معلومة

ما المجالات أو الأشكال القادرة على الارتباط بكل من DNA و RNA؟

ما المجالات أو الأشكال القادرة على الارتباط بكل من DNA و RNA؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

مجالات أو أشكال عوامل النسخ نشطة بشكل تحفيزي لربطها بالحمض النووي من أي نوع. أين يمكنني أن أجد قائمة بالمجالات أو الأشكال القادرة على الارتباط بكل من DNA و RNA؟ على سبيل المثال ، ترتبط مجالات KH إما بـ RNA أو DNA أحادي السلسلة.


بريون

البريونات هي بروتينات مشوهة ولديها القدرة على نقل شكلها المشوه إلى متغيرات طبيعية من نفس البروتين. إنها تميز العديد من الأمراض التنكسية العصبية المميتة والقابلة للانتقال لدى البشر والعديد من الحيوانات الأخرى. [3] ليس معروفًا سبب اختلال البروتين الطبيعي ، ولكن يُشتبه في أن الهيكل غير الطبيعي ثلاثي الأبعاد يمنح خصائص معدية ، مما يؤدي إلى انهيار جزيئات البروتين القريبة في نفس الشكل. الكلمة بريون مشتق من "الجسيمات المعدية البروتينية". [4] [5] [6] الدور المفترض للبروتين كعامل معدي يقف على النقيض من جميع العوامل المعدية الأخرى المعروفة مثل أشباه الفيروسات والفيروسات والبكتيريا والفطريات والطفيليات ، وكلها تحتوي على أحماض نووية (DNA ، RNA أو كليهما).

يُفترض أن الأشكال الإسفنجية البريونية لبروتين البريون (PrP) ، التي تكون وظيفتها المحددة غير مؤكدة ، هي سبب الاعتلال الدماغي الإسفنجي القابل للانتقال (TSEs) ، [7] بما في ذلك سكرابي في الأغنام ، ومرض الهزال المزمن (CWD) في الغزلان ، والاعتلال الدماغي الإسفنجي البقري ( مرض جنون البقر (BSE) في الأبقار (المعروف باسم "مرض جنون البقر") ومرض كروتزفيلد جاكوب (CJD) في البشر. تؤثر جميع أمراض البريون المعروفة في الثدييات على بنية الدماغ أو الأنسجة العصبية الأخرى كلها تقدمية ، وليس لها علاج فعال معروف ، ودائمًا ما تكون قاتلة. [8] حتى عام 2015 ، كان يُنظر إلى جميع أمراض البريون المعروفة في الثدييات على أنها ناتجة عن بروتين البريون (PrP) ، ولكن في عام 2015 ، تم افتراض أن الضمور الجهازي المتعدد (MSA) ناتج عن شكل بريون من ألفا سينوكلين. [9]

تشكل البريونات تجمعات غير طبيعية من البروتينات تسمى الأميلويد ، والتي تتراكم في الأنسجة المصابة وترتبط بتلف الأنسجة وموت الخلايا. [10] الأميلويد مسؤول أيضًا عن العديد من الأمراض العصبية التنكسية الأخرى مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون. [11] [12] تجمعات البريون مستقرة ، وهذا الاستقرار الهيكلي يعني أن البريونات تقاوم التمسخ بواسطة العوامل الكيميائية والفيزيائية: لا يمكن تدميرها بالتطهير العادي أو الطهي. وهذا يجعل التخلص من هذه الجسيمات واحتوائها أمرًا صعبًا.

مرض البريون هو نوع من البروتيوباثي ، أو مرض يصيب البروتينات الشاذة بنيوياً. في البشر ، يُعتقد أن البريونات هي سبب مرض كروتزفيلد جاكوب (CJD) ، ومتغيره (vCJD) ، ومتلازمة جيرستمان-ستراوسلر-شينكر (GSS) ، والأرق العائلي المميت (FFI) ، والكورو. [4] هناك أيضًا دليل يشير إلى أن البريونات قد تلعب دورًا في عملية مرض الزهايمر ، ومرض باركنسون ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS). أمراض تشبه البريون. [13] [14] [15] [16] تم تحديد العديد من بروتينات الخميرة على أنها ذات خصائص أولية. [17] [18] يخضع تكاثر البريون للاندماج والانتقاء الطبيعي تمامًا كما هو الحال بالنسبة للأشكال الأخرى من النسخ المتماثل ، ويختلف هيكلها اختلافًا طفيفًا بين الأنواع. [19]


محتويات

تم اكتشاف RdRps الفيروسي في أوائل الستينيات من الدراسات التي أجريت على فيروس الطحالب وفيروس شلل الأطفال عندما لوحظ أن هذه الفيروسات لم تكن حساسة للأكتينوميسين D ، وهو دواء يثبط تخليق الحمض النووي الريبي الخلوي الموجه للحمض النووي الريبي. يشير هذا النقص في الحساسية إلى وجود إنزيم خاص بالفيروس يمكنه نسخ الحمض النووي الريبي من قالب الحمض النووي الريبي وليس من قالب الحمض النووي.

يتم حفظ RdRps بشكل كبير في جميع الفيروسات وحتى أنها مرتبطة بالتيلوميراز ، على الرغم من أن السبب في ذلك هو سؤال مستمر اعتبارًا من عام 2009. [3] أدى التشابه إلى تكهنات بأن RdRps الفيروسي هو أسلاف التيلوميراز البشري.

أشهر مثال على RdRp هو فيروس شلل الأطفال. يتكون الجينوم الفيروسي من الحمض النووي الريبي ، الذي يدخل الخلية من خلال الالتقام الخلوي بوساطة مستقبلات. من هناك ، يكون الحمض النووي الريبي (RNA) قادرًا على العمل كقالب لتخليق الحمض النووي الريبي التكميلي على الفور. عندئذٍ ، يكون الشريط التكميلي ، في حد ذاته ، قادرًا على العمل كقالب لإنتاج جينومات فيروسية جديدة يتم تعبئتها بشكل أكبر وإطلاقها من الخلية الجاهزة لإصابة المزيد من الخلايا المضيفة. ميزة هذه الطريقة في التكرار هي أنه لا يوجد تكرار لمرحلة الحمض النووي يكون سريعًا وسهلاً. العيب هو أنه لا توجد نسخة احتياطية من الحمض النووي.

ترتبط العديد من RdRps ارتباطًا وثيقًا بالأغشية ، وبالتالي يصعب دراستها. وأشهر أنواع الـ RdRps هي فيروس 3Dpol الفيروسي ، وفيروس التهاب الفم الحويصلي L ، [4] وبروتين NS5B لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي.

تمتلك العديد من حقيقيات النوى أيضًا RdRps متورطًا في تداخل الحمض النووي الريبي ، مما يؤدي إلى تضخيم microRNAs و RNA زمني صغير وإنتاج RNA مزدوج الشريطة باستخدام RNAs صغيرة متداخلة كالبادئات. [5] في الواقع ، يمكن لفيروسات الحمض النووي الريبي أن تغتصب هذه الطرق التي تستخدم في آليات الدفاع لمصلحتها. [6] تمت مراجعة تاريخهم التطوري. [7]

يختلف RdRp عن بوليميراز RNA لأنه يعمل على تحفيز تخليق خيط RNA مكمل لقالب RNA معين ، بدلاً من استخدام قالب DNA. عملية تكرار الحمض النووي الريبي هي آلية من أربع خطوات ، كما هو موصوف.

  1. ربط النوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات (NTP) - في البداية ، يقدم RdRp موقعًا نشطًا شاغرًا يرتبط به NTP. يؤدي ربط NTP الصحيح إلى خضوع RdRp لتغيير توافقي. [8]
  2. الإغلاق النشط للموقع - التغيير المطابق الذي بدأه ربط NTP الصحيح ، ينتج عنه تقييد الوصول النشط للموقع وينتج حالة مؤهلة تحفيزيًا. [8]
  3. تكوين رابطة الفوسفوديستر - يوجد اثنان من أيونات Mg 2+ في الحالة النشطة التحفيزية وترتب نفسها بطريقة حول التمهيدي RNA بحيث يكون الركيزة NTP قادرة على الخضوع لنقل الفوسفاتيديل وتشكيل رابطة phosphodiester مع سلسلة النيوكليوتيدات الحالية. [9] باستخدام هذه الأيونات Mg 2+ ، لم يعد الموقع النشط يحتوي على الاستقرار التحفيزي ويتغير مجمع RdRp إلى شكل مفتوح. [9]
  4. النقل - بمجرد فتح الموقع النشط ، يكون شريط الحمض النووي الريبي قادرًا على التحرك من خلال مجمع بروتين RdRp وربط NTP جديد ومواصلة استطالة السلسلة ، ما لم ينص القالب على خلاف ذلك. [8]

يمكن إجراء تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق مادة أولية مستقلة (من جديد) أو آلية تعتمد على التمهيدي تستخدم التمهيدي المرتبط بالبروتين الفيروسي (VPg). [10] إن من جديد يتكون البدء في إضافة نيوكليوزيد ثلاثي الفوسفات (NTP) إلى 3'-OH من أول NTP البادئ. [10] خلال ما يسمى بمرحلة الاستطالة التالية ، يتكرر تفاعل نقل النيوكليوتيديل هذا مع NTPs اللاحقة لتوليد منتج الحمض النووي الريبي التكميلي. إنهاء سلسلة الحمض النووي الريبي الوليدة التي تنتجها RdRp غير معروف تمامًا ، ومع ذلك ، فقد ثبت أن إنهاء RdRp مستقل عن التسلسل. [11]

أحد العوائق الرئيسية لتكرار بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي هو معدل الخطأ الهائل أثناء النسخ. [10] من المعروف أن RdRps يفتقر إلى الدقة في حدود 10 4 نيوكليوتيدات ، والذي يُعتقد أنه نتيجة مباشرة لقدراته غير الكافية على التدقيق اللغوي. [10] يُفضل هذا المعدل المرتفع من التباين في الجينومات الفيروسية لأنه يسمح للممرض بالتغلب على الدفاعات التي طورها المضيفون الذين يحاولون تجنب العدوى التي تسمح بالنمو التطوري.

تستخدم بوليميرات الحمض النووي الريبي الموجهة الفيروسي / بدائية النواة ، جنبًا إلى جنب مع العديد من البوليميرات أحادية الخلية الموجهة من الحمض النووي ، ثنية تم ربط تنظيمها بشكل اليد اليمنى بثلاثة نطاقات فرعية تسمى الأصابع والنخيل والإبهام. [12] يتم حفظ النطاق الفرعي للنخيل فقط بشكل جيد بين جميع هذه الإنزيمات ، ويتكون من أربعة شرائح بيتا مضادة للتوازي مع حلزوني ألفا. في RdRp ، يتكون المجال الفرعي للنخيل من ثلاثة أشكال محفوظة جيدًا (A و B و C). يتم وضع الحافز A (D-x (4،5) -D) والعنصر C (GDD) جنبًا إلى جنب مكانيًا مع وجود بقايا حمض الأسبارتيك لهذه الأشكال في ربط Mg 2+ و / أو Mn 2+. تشارك بقايا الأسباراجين في النموذج B في اختيار ثلاثي فوسفات الريبونوكليوزيد على dNTPs ، وبالتالي ، يحدد ما إذا كان الحمض النووي الريبي (RNA) بدلاً من الحمض النووي (DNA) قد تم تصنيعه. [13] يتم الحفاظ على تنظيم المجال [14] والبنية ثلاثية الأبعاد للمركز التحفيزي لمجموعة واسعة من RdRps ، حتى تلك ذات تسلسل إجمالي متماثل منخفض. يتكون المركز التحفيزي من عدة أشكال تحتوي على عدد من بقايا الأحماض الأمينية المحفوظة.

يتطلب تداخل الحمض النووي الريبي حقيقيات النوى بوليميريز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي الخلوي (c RdRp). على عكس البوليمرات "اليدوية" ، فإنها تشبه بوليميراز RNA المبسط متعدد الوحدات المعتمد على الحمض النووي (DdRPs) ، وتحديداً في الوحدات الفرعية الحفزية β / β ، من حيث أنها تستخدم مجموعتين من براميل psi المزدوجة في الموقع النشط. QDE1 (Q9Y7G6) في نيوروسبورا كراسا، الذي يحتوي على كلا البراملين في نفس السلسلة ، [15] مثال على مثل هذا الإنزيم. [16] متماثلات البكتيريا ، بما في ذلك DdRp yonO (O31945) ذات السلسلة المفردة ، تبدو أقرب إلى c RdRps من DdRPs. [5] [17]

هناك 4 عائلات فائقة من الفيروسات تغطي جميع الفيروسات المحتوية على الحمض النووي الريبي بدون مرحلة الحمض النووي:

  • الفيروسات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الموجب الشريط أو الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة ، باستثناء الفيروسات القهقرية و Birnaviridae
    • جميع فيروسات الحمض النووي الريبي (RNA) حقيقية النواة الموجبة مع عدم وجود مرحلة الحمض النووي
    • جميع العاثيات المحتوية على الحمض النووي الريبي هناك عائلتان من عاثيات البكتيريا المحتوية على الحمض النووي الريبي: Leviviridae (فجوات سرنا موجبة) و Cystoviridae (العاثيات dsRNA)
    • عائلة فيروس dsRNA Reoviridae, Totiviridae, Hypoviridae, Partitiviridae

    يشبه نسخ الحمض النووي الريبي [ كيف؟ ] ولكن ليس مثل تكرار الحمض النووي.

    تنتج فيروسات Flavivirus بروتينًا متعددًا من جينوم ssRNA. ينقسم البوليبروتين إلى عدد من المنتجات ، أحدها NS5 ، بوليميريز RNA المعتمد على الحمض النووي الريبي. يمتلك بوليميراز RNA الموجه من RNA عددًا من المناطق القصيرة والزخارف المتماثلة مع بوليميرات RNA الأخرى الموجهة من RNA. [18]

    إن تكاثر الحمض النووي الريبي الموجود في فيروسات الحمض الريبي النووي الريبوزي الموجب مرتبطة ببعضها البعض ، وتشكل ثلاث عائلات كبيرة. [19] يعتبر Birnaviral RNA replicase فريدًا من حيث أنه يفتقر إلى الشكل C (GDD) في راحة اليد. [20] تم تصنيف RdRp أحادي الطور (PDB 5A22) تلقائيًا على أنه مشابه لـ (+) - ssRNA RdRps ، وبالتحديد واحد من بيستيفيروس وواحد من Leviviridae. [21] يشبه مونومر Bunyaviral RdRp (PDB 5AMQ) المركب غير المتجانس لـ Orthomyxoviral (Influenza PDB 4WSB) RdRp. [22]

    نظرًا لأنه بروتين عالمي للفيروسات المحتوية على الحمض النووي الريبي ، يعد RdRp علامة مفيدة لفهم تطورها. [23] تمت مراجعة التطور الهيكلي الشامل لـ RdRps الفيروسي. [24]

    تحرير إعادة التركيب

    عند تكرار جينوم الحمض النووي الريبي (+) الخاص به ، يكون فيروس شلل الأطفال RdRp قادرًا على إجراء إعادة التركيب. يبدو أن إعادة التركيب تحدث من خلال آلية اختيار النسخ التي يقوم فيها RdRp بتبديل قوالب ssRNA (+) أثناء توليف الجدائل السلبية. [25] يتم تحديد تردد إعادة التركيب جزئيًا بواسطة دقة تكرار RdRp. [26] تُظهر متغيرات RdRp ذات الدقة العالية في النسخ المتماثل انخفاضًا في إعادة التركيب ، وتعرض RdRps منخفض الدقة إعادة تركيب متزايدة. [26] تحدث أيضًا إعادة التركيب عن طريق تبديل حبال RdRp بشكل متكرر أثناء التكرار في (+) فيروسات carmoviruses وفيروسات tombusvirus في نبات ssRNA. [27]

    تحرير التكامل داخل الجين

    فيروس سينداي (عائلة الفيروسات المخاطية) يحتوي على جينوم RNA خطي واحد تقطعت به السبل غير مقسم. يتكون RdRp الفيروسي من وحدتين فرعيتين مشفرتين بالفيروس ، واحدة أصغر P وأخرى أكبر L. عند وجود طفرات مختلفة غير نشطة في RdRp مع عيوب على طول الوحدة الفرعية L حيث تم اختبارها في مجموعات زوجية ، لوحظ استعادة تخليق الحمض النووي الريبي الفيروسي في بعض مجموعات. [28] يشار إلى هذا التفاعل الإيجابي L-L على أنه مكمل داخل الجين ويشير إلى أن البروتين L عبارة عن أوليغومر في مركب بوليميراز الحمض النووي الريبي الفيروسي.

    يمكن استخدام RdRps كأهداف دوائية لمسببات الأمراض الفيروسية لأن وظيفتها ليست ضرورية للبقاء على قيد الحياة حقيقية النواة. عن طريق تثبيط وظيفة بوليميراز RNA المعتمدة على RNA ، لا يمكن تكرار RNAs الجديدة من حبلا قالب RNA ، ومع ذلك ، فإن RNA polymerase المعتمد على الحمض النووي سيظل وظيفيًا.

    توجد حاليًا أدوية مضادة للفيروسات ضد التهاب الكبد C و COVID-19 تستهدف على وجه التحديد RdRp. وتشمل هذه الأدوية سوفوسبوفير وريبافيرين ضد التهاب الكبد الوبائي سي [29] وريمديسيفير ، الدواء الوحيد المعتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لمكافحة COVID-19.

    GS-441524 ثلاثي الفوسفات ، عبارة عن ركيزة لـ RdRp ، ولكن ليس بوليميراز الثدييات. يؤدي إلى إنهاء السلسلة المبكرة وتثبيط تكاثر الفيروس. GS-441524 ثلاثي الفوسفات هو الشكل النشط بيولوجيًا لعقار الفوسفات المؤيد ، Remdesivir. تم تصنيف Remdesivir على أنه نظير نيوكليوتيد حيث يعمل على تثبيط وظيفة RdRp عن طريق الارتباط التساهمي مع إنهاء RNA الناشئ ومقاطعةه من خلال الإنهاء المبكر أو المتأخر أو منع المزيد من استطالة RNA polynucleotide. [30] [31] يؤدي هذا الإنهاء المبكر إلى عدم عمل الحمض النووي الريبي الذي يتحلل من خلال العمليات الخلوية العادية.

    يلعب استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي دورًا رئيسيًا في تداخل الحمض النووي الريبي في حقيقيات النوى ، وهي عملية تستخدم لإسكات التعبير الجيني عن طريق ارتباط الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNAs) بالـ mRNA مما يجعلها غير نشطة. [32] حقيقيات النوى يصبح RdRp نشطًا في وجود الرنا المزدوج الجديلة ، ومع ذلك ، فإن RdRp موجود فقط في مجموعة فرعية مختارة من حقيقيات النوى ، بما في ذلك C. ايليجانس و P. tetraurelia. [33] يؤدي وجود الرنا المزدوج الجديلة dsRNA إلى تنشيط عمليات RdRp و RNAi عن طريق بدء بدء نسخ الحمض النووي الريبي من خلال إدخال siRNAs في النظام. [33] في C. ايليجانس، يتم دمج siRNAs في مجمع الإسكات الناجم عن RNA ، RISC ، والذي يعمل جنبًا إلى جنب مع mRNAs المستهدفة للتدخل لتجنيد المزيد من RdRps لتجميع المزيد من siRNAs الثانوية وقمع التعبير الجيني. [34]


    أساليب

    تمت دراسة أنظمة ssDNA-ssDBPs و ssRNA-ssRBPs

    لتحليل شامل لمجموعة متنوعة من التفاعلات بين البروتينات والأحماض النووية أحادية السلسلة ، درسنا 12 مجمعًا: ستة مجمعات ssDNA-ssDBP وستة مجمعات ssRNA-ssRBP معروفة هياكلها ثلاثية الأبعاد (ملخصة في الجدول 1). تشتمل مجموعات معقدات البروتين - الدنا والبروتين - الرنا على بروتينات لها وظائف مختلفة ، مع طيات بأحجام مختلفة ، ومع ssDNA / ssRNA غير المتجانسة لها أطوال وتسلسلات مختلفة. تنتمي البروتينات الموجودة في مجمعات ssDNA-ssDBP هذه إلى مجالات هيكلية مختلفة: طية ربط قليل النوكليوتيد / قليل السكاريد (OB) ومجال التعرف على الحمض النووي الريبي (RRM) ومجال التماثل K (KH). نلاحظ أن المجمعات الأربعة ذات الطيات OB تختلف في هياكلها (أنا.ه. ، طول البروتين) والمتواليات. وبالمثل ، تم اختيار مجمعات ssRNA-ssRBP الستة أيضًا لتغطية المجالات الهيكلية المختلفة ، وهي OB-fold ، و RRM ، و PUF domain ، و zinc-finger domain ، و RAMP protein ، و Fab. بشكل عام ، قمنا بتغطية طيات مختلفة حيث تختلف مساهمات طاقة التكديس الكهروستاتيكية والعطرية من جزء طاقة تكديس عالي جدًا (طية OB) إلى جزء طاقة إلكتروستاتيكي مرتفع (مجال KH و RAMP). انطلاقا من الهياكل المتاحة للمجمعات الـ 12 التي تمت دراستها هنا واستنادا إلى الهياكل المتاحة غير المقيدة ، يبدو من غير المحتمل أن تخضع البروتينات لتغييرات توافقية كبيرة من أجل ربط روابط ssDNA / ssRNA الخاصة بها. جزيئات ssDNA و ssRNA أكثر مرونة في المحلول من البروتينات المطوية. وفقًا لذلك ، يمكن للمرء أن يستنتج أن أسطح الربط في ssDBPs و ssRBPs محددة مسبقًا ، ويحدث تغيير توافقي كبير لـ ssDNA / ssRNA فقط.


    العنوان: استهداف الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي بواسطة CRISPR-Cas9

    يعد ربط وانقسام الحمض النووي المزدوج (dsDNA) بواسطة Cas9 سمة مميزة للنوع الثاني من المناعة التكيفية للبكتيريا CRISPR-Cas. يُعتقد أن جميع إنزيمات Cas9 المعروفة تتعرف على الحمض النووي حصريًا كركيزة طبيعية ، مما يوفر الحماية ضد عاثيات الحمض النووي والبلازميدات. هنا ، نوضح أن إنزيمات Cas9 من كلا النوعين الفرعيين II-A و II-C يمكنها التعرف على الحمض النووي الريبي أحادي الجديلة (ssRNA) وشقّه بواسطة آلية موجهة من RNA مستقلة عن تسلسل عزر مجاور (PAM) في الهدف. RNA. انقسام الحمض النووي الريبي الموجه من الحمض النووي الريبي قابل للبرمجة ومخصص للموقع ، ونجد أنه يمكن استغلال هذا النشاط لتقليل العدوى بواسطة فجوة الحمض النووي الريبي أحادية الشريطة في الجسم الحي. نوضح أيضًا أن Cas9 يمكنه توجيه القمع المستقل لـ PAM للتعبير الجيني في البكتيريا. في الختام ، تشير هذه النتائج إلى أن مجموعة فرعية من إنزيمات Cas9 لديها القدرة على العمل على كل من تسلسل هدف DNA و RNA ، وتشير إلى إمكانية استخدامها في تطبيقات استهداف RNA القابلة للبرمجة.


    RG-rich يكرر - سكين الجيش السويسري لتفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي

    يتكون نموذج ربط الحمض النووي الريبي المضطرب الشائع في RBPs من تكرار الأرجينين والجليسين ، تسمى صناديق RGG أو تكرارات GAR. هذه التسلسلات غير متجانسة من حيث عدد التكرارات والتباعد بينها. قسم تحليل حديث هذه المناطق الغنية بـ RG إلى مربعات ثنائية وثلاثية RG و -RGG ، وحدد حالات لمثل هذه التكرارات بترتيب العشرات (di- و tri-RGG) إلى مئات (tri-RG) وما يقرب من ألفي (di-RG) بروتينات [47]. يتم إثراء البروتينات التي تحتوي على مثل هذه التكرارات في وظائف التمثيل الغذائي للحمض النووي الريبي [47]. ومع ذلك ، ليس من الواضح حاليًا ما إذا كانت معماريات التكرار المختلفة توفر توقيعات وظيفية مميزة.

    تم تحديد صندوق RGG لأول مرة في بروتين البروتين النووي غير المتجانس U (hnRNP-U ، المعروف أيضًا باسم SAF-A) كمنطقة كافية ومطلوبة لربط الحمض النووي الريبي (الجدول 1 ، الشكل 1). يفتقر hnRNP-U إلى RBDs الكنسي ، ولكنه يحتوي على مجال SAP شبه منظم يشارك في ربط الحمض النووي [48-50]. تم العثور على hnRNP-U لاستهداف المئات من RNAs غير المشفرة ، بما في ذلك RNAs النووية الصغيرة (sn) المشاركة في الربط RNA ، وعدد من RNAs الطويلة غير المشفرة (lnc) ، بطريقة تعتمد على RGG-box [51 ]. تفاعل RGG بوساطة من hnRNP-U مع lncRNAs Xist [52] و PANDA [53] قد تورط في التنظيم اللاجيني.

    يلعب ارتباط RNA بوساطة RG [G] أيضًا دورًا في تصدير الحمض النووي الريبي النووي ، كما يتضح من عامل تصدير الحمض النووي الريبي النووي 1 (NXF1). بينما يحتوي NXF1 على RRM قادر على ربط RNA [54] ، تُعزى معظم سعة ربط RNA في الجسم الحي إلى المنطقة الطرفية N المحتوية على RGG [55] (الجدول 1). تلعب الأرجينينات في هذا النموذج دورًا رئيسيًا في التفاعل مع الحمض النووي الريبي ، والذي ثبت أنه مستقل عن التسلسل ولكنه ضروري لتصدير الحمض النووي الريبي [55]. تقارب NXF1 الإجمالي لـ RNA منخفض [55 ، 56] ، ويتطلب التعاون مع محول التصدير ALY / REF [57]. تحمل ALY / REF أيضًا منطقة N-terminal مضطربة غنية بالأرجينين تشبه صندوق RGG [57] وتتوسط كلاً من ارتباط RNA [54 ، 58 ، 59] والتفاعل مع NXF1 [60]. يُقترح تنشيط NXF1 عن طريق تكوين معقد ثلاثي بين ALY / REF و NXF1 ، حيث تلعب المناطق المضطربة الغنية بـ RG دورًا مركزيًا. تم تحديد تسلسلات مماثلة في البروتينات الفيروسية وتسهل أيضًا تصدير الحمض النووي الريبي الفيروسي عن طريق تجاوز مسارات التصدير النووي الكنسي (الجدول 1).

    بروتين التخلف العقلي الهش X (FMRP) هو بروتين RBP آخر مع صندوق RGG ذو خصائص جيدة وملزم بالـ RNA (الشكل 1). المشاركة في قمع الترجمة في الدماغ [61] ، يؤدي فقدان نشاط FMRP إلى تغييرات في التوصيل المشبكي [62] ، والتخلف العقلي [63-65] ، وقد يؤدي أيضًا إلى ظهور الأمراض العصبية التنكسية [66]. بالإضافة إلى صندوق RGG ، يحتوي FMRP على مجالين KH يساهمان في ربط RNA. لقد ثبت أن صندوق RGG الخاص بـ FMRP يتفاعل مع تقارب كبير مع هياكل RNA G-quadruplex [67-77]. إن صندوق RGG غير منظم في حالته غير المنضمة [70 ، 78] ، ولكنه يطوي عند الارتباط بـ G-quadruplex منظم غني بالجوانين في RNA الهدف [78] (الشكل 2). يلعب كل من الأرجينين والجليسين دورًا رئيسيًا في وظيفة صندوق RGG واستبدال هذه الأحماض الأمينية يضعف ارتباط الحمض النووي الريبي [78]. تختلف بقايا الأرجينين المستخدمة للتفاعل مع الحمض النووي الريبي اعتمادًا على الحمض النووي الريبي المستهدف [70 ، 76 ، 78]. يستهدف صندوق FMRP RGG-mRNA الخاص به في بنية G-quadruplex التي تشفر RGG-box [69]. ينظم هذا الارتباط التضفير البديل لـ FMRP mRNA القريب من G-quartet ، مما يشير إلى أنه قد ينظم تلقائيًا توازن الأشكال الإسوية FRMP [74]. من المثير للدهشة أن دراسة حديثة على مستوى النسخ من FMRP المرتبط بتعدد الأشكال لم تجد أي إثراء لهياكل G-quadruplex المتوقعة في 842 mRNAs المستهدفة عالية الثقة [79]. حددت دراسة أخرى مواقع ربط FMRP غنية بزخارف تسلسلية محددة ، حيث ظهرت مجالات KH2 كمحددات خصوصية رئيسية [80]. تشير هذه النتائج إلى أن دور RGG-box في RBP هذا يمكن أن يقتصر على زيادة تقارب الارتباط الكلي للبروتين ، ودعم التفاعلات الخاصة بالتسلسل بوساطة مجالات KH2. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد إمكانية كفاءة الترابط المتشابك للأشعة فوق البنفسجية التفاضلية لمجالات KH2 وصندوق RGG ، مما قد يؤدي إلى توقيعات ربط متحيزة في دراسات CLIP.

    الأمثلة الهيكلية للمناطق المضطربة المرتبطة بالحمض النووي الريبي. أ يرتبط RGG-peptide لـ FMRP البشري بـ a في المختبر- الحمض النووي الريبي SC1 الغني بالجوانين المختار بواسطة الرنين المغناطيسي النووي (PDB 2LA5) [78] ب البقعة الأساسية من فيروس العوز المناعي البقري المضطرب (BIV) تشكل Tat منعطفًا عند التفاعل مع RNA المستهدف ، TAR. تم تحديد الهيكل بواسطة الرنين المغناطيسي النووي (PDB 1MNB) [91] ج Dimer من الرقعة الأساسية التي تحتوي على بروتين Rev من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) في مركب مع RNA المستهدف ، RRE ، المحدد بواسطة علم البلورات [102] (PDB 4PMI). أحمر ، أصفر ببتيد ، RNA. تم إنشاء الرسوم التوضيحية باستخدام PyMol

    يستخدم عدد من RBPs الأخرى منطقة RGG-تكرار لاستهداف أهداف RNA المنظمة الغنية بـ G وهي متورطة في الأمراض العصبية وكذلك السرطان (الجدول 1). يمكن لهذه المناطق الغنية بالـ RG التوسط في تفاعلات غير انتقائية ومحددة مع الحمض النووي الريبي ويمكن أن تشارك في عمليات التمثيل الغذائي المختلفة للحمض النووي الريبي.


    ما المجالات أو الأشكال القادرة على الارتباط بكل من DNA و RNA؟ - مادة الاحياء

    توفر أنظمة CRISPR / Cas للبكتيريا والعتائق مناعة تكيفية ضد الفيروسات والبلازميدات باستخدام crRNAs لتوجيه إسكات الأحماض النووية الغازية. نوضح هنا أنه في مجموعة فرعية من هذه الأنظمة ، يتم إقران قاعدة crRNA الناضجة بـ عبر-تنشيط tracrRNA يشكل بنية ثنائية الحمض النووي الريبي الذي يوجه البروتين المرتبط بـ CRISPR Cas9 لإدخال فواصل مزدوجة الشريطة (ds) في الحمض النووي المستهدف. في المواقع المكملة لتسلسل دليل crRNA ، يشق مجال نوكلياز Cas9 HNH الشريط التكميلي بينما يشق المجال الشبيه بـ Cas9 RuvC الشريط غير التكميلي. إن الـ tracrRNA: crRNA المزدوج ، عند تصميمه كجسم واحد من الحمض النووي الريبي ، يوجه أيضًا انقسام Cas9 dsDNA المحدد بالتسلسل. تكشف دراستنا عن عائلة من نوكليازات داخلية تستخدم RNAs مزدوجًا لانقسام الحمض النووي الخاص بالموقع وتسلط الضوء على إمكانية استغلال نظام تحرير الجينوم القابل للبرمجة في الحمض النووي الريبي.

    طورت البكتيريا والعتائق أنظمة دفاع تكيفية بوساطة الحمض النووي الريبي تسمى CRISPR (التكرارات المتقطعة القصيرة المنتظمة المتباعدة بانتظام) / Cas (المرتبطة بـ CRISPR) التي تحمي الكائنات الحية من غزو الفيروسات والبلازميدات (13). تعتمد أنظمة الدفاع هذه على RNAs صغيرة للكشف عن تسلسل محدد وإسكات الأحماض النووية الأجنبية. تتكون أنظمة CRISPR / Cas من كاس الجينات المنظمة في عمليات (عمليات) ومصفوفة كريسبر تتكون من تسلسلات فريدة لاستهداف الجينوم (تسمى الفواصل) تتخللها تكرارات متطابقة (13). تحدث المناعة عبر CRISPR / Cas في ثلاث خطوات. في المرحلة التكيفية ، تستجيب البكتيريا والعتيقة التي تؤوي واحدًا أو أكثر من مواقع CRISPR للتحدي الفيروسي والبلازميد من خلال دمج أجزاء قصيرة من التسلسل الأجنبي (أوليات أولية) في الكروموسوم المضيف في الطرف القريب من مجموعة CRISPR (13). في مرحلتي التعبير والتداخل ، ينتج عن نسخ عنصر فاصل التكرار إلى جزيئات CRISPR RNA (pre-crRNA) متبوعًا بانقسام إنزيمي جزيئات crRNA القصيرة التي يمكن أن تتزاوج مع متواليات protospacer التكميلية لغزو الأهداف الفيروسية أو البلازميدية (411). يوجه التعرف على الهدف بواسطة crRNAs إسكات التسلسلات الأجنبية عن طريق بروتينات Cas التي تعمل بشكل معقد مع crRNAs (10, 1220).

    هناك ثلاثة أنواع من أنظمة CRISPR / Cas (2123). تشترك أنظمة النوع الأول والثالث في بعض الميزات الشاملة: تعالج نوكليازات كاس المتخصصة ما قبل الرنا الريباسي ، وبمجرد أن تنضج ، يتجمع كل كرنا في مركب بروتين كبير متعدد الكبريتات قادر على التعرف على الأحماض النووية المكملة للكرنا وشقها. في المقابل ، تعالج أنظمة النوع الثاني ما قبل الرنا الريباسي بواسطة آلية مختلفة يكون فيها كرنا (ترانس رنا) مكمل لتسلسل التكرار في ما قبل الرنا الريباسي يؤدي إلى المعالجة بواسطة ريبونوكلياز RNA مزدوج السلسلة RNase III في وجود بروتين Cas9 (Csn1 سابقًا) (4, 24) (الشكل S1). يُعتقد أن Cas9 هو البروتين الوحيد المسؤول عن إسكات الحمض النووي الغريب الموجه بالـ crRNA (2527).

    نوضح هنا أنه في أنظمة النوع الثاني ، تشكل بروتينات Cas9 عائلة من الإنزيمات التي تتطلب بنية زوجية قاعدية تتشكل بين tracrRNA المنشط و crRNA المستهدف لشق الحمض النووي المستهدف مزدوج الشريطة (ds). يحدث الانقسام الخاص بالموقع في المواقع التي تحددها كل من تكامل الاقتران الأساسي بين crRNA و DNA protospacer المستهدف وعزر قصير (يشار إليه باسم النموذج المجاور الأولي ، أو PAM) جنبًا إلى جنب مع المنطقة التكميلية في الحمض النووي المستهدف. توضح دراستنا أيضًا أنه يمكن برمجة عائلة Cas9 endonuclease بجزيئات RNA مفردة لتقسيم مواقع DNA محددة ، وبالتالي زيادة إمكانية مثيرة لتطوير نظام موجه RNA بسيط ومتعدد الاستخدامات لتوليد فواصل dsDNA (DSBs) لاستهداف الجينوم وتحريره.

    Cas9 هو نوكلياز داخلي للحمض النووي يسترشد باثنين من الحمض النووي الريبي. يُفترض أن Cas9 ، وهو بروتين مميز لأنظمة النوع الثاني ، متورط في كل من نضج الرنا الريباسي وتداخل الحمض النووي الموجه كرنا (الشكل S1) (4, 2527). Cas9 متورط في نضوج crRNA (4) ، ولكن لم يتم التحقيق في مشاركتها المباشرة في تدمير الحمض النووي المستهدف. لاختبار ما إذا كان Cas9 قادرًا على انقسام الحمض النووي المستهدف وكيف ، استخدمنا نظام الإفراط في التعبير لتنقية بروتين Cas9 المشتق من العامل الممرض الأبراج العقدية (الشكل S2) واختبرت قدرتها على شق DNA البلازميد أو ثنائي النوكليوتيد المزدوج الذي يحمل تسلسل بروتوسفاسر مكمل لـ crRNA ناضج ، و PAM حسن النية. وجدنا أن crRNA الناضج وحده كان غير قادر على توجيه انقسام DNA البلازميد المحفز Cas9 (الشكل 1A والشكل S3A). ومع ذلك ، فإن إضافة tracrRNA ، والتي يمكن أن تتزاوج مع تسلسل تكرار crRNA وهي ضرورية لنضج الرنا الريباسي في هذا النظام ، حفزت Cas9 على شق DNA البلازميد (الشكل 1A والشكل S3A). يتطلب تفاعل الانقسام كلاً من المغنيسيوم ووجود تسلسل crRNA مكمل للحمض النووي ، وهو كرنا قادر على الاقتران بقاعدة tracrRNA ولكنه يحتوي على تسلسل ربط الحمض النووي المستهدف غير المشابه لم يدعم انشقاق البلازميد المحفز Cas9 (الشكل 1 أ والتين). S3A ، قارن crRNA-sp2 بـ crRNA-sp1 والتين. S4A). تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام ركيزة dsDNA خطية قصيرة (الشكل 1 ب والشكل S3 و B و C). ال عبر-تنشيط tracrRNA هو بالتالي رنا صغير غير مشفر له وظيفتان حاسمتان: تشغيل معالجة ما قبل الرنا الريباسي بواسطة إنزيم RNase III (4) ثم تنشيط انشقاق الحمض النووي الموجه بـ crRNA بواسطة Cas9.

    Cas9 هو نوكلياز داخلي للحمض النووي يسترشد بجزيئين من الحمض النووي الريبي. (أ) تمت برمجة Cas9 باستخدام 42 نيوكليوتيد crRNA-sp2 (كرنا يحتوي على تسلسل فاصل 2) في وجود أو عدم وجود 75 نيوكليوتيد tracrRNA. تمت إضافة المعقد إلى DNA البلازميد الدائري أو الخطي XhoI الذي يحمل تسلسلًا مكملًا للفاصل 2 و PAM وظيفي. crRNA-sp1 ، والتحكم في الخصوصية M ، وعلامة الحمض النووي تشير إلى الشكل. S3A. (ب) تمت برمجة Cas9 باستخدام crRNA-sp2 و tracrRNA (النيوكليوتيدات 4-89). تم تحضين المعقد مع الحمض النووي المزدوج أو المفرد الذي يحتوي على تسلسل مكمل للفاصل 2 و PAM وظيفي (4). كانت الخيوط التكميلية أو غير التكميلية من الحمض النووي 5′-radiolabeled وملدنة مع حبلا شريك غير مسمى. الرجوع إلى الشكل. S3 و B و C. (ج) تحليل التسلسل لمنتجات الانقسام من الشكل 1 أ. يشير إنهاء تمديد التمهيدي في تفاعل التسلسل إلى موضع موقع الانقسام. 3 ′ الطرفية المتدلية (علامة النجمة) هي قطعة أثرية من تفاعل التسلسل. الرجوع إلى الشكل. S5 و A و C. (د) تم تحليل نواتج الانقسام من الشكل 1 ب جنبًا إلى جنب مع علامات الحجم ذات 5 علامات نهائية المستمدة من السلاسل التكميلية وغير التكميلية للطرف المزدوج المستهدف. M ، علامة P ، منتج الانقسام. الرجوع إلى الشكل. S5 و B و C. (ه) تمثيل تخطيطي لـ tracrRNA و crRNA-sp2 و protospacer 2 مناطق تسلسل DNA من crRNA التكميلية لـ tracrRNA (برتقالي) و DNA protospacer (أصفر) ممثلة بتسلسل PAM ، مواقع الانقسام الرمادي المعينة في (C) و (D) ممثلة بواسطة الأسهم الزرقاء (C) ، السهم الأحمر (D ، الخيط التكميلي) والخط الأحمر (D ، الخيط غير التكميلي).

    انقسام كل من dsDNA البلازميد والقصير بواسطة tracrRNA: Cas9 الموجه بواسطة crRNA خاص بالموقع (الشكل 1 ، C إلى E ، والشكل S5 ، A و B). أنتج انقسام الحمض النووي البلازميد نهايات حادة في موضع ثلاثة أزواج قاعدية أعلى تسلسل PAM (الشكل 1 و C و E والتين. S5 و A و C) (26). وبالمثل ، داخل dsDNA المزدوج القصير ، يتم شق خيط DNA المكمل لتسلسل ربط الهدف في crRNA (الخيط التكميلي) في موقع ثلاثة أزواج أساسية في الجزء العلوي من PAM (الشكل 1 ، D و E ، والتين) . S5 و B و C). يتم شق خيط الحمض النووي غير التكميلي في موقع واحد أو أكثر في حدود 3 إلى 8 أزواج قاعدية في الجزء العلوي من PAM. كشف المزيد من التحقيقات أن الخيط غير التكميلي يتم شقه أولاً بطريقة التحلل الداخلي ثم يتم تقليمه لاحقًا بواسطة نشاط نوكلياز خارجي 3′-5 (الشكل S4B). تراوحت معدلات الانقسام بواسطة Cas9 في ظل ظروف دوران واحدة من 0.3 إلى 1 دقيقة -1 ، مقارنة بمعدلات نوكليازات التقييد (الشكل S6A) ، بينما حضانة Cas9-tracrRNA من النوع البري: مجمع crRNA مع زيادة ضرس 5 أضعاف من قدم الحمض النووي للركيزة دليلاً على أن Cas9 الموجه بالـ RNA المزدوج هو إنزيم متعدد الدورات (الشكل S6B). على عكس مجمع CRISPR Type I Cascade (18) ، يشق Cas9 كلا من البلازميدات الخطية والملفوفة (الشكلان 1 أ و 2 أ). لذلك ، يمكن من حيث المبدأ شق البلازميد الغازي عدة مرات بواسطة بروتينات Cas9 المبرمجة مع crRNAs مختلفة.

    يستخدم Cas9 نطاقي نوكلياز لشق الخيطين في الحمض النووي المستهدف. (أ) أعلى: تمثيل تخطيطي لهيكل مجال Cas9 يوضح مواقف طفرات المجال. أسفل: مجمعات من بروتينات Cas9 المتحولة من النوع البري أو النيوكلياز مع tracrRNA: تم اختبار crRNA-sp2 لنشاط نوكلياز داخلي كما في الشكل 1 أ. (ب) تم اختبار مجمعات Cas9 من النوع البري أو طفرات مجال نوكلياز مع tracrRNA و crRNA-sp2 للنشاط كما في الشكل 1 ب.

    كل مجال نوكلياز Cas9 يشق خيط DNA واحد. يحتوي Cas9 على مجالات مماثلة لكل من نوكليازات HNH و RuvC (الشكل 2 أ والشكل S7) (2123, 27, 28). قمنا بتصميم وتنقية متغيرات Cas9 التي تحتوي على طفرات نقطة معطلة في البقايا التحفيزية لنطاقات HNH أو RuvC (الشكل 2A والشكل S7) (23, 27). Incubation of these variant Cas9 proteins with native plasmid DNA showed that dual-RNA–guided mutant Cas9 proteins yielded nicked open circular plasmids, while the wild-type Cas9 protein-tracrRNA:crRNA complex produced a linear DNA product (Figs. 1A and 2A and figs. S3A and S8A). This result indicates that the Cas9 HNH and RuvC-like domains each cleave one plasmid DNA strand. To determine which strand of the target DNA is cleaved by each Cas9 catalytic domain, we incubated the mutant Cas9-tracrRNA:crRNA complexes with short dsDNA substrates in which either the complementary or the noncomplementary strand was radiolabeled at its 5′ end. The resulting cleavage products indicated that the Cas9 HNH domain cleaves the complementary DNA strand, while the Cas9 RuvC-like domain cleaves the noncomplementary DNA strand (Fig. 2B and fig. S8B).

    Dual-RNA requirements for target DNA binding and cleavage. tracrRNA might be required for target DNA binding and/or to stimulate the nuclease activity of Cas9 downstream of target recognition. To distinguish between these possibilities, we used an electrophoretic mobility shift assay to monitor target DNA binding by catalytically inactive Cas9 in the presence or absence of crRNA and/or tracrRNA. Addition of tracrRNA substantially enhanced target DNA binding by Cas9, whereas little specific DNA binding was observed with Cas9 alone or Cas9-crRNA (fig. S9). This indicates that tracrRNA is required for target DNA recognition, possibly by properly orienting the crRNA for interaction with the complementary strand of target DNA. The predicted tracrRNA:crRNA secondary structure includes base-pairing between the 3′-terminal 22-nucleotides of the crRNA and a segment near the 5′ end of the mature tracrRNA (Fig. 1E). This interaction creates a structure in which the 5′-terminal 20 nucleotides of the crRNA, which vary in sequence in different crRNAs, are available for target DNA binding. The bulk of the tracrRNA downstream of the crRNA base-pairing region is free to form additional RNA structure(s) and/or to interact with Cas9 or the target DNA site. To determine whether the entire length of the tracrRNA is necessary for site-specific Cas9-catalyzed DNA cleavage, we tested Cas9-tracrRNA:crRNA complexes reconstituted using full-length mature (42-nt) crRNA and various truncated forms of tracrRNA lacking sequences at their 5′ or 3′ ends. These complexes were tested for cleavage using a short target dsDNA. A substantially truncated version of the tracrRNA retaining nucleotides 23-48 of the native sequence was capable of supporting robust dual-RNA–guided Cas9-catalyzed DNA cleavage (Fig. 3, A and C, and fig. S10, A and B). Truncation of the crRNA from either end showed that Cas9-catalyzed cleavage in the presence of tracrRNA could be triggered with crRNAs missing the 3′-terminal 10 nucleotides (Fig. 3, B and C). In contrast, a 10-nucleotide deletion from the 5′ end of crRNA abolished DNA cleavage by Cas9 (Fig. 3B). We also analyzed Cas9 orthologs from various bacterial species for their ability to support S. المقيحة tracrRNA:crRNA-guided DNA cleavage. In contrast to closely related S. المقيحة Cas9 orthologs, more distantly related orthologs were not functional in the cleavage reaction (fig. S11). بصورة مماثلة، S. المقيحة Cas9 guided by tracrRNA:crRNA pairs originating from more distant systems were unable to cleave DNA efficiently (fig. S11). Species specificity of dual-RNA–guided cleavage of DNA indicates co-evolution of Cas9, tracrRNA and the crRNA repeat, as well as the existence of a still unknown structure and/or sequence in the dual-RNA that is critical for the formation of the ternary complex with specific Cas9 orthologs.

    Cas9-catalyzed cleavage of target DNA requires an activating domain in tracrRNA and is governed by a seed sequence in the crRNA. (أ) Cas9-tracrRNA:crRNA complexes were reconstituted using 42-nucleotide crRNA-sp2 and truncated tracrRNA constructs and assayed for cleavage activity as in Fig. 1B. (ب) Cas9 programmed with full-length tracrRNA and crRNA-sp2 truncations was assayed for activity as in (A). (ج) Minimal regions of tracrRNA and crRNA capable of guiding Cas9-mediated DNA cleavage (blue box). (د) Plasmids containing wild-type or mutant protospacer 2 sequences with indicated point mutations (right) were cleaved in vitro by programmed Cas9 as in Fig. 1A (left top) and used for transformation assays of wild-type or pre-crRNA-deficient S. المقيحة (left bottom). The transformation efficiency was calculated as CFU per μg of plasmid DNA error bars represent standard deviations for three biological replicates. (ه) Plasmids containing wild-type and mutant protospacer 2 inserts with varying extent of crRNA-target DNA mismatches (right) were cleaved in vitro by programmed Cas9 (left). The cleavage reactions were further digested with XmnI. The 1880 bp and 800 bp fragments are Cas9-generated cleavage products.

    To investigate the protospacer sequence requirements for Type II CRISPR/Cas immunity in bacterial cells, a series of protospacer-containing plasmid DNAs harboring single-nucleotide mutations were analyzed for their maintenance following transformation in S. المقيحة and their ability to be cleaved by Cas9 in vitro. In contrast to point mutations introduced at the 5′ end of the protospacer, mutations in the region close to the PAM and the Cas9 cleavage sites were not tolerated in vivo and resulted in decreased plasmid cleavage efficiency in vitro (Fig. 3D). Our results are in agreement with a previous report of protospacer escape mutants selected in the Type II CRISPR system from S. thermophilus in vivo (27, 29). Furthermore, the plasmid maintenance and cleavage results hint at the existence of a “seed” region located at the 3′ end of the protospacer sequence that is crucial for the interaction with crRNA and subsequent cleavage by Cas9. In support of this notion, Cas9 enhanced complementary DNA strand hybridization to the crRNA and this enhancement was the strongest in the 3′-terminal region of the crRNA targeting sequence (fig. S12). Corroborating this, a contiguous stretch of at least 13 base pairs between the crRNA and the target DNA site proximal to the PAM is required for efficient target cleavage, while up to six contiguous mismatches in the 5′-terminal region of the protospacer are tolerated (Fig. 3E). These findings are reminiscent of the previously observed seed sequence requirements for target nucleic acid recognition in Argonaute proteins (30, 31) and the Cascade and Csy CRISPR complexes (13, 14).

    A short sequence motif dictates R-loop formation. In multiple CRISPR/Cas systems, recognition of self versus non-self has been shown to involve a short sequence motif that is preserved in the foreign genome, referred to as the PAM (27, 29, 3234). PAM motifs are only a few base pairs in length, and their precise sequence and position vary according to the CRISPR/Cas system type (32). في ال S. المقيحة Type II system, the PAM conforms to an NGG consensus sequence, containing two G:C base pairs that occur one base pair downstream of the crRNA binding sequence, within the target DNA (4). Transformation assays demonstrated that the GG motif is essential for protospacer plasmid DNA elimination by CRISPR/Cas in bacterial cells (fig. S13A), consistent with previous observations in S. thermophilus (27). The motif is also essential for in vitro protospacer plasmid cleavage by tracrRNA:crRNA-guided Cas9 (fig. S13B). To determine the role of the PAM in target DNA cleavage by the Cas9-tracrRNA:crRNA complex, we tested a series of dsDNA duplexes containing mutations in the PAM sequence on the complementary or noncomplementary strands, or both (Fig. 4A). Cleavage assays using these substrates showed that Cas9-catalyzed DNA cleavage was particularly sensitive to mutations in the PAM sequence on the noncomplementary strand of the DNA, in contrast to complementary strand PAM recognition by Type I CRISPR/Cas systems (18, 34). Cleavage of target single-stranded DNAs was unaffected by mutations of the PAM motif. This observation suggests that the PAM motif is required only in the context of target dsDNA and may thus be required to license duplex unwinding, strand invasion, and the formation of an R-loop structure. Using a different crRNA-target DNA pair (crRNA-sp4 and protospacer 4 DNA), selected due to the presence of a canonical PAM not present in the protospacer 2 target DNA, we found that both G nucleotides of the PAM were required for efficient Cas9-catalyzed DNA cleavage (Fig. 4B and fig. S13C). To determine whether the PAM plays a direct role in recruiting the Cas9-tracrRNA:crRNA complex to the correct target DNA site, binding affinities of the complex for target DNA sequences were analyzed by native gel mobility shift assays (Fig. 4C). Mutation of either G in the PAM sequence substantially reduced the affinity of Cas9-tracrRNA:crRNA for the target DNA. This finding argues for specific recognition of the PAM sequence by Cas9 as a prerequisite for target DNA binding and possibly strand separation to allow strand invasion and R-loop formation, which would be analogous to the PAM sequence recognition by CasA/Cse1 implicated in a Type I CRISPR/Cas system (34).

    A PAM is required to license target DNA cleavage by the Cas9-tracrRNA:crRNA complex. (أ) Dual RNA-programmed Cas9 was tested for activity as in Fig. 1B. Wild-type and mutant PAM sequences in target DNAs are indicated (right). (ب) Protospacer 4 target DNA duplexes (labeled at both 5′ ends) containing wild-type and mutant PAM motifs were incubated with Cas9 programmed with tracrRNA (nt 23-89):crRNA-sp4. At indicated time points (min), aliquots of the cleavage reaction were taken and analyzed as in Fig. 1B. (ج) Electrophoretic mobility shift assays were performed using RNA-programmed Cas9 (D10A/H840A) and protospacer 4 target DNA duplexes [same as in (B)] containing wild-type and mutated PAM motifs. Cas9 (D10A/H840A)-RNA complex was titrated from 100 pM to 1 μM.

    Cas9 can be programmed with a single chimeric RNA. Examination of the likely secondary structure of the tracrRNA:crRNA duplex (Figs. 1E and 3C) suggested the possibility that the features required for site-specific Cas9-catalyzed DNA cleavage could be captured in a single chimeric RNA. Although the tracrRNA:crRNA target selection mechanism works efficiently in nature, the possibility of a single RNA-guided Cas9 is appealing due to its potential utility for programmed DNA cleavage and genome editing (Fig. 5A). We designed two versions of a chimeric RNA containing a target recognition sequence at the 5′ end followed by a hairpin structure retaining the base-pairing interactions that occur between the tracrRNA and the crRNA (Fig. 5B). This single transcript effectively fuses the 3′end of crRNA to the 5′ end of tracrRNA, thereby mimicking the dual-RNA structure required to guide site-specific DNA cleavage by Cas9. In cleavage assays using plasmid DNA, we observed that the longer chimeric RNA was able to guide Cas9-catalyzed DNA cleavage in a manner similar to that observed for the truncated tracrRNA:crRNA duplex (Fig. 5B and fig. S14, A and C). The shorter chimeric RNA did not work efficiently in this assay, confirming that nucleotides 5-12 positions beyond the tracrRNA:crRNA base-pairing interaction are important for efficient Cas9 binding and/or target recognition. Similar results were observed in cleavage assays using short dsDNA as a substrate, which further indicate that the position of the cleavage site in target DNA is identical to that observed using the dual tracrRNA:crRNA as a guide (Fig. 5C and fig. S14, B and C). Finally, to establish whether the design of chimeric RNA might be universally applicable, we engineered five different chimeric guide RNAs to target a portion of the gene encoding the green-fluorescent protein (GFP) (fig. S15, A to C), and tested their efficacy against a plasmid carrying the GFP coding sequence in vitro. In all five cases, Cas9 programmed with these chimeric RNAs efficiently cleaved the plasmid at the correct target site (Fig. 5D and fig. S15D), indicating that rational design of chimeric RNAs is robust and could in principle enable targeting of any DNA sequence of interest with few constraints beyond the presence of a GG dinucleotide adjacent to the targeted sequence.

    Cas9 can be programmed using a single engineered RNA molecule combining tracrRNA and crRNA features. (أ) Top: In Type II CRISPR/Cas systems, Cas9 is guided by a two-RNA structure formed by activating tracrRNA and targeting crRNA to cleave site-specifically target dsDNA (refer to fig. S1). Bottom: A chimeric RNA generated by fusing the 3′ end of crRNA to the 5′ end of tracrRNA. (ب) A plasmid harboring protospacer 4 target sequence and a wild-type PAM was subjected to cleavage by Cas9 programmed with tracrRNA(4-89):crRNA-sp4 duplex or in vitro-transcribed chimeric RNAs constructed by joining the 3′ end of crRNA to the 5′ end of tracrRNA with a GAAA tetraloop. Cleavage reactions were analyzed by restriction mapping with XmnI. Sequences of chimeric RNAs A and B are shown with DNA-targeting (yellow), crRNA repeat-derived (orange) and tracrRNA-derived (light blue) sequences. (ج) Protospacer 4 DNA duplex cleavage reactions were performed as in Fig. 1B. (د) Five chimeric RNAs designed to target the GFP gene were used to program Cas9 to cleave a GFP gene-containing plasmid. Plasmid cleavage reactions were performed as in Fig. 3E, except that the plasmid DNA was restriction mapped with AvrII following Cas9 cleavage.

    Conclusions. In summary, we identify a DNA interference mechanism involving a dual-RNA structure that directs a Cas9 endonuclease to introduce site-specific double-stranded breaks in target DNA. The tracrRNA:crRNA-guided Cas9 protein utilizes distinct endonuclease domains, HNH and RuvC-like, to cleave the two strands in the target DNA. Target recognition by Cas9 requires both a seed sequence in the crRNA and a GG dinucleotide-containing PAM sequence adjacent to the crRNA-binding region in the DNA target. We further show that the Cas9 endonuclease can be programmed with guide RNA engineered as a single transcript to target and cleave any dsDNA sequence of interest. The system is efficient, versatile and programmable by changing the DNA target-binding sequence in the guide chimeric RNA. Zinc-Finger Nucleases (ZFNs) and Transcription-Activator Like Effector Nucleases (TALENs) have attracted considerable interest as artificial enzymes engineered to manipulate genomes (3538). We propose an alternative methodology based on RNA-programmed Cas9 that could offer considerable potential for gene targeting and genome editing applications.


    Kink-turns in RNA

    The kink-turn (usually abbreviated to k-turn) is a widespread structural motif in RNA, first noted as a repeated structural element in the large ribosomal subunit by the Steitz lab (1). It introduces a very tight kink into the axis of helical RNA. It clearly plays an important structural role in RNA, and is significant in many aspects of RNA function including translation, modification and splicing, as well as genetic regulation.

    The sequence of Kt-7, an almost canonical k-turn found in the 50S subunit of the Haloarcula marismortui ribosome.

    The standard k-turn comprises a three-nucleotide bulge flanked on its 3 side by A G and G A basepairs (N-C stem), and on its 5 side by a section of regular basepairing (C stem) (1).

    The structure of a generic k-turn. A schematic of the structure is shown on the left, and the structure of Kt-7 in the H. marismortui ribosome is shown on the right.

    Kt-7 of the 23S rRNA of the H. marismortui ribosome is close to the consensus sequence for k-turns. The structure introduces a pronounced kink in the RNA (from whence its name), with an included angle between the axes of

    50 . The minor grooves of the two helices are juxtaposed, and the conformation is stabilized by interactions between the stacked adenosines of the A G basepairs and the C stem, and by stacking of the 5 and central bases of the bulge on the ends of the C and N-C stems respectively.

    The two A G basepairs at the center of the k-turn. The A G pairs of Kt-7 are shown in the molecular graphics.

    The A G basepairs are highly conserved. Both are trans sugar edge (G) to Hoogsteen edge (A) pairs, linked by potential hydrogen bonds G-N2 to A-N7 and A-N6 to G-N3. The 1b 1n pair is strongly buckled, while the bases of the 2n 2b pair are much closer to coplanarity. In some k-turns, the A-N6 to G-N3 hydrogen bond is not formed in the 2b 2n pair (see below). In the folded structure the minor groove edges of the two A G pairs are juxtaposed with the minor groove of the opposing C helix to participate in A-minor interactions (2). The structural principles of k-turn geometry have been analyzed using isostericity matrices (3).

    Many k-turns are bound by proteins in their natural state, at least some of which stabilize the kinked geometry. This is discussed further below.

    A general nucleotide numbering system for k-turns

    We have devised a universal nomenclature for the nucleotide positions in k-turns (4), thus avoiding the confusion that could arise from the many different numbering systems used in various crystal structures.

    A systematic nomenclature for the nucleotides of a k-turn.

    In this system, the unpaired bulge nucleotides are labelled Lj, where the index j is numbered sequentially from the 5 side. Unpaired nucleotides on the opposite strand (found in a small fraction of k-turns) are designated Lnj, with j increasing 5 to 3 . For all the remaining nucleotides, the two strands are differentiated by the suffix of b for the بulge-containing strand or n for the نon-bulged strand. The nucleotides of the non-canonical stem are positively numbered from the first G A mismatch in the 5 to 3 direction relative to the bulged strand, while those of the canonical stem are negatively numbered in the 3 to 5 direction. The numbering system can accommodate loops of different sizes.

    Where are k-turns found ?

    Some k-turns have been identified unequivocally, from their structure فى الموقع within crystal structures of larger RNA structures or complexes. Others are assumed by virtue of their sequence, and perhaps their homology with known k-turns in related species. The pronounced kink of the k-turn can also be observed using a variety of biophysical methods, such as FRET (5).

    The k-turn was first identified as a novel motif occurring multiple times in the ribosome (1,6,7). Further examples have been found in mRNA (8-11), and in riboswitches (12-16). They are very commonly found in C/D and H/ACA guide snoRNAs, and U3 snoRNA species (17-25). There is also a near-canonical k-turn in a stem-loop of the human U4 snRNA (26,27).

    Metal ion-induced folding of k-turns

    In order to adopt the tightly-kinked geometry, k-turn motifs require the presence of metal ions (5,27,28), or the binding of proteins (29). In the absence of either of these factors the RNA adopts a conformation that is more extended, like that of any three-nucleotide bulge in a duplex (30). The kinked conformation can be stabilized by addition of either divalent or monovalent metal ions (5), and folding can be treated as a two-state process.

    Ion-induced folding of Kt-7 observed by the increase in fluorescence resonance energy transfer between terminally-attached fluorophores that become closer when the RNA adopts the kink turn conformation.

    Folding is induced by micromolar concentrations of divalent ions, or millimolar concentrations of monovalent ions. For example, FRET analysis reveals that the folding of Kt-7 is achieved with a [Mg 2+ ]1/2 = 80 M, and a [Na + ]1/2 = 30 mM (4).

    There is no evidence for site-specific binding of metal ions to k-turns. It is likely that electrostatic interactions must be screened to allow the folded structure to achieve stability, and this is achieved by an ion atmosphere of loosely bound metal ions.

    This suggests a dynamic character for k-turn structures, where they sample both the kinked and a more extended geometry, consistent with fluorescent lifetime measurements (31). Computer modelling studies have suggested that k-turns undergo hinge-like motions on a fast timescale (32-34).

    Protein binding by k-turn RNA

    The majority of k-turns are known to bind one or more proteins. A few are not, including that found in the SAM riboswitch (12), although it remains possible that in the cellular environment even that too is bound by proteins.

    The archetypal k-turn binding protein is the ribosomal L7Ae and related proteins. These form a family of RNA-binding proteins including the eukaryotic and archaeal proteins L7Ae, L30e and S12e (35), the yeast Nhp2 and Snu13p proteins, and the human 15.5 kDa protein (36). Each of these proteins binds k-turn motifs in RNA, and some functional substitutions are tolerated (21). The assembly of the RNA methylation (box C/D) and pseudouridylation (box H/ACA) nucleoproteins are initiated by the binding of L7Ae-type proteins to k-turns contained within the guide RNA (37,38). The 15.5 kDa protein binds a k-turn of the U4 stem-loop in the U4-U6.U5 tri-snRNP (36). Crystal structures are available for the complexes of Archaeoglobus fulgidus L7Ae and box C/D RNA (22), Methanococcus jannaschii L7Ae and box H/ACA RNA (23) and the human 15.5 kDa protein and the U4 snRNA (26). In each case, the k-turn adopts the tightly-kinked conformation in the complex with the protein.

    Crystal structure of the L7Ae protein complexed with the box C/D k-turn (22).

    Even in the absence of added metal ions, the kinked conformation is induced by the binding of the protein. Moreover, the binding occurs with extremely high affinity. We have measured a dissociation constant of Kد = 10 pM for Archeoglobus fulgidus L7Ae binding to Kt-7 (39).

    The binding of L7Ae to Kt-7 observed by FRET. The k-turn becomes folded into the kinked geometry on binding L7Ae, and thus adopting the structure that exhibits high FRET efficiency. Thus the position of equilibrium can be followed in this manner. The data are fitted to a two-state model. However, the binding is so tight that only an upper limit can be measured for the Kد. An accurate value was measured using kinetic measurements of association and dissociation rates (39).

    In principle it could be imagined that k-turn folding could be promoted by protein binding in one of two ways, by passive selection of the kinked structure (conformational selection), or a more active process in which the protein manipulates the RNA structure (induced fit). The former requires an equilibrium between extended and folded k-turn structure in solution, as indicated in our measurement of fluorescent lifetimes (40). Real-time binding single-molecule experiments provide no evidence for a more extended intermediate down to a time resolution of 16 ms, supporting the conformational selection model (41).

    Stabilization of k-turn structure by tertiary interactions

    There is a third mechanism of stabilization, arising from longer-range tertiary interactions within the RNA. The k-turn introduces an abrupt transition in helical trajectory in the RNA helix that can be an important element in building the large-scale architecture of large RNA species. This is exemplified by the SAM-I riboswitch, where a long helix (P2) is kinked by a standard k-turn to allow the terminal loop to dock into a receptor in helix P4 (12,14).

    Schematic of the secondary structure of the SAM-I riboswitch. The k-turn is colored in our conventional manner. Note the loop-receptor interaction with the terminal loop of helix P2B.

    This stabilizes the global fold of the riboswitch that creates the binding pocket for its ligand س-adenosyl methionine (SAM - shown in red above), and removal of the k-turn completely prevents SAM binding. Conversely though, the tertiary structure of the RNA stabilizes the local structure of the k-turn. We observed that a G2nA substitution prevented the k-turn from folding as an isolated duplex, yet allowed the riboswitch to retain full function indicative of unperturbed folding (42). Solving the crystal structure of the modified SAM-I riboswitch showed that the k-turn was folded completely normally, despite the presence of an A A pair at the 2b 2n position.

    Crystal structure of the SAM-I riboswitch containing a k-turn that has been modified by a G2nA substitution. A. The 3D structure of the complete riboswitch. B. The structure of the k-turn (colored) superimposed with that of the unmodified sequence (grey).

    We conclude that the free energy of the tertiary interactions in the riboswitch is coupled to the folding of the k-turn so that an intrinsically unstable k-turn can fold normally.

    Thus we see that the folded structure of the k-turn can be stabilized in three ways : 1. By neutralization of charge on addition of metal ions. 2. By the binding of proteins, including members of the L7Ae family. 3. By tertiary interactions within larger RNA species. There is likely to be an interplay between these different processes in larger RNA-protein assemblies.

    Hydrogen bonding interactions that stabilize the kinked geometry

    The majority of k-turns have a G A pair at the 1b 1n position, and an A G pair at the 2b 2n position. Sequence substitution of any of the four nucleotides is usually highly detrimental to folding (5). Both are trans sugar edge (G) to Hoogsteen edge (A) pairs, linked by potential hydrogen bonds G-N2 to A-N7 and A-N6 to G-N3. We have found experimentally that all four hydrogen bonds are important to the stability of the kinked form of the RNA. But the G-N2 to A-N7 hydrogen bonds of the two G A pairs are the most critical to the stability of kinked form of Kt-7 in Mg 2+ ions, so that folding is completely prevented by G to inosine substitutions at either position (39).

    A cartoon summarizing the important hydrogen-bonding interactions involving O2 groups that stabilize the kinked geometry of the k-turn. Hydrogen bonds are indicated by the cyan arrows, with a thickness that reflects their conservation and importance in stabilizing the structure.

    In addition to the bonds linking the G A pairs, a number of critical hydrogen bonds involving O2 groups play a key role in stabilizing the kinked structure. These are summarized in the figure above. The most important are those in the core of the turn, and ribose-phosphate interactions around the bulge. These are strongly conserved in all k-turns, and critical to folding. Of these the single-most important hydrogen bond is one donated from the O2 of L1 ribose to the N1 of the A1n in the kink-proximal A G pair.

    The critical hydrogen bond formed between the O2 of L1 ribose to the N1 of the A1n.

    This is present in all known k-turn structures, and removal of the O2 from L1 completely prevents metal ion-induced folding (4). Another important hydrogen bond stabilizes the tight turn made at the loop of the k-turn. An interaction between the O2 of L3 and the طليعةS non-bridging O of the phosphate between L1 and L2 bridges the neck of the turn, and is observed in most k-turn crystal structures. Removal of the O2 from L3 ribose in Kt-7 led to marked impairment of ion-induced folding (4).

    Two important hydrogen bonds in the loop, seen here in Kt-7. One is donated from the O2 of L3 to the طليعةS non-bridging O of the phosphate between L1 and L2. The other is between the O2 of L2 and the طليعةS O of the L2/L3 phosphate group.

    There is a further key hydrogen bond in the A-minor interaction between the C and NC helices, from the O2' of -1n to the nucleobase of the conserved adenine 2b. However, the acceptor can be N3 or N1, and this divides most of the known k-turn structures into two structural classes (31) . This is also true for the k-turns with an A A pair at the 2b 2n position. The rotation of the adenine nucleobase required to present either N3 or N1 as acceptor affects the basepairing with the base at the 2n position. For example, where this is guanine, the G A pair is bonded by two hydrogen bonds for the N3 class however in the N1 class the A2b N6 to G2n N3 is too long to be considered hydrogen bonded.

    Examples of the N3 and N1 classes of k-turn, showing the A-minor interaction between A2b and the O2' at the -1n position, and the hydrogen bonding between A2b and G2n. The red broken line in Kt-38 indicates an N-N distance of 4.7 , too long to be bonded.

    K-turns that depart from the consensus sequence

    Some k-turns break the rules of the standard motif. We divide these into two classes :
    1. The simple k-turns. These retain the same ordering of key nucleotides with respect to the primary sequence.
    2. The complex k-turns. In these k-turns the key nucleotides do not map onto the primary sequence in a linear way.

    Some of the simple k-turns have sequence changes that alter the seemingly essential G A pairs. This is well exemplified by Kt-23 of the small ribosomal subunit, that exhibits frequent changes from the consensus in the 2n position.

    WebLogo (43) summary of Kt-23 sequences

    In Kt-23 of ثيرموفيلوس (6), the 2n nucleotide is uridine, forming a non-Watson-Crick A U pair with A2b. Although making the same change in Kt-7 totally prevents folding from occurring, Kt-23 folds efficiently on addition of magnesium ions, and its structure in the 30S ribosomal subunit is superimposable with that of Kt-7 (44).

    Overlay of the crystal structures of Kt-7 (blue) and Kt-23 (red), showing the closely similar positions of the adenine nucleobases at the 1n and 2b positions.

    A relatively rare subset of Kt-23 sequences have adenine at the 2n position, giving a potential A A pair at the 2b 2n position. One such example is found in Thelohania solenopsae. This can be folded into the k-turn conformation by the binding of L7Ae, or by tertiary interactions in the SAM-I riboswitch (45). The crystal structure of the latter construct shows that the RNA adopts standard k-turn geometry, with the 1n and 2b adenine nucleobases directed into the C helix minor groove as normal, and preservation of the standard hydrogen bonding pattern (45). This is an N1 structure, and consequently there is no hydrogen bond between A2b N6 and A2n N3 (N-N distance 4.7 ).

    The structure of the A2b A2n pair observed in the crystal structure of T. solenopsae Kt-23 (45). The electron density is the calculated composite omit map.

    The complex k-turns exhibit more radical departure from the simple k-turns such as H. marismortui Kt-7, where the key nucleotides appear to be out of order (as in T. thermophilus Kt-11), and can even pass between strands (as in H. marismortui Kt-15).

    The connectivity of the nucleotides in the structures of H. marismortui Kt-15, and T. thermophilus Kt-11.

    Despite the major departures of the sequences from the conventional k-turn, both form standard k-turn structures in the ribosome. We recommend naming the nucleotides according to their location in the structure, rather than their position in the linear sequence. Thus the adenine paired with G2n in Kt-15 is best termed 2b, even though it is covalently located on the non-bulged strand.

    In some species k-turns are functionally replaced by structures that are strongly kinked, yet not k-turns (if we define k-turns by the A G pairs and the juxtaposition of the N and NC helix minor grooves). على سبيل المثال ، ملف B. الرقيقة lysine riboswitch contains a probable k-turn that introduces a kink into the structure required for the tertiary structure (13), yet in Thermatoga maritima this is replaced by a sequence that is plainly not a k-turn (40). The latter may well be a point of flexibility rather than an intrinsic kink, but it functions in a similar manner فى الموقع. In another example, RNase P of T. ماريتيما contains a sequence (termed a pk turn) that is kinked similarly to a k-turn (47) , but lacks the G A pairs and cross-strand hydrogen bonding. However the pk-turn and the k-turn are functionally exchangeable between the SAM-I riboswitch and RNase P (40). In the crystal structure of the group I intron ribozyme of Azoarcus, Strobel and colleagues found a sequence that they termed the reverse k-turn (48). This motif has an A A pair at the putative 1b 1n position, and bends in the opposite direction compared to conventional k-turns, so that the major grooves become juxtaposed. We feel that this should not be classified as a k-turn because it lacks all the key elements that define a k-turn.

    A role for k-turns in building complex RNA structures ?

    Kink turns could play a key role in RNA architecture and the biogenesis of large assemblies. This includes the formation of functional RNA-protein complexes such as the box C/D in guided methylation, where the first even is the binding of an L7Ae-related protein to a k-turn. On a larger scale, the ribosome has many k-turns that are bound by a variety of different proteins. The dynamic character of the k-turn should provide opportunity for RNA to explore conformational space, but once folded the tight kink can provide long-range organization of the structure in a delicate interplay between the local structure and tertiary interactions. This may provide flexibility during the assembly of the structure, with subsequent fixation by the high-affinity binding of specific proteins to k-turns.


    شكر وتقدير

    We thank K. Makarova for assistance with the PSIBLAST search and S. Gottesman, S. Melamed, M. Raina, T. Updegrove, J. Vogel, and Z. Wroblewska for comments. Research in the M.O. lab is supported by the National Science Centre in Poland (grant no. 2014/15/B/NZ1/03330), KNOW RNA Research Centre in Poznań (grant no. 01/KNOW2/2014), and the Foundation for Polish Science (grant no. TEAM/2011-8/5), co-financed by the European Union Regional Development Fund. Research in the G.S. lab is supported by the Intramural Research Program of the يونيس كينيدي شرايفر National Institute of Child Health and Human Development. الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

    يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


    شاهد الفيديو: بناء تصنيع البروتين في الخلية: النسخ والترجمةافضل شرح (كانون الثاني 2023).