معلومة

ما هي أسرع طريقة لبناء مكتبة مسح الألانين؟

ما هي أسرع طريقة لبناء مكتبة مسح الألانين؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

بالنسبة للدراسات البينية ، أود إنشاء مكتبة مسح ضوئي للألانين لأحد بروتيناتي التي تفحص 20 موقعًا. سأعبر في النهاية عن استخدام الجين بكتريا قولونية تخليق البروتين الخالي من الخلايا. لدي بالفعل جين القالب الذي تم إنشاؤه في الأصل باستخدام تجميع PCR. الآن ، ما هي أفضل طريقة لإنشاء مكتبة مسح ضوئي؟


الأسرع سيتغير مع مرور الوقت ويتم تطوير تقنيات أفضل.

أعتقد أن أسرع طريقة موجودة في الوقت الحالي هي Shotgun Mutagenesis (مقدمة من Integral Molecular Inc).

هذا لا يستخدم أي طريقة جديدة للقيام بذلك. هم فقط يقدمون مجموعة من البلازميدات ، التي تحتوي على كل الطفرات الممكنة. يتم إنشاء المجموعة نفسها عن طريق التوليف الآلي للحمض النووي.

لذلك إذا لم يكن لديك مركب DNA معك ، فببساطة اطلب المجموعة من الشركة.


الحدود في الكيمياء

انتماءات المحرر والمراجعين هي الأحدث التي يتم توفيرها في ملفات تعريف بحث Loop وقد لا تعكس موقفهم في وقت المراجعة.


  • تحميل المادة
    • تحميل PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • تكميلي
      مادة
    • ملاحظة ختامية
    • مدير المراجع
    • ملف TEXT بسيط
    • BibTex


    مشاركه فى

    توليف مخصص للمكتبة والتسليم

    تقدم Pepscan مصفوفات ببتيد مخصصة بجميع الأحجام والتنسيقات ، بدءًا من مجموعة صغيرة من الببتيدات إلى مكتبات تضم 1000 مجموعة من الأنواع المختلفة. تتراوح أطوال الببتيد عادة من 5 إلى 30 حمض أميني ، وهو ما يكفي لمعظم التطبيقات. ومع ذلك ، بصفتها مخترع مفهوم مكتبة الببتيد ، توفر Pepscan أيضًا مكتبات الببتيد التي يصل طولها إلى 50 من الأحماض الأمينية ، إذا لزم الأمر مع القيود المطابقة أو تعديلات ما بعد الترجمة. يتم تصنيع مكتبات الببتيد على منصة تصنيع الببتيد الحديثة من Pepscan ، وعادة ما تكون بمقياس 4 ميكرولتر. ينتج عن هذا عادةً 1 إلى 4 ملغ من الببتيد الخام ، وهو مثالي لأعمال الفحص السريع والفعال. مراقبة الجودة الإضافية متاحة عند الطلب. عادة ، يبدأ التركيب في غضون أيام من تقديم الطلب ، مع أوقات التسليم القياسية حوالي 3-4 أسابيع ، اعتمادًا على حجم المكتبة وطول الببتيد. يتم تسليم مكتبات الببتيد المخصصة على هيئة ببتيدات مجففة بالتجميد إما في 96 طبقًا جيدًا للفحص عالي الإنتاجية أو في الأنابيب الدقيقة الفردية. سيتم تسليم جميع الببتيدات الموجودة في المكتبة كأملاح TFA كمساحيق مجففة بالتجميد.

    بناءً على الطلب ، ننتج مكتبات الببتيد مع تعديلات هيكلية مختلفة ، مثل الأسيتيل الطرفي N ، أو التحلل الحيوي ، أو Ser / Thr-phosphorylation ، أو N-methylation ، أو وضع العلامات باستخدام الأصباغ الفلورية. يرجى الاتصال بنا للحصول على مزيد من المعلومات حول التعديلات المخصصة.


    2. المواد والأساليب

    يقدم تطبيق الويب واجهة مستخدم بسيطة (الشكل 1) تغطي الوظائف من تطبيق سطر أوامر BudeAlaScan ، والذي تم وصفه وقياسه بالتفصيل في مكان آخر (Ibarra) وآخرون.، 2019). باختصار ، يستخدم تطبيق سطر الأوامر BudeAlaScan ISAMBARD (Wood وآخرون.، 2017) لإعداد ملفات الإدخال لإصدار مخصص من Bristol University Docking Engine (BUDE) (McIntosh-Smith وآخرون.، 2012) ، والذي ينفذ CASM باستخدام حقل قوة تجريبي مجاني للطاقة لتقدير الطاقة الحرة للربط. تم قياس دقة BudeAlaScan بشكل تجريبي ومقارنتها بشكل إيجابي مع الطرق الأخرى (Ibarra وآخرون.، 2019) ، ولكنه أسرع بشكل ملحوظ من البدائل ، مما يجعله مثاليًا للاستخدام في تطبيق ويب تفاعلي.

    نظرة عامة على تطبيق الويب BAlaS. (أ) تحتوي الواجهة الرئيسية على متخيل للهيكل ولوحة لتقديم الوظائف وعرض النتائج. تظهر لوحة المسح على اليمين وتعرض نتائج مهمة CASM ، مع جدول يصف المساهمة النشطة لكل بقايا. (ب) تعرض علامة تبويب الكوكبة الطاقات المحسوبة لكل كوكبة ، في هذه الحالة من وظيفة وضع المخلفات. (ج) تعرض لوحة الوظائف جميع الوظائف التي تم إرسالها بواسطة المستخدم. يمكن للمستخدم عرض النتائج وإنشاء ارتباط إلى الوظيفة التي يمكنه مشاركتها أو تنزيل المخرجات الكاملة أو حذف الوظيفة.

    نظرة عامة على تطبيق الويب BAlaS. (أ) تحتوي الواجهة الرئيسية على متخيل للهيكل ولوحة لتقديم الوظائف وعرض النتائج. تظهر لوحة المسح على اليمين وتعرض نتائج مهمة CASM ، مع جدول يصف المساهمة النشطة لكل بقايا. (ب) تعرض علامة تبويب الكوكبة الطاقات المحسوبة لكل كوكبة ، في هذه الحالة من وظيفة وضع المخلفات. (ج) تعرض لوحة الوظائف جميع الوظائف التي تم إرسالها بواسطة المستخدم. يمكن للمستخدم عرض النتائج وإنشاء ارتباط إلى الوظيفة التي يمكنه مشاركتها أو تنزيل المخرجات الكاملة أو حذف الوظيفة.

    تمت كتابة الواجهة الأمامية لتطبيق BAlaS بلغة Elm (https://elm-lang.org/) ويتعامل مع التحقق من صحة الإدخال وإدارة الوظائف وتصور النتائج. يتم عرض الهياكل باستخدام مكتبة PV JavaScript (Biasini ، 2015). بنية الواجهة الخلفية بسيطة نسبيًا: تُستخدم NGINX لخدمة التطبيق ويتم استخدام ملفات النتائج قاعدة بيانات NoSQL (MongoDB) لقائمة انتظار المهام ولتخزين النتائج ، يقوم نص برمجي بسيط باستطلاع قاعدة البيانات وتشغيل وظائف BudeAlaScan وواجهة برمجة تطبيقات RESTful مكتوبة باستخدام مكتبة Flask Python (http://flask.pocoo.org/) ، تستخدمه الواجهة الأمامية لإرسال الوظائف واسترداد النتائج. تعمل حزمة التطبيقات بالكامل داخل ثلاث حاويات Docker (https://www.docker.com/) ، والتي تمكن المستخدمين من تشغيل تطبيق الويب محليًا إذا رغبت في ذلك.

    يسمح وضع الكوكبة للمستخدم بدمج طفرات ألانين متعددة للعثور على مناطق من "الترابط" التي تتفاعل بشكل تعاوني مع "المستقبل" ، والتي نسميها الأبراج الساخنة ، أي أن ΔΔG عندما تتحول جميع البقايا إلى ألانين في وقت واحد ، يكون أكبر من المجموع من قيم ΔΔG عندما يتم تحور كل بقايا إلى ألانين على حدة. هذا مفيد لتسليط الضوء على مناطق "الترابط" التي تعتبر أساسية لتشكيل التفاعل مع "المستقبل". يمكن تشغيل وظائف Constellation في واحد من ثلاثة أوضاع: يدوي ، وبقايا وتلقائية. في الوضع اليدوي ، يحدد المستخدم جميع المخلفات في كوكبة. في وضع البقايا ، يختار المستخدم قائمة المخلفات وحجم الكوكبة ، ويتم تقييم جميع التباديل للمخلفات التي تساوي حجم الكوكبة. في الوضع التلقائي ، يحدد المستخدم حجم كوكبة ، وقطع ΔΔG (كيلوجول / مول) وقطع مسافة Cα-Cα (Å). يتم إنشاء تباديل لجميع البقايا التي تحتوي على ΔΔG أعلى من الحد الفاصل لحجم الكوكبة المحدد ، بشرط أن تكون البقايا ضمن المسافة المقطوعة من Cα – Cα لبعضها البعض.

    أخيرًا ، تُستخدم علامة تبويب الوظائف لإدارة وظائف المستخدم وكذلك استرداد النتائج ومشاركتها. يمكن تنزيل النتائج الكاملة من تطبيق سطر الأوامر كملف مضغوط ويحتوي على بيانات ΔΔG بتنسيقات نصية ، بالإضافة إلى نصوص لعرض النتائج في برنامج الرسوميات الجزيئي Chimera. يمكن للمستخدمين رسم البيانات الرسومية (ملفات json) الموجودة في المخرجات بسهولة من خلال البرنامج النصي replotAlaScan.py في حزمة BudeAlaScan.


    مراجع

    Littlewood، T. & amp Evan، G. I. عوامل النسخ الحلزوني - الحلقي - الحلزوني (مطبعة جامعة أكسفورد ، نيويورك ، 1998).

    وينستون ، ر.ل ، وأمبير جوتيسفيلد ، ج. م. تشيم. بيول. 7, 245–251 (2000).

    موري ، سي ، مكاو ، بي إس ، بالتيمور ، دي. زنزانة 56, 777– 783 (1989).

    Ferre-D'Amare، A. R.، Prendergast، G.C، Ziff، E.B & amp Burley، S. K. طبيعة سجية 363, 38–45 ( 1993).

    Ma، P.C، Rould، M.A، Weintraub، H. & amp Pabo، C.O. زنزانة 77, 451–459 ( 1994).

    Grandori، C. & amp Eisenman، R. N. اتجاهات Biochem. علوم. 22, 177–181 (1997).

    Grandori، C.، Mac، J.، Siebelt، F.، Ayer، D.E & amp Eisenman، R.N. EMBO J. 15, 4344– 4357 (1996).


    المواد والأساليب

    سلالة البناء

    تم إنشاء سلالات أليل مسح الأكتين ألانين الأصلية مع كلاهما مرتبطين HIS3 علامة وملف حوض 2-201 أليل في جين & # x003b2-tubulin الذي يمنح مقاومة للبينوميل (Wertman and Drubin 1992). كنا قلقين من أن طفرة & # x003b2-tubulin ستسهم في التفاعلات الجينية في شاشاتنا. علاوة على ذلك ، في إجراء CHI الخاص بنا ، نفضل تمييز الأليلات الطافرة بجين مرتبط بمقاومة nourseothricin (NAT r) لأن هذا يعطي اختيارًا ضيقًا للغاية. لذلك ، قمنا بإعادة بناء أليلات مسح الأكتين ألانين في خلفية أكثر ملاءمة. خلال هذه العملية ، اكتشفنا أن سبعة من طفرات مسح الأكتين ألانين الأصلية بها طفرات إضافية. قمنا بتصحيح السبعة جميعًا ولكن وجدنا أن اثنين من المسوخات التي تم الإبلاغ عنها سابقًا أنها أليلات قاتلة متنحية كانت في الواقع أليلات قاتلة مهيمنة وبالتالي لا يمكن استخدامها في تحليلنا. تم وصف تصحيح هذه الأليلات السبعة وتحليلها المظهري في رسالة إلى علم الوراثة (فيجيانو وآخرون. 2010). ترك هذا 31 أليلات مسح ألانين ، مميزة بـ NAT r وبدون طفرة & # x003b2-tubulin لتحليل CHI. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتضمين ملف قانون 1-159 الأليل الذي يشفر طفرة مثبتة للخيط من الأكتين (بلمونت ودروبين 1998). يسرد الجدول 1 هذه الأليلات وأنماطها الظاهرية ومواقعها وعدد التفاعلات.

    الجدول 1

    أليلطفرهالنمط الظاهريموقعتفاعلات CHI
    قانون 1-101D363A ، E364ATs & # x02212 ، متنحيةالجانب13
    قانون 1-102K359A ، E361Aالنوع البريالجانب16
    قانون 1-103E334A ، R335A ، K336Aمميتة ، متنحيةأمام26
    قانون 1-104K315A ، E316Aالنوع البريالجانب18
    act1-105E311A ، R312ACs & # x02212 ، Ts & # x02212 ، متنحيةأمام113
    قانون 1-106R290A ، K291A ، E292Aمميتة ، متنحيةالجانب41
    قانون 1-107D286A ، D288Aقاتلة ، سائدة جزئيةأسفل العلوي50
    قانون 1-108R256A ، E259ATs & # x02212 ، مهيمن بشكل ضعيفخلف63
    قانون 1-109E253A ، R254Aقاتلة ، سائدة جزئيةأمام52
    قانون 1-110E237A ، K238Aقاتلة ، سائدة جزئيةأسفل العلوي45
    قانون 1-111D222A ، E224A ، E226ATs & # x02212 ، متنحيةالجانب57
    قانون 1-112K213A ، E214A ، K215ACs & # x02212 ، Ts & # x02212 ، متنحيةأمام100
    قانون 1-113R210A ، D211Aضعيف Ts & # x02212 ، متنحيأمام21
    قانون 1-115E195A ، R196Aالنوع البريأسفل العلوي11
    قانون 1-116D187A ، K191Aالنوع البريخلف5
    قانون 1-117R183A ، D184Aالنوع البريخلف4
    قانون 1-119R116A ، E117A ، K118ATs & # x02212 ، متنحيةخلف12
    قانون 1-120E99A ، E100ATs & # x02212 ، متنحيةالجانب7
    قانون 1-121E83A ، K84ACs & # x02212 ، Ts & # x02212 ، متنحيةالجانب7
    قانون 1-122D80A ، D81ACs & # x02212 ، Ts & # x02212 ، متنحيةالجانب9
    قانون 1-123R68A ، E72Aالنوع البريخلف33
    قانون 1-124D56A ، E57ATs & # x02212 ، متنحيةأمام11
    قانون 1-125K50A ، D51ACs & # x02212 ، Ts & # x02212 ، متنحيةالجانب3
    قانون 1-127E270A ، D275Aمميتة ، متنحيةخلف19
    قانون 1-128E241A ، D244Aقاتلة ، سائدة جزئيةأسفل العلوي40
    قانون 1-129R177A ، D179ATs & # x02212 ، متنحيةخلف10
    قانون 1-131K61A ، R62Aقاتلة ، سائدة جزئيةأسفل العلوي54
    قانون 1-132R37A ، R39ACs & # x02212 ، Ts & # x02212 ، متنحيةخلف34
    قانون 1-133D24A ، D25ACs & # x02212 ، Ts & # x02212 ، متنحيةأمام34
    قانون 1-135E4Aالنوع البريأمام9
    قانون 1-136D2Aالنوع البرياختصار الثاني14
    قانون 1-159V159NTs & # x02212 ، متنحيةشق ATP17

    CHI ، عدم كفاية الفردانية المعقدة ND ، غير محدد.

    أكثر من قانون 1 تم إنشاء سلالات متحولة لمسح الألانين كما هو موضح سابقًا (Haarer وآخرون. 2007). سلالات تحمل قانون 1-107, -108, -127, -128، و -136 تم إنشاء الأليلات عن طريق تحويل ثنائي الزيجوت متغاير الزيجوت الموصوف سابقًا (Viggiano وآخرون. 2010) مع CEN URA3ACT1 البلازميد pKFW29 ، متبوعًا بتشريح رباعي لتوليد السلالات المستخدمة في شاشات تغاير الزيجوت المعقدة.

    ال قانون 1-159 تم إنشاء السلالة عن طريق عبور السلالة DAY245 (MATa leu2his3ura3act1-159: حوض Nat R tub2-201 lyp1can1 المستخدمة لتحليل SGA) إلى BY4741 و القانون 1-159: نات ر تم تهجين الفصل إلى BY4741 وحيدة الصيغة الصبغية القانون 1-159: نات ر تم تحويل الفصل من هذا ثنائي الصيغة الصبغية باستخدام pKFW29 واستخدامه في شاشات تغاير الزيجوت المعقدة. على عكس الآخر قانون 1 سلالات ، هذه السلالة تحمل قانون 1-مرتبط حوض 2-201 طفره.

    شاشات تغاير الزيجوت المعقدة بين قانون 1 أليلات مسح الألانين و قانون 1& # x02206 CHI مجموعة الجينات

    تم إجراء شاشات تغاير الزيجوت المعقدة الموصوفة في هذه الدراسة على النحو الموصوف سابقًا (Haarer وآخرون. 2007). لتلخيص ، سلالات أحادية العدد تحمل علامة Nat R متحولة قانون 1 الأليلات وتحتوي أيضًا على قانون 1 على CEN URA3 تم ربط البلازميد (pKFW29) بالسلالات المحذوفة (بواسطة علامة kan R / G418 R) للجينات التي تم عرضها سابقًا لإظهار الكفاءة الفردية المعقدة مع act1 & # x02206 (هارير وآخرون. 2007) ونتائجنا غير المنشورة). تم اختيار Diploids على الوسائط التي تحتوي على G418 و nourseothricin ، متبوعًا بخطوط المستعمرات ثنائية الصبغيات الفردية إلى الوسائط المتطابقة التي تحتوي على G418 و Nat مع أو بدون FOA ، والتي تنتقي ضد الخلايا التي تحمل URA3 علامة pKFW29. تم تحضين الشرائط على وسائط FOA + / & # x02212 عند 34.5 & # x000b0 و 37 & # x000b0 لمعظم التهجينات ، أو عند 25 & # x000b0 و 30 & # x000b0 لتلك السلالات التي تعرض حساسية درجة الحرارة بسبب عدم كفاية الجينات المعينة التي يتم اختبارها . يكون تسجيل عيوب النمو على النحو التالي: الدرجة الأولى هي الفتك ، والنتيجة 2 تقابل عيوب النمو الشديدة كما تنعكس في المستعمرات الصغيرة بالمقارنة مع الزيجوت غير المتجانسة ، والنتيجة 3 تعكس أحجام المستعمرات التي تكون أصغر بشكل ملحوظ من الزيجوت المتغايرة السيطرة.

    تحليل ارتباط سمة درجة التفاعل

    تم أخذ مجموعة السمات الفسيولوجية والتطورية لمجموعة الجينات CHI مباشرة من (Costanzo وآخرون. 2010). تم استخدام ارتباط بيرسون لقياس الارتباط بين درجة جين CHI وكل ميزة باستخدام MATLAB.

    تحليل الكتلة للتفاعلات غير المتجانسة المعقدة مع أليلات الأكتين

    تم تجميع ملفات تعريف التفاعل المتحولة الأكتين باستخدام Cluster 3.0 (de Hoon وآخرون. 2004). أجرينا التجميع الهرمي لكل من الأليلات والجينات من المصفوفة. تم قياس التشابه باستخدام ارتباط بيرسون غير المتمركز مع متوسط ​​الارتباط. تطلبت خوارزمية التجميع عكس وزن الدرجات: لقد حددنا 3 على أنها أقوى درجة و 1 على أنها أضعف درجة بحيث كانت الدرجات الضعيفة أقرب إلى عدم التفاعلات.

    النمذجة الجزيئية

    تم إنشاء النماذج الجزيئية باستخدام UCSF Chimera (Pettersen وآخرون. 2004) و Adobe Photoshop.

    المجهر مضان

    إن Sec4-GFP معربًا عن البلازميد pRC556 (هدية أنتوني بريتشر) (شوت وآخرون. 2002) إلى سلالة أحادية الصيغة الصبغية من النوع البري BY4741 ، قانون 1-112 سلالة أحادية الصيغة الصبغية SVY413 ، و act1-112 / ACT1 بالوزن سلالة SVY331. نمت الخلايا ل

    2 & # x000d7 10 7 خلايا / مل ، تم رصدها على وسائد من 25 ٪ من الجيلاتين في وسط اصطناعي كامل على شرائح زجاجية ، وتم التقاط صور ثابتة ومتأخرة على زايس Imager.Z1 مجهر epifluorescence مع هدف مخطط 100X Apochromator (الزيت ، فتحة عددية 1.46) باستخدام كاميرا Orca ER (Hamamatsu Photonics). تمت معالجة الصور باستخدام برنامج Zeiss AxioVision و Adobe Photoshop.


    الملخص

    كان Palivizumab أول جسم مضاد وحيد النسيلة مضاد للفيروسات (mAb) معتمد للاستخدام العلاجي في البشر ، ولا يزال علاجًا وقائيًا للرضع المعرضين لخطر الإصابة بمرض شديد بسبب الفيروس المخلوي التنفسي (RSV). Palivizumab هو نسخة متوافقة مع البشر من الفئران mAb تستهدف موقع المستضد الثاني لبروتين الانصهار RSV (F) ، وهو هدف رئيسي في تطوير اللقاح. هناك تقارير محدودة عن mAbs بشرية تحدث بشكل طبيعي إلى الموقع II وبالتالي ، فإن الأساس الهيكلي للتعرف على الأجسام المضادة البشرية لهذا الموقع المستضد الرئيسي غير مفهوم جيدًا. هنا ، نصف فئة غير محايدة من mAbs الخاصة بالموقع الثاني والتي تنافست على الارتباط مع palivizumab ببروتين RSV F بعد الانصهار. وصفنا أيضًا فئتين من تحييد mAbs الخاص بالموقع II ، أحدهما أفلت من المنافسة باستخدام mAbs غير المحايد. أظهر التركيب البلوري للأشعة السينية لـ mAb 14N4 المعادل في مركب مع بروتين F أن زاوية الربط التي يتفاعل فيها mAbs البشري مع موقع المستضد II تحدد ما إذا كانت الأجسام المضادة غير المعادلة تتنافس مع ارتباطها أم لا. حددت دراسات الخرائط الدقيقة أن mAbs غير المعادلة التي تتداخل مع ربط mAbs المعادلة تتعرف على الموقع II بوضعية تسهل الارتباط بحلقة تحتوي على بقايا سطح F على بروتومر مجاور. تحييد الأجسام المضادة ، مثل motavizumab و mAb الجديد المعين 3J20 الذي يفلت من التداخل بواسطة mAbs المثبط ، تجنب مثل هذا الاتصال عن طريق الارتباط بزاوية يتم إزاحتها بعيدًا عن الموقع غير المعادل. علاوة على ذلك ، فإن الارتباط بلقاح الحلزون الحلزوني - الحلقي - الحلزوني - السقالة المصمم عقلانيًا وحسابيًا يميز المعادلة عن الأجسام المضادة غير المحايدة في الموقع II.

    يعد الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) من مسببات الأمراض البشرية شديدة العدوى ، حيث يصيب غالبية الأطفال قبل سن عامين ، وهو السبب الرئيسي لالتهاب القصيبات الفيروسي والالتهاب الرئوي الفيروسي عند الرضع والأطفال (1 ، 2). تظل RSV أولوية قصوى لتطوير اللقاح ، حيث يتم تسجيل الآلاف من الوفيات في جميع أنحاء العالم كل عام بسبب مضاعفات العدوى (3). حتى الآن ، لا يوجد لقاح RSV مرخص. كان التركيز الرئيسي لتطوير لقاح RSV هو تضمين بروتين الانصهار RSV (F) ، وهو بروتين سكري من الدرجة الأولى يتم تصنيعه كسلائف وينقسم إلى جزأين مرتبطين بثاني كبريتيد عند النضج في قاطع (4). على الرغم من أن فيريون RSV يحتوي على نوعين من البروتينات السطحية الإضافية ، بروتين (G) المرفق عالي الجليكوزيلات والبروتين الصغير الكاردي للماء ، يتم حفظ بروتين F بشكل كبير بين سلالات RSV وهو الهدف الرئيسي للأجسام المضادة المعادلة الواقية.

    من المعروف أن بروتين F يتبنى على الأقل شكلين رئيسيين: التشكل المسبق المنتشر وتشكل ما بعد الانصهار. بعد ربط الفيروس بالخلية بواسطة البروتين G ، يخضع البروتين F لعملية إعادة ترتيب هيكلية مثيرة ، مما يؤدي إلى اندماج الأغشية الفيروسية والخلوية ، وفي الخلايا المستنبتة يتسبب في تكوين خلوي الخلية. تم تحديد أربعة مناطق مستضد معادلة رئيسية حتى الآن في بروتين F ، وهي مواقع مستضدية محددة بشكل عام I و II و IV و Ø ، مع وجود الأخيرة فقط في التشكل الأولي. الموقع الثاني هو الهدف من palivizumab (5) ، وهو علاج وقائي مرخص للاستخدام في الرضع المعرضين لخطر كبير خلال موسم RSV. يتم اختبار لقاح الوحدة الفرعية لبروتين RSV F الذي يشتمل على مجاميع من تشكيل ما بعد الانصهار لـ RSV F حاليًا في التجارب السريرية (6) ، وقد تم اقتراح منافسة الأجسام المضادة في المصل مع palivizumab كإرتباط مصلي محتمل للمناعة لهذا اللقاح (7 ، 8) ). لقد قمنا مع غيرنا بعزل ودراسة mAbs الخاصة بـ RSV F باستخدام الأورام الهجينة الفئران (9) ، وخلايا المكاك B المصنفة (10) ، وتحويل الخلايا B البشرية أو مكتبات عرض الجينات البشرية للأجسام المضادة (11 ، 12). تتضمن الأمثلة mAbs 101F (9) و D25 (13) وموقع الجيل التالي II mAb motavizumab (14). ومع ذلك ، لا توجد تقارير عن mAbs بشرية تحدث بشكل طبيعي في الموقع الثاني ، و palivizumab هو نسخة هندسية متوافقة مع البشر من الفئران mAb 1129 (15). لذلك ، فإن ذخيرة الأجسام المضادة البشرية التي تتفاعل مع الموقع II والأساس الهيكلي للتعرف على موقع المستضد الرئيسي هذا غير مفهوم جيدًا.

    لتوصيف الاستجابة المناعية البشرية لبروتين RSV F ، قمنا بعزل وتمييز mAbs البشرية التي تستهدف بروتين RSV F ، وعلى وجه الخصوص جهود الاكتشاف المركزة على موقع المستضد II. كشف تحديد الأساس الهيكلي للتفاعل بين الأجسام المضادة الخاصة بالموقع II عن رؤى جديدة حول تعقيد هذا الموقع وأنماط متنوعة من التعرف التي تحدد ما إذا كانت الأجسام المضادة البشرية المتنافسة في الموقع II تحيد RSV أم لا.


    ملخص الطفرات الموجهة بالموقع

    باختصار ، يمكن إدخال الطفرات النقطية على البلازميدات باستخدام الاشعال (مع الطفرة المرغوبة) في بروتوكول PCR الذي يضخم قالب البلازميد بأكمله. تتم إزالة القالب الأصلي باستخدام نوكلياز داخلي يعتمد على المثيلة (أي DpnI) ، ويتم تحويل البكتيريا باستخدام البلازميد المكسور المقاوم للنيوكلياز (منتج PCR). يتم عزل البلازميدات من المستعمرات الناتجة ، ويتم فحصها من أجل التعديل المطلوب. أخيرًا ، يتم تسلسل النسخ الإيجابية لتأكيد التعديل المطلوب وغياب التعديلات الإضافية.


    خدمة تجميع مكتبة Omizzur Peptide:

    مجموعة كبيرة من أدوات تصميم المكتبات: متداخلة ، مقطوعة ، مقطوعة للخلايا التائية ، مسح ألانين ، مكتبة عشوائية ، مسح ضوئي موضعي ، مسح موضعي 2/3 لتلبية المتطلبات المختلفة.

    تجنب التلوث المتبادل

    يتم تجفيف الببتيدات بالتجميد في 96 لوحة أنبوبية أو قوارير فردية لتجنب أي تلوث متقاطع.

    تعديلات الببتيد الشاملة

    يدمج Omizzur جميع تعديلات الببتيد المستديرة: تعديل أطراف N / C ، والأحماض الأمينية الخاصة ، وتقارن الببتيد ، والبيوتين ، ووسم التألق الفسفوري وما إلى ذلك.

    نظام صارم لمراقبة الجودة

    تتبع مكتبة الببتيد المخصصة نظام جودة Omizzur الصارم ، من خلال منصة OMIZZU TM Synthesis الأوتوماتيكية ، تضمن Omizzur توفير درجة نقاء عالية ، ولا فرق في الدُفعات لكل منتج من منتجات الببتيد.

    مكتبة الببتيدالخام أناأنا المنقىتنقية II
    طول5-30AA5-15AA16-30AA
    نقاءخام& GT70٪& GT98٪
    كمية3-20 ملجم3-9 ملغ3-9 ملغ
    ايصال7-15 يوم10-15 يوم15-20 يومًا
    الحد الأدنى للطلب24 ببتيدات24 ببتيدات24 ببتيدات
    تعديلات الببتيدتعديل أطراف N / C ، أحماض أمينية خاصة ، متقارنات الببتيد ، البيوتين ، الفسفرة ، إلخ
    تقرير التحليلشهادة توثيق البرامجHPLC + COA + MSHPLC + COA + MS

    التطبيقات أنواع المكتباتاقتراح الطهارة
    • رسم خرائط حاتمة مستضد.
    • تحديد حاتمة الخلية التائية
    • مسح تسلسل البروتين
    مكتبة متداخلةخام
    • العلاج المناعي للخلايا التائية
    • دراسة التمثيل الغذائي للأدوية الببتيدية
    مكتبة الاقتطاعخام أو ≥70٪
    • رسم خرائط حاتمة للجسم المضاد
    • دراسة ركائز الإنزيم
    تحديد المواقع الاندماجي
    مكتبة المسح
    مكتبة متداخلة
    خام أو ≥70٪
    • المقايسات البيولوجيةمكتبة الببتيد المخفوق
    مكتبة متداخلة
    حتى 70٪
    • تطوير لقاحمكتبة مسح الألانينحتى 90٪

    مكتبة الببتيد عبارة عن مزيج من جزء من الببتيد بطول معين ، والذي يحتوي على جميع معلومات الترتيب الممكنة للأحماض الأمينية ، وهناك نوعان من مكتبة الببتيد ، أحدهما مكتبة الببتيد الاصطناعية ، والآخر مكتبة الببتيد العاثيات. خاصية الارتباط بالبروتين المحدد المقابل ، يمكن اختيار جزء محدد واحد من مكتبة الببتيد باستخدام البروتين المحدد المسمى ، يمكن أن تكون العلامات المستخدمة في وضع العلامات على البروتينات عبارة عن إنزيمات ، وفلوريسين ، وبيوتين ، ونظائر ، ونطلق على هذا المسمى محددًا البروتين كمسبار.

    يمكن أن يؤدي استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة كمسبار إلى فحص جزء الببتيد ذي التقارب العالي من مكتبة الببتيد الاصطناعية. يمكن أن توفر معلومات الحاتمة المحددة هذه إلهامًا مهمًا لتطوير لقاح الببتيد. خلية المستقبل: بناءً على هذه المعلومات ، يمكن للعالم تطوير مضادات ببتيد اصطناعية معينة لمستقبلات السيتوكين ، والتي يمكن تطويرها إلى عقار ببتيد.

    مكتبة الببتيد المتداخلة

    يتم استخدامه بشكل أساسي لرسم خرائط حاتمة لمستضد ومسح البروتين ، وبهذه الطريقة يمكننا معرفة أي جزء من الأحماض الأمينية التي تنقسم من الببتيد أو البروتين يمكن أن تساهم في النشاط البيولوجي. الرقم: طول الببتيد بشكل عام هو 5-15 AA ، وعدد رقم الإزاحة بشكل عام هو 2-5.

    تكون حواتم الخلايا التائية عمومًا عبارة عن ببتيدات قصيرة خطية في بروتين هولوبروتين ، لذا فإن المكتبة المتداخلة هي أيضًا طريقة شائعة لفحص حلقات الخلايا التائية. توفر تقنية التوليف عالية الإنتاجية AurPepTM إمكانية هذا العمل البحثي.

    مجال التطبيق: رسم خرائط حاتمة المستضد ، مسح البروتينات ، تحديد حاتمة الخلية التائية.

    مكتبة الببتيد الاقتطاع

    تحديد أقصر متواليات الأحماض الأمينية المتعلقة بالنشاط البيولوجي ، عن طريق إزالة الأحماض الأمينية بشكل منهجي على جانبي تسلسل الببتيد الأصلي ، يمكن أن يحدد النطاق الأدنى من حواتم المستضد.

    مجال التطبيق: أقصر تحديد تسلسل حيوي ، استقلاب الأدوية الببتيدية في الجسم الحي.

    ألانين هو أصغر حمض أميني مراوان في 20 نوعًا من الأحماض الأمينية الطبيعية. يمكن استخدامه لتحديد تأثير كل موقع من الببتيد المستهدف على نشاطه البيولوجي عن طريق استبدال كل حمض أميني بشكل فردي بالتسلسل. عندما يتم استبدال بقايا الأحماض الأمينية الأساسية بالألانين ، فإن الببتيدات ستقلل بالتالي من النشاط البيولوجي.

    مجال التطبيق: دراسة تأثير حمض أميني معين على وظيفة البروتين بالكامل.

    يستخدم 20 نوعًا من الأحماض الأمينية الطبيعية لتحل محل بقايا الأحماض الأمينية المختارة في الببتيد الأصلي بشكل متزامن وعشوائي عن طريق نهج البندقية ، وذلك لتشكيل أكبر عدد ممكن من الطفرات العشوائية ، وبهذه الطريقة يمكن تحديد الببتيدات ذات الوظائف أو الأنشطة المحددة مبدئيًا في مجموعة متواليات نشطة.

    مجال التطبيق: تحسين تسلسل الببتيد ، اكتشاف الأدوية

    مكتبة الببتيد المخفوق

    يتم استخدامه بشكل أساسي لفحص الببتيد أو تحسين تسلسل الببتيد الذي يستهدف البروتين أو الجسم المضاد أو الحمض النووي. يعتمد تصميم هذه المكتبة على الاستبدال الداخلي لتسلسل الببتيد الأصلي. إنها مكتبة الببتيد الأكثر تحورًا ، وهي أيضًا أداة فحص عشوائية للعثور على أهداف جديدة.

    مجال التطبيق: فحص الببتيد ، تحسين تسلسل الببتيد

    تتيح مكتبة T-cell Truncated تحديدًا عالي الدقة لحلقات الخلايا التائية عبر البروتين. تم قطع الببتيد تدريجيًا من كلا الطرفين لتشكيل مكتبة الببتيد ، ثم تم دمج مكتبة الببتيد في تجمع الببتيد لفحص أفضل حاتمة الخلية التائية. توفر مكتبة الببتيد المقطوعة للخلايا التائية ضمانًا قويًا لفحص أفضل حاتمة للخلية التائية ذات الأهمية.

    مجال التطبيق: اختبر كل حاتمات الخلايا التائية الممكنة في البروتين

    مكتبة الببتيد المسح الموضعي التجميعي

    تعد مكتبة المسح الموضعي التجميعي أداة مهمة لتحسين تسلسلات الببتيد ، وهي ترقية للمسح الموضعي ، بعد فحص المواقع المهمة التي تؤثر على نشاط مكتبة الألانين ، يمكن اكتشاف مخططات التعديل لتحسين نشاط الببتيدات بسرعة عن طريق التباين بشكل منهجي وضعان أو أكثر في وقت واحد (استبدل كل موقع من مواقع الببتيد بأحماض أمينية غير طبيعية / طبيعية ، أحماض أمينية D ، أحماض أمينية مشتقة من Phe / Tyr ، فسفرة / N- مثيلة ، إلخ)

    سيكون 20 × 20 = 400 ببتيد يتم إنتاجه في عملية المسح ثنائي الموضع مع 20 نوعًا من الأحماض الأمينية الطبيعية ، سيكون المسح ثلاثي المواضع 8000 ببتيد إجمالاً. يمكن أن تساعدك منصة AuaPepTM Synthesis المطورة على إنشاء مجموعة المصفوفة هذه بسرعة. يرجى إخبارنا بالتسلسل ، والموقع المراد دراسته ، والنقاء والكمية ، وستساعدك منصة التوليف الخاصة بنا تلقائيًا على إنشاء هذه المصفوفة.

    مجال التطبيق: تحسين النشاط البيولوجي للببتيد ، دراسة عن نشاط ركائز الإنزيم.

    أدخلت Omizzur معدات تصنيع الببتيد الأوتوماتيكية عالية الإنتاجية مع منصة تصنيع OMIZZUTM المطورة بشكل مستقل لإنتاج منتجات ببتيد بمستوى ملغم ومتعدد التسلسل لتلبية طلب مكتبة الببتيد من العملاء. سيساعدك برنامج Omizzur تلقائيًا في إنشاء مكتبة الببتيد عندما تخبرنا بالتسلسل والنقاء والمتطلبات الأخرى ذات الصلة التي تريد دراستها ، وسيتم إرسال النتائج إليك عبر البريد الإلكتروني مع عرض الأسعار للمراجع الخاصة بك.

    1.Smith G P. عرض السطح ومكتبات الببتيد. الجين ، 1993،128.1-2

    2.Devlin JJ، Pangniban L C، Devlin P E. مكتبات الببتيد العشوائية: مسار لعلوم جزيئات ملزمة للبروتين ، 1990،249: 404-406

    3.Scott JK، Smith G P. البحث عن روابط الببتيد مع مكتبة Epitope. العلوم ، 1990،249: 386-390

    4.Houghten RA ، Pinilla C ، Blondelle SE ، وآخرون ، توليد واستخدام المكتبات التجميعية الببتيدية الاصطناعية للبحث الأساسي واكتشاف الأدوية [J]. الطبيعة ، 1991،354: 84-86

    5.Ohlmeyer MH، Swanson RN، Dillard LW، et al، مكتبات كيميائية تركيبية معقدة مفهرسة بعلامات جزيئية [J]، Proc Natl Acad Sci، 1993،90: 10922-10926


    الاستنتاجات

    يمكن لخادم الويب ABS-Scan أن يوفر رؤى قيمة حول التعرف الجزيئي الذي يتضمن تفاعلات بروتين - يجند. يمكن دراسة هياكل البروتين - الترابطية المحددة تجريبياً لفهم مساهمات المخلفات الفردية تجاه الارتباط بالرابط. يمكن أيضًا تقديم المجمعات المصممة على شكل نموذج لاستنتاج جدوى التفاعل. نعتقد أن ABS-Scan سيضيف بُعدًا آخر لتحليل مواقع الربط في البروتينات ، ومقارنة تفاعلات ligand المختلفة ويكون ذا أهمية للباحثين الذين يقومون بدراسات ASM.


    شاهد الفيديو: مكتبة حصيف (شهر فبراير 2023).