الإجازة.

بفضل كل من حضر إلى أحداثنا واجتماعاتنا هذا المصطلح ، نتوقع أن تصبح الأمور أكثر إثارة بعد عطلة الشتاء حيث نحاول تجميع دوائرنا الحساسة للضوء وتشغيلها بكتريا قولونية بكتيريا! أخيرًا ، شكراً جزيلاً لكاتيا سميث-ليتيير وخاصة جيني مولوي لمساعدتنا في الأعمال الورقية والطلب وغير ذلك مما مكننا من النهوض والتشغيل في Biomakespace هذا المصطلح.


هلام الكهربائي

سيراجع محررونا ما قدمته ويحددون ما إذا كان ينبغي مراجعة المقالة أم لا.

هلام الكهربائي، أي من التقنيات العديدة المستخدمة لفصل جزيئات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين على أساس حجمها أو شحنتها الكهربائية. يحتوي الفصل الكهربائي للهلام على مجموعة متنوعة من التطبيقات ، على سبيل المثال ، يتم استخدامه في بصمة الحمض النووي والكشف عن المتغيرات الجينية والبروتينات المشاركة في الصحة والمرض وكذلك في الكشف عن الأحماض النووية والبروتينات وتنقيتها من أجل البحث. كما أنها تستخدم للمساعدة في الكشف عن مسببات الأمراض (الكائنات الحية المسببة للأمراض) التي قد تكون موجودة في الدم أو الأنسجة الأخرى أو في مصادر مثل الطعام. في كثير من الحالات ، يتم فحص الأحماض النووية أو البروتينات التي يتم اكتشافها وتنقيتها باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام عن طريق تسلسل الحمض النووي أو قياس الطيف الكتلي.

يتكون جهاز الرحلان الكهربي للهلام من مادة هلامية ، والتي غالبًا ما تكون مصنوعة من أجار أو بولي أكريلاميد ، وغرفة كهربي (عادةً صندوق أو خزان بلاستيكي صلب) مع كاثود (طرف سالب) في أحد طرفيه وأنود (طرف موجب) عند الطرف. نهاية المقابلة. يتم وضع الجل ، الذي يحتوي على سلسلة من الآبار في نهاية الكاثود ، داخل الحجرة ومغطى بمحلول عازل. ثم يتم تحميل العينات في الآبار باستخدام ماصة. الغرفة متصلة بمصدر طاقة ، عند تشغيله ، يطبق مجالًا كهربائيًا على المخزن المؤقت. يتسبب المجال الكهربائي في انتقال الجزيئات سالبة الشحنة عبر الهلام نحو القطب الموجب. (الحمض النووي والحمض النووي الريبي عبارة عن بروتينات سالبة الشحنة يجب معالجتها بمنظف لمنحها شحنة سالبة.) تتأثر حركة الجزيئات بمصفوفة الهلام المسامية بحيث تتحرك الجزيئات الأكبر والأثقل ببطء نسبيًا ، بينما تتحرك الجزيئات الأصغر والأخف وزناً بشكل أكبر. بسرعة. تؤثر كثافة المسام ونوع المادة المستخدمة في صنع الجل على معدل هجرة الجزيئات. غالبًا ما يتم تشغيل "سلم" مصبوغ ، أو علامة ذات جزيئات متعددة ذات أوزان جزيئية معروفة ومتغيرة ، جنبًا إلى جنب مع عينات تجريبية لتكون بمثابة مرجع للحجم. تتيح الصبغة تصور العلامة أثناء تحركها عبر عينات الهلام عادةً مصبوغة أيضًا من أجل التصور. غالبًا ما تُستخدم صبغة تُعرف باسم بروميد إيثيديوم ، والتي تتألق تحت الضوء فوق البنفسجي ، لتصور واضح لعينات الحمض النووي.


يمكن استخدام الرحلان الكهربائي الهلامي للعثور على الجينات المرتبطة بمرض ما

في هذه الحالة المحاكاة ، يبحث الباحثون عن شظايا الحمض النووي التي توجد فقط في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء.

يتم تقديم شظايا الحمض النووي هذه على شكل "عصابات" في نتائج الفصل الكهربائي (انظر الصورة).

إذا تم العثور على الشظايا فقط في الأشخاص المصابين بالمرض ، فهذا يشير إلى أن الأجزاء تحتوي على الحمض النووي من نوع جيني قد يعني أن الشخص أكثر عرضة للإصابة بالمرض.

تُظهر الصورة نتائج تحليل الحمض النووي من سبعة أشخاص مختلفين. يمثل الممر الأول (1) "سلمًا" يسمح لك بتحديد حجم أجزاء الحمض النووي التي تم فصلها.

تخيل أن الحمض النووي المحمّل في الآبار 2 و 3 و 4 و 5 يأتي من مرضى مصابين بالمرض ، والحمض النووي المحمّل في الآبار 6 و 7 و 8 و 9 يأتي من أشخاص غير مصابين بالمرض. هل يمكنك أن ترى أنه في ثلاثة من المرضى الأربعة المصابين بالمرض يوجد نطاق إضافي في النمط؟

الشخص المصاب بالحمض النووي المحمل في الممر 2 مصاب أيضًا بالمرض ، لكن النتائج لا تظهر نفس نمط النطاقات مثل الأشخاص الآخرين المصابين بالمرض. يشير هذا إلى أن أكثر من اختلاف جيني قد يرتبط بهذا المرض.


مساعدة في PCR والهلام الكهربائي. عدم الحصول على أي فرق - (سبتمبر / 07/2012)


يمكن لأي شخص أن يساعدني أو ينصحني. أنا طالب وكنت أحاول تضخيم cDNA المنتج من RNA دون جدوى لعدد من الأسابيع الآن من أجل إكمال تسلسل الجينات حيث لدي فجوة صغيرة لحوالي 40 نيوكليوتيد.
لقد أجريت عملية تخليق RT-PCR First Strand باستخدام Fermatas Revert Aid Firrst Strand cDNA Synthesis Kit وبعد 10 محاولات حصلت على فرقة باستخدام ما يلي:
12ul MyTaq
1ul 18s Forward Primer
1ul 18s عكس التمهيدي
1ul تتركز [كدنا]
9.5ul نوكلياز خالٍ من H2O

كان هذا للتحقق من إنتاج (كدنا) بالفعل.
ثم تم تصميم الاشعال من جانبي "الجزء المفقود" لحوالي 45 نيوكليوتيد.

لتضخيم الجين المعني (POR Gene) لقد جربت عدة أشياء.
في البداية استخدمت:
16.25ul نوكلياز حر H20
5ul العازلة
0.5ul dNTPs
1ul فود برايمر
1ul Rev Primer
قالب 1ul
إنزيم 0.25ul (Phusion Hotstart II)

كانت شروط PCR المستخدمة
دورة واحدة:
98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
39 دورة من:
98 درجة مئوية 10 ثوان
54 درجة مئوية 30 ثانية
72 درجة مئوية 30 ثانية
دورة واحدة:
72 درجة مئوية 5 دقائق

لقد حاولت الآن تغيير ما يلي:
التحول إلى إنزيم السرعة
PCR المصنف
خفض كمية الإنزيم إلى النصف
تقليل وقت التمديد
تغيير درجة حرارة التلدين من 54 درجة مئوية إلى 50 درجة مئوية وكذلك 45 درجة مئوية
إضافة المزيد من القالب
زيادة وقت التلدين إلى 60 ثانية

كل ما سبق لم ينتج عنه أي شرائط أو مسحات على الإطلاق ، أو أن منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لا يزال في الآبار بعد تشغيل الهلام.

أنا في حيرة من أمري الآن وسأقدر بعض النصائح.
آمل أن أكون قد أدرجت كل ما أحتاجه في هذا المنشور.

شكرا كثيرا مسبقا.

كيف تم تصميم البرايمر الخاص بك؟ أي شيء خاص عن القالب (GC عالية ، GC منخفضة ؟، الهيكل)؟

لدي بالفعل تسلسلين ، أحدهما هو الطرف 5 & # 39 للجين ، والآخر هو النهاية 3 & # 39. ومع ذلك ، هناك فجوة من حوالي 45 نيوكليوتيد في الوسط وهو ما أحاول تضخيمه. تم تصميم البادئات من هذه التسلسلات على جانبي الفجوة ، وهي بطول 20 نيوكليوتيد وليست غنية بشكل خاص بالـ GC.

هذه تبدو وكأنها مواد أولية معقولة تمامًا. كيف تعرف طول هذه الفجوة؟ هل أنت قادر على تضخيم المناطق المعروفة لجينك من نفس عينة النموذج؟
ربما تكون الفجوة عبارة عن intron بالفعل ، وقد قمت بتضخيم الحمض النووي الجيني بدلاً من cDNA.

أجرى بحثًا عن Blast وقارن التسلسل 2 من نفس العائلة ، باستخدام ClustalW2 وحصلت على فكرة عن طول الفجوة.

وهل يمكنك تضخيم الأجزاء التي لديك تسلسل لها من قالب cDNA الخاص بك؟
يمكنك تضخيم الحمض النووي الجيني باستخدام البادئين اللذين لديك. إذا حصلت على نتيجة قصيرة ، فسوف تغطي الفجوة. إذا حصلت على نتيجة طويلة ، فستعرف أن هناك intron. ما هو الهدف النهائي؟ هل تحاول صنع الجين؟ إذا كان الأمر كذلك ، فيمكنك على الأرجح استبدال أحد المتواليات المتجانسة التي وجدتها على ما يبدو بـ 9 aa المفقودة.

التسلسلات التي قدمتها إلينا بالفعل مع العديد من التسلسلات الأخرى من قسم أبحاث آخر وعندما أجرينا بحثًا بلاست عنهم جميعًا في قاعدة البيانات ، فإن التسلسلين اللذين لدينا هما التسلسل الذي ظهر باسم POR Gene ولكن هناك جزء صغير تسلسل مفقود بينهما.

لذا ، أوصي بمحاولة تضخيم التسلسلات التي تعرف بالفعل وجودها. هذا سوف يتحقق من أن cDNA الخاص بك (أو ربما الحمض النووي الجيني) موجود بالفعل وذات جودة كافية. سأحاول أيضًا تخفيف القالب الخاص بك.

لقد جربت بالفعل تخفيفات القالب ، لكنني سأحاول التسلسل الذي أعرفه بالفعل ، شكرًا لك


أيهما يأتي أولاً ، PCR أم الهلام الكهربائي؟ - مادة الاحياء

هل أنت متأكد؟

لا يمكن التراجع عن هذا الإجراء. سيؤدي هذا إلى حذف جميع الأسئلة التي تمت ممارستها بشكل دائم.

هل أنت متأكد؟

لا يمكن التراجع عن هذا الإجراء. سيؤدي هذا إلى حذف جميع الأسئلة التي تمت ممارستها بشكل دائم.

Agarose المستخرج من الأعشاب البحرية يستخدم في (AIPMT Pre. - 2011)
1. قياس الطيف الضوئي
2. زراعة الأنسجة
3. PCR
4. الرحلان الكهربائي للهلام

اضف ملاحظة

لفتح جميع الشروحات المكونة من 38 فصلاً ، يجب أن تكون مسجلاً في دورة MasterClass.

أود أن أعرف أكثر من ذلك

أي من التقنيات التالية جعلت من الممكن هندسة الكائنات الحية وراثيًا؟ (AIPMT Mains-2011)
1. تقنيات الحمض النووي المؤتلف
2. حيود الأشعة السينية
3. وسم أثقل النظائر
4. التهجين

اضف ملاحظة

لفتح جميع الشروحات المكونة من 38 فصلاً ، يجب أن تكون مسجلاً في دورة MasterClass.

أود أن أعرف أكثر من ذلك

من أجل التحول ، تتكون الجسيمات الدقيقة المغلفة بالحمض النووي المراد قصفها بمدفع الجينات من: (AIPMT Pre. 2012)
1. الفضة أو البلاتين
2. البلاتين أو الزنك
3. السيليكون أو البلاتين
4. الذهب أو التنغستن

اضف ملاحظة

لفتح جميع الشروحات المكونة من 38 فصلاً ، يجب أن تكون مسجلاً في دورة MasterClass.

أود أن أعرف أكثر من ذلك

ما هو بيان صحيح فيما يتعلق ببوليميراز الحمض النووي المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل (AIPMT Pre. 2012)
1. يتم استخدامه لربط الحمض النووي الذي تم إدخاله في الخلية المتلقية
2. إنه بمثابة علامة اختيار
3. عزله عن فيروس
4. يظل نشطًا عند درجة حرارة عالية

اضف ملاحظة

لفتح جميع الشروحات المكونة من 38 فصلاً ، يجب أن تكون مسجلاً في دورة MasterClass.

أود أن أعرف أكثر من ذلك

PCR وطول جزء التقييد تعدد الأشكال هما طريقتان لـ: (AIPMT Pre. 2012)
1. دراسة الانزيمات
2. التحول الجيني
3. تسلسل الحمض النووي
4. البصمات الوراثية

اضف ملاحظة

لفتح جميع الشروحات المكونة من 38 فصلاً ، يجب أن تكون مسجلاً في دورة MasterClass.

أود أن أعرف أكثر من ذلك

الشكل أدناه هو تمثيل تخطيطي لمتجه الإشريكية القولونية pBR 322. أي من الخيارات المعطاة يحدد بشكل صحيح مكوناته المعينة؟ (AIPMT قبل 2012)

1. ori - إنزيم التقييد الأصلي
2. الضغط الاسموزي المخفض بالحبال
3. Hind III ، EcoRI - علامات مختارة
4. amp R، tet R - جينات مقاومة المضادات الحيوية

اضف ملاحظة

لفتح جميع الشروحات المكونة من 38 فصلاً ، يجب أن تكون مسجلاً في دورة MasterClass.

أود أن أعرف أكثر من ذلك

يوضح الشكل أدناه ثلاث خطوات (أ ، ب ، ج) لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). حدد الخيار الذي يعطي & # x2018 تعريفًا صحيحًا مع ما يمثله؟ & # xA0 & # xA0 & # xA0 & # xA0 & # xA0 & # xA0 & # xA0 (AIPMT Mains. - 2012) & # xA0 & # xA0

خيارات:
1. B - تمسخ عند درجة حرارة حوالي 98 & # xB0C تفصل بين خيوط DNA.
2. أ - تمسخ عند درجة حرارة حوالي 50 & # xB0C
3. ج - التمدد في وجود بوليميراز DNA مستقر للحرارة
4. أ- التلدين بمجموعتين من البادئات


  • العلم من منظور شخصي واجتماعي ، معيار المحتوى "و" "يمكن منع العديد من الأمراض أو السيطرة عليها أو علاجها من خلال المعرفة المكتسبة من العلم."
  • معيار المحتوى أ: "كنتيجة للأنشطة في الصفوف من 9 إلى 12 ، يجب على جميع الطلاب تطوير القدرات اللازمة لإجراء البحث العلمي والتفاهم حول الاستفسار العلمي"
  • معيار المحتوى هـ: "نتيجة للأنشطة في الصفوف من 9 إلى 12 ، يجب على جميع الطلاب تطوير قدرات التصميم التكنولوجي والتفاهم حول العلوم والتكنولوجيا"
  • دورة دراسية قياسية في شمال كارولينا في علم الأحياء ، الهدف 1
  • دورة دراسية قياسية في شمال كارولينا في علم الأحياء ، الهدف 3.04
  • دورة دراسية قياسية في شمال كارولينا في علم الأحياء ، الهدف 4.03

NanoArmoring من الإنزيمات: التصميم العقلاني للإنزيمات المغلفة بالبوليمر

كاترينا إم ريكاردي ،. شالا في كومار ، في طرق علم الإنزيمات ، 2017

3.1 اقتران الإنزيم إلى PAA والتوصيف بواسطة Agarose Gel Electrophoresis

تم إجراء الرحلان الكهربائي للهلام Agarose للتحقق من الاقتران الكامل للإنزيمات مع PAA في المحلول (الشكل 1 أ). أظهر GOx-HRP-PAA (المسار 3) النانوي التنقل زيادة في الحركة الكهربية نحو القطب الموجب بالمقارنة مع عناصر تحكم GOx / HRP (المسار 1) و GOx / HRP / PAA (المسار 2). ترجع الشحنة السالبة المتزايدة إلى الارتباط التساهمي للإنزيم (NH2 المجموعات) إلى PAA سالبة الشحنة (مجموعات COOH) ، مما يشير أيضًا إلى عدم بقاء أي إنزيم غير مقترن بعد اكتمال تفاعل EDC (المخطط 3). عادةً ما يكون تفاعل EDC مكتملًا بنسبة 40٪ إلى 50٪ ، لكننا حققنا اقترانًا كاملاً بسبب النسبة المثلى المحتملة للإنزيمات إلى البوليمر وتركيز EDC العالي والشروط المتبعة. سبب آخر هو أنه من المتوقع أن يكون التشابك نفسه فعالاً لأنه لا يحتاج 100٪ من الكربوكسيل أو مجموعات الأمين المتاحة للتفاعل. يجب أن يتفاعل جزء كبير مع المكونات المتشابكة بشكل آمن في المصفوفة الليفية. وبالتالي ، هناك هامش خطأ كبير مسموح به في مدى التشابك المطلوب للتشابك الكامل للمكونات.

رسم بياني 1 . (أ) هلام Agarose لمتقارن GOx-HRP-PAA في محلول (المسار 3 ، نسبة التركيز 16: 3: 10000 ميكرومترم GOx: HRP: PAA) ، الضوابط المقابلة لـ GOx / HRP (المسار 1 ، خليط بسيط في محلول بنسبة تركيز 16: 3 μم GOx: HRP) والمزيج الفيزيائي GOx / HRP / PAA في محلول قبل معالجة EDC (المسار 2). (ب) يُظهر SDS-PAGE لاتحاد GOx-HRP-PAA (المسار 4) زيادة الوزن الجزيئي مقارنةً بعناصر التحكم المقابلة لـ GOx / HRP (المسار 2) و GOx / HRP / PAA المخاليط الفيزيائية (المسار 3). تظهر علامات الوزن الجزيئي القياسية (الممرات 1 و 5).

مستنسخ من Riccardi ، C.M ، Mistri ، D. ، Hart ، O. ، Anuganti ، M. ، Lin ، Y. ، Kasi ، R.M ، & ampamp Kumar ، C.V (2016). التشابك التساهمي بين الجلوكوز أوكسيديز والبيروكسيديز في فراغات الورق: إنزيم - بوليمر "شبكات العنكبوت". الاتصالات الكيميائية ، 52, 2593–2596.

مخطط 3. يتم تحفيز التفاعل الكيميائي بين مجموعات الأمين والكربوكسيل بواسطة EDC.

تحضير هلام الاغاروز (0.125 جم [اغروس)) عن طريق تسخين محلول من [اغروس) في الميكروويف (0.5٪ ، وزن / حجم) في محلول تريس-أسيتات (40 م)م، درجة الحموضة 7.0 ، 25 مل) لمدة دقيقة واحدة على الإعداد العالي. بعد التسخين في الميكروويف ، يجب أن يكون الاغاروز قد ذاب.

اترك الاغاروز للعلاج في قالب الهلام لمدة 30 دقيقة.

في غضون ذلك ، تحضير العينات عن طريق خلط 5-6 ميكرومترم مع المخزن المؤقت للتحميل (10 ميكرولتر ، 50٪ (حجم / حجم) جلسرين ، و 0.1٪ (وزن / حجم) أزرق بروموفينول).

تحميل 15 ميكرولتر من العينة في كل بئر. بمجرد تحميلها ، قم بتشغيل هلام الاغاروز عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة.

صبغ الجل باللون الأزرق اللامع R250 (0.1٪ ، وزن / حجم) لمدة 4 ساعات ، ثم قم بإزالة الجل بحمض الأسيتيك (10٪ ، حجم / حجم) طوال الليل.


10.1 الاستنساخ والهندسة الوراثية

التكنولوجيا الحيوية هي استخدام الأساليب الاصطناعية لتعديل المادة الوراثية للكائنات الحية أو الخلايا لإنتاج مركبات جديدة أو لأداء وظائف جديدة. تم استخدام التكنولوجيا الحيوية لتحسين الثروة الحيوانية والمحاصيل منذ بداية الزراعة من خلال التربية الانتقائية. منذ اكتشاف بنية الحمض النووي في عام 1953 ، وخاصة منذ تطوير أدوات وطرق معالجة الحمض النووي في السبعينيات ، أصبحت التكنولوجيا الحيوية مرادفة لمعالجة الحمض النووي للكائنات على المستوى الجزيئي. التطبيقات الأولية لهذه التكنولوجيا في الطب (لإنتاج اللقاحات والمضادات الحيوية) وفي الزراعة (من أجل التعديل الوراثي للمحاصيل). للتكنولوجيا الحيوية أيضًا العديد من التطبيقات الصناعية ، مثل التخمير ومعالجة الانسكابات النفطية وإنتاج الوقود الحيوي ، بالإضافة إلى العديد من التطبيقات المنزلية مثل استخدام الإنزيمات في منظفات الغسيل.

التلاعب بالمواد الجينية

لإنجاز التطبيقات الموضحة أعلاه ، يجب أن يكون علماء التكنولوجيا الحيوية قادرين على استخراج الأحماض النووية ومعالجتها وتحليلها.

مراجعة بنية الحمض النووي

لفهم التقنيات الأساسية المستخدمة للعمل مع الأحماض النووية ، تذكر أن الأحماض النووية عبارة عن جزيئات كبيرة مكونة من النيوكليوتيدات (سكر ، فوسفات ، وقاعدة نيتروجينية). كل مجموعات الفوسفات في هذه الجزيئات لها شحنة سالبة صافية. مجموعة كاملة من جزيئات الحمض النووي في نواة الكائنات حقيقية النواة تسمى الجينوم. يحتوي الحمض النووي على خيطين متكاملين مرتبطين بروابط هيدروجينية بين القواعد المزدوجة.

على عكس الحمض النووي في الخلايا حقيقية النواة ، تترك جزيئات الحمض النووي الريبي النواة. يتم تحليل Messenger RNA (mRNA) بشكل متكرر لأنه يمثل جينات ترميز البروتين التي يتم التعبير عنها في الخلية.

عزل الأحماض النووية

لدراسة الأحماض النووية أو معالجتها ، يجب أولاً استخراج الحمض النووي من الخلايا. يتم استخدام تقنيات مختلفة لاستخراج أنواع مختلفة من الحمض النووي (الشكل 10.2). تتضمن معظم تقنيات استخراج الحمض النووي خطوات لفتح الخلية ، ثم استخدام التفاعلات الأنزيمية لتدمير جميع الجزيئات الكبيرة غير المرغوب فيها. يتم فتح الخلايا باستخدام محلول منظف يحتوي على مركبات التخزين المؤقت. لمنع التحلل والتلوث ، يتم تعطيل الجزيئات الكبيرة مثل البروتينات والحمض النووي الريبي باستخدام الإنزيمات. ثم يتم إخراج الحمض النووي من المحلول باستخدام الكحول. الحمض النووي الناتج ، لأنه يتكون من بوليمرات طويلة ، يشكل كتلة هلامية.

يتم دراسة الحمض النووي الريبي لفهم أنماط التعبير الجيني في الخلايا. الحمض النووي الريبي غير مستقر بشكل طبيعي لأن الإنزيمات التي تكسر الحمض النووي الريبي توجد عادة في الطبيعة. حتى أن بعضها تفرزها بشرتنا ويصعب للغاية تعطيلها. على غرار استخراج الحمض النووي ، يتضمن استخراج الحمض النووي الريبي استخدام العديد من المحاليل والإنزيمات لتعطيل الجزيئات الكبيرة الأخرى والحفاظ على الحمض النووي الريبي فقط.

هلام الكهربائي

نظرًا لأن الأحماض النووية عبارة عن أيونات سالبة الشحنة عند درجة حموضة محايدة أو قلوية في بيئة مائية ، فيمكن نقلها بواسطة مجال كهربائي. الرحلان الكهربائي للهلام هو تقنية تستخدم لفصل الجزيئات المشحونة على أساس الحجم والشحنة. يمكن فصل الأحماض النووية ككروموسومات كاملة أو أجزاء. يتم تحميل الأحماض النووية في فتحة في أحد طرفي مصفوفة هلامية ، ويتم تطبيق تيار كهربائي ، ويتم سحب الجزيئات سالبة الشحنة باتجاه الطرف المقابل للجيل (النهاية مع القطب الموجب). تتحرك الجزيئات الأصغر عبر المسام في الهلام أسرع من الجزيئات الأكبر ، وهذا الاختلاف في معدل الهجرة يفصل الأجزاء على أساس الحجم. الأحماض النووية في مصفوفة هلامية غير مرئية حتى يتم تلطيخها بمركب يسمح برؤيتها ، مثل الصبغة. تظهر شظايا مميزة من الأحماض النووية كعصابات على مسافات محددة من الجزء العلوي من الهلام (نهاية القطب السالب) التي تعتمد على حجمها (الشكل 10.3). يظهر خليط من شظايا متعددة بأحجام مختلفة على شكل مسحة طويلة ، في حين أن الحمض النووي الجينومي غير المقطوع عادة ما يكون أكبر من أن يمر عبر الهلام ويشكل نطاقًا كبيرًا واحدًا في الجزء العلوي من الجل.

تفاعل البلمرة المتسلسل

غالبًا ما يتطلب تحليل الحمض النووي التركيز على منطقة محددة أو أكثر من الجينوم. كما أنها تتضمن أيضًا مواقف لا تتوفر فيها سوى نسخة واحدة أو بضع نسخ من جزيء DNA لمزيد من التحليل. هذه الكميات غير كافية لمعظم الإجراءات ، مثل الرحلان الكهربائي للهلام. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو تقنية تستخدم لزيادة عدد نسخ مناطق معينة من الحمض النووي بسرعة لمزيد من التحليلات (الشكل 10.4). يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل شكلاً خاصًا من بوليميريز الحمض النووي ، وهو الإنزيم الذي يكرر الحمض النووي ، وتسلسلات نوكليوتيد قصيرة أخرى تسمى البادئات التي تتزاوج القاعدة مع جزء معين من الحمض النووي الذي يتم نسخه. يستخدم PCR لأغراض عديدة في المختبرات. وتشمل هذه: 1) تحديد مالك عينة الحمض النووي المتروكة في مسرح الجريمة 2) تحليل الأبوة 3) مقارنة كميات صغيرة من الحمض النووي القديم مع الكائنات الحية الحديثة و 4) تحديد تسلسل النيوكليوتيدات في منطقة معينة.

استنساخ

بشكل عام ، يعني الاستنساخ إنشاء نسخة متماثلة مثالية. عادةً ما تُستخدم الكلمة لوصف إنشاء نسخة متطابقة وراثيًا. في علم الأحياء ، يُشار إلى إعادة تكوين كائن كامل باسم "الاستنساخ التناسلي". قبل وقت طويل من محاولات استنساخ كائن حي بأكمله ، تعلم الباحثون كيفية نسخ امتدادات قصيرة من الحمض النووي - وهي عملية يشار إليها باسم الاستنساخ الجزيئي.

الاستنساخ الجزيئي

يسمح الاستنساخ بإنشاء نسخ متعددة من الجينات ، والتعبير عن الجينات ، ودراسة جينات معينة. للحصول على جزء من الحمض النووي في خلية بكتيرية بالشكل الذي سيتم نسخه أو التعبير عنه ، يتم إدخال الجزء أولاً في البلازميد. البلازميد (يسمى أيضًا ناقل في هذا السياق) هو جزيء DNA دائري صغير يتكاثر بشكل مستقل عن الحمض النووي الصبغي في البكتيريا. في الاستنساخ ، يمكن استخدام جزيئات البلازميد لتوفير "وسيلة" يتم فيها إدخال جزء DNA المطلوب. عادة ما يتم إعادة إدخال البلازميدات المعدلة في مضيف بكتيري لتكرارها. عندما تنقسم البكتيريا ، فإنها تنسخ الحمض النووي الخاص بها (بما في ذلك البلازميدات). يتم نسخ جزء الحمض النووي الذي تم إدخاله مع باقي الحمض النووي البكتيري. في الخلية البكتيرية ، يُشار إلى جزء الحمض النووي من الجينوم البشري (أو كائن حي آخر قيد الدراسة) على أنه دنا غريب لتمييزه عن الحمض النووي للبكتيريا (الحمض النووي المضيف).

تحدث البلازميدات بشكل طبيعي في التجمعات البكتيرية (مثل الإشريكية القولونية) ولها جينات يمكن أن تسهم في سمات مواتية للكائن الحي ، مثل مقاومة المضادات الحيوية (القدرة على عدم التأثر بالمضادات الحيوية). تم تصميم البلازميدات بشكل كبير كنواقل للاستنساخ الجزيئي وللإنتاج التالي على نطاق واسع للجزيئات المهمة ، مثل الأنسولين. السمة القيّمة لناقلات البلازميد هي السهولة التي يمكن بواسطتها إدخال جزء دنا غريب. تحتوي نواقل البلازميد هذه على العديد من متواليات الحمض النووي القصيرة التي يمكن قطعها باستخدام إنزيمات تقييد مختلفة متاحة بشكل شائع. تتعرف إنزيمات التقييد (وتسمى أيضًا نوكليازات التقييد) على تسلسلات معينة من الحمض النووي وتقطعها بطريقة يمكن التنبؤ بها تنتجها البكتيريا بشكل طبيعي كآلية دفاع ضد الحمض النووي الغريب. تقوم العديد من إنزيمات التقييد بعمل قطع متداخلة في خيطي الحمض النووي ، بحيث يكون للنهايات المقطوعة نتوء أحادي الجديلة من 2 إلى 4 نيوكليوتيدات. التسلسل الذي يتم التعرف عليه بواسطة إنزيم التقييد هو تسلسل من أربعة إلى ثمانية نيوكليوتيدات وهو متماثل. كما هو الحال مع كلمة متناظرة ، هذا يعني أن التسلسل يقرأ نفس الشيء للأمام وللخلف. في معظم الحالات ، يقرأ التسلسل نفس الشيء للأمام على خصلة واحدة وللخلف على الشريط التكميلي. عندما يتم إجراء قطع متداخلة في تسلسل مثل هذا ، فإن الأجزاء المتدلية تكون مكملة (الشكل 10.5).

نظرًا لأن هذه الأجزاء المتراكمة قادرة على العودة معًا عن طريق الرابطة الهيدروجينية مع الأجزاء المتدلية التكميلية على قطعة من الحمض النووي مقطوعة بنفس إنزيم التقييد ، فإن هذه تسمى "النهايات اللاصقة". تسمى عملية تكوين روابط هيدروجينية بين التسلسلات التكميلية على خيوط مفردة لتشكيل DNA مزدوج الشريطة التلدين. إضافة إنزيم يسمى DNA ligase ، والذي يشارك في تكرار الحمض النووي في الخلايا ، ينضم بشكل دائم إلى شظايا الحمض النووي عندما تتجمع الأطراف اللاصقة. بهذه الطريقة ، يمكن تقطيع أي جزء من الحمض النووي بين طرفي DNA البلازميد الذي تم قطعه بنفس إنزيم التقييد (الشكل 10.6).

تسمى البلازميدات التي تحتوي على دنا أجنبي داخلها بجزيئات الحمض النووي المؤتلف لأنها تحتوي على توليفات جديدة من المواد الجينية. تسمى البروتينات التي يتم إنتاجها من جزيئات الحمض النووي المؤتلف بالبروتينات المؤتلفة. ليست كل البلازميدات المؤتلفة قادرة على التعبير عن الجينات. يمكن أيضًا تصميم البلازميدات للتعبير عن البروتينات فقط عندما يتم تحفيزها بواسطة عوامل بيئية معينة ، بحيث يمكن للعلماء التحكم في التعبير عن البروتينات المؤتلفة.

الاستنساخ التناسلي

الاستنساخ التناسلي هو طريقة تستخدم لعمل نسخة أو نسخة متطابقة من كائن حي متعدد الخلايا بأكمله. تخضع معظم الكائنات متعددة الخلايا للتكاثر بالوسائل الجنسية ، والتي تتضمن مساهمة الحمض النووي من فردين (الوالدين) ، مما يجعل من المستحيل إنتاج نسخة متطابقة أو استنساخ لأي من الوالدين. جعلت التطورات الحديثة في التكنولوجيا الحيوية من الممكن استنساخ الثدييات التناسلية في المختبر.

يتضمن التكاثر الجنسي الطبيعي اتحاد الحيوانات المنوية والبويضة أثناء الإخصاب. كل من هذه الأمشاج أحادية العدد ، مما يعني أنها تحتوي على مجموعة واحدة من الكروموسومات في نواتها. تكون الخلية الناتجة ، أو الزيجوت ، ثنائية الصبغة وتحتوي على مجموعتين من الكروموسومات. تنقسم هذه الخلية بشكل انقسامي لإنتاج كائن متعدد الخلايا. ومع ذلك ، فإن اتحاد أي خليتين فقط لا يمكن أن ينتج زيجوتًا قابلاً للحياة ، فهناك مكونات في السيتوبلازم لخلية البويضة ضرورية للتطور المبكر للجنين خلال الانقسامات الخلوية القليلة الأولى. بدون هذه الأحكام ، لن يكون هناك تطور لاحق. لذلك ، لإنتاج فرد جديد ، يلزم وجود مكمل جيني ثنائي الصبغة وسيتوبلازم بيض. تتمثل طريقة إنتاج فرد مستنسخ صناعيًا في أخذ خلية بويضة فرد واحد وإزالة النواة أحادية العدد. ثم يتم وضع نواة ثنائية الصبغيات من خلية جسم الفرد الثاني ، المتبرع ، في خلية البويضة. ثم يتم تحفيز البويضة على الانقسام حتى يستمر التطور. يبدو هذا بسيطًا ، ولكنه في الواقع يتطلب عدة محاولات قبل إكمال كل خطوة بنجاح.

كان أول حيوان زراعي مستنسخ هو دوللي ، وهي شاة ولدت في عام 1996. وكان معدل نجاح الاستنساخ لأغراض التكاثر في ذلك الوقت منخفضًا للغاية. عاشت دوللي لمدة ست سنوات وتوفيت بسبب ورم في الرئة (الشكل 10.7). كانت هناك تكهنات بأنه نظرًا لأن الحمض النووي للخلية الذي أدى إلى ظهور دوللي جاء من فرد أكبر سنًا ، فقد يكون عمر الحمض النووي قد أثر على متوسط ​​عمرها المتوقع. منذ دوللي ، تم استنساخ العديد من أنواع الحيوانات (مثل الخيول والثيران والماعز) بنجاح.

كانت هناك محاولات لإنتاج أجنة بشرية مستنسخة كمصادر للخلايا الجذعية الجنينية. في هذا الإجراء ، يتم إدخال الحمض النووي من إنسان بالغ في خلية بويضة بشرية ، والتي يتم تحفيزها بعد ذلك على الانقسام. تشبه هذه التقنية التقنية التي تم استخدامها لإنتاج Dolly ، ولكن لا يتم زرع الجنين أبدًا في أم بديلة. تسمى الخلايا المنتجة بالخلايا الجذعية الجنينية لأنها تتمتع بالقدرة على التطور إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، مثل العضلات أو الخلايا العصبية. يمكن استخدام الخلايا الجذعية للبحث وتقديم تطبيقات علاجية في نهاية المطاف ، مثل استبدال الأنسجة التالفة. وتتمثل فائدة الاستنساخ في هذه الحالة في أن الخلايا المستخدمة لتجديد أنسجة جديدة ستكون مطابقة تمامًا للمتبرع بالحمض النووي الأصلي. على سبيل المثال ، لن يحتاج مريض اللوكيميا إلى شقيق لديه نسيج مطابق لعملية زرع نخاع العظم.

اتصال مرئي

لماذا كانت دوللي فنلندي دورست وليست خروفًا اسكتلنديًا ذو وجه أسود؟

الهندسة الوراثية

يُعرف استخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف لتعديل الحمض النووي للكائن الحي لتحقيق السمات المرغوبة بالهندسة الوراثية. تعد إضافة الحمض النووي الأجنبي في شكل نواقل الحمض النووي المؤتلف الناتجة عن الاستنساخ الجزيئي أكثر الطرق شيوعًا في الهندسة الوراثية. يسمى الكائن الحي الذي يتلقى الحمض النووي المؤتلف كائنًا معدل وراثيًا (GMO). إذا كان الحمض النووي الغريب الذي تم إدخاله يأتي من نوع مختلف ، فإن الكائن الحي المضيف يسمى جينيا. Bacteria, plants, and animals have been genetically modified since the early 1970s for academic, medical, agricultural, and industrial purposes. These applications will be examined in more detail in the next module.

Concepts in Action

Watch this short video explaining how scientists create a transgenic animal.

Although the classic methods of studying the function of genes began with a given phenotype and determined the genetic basis of that phenotype, modern techniques allow researchers to start at the DNA sequence level and ask: "What does this gene or DNA element do?" This technique, called reverse genetics , has resulted in reversing the classical genetic methodology. One example of this method is analogous to damaging a body part to determine its function. An insect that loses a wing cannot fly, which means that the wing’s function is flight. The classic genetic method compares insects that cannot fly with insects that can fly, and observes that the non-flying insects have lost wings. Similarly in a reverse genetics approach, mutating or deleting genes provides researchers with clues about gene function. Alternately, reverse genetics can be used to cause a gene to overexpress itself to determine what phenotypic effects may occur.

بصفتنا مشاركًا في Amazon ، فإننا نكسب من عمليات الشراء المؤهلة.

هل تريد الاستشهاد بهذا الكتاب أو مشاركته أو تعديله؟ هذا الكتاب هو Creative Commons Attribution License 4.0 ويجب أن تنسب OpenStax.

    إذا كنت تعيد توزيع هذا الكتاب كله أو جزء منه بتنسيق طباعة ، فيجب عليك تضمين الإسناد التالي في كل صفحة مادية:

  • استخدم المعلومات أدناه لتوليد اقتباس. نوصي باستخدام أداة استشهاد مثل هذه.
    • Authors: Samantha Fowler, Rebecca Roush, James Wise
    • الناشر / الموقع الإلكتروني: OpenStax
    • Book title: Concepts of Biology
    • تاريخ النشر: 25 أبريل 2013
    • المكان: هيوستن ، تكساس
    • Book URL: https://openstax.org/books/concepts-biology/pages/1-introduction
    • Section URL: https://openstax.org/books/concepts-biology/pages/10-1-cloning-and-genetic-engineering

    © Jan 12, 2021 OpenStax. محتوى الكتاب المدرسي الذي تنتجه OpenStax مرخص بموجب ترخيص Creative Commons Attribution License 4.0. لا يخضع اسم OpenStax وشعار OpenStax وأغلفة كتب OpenStax واسم OpenStax CNX وشعار OpenStax CNX لترخيص المشاع الإبداعي ولا يجوز إعادة إنتاجه دون الحصول على موافقة كتابية مسبقة وصريحة من جامعة رايس.


    Osama bin Laden: The Science of His End

    "DNA is a charged molecule. Consequently, DNA molecules will move when an electrical field is applied to a liquid in which they are dissolved. If the liquid is a simple one--such as water with some salts in it--all the DNA molecules move at nearly the same speed. Under those conditions, it is hard to distinguish the tiny disparities in the motion of different kinds of DNA.

    "If the solution is made less liquid, as in a gel, and the DNA molecules all start moving across the solution from some initial small volume--that is, from essentially the same staring point--then the molecules can move at perceptibly different speeds. Usually smaller DNA molecules move faster than larger ones. After a while, the molecules are separated by size. If the molecules fall into only a few discreet sizes, then bands (little rectangles) of DNA will appear in the gel. Each of these bands contains DNA strands of a specific size."

    [Editors note: DNA fingerprinting uses gel electrophoresis to distinguish between samples of the genetic material. The human DNA molecules are treated with enzymes that chop them at certain characteristic points, thereby reducing the DNA to a collection of more manageably sized pieces. The DNA fragments are loaded into a gel and placed in an electrical field, which electrophoretically sorts the DNA fragments into various bands. These bands can be colored with a radioactive dye to make them visible to imaging techniques.]

    "For individual people, the bands of DNA created through this process will have a pattern that is specific to the individual. Part of this pattern comes from the size of the DNA part of it comes from the sequence of the DNA of a specific size.


    شاهد الفيديو: How to understand Gel Electrophoresis results 1 (شهر فبراير 2023).