معلومة

ماذا يشعر C. Elegans عند لمسه؟

ماذا يشعر C. Elegans عند لمسه؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أقرأ الردود اللمسية لـ C. Elegans. بمجرد لمسها ، ما الذي تستشعره الخلايا العصبية على وجه التحديد؟ من المفترض أن اللمس يشوه خلايا الجسم ، وهذا التشوه تستشعره الخلايا العصبية الحسية. هل هذا صحيح؟ بالتناوب ، هل يتم تحفيز الخلايا العصبية نفسها بشكل مباشر بسبب صغر حجم الكائن الحي؟ (أم أنني بعيد؟)


باختصار ، أنت محق. تلمس الجلد ، وهذا يضغط على المستقبلات الميكانيكية ، والتي تولد بعد ذلك استجابة عصبية متتالية.

بقدر ما يتعلق بالخلايا العصبية الفعلية ، فإنه يعتمد حقًا على نوع اللمس. على سبيل المثال ، النوع المتميز جيدًا هو المحفزات الميكانيكية اللطيفة ، والتي يمكن أن تشمل ALM و AVM و PLMs و PVM ، اعتمادًا على الاستجابة (Will Schafer's review doi: 10.1007 / s00424-014-1574-3).

توجد مستقبلات اللمس اللطيف (TRNs) في اللحمة ، ولديها قنوات نقل ميكانيكي متخصصة (MeT) على طول عصبتها. إن تغيير تلك القنوات هو الذي يتسبب في تنشيط المستقبلات والاستجابة السلوكية النهائية الكاملة (ملخصة من ورقة التقارير العلمية أدناه).

لذلك ، باختصار: يتم تنشيط الخلايا العصبية الميكانيكية ، وتنتج استجابة. أعني بـ "الاستجابة" أن تلك الخلايا العصبية المستقبلة للميكانيكية تنشط بعض المسارات العصبية الداخلية ، والتي بدورها تنشط الخلايا العصبية الحركية ، التي تجعل الدودة تقوم بالأشياء.

هناك العديد من آليات التحسس الآلي الأخرى ، و WormBook هو المكان المناسب لمشاهدة مراجعة شاملة لها.


تعد الآلية / الطريقة الميكانيكية الفعلية لتنشيط قنوات MeT سؤالًا كبيرًا بما يكفي لنشر ورقة بحثية حديثة في التقارير العلمية لمعالجتها. هذه الورقة هي DOI: 10.1038 / s41598-017-12190-0 (Elmi et al. تحديد الميكانيكا الحيوية لإحساس اللمس في C elegans).

يقدمون الورقة مكررين ما لخصته أعلاه.

[...] يمكن اعتبار الإحساس باللمس كسلسلة من الأحداث التي بدأها التوزيع الزماني المكاني للأحمال الميكانيكية المطبقة على الجلد ، والتي تؤدي إلى ضغوط تشوه سطح الجلد والطبقات الفرعية والمستقبلات الميكانيكية الكامنة. استجابةً للطاقة الميكانيكية المرسلة ، تقوم المستقبلات الميكانيكية بتنشيط شبكة إشارات عصبية تقوم بتشفير الاتصال الجسدي كمعلومات نعتبرها "لمسة".


إلمي وآخرون قم بإعداد اختبار ذكي للنظر في كيفية تغير جسم الدودة. الجسم مرن جدًا (حتى 16 ميكرومترًا) وهناك إزاحة غير كاملة للجلد لأن الجسم ليس أسطوانيًا تمامًا.

استخدموا هذه البيانات لبناء نموذج أولي للطبقات المختلفة لجسم الدودة ، ثم قاموا بالتحقق من صحة النموذج وضبطه. إنها ورقة رائعة (مع بعض الرياضيات / الفيزياء ، والتي من ملفك الشخصي يبدو أنك قد تقدرها).


استقرار الجينوم في Caenorhabditis elegans

م. Rieckher ،. ب.شوماخر ، في استقرار الجينوم ، 2016

الملخص

أنواع معينة انيقة كان بمثابة كائن نموذجي مهم خلال العقود الماضية. السلالة التنموية المحددة والخط الجرثومي الديناميكي الذي يحتوي على انقسامات الخلايا الانقسامية والانقسامية التي تم حلها مكانيًا تجعل الديدان الخيطية نظامًا تجريبيًا هائلاً لدراسة استقرار الجينوم وآليات إصلاح الحمض النووي. سهلت الجينات التي يمكن تتبعها اكتشاف آليات صيانة الجينوم الجديدة والتحقيق فيها في سياق حيوان نامي وشيخوخة. نحن نقدم نظرة عامة على آليات الاستجابة لإصلاح الحمض النووي وتلف الحمض النووي في C. ايليجانس والمنهجيات المختلفة التي تم استخدامها لاكتساب نظرة ثاقبة لاستقرار جينوم الميتازوان.


بيولوجيا الأنظمة الميكانيكية C. ايليجانس إحساس اللمس

تُعلمنا حاسة اللمس بالخصائص الفيزيائية لمحيطنا وهي جانب مهم من جوانب الاتصال. قبل إدراك اللمسات ، تنتقل الإشارات الميكانيكية بسرعة وبشكل موثوق من سطح الجلد إلى قنوات النقل الميكانيكية الكهربائية المدمجة داخل الخلايا العصبية الحسية المتخصصة. لقد بدأنا للتو في فهم كيفية مشاركة الأنسجة الرخوة في انتقال القوة وكيفية تشوهها. هنا ، نراجع الدراسات التجريبية والنظرية للجزيئات المفردة والمجموعات الجزيئية التي يُعتقد أنها تشارك في النقل الميكانيكي ونطبق المفاهيم الناشئة من هذا العمل على حاسة اللمس. نحن نركز على الديدان الخيطية أنواع معينة انيقة كنموذج مدروس جيدًا للإحساس باللمس يمكن من خلاله دراسة الميكانيكا على المستوى الجزيئي والخلوي والأنظمة. أخيرًا ، نستنتج أن انتقال القوة هو خاصية ناشئة للهياكل الخلوية الجزيئية التي تعمل على استقرار بعضها البعض بشكل متبادل.


كيف يستخدم العلماء C. ايليجانس للقيام بالبحث اليوم؟

ما يقرب من 60 عامًا بعد أن بدأ برينر العمل معه C. ايليجانس، أصبح الآن كائنًا نموذجيًا راسخًا & # 8211 هناك أكثر من 500 مختبر في جميع أنحاء العالم يدرسون هذه الديدان! لا تزال العديد من حجج برينر الأصلية لصالح استخدام الديدان في المختبر صحيحة مع صغر حجمها ودورة حياتها القصيرة (حوالي ثلاثة أيام من البيضة إلى الكبار) وعدد كبير من النسل (ما يقرب من 300 بيضة) ، ويمكننا أن ننمي أعدادًا كبيرة جدًا. بسرعة. ومع ذلك ، بفضل التقدم في علم الوراثة والبيولوجيا الجزيئية ، كانت هذه الديدان مفيدة بطرق غير متوقعة.

لماذا لا تزال الديدان كائنًا نموذجيًا جيدًا؟

  • ذو صلة: العديد من جينات الديدان لها نظائر بشرية ، والتي يمكن أن تكون متشابهة بشكل مدهش! لذا على الرغم C. ايليجانس تبدو وتتصرف بشكل مختلف عن البشر ، فدراسة جينات الديدان والبروتينات يمكن أن تؤدي إلى رؤى حول كيفية عمل خلايانا أيضًا.
  • بسيط: C. ايليجانس فقط 302 خلية عصبية في الدودة البالغة (مقارنة بـ 100 مليار لدينا).
  • ومع ذلك فهي معقدة: لا يزال بإمكان هذا الجهاز العصبي الصغير نسبيًا أن يولد سلوكيات معقدة ، مثل البحث عن الطعام ، والتزاوج ، وتجنب المنبهات الضارة ، وحتى التعلم.
  • يتميز بشكل جيد: لقد كانوا أول كائن متعدد الخلايا يتسلسل جينومه بالكامل ، ولدينا خريطة مفصلة لجميع الخلايا العصبية الخاصة بهم وكيف يتم توصيل العديد من هذه الخلايا العصبية ، والعديد من جيناتها معًا ، تمت دراستها على نطاق واسع.

كيف نقوم بالبحث في الديدان؟

البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء التي تحدد أنواع الخلايا العصبية المختلفة في رأس الدودة

قدمت سنوات الدراسة في المعامل في جميع أنحاء العالم مجموعة أدوات رائعة من التقنيات.

  • تتمتع الديدان بالعديد من السلوكيات والخصائص المميزة (الرائحة ، والذوق ، والإحساس باللمس ، والحركة ، والتعلم) ، والتي يمكننا استخدامها لمعرفة كيفية عمل خلاياها العصبية.
  • يمكننا إدخال حمض نووي جديد في الديدان ، أي جعلها "معدلة وراثيًا". يمكننا حتى التعبير عن البروتينات البشرية في الخلايا الدودية!
  • يمكن أن تساعدنا الواسمات الفلورية (مثل البروتين الفلوري الأخضر ، GFP) على تصور بروتين مهم ، وإعطائنا أدلة حول ما يفعله ، أو يمكنه تسمية خلايا عصبية معينة ، مما يمكننا من التحقق مما إذا كانت تتطور بشكل طبيعي.
  • يمكننا التعبير عن بروتينات "مؤشر" الفلورسنت ، والتي تغير لونها اعتمادًا على نشاط الخلايا العصبية ، مما يسمح لنا بمتابعة ما تفعله الخلايا العصبية المعينة.
  • يمكننا تغيير الجينات ذات الأهمية ، وإعادة نسخة جديدة ، مع أو بدون تغييرات في تسلسل الحمض النووي ، التي تساعدنا على فهم كيفية عملها.

من خلال الجمع بين هذه الاستراتيجيات ، يمكن للعلماء تحديد الخلايا التي يتم فيها التعبير عن جين معين ، والسلوكيات التي يساهم فيها ، والجينات الأخرى التي يتفاعل معها. هذا النهج مفيد بشكل خاص لأفراد عائلة الجينات التي تساهم في العمليات البيولوجية لدى البشر. المدرجة أدناه هي بعض الأمثلة على كيفية مساهمة الديدان الخيطية في فهمنا لصحة الإنسان والأمراض.

إدمان المخدرات والأمراض العقلية

يميز البروتين الفلوري الأخضر الخلايا العصبية التي تعبر عن السيروتونين والدوبامين. تعدل هذه الناقلات العصبية سرعة الديدان على الطعام ، ومدى سرعة تناولها ، ومعدل وضع البيض.

استجابة للمعلومات الحسية ، وباستخدام خبراتنا السابقة ، نقوم بتغيير سلوكنا بفضل جزيئات المرسال طويلة المدى ("الناقلات العصبية"). تستخدم الديدان نفس الناقلات العصبية لتنظيم سلوكها أيضًا. عندما يواجهون طعامًا جيدًا ، على سبيل المثال ، فإنهم يبطئون ويضعون البيض ، وهي عملية تتطلب الدوبامين. يلعب الدوبامين دورًا رئيسيًا في إدمان المخدرات والفصام واضطراب فرط الحركة ونقص الانتباه ومرض باركنسون. لذا فإن فهم مسارات الإشارات التي تكمن وراء سلوكيات الدودة هذه يمكن أن يساعدنا في فهم مسارات الإشارات التي تنطوي عليها الحالات البشرية (وكيفية علاجها). يعتبر السيروتونين مثالاً آخر على البشر ، فهو متورط في الاكتئاب والقلق ، بينما يتحكم في الديدان في وضع البيض ومعدل التغذية (يضعون المزيد من البيض ويأكلون بشكل أسرع إذا أعطيتهم بروزاك!).

استخدام الديدان لدراسة الصمم

ما يقرب من نصف حالات الصمم وراثية ، وتسببها تغيرات في تسلسل جينات معينة. أدت دراسة العائلات المصابة بالصمم إلى تحديد العديد من الجينات المسؤولة. العديد من هذه الجينات لها نظائر متشابهة جدًا في الديدان ، لذلك يمكننا استخدام الديدان لمحاولة فهم كيفية تسببها في الصمم ، وما الدور الذي تلعبه هذه الجينات في الأفراد الأصحاء. على الرغم من أن الديدان لا تستطيع السمع ، إلا أن السمع يعتمد على اكتشاف الاهتزازات ، وهو أمر مشابه جدًا لاكتشاف اللمس. تستجيب الديدان للمس من خلال التحرك في الاتجاه المعاكس ، لذلك ، إذا كان الجين الدودي يعمل على اللمس ، فإن هذا يوفر لنا سلوكًا يمكن ملاحظته للمقايسة.

الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر

تشيخ الخلايا الدودية بطرق مشابهة للخلايا البشرية ، لذا يمكننا استخدامها كنموذج للمرض. دورة الحياة القصيرة لـ C. ايليجانس يعني أنه يمكننا ملاحظة آثار الشيخوخة بسرعة. يمكننا وضع الجينات والبروتينات التي تسبب الأمراض البشرية المرتبطة بالعمر (مثل مرض الزهايمر أو مرض هنتنغدون أو مرض باركنسون) في الديدان ، ودراسة سبب تسببها في الإصابة بأمراض شيخوخة الحيوانات. يمكننا التلاعب بالديدان وراثيًا بحيث تصبح أقل عرضة للإصابة بالمرض ، ومن ثم التحقق من أسباب ذلك. حددت مثل هذه الدراسات الأنسولين كعامل رئيسي يؤثر على كيفية تقدمنا ​​في العمر ، ومدى احتمالية الإصابة بأمراض الشيخوخة.

دودة "شابة" بالغة تحتوي على بروتين مرتبط بالشيخوخة موسوم ببروتين فلوري. يتم توزيعه في جميع أنحاء الجسم
دودة بالغة "قديمة" حيث تجمع نفس البروتين

C. ايليجانس تعتبر رائعة لشاشات الإنتاجية العالية

نظرًا لأن الديدان رخيصة وسهلة النمو بأعداد كبيرة ، فهي مثالية للشاشات الكبيرة. يمكن أن يساعدنا الكشف عن طفرات ذات عيب معين ، ثم تحديد الجين ، على فهم الأمراض البشرية بشكل أفضل. يمكن للفحص بحثًا عن جزيئات جديدة تصحح هذا الخلل تحديد عقاقير جديدة أيضًا!


البروتوكول الأساسي 2

تغذية الديدان دسرنا

يمكن إحداث RNAi عن طريق تغذية بكتيريا الديدان التي تعبر عن dsRNA (Timmons et al. ، 2001). أولاً ، يتم استنساخ (كدنا) المطابق للجين المعني في ناقل تعبير بكتيري بين مواقع محفز بوليميراز T7 المتعارضة. ثم يتم تحويل ناقل التغذية إلى بكتريا قولونية سلالة HT115 تحمل ليسوجين DE3 ( الوحدة 1.8) ، مما يوفر تعبيرًا محرضًا لـ IPTG عن بوليميريز Phage T7 RNA. تفتقر سلالة HT115 (DE3) أيضًا إلى Rnc الجين ، الذي يشفر RNase III وبالتالي فهو ناقص في تدهور الرنا المزدوج الجديلة. يتم تحضير طعام RNAi وبذره على أطباق NGM التي تحتوي على IPTG. يتم وضع الحيوانات على غذاء RNAi ويتم فحص كل من الخنثى والذرية وتقييمها من أجل الأنماط الظاهرية.

لاستهداف جينين في وقت واحد عن طريق التغذية ، وجدنا نحن وآخرون (Min et al. ، 2010) أنه من الأفضل دمج شظيتين (كدنا) ، واحدة من كل جين ، في ناقل تغذية واحد. خلط اثنين بكتريا قولونية تعمل السلالات أيضًا ، ولكنها أكثر عرضة للخطأ الناجم عن الاختلاط غير المتكافئ أو تعبير RNA في سلالتي التغذية المختلفتين. لا تحاول إطعام الحيوانات التي تم حقنها سابقًا بـ dsRNA لأسباب غير معروفة ، فإن الحقن المجهري لـ dsRNA (حتى غير محدد dsRNA) سوف يقمع RNAi عن طريق التغذية.

يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول بسهولة لفحص العواقب الجزيئية والكيميائية الحيوية لاستنفاد منتج جيني معين.

يسمح RNAi عن طريق التغذية بتنسيق microtiter & # x02013the موضوع البروتوكولين الأساسيين 3 و 4 والبروتوكول البديل 2 & # x02013 بإجراء شاشات منهجية (Fraser et al. ، 2000 ، Sonnichsen et al. ، 2005 ، Lehner et al. ، 2006c ، Watson et آل ، 2013).

المواد

ناقل تغذية L4440 مزدوج T7 RNAi (الشكل 26.3.5 Addgene)

موقع الاستنساخ المتعدد لمتجه التغذية المزدوج T7 RNAi L4440. يحيط مروجو Phage T7 المتعارضون بموقع الاستنساخ المتعدد لـ L4440. يتم عرض مواقع التقييد الخاصة بـ MCS ، وتتم الإشارة إلى المواقع الفريدة بخط عريض.

بكتريا قولونية سلالة تغذية RNAi HT115 (DE3) (CGC)

مرق رائع (TB الوحدة 1.1) تحتوي على 50 & # x003bcg / مل لكل أمبيسيلين وتتراسيكلين ( الوحدة 1.4)

يحتوي TB على 50 & # x003bcg / مل الأمبيسيلين

لوحات NGM / amp / IPTG (انظر الوصفة)

جرافيد / شاب بالغ ، يرقات L1 ، أو يرقات L4 C. ايليجانس من السلالة (السلالات) المناسبة (على سبيل المثال ، N2 ، CGC)

لوحات NGM / amp / IPTG (انظر الوصفة) المصنفة بـ HT115 التي تحتوي على ناقل تغذية L4440 RNAi فارغ

الكواشف والمعدات الإضافية لاستنساخ أجزاء الحمض النووي ( الوحدة 3.16) ، تحويل بكتريا قولونية ( الوحدة 1.8) ، المتزايد بكتريا قولونية ( الوحدة 1.2) ونقلها وتكاثرها C. ايليجانس (انظر بروتوكول الدعم 1)

ملاحظة: نفذ كل تجربة RNAi في ثلاث نسخ.

تحضير سلالة تغذية [رني)

استنساخ (كدنا) للجين المعني في ناقل تغذية L4440 مزدوج T7 RNAi ( الوحدة 3.16).

تجنب الإنترونات & # x02014 قد يؤدي وجود الإنترونات في بنية التغذية إلى تقليل كفاءة التداخل. تشمل بدائل L4440 Litmus 28i و 38i (NEB) والإصدارات المتوافقة مع البوابة من L4440 و L4440-dest-RNAi (Rual وآخرون ، 2004) و L4440-gtwy (كالدويل وآخرون ، 2006). L4440 و L4440-gtwy متاحان من خلال Addgene.

تحويل بنية تغذية RNAi إلى بكتريا قولونية سلالة التغذية HT115 (DE3) ( الوحدة 1.8).

اختر مستعمرة وقم بتلقيح 2 مل من المرق الرائع (TB) الذي يحتوي على 50 & # x003bcg / مل لكل من الأمبيسيلين والتتراسيكلين ، وينمو طوال الليل عند 37 & # x000b0C ( الوحدة 1.2).

قم بزرع المزرعة البادئة في 1 لتر تيرابايت تحتوي على 50 & # x003bcg / مل من الأمبيسلين واحتضانها مع الرج عند 37 & # x000b0C لمدة 8 إلى 16 ساعة ( الوحدة 1.2).

التتراسيكلين في هذه الثقافة غير ضروري ، وفي الواقع ، قد يقلل من كفاءة الحمض النووي الريبي (كاماث وآخرون ، 2001).

يمكن تقليص الثقافات ومع ذلك ، يمكن تخزين الطعام الزائد من الثقافات الكبيرة في & # x0201380 & # x000b0C ، لعدة أشهر.

احصد البكتيريا

5 أ. للطرد المركزي: بكتيريا الطرد المركزي 10 دقائق عند 800 & # x000d7 ز، 4 & # x000b0C. أعد تعليق الكريات البكتيرية في المخزن المؤقت M9 (استخدم 25 مل لكل لتر من المزرعة) وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

حصاد الطعام بالطرد المركزي إذا كانت هناك حاجة ماسة للطعام.

إذا سمح الوقت ، اسمح للبكتيريا أن تترسب بشكل سلبي لتقليل احتمالية تلويث غذاء الرنا المزدوج الجديلة.

5 ب. للترسيب السلبي: استبدل وسيط TB بـ M9 buffer على النحو التالي:

اسمح للبكتيريا بالاستقرار في قاع دورق الثقافة طوال الليل عند 4 & # x000b0C. قم بشفط أكبر قدر ممكن من الوسط من الدورق بحذر دون إزعاج البكتيريا ، مما يشكل طبقة ناعمة في أسفل القارورة. قم بتدوير القارورة لتعليق البكتيريا في الحجم المتبقي من السل وصبها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

بيليه البكتيريا في جهاز الطرد المركزي السريري لمدة 10 دقائق عند 800 & # x000d7 ز (4500 دورة في الدقيقة) ، 20 & # x000b0C. إزالة المرق عن طريق الشفط.

تميل هذه الكريات إلى أن تكون ناعمة ويمكن أن يؤدي سكبها من الوسط إلى فقدان الحبيبات البكتيرية.

غسل البكتيريا في 5 أحجام بيليه M9 العازلة عن طريق دوامة حتى يتم إذابة الكتل.

6. قم بتكوير البكتيريا في جهاز طرد مركزي سريري لمدة 10 دقائق عند 800 & # x000d7 ز (4500 دورة في الدقيقة) ، 20 & # x000b0C.

7 أ. للاستخدام الفوري / قصير المدى: غسلت البكتيريا Resuspend في 5 أحجام بيليه من المخزن المؤقت M9. تخزين لمدة تصل إلى شهر واحد في 4 & # x000b0C.

طعام RNAi جاهز للاستخدام بعد إعادة التعليق في أي من المخزن المؤقت.

7 ب. للتخزين: غسلت البكتيريا Resuspend في M9 / 15٪ الجلسرين. تخزين في أجزاء 10 مل لعدة أشهر في & # x0201370 & # x000b0C.

8. زرع عددًا مناسبًا من أطباق NGM / amp / IPTG بقطرة واحدة (& # x0223c100 & # x003bcl) لكل طعام RNAi.

9. اترك الأطباق تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

يسمح هذا أيضًا بتحريض إنتاج الرنا المزدوج الجديلة dsRNA وينتج باستمرار أكثر أنماط RNAi اختراقًا عن طريق التغذية.

يمكن تخزين لوحات البذور في حاوية محكمة الغلق لمدة تصل إلى عدة أسابيع عند 4 & # x000b0C. تدفئة لوحات RNAi لدرجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.

زراعة الديدان على غذاء RNAi وتحليل الأنماط الظاهرية

10 أ. اختبار الأنماط الظاهرية الجنينية وما بعد الجنين: ضع حامل واحد بالغ C. ايليجانس على لوحات NGM / amp / IPTG. كعنصر تحكم ، ضع البالغات المفردة الحمضية على HT115 (DE3) الذي يحتوي على ناقل تغذية L4440 RNAi الفارغ. بعد 24 ساعة ، انقل كل بالغ يتغذى من الحمض النووي الريبي (RNAi) أو يتغذى بالسيطرة على طبق طازج من نفس النوع وعد عدد السلالات (البيض واليرقات) على كل طبق.

عن طريق وضع البالغين الحملي على لوحات RNAi ، يمكن للمرء تقييم قدرة RNAi على إنتاج أنماط ظاهرية جنينية وكذلك ما بعد الجنين على نفس اللوحة.

10 ب. اختبار الأنماط الجنينية المميتة: ضع حيوانات L4 مفردة على NGM / amp / IPTG (RNAi) والتحكم & # x02014i.e. ، المصنف بـ HT115 (DE3) الذي يحتوي على ناقل تغذية L4440 RNAi الفارغ & # x02014plates. بعد 24 ساعة ، انقل كل شخص بالغ إلى طبق طازج من نفس النوع الذي تم بذره عليه (أي RNAi أو مجموعة التحكم) وعد عدد السلالات (البيض واليرقات) على كل طبق.

10 ج. اختبار الأنماط الظاهرية بعد الجنين: ضع 20 يرقة L1 حديثة الفقس على لوحات RNAi والتحكم.

11. افحص اللوحات كل يوم لتحديد ما إذا كان طعام RNAi ينتج أي أنماط ظاهرية جنينية و / أو ما بعد الجنين.

يشير وجود الأجنة على لوحات RNAi بعد 24 ساعة من إزالة الشخص البالغ إلى أن RNAi ينتج نمطًا جنينيًا قاتلًا. ومع ذلك ، تأكد دائمًا من مقارنة لوحات RNAi بلوحات التحكم.

في بعض الحالات ، يمكن بسهولة تحديد الأنماط الظاهرية بعد الجنين من خلال مقارنة ذرية RNAi مع ذرية التحكم.


الفقاريات غير الثديية

2.20.2.1.1 النيماتودا

تمت دراسة خلايا المستقبلات الكيميائية ومستقبلاتها الجزيئية جيدًا أنواع معينة انيقة . لسوء الحظ ، فإن الأدبيات في هذا المجال مرتبكة بسبب الميل إلى الإشارة إلى الاستجابات الكيميائية للمركبات القابلة للذوبان في الماء باسم "الذوق" بينما يُطلق على المستجيبات الكيميائية للمواد المتطايرة اسم "الشم" على الرغم من أن نفس العضو النهائي (المستقبلات الكيميائية البرمائية) يستخدم للتوسط في كلا الاستجابتين. كما نوقش أعلاه ، فإن الفصل بين الذوق والرائحة وفقًا للطبيعة الكيميائية للمحفز ليس مفيدًا بشكل عام (على سبيل المثال ، قارن بين الذوق والشم في سمك السلور). المستقبل الكيميائي المدروس جيدًا للديدان الخيطية C. ايليجانس يتكون من أجهزة أمفيد مقترنة كل منها يعصبها 12 خلية عصبية (الشكل 1 وارد وآخرون.، 1975). من بين هؤلاء ، 11 منها حسي كيميائي ، والآخر حساس للحرارة (Bargmann and Mori ، 1997). ثمانية من الخلايا العصبية الحسية الكيميائية (ADF ، ADL ، ASE ، ASG ، ASH ، ASI ، ASJ ، ASK) تمد التشعبات من خلال المسام البرمائية في البشرة لتكون على اتصال مباشر إلى حد ما مع البيئة. تستجيب هذه الخلايا للمواد القابلة للذوبان في الماء. تحتوي ثلاثة عصبونات حسية كيميائية برمائية أخرى (AWA ، AWB ، AWC) على تشعبات تمتد بالقرب من المسام البرمائية ، ولكنها مغلفة بخلية "الغلاف" أو "الجناح" ، وبالتالي ليس لها اتصال مباشر بالبيئة. تستجيب خلايا AWA و AWB و AWC للمواد المتطايرة ، والتي يُفترض أنها قادرة على الانتشار عبر خلية الغلاف أو نقلها عبرها. إن السلوكيات الكيميائية المدروسة بشكل شائع مدفوعة بالكامل تقريبًا بهذه المستقبلات الكيميائية البرمائية (Bargmann and Mori ، 1997). كما هو موضح أعلاه ، عادة ما يتم تقسيم السلوك الكيميائي للديدان الخيطية إلى "طعم" و "رائحة" وفقًا لطبيعة المنبه الكيميائي (قابل للذوبان في الماء أو متطاير ، على التوالي). أقترح أن جميع السلوكيات التي تتوسط فيها البرمائيات يجب اعتبارها "رائحة" بشكل أكثر ملاءمة حيث لا يتعلق أي من السلوكيات المقاسة باستساغة كائن غذائي مشتبه به. بدلاً من ذلك ، يدفع البرمائيات السلوكيات الحركية ، تمامًا كما يقود حاسة الشم في الفقاريات إلى الاقتراب / تجنب الاستجابات الحركية.

النيماتودا ، بما في ذلك C. ايليجانس، لديها مجموعة من المستقبلات الكيميائية الأقل شهرة ، الخلايا العصبية الشفوية الداخلية ، والتي تقع أكثر داخل تجويف الفم ويبدو أنها تتوسط في سلوكيات تشبه الذوق (تابيش وآخرون.، 1995). ومع ذلك ، لا يُعرف الكثير عن وظيفة أو استجابات هذه المستقبلات الكيميائية المفترضة حول الفم. يقترح Trett and Perry (1985) ، على أساس الهيكل ، أن الخلايا العصبية IL2 من الحسية الشفوية الداخلية تعمل كمستقبلات كيميائية تلامسية (تمامًا كما تم وصف براعم التذوق) ولكن لم يتم تأكيد هذه التكهنات من خلال الدراسات الوظيفية أو السلوكية. الديدان الخيطية التي تمت دراستها حتى الآن تمتلك ستة أحاسيس شفوية داخلية متناظرة شعاعيًا مع فتحات جليدية تواجه الجانب الداخلي من نهاية المنقار من تجويف الفم في العديد من الأنواع (انظر الشكل 1). يتم تعصب كل محس من قبل اثنين من الخلايا العصبية (IL1 و IL2) أحدهما (IL2) يمتد عملية للوصول إلى البيئة الخارجية وينتهي التغصنات الحسية الأخرى أسفل السطح مباشرة تحت الفتحة في البشرة (وارد وآخرون.، 1975). ومع ذلك ، في الأنواع الطفيلية ، قد تكون الحسية الشفوية الداخلية حسية ميكانيكية بحتة من حيث أن عملياتها الحسية لا تستطيع الوصول إلى السطح (غرامة وآخرون.، 1997) ولكن هذا الترتيب لن يمنع اكتشاف المواد المتطايرة مثل الخلايا العصبية الأمفيد AWA و AWB و AWC.

شكل 1 . أعضاء المستقبلات الكيميائية على رأس الديدان الخيطية. أ ، رسم تخطيطي يوضح موقع شعر الرأس Pratylenchus ص. CS ، محسس رأسي ILS ، حساس شفوي داخلي OLS ، محسس شفوي خارجي. ب ، رسم تخطيطي للحس الشفوي الداخلي (معروض باللون الأحمر في اللوحة أ). IL2 ، الذي يتعرض طرفه التغصني إلى المحيط الخارجي ، هو عبارة عن عصبون حسي كيميائي بينما يُقال إن IL1 ، الذي لم يتم الكشف عن طرفه ، يكون ميكانيكيًا. ج ، يحتوي البرمائيات على العديد من الخلايا العصبية الحسية الكيميائية التي تكتشف المواد القابلة للذوبان (ASE ، ASG ، ASH ، ADF ، ADL ، ASI ، ASJ ، ASK) أو المواد المتطايرة (AWA ، AWB ، AWC). ليس من الواضح ما إذا كان ينبغي اعتبار المستقبلات الكيميائية البرمائية "طعمًا" وفقًا للتعريف الوارد في هذا الفصل نظرًا لأن تحفيز هذه الخلايا المستقبلة يؤدي إلى الانجذاب الكيميائي بدلاً من التغذية. أ ، مستنسخ من Trett، M.W and Perry، R.N 1985. الآثار الوظيفية والتطورية للتشريح الحسي الأمامي لأنواع نيماتودا آفات الجذر (جنس Pratylenchus). Revue Nematol. 8 (4) ، 341–355 ، بإذن من IRD. ب ، الرسم على أساس وارد ، س ، طومسون ، إن ، وايت ، جي جي ، وبرينر ، س. 1975. إعادة البناء المجهري الإلكتروني للتشريح الحسي الأمامي للنيماتودا أنواع معينة انيقة. J. كومب. نيورول. 160 (3) ، 313-337. ج ، مستنسخة من بيولوجيا الخلية للظهارة الشمية. في: البيولوجيا العصبية للتذوق ورائحة الأمبامب Farbman ، A. محرران. T. E. Finger و W. L. Silver و D. Restrepo حقوق النشر © 2000 ، Wiley. أعيد طبعها بإذن من John Wiley & ampamp Sons، Inc.


7. تجميد واسترداد C. ايليجانس مخازن

أنواع معينة انيقة يمكن تجميدها وتخزينها إلى أجل غير مسمى في نيتروجين سائل (& # 8722196 درجة مئوية) (برينر ، 1974). تتمثل مفاتيح نجاح عملية التجميد في استخدام الحيوانات في المرحلة الصحيحة من التطور ، وإضافة الجلسرين إلى وسائط التجميد ، والتبريد التدريجي إلى -80 درجة مئوية. لا تعيش الحيوانات التي تتغذى جيدًا والبالغات والبيض والبيض بشكل جيد. من الأفضل استخدام عدة لوحات من الديدان التي استنفدت للتو بكتريا قولونية OP50 العشب والتي تحتوي على الكثير من الحيوانات L1-L2. يتم استخدام حجم نهائي 15٪ من الجلسرين في محلول التجميد. من المستحسن خفض درجة الحرارة بمقدار 1 درجة مئوية في الدقيقة أثناء التجميد. يمكن تحقيق ذلك عن طريق وضع الديدان (في قوارير الفريزر) في حاوية ستايروفوم عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. عقد قوارير. بعد 12 ساعة أو أكثر عند درجة حرارة -80 درجة مئوية ، يجب نقل قوارير الفريزر إلى مكان التجميد الدائم للتخزين على المدى الطويل.

تستخدم CGC حلين للتجميد C. ايليجانس : محلول تجميد سائل (برينر ، 1974) ومحلول تجميد ناعم أجار (ليون أفيري ، اتصال شخصي). للتخزين طويل الأجل للمخزونات في النيتروجين السائل ، يوصى باستخدام محلول التجميد السائل. عند استخدام هذا المحلول ، تستقر الديدان في قاع قارورة الفريزر ، ولا يمكن استرجاع أي حيوانات قابلة للحياة بسهولة دون إذابة محتويات القارورة بالكامل. حل التجميد الناعم مفيد لتجميد مخزون الأجار العامل C. ايليجانس . تساعد إضافة الأجار في إبقاء الديدان معلقة طوال المحلول. يمكن أخذ ملعقة صغيرة من المحتويات المجمدة ، ويمكن ترك الباقي في القارورة وإعادته إلى الفريزر لاستخدامه لاحقًا. يجب تخزين القوارير المجمدة باستخدام Soft Agar Freezing Solution في درجة حرارة -80 درجة مئوية. إذا تم حفظها في النيتروجين السائل ، تصبح المحتويات قاسية جدًا ، وستحتاج القارورة إلى التسخين قبل أن يكون من الممكن إزالة مغرفة المحتويات. تقلل فترة الاحترار من عدد المرات التي يمكن فيها استعادة الديدان الحية من القارورة. عند التخزين في درجة حرارة -80 درجة مئوية ، ليست هناك حاجة للسماح بتسخين القارورة ، حيث تكون المحتويات ناعمة بدرجة كافية لاستخدامها على الفور. نقوم باستعادة الديدان 3-4 مرات من كل قنينة من مخزون الأجار الناعم.

يمكن تجميد الديدان في 1.8 مل من أنابيب التبريد. تستخدم CGC قوارير Nunc Cryotube (# 65234) مع خيوط داخلية وتجمد ستة قوارير من كل سلالة تتلقاها. يتم تجميد قارورتين باستخدام محلول Soft Agar Freezing ويتم تخزينها في درجة حرارة & # 8722 80 & درجة مئوية لاستخدامها كمخزون عامل. يتم تجميد أربع قوارير باستخدام محلول التجميد السائل ، ويتم إذابة أحدها كمختبر ، ويتم وضع الثلاثة الأخرى في خزانين مختلفين للنيتروجين السائل على الأقل. لملء طلبات الإجهاد ، يتم استخدام مخزون العمل الذي يتم الاحتفاظ به عند & # 8722 80 & deg. عندما يتم إفراغ آخر قنينة مخزنة في & # 8722 80 & deg C ، يتم تجميد الديدان مرة أخرى باستخدام Soft Agar Freezing Solution لاستبدال هذه القوارير. من الناحية النظرية ، لن تحتاج أبدًا إلى استخدام المخزونات المخزنة في النيتروجين السائل نظرًا لاستبدال مخزون الأجار الناعم باستمرار عند نفادها.

انتعاش C. ايليجانس من المخزونات المخزنة في النيتروجين السائل في حدود 35-45٪ من إجمالي عدد الحيوانات المجمدة. يتناقص هذا العدد قليلاً فقط بعد سنوات عديدة من التخزين في النيتروجين السائل. إن استعادة المخزونات المخزنة عند & # 8722 80 & درجة مئوية لسنوات عديدة (& GT 10) ليست عالية مثل النيتروجين السائل ، ولكن يمكن تخزين الديدان بأمان بهذه الطريقة لسنوات عديدة (CGC ، بيانات غير منشورة). بالطبع ، يمكن أن يؤدي انقطاع التيار الكهربائي إلى فقدان جميع المخزونات المحفوظة عند & # 8722 80 & deg C ، لذلك من الحكمة جدًا الاحتفاظ بنسخة واحدة على الأقل من جميع المخزونات في النيتروجين السائل. بعض سلالات الطفرات (خاصة بعض طفرات Dpy) لا تنجو من التجمد وكذلك الحيوانات البرية.

بروتوكول 7. التجميد C. ايليجانس باستخدام محلول التجميد السائل

S عازلة [129 مل 0.05 م ك2HPO4، 871 مل 0.05 م خ2ص4، 5.85 جم كلوريد الصوديوم]


كيف يعوض الدماغ الفقد الحسي ويشير إلى جذوره التطورية المبكرة

أنواع معينة انيقة. الصورة: ويكيبيديا.

يمتلك الدماغ البشري قدرة رائعة على الاستجابة لفقدان الحواس من خلال تعزيز ما تبقى من الحواس العاملة. من خلال آلية التعويض في الدماغ ، والمعروفة باسم اللدونة عبر الوسائط ، يتم تحسين بعض الحواس بعد فقدان المدخلات الحسية الأخرى ، مثل تحسين السمع لدى الأشخاص المكفوفين.

حتى الآن ، تمت دراسة هذه الآلية على البشر والثدييات الأخرى ، على افتراض أنها وظيفة أدمغة معقدة تتكون من مليارات الخلايا ، مثل البشر. الآن ، كشفت دراسة دولية جديدة بقيادة باحثين في الجامعة العبرية في القدس ، أن آلية الدماغ التعويضية هي ميزة أساسية توجد أيضًا في الأنظمة العصبية الأقل تعقيدًا. كشفت الدراسة أيضًا عن الطريقة التي تعمل بها الآلية في الدماغ من خلال نظام الإشارات بين الحواس.

البحث الذي نشر في المجلة علم الأحياء بلوستم إجراؤه بشكل مشترك في معهد الأبحاث الطبية الإسرائيلية الكندية (IMRIC) في كلية الطب بالجامعة العبرية ، بالتعاون مع مختبر MRC للبيولوجيا الجزيئية في كامبريدج بالمملكة المتحدة ومركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان في سياتل ، الولايات المتحدة .

"واحدة من أكثر القدرات الرائعة للدماغ هي القدرة على تعويض فقدان المدخلات الحسية. يمكننا أن نتعلم الكثير من كيف يمكن للجهاز العصبي البسيط نسبيًا أن يمارس وظيفة دماغية متطورة مثل هذا. في هذا البحث ، كشفنا عن الحد الأعلى للتعقيد العصبي المطلوب لآلية تعويضية مثل هذه ، مما يسمح لنا بفحص وفهم كيفية عملها بسهولة أكبر ، من المستوى الجزيئي إلى المستوى السلوكي "، قال الدكتور إيثاي رابينوفيتش ، الذي قاد البحث خلال عمله في قسم علم الأعصاب الطبي في الجامعة العبرية.

لفهم كيفية عمل اللدونة عبر الوسائط بشكل أفضل ، قام فريق البحث بفحص كائن حي به نظام عصبي أقل تعقيدًا بشكل كبير مما هو موجود في البشر - الدودة المستديرة C. elegans. يبلغ طوله ملليمترًا واحدًا ، ويتغذى على البكتيريا ، ويحتوي نظامه العصبي على 302 خلية عصبية فقط (مقارنة بـ 100 مليار خلية عصبية في دماغ الإنسان).

درس الباحثون العلاقة بين فقدان حاسة اللمس والتعزيز المحتمل لحاسة الشم. للقيام بذلك ، ركزوا على الديدان ذات الطفرة الجينية التي تقضي على حاسة اللمس.

اكتشفوا أن طفرات C. elegans التي لا تستطيع الإحساس باللمس للجسم تُظهر حاسة شم محسّنة. كانوا قادرين على تحديد هذا التغيير في الأداء الحسي إلى تغيير في قوة مشابك معينة في دائرة حاسة الشم.

وأوضح الدكتور رابينوفيتش: "لقد تمكنا من عكس هذه التأثيرات عن طريق التحفيز الاصطناعي للخلايا العصبية التي تعمل باللمس ومن خلال هندسة مشابك جديدة في دائرة حاسة الشم". "لا يزال أمامنا طريق طويل لنقطعه ، ولكن يمكننا بالفعل التفكير في التطبيقات المستقبلية لعلاج الآثار الجانبية غير المرغوب فيها بعد فقدان المدخلات الحسية."

يضيف هذا البحث إلى سلسلة من الدراسات التي تبحث في دور الببتيدات العصبية في الإشارات بين الحواس في الدماغ ، ويوسع المعرفة حول العمليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء اللدونة عبر الوسائط. قد تشير هذه النتائج أيضًا إلى الجذور التطورية القديمة لآلية التعويض هذه ، الآن بعد أن تم الكشف عنها في نظام أقل تطورًا بكثير من نظامنا.


لمس الدوائر الانعكاسية

يؤدي الإحساس بالمحفزات الميكانيكية بواسطة عصبون مستقبل اللمس إلى إحداث تغييرات في الحركة والسلوكيات الأخرى. يتم التحكم في الحركة بعيدًا عن محفز اللمس بواسطة دائرة انعكاسية ثلاثية الخلايا العصبية. C. ايليجانس تنجم الحركة عن تقلص عضلات الجدار الظهرية والبطنية بالتناوب. يتم تنشيط هذا الانقباض العضلي بواسطة الخلايا العصبية الحركية في الحبل البطني (الخلايا العصبية الحركية للحركة الخلفية والخلايا العصبية الحركية B للحركة الأمامية) ، والتي يتم تنظيمها بدورها بواسطة أربعة أزواج من الخلايا العصبية الداخلية التي تمتد عبر الحبل البطني (AVA و AVD للحركة الخلفية AVB و PVC للحركة الأمامية) [13]. تشكل الخلايا العصبية التي تعمل باللمس تقاطعات فجوة مع هذه العصبونات الداخلية لتنشيط الحركة بعيدًا عن محفز اللمس (الخلايا العصبية اللمسية الأمامية لـ AVD والخلفية للوصلات الثانوية PVC تتضمن الخلايا العصبية الداخلية الأخرى) [13]. لمنع التنشيط المتزامن لكل من الاستجابات الأمامية والخلفية ، تشكل الخلايا العصبية اللمسية الأمامية والخلفية أيضًا المشابك الجلوتاماتيكية المثبطة المفترضة مع الخلايا العصبية الداخلية التي يتم تنشيطها بواسطة الخلايا العصبية اللمسية الأخرى (الخلايا العصبية اللمسية الأمامية للـ PVC والخلفية مع AVD) [13 ، 47].

يبدو أن القوة النسبية للدارة الانعكاسية تتغير أثناء التطور كما يتضح من الاستجابة لضغط الصفيحة ، والذي ينتج محفزًا غير اتجاهي يُفترض أنه ينشط استجابة اللمس الأمامية والخلفية [93]. في اليرقة المبكرة ، C. ايليجانس responds to plate tap by either moving forward or reversing at equal frequencies, suggesting the head and tail-touch circuits display equal strength and sensitivity. However, older animals almost always reverse, pointing to a developmental preeminence of the anterior touch circuit that corresponds to the rise of the postembryonic touch receptor neurons AVM and PVM [18].

In addition to locomotion, touch sensed by the touch receptor neurons modulates feeding behaviors, egg laying, and defecation. C. ايليجانس slows upon encountering bacterial food, a texture-sensing behavior requiring the dopaminergic CEP, ADE, and PDE neurons [68]. The touch neurons synapse onto these neurons [13] and may override their signaling in preference of moving away from the touch stimulus [56]. Stimulating touch receptor neurons also suppresses pharyngeal pumping and head oscillations in foraging behavior. The mechanism for suppressing pharyngeal pumping is unknown, though the touch neurons form connections with PVR neurons that synapse onto neurons in the pharynx [13]. Suppression of head oscillations results from anterior touch stimulation of the AVD and AVA interneurons, which trigger RIM neurons to release tyramine that inhibits motor neurons and contraction of muscles radially surrounding the base of the head [1]. In both cases, the feeding behavior of the worm is suspended as touch avoidance becomes paramount. Touch stimulation also suppresses egg-laying behavior. Egg laying requires HSN neurons, which receive chemical synapses from PLM neurons that may inhibit their function [13]. Finally, touch stimulation also resets the defecation cycle of the animal [49], though no intermediate neural connections have been identified.


أساليب

Strains, genome sequencing, and transgenesis

C. ايليجانس strains were propagated as described 50 and N2 and TU2769 uIs31 [pMec17::GFP] were used as wild-type controls. A complete list of strains is presented in Supplementary Table 1. All experiments were performed with L4 or young adult hermaphrodites.

The molecular defect in unc-70(e524) و unc-70(n493) was determined by sequencing genomic DNA isolated from mixed staged worms (gDNA kit, Qiagen). In brief, the fragment corresponding to the unc-70 locus was amplified with long-range PCR with the primers MK16 and MK09R (Supplementary Table 2). A 9000-bp fragment was isolated and sequenced to reveal a single consistent nucleotide change apparent in each mutant: unc-70(e524) encodes G6024A and E2008K, while unc-70(n493) encodes T6132C and L2044P (Supplementary Fig. 1).

Young adult worms were injected with constructs of interest (25ng·μl 𢄡 or 10ng·μl 𢄡 ) together with a co-transformation marker (Pmyo-3::mCherry, Pmyo-2::mCherry, or Punc-122::RFP at 2� ng·μl 𢄡 ) and linearized N2 carrier DNA (50ng·μl 𢄡 ). At least three lines were subjected to initial analyses results from a single line are presented for clarity. UNC-70 isoforms were injected into unc-70(s1502)oxIs95 animals, which harbor a null allele of unc-70 and an integrated transgene that restores wild-type UNC-70 to the hypodermis 18 . Strains carrying stable arrays were crossed with N2 Bristol to create strains carrying the same array in both the unc-70(s1502) and N2 backgrounds. Transgenic expression of UNC-70(TSMod) in unc-70(s1502) mutants partially rescued locomotion and touch defects. Other transgenics were created in an N2 wild-type background.

Constructs for transgenic expression

Wild-type UNC-70

A plasmid encoding wild-type UNC-70 was built as follows. First, RNA was extracted from mixed stage worms (TRIZOL, Ambion RNA isolation kit), eluted in RNAse-free water, and used as template for RT-PCR (VILO cDNA kit, Invitrogen), which was conducted in the presence of RNAse inhibitor (Superrase, Ambion). unc-70 cDNA was isolated in two fragments: a 5′ 3200 bp fragment was amplified with primers MK16 and MK12R and 3′ 3600 bp fragment was amplified with primers MK13F and MK09R. The two fragments were joined using overlap extension PCR (Phusion polymerase, NEB) and blunt-cloned into a pCR Blunt sequencing vector (Invitrogen). Sequencing this product revealed that it corresponds to the major transcript encoded by unc-70, K11C4.3a, which is expressed in adult neurons, hypodermis and muscles 17, 18 .

The endogenous unc-70 promoter was isolated from genomic DNA using primer pair MK17, which contains a HindIII site and an SpeI site, and cloned into the pCR Blunt vector to create pCR:pUnc70. Both, pCR:pUnc70 and unc-70 cDNA were digested with HindIII and SpeI to create pCR:unc70E containing the endogenous promoter fused to the full-length unc-70 open reading frame. In a last step, un-54 3′UTR was inserted into pCR:unc70E and injected into unc-70(s1502)oxIs95 transgenic animals together with co-transformation marker, Pmyo-3::mCherry unc-70(s1502)oxIs95 mutant animals expressing full-length unc-70 cDNA showed a complete rescue of the uncoordinated (Unc) phenotype associated with unc-70 (not shown).

UNC-70(TSMod)

The tension sensor, TSMod 5 , was inserted into UNC-70 in between spectrin repeats 8 and 9, following residue 1166. This was accomplished with a four-way way Gateway ™ recombination strategy. The four entry clones contained: (1) unc-70 promoter, as described above (2) the N-terminal fragment of unc-70 (encoding residues 1-1166), (3) TSMod and (4) the C- terminal fragment of unc-70 (encoding residues 1167-2267) fused to the un-54 3′UTR. The fragments were amplified by PCR using primers 1𠄸 (Supplementary Table 2) and combined with the appropriate DONR vector in a standard BP reaction, yielding four Entry clones: pENTR Unc70P[1 5], pENTR ATG-R8[5 4], pENTR TSMod[4 3] and pENTR R9-TAA[3 2]. These clones were combined in a standard LR reaction overnight with pDEST14 (Invitrogen) yielding the assembled construct Punc-70::UNC-70(1 to 1166)::TSMod::UNC-70(1167 to 2267)::unc-54 3′ UTR, which was verified by sequencing.

High FRET (5aa), low FRET (TRAF), cytoTSMod, and N-TSMod

Constitutively high FRET and low FRET constructs were made by replacing the TSMod sensor in UNC-70 with mTFP-Venus FRET pair separated by a 5aa linker or a TRAF domain, respectively 35, 38 . Entry clones were made as described above, yielding pENTR TSMod5aa[4 3] and pENTR TSModTRAF[4 3].

Cytoplasmic TSMod (cytoTSMod) was isolated from pENTR TSMod[4 3] using the MK42 primer pair and cloned into pCR pUnc70E using the restriction sites Spe1 and Nsi1. ال unc-70 cDNA coding sequence in pCR pUnc70E was removed by cutting with Spe1 and Pst1-HF, leaving the unc-70 promoter and un-54 3′UTR in the backbone.

An N-terminal fusion of TSMod to UNC-70 was made as follows: TSMod was amplified by PCR using primers MK42F and MK43R flanked by SpeI and SalI restriction sites and inserted after the first 15 bp of unc-70 cDNA under the control of the endogenous unc-70 المروجين. The TSMod and unc-70 sequences were separated by a flexible linker consisting of five glycines.

Dominant-negative SPC-1 α spectrin

Single step RT-PCR was performed as described above using primer pair MK42 to amplify a cDNA encoding the first 170 residues of SPC-1 a spectrin, which contains spectrin domains 0 and 1 (Ref. 51). The resulting product was cloned into vector MG115 containing pMEC-17 52 and a C-terminal mCherry tag.

Dynamics of body and neuron curvature

Image collection

To image neuron dynamics in moving worms at high resolution ( Fig. 1 , ​ ,2 2 and Supplementary Fig. 2, 3), individual uIs31 [TRN::GFP] worms were mounted on 1𠄲% agarose pads, as described 53 . Worms were free to move without crawling out of the field of view, allowing diffraction-limited observation of neuron morphology. Still images and short movies (0.5 fps, about 75 s) were collected at 20x magnification on a Leica SP5. These movies were analyzed posthoc to derive the curvature of both the body and the AVM neuron, neuron length, إل, and neuron strain, Δإل/إل. At least 17 animals and an average of 6.9 still images were examined for each genotype.

Image analysis

Body curvature was calculated as follows: Using Fiji (Ref. 54), the ventral side of the animal was marked with 10� individual points between the terminal bulb of the pharynx and the nose. The coordinates were imported into IgorPro (Wavemetrics) to calculate curvature according to:

Where, x′ و x″ are the first and second derivative of the projection in x و ذ على التوالى. When the animal bends toward its ventral (dorsal) side, curvature is positive (negative). Body curvature was used together with a model of body deformation (Supplementary Information) to calculate body strain ( Fig. 1c ).

Neuron (AVM) curvature was measured by modifying the strategy for body curvature to account for bucking observed during ventral flexures in unc-70 المسوخ. The neurite was traced with 20� points distributed along a

100 μm segment centered at the nerve ring and the curvature at each point was calculated. The mean±standard deviation (SD) of these curvatures yielded one data point ( Fig. 2b , Supplementary Fig. 3b). The standard deviation of the neuron curvature in each frame was calculated as a running average of 20 frames and plotted against body curvature ( Fig. 2b , Supplementary Fig. 2b, S3b).

Neuron length, إل, was determined by tracing the anterior branch of AVM from the nerve ring to the nose. This path was imported into IgorPro and the length and curvature of that path was calculated for several consecutive images in a stack. Neuron length was normalized to yield the effective strain, (إلإل0)/إل0، مع إل as the instantaneous neuron length and إل0 is the length as zero curvature, which was determined by fitting a line to the raw data (إل(ج) = L0 +χ୼) and estimated from the fit parameters according to إل(0) = L0. The slope, Χ, is a measure of the compliance (inverse of the stress) of the neuron.

Dynamic AFM force spectroscopy

Primary cell culture

Touch receptor neurons were isolated from wild-type (TU2769 uIs31) and mutant animals using standard protocols 55 and plated onto peanut lectin-coated glass bottom Petri dishes (WillCo). Mixed cultures of embryonic cells were grown for up to 7 days in L-15 medium supplemented with heat-inactivated fetal calf serum (10% v/v), penicillin (10mg mL 𢄡 ), and streptomycin (100 units). Individual TRNs were visualized by their expression of GFP ( Fig. 3a ).

AFM force spectroscopy

We used an AFM designed for cell measurements (Bruker BioScope Catalyst, generous loan of Stephen Minne, Andrea Slade and James Shaw, BrukerNano) mounted on a Nikon Eclipse 2000 equipped for epifluorescence to perform AFM force spectroscopy as described 56 . Cantilevers (Olympus Biolever, 6mN m 𢄡 ) were coated overnight with peanut lectin (1 mg/mL) in MES buffer (pH 6.0, 50 mM) and calibrated according to a thermal noise method 57 .

Individual TRNs were identified by GFP fluorescence and positioned under a cantilever, which was used to pull membrane nanotubes after 100� ms contact time and 400 pN contact force. Interaction frequency was adjusted so that

20% of all cell-cantilever contacts yielded a nanotube event, a maneuver that ensures that only single tether events were analyzed. Pulling velocity was changed randomly to decrease history effect. No history effect was observed. The number of cells analyzed for each genotype and condition is given in Supplementary Table S3. Force-distance curves were analyzed using a step fitting algorithm 56 . Mean tether force was plotted against extrusion velocity and fit to a recently proposed model 30 to estimate the static force, F0, which was used to estimate tension according to f 0 = 2 π 2 κ ( T m + W 0 ) 29, 30 , where تيم is the in-plane membrane tension and دبليو0 is the bilayer-cytoskeleton adhesion energy, and κ is the bending rigidity. The bending rigidity was assumed to be 2.7 · 10 � Nm (Ref. 29). Log-log transformed data was used to perform linear regression followed by Tukey-type test on multiple regressions in order to assess statistical significance as a function of genotype. Logarithmically transformed data was well fit by a line with slope 1/3 (not shown) as predicted by the power law 30 . The p-value is shown in Fig. 3 for individual comparisons under the hypothesis that the elevation of the line is the same. Latrunculin A (1μM) and Cytochalasin D (2μM) were applied to cells, treated TRNs were analyzed by dynamic AFM force spectroscopy and compared to data drawn from untreated neurons analyzed on the same day.

في الجسم الحي laser axotomy and analysis of neurite retraction

Young adult wild type and mutant worms were immobilized in a drug-free manner using a 5% agar pad, as described 53 . All strains used for these experiments ( Fig. 4 , Supplementary Fig. 4) contained the uIs31 transgene to drive GFP expression in the TRNs. Immobilized worms were placed on the stage of a laser scanning confocal microscope equipped with two, pulsed Ti::Sa lasers (Prairie Technologies). One laser was used for imaging and the other for axotomy. Both lasers have an average power of 2.7 W (at 860 nm), 190 fs pulse width and a repetition rate of 80MHz. The ablation laser was tuned to 720 nm and GFP imaging was performed at 920nm. The energy per pulse of the ablation laser was attenuated to

2 nJ and a pulse train of

2 ms was delivered into the sample through a 60x, 0.9 NA water immersion objective. In order to achieve a focused spot at the sample plane, the ablation laser beam was expanded to fill the back aperture of the microscope lens.

To quantify the evolution of the gap-width vs time, kymographs were binarized, denoised and outlined in Fiji. Measurement of the distance of the two neuronal ends from the outlined image was performed in IgorPro. The time evolution of the resulting gap width was fitted to a single exponential as described 33 .

في الجسم الحي FRET imaging and analysis

Image collection

Young adult worms were immobilized without drugs on a 5% agarpad, as described 53 and imaged with a 63x/1.32 oil immersion lens on a confocal microscope equipped with an Ar ion laser and avalanche photodiode detectors coupled to an upright microscope equipped for epifluorescence illumination (Leica SP5 II, Leica DM6000). Donor (mTFP) and acceptor (Venus) fluorophores were activated with the 458nm and 514nm laser lines, respectively and collected with photodiode detectors tuned to 465�nm and 520�nm, respectively. Detector collection efficiency and linearity was determined by imaging dilute, homogenous FITC solutions (0.001�%, in logarithmic increments) and based on this measurement the gain on the donor and acceptor sensors were adjusted to 150% and 100% to equalize detection efficiency & # x003c6د/& # x003c6أ. Exact values were determined based on the counts at a given ROI for these settings. Bleed-through factors were determined by imaging transgenic worms with an intact donor (GN495) or acceptor (GN498) fluorophore prior to each imaging session and were 0.37ଐ.05 for the donor channel and 0.17ଐ.07 for the acceptor channel.

Three image types were collected for each neurite: 1) acceptor excitation-acceptor emission (أناأ) 2) donor excitation-donor emission (أناد) 3) donor excitation-acceptor emission (أناF). Portions of the ALM and PLM neurites were identified for imaging based on animal orientation and morphology other neuronal ROIs included neurites arranged parallel to the long axis of the worm’s body.

Image analysis and estimation of FRET efficiency by sensitized emission

For each micrograph, intensity profiles were computed across the diameter of the neurite of interest and fit by a Gaussian to estimate the background intensity, neurite width, and centerline position. The latter information (width, centerline) was used to determine the relevant ROI for subsequent processing. This process was applied to all images to yield the data required to estimate FRET efficiency by sensitized emission following a linear correction for spectral bleed-through. The FRET efficiency, ه was computed on a pixel-by-pixel basis according to:

Where, cF و qD are the bleedthrough-corrected values for the FRET and donor channels, respectively, سد is the quantum yield of the donor chromophore 38 , and ψدأ is the ratio of the collection efficiencies of the donor and acceptor emission sensors. The uncertainty of each pixel was estimated as described 58 and pixels with errors 𾔀% were rejected from analysis the remaining pixels were averaged to yield an average ه for each ROI.

To better understand the accuracy of this sensitized emission technique, we also performed fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on the same transgenic animals as described 38 . Briefly, worms were immobilized as described and imaged with an SP5 confocal system equipped with a Becker&Hickl SPC-150 module for time-correlated photon counting. Photons were accumulated for up to 150 frames using a 20x oil immersion lens and υ% transmission of a pulsed Ti::Sa laser at 870nm through a 475/28nm emission bandpass filter.

Fluorescence lifetime histogram was fitted using a double exponential decay function, convolved with a synthetic IRF, to extract the amplitude weighted mean of the two components of the excited state lifetime. The lifetime of the donor by itself (in absence of the acceptor) was measured using mTFP transfected MDCK cells. FRET efficiency was calculated according to E = 1 - τ D A τ D D in which τDA is the lifetime of the donor in presence of the acceptor and τDD is the lifetime of the donor alone. These independent estimates of FRET efficiency yielded essentially identical values for all TSMod isoforms tested (Supplementary Fig. 6). Moreover, FRET efficiency values for the low FRET (TRAF) and high FRET (5aa) UNC-70 isoforms are similar to published values derived from في المختبر measurements of mTFP-TRAF-Venus and mTFP-5aa-Venus 35 .

FRET imaging following laser axotomy

Transgenic animals expressing UNC-70(TSMod) and UNC-70(TRAF) were immobilized on the stage of the Leica SP5 imaging station and TRNs were axotomized with a pulsed Ti::Sa laser (2.7W, 860nm) using 70% transmission and were ablated by scanning over a 1024휲 pixel ROI for 200ms and allowed to retract for

5 s before imaging the proximal end, as described above. A final image was taken to calculate FRET after cutting.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)

Transgenic animals were immobilized on agarose pads, as described 53 and placed on the stage of confocal microscope. UNC-70(TSMod) was analyzed with a Leica SP5 II and a 63x/1.3 oil immersion lens. Under the control of FRAP Wizard software, a short segment (2𠄴 μm long) of a TSMod-expressing neurite was illuminated at full power for 1.5s at 458nm and 514nm. The same region of interest (ROI) was subsequently imaged for 10 frames at 0.6 fps and 20 frames at 0.1 fps, exciting the Venus fluorophore. This system lacked the temporal resolution needed to analyze rapid recovery of cytosplasmic cytoTSMod. Therefore, a Prairie Technologies dual 2-photon microscope was used to image and bleach the neurite of cytoTSMod simultaneously using 920nm excitation with a 60x/0.9 water immersion lens. A line scan of

10�μm in length was imaged at 1000 fps for 1s to image the recovery process. Image stacks were analyzed to plot intensity ضد. time and fitted with to D = ln ( 2 ) ω 2 τ 59 .

Immunofluorescence

Animals were fixed and subjected to antibody labeling as described 4 . Fixed animals were treated with anti-myotactin antibodies (MH46, Developmental Studies Hybridoma Bank) at 1:50 dilution in B-PBST (PBS + 0.1% Triton-X100 + 3% BSA), incubated overnight at 4ଌ, and washed several times in B-PBST. Next, samples were treated with an anti-mouse secondary antibody (Alexa567-tagged, 1:2000, LifeTechnologies) overnight, washed in B-PBST, and mounted in VectorShield, cured for several hours (4ଌ), and imaged in a Leica SP5 confocal system. Interpunctum interval (IPI) was determined from intensity profiles, as described 60 . The binsize for IPI histograms was calculated according to Freedman-Diaconis rule: width=3.49ن 0.3 , where ن is the number of observations. Histograms were normalized to yield a probability density function, which were fit by a Gamma-distribution.

Statistical and computational analysis

Unless indicated, computations and statistical analyses were performed using IgorPro 6.04 (Wavemetrics) and image analysis was performed with NIH ImageJ or Fiji software 54 .


شاهد الفيديو: C. elegans under the Microscope (شهر فبراير 2023).