معلومة

هل التعبير البروتيني الفيروسي مهم للقاح الببتيد؟

هل التعبير البروتيني الفيروسي مهم للقاح الببتيد؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أود أن أعرف ما إذا كانت البروتينات المعبر عنها بكميات أعلى ، مثل DNA polymerase ، ستكون أفضل لقاح لقاح قائم على الخلايا التائية.


للعثور على البروتينات المرشحة التي يمكن استخدامها كلقاح ببتيد ، يجب أن تفي هذه ببعض المعايير:

  • الأهم هو أن الببتيد (أو البروتين) يستخدم
    يجب ألا يكون للتلقيح تسلسل وثيق الصلة في الكائن الحي الذي سيحدث فيه التطعيم. وبخلاف ذلك ، قد لا يحدث أي رد فعل (بسبب التحمل المناعي للذات) أو تفاعل مناعي ذاتي.
  • يجب التعبير عن الببتيد / البروتين على سطح الميكروب (إما فيروس أو بكتيريا) لأنه بخلاف ذلك لن يتعرف عليه الجهاز المناعي. كما أن نطاقات لقاح مرشح محتمل داخل الغشاء ليست مفيدة.
  • يجب أن تكون الحاتمة مستقرة بدرجة كافية لاستخدامها كلقاح وأيضًا أن تكون موجودة على الميكروب (وإلا فلن يكون هناك تفاعل مناعي).

إذا كنت ترغب في قراءة المزيد حول هذا الموضوع ، فهناك ورقة مثيرة للاهتمام من منظمة الصحة العالمية متاحة ، والتي تقدم مقدمة لطيفة:

للإجابة على سؤالك: لا ، لا يمكن استخدام هذه البروتينات لهذا الغرض ، لأنها ترتبط ارتباطًا وثيقًا نسبيًا بنفس البروتينات في جسم الإنسان. من المحتمل أن يؤدي هذا إلى عدم وجود تفاعل مناعي على الإطلاق. بالإضافة إلى ذلك ، توجد هذه البروتينات داخل الخلايا وبالتالي لا تتعرض لجهاز المناعة.


السؤال الأصلي يسأل عن تطوير لقاح ضد الفيروس. تستثير أكثر اللقاحات المضادة للفيروسات فاعلية استجابات من الأجسام المضادة التي يفترض أنها تحمي من خلال تحييد الفيروسات عند دخولها الجسم. بوب سدر لديه مراجعة جيدة لهذا الموضوع - قد تجد مناقشة ذات صلة بهذا الموضوع في القسم المعنون "الأهداف الفيروسية لتحريض المناعة الخلطية". لن تؤدي هذه اللقاحات بالضرورة إلى تدمير الخلايا المصابة لأن هذه وظيفة CTL.

أعتقد أن الضجيج الذي تشير إليه التكنولوجيا الحيوية يتعلق باللقاحات العلاجية ضد السرطان ، وما إلى ذلك ، والتي تثير استجابات CTL القادرة على تدمير الخلايا السرطانية. ومع ذلك ، من المهم أيضًا أن تضع في اعتبارك أن كلاً من خلايا CTL و B تحتاج إلى مساعدة CD4 T Cell من أجل التطور - لا شيء يقف بمفرده في جهاز المناعة.


الحدود في الكيمياء

انتماءات المحرر والمراجعين هي الأحدث التي يتم توفيرها في ملفات تعريف بحث Loop وقد لا تعكس موقفهم في وقت المراجعة.



مشاركه فى

مقدمة

تم الإبلاغ عن تفشي مرض الالتهاب الرئوي بشكل غير مسبوق في أواخر ديسمبر 2019 ، بعد تسجيل العديد من الوفيات في ووهان ، الصين [1]. كان هناك انتشار سريع للمرض من مدينة ووهان إلى العديد من البلدان ، بما في ذلك الولايات المتحدة ، حيث أصيب الآلاف ومات الكثير في غضون أشهر من انتشاره الأولي. [1, 2]. في 31 ديسمبر 2019 ، تم تتبع تفشي المرض إلى سلالة جديدة من فيروس كورونا [1]. تم تسميته لاحقًا بـ SARS-CoV-2 ومرض COVID-19 من قبل منظمة الصحة العالمية [3, 4]. أظهرت التقارير أنه اعتبارًا من 16 يونيو 2020 ، ما لا يقل عن 440421 حالة وفاة مؤكدة وأكثر من 8144359 حالة مؤكدة ، والإحصاءات الحالية حتى 27 نوفمبر تبلغ 1.4 مليون حالة وفاة مع 61.2 مليون حالة إصابة. [1, 5]. تم تحديد SARS-CoV-2 على أنها سلالة جديدة من فيروسات كورونا المجموعة 2B ، مع ما يقرب من 70 ٪ من التشابه الجيني مع SARS-CoV ، منذ اندلاع عام 2003 [4]. يشبه الفيروس 96٪ لفيروس الخفافيش التاجي ، لذلك يُشتبه على نطاق واسع أنه مصدره الخفافيش [6, 7]. أدى الوباء إلى فرض قيود على السفر وإغلاق على مستوى البلاد في العديد من البلدان وأدى إلى فوضى اقتصادية [1]. تم إيداع تسلسلات الجينوم في العديد من المستودعات الحيوية المنسقة عبر الإنترنت في البحث عن حلول وتطوير لقاح متاح عالميًا أمر بالغ الأهمية.

فيروسات كورونا هي مجموعة من الفيروسات التي تسبب المرض بشكل عام في الثدييات والأفيس. في حالة البشر ، تكون فيروسات كورونا مسؤولة عن التهابات الجهاز التنفسي التي يمكن أن تتراوح من خفيفة ، مثل حالات نزلات البرد والحمى المنخفضة ، وغيرها من الحالات التي يمكن أن تكون مميتة ، مثل السارس وفيروس كورونا و COVID-19 [4]. أظهرت الحالات أن الأعراض يمكن أن تختلف اعتمادًا على المضيف ، على سبيل المثال ، تم العثور على أمراض الجهاز التنفسي العلوي في الدجاج والإسهال في الأبقار والخنازير [6]. يتم تجميع فيروس كورونا تحت فصيلة فرعية Orthocoronavirinae، في عائلة Coronaviridae ، تأمر Nidovirales [5, 6]. إنها فيروسات RNA أحادية الشريطة إيجابية الحس مع قابس نيوكليوكابسيد من التناظر الحلزوني. كما أنها مغلفة ببروتينات سبايك ويتراوح حجم الجينوم للعديد من فيروسات كورونا من 27 إلى 34 كيلو قاعدة ، وهي الأكبر بين الفيروسات القهقرية المعروفة. [8]. تعتبر القفزة الحالية حيوانية المصدر للبشر مصدر قلق لأن عدوى الجهاز التنفسي العلوي يمكن أن تؤدي إلى مرض قاتل لدى بعض الأفراد. لا يزال هناك لقاح فعال لمنع أو علاج أي عدوى بفيروس كورونا البشري [4].

أظهر التحليل الهيكلي أن بروتين سبايك S1 يسهل ربط الفيريون بغشاء الخلية من خلال التفاعل مع مستقبلات ACE2 و CLEC4M / DC-SIGNR. [9]. يتم إحداث تغيير توافقي للبروتين السكري S عند استيعاب العامل الممرض الفيروسي في الحيز الداخلي للمضيف [9]. قد يؤدي تحلل البروتين بواسطة مجموعة من عائلات الكاتيبسين الليزوزومية L إلى الكشف عن ببتيد الانصهار لـ S2 وتنشيط اندماج الأغشية داخل الجسيمات الداخلية للمضيف. يتوسط بروتين السنبلة S2 ، الذي يعمل كبروتين اندماج فيروسي من الدرجة الأولى ، اندماج الفيريون والغشاء الخلوي. هناك ثلاث سمات توافقية للبروتين: الحالة الأصلية قبل الاندماج ، والحالة المتوسطة قبل الانصهار ، وحالة دبوس الشعر بعد الاندماج [9]. أثناء اندماج غشاء الخلية الفيروسي والهدف ، تفترض المناطق الملتفة (يتكرر heptad) بنية قاطعة من دبوس الشعر ، وتضع ببتيد الانصهار بالقرب من المنطقة الطرفية C للنطاق الخارجي [10]. يسهل هذا التكوين الهيكلي الاندماج اللاحق للبروتين الفيروسي وغشاء الخلية المستهدف [10]. عند الالتقام الخلوي ، يعمل بروتين السنبلة S2 كببتيد اندماج فيروسي ويتم كشفه بعد انقسام S2 الذي يحدث عند الالتقام الفيروسي [10]. تم تحديد مجال ربط المستقبلات (RBD) على البروتين الشائك المقترن بمستقبل ACE2 الخلوي الذي يميز جزءًا من الآلية الجزيئية المحيطة بالدخول الفيروسي والعدوى [11, 12]. أظهرت الدراسات أن تحريض الأجسام المضادة المعادلة وعملية ربط الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 (ACE2) التي تساعد في الدخول الفيروسي تتم بوساطة RBD للمنطقة S1 من البروتين S [13]. أظهرت الدراسات التجريبية أيضًا أن الاستنفاد المستمر للأجسام المضادة لـ RBD من مكونات المصل قلل من قدرة تحييد المصل ، مما يشير إلى أن هذا المجال هو المسيطر في تحييد تحريض الجسم المضاد [14]. الدور المحوري لبروتين S في العدوى الفيروسية جعله مرشحًا رئيسيًا لإنتاج اللقاح. يوجد حاليًا أكثر من 90 لقاحًا مرشحًا لـ SARS-CoV-2 [1]، وقد يوفر اللقاح المستند إلى الحاتمة نهجًا تكميليًا مفيدًا من شأنه أن يوجه المناعة إلى الحواتم المناعية على البروتين S. باستخدام المعلوماتية المناعية ، أصبح من الممكن الآن تقييم الخصائص المناعية للبروتينات عبر الطرق الحسابية (في السيليكو) بكفاءة عالية [15–17]. لذلك استخدمنا في السيليكو نقطة تفتيش لتصميم لقاح قائم على الببتيد الحاتمي ضد السارس-CoV-2 المرتفع للبروتين السكري وأيضًا محاكاة نطاق الاستجابات في سيناريو التعزيز الأولي.


وظيفة بروتين سبايك

تنتشر فيروسات كورونا على نطاق واسع في الطبيعة ويمكن أن يتسبب انتقالها من حيواني المصدر إلى البشر في حدوث مرض وبائي. بعد الدخول في الجهاز التنفسي أو الجهاز الهضمي ، تثبت هذه الفيروسات نفسها عن طريق الدخول وإصابة الخلايا الضامة اللمعية والخلايا الظهارية. يتم تنظيم برامج دخول الخلايا لهذه الفيروسات بواسطة بروتينات سبايك الفيروسية (S) التي تربط المستقبلات الخلوية وتتوسط أيضًا في اندماج غشاء الخلية الفيروسية. خذ SARS-CoV على سبيل المثال. يلعب البروتين الشائك (بروتين S) الخاص بفيروس SARS-CoV دورًا محوريًا في العدوى الفيروسية والتسبب في المرض. يتعرف S1 على مستقبلات المضيف ويرتبط بها ، وتسهل التغييرات التوافقية اللاحقة في S2 الاندماج بين الغلاف الفيروسي وغشاء الخلية المضيفة.

امتدت النماذج التي تصور حدث اندماج الغشاء بوساطة S من معرفة هياكل ووظائف البروتين S. جزئيًا ، تعتبر هذه النماذج معقولة لأن مطابقة 6-HB بعد الانصهار في بروتينات SARS و MHV S تشبه بشكل لافت للنظر أشكال ما بعد الاندماج لأنفلونزا HA2 و paramyxovirus F2 و Ebolavirus GP2 و HIV gp41. بالتشابه مع بروتينات الاندماج الفيروسي التي تمت دراستها على نطاق واسع والمفهومة جيدًا ، يُنظر إلى عملية اندماج الغشاء بوساطة CoV S بشكل عام على أنها مخطط في الشكل 3.

الشكل 3. الشكل 3. تخطيطي من CoV ارتفاع البروتين بوساطة الانصهار الغشاء. تمثل الرسوم التوضيحية عدة خطوات لتغييرات تكوين بروتين S التي قد تحدث أثناء اندماج الغشاء. في الخطوة الأولى ، يؤدي ارتباط المستقبلات و / أو تقليل الأس الهيدروجيني و / أو تحلل البروتين S إلى تفكك S1 عن S2. تم توثيق هذه الخطوة لبعض MHVs. في الخطوة الثانية ، يتم إقحام الببتيد الانصهار (FP) في غشاء الخلية المضيفة. هذه هي المرحلة المتوسطة الانصهار. في المرحلة الثالثة ، يتم إعادة طي الجزء من بروتين S الأقرب إلى غشاء الفيروس على قلب heptad كرر 1 (HR1) لتشكيل حزمة الحلزون السداسي (6-HB) ، وهي التكوين النهائي لما بعد الانصهار لبروتين S2.


مناقشة

انتشر فيروس SARS-CoV-2 ، وهو الفيروس ذو الأهمية الحيوانية الكبيرة ومعدل انتقاله ، بسرعة في جميع أنحاء العالم ويسبب COVID-19 الذي يهدد الحياة (Gorbalenya et al. ، 2020). يتزايد عدد الإصابات بفيروس SARS-CoV-2 والوفيات اللاحقة يومًا بعد يوم (Tai et al. ، 2020) ، وبالتالي ، تم إعلان تفشي COVID-19 كحالة طوارئ صحية عامة من قِبل International Concerns (Hui et al. ، 2020 Zhou et al.، 2020a). يحاول المجتمع العلمي في جميع أنحاء العالم تطوير لقاح فعال وآمن ضد هذا السارس - CoV-2 سريع الظهور (Abdelmageed et al. ، 2020). على الرغم من أن عددًا كبيرًا من اللقاحات المرشحة لـ COVID-19 تخضع للتجارب الآن ، فقد تم تحويل بعضها إلى التجارب البشرية (لين ، 2020) ، لم يتم الإعلان حتى الآن عن كونها فعالة وآمنة للوقاية من عدوى SARS-CoV-2. من اللافت للنظر أنه لا توجد أدوية أو لقاحات علاجية فعالة حتى الآن متاحة لعلاج مرضى SARS-CoV-2 (Hoque et al.، 2020a). من خلال دراسة جينومية وبروتينية شاملة ، نسعى لتصميم لقاح خيمري متعدد الحلقات (مناعي) مستضد لـ SARS-CoV-2 ، المسمى CoV-RMEN (417 aa) ، والذي سيلغي تورط الانتقال الفيروسي للهروب من المختبر ، وتقليل التكلفة ، وقد تثير المناعة عن طريق التحفيز الانتقائي للخلايا B و T الخاصة بالمستضد.

يمثل النهج الجديد لتصميم اللقاحات متعددة الحاتمات (بما في ذلك الحاتمات المتعددة المحفوظة) تحفيز مناعة خلوية محددة ، وأجسامًا مضادة قوية للغاية ضد العدوى (داود وآخرون ، 2019 يونغ وآخرون ، 2019 Gralinski & amp Menachery ، 2020 Kibria ، Ullah & أمبير مياه ، 2020). توفر هذه اللقاحات المستندة إلى الحاتمة أيضًا مزيدًا من الأمان ولديها القدرة على التركيز على الاستجابات المناعية المستدامة بسبب تضمين حواتم متعددة محفوظة. على عكس بروتين S كامل الطول ، تمتلك مقاطع RBD و NTD مجالات تحييد حرجة دون أي منطقة مناعية غير معادلة (Ul Qamar et al. ، 2019 Gralinski & amp Menachery ، 2020 Shang et al. ، 2020 Wrapp et al. ، 2020) . قد تمكن الطفرات على RBD السلالات الجديدة من الهروب من التحييد عن طريق الأجسام المضادة التي تستهدف RBD ، وبالتالي يجب مراعاة المناطق الوظيفية الأخرى ، وخاصة NTD ، لتطوير لقاح فعال أيضًا (Wang et al. ، 2019 Zhou et al. ، 2019). إلى جانب ذلك ، تسبب الإعطاء المشترك لبروتينات RBD و NTD في إحداث أجسام مضادة شديدة التحييد ومناعة وقائية طويلة الأمد في النماذج الحيوانية (Song et al. ، 2018). بالنظر إلى منظورات السلامة والفعالية ، فإن RBD و NTD هما مرشحان واعدان أكثر في تطوير لقاحات SARS-CoV-2 على بروتين S الكامل. يمكن أن يؤدي وجود بروتينات E و M على الغلاف إلى زيادة الاستجابة المناعية ضد SARS-CoV (Millet & amp Whittaker، 2015 Almofti et al.، 2018) وبالتالي يعتبر مرشحًا مناسبًا لتطوير اللقاح (Yong et al.، 2020 Ahmed ، Quadeer & amp McKay ، 2020 Gralinski & amp Menachery ، 2020). وبالتالي ، فإن الأجسام المضادة ضد الحمم المناعية الجوهرية لبروتينات S و M و E من SARS-CoV-2 ستوفر مناعة وقائية ضد العدوى (Yong et al. ، 2020 Ahmed ، Quadeer & amp McKay ، 2020 Gralinski & amp Menachery ، 2020 Shang et al. ، 2020). لذلك ، فإن الاستجابة المناعية التي تستهدف RBD و / أو NTD للبروتين السكري S و M و E لبروتينات SARS-CoV-2 ستكون تدخلات وقائية وعلاجية مهمة ، والتي يمكن اختبارها بشكل أكبر في نماذج مناسبة قبل التجارب السريرية (Chan et آل ، 2020).

تعتمد المناعة الفعالة للعدوى الفيروسية بشكل كبير على تنشيط كل من الخلايا البائية والتائية (شي وآخرون ، 2015 شي وآخرون ، 2019). لذلك ، من خلال إحداث مناعة خلطية أو خلوية معينة ضد مسببات الأمراض ، يجب أن يحتوي اللقاح المثالي على كل من حاتمات الخلايا البائية والخلايا التائية. كشفت تحليلاتنا أن مناطق RBD و NTD المختارة في CoV-RMEN تحتوي على كمية وافرة من الخلايا B عالية التقارب ، و MHC Class I ، و MHC Class II و interferon-(IFN-γ) حواتم مع درجات عالية من الاستضداد. علاوة على ذلك ، عززت حاتمة الخلية B الغشائية (MBE) وحاتمة الخلية B المغلفة (EBE) الاستقرار العام ، والاستمناع والاستدقاق لـ CoV-RMEN. كان تطور خلايا الذاكرة B والخلايا التائية واضحًا ، مع استمرار الذاكرة في الخلايا البائية لعدة أشهر. تتعارض هذه النتائج مع العديد من التقارير السابقة التي اعتبرت الاستجابة المناعية التي تتوسط فيها الخلايا التائية استجابة طويلة الأمد مقارنة بالخلايا البائية (Abdelmageed et al.، 2020 Wrapp et al.، 2020). من النتائج المثيرة الأخرى لهذه الدراسة تطوير استجابة Th1 التي تعزز نمو وتكاثر الخلايا B التي تزيد من المناعة التكيفية (Carvalho et al. ، 2002). إذا حدثت استجابة قوية للخلايا B في التجارب على الحيوانات (الفئران أو الأرانب) ، فيمكن استخدام هذه الأجسام المضادة في أغراض التشخيص ، حيث يجب أن تتعرف على المستضدات البارزة على سطح الفيروس (Kibria ، Ullah & amp Miah ، 2020). علاوة على ذلك ، تلعب استجابات الخلايا التائية CD8 + و CD4 + دورًا رئيسيًا في المناعة المضادة للفيروسات (Abdelmageed et al.، 2020). هناك حقيقة مهمة أخرى وهي أن المستقبلات الشبيهة بالرصاص (TLRs) يمكن أن ترتبط بشكل فعال ببروتين سبايك من CoV (Totura et al. ، 2015 Zander et al. ، 2017) ، وقد تلعب دورًا مهمًا في الاستجابة المناعية الفطرية لـ SARS- عدوى CoV-2 (Shahabi et al. ، 2020).

كشفت الخصائص الفيزيائية والكيميائية أيضًا عن الوهم كبروتين أساسي أو قلوي (pI = 8.71) وسيكون ثابتًا للحرارة عند التعبير ، وبالتالي ، فإن لقاحنا المقترح CoV-RMEN سيكون الأنسب للاستخدام في جميع أنحاء العالم في المناطق الموبوءة المختلفة (Shey et al. ، 2019 Ul Qamar et al.، 2019). أظهرت الأشكال الهيكلية (الثانوية والثالثية) لـ CoV-RMEN ، عند اختبارها على أنها الببتيدات الاصطناعية ، القدرة على الانطواء في بنيتها الأصلية ، وبالتالي يمكن أن تحاكي العدوى الطبيعية بواسطة SARS-CoV-2 (Almofti et al. ، 2018 ). قدم الهيكل الثلاثي (3D) المكرر لبناء اللقاح النهائي بشكل ملحوظ الميزات الهيكلية المرغوبة بناءً على تنبؤات مؤامرة Ramachandran (Shey et al. ، 2019 Srivastava et al. ، 2019). أظهر تحليل الالتحام الجزيئي أن البروتين الخيمري المتوقع يمكن أن يؤسس تفاعلات بروتينية مستقرة مع TLRs (TLR-2 ، TLR-3 ، TLR-4) (Totura وآخرون ، 2015). يعد التنشيط الفعال للجزيئات السطحية لـ CoV-RMEN أمرًا بالغ الأهمية للتنشيط المناعي للخلايا المتغصنة ، ومعالجة المستضد اللاحقة وعرضها على خلايا CD4 + و CD8 + T عبر MHC-II و MHC-1 ، على التوالي (شي وآخرون ، 2015 Shey et al.، 2019 Shang et al.، 2020). كشفت محاكاة الديناميكيات الجزيئية أيضًا أن مجمعات CoV-RMEN-TLRs الراسية كانت مستقرة ، ولديها تقارب ارتباط أكبر TLR-3 و TLR-4 (أبراهام وآخرون ، 2015). علاوة على ذلك ، أظهر CoV-RMEN درجات مستضدية جيدة على Vaxijen v2.0 و ANTIGENpro مما يشير إلى أن تسلسلات الببتيد هذه من المفترض أن تكون مستضدية بطبيعتها (Shey et al. ، 2019). تعزز الخصائص غير المسببة للحساسية لـ CoV-RMEN من إمكاناتها كمرشح للقاح (Shey et al. ، 2019 Ul Qamar et al. ، 2019).

أظهرت المحاكاة المناعية لـ CoV-RMEN النتائج المتوقعة المتوافقة مع الاستجابات المناعية النموذجية ، وكان هناك استجابات مناعية متنامية بعد التعرض للمستضد المتكرر (الشكل 6). زاد السيتوكين المضاد للفيروسات IFN-ومستوى IL-2 المحفز للخلايا بشكل كبير ، مما يساهم أيضًا في الاستجابة المناعية اللاحقة بعد التطعيم في المضيف (Almofti et al. ، 2018). يشير هذا إلى مستويات عالية من الخلايا التائية المساعدة وبالتالي إنتاج أجسام مضادة فعالة ، مما يدعم الاستجابة الخلطية (Shey et al. ، 2019). IC أقل50 تشير القيمة إلى تقارب ارتباط أعلى للحلقات بجزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير من الصنف الأول والثاني. في حين أن معظم الدراسات السابقة (Sakib et al. ، 2014 Adhikari، Tayebi & amp Rahman، 2018) ذكرت أن تقارب ملزم (IC50) عتبة 250 نانومتر تحدد روابط الببتيد المعترف بها من قبل الخلايا التائية ، ويمكن استخدام هذه العتبة لتحديد الببتيدات ، لقد حافظنا على تقارب ملزم خلال 50 نانومتر للحصول على مستوى ثقة أفضل في التنبؤ بحلقات MHC-I و MHC-II الأليلات. قدر مؤشر سيمبسون أن الخصوصية النسيليّة تشير إلى وجود استجابة مناعية متنوعة محتملة وهذا أمر معقول بالنظر إلى أن الببتيد الخيمري المتولد يتكون من حواتم خلايا B و T كافية (الشكل 6).

كشف التفاعل بين حواتم الخلايا التائية وأليلات HLA الخاصة بها عن تقارب ارتباط كبير يعكس التنشيط المناعي للخلايا B و T كما تدعمه التقارير الأخرى (Srivastava et al. ، 2019 Jaimes et al. ، 2020). غطت حواتم الخلايا التائية من مناطق RBD و NTD التي تُظهر تفاعلًا عاليًا مع أليلات HLA أكثر من 98 ٪ من سكان العالم بمجموعات عرقية مختلفة ، وقد دعمت هذه النتائج العديد من الدراسات السابقة (Huang et al. ، 2007 Jaimes et al. ، 2020 Ul Qamar et al.، 2019). أدى دمج روابط GG و EGGE بين الحلقات المتوقعة لـ CoV-RMEN إلى إنتاج متواليات ذات مناعة توصيلية أقل ، وسمح ببناء تصميم عقلاني للقاح قوي متعدد الحلقات (Huang et al. ، 2007 Badawi et al. ، 2016 Shey وآخرون ، 2019 سريفاستافا وآخرون ، 2019). يساعد الارتباط بالجليكوزيل في المستضدات السطحية الفيروسات المغلفة على تجنب التعرف عليها من قبل الجهاز المناعي المضيف ، ويمكن أن تؤثر على قدرة المضيف على رفع استجابة مناعية تكيفية فعالة (بيريرا وآخرون ، 2018) أو حتى استغلالها من قبل الفيروس لتعزيزها. العدوى (Wolfert & amp Boons ، 2013). علاوة على ذلك ، تطورت بعض الأجسام المضادة مثل mAb 8ANC195 للتعرف على حاتمة الببتيد دون الاعتماد على الارتباط بالجليكان (Kong et al. ، 2015). ومع ذلك ، لا توجد بيانات متاحة عن الأجسام المضادة الخاصة بالبروتينات السكرية المرتفعة لـ SARS-CoV-2 ، سواء تم التداخل مع التعرف عليها عن طريق الارتباط بالجليكوزيل في السنبلة أو يمكن تقويتها بواسطة السكريات القريبة من حاتمة الببتيد ، أو لا تتداخل مع تعديل السكر ( Zhou et al.، 2020b). علاوة على ذلك ، فإن معظم حواتم CoV-RMEN لا تحتوي على جليكوسيد باستثناء منطقة NTD (واتانابي وآخرون ، 2020). علاوة على ذلك ، فإن معظم الجليكانات الموجودة في حلقات NTD موجودة في نهايات مستضدات HLA المفترضة ، وقد لا تتداخل مع عرض المستضد في مركب HLA (جرانت وآخرون ، 2020). تشير تكامل مستقبل ACE2 الخاص بـ RBD ، وحاتمة الخلية B للبروتين المغلف (EBE) وبروتين الغشاء B-cell epitope (MBE) في CoV-RMEN إلى أن اللقاح قد يحافظ على فعاليته على الرغم من الانجراف المستضدي وظاهرة الارتباط بالجليكوزيل ، طالما يستمر الفيروس في استهداف نفس مستقبل المضيف (جرانت وآخرون ، 2020).

تتمثل إحدى الخطوات الأولى في التحقق من صحة اللقاح المرشح في فحص نشاط المناعة من خلال التحليل المصلي. هذا يتطلب التعبير عن البروتين المؤتلف في مضيف مناسب. نظرًا لأننا ركزنا على الحواتم بدون الارتباط بالجليكوزيل أو الارتباط بالجليكوزيل غير الهام ، فقد تم تحسين التعبير عالي المستوى للقاح في نظام تعبير بدائي النواة راسخ وفعال من حيث التكلفة بكتريا قولونية سلالة K-12 كخيار أول باستخدام petite البلازميد الذي يحتوي على علامة SUMO (معدل صغير يشبه Ubiquitin) وعلامة 6x-His سهلت كلاً من الذوبان وتنقية التقارب للبروتين المؤتلف (Biswal et al. ، 2015). كشف تحسين Codon لـ CoV-RMEN عن تعبيره عالي المستوى في بكتريا قولونية (سلالة K12). كانت بنية mRNA المستقرة ، ومؤشر التكيف مع الكودون (0.87) ، ومحتوى GC (50.26٪) مواتية للتعبير عالي المستوى عن البروتين في البكتيريا. بعد الاستنساخ الناجح للجين ، يمكن نشر البلازميد المؤتلف بكفاءة باستخدام بكتريا قولونية الخلايا ، ويمكن إجراء التعبير البروتيني اللاحق فيها بكتريا قولونية سلالة K-12 باستخدام IPTG (Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside) الحث ، والزراعة عند 28 درجة مئوية كما ورد سابقًا (Biswal et al. ، 2015).

كبديل ل بكتريا قولونية، خط الخلايا حقيقية النواة ، تم اعتبار HEK-293 لتعبير CoV-RMEN. كان مؤشر تكييف الكودون (CAI) ومحتوى GC 1.0 و 61.60 على التوالي ، مما يشير إلى مستوى عالٍ من التعبير عن بنية اللقاح في خط خلية HEK-293. في هذه الحالة ، يمكن استخدام ناقل التعبير للثدييات pSec Tag2 ، والذي يحتوي على إشارة إفراز من منطقة V-J2-C من سلسلة Ig kappa للفأر للإفراز الفعال للبروتين المؤتلف ، علامة بولي هيستيدين C- الطرفية (6xHis) للتنقية السريعة باستخدام حاتمة C-termnal c-myc للكشف عن الجسم المضاد للفطريات الفطرية. لإزالة علامات التقارب والكشف (علامته و c-myc epitope) بعد التنقية ، يمكن إضافة موقع انشقاق العامل Xa (LVPR ↓ GS) إلى الطرف C الخاص بـ CoV-RMEN (Waugh ، 2011).


لقاحات موجهة ضد فيروس كورونا

أبلغت عدة مجموعات عن التقييم قبل السريري للقاحات التي تستخدم فيروسات أخرى كناقلات لبروتينات السارس ، بما في ذلك فيروس الإنفلونزا الخيمري ، و MVA ، وفيروس داء الكلب ، وفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV) ، والفيروس الغدي. تم استخدام فيروس الأنفلونزا الخيمري البقري / البشري 3 (BHPIV3) ، وهو لقاح حي موهن لقاح فيروس الإنفلونزا ، كناقل للبروتينات الهيكلية لـ SARS-CoV بما في ذلك S ، N ، المصفوفة (M) ، والمغلف (E) ، بمفرده أو في مزيج. تُظهر الدراسات التي أجريت على اللقاحات الموجهة كذلك أن تحريض NAbs الخاصة ببروتين S كافٍ لمنح الحماية.


الاستنتاجات

باختصار ، يوفر عملنا المجموعة الأكثر شمولاً من كل من حواتم الخلايا CD4 + و CD8 + T التي تغطي جينوم SARS-CoV-2 بأكمله وتربط مجموعة واسعة من أليلات HLA-I و HLA-II. سيؤدي الجمع بين قائمة الحاتمة هذه مع مراعاة مستويات التعبير البروتيني وتغطية السكان والحفاظ على التسلسل الفيروسي إلى إنشاء قائمة قصيرة من حاتمة اللقاح المرشحة التي من المحتمل أن تكون مناعية في غالبية السكان. ستكمل قائمتنا المتوقعة من حواتم الخلايا CD4 + و CD8 + T حواتم الخلايا البائية وستعمل كمورد للمجتمع العلمي لتوليد حواتم لقاح قوية لـ SARS-CoV-2 وتوليد مناعة طويلة الأمد للخلايا التائية.


مناقشة

هناك ما يقرب من 200 لقاح مرشح قيد التطوير استنادًا إلى 6 منصات تكنولوجية: اللقاحات المعطلة ، ولقاحات الوحدات الفرعية البروتينية ، ولقاحات mRNA ، ولقاحات الحمض النووي ، ولقاحات ناقلات الفيروس غير المتكاثرة / المتماثلة ، ولقاح الجسيمات الشبيهة بالفيروسات ، (تقرير منظمة الصحة العالمية للمناظر الطبيعية بحلول 3 نوفمبر / تشرين الثاني) ، 2020) (13). من بين هؤلاء ، يدخل 47 مرشحًا التطوير السريري (المرحلة 1-3). أظهرت النتائج الأولية لهذه اللقاحات استجابات مناعية مرضية في كل من مرحلتي التجارب السريرية قبل السريرية ومراحل التجارب السريرية المبكرة. على سبيل المثال ، لقاح mRNA الذي طورته شركة Moderna ، والذي يعبر عن ارتفاع كامل مع طفرات 2 برولين (mRNA-1273) لتحقيق الاستقرار في بروتين السنبلة في شكل تمهيد [28 ، 29] ، أظهر استجابة وحماية NAb قوية بعد التحدي الفيروسي في سلالات الفئران والرئيسيات غير البشرية. تم الكشف أيضًا عن استجابات خلايا CD4 + T وخلية T الجرابية المساعدة [29]. تم أيضًا اختبار نسخة من النوع البري من بروتين سبايك المستخدم في لقاحات ناقلات الفيروس ، مثل ChAdOx1 nCoV-19 ، التي طورتها جامعة أكسفورد وأسترا زينيكا. طورت قرود المكاك المحصنة استجابات NAb و Th1 وكانت في الغالب محمية من تكاثر الفيروس بعد الطعن [30]. تم أيضًا تقييم إصدارات سبايك أخرى مثل مجال تقليم RBD باستخدام منصة mRNA (BNT162b1) التي طورتها BioNTech-Pfizer. في الآونة الأخيرة ، أبلغت شركة Pfizer عن مقارنة مباشرة بين BNT162b1 مع BNT162b2 والتي تشفر بروتين سبايك كامل الطول مع طفرات دي برولين. أظهرت النتائج عيار جسم مضاد مشابه لكن BNT162b2 زودت بملف تعريف أمان أكثر ملاءمة [31]. على الرغم من الإبلاغ عن عيار NAb في جميع اللقاحات المرشحة ، إلا أنه من الصعب مقارنة النتائج بسبب التقنيات والقراءات المختلفة في قياس NAb [32].

في هذه الدراسة ، اخترنا منصة لقاح الحمض النووي لأن ميزتها هي أنه يمكن إنتاجها في وقت قصير محدود [33]. كان العمود الفقري للبلازميد ونظام التعبير المستخدم في هذا دليلاً سابقًا على فعاليته في لقاح الدنا لحمى الضنك [25 ، 34]. كان الهدف هو التحقيق في مناعة ارتفاع SARS-CoV-2 إما كنوع بري كامل الطول أو تم اقتطاعه كـ S1 أو S2 في منصة تصميم لقاح الحمض النووي هذه في نموذج الفئران.

هنا ، أظهرنا أن المرشحين لقاح الحمض النووي لـ SARS-CoV-2 قد أثاروا استجابات مناعية خلطية وخلطية كبيرة خاصة بالفيروس. على الرغم من أن RBD هو حاليًا المستضد المستهدف الرئيسي في العديد من اللقاحات المرشحة ، فقد اخترنا S أو S1 بدلاً من RBD لأنه تم الإبلاغ سابقًا عن وجود حواتم تحييد SARS-CoV-2 القوية أيضًا خارج منطقة RBD. على سبيل المثال ، كشف تحليل مصل مرضى COVID-19 أن الأجسام المضادة المعادلة كانت موجهة أيضًا ضد الحواتم في N-terminal [35] ومجال C-terminal [36 ، 37] من بروتين S1. اتفقت الدراسة السابقة أيضًا مع هذه النتيجة أن بروتين S1 المؤتلف أكثر مناعة من بروتين RBD عندما تم تحليل إجمالي IgG و IgA و NAb [38]. كشف تحليل فئة IgG الفرعية في جميع تركيبات اللقاح عن استجابة مختلطة من IgG2a و IgG1 (الشكل 3 ب). هذا يعني أن مرشحي لقاح الحمض النووي لـ SARS-CoV-2 قد تسبب في استجابات متوازنة من Th1 / Th2 يمكن أن تتجنب القلق من مرض الجهاز التنفسي المعزز المرتبط باللقاح (VAERD) الناجم عن طريقة لقاح Th2-bias [21].

على الرغم من أن الجسم المضاد لارتباط البروتين الكلي تم العثور عليه عند مستوى مماثل في الفئران عندما تم إعطاء لقاح S- أو S1- أو S2-DNA (الشكل 3) ، تم العثور على أعلى نشاط معادل للفيروس الحي بشكل ملحوظ في المجموعة الملقحة S-DNA . ربما كان نشاط التحييد المنخفض ناتجًا عن عدم وجود بنية ثلاثية الأبعاد للبنية S1 [11 ، 39]. من ناحية أخرى ، من المحتمل أن تشكل بنية S بنية ثلاثية مماثلة لتلك الموجودة في السنبلة على الهيكل الفيروسي [11 ، 39]. علاوة على ذلك ، يمكن أيضًا التوسط في تفوق S على بنية S1 من خلال تضمين منطقة S2 [11 ، 40]. كما هو موضح في النتيجة ، يكون S2 عالي المناعة عند تحليله بواسطة ELISA و ELISpot ولكن تم اكتشاف مستويات منخفضة من NAb. وبالتالي ، فإن الأجسام المضادة ضد S2 ، على الأقل ، قد تساعد في تعزيز نشاط التعادل الفيروسي. على سبيل المثال ، يمكن أن يمنع الجسم المضاد الموجه إلى اندماج الببتيدات اندماج الخلايا الفيروسية [41]. تم الكشف عن نشاط تحييد الجسم المضاد ضد الببتيدات الاندماجية من مصل مريض COVID-19 [42]. علاوة على ذلك ، فإن الجسم المضاد ضد تكرار اتصال سباعي (HR) 1 و HR2 (حمض أميني 1148-1159) على الوحدة الفرعية S2 توسط أيضًا في التعادل الفيروسي [37].

تلعب الاستجابة المناعية الخلوية أيضًا دورًا مهمًا في السيطرة على الفيروس حيث تم العثور على الاستجابة المناعية الخلوية دون استجابة الأجسام المضادة في الأفراد الذين تم تأكيد تشخيصهم بفيروس كوفيد -19 بدون أعراض وخفيفة [43]. علاوة على ذلك ، أظهرت دراسة سابقة أن معظم المرضى الذين تعافوا من COVID-19 لديهم خلايا CD4 + و CD8 + T الخاصة ببروتين S في الدم المحيطي [44]. ومع ذلك ، لا يزال دوره في الحماية من عدوى السارس- CoV-2 بحاجة إلى توضيح. دعمت دراسة سابقة أجريت على لقاح SARS-CoV-1 على الفئران دورًا وقائيًا للخلايا التائية [45]. وجدنا في هذه الدراسة أن أكبر قدر من استجابات الخلايا التائية الخاصة بـ SARS-CoV-2 قد لوحظ في تحصين الحمض النووي من النوع S-spike من النوع البري. تم توجيه الردود الأكثر وفرة إلى مجمعات RBD و HR1peptide. تتوافق هذه النتيجة مع نتائج تجربة إكلينيكية من المرحلة الأولى ، حيث تم تحصين المشاركين الذين تم تحصينهم بلقاح ثنائي برولين spike mRNA ، ولَّدوا استجابات جيدة لخلايا CD4 + T ضد كل من الببتيدات المجمعة S1 و S2 [16]. علاوة على ذلك ، الدراسات السابقة على حاتمة الخلايا التائية رسم خرائط على حد سواء في الجسم الحي و في السيليكو كشفت أن حلقات الخلايا التائية المناعية وجدت أيضًا في مناطق RBD و HR1 [46 ، 47].

ومع ذلك ، في دراستنا ، قدمنا ​​فقط استجابات الخلايا الطحالية الشاملة ، وسيوفر التحقيق التفصيلي حول استجابات مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية المساعدة معلومات أكثر دقة عن مناعة الخلايا التائية التي يسببها لقاح الحمض النووي. كشف تحليل ملف تعريف السيتوكين في طاف الخلايا الطحالية المستنبتة مع الببتيدات المتداخلة SARS-CoV-2 عن استجابة Th1 المنحرفة في لقاح S-DNA المرشح. وبالتالي ، فإن هذه النتيجة قد تقلل من القلق بشأن المرض المناعي الناجم عن استجابة تحيز Th2 الموجودة سابقًا في لقاحات MERS و SARS CoV-1 [48-50].

كما ورد في MERS و SARS CoV-1 ، التعزيز المعتمد على الجسم المضاد ، فإن ADE هو أحد المخاوف في استجابة الجسم المضاد التي يسببها اللقاح [51-53]. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات الحديثة أنه على عكس MERS و SARS CoV-1 ، فإن S أو RBD كامل الطول لـ SARS CoV-2 أثار استجابة قوية معادلة للجسم المضاد دون تحريض ADE في دراسات التحصين الحيواني [54 ، 55]. لتأكيد هذا القلق ، هناك ما يبرر تحليل ظاهرة ADE خاصة في دراسات التجارب السريرية.

لقد أثبت النوع البري كامل الطول المستخدم في هذه الدراسة سابقًا أنه يمكن أن يشكل بنية ثلاثية مماثلة لتلك الخاصة بطفرات 2 برولين [56]. كما تم إظهار القدرة المناعية وكذلك الفعالية الوقائية للسفرة من النوع البري كامل الطول في نماذج حيوانية مختلفة [30 ، 57 ، 58]. أظهرت الدراسة في المرحلة الأولى من التجربة السريرية أن لقاح الحمض النووي باستخدام السنبلة البرية كاملة الطول كان آمنًا ويمكن أن يحفز كل من الأجسام المضادة واستجابات الخلايا التائية [59]. يتم اختبار ChAdOx1 nCoV-19 ، وهو اللقاح المرشح الأكثر تقدمًا الذي استخدم سبايك من النوع البري كامل الطول كمستضد في التجارب السريرية للمرحلة الثالثة (ISRCTN89951424 ، NCT04516746). في الآونة الأخيرة ، أظهر التحليل المؤقت لتجارب لقاح ChAdOx1 nCoV-19 أن الفعالية الإجمالية لـ ChAdOx1 nCoV-19 كانت 70.4٪ [60]. أدى ذلك إلى الموافقة على الاستخدام الطارئ لـ ChAdOx1 nCoV-19 في بريطانيا والهند ودول أخرى. وبالتالي ، أكدت هذه النتائج أن النوع البري كامل الطول يعمل أيضًا كمستضد مرشح جيد يمكن أن يوفر مستوى عالٍ من الحماية في التجارب السريرية الكبيرة.

بسبب محدودية منشأة ABSL-3 ، لا يمكن إجراء دراسة تحدي لهؤلاء المرشحين للقاحات في هذه الدراسة. ومع ذلك ، من خلال المقارنة مع الدراسة التي يمكن أن تحول قراءة مستويات NAb إلى عيار PRNT ، فإن عيار PRNT بمتوسط ​​3log10 يمكن أن تحمي الفئران من عدوى الجهاز التنفسي [61]. This implies that the NAb titers induced by pCMVkan-S DNA immunization in this study is potentially sufficient to provide protection. However, as the correlated protective immunity has not been established for COVID-19, a challenge study in animal model to provide efficacy data is still required.

In conclusion, this study provides crucial information regarding selection of antigens for SARS-CoV-2 vaccine development. SARS-CoV-2 full length S (S1+S2) is more potent in induction of both NAb and T cells responses than the truncated S1 or S2 immunogen. This finding could be further applied for development of other vaccine modalities.


مجالات البحث الرئيسية

  • دخول الفيروس إلى الخلايا
  • تنظيم التعبير الجيني الفيروسي والمضيف
  • آليات تكاثر الحمض النووي الفيروسي
  • التكاثر الحيوي للبروتينات والجزيئات الفيروسية
  • تأثيرات عوامل النمو الفيروسي وجزيئات الدفاع المناعي
  • محددات الفوعة الفيروسية والإمراضية
  • جيل معقد التوافق النسيجي الكبير من الدرجة الأولى الببتيدات
  • خصوصية ووظيفة الأجسام المضادة للفيروسات
  • تطوير نواقل التعبير المأشوب واللقاحات المرشحة والعوامل المضادة للفيروسات
  • مجموعة واسعة من فيروسات الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، بما في ذلك فيروسات نقص المناعة البشرية / القرد ، وفيروسات الجدري ، وفيروسات الهربس ، وفيروسات الورم الحليمي ، والفيروسات التاجية ، وفيروسات الأنفلونزا ، وفيروسات ألفا والفيروسات المصفرة
  • مجموعة واسعة من الخبرات ، بما في ذلك البيولوجيا الجزيئية ، وبيولوجيا الخلية ، وعلم المناعة الخلوي ، والمناعة الخلطية ، والسرطان ، والفيروسات المؤتلفة ، واللقاحات ، والتسبب في الأمراض الفيروسية ، والميكروبيوم

Applications of Cell-Free Protein Expression Systems

As our knowledge of cell-free expression systems and their capabilities has continuously expanded, researchers have been able to exploit the various advantages of these systems to develop novel protein technologies. We explore some of these unique applications below.

Functional Genome and Proteome Analysis

Cell-free protein synthesis provides a basic, straightforward tool to aid in the identification of protein and molecular interactions, such as protein-protein, protein-nucleic acid, and protein-ligand. In order to characterize these interactions, one of the desired entities (nucleotide/ligand/protein etc.) is labelled, then incubated in a CFPS system with the other desired entity. The resulting complex is then either isolated utilizing a technique like immunoprecipitation, or detected directly by a electrophoretic mobility-shift assay (EMSA), in which protein interaction complexes are slowed when compared to their unbound counterparts (5).

Cell-free protein expression systems are also valuable tools for manufacturing protein arrays. Protein microarrays are solid-phase ligand binding assay systems that are utilized to track protein activity and interaction, and to determine protein function in a high-throughput format. Traditional cell-based generation of these protein chips is a labor-intensive process which requires expression and purification of each individual protein to be arrayed. Another drawback is long-term functional stability of the immobilized proteins is usually limited. The use of CFPS can circumvent these challenges, through the parallel synthesis of multiple proteins directly فى الموقع (on-chip).

There are several different types of protein microarrays being utilized in current research, including PISA (Protein In Situ Array), NAPPA (Nucleic Acid Programmable Protein Array) and DAPA (DNA Array to Protein Array) .

الشكل 5. Proteins produced in vitro in cell-free systems exhibit varying degrees of protein function or activity, depending on the factors necessary for correct synthesis, folding and cofactor incorporation. In this illustration the protein demonstrates luminescence once the essential cofactor ATP is present.

The PISA method, the first well-known cell-free in situ protein microarray technology, involves the rapid production of tagged proteins directly from DNA fragments by cell-free expression in solution. The individual DNA constructs that encode for the protein of interest contain a T7 promoter, sequences for translation initiation and termination, as well as an N- or C-terminal tag sequence. The DNA constructs are generated via PCR or RT-PCR utilizing a high fidelity TAQ polymerase, then cell-free coupled transcription and translation expresses the desired tagged proteins (25). Following synthesis, the proteins are simultaneously captured and immobilized in situ, by the tag-capturing coating on the surface of the slide (26).

NAPPA

NAPPA is a label-based technology, in which the DNA template is biotinylated and immobilized onto a slide pre-coated with avidin and an anti-GST antibody that functions as the protein capture reagent (27). The array can then be used for to express targeted proteins in situ by using rabbit reticulocyte lysate or similar CFPS system. Following translation, the targeted proteins are captured by the immobilized antibody in each spot, resulting in a protein array in which each protein is co-localized with its corresponding expression plasmid (28).

The NAPPA method has demonstrated particular value in the characterization of disease biomarkers and study of autoimmune disease. NAPPA-generated microarrays have been used to help identify new antibody responses to the السل الفطري proteome, effectively pinpointing 8 proteins with tuberculosis biomarker value (29). NAPPA has also been utilized to characterize autoantibody response in patients with the autoimmune rheumatic disease Ankylosing spondylitis (30), to profile circulating and synovial antibodies in patients with juvenile idiopathic arthritis (31), and to detect antibodies that bind tumor antigens in breast cancer (32).

The DNA array to protein array (DAPA) method was developed as a means of producing protein arrays on demand by printing them from a single DNA array template. In this method, a slide containing an array of immobilized PCR-amplified fragments encoding for a set of tagged proteins is assembled face-to-face with a second slide, pre-coated with a protein tag-capturing reagent. A permeable membrane containing a cell-free lysate is then sandwiched between the two slide surfaces, enabling coupled transcription and translation. Protein synthesis originates from the spots of the immobilized DNA, and the synthesized proteins diffuse through the membrane and are immobilized on the capture slide surface, creating the protein array (33).

Expression of Difficult-to-Express Proteins

Cell-free protein expression systems provide a means to produce functional proteins that are typically difficult to express, such as membrane proteins, toxic proteins and viral proteins. Using a coupled CFPS system, a complex heterotetrameric and multiple disulfide-bridged IgG molecule has been assembled successfully and completely under suitable oxidation and folding conditions (34). Various cell-free systems have also successfully been used to synthesize membrane proteins in vitro, including G-protein-coupled receptors, epidermal growth factor receptor and ATP synthase (35).

In vitro translation systems have also been used to successfully express viral proteins, virus-like particles (VLPs) and vaccine antigens. In one study, 124 المتصورة المنجلية genes of interest were synthesized in vitro as potential malaria vaccine candidates, resulting in the successful synthesis of 75% of the products in soluble form, without the need for codon optimization. Cell-free بكتريا قولونية extract systems have been applied to synthesize both VLPs and vaccines, including anti-influenza VLPs, a B-cell lymphoma vaccine and anti-hepatitis B VLPs (35).

In vitro systems have effectively produced infectious encephalomyocarditis virus (EMCV), and the entire open reading frame of hepatitis C virus RNA has been correctly translated and processed when supplemented with canine microsomal membranes (5). These studies demonstrate the enormous potential of cell-free expression systems not only as valuable tools for understanding the mechanisms of viral replication, but also as a means for vaccine discovery and prospective platform for large-scale production of vaccines (5 35).

Protein Evolution and Enzyme Engineering

Proteins are complex, versatile molecules that serve a variety of functions in the cell. Directed protein evolution is a cyclic process of alternating between the selection of functional gene variants and gene diversification, that can be utilized as a means of improving certain types of protein functions, like catalytic activity, binding affinity and thermostability (4 36). Several unique protein technologies in directed evolution, including ribosome display, mRNA display and in vitro compartmentalization, have been developed in the last thirty years using in vitro translation systems. In comparison to cell-based methods, these in vitro technologies offer several advantages, including efficient linking of genetic information (genotype) to their encoded proteins (phenotype) and broader range of library sizes.

Ribosome Display

The ribosome display method involves isolating individual proteins from polypeptide DNA sequence libraries. During in vitro translation, protein-ribosome-mRNA (PRM) complexes are established by connecting the nascent polypeptide to its encoding mRNA (1).

This PRM of interest can then be captured through affinity binding via immobilized ligand, from which the mRNA can then be recovered and reverse transcribed back into cDNA to be mutated as desired. This process can also be repeated without mutating the recovered cDNA as a means of enriching target proteins from large populations (5).

The ribosome display technology (Figure 6) has been a popular method for in vitro selection and evolution of antibodies, as well as transcription factors, receptors, proteases, enzymes, novel peptides, tag sequences and ligand-binding domains and motifs (5). Ribosome display has also been utilized in proteomics applications, leading to the identification of a sequence of 5'-untranslated region that promotes translation efficiency (37), as well as comprehensive determination of antigenic proteins for a cDNA library of Staphylococcus aureus that could be used as potential vaccine candidates (38).

الشكل 6. This illustration depicts antibody-ribosome-mRNA (ARM) complexes, which have been used as display selection particles in an in vitro eukaryotic method for selection of antibody-combining sites. An important feautre of the ARM method is that it preserves the link between the peptide of interest and the gene that encodes it.

In mRNA display technology, a large DNA library encoding the polypeptide of interest is transcribed into mRNA. The 3’ end of mRNA is ligated to a short, single-strand DNA oligonucleotide which carries an adaptor molecule, typically puromycin. The modified mRNA product is translated via cell-free protein synthesis the puromycin enters the ribosome and forms a peptide bond with the nascent polypeptide chain. Then cDNA is generated via reverse transcription to stabilize the nucleic acid component and facilitate recovery of the genetic information following selection. This cDNA can then be amplified via PCR for further study or other use (39).

This mRNA display technology has been employed in the successful directed evolution of ligases as well as ATP-binding domains from artificial random-sequence libraries (40 41). mRNA display has also been applied to obtain antigen-binding proteins that were based on the scaffold fibronectin type III, resulting in production of high-affinity molecules capable of binding TNF-alpha (42) and recognition of specific endogenous phosphorylated IkBalpha (43).

In Vitro Compartmentalization

In vitro compartmentalization (IVC) is a method of directed evolution where the objective is to split up a large reaction into many microscopic compartments, which encapsulate DNA and its associated mRNA and protein(s), in either water-in-oil emulsion microdroplets or on the surface of microbeads. Each of these droplets contain a single gene, in addition to all the necessary molecular components required, which are then transcribed and translated. Proteins that express the desired activity convert substrate into a product that will remain linked to the gene, as they are completely confined to the microdroplet. Genes that are linked to the product are either selectively enriched, amplified and characterized, or linked back to the substrate and subjected to additional rounds of selection via compartmentalization. The IVC strategy has successfully been applied in the engineering of several enzymes, including methyltransferases, polymerase and restriction endonucleases (5 44).

Screenings

Incorporating cell-free expression systems into high-throughput screening applications enables both in situ and on-demand expression of proteins and peptides. These cell-free expression high-throughput screening applications can be categorized broadly into on-chip technologies and in vitro displays, several selection methods previously discussed in the Protein Evolution and Enzyme Engineering section.

In the in vitro display selection technologies, the expressed complexes are directly screened and tested for activity, and the linked genetic sequence is used in successive rounds of enrichment. On-chip selection technologies immobilize expressed proteins in treated surfaces without their source DNA or RNA (45).

There are a variety of high-throughput screening methods currently available, all of which are capable of streamlining the traditional screening process. These screening methods include microtiter plates, digital imaging, fluorescence-activated cell sorting (FACS), cell surface display, IVTC and resonance energy transfer (46).

In vitro translation followed by screening has largely been employed in medical applications, enabling the development of the Protein Truncated Test (PTT) (Figure 7) which utilizes open reading frames of genetic diseases caused by translation-terminating mutations as diagnostics (5). Cell-free protein expression systems have also enabled screening of toxic reagents (47) and identification of translation inhibitors as potential drugs (48). Screening and production of potential vaccine candidates via in vitro protein expression led to the identification of some effective vaccines that protected mice against tumors with the same efficacy as those produced in a mammalian cell (49).

الشكل 7. This diagram illustrates production of a truncated protein (right) as compared to a normal length protein (left) using the Protein Truncation Test. This test has been used, in vitro, to determine whether a gene mutation results in a shortened translation product that may lead to a cancerous cell.

Protein Labeling and Detection

Detection of proteins expressed using cell-free systems is necessary for most applications such as protein:protein interaction and protein:nucleic acid interaction studies. Traditionally, radioactive [ 35 S]methionine has been added to cell-free expression reactions, and the methionine is incorporated into the expressed protein, allowing detection by autoradiography. Many researchers are moving away from radioactivity due to high costs, regulations, radioactive exposure and waste disposal issues. Traditional Western blot analysis provided researchers with a non-radioactive method for detection but, if performed improperly, could result in high backgrounds. However, detection methods such as FluoroTect™ Greenليس in vitro Translation Labeling System (Cat.# L5001) and the Transcend™ Non-Radioactive Translation Detection System (Cat.# L5070, L5080) allow Western blotting with sensitive detection and low backgrounds (50).

The FluoroTect™ System employs a tRNA charged with a lysine that is labeled at the e position with the BODIPY ® -FL fluorophore. These fluorescently labeled lysine residues are incorporated into synthesized proteins during in vitro translation. The Transcend™ System relies on incorporation of biotinylated lysine residues into nascent proteins during translation. The biotinylated lysine is added to the translation reaction as a charged e-labeled biotinylated-lysine:tRNA complex (Transcend™ tRNA) rather than a free amino acid. After SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and electroblotting, biotinylated proteins can be visualized by binding Streptavidin-AP or Streptavidin-HRP, followed by colorimetric or chemiluminescent detection, respectively. Typically, these methods can detect 0.5–5ng of protein, with a sensitivity equivalent to that achieved with [ 35 S]methionine incorporation and autoradiographic detection.

Transcend&trade Non-Radioactive Translation Detection Systems

The Transcend&trade Non-Radioactive Translation Detection Systems enable non-radioactive detection of proteins synthesized in vitro. Using this system, biotinylated lysine residues are incorporated into nascent proteins during translation, eliminating the need for labeling with [ 35 S]methionine or other radioactive amino acids. Biotinylated lysine is added to the translation reaction as a pre-charged e-labeled biotinylated lysine-tRNA complex (Transcend&trade tRNA) rather than a free amino acid. After SDS-PAGE and electroblotting, the biotinylated proteins can be visualized by binding either Streptavidin-Alkaline Phosphatase (Streptavidin-AP) or Streptavidin-Horseradish Peroxidase (Streptavidin-HRP), followed either by colorimetric or chemiluminescent detection. Typically, 0.5&ndash5ng of protein can be detected within 3&ndash4 hours after gel electrophoresis. This sensitivity is equivalent to that achieved with [ 35 S]methionine incorporation and autoradiographic detection 6&ndash12 hours after gel electrophoresis. For a detailed protocol and background information, please see Technical Bulletin #TB182 .

الشكل 8. Schematic representation of Transcend&trade tRNA structure.

The use of Transcend™ tRNA offers several advantages:

  • No radioisotope handling, storage or disposal is needed.
  • The biotin tag allows detection (0.5–5ng sensitivity).
  • The biotin tag is stable for 12 months, both as the Transcend™ tRNA Reagent and within the labeled proteins. It is not necessary to periodically resynthesize biotin-labeled proteins, unlike [ 35 S]-labeled proteins, whose label decays over time.
  • Labeled proteins are detected as sharp gel bands, regardless of the intensity of labeling or amount loaded on the gel, thus allowing the detection of poorly expressed gene products.
  • Results can be visualized quickly, using either colorimetric or chemiluminescent detection.

The precharged بكتريا قولونية lysine tRNAs provided in this system have been chemically biotinylated at the e-amino group using a modification of the methodology developed by Johnson وآخرون. (1976). The biotin moiety is linked to lysine by a spacer arm, which greatly facilitates detection by avidin/streptavidin reagents (Figure 8). The resulting biotinylated lysine tRNA molecule (Transcend™ tRNA) can be used in either eukaryotic or prokaryotic in vitro translation systems such as the T N T ® Coupled Transcription/Translation Systems, Rabbit Reticulocyte Lysate, Wheat Germ Extract or بكتريا قولونية S30 Extract (52). Lysine is one of the more frequently used amino acids. On average, lysine constitutes 6.6% of a protein’s amino acids, whereas methionine constitutes only 1.7% (53).

Effects of Biotinylated Lysine Incorporation on Expression Levels and Enzyme Activity

Lysine residues are common in most proteins and usually are exposed at the aqueous-facing exterior. The presence of biotinylated lysines may or may not affect the function of the modified protein. In gel shift experiments, c-Jun synthesized in T N T ® Reticulocyte Lysate reactions and labeled with Transcend™ tRNA performed identically to unlabeled c-Jun (54).

Estimating Incorporation Levels of Biotinylated Lysine

Incorporation of radioactively labeled amino acids into proteins typically is quantitated as percent incorporation of the label added. This value can include incorporation of radioactivity into spurious gene products such as truncated polypeptides. Thus, percent incorporation values provide only a rough estimate of the amount of full-length protein synthesized and do not provide any information on translation fidelity. With Transcend™ tRNA reactions, it is difficult to directly determine the percent incorporation of biotinyl-lysines into a translated protein. An alternative means of estimating translation efficiency and fidelity in Transcend™ tRNA reactions is to determine the minimum amount of products detectable after SDS-PAGE. In all cases tested, we detected translation products in 1µl of a 50µl translation reaction using as little as 0.5µl of Transcend™ tRNA (Figure 9). The amount of biotin incorporated increases linearly with the amount of Transcend™ tRNA added to the reaction, up to a maximum at approximately 2µl.

Figure 9. Effects of Transcend&trade tRNA concentration on detection of proteins synthesized in vitro. Coupled transcription/translation reactions were performed. The indicated amounts of Transcend&trade tRNA (equivalent to 2.0, 1.0, 0.5 or 0µl) were added to the translation reactions prior to incubation at 30°C for 1 hour. One microliter of the reaction was used for SDS-PAGE. The separated proteins were transferred to PVDF membrane (100V for 1 hour). The membrane was blocked in TBS + 0.5% Tween ® 20 for 15 minutes, probed with Streptavidin-AP (45 minutes), washed twice with TBS + 0.5% Tween ® 20 and twice with TBS, and incubated with Western Blue ® Substrate for 2 minutes.

Capture of Biotinylated Proteins

Biotinylated proteins can be removed from the translation reaction using biotin-binding resins such as SoftLink™ Soft Release Avidin Resin (Cat.# V2011, V2012). Nascent proteins containing multiple biotins bind strongly to SoftLink™ Resin and cannot be eluted using “soft-release” nondenaturing conditions. SoftLink™ Resin is useful, however, as a substitute for immunoprecipitation.

Colorimetric and Chemiluminescent Detection of Translation Products

Biotin-containing translation product can be analyzed in either of two ways. The product can be resolved directly by SDS-PAGE, transferred to an appropriate membrane and detected by either a colorimetric or chemiluminescent reaction (Figure 10). Alternatively, biotinylated protein can be captured from the translation mix using a biotin-binding resin such as SoftLink™ Resin. This approach is useful as a replacement for immunoprecipitation of protein complexes.

الشكل 10. Schematic of colorimetric and chemiluminescent detection of translation products.

The FluoroTect™ Green ليس in vitro Translation Labeling System

The FluoroTect™ Greenليس in vitro Translation Labeling System uses a charged lysine tRNA molecule labeled with the fluorophore BODIPY ® -FL at the epsilon (e) amino acid position of lysine (Figure 11). For the FluoroTect™ System, lysine was chosen as the labeled amino acid because it is one of the more frequently used amino acids, comprising, on average, 6.6% of a protein’s amino acids. Detection of the labeled proteins is accomplished in 2–5 minutes directly “in-gel” by use of a laser-based fluorescent gel scanner. This eliminates any requirement for protein gel manipulation such as fixing/drying or any safety, regulatory or waste disposal issues such as those associated with the use of radioactively labeled amino acids. The convenience of non-isotopic “in-gel” detection also avoids the time-consuming electroblotting and detection steps of conventional non-isotopic systems. For a detailed protocol and background information about this system, please see Technical Bulletin #TB285.

الشكل 11. Structure of FluoroTect&trade Green ليس tRNA.


شاهد الفيديو: Vaccinologe Isabel Leroux-Roels over AstraZeneca en vaccinatie tegen COVID-19 (شهر فبراير 2023).