معلومة

كيف يمكن للمرء أن يحدد ما إذا كانت البكتيريا مثبتة للنيتروجين أم لا؟

كيف يمكن للمرء أن يحدد ما إذا كانت البكتيريا مثبتة للنيتروجين أم لا؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إذا كان لديك عينة بكتيريا معزولة ، فكيف ستحدد ما إذا كانت مثبتة للنيتروجين؟


لا يهم إذا وجدت الإجابة بنفسي ، يمكنك استخدام اختبار تقليل الأسيتيلين.


أود أن أقترح إجراء بحث بيولوجي عن الجينوم البكتيري أولاً قبل إجراء التجارب. يجب أن تكون قادرًا على العثور على متماثلات لجينات "nif" (تثبيت النيتروجين) هناك.


هل وصلنا؟ المسيرة الطويلة نحو تطوير روابط تكافلية فعالة بين البكتيريا المثبتة للنيتروجين والمحاصيل غير البقولية

النيتروجين عنصر أساسي في الحياة ، وغالبًا ما يحد توافر النيتروجين من غلة المحاصيل. منذ الثورة الخضراء ، تم إنتاج كميات هائلة من الأسمدة النيتروجينية الاصطناعية من النيتروجين والغاز الطبيعي في الغلاف الجوي ، مما يهدد استدامة إنتاج الغذاء العالمي ويؤدي إلى تدهور البيئة. هناك حاجة إلى وسائل بديلة لجلب النيتروجين إلى المحاصيل ، والاستفادة بشكل أكبر من التثبيت البيولوجي للنيتروجين يبدو خيارًا منطقيًا. تُستخدم البقوليات في معظم أنظمة الزراعة حول العالم بسبب تكافل تثبيت النيتروجين مع الريزوبيا. ومع ذلك ، فإن محاصيل الحبوب الرئيسية الثلاثة في العالم - الأرز والقمح والذرة - لا ترتبط بالريزوبيا. في هذه المراجعة ، سنقوم بمسح كيف سمحت الأساليب الجينية في الجذور ومضيفيها من البقوليات بإحراز تقدم هائل في فهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في تعايش عقيدات الجذر ، وكيف تمهد هذه المعرفة الطريق لهندسة مثل هذه الارتباطات في المحاصيل غير البقولية. سنناقش أيضًا التحديات في إدخال هذه الأنظمة إلى الميدان وكيف يمكن التغلب عليها من خلال التعاون متعدد التخصصات بين علماء الأحياء التركيبية وعلماء الأحياء الدقيقة وعلماء الأحياء النباتية والمربين والمهندسين الزراعيين وصانعي السياسات.


  • "عامل الإيماءة" الذي يفرزه الريزوبيا وعلى خلايا الشعر الجذري للبقوليات.
  • تنتج سلالات مختلفة من رهيزوبيا عوامل مختلفة للإيماءة ، و
  • تنتج البقوليات المختلفة مستقبلات ذات نوعية مختلفة.

إذا كانت التركيبة صحيحة ، تدخل البكتيريا خلية طلائية للجذر ثم تهاجر إلى القشرة. [ارتباط إلى بنية الجذر.] مسارهم يمتد داخل قناة داخل الخلايا التي تنمو من خلال خلية قشرة واحدة تلو الأخرى. هذه خيط العدوى تتشكل من الخلايا الجذرية ، وليس البكتيريا ، وتتشكل فقط استجابة للعدوى.

عندما يصل خيط العدوى إلى خلية عميقة في القشرة ، فإنه ينفجر ويبتلع الجذور بواسطة الالتقام الخلوي في غشاء مغلق التعايش داخل السيتوبلازم. في هذا الوقت تمر الخلية بعدة جولات من الانقسام و [مدش] بدون الحركية الخلوية و [مدش] حتى تصبح الخلية متعددة الصيغ الصبغية.

تُظهِر الصورة المجهرية الإلكترونية الموجودة على اليمين (بإذن من د. سي جوردان) خيط عدوى ممتلئ بالجذريات ينمو في الخلية (من أعلى اليسار إلى أسفل اليمين). لاحظ كيف أن جدار خيط العدوى مستمر مع جدار الخلية. الأشكال البيضاوية المظلمة هي التكافل.

ثم تبدأ خلايا القشرة بالانقسام بسرعة لتشكل a العقدة. هذه الاستجابة مدفوعة بنقل السيتوكينينات من خلايا البشرة إلى خلايا القشرة.

تُظهر الصورة الموجودة على اليسار (مقدمة من شركة Nitragin Co. Milwaukee ، ويسكونسن) عقيدات على جذور نبات البقول.

تمر الجذور أيضًا بفترة تكاثر سريع داخل خلايا العقيدات. ثم يبدأون في تغيير شكلهم ويفقدون قدرتهم على الحركة. ال البكتيريا، كما يطلق عليهم الآن ، قد تملأ الخلية تقريبًا. الآن فقط يبدأ تثبيت النيتروجين.

يُظهر الرسم المجهر الإلكتروني الموجود على اليمين (بإذن من R.R. Hebert) خلايا مملوءة بالبكتيريا من عقيدات فول الصويا. يشير الخط الأفقي إلى الجدران بين خليتين متجاورتين من العقيدات.

العقيدات الجذرية ليست مجرد كتل من الخلايا عديمة البنية. يصبح كل منها مرتبطًا بالخشب واللحاء بالجهاز الوعائي للنبات. تُظهر الصورة أدناه على اليسار جذرًا جانبيًا نامًا على جذر البازلاء. على اليمين قطعة من جذر البازلاء تظهر أ تطوير العقيدات بعد 12 يومًا من إصابة الجذر بالريزوبيا. يرتبط كلا الهيكلين بنظام نقل المغذيات للنبات (المنطقة المظلمة تمتد عبر مركز الجذر). (الصور المجهرية مقدمة من الراحل جون جي توري.)

وبالتالي فإن تطور العقيدات ، بينما يعتمد على الجذور ، هو عملية تنموية جيدة التنسيق للنبات.

على الرغم من أن بعض بكتيريا التربة (على سبيل المثال ، أزوتوباكتر) يمكنها إصلاح النيتروجين من تلقاء نفسها ، بينما لا تستطيع ريزوبيا. من الواضح أن الريزوبيا والبقوليات يعتمدان على بعضهما البعض.

فائدة مضيف البقوليات واضحة. تجعلها الريزوبيا مستقلة عن نيتروجين التربة.

لكن لماذا البقوليات ضرورية؟ من المؤكد أن البقوليات مفيدة لأنها تزود البكتيريا بالمغذيات التي تصنع بها الكميات الكبيرة من ATP اللازمة لتحويل النيتروجين (N2) في الأمونيا (NH3)

بالإضافة إلى ذلك ، يوفر مضيف البقوليات عنصرًا مهمًا من نيتروجيناز & [مدش] الإنزيم الرئيسي لتثبيت النيتروجين.

تحتاج البكتيريا إلى الأكسجين لصنع ATP (عن طريق التنفس الخلوي). ومع ذلك ، فإن الأكسجين يثبط بشدة النيتروجين. وبالتالي يجب أن تسير البكتيريا على خط رفيع بين الأكسجين الزائد جدًا والقليل جدًا. أصبحت وظيفتهم أسهل من خلال مساهمة أخرى من مضيفهم: الهيموغلوبين.

تمتلئ العقيدات بالهيموغلوبين. الكثير منها ، في الواقع ، أن العقدة المقطوعة حديثًا حمراء. من المحتمل أن يوفر الهيموغلوبين الموجود في البقوليات (يسمى ليغيموغلوبين) ، مثل الهيموغلوبين في الفقاريات ، التركيز الصحيح للأكسجين للبكتيريا لتلبية متطلباتها المتضاربة.

المعدن الموليبدينوم هو عنصر حاسم في نيتروجيناز ولذا فهو ضروري للغاية لتثبيت النيتروجين. لكن الكميات المطلوبة صغيرة بشكل ملحوظ. تم العثور على أونصة واحدة (28.3 جم) من الموليبدينوم على مساحة فدان (0.4 هكتار) من الأراضي الزراعية في أستراليا لتكون كافية لاستعادة الخصوبة لأكثر من عشر سنوات.

تظهر الصورة على اليمين أن البرسيم البقولي ينمو بشكل طبيعي فقط عندما يكون إمداد الموليبدينوم كافياً. التربة الموضحة هنا (في شرق أستراليا) تعاني من نقص طبيعي في الموليبدينوم. على الرغم من أن قطعة الأرض المسيجة بأكملها كانت مزروعة بالبرسيم ، إلا أن النبات كان قادرًا على الازدهار وإصلاح النيتروجين فقط حيث تمت إضافة سماد الموليبدينوم (في المقدمة). (حقوق الصورة لـ A.J. Anderson.)

نظرًا لخصوصية التفاعل بين عامل Nod والمستقبل على البقوليات ، فإن بعض سلالات Rhizobia ستصيب البازلاء فقط ، وبعضها فقط البرسيم ، والبعض الآخر فقط البرسيم ، وما إلى ذلك. ممارسة زراعية روتينية. (شركة Nitragin ، التي قدمت إحدى الصور أعلاه ، متخصصة في إنتاج سلالات جذرية مناسبة لكل محصول بقولي.)


هل يمكن للمحاصيل المعدلة وراثيا والمثبتة للنيتروجين أن تحل محل الأسمدة الاصطناعية الملوثة؟

الائتمان: الاتجاهات في علوم النبات

لقد سمع شخص واحد عن المغذيات ، النيتروجين ، ولكن لماذا هو مهم للنباتات؟

إنه عنصر رئيسي في البروتينات ، سواء في الحبوب (البذور) التي نأكلها أو في الأوراق. قد تتحول الأوراق المتعطشة للنيتروجين إلى اللون الأصفر ولديها معدلات أقل من التمثيل الضوئي ، مما يحول ثاني أكسيد الكربون من الغلاف الجوي إلى نمو نباتي جديد.

للحفاظ على الغذاء بأسعار معقولة وحماية البيئة ، تحتاج نباتات المحاصيل إلى الكمية المناسبة فقط من النيتروجين ، ولكن هذا يمثل تحديًا لكل من المزارعين والعلماء. الكثير من الأسمدة النيتروجينية على المحاصيل تلوث الأنهار ومياه الآبار وتكلفتها تجعل الغذاء أكثر تكلفة. مع النيتروجين القليل جدا ، تنخفض الغلة وعدم التوازن بين العرض والطلب يجعل الغذاء أكثر تكلفة. كما أن ارتفاع أسعار الحبوب يمكن أن يجعل إزالة الغابات الاستوائية أكثر ربحية للزراعة.

يعتبر التثبيت البيولوجي للنيتروجين حلاً محتملاً لهذه المشاكل. تحصل المحاصيل البقولية مثل الفول والفول السوداني وفول الصويا والبرسيم على الكثير من النيتروجين من البكتيريا التكافلية ، المعروفة باسم الريزوبيا ، التي تأخذ غاز النيتروجين من الهواء وتحوله إلى أشكال يمكن أن تستخدمها النباتات ، مثل الأمونيا. تأتي مركبات الكربون التي تحتاجها الجذور من مضيفيها النباتيين. كان من الممكن استخدام هذه الموارد في صنع المزيد من البذور ، لذلك طورت البقوليات آليات معقدة لدعم عدم تثبيت النيتروجين أكثر مما تحتاجه. عندما تتوفر مصادر النيتروجين الأقل تكلفة مثل الأمونيا أو النترات في التربة ، فإن البقوليات تنتج عددًا أقل من العقيدات الجذرية التي تأوي البكتيريا وقد تغلق العقيدات الموجودة.

التثبيت البيولوجي للنيتروجين: فوائد بيئية وتكلفة أقل؟

هل يمكن أن تستخدم غير البقوليات أيضًا تثبيت النيتروجين بطريقة ما ، مع فوائد بيئية مماثلة؟ إذا كان الأمر كذلك ، فهل سيوفر المزارعون ما يكفي من المال على تكاليف الأسمدة لموازنة انخفاض العائد من تحويل الموارد من إنتاج البذور إلى تثبيت النيتروجين؟ أم أن إمداد النيتروجين الأكثر موثوقية قد يؤدي بالفعل إلى زيادة الغلة ، على الرغم من تكلفة الطاقة؟

لا تصنع الذرة والقمح والأرز عقيدات جذرية ، لكن بعض البكتيريا التي تعيش على جذورها أو بالقرب منها يمكنها إصلاح كميات صغيرة من النيتروجين. في علم الأحياء الدقيقة الطبيعة، ريو وآخرون. مناقشة التحسين الجيني لهذه البكتيريا. عادةً ما يصلحون القليل من النيتروجين أو لا يصلحون مطلقًا إذا تعرضوا للأكسجين ، والذي يدمر الإنزيم الرئيسي ، أو النيتروجيناز ، أو إذا كانت الأمونيا متوفرة. Ryu et al. كانوا قادرين على تغيير هذه السمات ، لكن التطبيقات العملية لعملهم بعيدة كل البعد عن اليقين ، حتى على المدى الطويل.

الائتمان: Ryu et al.

قد يبدو التخلص من قمع تثبيت النيتروجين بواسطة الأمونيا خطوة إلى الوراء من وجهة نظر بيئية. بعد كل شيء ، فإن قدرة المحاصيل البقولية على إصلاح النيتروجين ليس أكثر مما تحتاجه هو المفتاح للحد من تلوث النترات لإمدادات المياه لدينا. لكننا نريد أن يعتمد معدل تثبيت النيتروجين على احتياجات النبات الإجمالية ، وليس فقط على مستويات الأمونيا حول البكتيريا. So Ryu et al. البكتيريا المهندسة لضبط معدلات تثبيت النيتروجين استجابة للإشارات من النباتات. ومع ذلك ، لا يزال يتعين أن تأتي الطاقة من المصانع. هل فوائد تثبيت النيتروجين تبرر هذه التكلفة؟ لنكن متفائلين ونفترض أنهم سيفترضون ذلك في البداية.

لكن البكتيريا تتطور. حتى لو وفروا النيتروجين بتكلفة معقولة في البداية ، يمكن أن تنخفض الفوائد في غضون أيام قليلة فقط. تذكر الورقة & # 8220 عبء اللياقة & # 8221 من تثبيت النيتروجين ، مما تسبب في رهاب الجذور الذي يعالج المزيد من الموت. إن المتحولة "الغشائية" التي تثبت القدر الذي تحتاجه من النيتروجين فقط ، مع عدم وجود أي شيء إضافي للنبات ، ستحرر الموارد لتكاثرها وتتولى زمام الأمور.


22.1: نظرة عامة على استقلاب النيتروجين

عادة ما توصف الكيمياء العضوية بأنها كيمياء الجزيئات المحتوية على الكربون. لكن أليس هذا التعريف مركزًا للكربون بعض الشيء ، خاصة وأن انتشار الجزيئات المحتوية على الأكسجين مذهل؟ ماذا عن النيتروجين؟ نحن نعيش في جو غني بالنيتروجين (80٪) ، وجميع فئات الجزيئات الحيوية (الدهون والكربوهيدرات والأحماض النووية والبروتينات) تحتوي على النيتروجين. يعتبر الدينيتروجين مستقرًا جدًا ، نظرًا لرابطه الثلاثي وعدم قطبية. نحن نعتمد على عدد قليل من الكائنات الحية لإصلاح N.2 من الغلاف الجوي لتكوين الأمونيوم (NH4 +) ، والتي من خلال النترجة ونزع النتروجين يمكن أن تشكل النتريت (NO2 -) ، نترات (NO2 -) وأكسيد النيتريك (NO) وأكسيد النيتروز (N2O) ، وهذا الأخير هو من غازات الدفيئة القوية. سنركز على المصير الأيضي للمجموعات الأمينية في الأحماض الأمينية والبروتينات في القسم التالي. قبل استكشاف مصائرهم ، انظر إلى الشكل أدناه الذي يظهر نظرة شاملة لدورة النيتروجين البيولوجية. يجب أن تشمل دراسة الكيمياء الحيوية أكثر من الإنسان العاقل وأن تتوسع لتشمل النظام البيئي الذي نحن فيه جزء صغير ولكنه ضار.

دعنا نقسم المخطط من منظور كيميائي حيوي. هناك عمليات هوائية ولا هوائية (تقوم بها البكتيريا). تشمل المواد المحتوية على النيتروجين جزيئات غير عضوية (أمونيوم ، نترات ، نتريت) وعضوية (أحماض أمينية ، نيوكليوتيدات ، إلخ). التفاعلات الموضحة مؤكسدة واختزالية (ملاحظة: عدد أكسدة ذرات النيتروجين في الجزيئات موضح باللون الأحمر). تتم معظم التفاعلات تحت الأرض بواسطة كائنات دقيقة بكتيرية وأثرية.

فيما يلي بعض ردود الفعل الرئيسية:

  • ن2 التثبيت (التخفيض): ن2 من الهواء يتم تحويله بواسطة البكتيريا إلى أمونيوم (NH4 +) بواسطة إنزيم نيتروجيناز بدائيات النوى في التربة. يتطلب رد الفعل المستاء بقوة الكثير من ATPs. يمكن بعد ذلك تناول الأمونيوم المصنوع مرة واحدة من قبل المنتجين الأساسيين مثل النباتات ودمجها في الجزيئات الحيوية مثل الأحماض الأمينية التي تستهلكها الحيوانات. بالنسبة لأولئك الذين ما زالوا يعتقدون أن للناس تأثيرات هامشية على محيطنا الحيوي ، فكر في هذا. قد نصلح قريبًا المزيد من N2 إلى نيو هامبشاير3 من خلال تفاعل Born-Haber الصناعي (المستخدم في إنتاج الأسمدة والمتفجرات) الذي يصنعه المحيط الحيوي. يأتي الكثير من النيتروجين المستخدم من تفاعل بورن هابر. NH الزائدة4 + (أكثر من 50٪) منتج صناعي والذي يدخل التربة في الأسمدة (في الغالب على شكل NH4لا3) قد طغت على قدرة الطبيعة على موازنة دورة النيتروجين ولم يتم تناولها بواسطة النباتات. يتم استقلابه بواسطة الكائنات الحية الدقيقة إلى نتريت ونترات.
  • النترجة: يتم تحويل الأمونيوم إلى نتريت بواسطة الكائنات الحية الدقيقة الهوائية المؤكسدة للأمونيا ثم إلى نترات بواسطة مجموعة منفصلة من البكتيريا الهوائية المؤكسدة للنتريت. فيما يلي التفاعلات (Rx 1 و 2) لإنتاج النترات من خلال وسيط هيدروكسيل أمين ، متبوعًا بتكوين النترات (Rx 3).

هذه الأيونات المضافة تتجاوز سعة التربة وينتهي بها الأمر بمياه الجريان ، مما يؤدي إلى تلويث الأنهار والبحيرات.

  • نزع النتروجين: مسار التفاعل اللاهوائي هذا يعيد إنتاج N.2 من النترات هنا هو صافي التفاعل:
  • تفاعل Anammox: مسار التفاعل اللاهوائي البكتيري المكتشف حديثًا يحول الأمونيوم والنترات إلى N2. ها هو رد الفعل الصافي
  • يحدث التحنيط (يجب عدم الخلط بينه وبين التحنيط) عندما تتحلل النباتات والحيوانات ، مما يعيد الأمونيوم إلى التربة لإعادة استخدامه بواسطة النباتات والميكروبات.

تظهر هذه التفاعلات في دورة النيتروجين المختصرة أدناه.

مستقلبات النيتروجين هي مغذيات للنباتات وربما أكثر المغذيات استيرادًا في تنظيم نمو النبات (الإنتاجية الأولية) وفي تنظيم تنوع الحياة في المحيط الحيوي. تتطلب جميع الكائنات الحية مواد أولية لإنتاج الطاقة وكركائز لتفاعلات التخليق الحيوي. التي تستخدم تعتمد على الكائن الحي. تعتبر النباتات منتجة أساسية لذلك فهي تستخدم الكربوهيدرات المركبة الخاصة بها لإنتاج الطاقة والتخليق الحيوي. بالنسبة للحيوانات آكلة اللحوم ، فإن البروتينات والأحماض الأمينية المشتقة منها هي مصدر الطاقة (من خلال الأكسدة) وتعمل كسلائف حيوية. بالنسبة للكائنات النهمة ، يعتمد مصدر الطاقة على الحالة & quotfed & quot. مع الموارد الغذائية الوفيرة ، تعتبر الكربوهيدرات والدهون مصدر الطاقة. على عكس الكربوهيدرات والدهون ، التي يمكن تخزينها كجليكوجين وثلاثي جليسريد للاستخدام في المستقبل ، لا يمكن تخزين البروتين الزائد والأحماض الأمينية المرتبطة به ، لذلك يمكن التخلص من الأحماض الأمينية أو استخدامها للطاقة المؤكسدة.

في حالة التغذية ، تعتبر الكربوهيدرات هي المصدر الرئيسي ، بينما في الحالة غير المغذية ، تلعب الدهون دورًا رئيسيًا. في ظل ظروف الجوع ، يتم تكسير البروتينات الخاصة بالكائنات واستخدامها لإنتاج الطاقة المؤكسدة ولأي تخليق حيوي باقٍ. في الحالات المرضية مثل مرض السكري ، والذي يمكن تشبيهه بحالة الجوع في وجود الكربوهيدرات الوفيرة ، تصبح كل من الدهون والأحماض الأمينية مصادر الطاقة.

كيف يتم التمثيل الغذائي للأحماض الأمينية في الحيوانات بشكل مؤكسد؟ يمكن استخدام العديد من المسارات للقيام بذلك ولكن يبدو منطقيًا أن NH4 + ستتم إزالته وستدخل الكربونات الموجودة في الجزيء المتبقي في النهاية في تحلل السكر أو دورة TCA في شكل أحماض كيتونية. نيو هامبشاير4 + سام في التركيز العالي. لا يتأكسد الأمونيوم إلى نتريت أو نترات في الإنسان كما يحدث في التربة بواسطة الكائنات الحية الدقيقة. يمكن إعادة تدويرها مرة أخرى إلى نيوكليوتيدات أو أحماض أمينية ، ويتم التخلص من الكميات الزائدة من الكائن الحي. يجب التحكم في كلتا العمليتين بدرجة عالية. سننتقل إلى أكسدة الأحماض الأمينية في القسم التالي.

نيتروجيناز: مقدمة

الجمال هو في عين الناظر.

نظرًا لأن مجال الكيمياء الحيوية يغطي العالم البيولوجي بأكمله ، يمكن أن يعتمد مدى تغطية موضوع معين في الكتب المدرسية ، جزئيًا ، على اهتمامات وخبرات المؤلف (المؤلفين) الذين يقدمون المادة. هل الملاءمة مقياس يجب أن يحدد التغطية؟ إذا كان الأمر كذلك ، فإن الكتب التي تركز على الكيمياء الحيوية البشرية أو الطبية ستحذف بالتأكيد عملية التمثيل الضوئي. إذا تم اختيار الموضوعات بناءً على أهميتها في الحياة ، فيجب بالتأكيد تغطية عملية التمثيل الضوئي. إذا كان الأمر كذلك ، فيجب أيضًا تضمين النيتروجيناز. إذا تم النظر في درجة الصعوبة الكيميائية للتفاعل الكيميائي والبلاغة المذهلة لمحلول الكيمياء الحيوية المتطور ، فيجب تقديم كل من التركيب الضوئي وتثبيت النيتروجين. على الرغم من أن تثبيت النيتروجين هو تفاعل اختزالي ، إلا أنه يشترك في أوجه تشابه قوية مع مجمع الأكسجين المتطور لعملية التمثيل الضوئي. إنها تحفز تفاعلات الأكسدة والاختزال المهمة للغاية والتي تتضمن غازًا وفيرًا في الغلاف الجوي باستخدام عامل مساعد معدني غير عضوي معقد للغاية وفريد ​​من نوعه والذي اختاره التطور على أنه مناسب بشكل فريد للوظيفة.

يمكن لكل طالب في السنة الأولى في الكيمياء رسم بنية لويس للدينتروجين ، إن2الذي يحتوي على رابطة ثلاثية وزوج وحيد على كل نيتروجين. إذا تحدثت هياكل لويس إليهم ، فيجب أن يكونوا قادرين على ذكر أن الرابطة الثلاثية تجعل N2 مستقر بشكل غير عادي ، مما يفسر لماذا يمكننا تنفس جو يحتوي على 80 ٪ N2 ولا تموت. إذا أخذوا علم الأحياء ، فإنهم يدركون أيضًا أن عددًا قليلاً جدًا من الكائنات الحية يمكنها استخدام N.2 كركيزة ، لأن هذا يتطلب كسر الروابط بين ذرات النيتروجين ، وهي عملية كيميائية مخصصة للنيتروجين والبكتيريا ldquofixing & rdquo الموجودة في جذور بعض النباتات. أخيرًا ، ربما حفظوا أن الضغط المرتفع ودرجة الحرارة ، في عملية تسمى عملية هابر بوش ، يتم استخدام تفاعل N2 و ح2 لتكوين الأمونيا ، NH3. كما هو الحال مع أي تقدم علمي ، تسببت عملية Haber-Bosch في كل من الضرر (المستخدم للأسلحة المتفجرة) والأسمدة الجيدة. تعمل هذه العملية الآن على إصلاح ما يكفي من N.2 في شكل أسمدة لدعم نصف سكان العالم و rsquos ، مع دعم النيتروجينيز الباقي. يتم تكريس الجهود لتعديل النباتات وراثيًا لإنتاج النيتروجيناز الخاص بها ، مما يلغي الحاجة إلى الأسمدة ولكن ربما يخلق مشاكل غير متوقعة خاصة به.

قد تتفاجأ عندما تكتشف أنه في درجة حرارة الغرفة ، يفضل ثابت التوازن تكوين الأمونيا ، ومن ثم يكون DG 0 & lt 0. يُفضل التفاعل محتويًا لأنه طارد للحرارة في درجة حرارة الغرفة. إنه غير مرغوب فيه من الناحية الإنتروبية كما يجب أن يتضح من المعادلة المتوازنة أدناه: N2(ز) + 3 ح2(ز) و rarr 2 NH3(ز)

إذا كان التفاعل مفضلًا ديناميكيًا في درجة حرارة الغرفة ، فلماذا لا يستمر؟ تبدو هذه القصة مألوفة لأن هذا الوصف نفسه ينطبق على أكسدة الجزيئات العضوية مع ثنائي الأكسجين. هناك أظهرنا باستخدام نظرية MO أن التفاعل بطيء حركيًا. نفس الشيء مع NH3 تشكيل. طريقة سطحية لرؤية هذا هو أنه يجب علينا كسر الروابط في المستقر N2 لبدء التفاعل ، مما يؤدي إلى طاقة تنشيط عالية ، مما يجعل حركية التفاعل بطيئة.

يمكن للمرء أن يبدأ التفاعل برفع درجة الحرارة ، لكن هذا من شأنه أن يبطئ التفاعل الطارد للحرارة. Keq (أو K.د) و DG0 من الواضح أنها وظائف لدرجة الحرارة وهذا التفاعل ، ويصبح التفاعل غير مرغوب فيه عند درجات حرارة أعلى. كان المحلول الذي وجده هابر عبارة عن ضغط مرتفع ، مما أجبر التفاعل على الجانب الذي يحتوي على عدد أقل من جزيئات الغاز ، ودرجة حرارة عالية للتغلب على حاجز طاقة التنشيط وجعل التفاعل ممكنًا من الناحية الحركية. محفزات معدنية معقدة (أكسيد الحديد الأسود - الحديد3ا4 - مع أكاسيد المعادن مثل CaO و Al2ا3 مما يمنع اختزال الحديد مع H2) يوفر سطحًا ماصًا لتجميع الكواشف معًا وتسهيل كسر الرابطة في H.2 ون2.

لقد رأينا أن الطبيعة قد بدت وكأنها تشتمل على آليات تتضمن المركب الغريب جدًا للأكسجين المتطور من Mn و Fe و S و Ca لأكسدة جزيء آخر مستقر للغاية ومتواجد في كل مكان ، H2O. الآن نستكشف الآليات المدهشة وراء مركب النيتروجيناز الذي يعمل على إصلاح N2 لتشكيل NH3.

ما الذي قد يكون مطلوبًا لدفع هذا التفاعل بيولوجيًا؟ يمكنك تخمين القائمة لتشمل:

مصدر للطاقة ، على الأرجح ATP ، لدفع هذا التفاعل الصعب وأنت & rsquod على حق

مصدر للإلكترونات حيث تنتقل ذرات N من حالة أكسدة من 0 في عنصر N إلى 3 في NH3 ، تبين أن هذا المصدر هو بروتين يسمى flavodoxin أو ferridoxin. بالطبع ، هذه الإلكترونات لها أيضًا مصادر مثيرة للاهتمام قبل أن تكون في حوامل الإلكترون لهذه البروتينات

بعض المراكز المعدنية المدهشة جدًا لقبول الإلكترونات والتبرع بها بطريقة مسيطر عليها هذه المراكز هي في الغالب مجموعات FeS مع مجموعة إضافية تحتوي على الموليبدينوم (Mo). تسمى المجموعات F و P و M

مصدر للهيدروجين ربما تكون قد خمنت بشكل صحيح أنه & rsquos ليس H.2 الغاز (من أين سيأتي ذلك؟) ، لكن أيونات H + متوفرة في كل مكان إلى حد كبير.

رد فعل صافٍ يختلف عن عملية هابر بوش (N2 + 3 ح2 & rarr 2 NH3).

هنا هو التفاعل الفعلي الذي يحفزه النيتروجين:

دعونا نفكر قليلاً في رد الفعل. عند إضافة الإلكترونات ، يجب أن تنخفض عوامل الجذب بين ذرات النيتروجين. في النهاية يجب كسر الروابط بينهما. يمكن إضافة البروتونات بسهولة للحفاظ على حيادية الشحنة. قد تتضمن الآلية الأساسية وسيطة كما هو موضح أدناه:

يمكن أن يحتوي النيتروجيناز أيضًا على جزيئات صغيرة أخرى ذات روابط ثلاثية ، بما في ذلك: C=O: و H-C=سي اتش.

هيكل النيتروجيناز

النيتروجين هو مركب متعدد البروتينات يحتوي على ما يلي:

وحدتان فرعيتان متطابقتان ، E و F ، لهما مواقع ربط للناقل المحمول للإلكترونات (بروتين ferrodoxin أو flavodoxin) ، ATP ، وعامل مساعد FeS (4Fe-4S ، يسمى F الكتلة) الذي يقبل الإلكترونات. ومن ثم تسمى هذه الوحدات الفرعية الوحدات الفرعية إنزيم اختزال النيتروجين

مغاير الوحدات الفرعية ألفا وبيتا. تربط a (سلسلة ألفا) مجموعة 8Fe-7S F ومجموعة Fe-S-Mo M. تشتمل هذه الوحدات الفرعية على وحدات نيتروجيناز (di)

يظهر أدناه الهيكل العام لمركب البروتين مع ATP المرتبط والمراكز المعدنية.

تم العثور على هيكل تفاعلي Jsmol من النيتروجيناز في الرابط أدناه.

يتم عرض عرض محسن للعوامل المساعدة المرتبطة و ATP في نفس الاتجاه المكاني في الشكل أدناه.

يتم عرض المراكز المعدنية أدناه بمزيد من التفاصيل في كل من طرق عرض ملء الخط والمسافة.

يرتبط Mo بـ 3 أيونات كبريتية واثنين من مجموعة OH والكربوكسيل من 3-hydroxy-3-carboxy ، وحمض الأديبيك في التركيب البلوري الموضح أعلاه.

تحتوي الكتلة M على أيون كربيد خلالي مشتق من -CH3 مرتبط بكبريت S-adenosyl-methionine (SAM) مما يسمح بتسمية الكربيد إما بـ 13 درجة مئوية أو 14 درجة مئوية للدراسات الميكانيكية. لا يتم تبادل هذه الكربيدات المسمى أو استخدامها كركيزة عندما يخضع الإنزيم لدوران محفز. ومن ثم يبدو أن الكربيد ربما يعمل على استقرار الكتلة M. لن يتم عرضه في الأشكال أدناه التي توضح آليات أكثر تفصيلاً.

تفاعل النيتروجين: الجزء 1 - إضافة الإلكترونات والبروتونات

يجب أن يكون المسار المتسلسل للإلكترونات من الوحدة الفرعية للاختزال التي تحتوي على الكتلة F إلى المجموعتين P و M في الوحدة الفرعية للنيتروجينيز واضحًا من الأشكال أعلاه. سوف نركز على ربط N.2 وكيف يستقبل الإلكترونات من الكتلة M. يوضح الشكل أدناه العامل المساعد FeMo وبعض بقايا الأحماض الأمينية المجاورة. لا يظهر Mo في ملء الفراغ.

السؤال 1: إذا تم تحوير Val 70 إلى Ile ، يبدو أن الركيزة لا يمكنها الوصول إلى الكتلة. أي جزء من الكتلة يتفاعل على الأرجح مع N.2?

السؤال 2: غالبًا ما توجد سلاسله الجانبية في مواقع الإنزيم النشطة. ما هو الدور الذي يمكن أن يلعبوه في التحفيز؟

تم اقتراح نموذج Lowe and Thorneley (LT) كآلية لتقليل ثنائي النيتروجين. في هذا النموذج ، يضاف الإلكترون والبروتون إلى الشكل المؤكسد للإنزيم (E.ا) لإنتاج E.1. يتكرر هذا 3 مرات أكثر ليشكل بالتتابع ، E.2، إي3 و هـ4. عندها فقط يفعل N2 ربط والحد من N.2 تحدث. يتم قبول اثنين من الإلكترونات المضافة بواسطة أيونات H + التي تشكل H2، والذي تم تحريره على N.2 ربط.

السؤال 3: بناءً على عدد أكسدة N و H في N2، نيو هامبشاير3و H + و H2 والآلية المذكورة أعلاه ، هل تتوقع أن تكون هناك حاجة إلى 8 إلكترونات؟

يُظهر التركيب البلوري 2 ATPs مرتبطين بالوحدة الفرعية المختزلة. يُظهر قياس العناصر المتكافئة للتفاعل استخدام 16 ATP. تشير الرياضيات البسيطة إلى أن 2 ATP مشقوق لدعم دخول إلكترون واحد إلى المجمع.

الجزء 1 - E1-E4: هيكل محتمل للوسيط E4 مبين أدناه. لاحظ أن الكربيد لا يظهر. غالبًا ما يُطلق على هذا اسم جانوس الوسيط لأنه يقع في منتصف الطريق خلال الدورة التحفيزية. سمي على اسم يانوس ، إله البدايات والانتقالات الروماني ، ونُسب إلى البوابات والأبواب والمداخل والممرات. يظهر جانوس عادةً بوجهين ، أحدهما يتطلع إلى المستقبل والآخر إلى الماضي.

السؤال 4: كيف يمكنك معرفة أن هذا الرقم يمثل E4؟

جسر الهيدريد 2 Fe أيون لذا فهذه أمثلة على روابط ثلاثية المراكز ثنائية الإلكترون.

كيف يحدث هذا التفاعل؟ يجب أن ننظر إلى الكيمياء العضوية المعدنية لمساعدتنا على فهم آلية هذا والخطوات اللاحقة. من الواضح أنه تمت إضافة مكافئ هيدريد إلى المعادن ، المرتبط بأكسدة أيونات المعادن في المركز. يسمى هذا التفاعل الخاص بـ إضافة مؤكسدة. من المفترض أن تعمل أيونات الكبريت كقواعد لويس لأنها تكتسب البروتونات من حمض لويس ، على الأرجح HIs 195.

تفاعلات الإضافة المؤكسدة

يوضح الشكل أدناه الإضافات المؤكسدة لثلاثة أنواع مختلفة من المواد المتفاعلة. لاحظ المثال المحدد لإدخال H.2، مثال مشابه إلى حد ما لإضافات الهيدريد إلى الكتلة M. يحدث الاختزال التأكسدي بسهولة أكبر عندما تكون حالتا أكسدة أيون الفلز مستقرة. إنه مفضل أيضًا للمراكز المعدنية التي لا يتم إعاقتها بشكل تعقيم (يكون منطقيًا إذا تمت إضافة A-B) وإذا كان A-B لديه طاقة تفكك رابطة منخفضة.

السؤال 5: ما هو الدور الذي يمكن أن تلعبه أيونات H + في مركب E4 الموضح أعلاه؟ لماذا قد تكون قريبة نسبيًا من الهيدريدات؟

طريقة واحدة لدراسة المواد الوسيطة لرد الفعل هي حبسهم. إذا كان N.2 لا يمكن الوصول إلى موقع الربط وتنخفض درجة الحرارة ، قد تتفاعل الهيدرات المتراكمة و H + في E4 حيث يعود التفاعل إلى E1.

السؤال 6: ما المنتج المحتمل في مثل هذه الحالة؟ ما المتحولة التي يمكن استخدامها لمحاولة هذه التجربة.

تفاعل النيتروجيناز: الجزء 2 - الحد من N2

الخطوة E4 إلى E5 تبدو غريبة بعض الشيء مثل H.2 يتم إطلاق الغاز. يبدو أن هذا يضيع ATP ولكن يجب أن يكون واضحًا أننا يجب أن نثق في التطور الذي خلق هذا الإنزيم. هل تعتقد أن هذا التفاعل يمكن تسهيله بوجود الهيدريد في أيون Fe واحد ، Fe6؟ الآلية هي تفاعل عضوي معدني كلاسيكي آخر ، القضاء الاختزالي، عكس الإضافة المؤكسدة.

تفاعلات الإزالة المختزلة

في هذا التفاعل ، يتم التخلص من الجزيء أو طرده من المعقد حيث يتم تقليل أيون المعدن ويضيف إلكترونين. يوضح الشكل أدناه القضاء الاختزالي. يحدث الإزالة الاختزالية بسهولة في المراكز المعدنية ذات حالة الأكسدة العالية والتي يمكن تثبيتها عند الاختزال. يحدث ذلك بسهولة أكبر من الروابط الغنية بالإلكترون وإذا كانت الروابط الأخرى المحيطة ضخمة. يجب أن تكون الأنواع المنفصلة رابطة مع بعضها البعض لأنها تشكل رابطة مع بعضها البعض عند مغادرتها.

غالبًا ما يقترن الإضافة المؤكسدة والقضاء الاختزالي في المراكز المعدنية معًا في فلز عضوي الدورات التحفيزية مع بعض إعادة الترتيب أو التعديل الآخر الذي يحدث بينهما. فكر في الأمر. يجب أن تعود مجموعات FeS إلى حالة الأكسدة الأصلية بعد دورة LT الكاملة. سنواجه تفاعلًا عضويًا فلزيًا آخر بعد إضافة N.2, الإدراج المهاجر، في النصف الثاني من رد الفعل.

هل ح2(ز) صدر حقا؟ لدراسة هذا ، استخدم الباحثون ركيزة بديلة ، الأسيتيلين ، HC=CH بحضور د2 ون2 في نظام مائي.

تم تقليل الأسيتيلين وتشكيل C2ح2د2 و ج2ح3D. ومن ثم يجب أن يكون E4 يحتوي على 2 D ، ومن المحتمل أن E2 1. هذه النتائج تدعم تفريغ آلية الإزالة الاختزالية لـ E4 إلى E4: N2 رد الفعل أعلاه. في السابق ، تم عرض H + تم تقليله بمقدار D2 بحضور د2 ون2 في نظام مائي ، لذلك فإن هذه النتائج متسقة. في دعم إضافي ، الديوتيريوم من د2 لم يتم دمجها في المنتجات (ج2ح2د2، ج2ح3D أو HD) في حالة عدم وجود N2.

دعنا نعود للحظة إلى هيدرات التجسير كما هو موضح مرة أخرى في الشكل أدناه.

لتشكيل H.2، يجب أن تتم بروتونات H - hydrides.

السؤال 5: تظهر الهيدريدات في النموذج أعلاه كجسور (متضمنة في 3 مراكز ، 2 روابط إلكترونية) وليست كمطراف (كما هو موضح في H +). أيهما سيكون أكثر مقاومة للبروتونات وبالتالي الإزالة الاختزالية أو الجسور أو الهيدريدات الطرفية؟

أصبحت هيدرات التجسير الآن مستقرة بدرجة كافية لتتفاعل مع الركيزة المرغوبة ، N2. العامل المساعد M كبير بما يكفي لإنشاء وجه مكون من أربعة أيونات حديدية (انظر الشكل أدناه) منسقة مع كربيد على الوجه السفلي. لإنشاء هذا الوجه من أيونات الحديد يتطلب مجموعة ذات حجم كافٍ مع 6 Fes و 1 C مركزيًا لتشكيل هندسة موشورية مثلثية.

حالات الأكسدة لمراكز الحديد النيتروجيناز

النصف الاول: سيكون من الصعب تعيين حالات أكسدة محددة لكل أيون Fe في المركب M. بدلاً من ذلك ، يمكننا تعيين تغييرات نسبية في حالات الأكسدة مع استمرار التفاعل من E0 إلى E4. في كل خطوة من نموذج LT ، يضاف إلكترون واحد. سنقوم أولاً بتعيين هذا إلى متوسط ​​Fe أيون ، M 0 ، مع حالة أكسدة محددة عشوائيًا تبلغ 0. بالإضافة إلى 1 إلكترون ، ستنتقل حالة الأكسدة من M 0 إلى M -1 حيث يتم تقليل المعدن. ثم تتأكسد الحالة M -1 حيث يتم نقل الإلكترون إلى H + ، وعندما يتم نقل إلكترونين ، ويتم تكوين H واحد. يوضح الرسم البياني أدناه التغيير في حالة الأكسدة في الانتقال من E0 إلى E4.

تسلط المربعات الحمراء الضوء على الخطوات الشبيهة بالدورة الديناميكية الحرارية والتي توضح كيف يمكن تصور التغييرات في حالة الأكسدة والاختزال في أيونات الحديد (M). لاحظ أنه في الانتقال من E0 إلى E4 ، تتغير حالة الأكسدة الفعلية لـ M من 0 إلى +1 إلى 0 إلى +1 والعودة إلى 0. وهذا أمر مذهل نظرًا لإضافة 4 إلكترونات. لاحظ أيضًا أنه في المربع الأحمر من الخطوة E0 إلى E1 ، ينتقل M من -1 إلى +1 وهو ما يتوافق مع وصفنا للإضافة المؤكسدة عندما يفقد المركز المعدني إلكترونين. توضح هذه الآلية أن النيتروجيناز يمكن اعتباره جهاز تخزين & quothydride & quot.

النصف الثاني (يواجه إنتاج NH3):

كيف يفعل N.2 تتفاعل في البداية مع E4؟ يجب أن يعتمد على كيفية إطلاق الهيدريدات على شكل H2التي تظهر الأدلة حدوثها القضاء الاختزالي (إعادة) وليس بروتون هيدريد (حصان). بالإضافة إلى ذلك ، فإن محرك N.2 يتم تحويله بسرعة كبيرة إلى ديازين ، HN = NH ، مع H المغادر2 مع أخذ 2 H + s و 2 إلكترون (أو اختزال المعادلات). يمكن أن تحدث هذه الأحداث كما هو موضح في الشكل أدناه.

الآن ، مع N.2 ملزمة مثل الديازين (ن2ح2) و H.2 بعد إطلاقه ، يمكن أن يحدث باقي التفاعل كما هو موضح أدناه. يتم عرض خطوة جديدة ، وهي الإدراج المهاجر.

يتشابه نصفا التفاعل مع هيدرات التجسير المستخدمة. يربط الوسيط E4 Janus النصفين معًا.


كيف يمكن للمرء أن يحدد ما إذا كانت البكتيريا مثبتة للنيتروجين أم لا؟ - مادة الاحياء

References herein to the writing of lab reports and posters were current through Fall Semester, 2006. Since then, report guidelines for any current semester are in the present lab manual for Microbiology 102. However, even though this website for our old Bacteriology 102 course (splammo.net/bact102) was "retired" as of the end of Fall Semester, 2006, subject matter details throughout the site are still current , and questions asked on this page are generally worth pursuing regarding isolation of microorganisms, lab reports on such experiments, and examinations.

I. GENERAL INTRODUCTION

This page on our Bacteriology 102 website expands on the material given in the introduction to Experiment 11 in the manual and also serves to summarize major points regarding the following specific isolation experiments: 11.1 (purple non-sulfur photosynthetic bacteria), 11.2 ( Bacillus ), 11.3 (N 2 -fixers), 10.2 ( Streptomyces ) and 9.3 (bacteriophages). Even though bacteriophages are not bacteria but, rather, viruses which infect bacteria, many of these general principles will apply.

In this course, the selective enrichment/isolation concept applies not only to the isolation of the organisms indicated in the above-named experiments, but wherever we are isolating a certain type of organism from a natural source. This includes gram-negative bacteria from hamburger (Exp. 4), lactic acid bacteria from sauerkraut (Exp. 12), Staphylococcus aureus from the body (Exp. 13.1) and coliforms from water (Exp. 15). The basic principles also apply to the isolation and identification of the mixed unknowns (Exps. 7.2, 14.1 and 17).

The generalized procedure for the isolation and identification of any particular type of bacteria can be represented in the following flow chart:

ENRICHMENT AND ISOLATIONPURE CULTURE WORK
SOURCE
مواد
BROTH
ENRICHMENT
PLATING FOR
ISOLATION
STOCK
CULTURES
CHARACTERIZATION & IDENTIFICATION
•Consider inoculum: what organisms may or may not be present.
•May pre-treat inoculum, e.g., by heat-shocking.
•Usually is selective.
•May be skipped altogether.
•Usually selective or selective-differential &ndash but not always!! 
Throughout procedure, appropriate media and incubation conditions must be considered.

In these experiments, we show how this general plan is applied productively to several specific, naturally-found groups of organisms . Students who took our Bacteriology 320 course from the mid-1970s through the 1990s will recognize this approach and recall the dozen or so different kinds of bacteria we obtained from a variety of natural sources &ndash intestinal and otherwise. Naturally the successful isolation of the small set of organisms in either course will not make us experts in the isolation of all kinds of bacteria &ndash nor has this author ever claimed to be such an expert(!) &ndash but we can appreciate the general plan and how samples, media and incubation conditions can be chosen appropriately for each type of organism such that the desired growth is enhanced with the inhibition of as many other kinds of organisms as possible . So, we provide the basic framework upon which we can hang the specifics of a given isolation situation, and such can be kept in mind out in the real world if the student encounters an entirely new isolation project. The author has applied this concept in the isolation of Edwardsiella (with appropriate pH-based differential media) and the purple non-sulfur photosynthetic bacteria &ndash both of which have been great fun &ndash and may possibly consider iron-oxidizing bacteria his third area of expertise in bacterial isolation.

I often put a multiple-true/false question like this on a quiz or final. We expect all statements to be false and sincerely hope no one teaches such heresy.

To isolate a certain kind of organism from a natural source, utilizing the enrichment and isolation principles we learned about in our experiments:

       We can examine a sample from anywhere to find any kind of organism, as bacteria do tend to get around and can be found everywhere .

       It is best to utilize an all-purpose medium to isolate as many different kinds of bacteria as possible. Then we can study all of the colonies obtained and choose which ones we want to continue with.

       We always wish to compare our results to a general key to find out if we isolated the correct strains and got the correct determination of CFUs per gram of the sample.

       We always try to duplicate the original habitat of the organisms in the laboratory as much as possible such that all organisms in any sample can continue to grow in the laboratory as they did out in their normal habitat.

       We can expect to find a pure culture growing in any selective enrichment.

       In the experiment on purple non-sulfur photosynthetic bacteria, we expect each different kind of colony on a plate to represent a different genus .

Generally speaking, it would be unthinkable to streak out a plate of an all-purpose medium from a sample and then examine all of the resulting colonies to find what we are after . (That is the literal "looking for the needle in the haystack" approach.) Most likely, the desired type of organism would be totally overgrown. In looking for some obscure organism in the environment &ndash for example, Edwardsiella tarda from a swimming beach &ndash one would never be expected to have generated a list of genera or species in that environment that were encountered on the way to finding the E. tarda . You don't have to be an expert on the microbial flora in the environment &ndash that's a separate issue for those who care to do that. Using selective procedures you would be inhibiting or killing most of them anyway in your attempt to recover (more easily) the desired organism.

Hopefully for our experiments, we will have a variety of samples from various probable habitats of these organisms. (Note the admonition in the manual to bring in your own samples !) Habitats from which the samples are taken are not homogenous and will vary considerably from each other, and they will themselves vary over time. We must never expect to replicate exactly anyone else's results or any supposed "typical" result! There is no "key" to tell us if we are "correct" when we isolate anything &ndash that is, there is no tally of specific genera or species to check off for any given source! For any of our experiments, we may isolate representatives of several genera from one sample and several species of only one genus from another. We may spot a "trend," and we may isolate a new species these are things that are fun to follow up on. At least we will come up with some new strains &ndash as we define that term here.

Sooner or later in your lecture course you will learn about lithotrophic organisms such as the iron-oxidizing bacteria which we really should be including in our lab course. (A few views of a habitat in which they are found are shown here.) Similarly we could do something with the symbiotic nitrogen-fixers, but &ndash at least &ndash we get an appreciation of what "special" medium can help sort out free-living nitrogen-fixers from other soil organisms, and we have demonstration materials that feature the effects of Rhizobium , a genus of organisms that fix nitrogen whilst in symbiosis with leguminous plants.

Here are some items to consider as you collect, analyze and present your data and observations:

    Taking notes in lab of various observations can be greatly facilitated by the use of tables which are also valuable in reports and posters. Also, flow charts can summarize procedures in a general way and can be used to great advantage in posters and in day-to-day preparation for lab. The set-up of flow charts and tables is discussed here.

  • In the highlighted box above, we show a six-part multiple-true/false question. Be sure you understand why each of the six statements is false.
  • Questions are posed below in Sections III and V concerning the setup of the various experiments and what we hope to find out about the cultures we isolate.
  • Also, look over the relevant quiz questions in Appendix X of the lab manual. They test basic understanding of the general concept of isolating bacteria as well as major points about the specific kinds of organisms we are looking for.
  • Be sure to go over the requirements for reports and posters associated with these experiments. Some questions to think about are found on this page.

Reference material concerning the isolation of various organisms can include some professionally-produced web pages, a good textbook (such as recent editions of Brock ) and also these items:

    The Prokaryotes , a multi-volume set. The updated on-line edition is found here and is the primary source of reliable information I recommend when questions keep pouring in about how to isolate whatever. As stated above, I do not claim to be an expert on such things &ndash or a general consultant, for that matter. But The Prokaryotes is where the experts on specific kinds of bacteria hang out. As an example of how one can begin to use The Prokaryotes on-line, type "Edwardsiella AND isolation" in the search box (without the quotes), and you might find a surprise.

II. TAILORING THE ENRICHMENT/ISOLATION PLAN TO SPECIFIC TYPES OF ORGANISMS

Many specific kinds of microorganisms can be obtained from their natural habitats (soil, water, etc.) by the creation in the laboratory of an artificial environment which will enhance their growth over competing organisms. We would not get far by replicating exactly the habitat from which a sample was taken. Morphological and/or physiological characteristics of the desired organisms which can give them special advantages over others are exploited in the formulation of culture media, the choice of incubation conditions, and any special treatment of the original source material itself. We want to inhibit as many "undesirable" organisms as possible so they do not interfere with the isolations of the desired organisms, and we want to satisfy the nutritional requirements of the desired organisms such that they grow well.

To help us detect and isolate a certain kind of organism and minimize interference by other organisms, the following considerations are made:

    Choice of suitable source material likely to contain the desired organism. Also, one can consider where the desired organism may occur as a significant contaminant. As mentioned elsewhere, purple non-sulfur photosynthetic bacteria have been found in samples of snow, ice and rain &ndash surely not to be considered as habitats for microorganisms.

  • Often the source material is inoculated directly into a broth medium which will encourage the proliferation of the desired organism this is called an enrichment . When an enrichment is formulated to suppress the growth of undesired competitors, it is then a selective enrichment . A selective enrichment (such as what is utilized in Experiments 11.1 and 11.3) increases the probability that colonies of the desired organism will be isolated upon subsequent streak-plating and not crowded out by others. Selective enrichment media are useful in recovering organisms which are in very low numbers, and they are often formulated like their corresponding isolation media. Selective enrichments can also be used for certain organisms that are not necessarily in low numbers the "most probable number" method of quantitation involves their use as we shall find out in the water analysis experiment (Exp. 15).
  • When plate counts are to be performed and/or when the desired organism is relatively abundant, no enrichment is made and the source material is plated directly (as in Experiments 10.2 and 11.2).
  • Water samples can be passed through a filter which is then placed on the appropriate selective plating medium. This method is useful in the direct plating of samples containing low numbers of the desired organism and is discussed further and illustrated here.

  • Temperature: How high or low can we go without inhibiting or killing the desired organism?
  • Oxygen or no oxygen?
  • Does the desired organism need an increased-CO 2 atmosphere?
  • Is light necessary?

Note how the blank table on this page can be filled in to summarize the above points for the organisms we are isolating in these experiments.

ثالثا. ENRICHMENT AND ISOLATION MEDIA

Essential medium components can be manipulated (these are items from Appendix D):

  • Carbon source: As an example, one can leave organic compounds out of the medium to allow for the growth of autotrophs which can obtain their carbon from atmospheric CO 2 which diffuses into the medium.
  • Nitrogen source: For example, one can leave nitrogenous compounds out for the growth of " nitrogen-fixers " which can obtain atmospheric nitrogen (N 2 ). The so-called "nitrogen-free media" are indeed free of nitrogenous compounds but not N 2 which diffuses in from the air.
  • Energy source: For example, photosynthetic bacteria utilize light as their ultimate source of energy , and any compounds that can serve as energy sources for other types of organisms can be left out of the medium.
  • Compounds which can be used as growth factors (vitamins, amino acids, nucleic acid bases, fatty acids, etc.) and other special medium ingredients can be added as needed.

Here are some questions about specific medium components and procedures:

  • Regarding purple non-sulfur photosynthetic bacteria: What is the "magic" of succinate ? Why use it as the carbon source?
  • What do we really mean when we say " non-sulfur " regarding the very metabolically-diverse group of photosynthetic bacteria we are working with? If we were to look for various kinds of photosynthetic bacteria that can grow autotrophically, why might one include a sulfide compound in the medium?
  • Regarding Streptomyces : What kind of compound serves as the primary source of carbon and energy (and nitrogen)? What does an organism need to produce in order to utilize such a compound? Why is it beneficial to re-streak our initial colonies on an all-purpose medium?
  • Regarding the nitrogen-fixers: Why is there so much sugar in the enrichment and isolation media? Is it possible for non -nitrogen-fixers to grow in our enrichments and on our plates? How do we really know that we are isolating nitrogen-fixers?
  • Why don't we need a selective medium when isolating Bacillus from soil?
  • Why does the combination of (1) heating the initial soil suspension to 80°C and (2) aerobic incubation assure us of having virtually only Bacillus on our isolation plates? What two genera would we expect if we were to incubate the isolation plates anaerobically ?
  • When we get to Experiment 12 on the lactic acid bacteria, consider why the combination of (1) a "rich" plating medium with sodium azide and (2) aerobic incubation conditions assures us of having virtually only aerotolerant anaerobes on the plates.

رابعا. DETECTION OF THE DESIRED ORGANISMS DURING THE ENRICHMENT AND ISOLATION PROCESS

The following gives a few examples of recognizable cultural and/or morphological characteristics of certain organisms which aid in their detection during enrichment and/or isolation. Click on the highlighted text for images and further explanation.

V. CHARACTERIZATION AND IDENTIFICATION OF OUR ISOLATES

We have neither the time nor the materials necessary to identify any of our bacterial isolates to the species level. Find a copy of Bergey's Manual and see what it takes to identify the dozens of species for the various genera we consider in our isolation experiments. A little more about bacterial identification is given here.

We can at least run some tests on pure cultures of our isolates to see if they follow the general pattern of what is expected for the genus or type of organism under consideration. And we can perform some "special" tests which are not essential to identify anything to the genus level, such as testing Streptomyces isolates for the ability to produce antibiotics and Bacillus isolates for the production of amylase.

For the organisms in Experiments 10.2 and 11, consider the following:

    إكسب. 10.2 ( Streptomyces ): How did we recognize probable Streptomyces colonies, and what do the cells look like microscopically? Should we expect all Streptomyces isolates to be able to produce an antibiotic? What is our official definition of antibiotic ?

  • As we incubated one tube of Succinate Agar in the dark and one in the light, which tube shows the pigmented phototrophic growth? Where do you see it? (Aerobically or anaerobically?)
  • As we expect most purple non-sulfur bacteria to be "facultative phototrophs," do you see any growth in the tube incubated in the dark? (Aerobically or anaerobically?) Is there corresponding growth in the "light" tube?
  • Click here to see the appearance of a "facultative phototroph" in this test.

  • Why do we expect virtually any isolate from these plates to be a member of the genus Bacillus ? If you don't see endospores for any isolate, what might you do with the isolation plates in order to see endospores eventually? (It's hinted at in the lab manual!)
  • As we have mentioned a number of times, some species of Bacillus are strictly aerobic and the others are facultatively anaerobic. How does this relate to the tests for catalase and glucose fermentation? Recall what we did in Experiment 7 to show the oxygen relationships of the twelve known cultures without the use of Thioglycollate Medium.
  • Must we expect all isolates of Bacillus to give positive results for the amylase test? Remember in Experiment 7 that we tested only three of the dozens of Bacillus species.

  • Do not be concerned if you did not isolate anything resembling Azotobacter. Other nitrogen-fixers are possible, but they would be a bit harder to identify with what little we did in lab. A non-motile gram-negative rod might suggest Klebsiella. Sometimes Bacillus (identifiable if endospores are apparent) is isolated. Why would we not expect Clostridium on our plates? (Think about the incubation conditions of the plates.) Just characterize each isolate the best you can, and do not go beyond the recommendations and precautions mentioned in the latter part of Experiment 11.3 , although some semesters we have media available to see whether or not any non-motile gram-negative rod is a Klebsiella. If you can't identify anything to genus based on the observations made, don't go sleepless about it! At least you can indicate whether or not each one was a nitrogen-fixer or a non-nitrogen-fixer.
  • As for the slants we inoculate our isolates onto: Would you expect nitrogen-fixers to grow on the all-purpose medium? (Why not?) Would you expect a non-nitrogen-fixer to grow by itself on the N-free medium? (Why?) For there to be any growth on the N-free medium, the growth has to be initiated by a nitrogen-fixer, so a pure culture inoculated onto such a medium which grows (without any "help" from another organism) is considered by us to be a confirmed nitrogen-fixer. We always strive to inoculate any of our test media with a pure culture and this test is no exception. Furthermore, if a mixed/contaminated culture were to be inoculated onto an N-free Agar slant and it subsequently grew, there must have been a nitrogen-fixer included in the mixed inoculum. But at this point in the semester, let's not expect to be rampant contaminators any more &ndash what with our aseptic technique skills which had better not be deteriorating!

السادس. A FEW GENERAL WORDS OF CAUTION especially to those not taking Bact. 102 at UW-Madison

The growth of cultures from natural sources (soil, water, human body, etc.) can be a dangerous undertaking and should only be done in a for-real microbiology lab. One can never tell if the growth of pathogens is being enhanced. Make sure all cultures are handled with the utmost care and are completely sterilized before they are discarded!

I cannot advise about laboratory techniques (such as learning the various bacteriological manipulations) via e-mail or even the phone. Take the course in the appropriate laboratory environment at a college or university and get your techniques certified.


Scientists identify corn that fixes its own nitrogen, needing less fertilizer

The dripping gel from this corn plant harbors bacteria that convert atmospheric nitrogen into a form usable by the plant. Photo: Howard-Yana Shapiro

A public-private collaboration of researchers at the University of Wisconsin–Madison, the University of California, Davis, and Mars Inc., have identified varieties of tropical corn from Oaxaca, Mexico, that can acquire a significant amount of the nitrogen they need from the air by cooperating with bacteria.

To do so, the corn secretes copious globs of mucus-like gel out of arrays of aerial roots along its stalk. This gel harbors bacteria that convert atmospheric nitrogen into a form usable by the plant, a process called nitrogen fixation. The corn can acquire 30 to 80 percent of its nitrogen in this way, but the effectiveness depends on environmental factors like humidity and rain.

Scientists have long sought corn that could fix nitrogen, with the goal of reducing the crop’s high demand for artificial fertilizers, which have monetary, energy and environmental costs. Further research is required to determine if the trait can be bred into commercial cultivars of corn, the world’s most productive cereal crop.

Jean-Michel Ané

The findings were reported Aug. 7 in the journal PLOS Biology.

“It has been a long-term dream to transfer the ability to associate with nitrogen-fixing bacteria from legumes to cereals,” says Jean-Michel Ané, a professor of bacteriology and agronomy at UW–Madison and a co-author of the new study.

Legumes, such as beans, are the only group of crop plants previously known to acquire a significant amount of nitrogen through fixation, which they perform in specialized tissues called root nodules.

Howard-Yana Shapiro, the chief agricultural officer at Mars, a senior fellow in the Department of Plant Sciences at UC Davis and a co-author of the report, identified the indigenous varieties of corn in a search for cultivars that might be able to host nitrogen-fixing bacteria.

The corn is grown in the Sierra Mixe region of Oaxaca in southern Mexico, part of the region where corn was first domesticated by Native Americans thousands of years ago. Farmers in the area grow the corn in nitrogen-depleted soils using traditional practices with little or no fertilizer, conditions that have selected for a novel ability to acquire nitrogen. The biological materials for this investigation were accessed and utilized under an Access and Benefit Sharing Agreement with the Sierra Mixe community and with the permission of the Mexican government.

Nitrogen-fixing corn varieties secreting large amounts of sugar-rich gel as they grow in Madison, Wisconsin. Photo: Jean-Michel Ané

The corn is striking. Most corn varieties grow to about 12 feet and have just one or two groups of aerial roots that support the plant near its base. But the nitrogen-fixing varieties stand over 16 feet tall and develop up to eight or 10 sets of thick aerial roots that never reach the ground. Under the right conditions, these roots secrete large amounts of sugar-rich gel, providing the energy and oxygen-free conditions needed for nitrogen-fixing bacteria to thrive.

Establishing that plants are incorporating nitrogen from the air is technically challenging.

“It took us eight years of work to convince ourselves that this was not an artifact,” says Ané, whose lab specializes in studying and quantifying nitrogen fixation. “Technique after technique, they’re all giving the same result showing high levels of nitrogen fixation in this corn.”

The group used five different techniques across experiments in Mexico and Madison to confirm that the Sierra Mixe corn’s gel was indeed fixing nitrogen from the air and that the plant could incorporate this nitrogen into its tissues.

“What I think is cool about this project is it completely turns upside down the way we think about engineering nitrogen fixation,” says Ané.

The gel secreted by the corn’s aerial roots appears to work primarily by excluding oxygen and providing sugars to the right bacteria, sidestepping complex biological interactions. The research team was even able to simulate the natural gel’s effects with a similar gel created in the lab and seeded with bacteria. The simplicity of the system provides inspiration to researchers looking to identify or create more crop plants with this trait.

Nitrogen-fixing corn varieties secreting large amounts of sugar-rich gel as they grow in Madison, Wisconsin. Photo: Jean-Michel Ané

Breeding the trait into commercial cultivars of corn could reduce the need for artificial nitrogen fertilizers, which have a host of disadvantages. More than 1 percent of the world’s total energy production goes toward producing nitrogen fertilizer. Developed countries contend with waterways polluted by leaching nitrogen, while adequate fertilizer is often inaccessible or too expensive for farmers in developing countries. Corn that fixes some of its own nitrogen could mitigate these issues, but more research will be required.

“Engineering corn to fix nitrogen and form root nodules like legumes has been a dream and struggle of scientists for decades,” says Ané. “It turns out that this corn developed a totally different way to solve this nitrogen fixation problem. The scientific community probably underestimated nitrogen fixation in other crops because of its obsession with root nodules.”

“This corn showed us that nature can find solutions to some problems far beyond what scientists could ever imagine,” Ané says.

This story was originally published on the UW–Madison News site.


Nitrogen cycle for IGCSE Biology: Grade 9 Understanding 4.11B

I will make a blog post on each of the three “cycles” you need to know about for iGCSE. By far the most complicated is the Nitrogen cycle, so we might as well start there….

The first bit of understanding you need to is be clear the difference between how energy moves through an ecosystem and how matter (i.e. atoms) are exchanged between organisms and their environment. Energy in the ecosystems moves in a linear flow: there is no recycling of energy. The energy comes in at one end (in the producers through the process of photosynthesis) and is ultimately all lost as heat to the environment through the process of respiration. There is no possible way energy can be recycled. The “circle of life” that students like so much from Disney certainly does not apply here…. People find this idea very difficult to appreciate. All the time students will tell me that the energy in dead plants and animals goes into the soil and is then absorbed through the roots of plants: “it’s the circle of life sir” they earnestly tell me. And in the words of the late, great Amy Winehouse, I say “NO,NO,NO”…

Matter on the other hand is المعاد تدويرها through the ecosystem. The individual atoms that make up your body (H,O,C,N,S etc.etc,) have all been in other organisms and indeed will be again in the future. You took them in through your food and use these atoms to build the molecules that make up your cells. But ultimately all these atoms will leave your body either through metabolic processes or when you die and are decomposed. You could draw up a cycle for any of the atoms that are found in living things but your specification only requires you to understand two. How are carbon atoms cycled – the Carbon cycle – and how are nitrogen atoms cycled – the Nitrogen cycle. (You will also look at the Water cycle as well…..)

Things to understand about the Nitrogen Cycle:

1) Which molecules in living things contain nitrogen atoms?

Well the answer is fairly simple. البروتينات عبارة عن بوليمرات من الأحماض الأمينية. Amino acids all contain an -NH2 group (amine group) and so Nitrogen is found in proteins. The bases in DNA (Adenine, Cytosine, Guanine and Thymine) are described as nitrogenous bases and so they contain nitrogen too.

2) Where are nitrogen atoms found in the ecosystem other than in the molecules of living organisms?

This is more complicated. Nitrogen gas makes up 78% of the atmosphere so clearly there is a lot of nitrogen in the air. In the soil, there will be urea from the urine of animals and urea contains nitrogen. There are also a range of ions found in the soil that contain nitrogen: the two most important are ammonium NH4+ and nitrate, NO3-. (I don’t know how to do subscript and superscript in WordPress and so you will have to excuse the rather ugly molecular formulae)

3) How do nitrogen atoms move from the abiotic (non-living) parts of the ecosystem and into the organisms?

There is only one way nitrogen atoms can move from the abiotic environment and into the organisms in an ecosystem. This is via plants that can absorb nitrate ions from the soil in their roots. This is a slight simplification but it will do at the moment. Look at the diagram above and find the arrow that shows assimilation of nitrates from the soil into plants.

4) How many different kinds of soil bacteria are involved in cycling nitrogen?

You need to know about أربعة different kinds of bacterial that live in the soil that play a role in recycling nitrogen. Use the diagram above and your notes to describe the role each of these organisms play in the cycling of nitrogen atoms in the ecosystem.

  • Decomposers (Putrefying Bacteria)
  • البكتيريا الآزوتية
  • Nitrogen-Fixing Bacteria
  • Denitrifying Bacteria

I am off to have my supper: another post about these bacteria will appear here later tonight or tomorrow. Please don’t read it until you have tried to write down a paragraph on each of the four types of bacteria in the bullet point list above.


Displaced Cholera

It seems that many microbes once had a good purpose but have changed as a result of the Fall and now cause disease.

Cholera is a severe intestinal illness that humans get from contaminated water or food. It leads to severe diarrhea, shock, and even death. In its most virulent form, it can kill within three hours of infection. Cholera is caused by the bacterium Vibrio cholera, which produces a variety of toxins. Interestingly, most species related to Vibrio cholera grow harmlessly on the surface of practically all shelled ocean creatures and some fish. There they perform a valuable task: breaking down chitin, the main component of the hard outside shell, or exoskeleton, of crabs, shrimp, lobsters, and many other sea creatures. Without their help, oceans and beaches would be littered with billions of shells. The breakdown of chitin also returns precious nutrients like carbon and nitrogen back to the ocean.

Even more fascinating, some of the cholera components that are toxic to the human intestines are used to break down chitin. So creationists hypothesize that Vibrio cholera originally broke down chitin in the ocean, but after Adam’s Fall, God allowed them to spread beyond their proper place.

Disease-causing versions of Vibrio cholera may also have been genetically modified after the Fall. We have discovered that they have some extra DNA, apparently inserted by viruses, which allows the bacteria to produce toxin. Other types of cholera lack this DNA and are typically nontoxic.


Farmers Can Now Buy Designer Microbes to Replace Fertilizer

لإعادة مراجعة هذه المقالة ، قم بزيارة ملفي الشخصي ، ثم اعرض القصص المحفوظة.

Wichan Nikhrothanon/EyeEm/Getty Images

لإعادة مراجعة هذه المقالة ، قم بزيارة ملفي الشخصي ، ثم اعرض القصص المحفوظة.

Jake Misch’s family has been growing corn in the sandy soils of northwestern Indiana for four generations. Like other farmers in the area, the Misches spray their fields with a nitrogen-rich fertilizer once in the spring when the seeds are planted, and once later in the year, when the corn is going through its growth spurt. Fertilizing is essential to yielding a healthy harvest, but it’s expensive enough that he stresses about it, and, as he’s well aware, it’s not great for the planet.

Which is why next year, Misch is trying something new. In the spring he’ll douse his freshly furrowed corn seeds with a liquid probiotic for plants. As the seedlings grow, these special microbes will colonize their roots, forming hairy nodes and converting atmospheric nitrogen into a form that plants can use to turn sunlight into sugar. If all goes as planned, those little critters will produce 25 pounds of usable nitrogen for every acre of corn.

At least, that’s what Pivot Bio is promising. The Berkeley, California, biotech startup announced today its commercial launch of the first and only nitrogen-producing microbial treatment for US corn farmers. It’s not a complete and total replacement for fertilizer, but the product aims to reduce farmer’s reliance on it. Fertilizer production is a huge contributor to greenhouse gases. Once it’s on fields, it can leach into aquifers or run off into rivers, leading to toxic algae blooms. According to Pivot, if every corn farmer in the US followed Misch’s lead, it would be the environmental equivalent of removing one million cars from the road.

“We’re trying to create an ecological zeitgeist,” says Karsten Temme, CEO and cofounder of Pivot. The company also announced that it had raised $70 million in series B funding, led by Bill Gates’ Breakthrough Energy Ventures, an investment fund that aims to drastically cut greenhouse gas emissions.

Using underground microbes to solve modern agriculture’s biggest challenges is not an altogether new idea. Farmers have been lacing their fields with pest-killing bacteria for decades. But money only recently started flowing into Big Ag microbials. Startups like Pivot and Indigo Ag began hunting down useful organisms to turn into products in 2014. Last year, German biotech giant Bayer launched a $100 million joint venture with Ginkgo Bioworks, an organism-engineering outfit, to create self-fertilizing crops with the help of designer bacteria.

That company, now called Joyn Bio, is using every trick in the synthetic biology trade to engineer organisms that can do for corn and wheat what naturally occurring microbes do for legume crops like soybeans. It’s still two to three years from field testing its first product.

Pivot, on the other hand, saw a way forward with what nature had already provided. There were bacteria, they knew, that lived on corn roots, that had nitrogen-fixing genes encoded in their DNA. But because the process is so energy-expensive, those bacteria only flipped those genes when needed. And because farmers always plant in fertilized fields, those genes had gone dormant over the decades. Someone just had to turn them back on. “What we’re trying to do is actually reawaken this function that the microbe has had all along,” says Temme.

But first, they had to find ’em. To start, Pivot bought buckets of soil from farmers throughout the US corn belt. Into that soil, the company’s scientists planted young corn seedlings called “bait plants” because of the substances they excrete to attract beneficial bacteria. Think of it like agricultural Tinder the corn swipes right on microbes that make its life easier. Out of thousands of bugs that might be in the soil, the plant pulls out maybe a dozen or so. Then Pivot’s scientists grind up the roots and dab the mixture onto a plate of agar devoid of nitrogen. Anything that survives must be making its own.

Once they’ve got some good candidate bacteria, says Pivot scientist Sarah Bloch, they use gene editing tools to rewire their gene expression programs. The goal is to keep the nitrogen-fixing activity turned on, even in the presence of fertilizer. “We’ll take a promising strain and remodel it 100 different ways and test all those approaches to see which one is best,” she says. Sometimes, big breakthroughs come from surprising places. The strain that makes up Pivot’s first product, which will be available to farmers in select states for the next growing season, came from land in Missouri belonging to Bloch’s father.

“A lot of our early samples came from people we know—friends and family,” says Bloch. “It just turned out that we hit the jackpot on my dad’s sample.”

That product was tested in five generations of small field trials before going into larger trials this summer. Pivot worked with twenty-five farmers across the US to each grow a few acres using the liquid probiotic treatment. The harvest has yet to come in, and the data with it, but farmers like Misch are already excited. He learned on Twitter that an associate of his was participating in the trial, so Misch stopped by his farm to walk the test rows last week. What he saw convinced him to sign up to be Pivot’s first customer in Indiana. “If you go back 10 years, biologics get a mixed review from farmers,” says Misch. “These are living organisms and they act with every environment differently, but the science has come a long way.” The way Misch crunches the numbers, using this kind of probiotic plant treatment could save him $20 an acre, or about a third of his current annual nitrogen investment.

Is it enough to save the planet? ربما لا. But at least it's a step in the right direction.