معلومة

13.5: نضعها معًا - التعبير الجيني - علم الأحياء

13.5: نضعها معًا - التعبير الجيني - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

دعنا نعود إلى نظرتنا السابقة للسرطان: أحد الأمثلة على تعديل الجينات الذي يغير معدل النمو هو زيادة فسفرة cyclin B ، وهو بروتين يتحكم في تقدم الخلية خلال دورة الخلية ويعمل كبروتين نقطة تفتيش لدورة الخلية.

لكي تتحرك الخلايا خلال كل مرحلة من مراحل دورة الخلية ، يجب أن تمر الخلية عبر نقاط التفتيش. هذا يضمن أن الخلية قد أكملت الخطوة بشكل صحيح ولم تصادف أي طفرة من شأنها تغيير وظيفتها. تتحكم العديد من البروتينات ، بما في ذلك cyclin B ، في نقاط التفتيش هذه. إن فسفرة cyclin B ، حدث ما بعد متعدية ، يغير وظيفته. نتيجة لذلك ، يمكن للخلايا أن تتقدم خلال دورة الخلية دون عوائق ، حتى لو كانت الطفرات موجودة في الخلية ويجب إنهاء نموها.

معالجة السرطان

تم تصميم علاجات السرطان لاستهداف الخلايا المنقسمة بنشاط. إلى جانب الخلايا السرطانية ، ما هي الخلايا الأخرى التي تنقسم بنشاط في البشر؟ يعتبر تساقط الشعر من أكثر الآثار الجانبية وضوحًا جسديًا لعلاج السرطان. وذلك لأن الخلايا الحية في جذر الشعر تنقسم باستمرار لجعل الشعر ينمو لفترة أطول. لذلك غالبًا ما تتأثر هذه الخلايا بعلاجات السرطان على نطاق واسع مثل أدوية العلاج الكيميائي والإشعاع الموضعي في الرأس. بعد فترة وجيزة من علاج السرطان ، قد ينخفض ​​أيضًا تعداد دم المريض. هذا بسبب الانقسام السريع لخلايا الدم طوال حياة الشخص. على عكس خلايا الشعر ، تنقسم خلايا الدم في كثير من الأحيان وبسرعة. وبالتالي ، غالبًا ما يعود تعداد الدم إلى طبيعته بشكل أسرع بكثير من نمو الشعر.

جربها

يستخدم العلماء ما هو معروف عن تنظيم التعبير الجيني في حالات المرض ، بما في ذلك السرطان ، لتطوير طرق جديدة لعلاج ومنع تطور المرض. يصمم العديد من العلماء الأدوية على أساس أنماط التعبير الجيني داخل الأورام الفردية. هذه الفكرة ، أن العلاج والأدوية يمكن تكييفهما للفرد ، أدت إلى ظهور مجال الطب الشخصي. مع زيادة فهم تنظيم الجينات ووظيفة الجينات ، يمكن تصميم الأدوية لاستهداف الخلايا المريضة على وجه التحديد دون الإضرار بالخلايا السليمة. استغلت بعض الأدوية الجديدة ، التي تسمى العلاجات الموجهة ، الإفراط في التعبير عن بروتين معين أو تحور الجين لتطوير دواء جديد لعلاج المرض. أحد الأمثلة على ذلك هو استخدام الأدوية المضادة للمستقبلات EGF لعلاج مجموعة فرعية من أورام سرطان الثدي التي تحتوي على مستويات عالية جدًا من بروتين EGF. مما لا شك فيه ، سيتم تطوير علاجات أكثر استهدافًا حيث يتعلم العلماء المزيد حول كيفية تسبب تغيرات التعبير الجيني في الإصابة بالسرطان.

نظرًا لأن العلماء يتعلمون المزيد عن الانقسام الخلوي والطرق الفريدة التي يحدث بها خلل في الخلايا السرطانية ، فإنهم قادرون على تطوير علاجات موجهة. لا تزال هذه الأدوية علاجات كيميائية ، لكنها غالبًا ما تركز على سمة معينة لأنواع مختلفة من الخلايا السرطانية ، مما يجعلها أقل عرضة لاستهداف الخلايا غير السرطانية المنقسمة. هذا يقلل من الآثار الجانبية العالمية. لسوء الحظ ، لا يزال فهمنا للسرطان غير مكتمل. لذلك ، يعمل باحثو وأطباء السرطان كل يوم لإدارة وعلاج هذه الأمراض الرهيبة.

اقرأ المزيد على www.cancer.org


الفصل 20 التكامل مع وفرة البروتين

الفهرسة الخلوية للنصوص والحلقات بالتسلسل (CITE-seq) هي تقنية تحدد كلاً من التعبير الجيني ووفرة البروتينات السطحية المختارة في كل خلية في وقت واحد (Stoeckius et al. 2017). في هذا النهج ، يتم تصنيف الخلايا أولاً بالأجسام المضادة التي تم اقترانها بعلامات RNA الاصطناعية. الخلية التي تحتوي على وفرة أعلى من البروتين المستهدف سوف ترتبط بمزيد من الأجسام المضادة ، مما يتسبب في ربط المزيد من جزيئات العلامة المقابلة المشتقة من الجسم المضاد (ADT) بتلك الخلية. يتم بعد ذلك فصل الخلايا إلى غرف التفاعل الخاصة بها باستخدام موائع جزيئية تعتمد على القطيرات (Zheng et al. 2017). يتم نسخ كل من ADTs والنصوص الداخلية عكسيًا والتقاطها في مكتبة cDNA ، ويتم لاحقًا تحديد وفرة كل بروتين أو تعبير عن كل جين عن طريق تسلسل كل مجموعة من الميزات. يوفر هذا أداة قوية لاستجواب جوانب البروتين (مثل التعديلات اللاحقة للترجمة) والميزات الخلوية الأخرى التي عادة ما تكون غير مرئية لدراسات النسخ.

كيف ينبغي دمج بيانات ADT في التحليل؟ بينما لدينا حسابات لكل من ADTs والنصوص ، هناك اختلافات جوهرية في طبيعة البيانات تجعل من الصعب التعامل مع الأول على أنه ميزات إضافية في الأخير. تتضمن معظم التجارب عددًا صغيرًا فقط من الأجسام المضادة (& lt20) التي اختارها الباحث لأنها من بداهة الاهتمام ، على عكس بيانات التعبير الجيني التي تلتقط النسخة الكاملة بغض النظر عن الدراسة. كما أن تغطية ADTs أعمق بكثير حيث يتم تسلسلها بشكل منفصل عن النصوص ، مما يسمح بتركيز موارد التسلسل في عدد أقل من الميزات. وبالطبع ، فإن استخدام الأجسام المضادة ضد أهداف البروتين ينطوي على دراسة تحيزات منفصلة مقارنة بتلك التي لوحظت في النصوص.

في هذا الفصل ، سنصف بعض الاستراتيجيات للتحليل المتكامل لبيانات ADT والنسخ في تجارب CITE-seq. سوف نوضح استخدام مجموعة بيانات PBMC من 10x Genomics التي تحتوي على وفرة كمية لعدد من البروتينات السطحية المثيرة للاهتمام. نحصل على مجموعة البيانات بسهولة باستخدام ملف DropletTestFiles الحزمة ، وبعد ذلك يمكننا إنشاء SingleCellExperiment كما هو موضح أدناه.


8.2 قياس التباين لكل جين

8.2.1 تباين أعداد اللوغاريتمات

إن أبسط نهج لتقدير التباين حسب الجين هو ببساطة حساب التباين في قيم التعبير المعياري بالسجل (المشار إليها باسم "أعداد السجل" للبساطة) لكل جين عبر جميع الخلايا في المجتمع (ATL Lun و McCarthy و ماريوني 2016). هذا له ميزة في أن اختيار الميزة يعتمد على نفس قيم السجل المستخدمة لخطوات المصب اللاحقة. على وجه الخصوص ، ستساهم الجينات ذات التباينات الأكبر في القيم اللوغاريتمية بشكل أكبر في المسافات الإقليدية بين الخلايا. باستخدام قيم السجل هنا ، نضمن أن تعريفنا الكمي لعدم التجانس متسق طوال التحليل بأكمله.

يعد حساب التباين حسب الجين أمرًا بسيطًا ولكن اختيار الميزة يتطلب نمذجة علاقة التباين المتوسط. كما تمت مناقشته بإيجاز في القسم 7.5.1 ، لا يحقق التحول اللوغاريتمي استقرارًا مثاليًا للتباين ، مما يعني أن تباين الجين مدفوع بوفرة أكثر من عدم تجانسه البيولوجي الأساسي. لحساب هذا التأثير ، نستخدم وظيفة modelGeneVar () لتلائم اتجاهًا مع التباين فيما يتعلق بالوفرة عبر جميع الجينات (الشكل 8.1).

الشكل 8.1: التباين في مجموعة بيانات PBMC كدالة للمتوسط. تمثل كل نقطة جينًا بينما يمثل الخط الأزرق الاتجاه المناسب لجميع الجينات.

في أي وفرة معينة ، نفترض أن ملفات تعريف التعبير لمعظم الجينات تهيمن عليها ضوضاء تقنية عشوائية (انظر القسم 8.2.3 للحصول على التفاصيل). في ظل هذا الافتراض ، يمثل اتجاهنا تقديرًا للضوضاء الفنية كدالة للوفرة. ثم نقوم بعد ذلك بتقسيم التباين الكلي لكل جين إلى مكون تقني ، أي القيمة الملائمة للاتجاه عند وفرة هذا الجين والمكون البيولوجي ، المحدد على أنه الفرق بين التباين الكلي والمكون التقني. يمثل هذا المكون البيولوجي التباين "المثير للاهتمام" لكل جين ويمكن استخدامه كمقياس لاختيار HVG.

(سيلاحظ القراء الحريصون أن بعض الجينات تحتوي على مكونات بيولوجية سلبية ، والتي ليس لها تفسير واضح ويمكن تجاهلها في معظم التطبيقات. إنها حتمية عند ملاءمة اتجاه للتباينات لكل جين حيث أن نصف الجينات تقريبًا سيكون أقل من الاتجاه .)

يحتوي اتجاه الاتجاه على العديد من المعلمات المفيدة (انظر؟ fitTrendVar) التي يمكن ضبطها للحصول على ملاءمة أكثر. على سبيل المثال ، يمكن أن تسفر القيم الافتراضية في بعض الأحيان عن اتجاه مفرط عندما تكون الجينات القليلة الوفرة عالية أيضًا متغيرة بدرجة كبيرة. في مثل هذه الحالات ، يمكن للمستخدمين تقليل مساهمة تلك الجينات عالية الوفرة عن طريق إيقاف تشغيل أوزان الكثافة ، كما هو موضح في الشكل 8.2 مع متبرع واحد من Segerstolpe et al. (2016) مجموعة البيانات.

الشكل 8.2: التباين في مجموعة بيانات البنكرياس Segerstolpe كدالة للمتوسط. تمثل كل نقطة جينًا بينما تمثل الخطوط الاتجاه المناسب لجميع الجينات ذات المعلمات الافتراضية (الأزرق) أو بدون أوزان (أحمر).

8.2.2 معامل الاختلاف

يستخدم نهج بديل للتقدير الكمي معامل التباين التربيعي (CV 2) لقيم التعبير المقيسة قبل تحويل السجل. CV 2 هو مقياس مستخدم على نطاق واسع لوصف التباين في البيانات غير السالبة ويرتبط ارتباطًا وثيقًا بمعامل التشتت للتوزيع ذي الحدين السالب في الحزم مثل حافة و تصميم 2. نحسب السيرة الذاتية 2 لكل جين في مجموعة بيانات PBMC باستخدام وظيفة modelGeneCV2 () ، والتي توفر تنفيذًا قويًا للنهج الموصوف بواسطة Brennecke et al. (2013).

هذا يسمح لنا بنمذجة علاقة التباين المتوسط ​​عند النظر في أهمية كل جين (الشكل 8.3). مرة أخرى ، افتراضنا هو أن معظم الجينات تحتوي على ضوضاء عشوائية وأن الاتجاه يلتقط في الغالب التباين التقني. من المحتمل أن تمثل قيم CV 2 الكبيرة التي تنحرف بشدة عن الاتجاه الجينات المتأثرة بالبنية البيولوجية.

الشكل 8.3: CV 2 في مجموعة بيانات PBMC كدالة للمتوسط. تمثل كل نقطة جينًا بينما يمثل الخط الأزرق الاتجاه المناسب.

لكل جين ، نحدد الانحراف عن الاتجاه من حيث نسبة السيرة الذاتية 2 إلى القيمة الملائمة للاتجاه عند وفرة. هذا أكثر ملاءمة من الطرح المباشر للاتجاه من السيرة الذاتية 2 ، حيث لا يتأثر حجم النسبة بالمتوسط.

يعتبر كل من السيرة الذاتية 2 والتباين في أعداد السجلات مقاييس فعالة لقياس التباين في التعبير الجيني. تميل السيرة الذاتية 2 إلى إعطاء مرتبة أعلى لمركبات HVGs منخفضة الوفرة مدفوعة بالتنظيم في مجموعات سكانية فرعية نادرة ، حيث تكون الزيادة في التباين على النطاق الخام أقوى من تلك الموجودة على مقياس اللوغاريتمات. ومع ذلك ، فإن التباين الموصوف في السيرة الذاتية 2 أقل ارتباطًا بشكل مباشر بالإجراءات النهائية التي تعمل على حسابات السجل ، ويمكن أن يؤدي الاعتماد على النسبة إلى تعيين مرتبة عالية للجينات غير المهمة ذات التباين المطلق المنخفض. نحن نفضل استخدام تباين حسابات السجل وسنستخدمه في الأقسام التالية على الرغم من أن العديد من نفس المبادئ تنطبق على الإجراءات القائمة على السيرة الذاتية 2.

8.2.3 قياس الضوضاء الفنية

بالمعنى الدقيق للكلمة ، فإن استخدام اتجاه ملائم للجينات الذاتية يفترض أن ملامح التعبير لمعظم الجينات تهيمن عليها ضوضاء تقنية عشوائية. من الناحية العملية ، ستظهر جميع الجينات المعبر عنها مستوى غير صفري من التباين البيولوجي بسبب أحداث مثل الانفجار النسخي. يشير هذا إلى احتمال تضخم تقديراتنا للمكون الفني. سيكون من الأنسب اعتبار هذه التقديرات على أنها ضوضاء تقنية بالإضافة إلى تباين بيولوجي "غير مثير للاهتمام" ، على افتراض أن معظم الجينات لا تتأثر بالتغايرية ذات الصلة في السكان.

هذا الافتراض المنقح معقول بشكل عام ولكنه قد يكون مشكلة في بعض السيناريوهات حيث يتأثر العديد من الجينات عند وفرة معينة بعملية بيولوجية. على سبيل المثال ، قد يؤدي التنظيم القوي للجينات الخاصة بنوع الخلية إلى إثراء HVGs عند الوفرة العالية. هذا من شأنه أن يضخم الاتجاه المناسب في فترة الوفرة هذه ويقوض اكتشاف الجينات ذات الصلة. يمكننا تجنب هذه المشكلة عن طريق ملاءمة اتجاه يعتمد على المتوسط ​​مع تباين النصوص المتصاعدة (الشكل 8.4) ، إذا كانت متوفرة. الفرضية هنا هي أن الارتفاعات لا يجب أن تتأثر بالتنوع البيولوجي ، لذلك يجب أن تمثل القيمة الملائمة لاتجاه الارتفاع المفاجئ تقديرًا أفضل للمكون الفني لكل جين.

الشكل 8.4: التباين في مجموعة البيانات 416B كدالة للمتوسط. تمثل كل نقطة نسخة من الجين (أسود) أو نسخة متدرجة (حمراء) ويمثل الخط الأزرق الاتجاه المناسب لجميع الارتفاعات.

في حالة عدم وجود بيانات متداخلة ، يمكن للمرء محاولة إنشاء اتجاه من خلال وضع بعض الافتراضات التوزيعية حول الضوضاء. على سبيل المثال ، تظهر أعداد UMI عادةً تباينًا قريبًا من Poisson إذا نظرنا فقط إلى الضوضاء الفنية من إعداد المكتبة وتسلسلها. يمكن استخدام هذا لتكوين اتجاه متوسط ​​التباين في أعداد السجلات (الشكل 8.5) باستخدام دالة modelGeneVarByPoisson (). لاحظ البقايا المتزايدة للجينات عالية الوفرة ، والتي يمكن تفسيرها على أنها مقدار التباين البيولوجي الذي يُفترض أنه "غير مثير للاهتمام" عند ملاءمة الاتجاه المعتمد على الجينات في الشكل 8.1.

الشكل 8.5: تباين قيم تعبير السجل المعياري لكل جين في مجموعة بيانات PBMC ، المرسومة مقابل متوسط ​​تعبير السجل. يمثل الخط الأزرق علاقة متوسط ​​التباين المقابلة لضوضاء بواسون.

ومن المثير للاهتمام ، أن الاتجاهات التي تعتمد فقط على الضوضاء التقنية تميل إلى إنتاج مكونات بيولوجية كبيرة للجينات عالية التعبير. يتضمن هذا غالبًا ما يسمى ترميز جينات "حفظ المنزل" للمكونات الخلوية الأساسية مثل بروتينات الريبوسوم ، والتي تعتبر غير مهمة لوصف عدم التجانس الخلوي. تشير هذه الملاحظات إلى أن نموذج الضوضاء الأكثر دقة لا يؤدي بالضرورة إلى ترتيب أفضل لـ HVGs ، على الرغم من أنه يجب على المرء أن يبقي عقله متفتحًا - جينات التدبير المنزلي تعمل بانتظام في مجموعة متنوعة من الظروف (Glare et al. 2002 Nazari و Parham و Maleki 2015 Guimaraes and Zavolan 2016) ، وحقيقة أن لديهم مكونات بيولوجية كبيرة تشير إلى وجود تباين قوي عبر الخلايا قد لا يكون غير ذي صلة تمامًا.

8.2.4 المحاسبة عن عوامل الحجب

8.2.4.1 الاتجاهات الملائمة للكتلة

غالبًا ما تظهر البيانات التي تحتوي على دفعات متعددة تأثيرات الدُفعات (انظر الفصل 28.8 لمزيد من التفاصيل). نحن عادة لا نهتم بالمركبات الهاي في جي التي تحركها التأثيرات المجمعة. بدلاً من ذلك ، نريد التركيز على الجينات شديدة التباين داخل كل دفعة. يتم تحقيق ذلك بشكل طبيعي عن طريق إجراء ملاءمة الاتجاه وتحلل التباين بشكل منفصل لكل دفعة. نوضح هذا النهج من خلال معالجة كل لوحة (كتلة) في مجموعة البيانات 416B كدفعة مختلفة ، باستخدام وظيفة modelGeneVarWithSpikes (). (تتوفر نفس الوسيطة في جميع وظائف نمذجة التباين الأخرى.)

يعد استخدام ملاءمة الاتجاه الخاصة بالدُفعة مفيدًا حيث أنه يستوعب الاختلافات في اتجاهات متوسط ​​التباين بين الدُفعات. هذا مهم بشكل خاص إذا أظهرت الدُفعات اختلافات فنية منهجية ، على سبيل المثال ، الاختلافات في التغطية أو في مقدار الزيادة في الحمض النووي الريبي المضافة. في هذه الحالة ، لا توجد سوى اختلافات طفيفة بين الاتجاهات في الشكل 8.6 ، مما يشير إلى أن التجربة تم تكرارها بإحكام عبر اللوحات. ينتج عن تحليل كل لوحة تقديرات للمكونات البيولوجية والتقنية لكل جين ، والتي يتم حساب متوسطها عبر اللوحات للاستفادة من المعلومات من دفعات متعددة.

الشكل 8.6: التباين في مجموعة البيانات 416B كدالة للمتوسط ​​بعد الحجب على لوحة الأصل. تمثل كل مؤامرة نتائج لوحة واحدة ، وتمثل كل نقطة جينًا (أسود) أو نصًا متصاعدًا (أحمر) ويمثل الخط الأزرق الاتجاه المناسب لجميع الارتفاعات.

كجانب جانبي ، فإن الشكل الشبيه بالموجة الذي لوحظ أعلاه هو نموذجي لاتجاه التباين المتوسط ​​لقيم التعبير اللوغاريتمي. (نفس الموجة موجودة ولكن أقل وضوحًا لبيانات UMI.) لوحظت زيادة خطية في التباين مع زيادة المتوسط ​​من الصفر ، حيث من الواضح أن الفروق الأكبر ممكنة عندما لا تكون الأعداد كلها مساوية للصفر. في المقابل ، تقل المساهمة النسبية لضوضاء العينات عند الوفرة العالية ، مما يؤدي إلى اتجاه تنازلي. تمثل الذروة النقطة التي عندها يلغي هذين التأثيرين المتنافسين بعضهما البعض.

8.2.4.2 استخدام مصفوفة التصميم

يعد استخدام الاتجاهات الخاصة بالكتلة هو النهج الموصى به للتجارب باستخدام عامل حظر واحد. ومع ذلك ، هذا ليس عمليًا للدراسات التي تنطوي على عدد كبير من عوامل الحجب و / أو المتغيرات المشتركة. في مثل هذه الحالات ، يمكننا استخدام التصميم = الحجة لتحديد مصفوفة تصميم مع عوامل اختلاف غير مهمة. نوضح مرة أخرى بمجموعة البيانات 416B ، التي تحجب على لوحة المنشأ وتحريض الجين الورمي. (تتوفر نفس الوسيطة في modelGeneVar () عندما لا تتوفر spike-ins.)

هذه الإستراتيجية بسيطة ولكنها غير دقيقة إلى حد ما لأنها لا تأخذ في الاعتبار التعبير المتوسط ​​في كل مستوى من مستويات الحظر. تذكر أن المكون الفني يقدر على أنه القيمة الملائمة للاتجاه بمتوسط ​​الوفرة لكل جين. ومع ذلك ، فإن المكون الفني الحقيقي هو متوسط ​​القيم المجهزة في متوسط ​​كل كتلة ، والذي قد يكون مختلفًا تمامًا بالنسبة لتأثيرات الدُفعات القوية وعلاقات التباين غير الخطية. يعتبر أسلوب block = أكثر أمانًا ويجب تفضيله في جميع المواقف التي يكون فيها قابلاً للتطبيق.


12.3 تعيين تسميات الخلايا من مجموعات الجينات

تتمثل الإستراتيجية ذات الصلة في تحديد مجموعات الجينات الواسمة التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في كل خلية على حدة. لا يتطلب هذا مطابقة الخلايا الفردية لقيم تعبير مجموعة البيانات المرجعية ، والتي تكون أسرع وأكثر ملاءمة عندما تتوفر فقط هويات العلامات. نوضح هذا النهج باستخدام علامات نوع الخلية العصبية المستمدة من Zeisel et al. (2015) دراسة.

ستكون مجموعة بيانات الاختبار الخاصة بنا تجربة أخرى لـ scRNA-seq في الدماغ من Tasic et al. (2016).

نحن نستخدم ال AUCell حزمة لتحديد مجموعات العلامات التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في كل خلية. تصنف هذه الطريقة الجينات حسب قيم تعبيرها داخل كل خلية وتبني منحنى استجابة لعدد الجينات من كل مجموعة علامات موجودة بترتيب متزايد. ثم يحسب المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) لكل مجموعة علامات ، ويحدد مدى إثراء تلك العلامات من بين الجينات الأكثر تعبيرًا في تلك الخلية. يشبه هذا تقريبًا إجراء اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون بين الجينات داخل وخارج المجموعة ، ولكنه يتضمن فقط الجينات ذات الترتيب الأعلى عن طريق التعبير في كل خلية.

نقوم بتعيين هوية نوع الخلية لكل خلية في مجموعة بيانات الاختبار عن طريق أخذ مجموعة العلامة مع أعلى AUC كتسمية لتلك الخلية. تتوافق ملصقاتنا الجديدة في الغالب مع التعليق التوضيحي الأصلي من Tasic et al. (2016) ، وهو أمر مشجع. الاستثناء الوحيد ينطوي على خطأ في تعيين سلائف قليلة التغصن للخلايا النجمية ، وهو ما قد يكون مفهومًا نظرًا لأنها مشتقة من سلالة مشتركة.في حالة عدم وجود تعليق توضيحي سابق ، فإن الفحص التشخيصي الأكثر عمومية هو مقارنة التسميات المعينة بهويات الكتلة ، مع توقع أن يكون لمعظم الخلايا في مجموعة واحدة نفس التسمية (أو ، في حالة وجود تسميات متعددة ، يجب أن تكون على الأقل تمثل حالات الخلية وثيقة الصلة).

كإجراء تشخيصي ، نقوم بفحص توزيع AUCs عبر الخلايا لكل تسمية (الشكل 12.4). في المجموعات السكانية غير المتجانسة ، يجب أن يكون التوزيع لكل ملصق ثنائي النسق مع ذروة واحدة عالية الدرجات تحتوي على خلايا من هذا النوع من الخلايا وذروة منخفضة الدرجات تحتوي على خلايا من أنواع أخرى. يمكن استخدام الفجوة بين هاتين القمتين لاشتقاق عتبة لما إذا كانت التسمية "نشطة" لخلية معينة. (في هذه الحالة ، نأخذ ببساطة أعلى تصنيف فردي لكل خلية حيث يجب أن تكون الملصقات متنافية.) في المجموعات السكانية التي يُتوقع فيها نوع خلية معين ، قد يشير عدم وجود ثنائية واضحة للتسمية المقابلة إلى أن مجموعة الجينات الخاصة بها هي ليست مفيدة بما فيه الكفاية.

الشكل 12.4: توزيع AUCs في مجموعة بيانات الدماغ Tasic لكل تسمية في مجموعة بيانات Zeisel. يمثل المنحنى الأزرق تقدير الكثافة ، ويمثل المنحنى الأحمر مزيجًا مركبًا مكونًا من عنصرين من الأعراف ، ويمثل المنحنى الوردي مزيجًا من ثلاثة مكونات ، ويمثل المنحنى الرمادي توزيعًا طبيعيًا مناسبًا. تمثل الخطوط الرأسية تقديرات العتبة المقابلة لكل تقدير للتوزيع.

تفسير AUCell تكون النتائج أكثر وضوحًا عندما تكون مجموعات العلامات متنافية ، كما هو موضح أعلاه لعلامات نوع الخلية. في تطبيقات أخرى ، قد يفكر المرء في حساب AUCs لمجموعات الجينات المرتبطة بالإشارات أو المسارات الأيضية. من المحتمل أن تكون المسارات المتعددة نشطة في أي خلية معينة ، ومن المغري استخدام AUCs لتحديد هذا النشاط كمياً للمقارنة عبر الخلايا. ومع ذلك ، يجب تفسير مثل هذه المقارنات بحذر شديد لأن AUCs هي قيم تنافسية - أي زيادة في نشاط مسار واحد ستقلل بشكل طبيعي AUCs لجميع المسارات الأخرى ، مما قد يؤدي إلى اختلافات زائفة بين السكان.

كما ذكرنا سابقًا ، فإن ميزة AUCell النهج هو أنه لا يتطلب قيم تعبير مرجعي. هذا مفيد بشكل خاص عند التعامل مع مجموعات الجينات المشتقة من الأدبيات أو الأشكال النوعية الأخرى للمعرفة البيولوجية. على سبيل المثال ، قد نستخدم بدلاً من ذلك التوقيعات أحادية الخلية المحددة من MSigDB ، والتي تم الحصول عليها كما هو موضح أدناه.

الجانب الآخر هو أن المعلومات المتعلقة بالتعبير النسبي تُفقد عند استخدام هويات العلامة فقط. من الصعب التنبؤ بالتأثير الصافي لتجاهل قيم التعبير ، على سبيل المثال ، قد يؤدي ذلك إلى تقليل الأداء لحل أنواع الخلايا الأكثر دقة ، ولكنه قد يؤدي أيضًا إلى تحسين الأداء إذا كان التعبير لكل خلية صاخبًا جدًا بحيث لا يكون مفيدًا. يعتمد الأداء أيضًا بشكل كبير على مجموعات الجينات نفسها ، والتي قد لا يتم تعريفها في نفس السياق الذي تستخدم فيه. على سبيل المثال ، يعد تطبيق جميع توقيعات MSigDB على مجموعة بيانات Muraro أمرًا مخيبًا للآمال إلى حد ما (الشكل 12.5) ، بينما يعد التقييد على مجموعة فرعية من توقيعات البنكرياس واعدًا أكثر.

الشكل 12.5: الخرائط الحرارية لعدد سجل الخلايا مع كل مجموعة من الملصقات المعروفة (الأعمدة) وتوقيعات MSigDB المعينة (الصفوف) في مجموعة بيانات Muraro. تم تعريف التوقيع المعين لكل خلية على أنه مع أعلى AUC عبر جميع (أعلى) أو جميع التوقيعات المتعلقة بالبنكرياس (أسفل).


مناقشة

المطلب الرئيسي لتصور الخلايا المفردة ذات التركيزات المرتفعة لجزيء صغير مهم هو توافر مناسبة في الجسم الحي أنظمة استشعار ذات حساسية وخصوصية كافية. هناك عدد كبير من الخيارات لتطوير مراسلين مخصصين يستشعرون المستقلبات داخل الخلايا. وهي تستند إلى التعرف الجزيئي الطبيعي ، والتبديل الخيفي ، وسلوك تنظيم الجينات للبروتينات والحمض النووي الريبي. لكل نظام مزايا وعيوب خاصة به ، ويتم إحالة القارئ إلى المراجعات الحديثة حول الأفكار العديدة والتطورات الجارية في هذا المجال [12 ، 28-33]. في حين أن مستشعرات البروتين القائمة على بروتينات الربط المحيطة بالبروتينات ونقل طاقة الرنين Förster (FRET) تتيح من حيث المبدأ تحديد التركيز في الوقت الفعلي ، فإن استخدام TFs يعتمد على التعبير عن الجين المراسل. هذا التأخير بين الارتباط بالرابط وتغير النمط الظاهري المقابل ليس عيبًا في تطوير أو توصيف الخلايا المؤتلفة حيث يتم البحث عن أنماط وراثية مستقرة مشفرة وراثيًا. فيما يتعلق باستخدام TFs في استشعار الأيض لأغراض الفحص ، يعتمد العمل الحالي على LysR لـ C. الجلوتاميك هو المثال الأول حيث يتم إعطاء استجابة المخرجات الضوئية لتركيز المستقلب داخل الخلايا الموجود ، وحيث يتم استخدام مستشعر قائم على TF في شاشة HT تطبق FACS لعزل منتجي الجزيئات الصغيرة البكتيرية الجديدة.

يتم استنتاج استجابة TFs التي تم تمييزها سابقًا من الإضافة الخارجية لجزيء المستجيب واستجابة الثقافة الكاملة. على الرغم من أن هذا قد يكون ذا أهمية محدودة فقط للفحص ، إلا أنه غير مناسب للتوصيف الدقيق لأن العمليات المختلفة مثل الامتصاص النشط والتصدير النشط وانتشار وتدهور المستجيب قد يؤدي إلى تركيز عصاري خلوي مختلف عن ذلك الموجود خارج الخلية. في حالة pSenLys المستندة إلى LysG ، حددنا نطاق اكتشاف يتراوح من 4 إلى 25 ملي مولار داخل الخلايا L-lysine. تتميز استجابة المستشعر باستجابة تشبه التناظرية والتي ، عند تركيبها على معادلة هيل ، يتم وصفها بواسطة نتطبيق من 3.19 ± 1.45. إنه يمكّن من التمييز بين WT وخلايا الإنتاج المتوسطة والعالية المستوى (الجدول S2 في ملف إضافي 1). حسب قراراتنا داخل الخلايا ومقارنة السلالات المتجانسة بنسخة واحدة ونسختين من ليز قد يتم توسيع النطاق الفعال للكشف عن طريق تغيير نشاط التصدير. قد يكون هذا مهمًا لمزيد من التحسين للمنتجين الجيدين. تعتمد استجابة المستشعر وفائدته على التفاعل بين تركيز العصارة الخلوية للجزيء الصغير ونشاط التصدير ، وكذلك على تقارب المستشعر مع المستجيب وموقع المروج المستهدف.

ثلاثة من مستشعرات الجزيئات الصغيرة الموصوفة في العمل الحالي تستند إلى LysR من نوع TF ، وواحد على نوع ROK TF. لحسن الحظ ، فإن نطاق الجزيئات الصغيرة التي يمكن اكتشافها بواسطة TFs كبير. بكتريا قولونية لديها أكثر من 230 TFs ، والعديد منها يكتشف الجزيئات الصغيرة. في البكتيريا ، تم العثور على TFs لاستشعار السكريات ، وفوسفات السكر ، والفيتامينات ، 2-oxoacids ، والأيونات ، والمضادات الحيوية ، ومشتقات أسيل CoA [9]. علاوة على ذلك ، يمكن إنشاء الصناديق ذات الخصائص الجديدة [11]. مثال على ذلك هو AraC ، الذي تم تحويله من مستشعر L- أرابينوز طبيعي إلى مستشعر يكتشف D-arabinose [34] أو ميفالونات [10] ، وقد تم استخدام خصوصية المستجيب الأخير في اختبار قائم على اللوحة للفحص من أجل تحسين منتجي الميفالونات. تم تطوير المستشعرات الأخرى التي أعطيت خصائص جديدة من NahR أو XylR للكشف عن المركبات المرتبطة بحمض البنزويك [35] ، أو TetR للمشتقات الهيكلية للتتراسيكلين [36]. تمت مؤخرًا مراجعة التقدم في تصميم المراسلين الجزيئيين المعتمدين على الميكروبات وتخصيص الاعتماد على الترابط المشتق من الصناديق الطبيعية [12]. وبالتالي ، فإن أجهزة الاستشعار الخاصة بعدد كبير من الجزيئات الصغيرة ذات الأهمية التكنولوجية الحيوية أو الصيدلانية في متناول اليد.

في حين أن وزن C. الجلوتاميك لا يفرز L-lysine ، واستشعار العصارة الخلوية و FACS كشاشة فعالة تمكن من العزل السريع لـ 185 طفرة جديدة تتراكم L-lysine في طاف الثقافة. يبلغ العدد الحالي للجينات التي تسبب الطفرات فيها زيادة في تخليق L-lysine حوالي 12 [37 ، 38]. تعمل هذه الطفرات على زيادة التدفق من خلال مسار L-lysine نفسه ، أو لزيادة تجمع البيروفات والأكسالو أسيتات ، أو إمداد NADPH. ومع ذلك ، لا تزال هناك طفرات غير معروفة يجب اكتشافها ، حيث أنه من المعروف أنه في طفرات L-lysine التي تم تطويرها على مدى عقود في الفحوصات الكلاسيكية ، تظهر العديد من جينات مسارات التخليق الحيوي تعبيرًا متزايدًا [39] ، وفي L- مشتق بشكل مشابه منتج الأرجينين ، جينات التخليق الحيوي للأرجينين يتم التعبير عنها بشكل كبير بطريقة لا يمكن تحقيقها عن طريق التعبير المشفر بالبلازميد [40]. قدم نهجنا أليلات من الجينات المعروفة ، وهذا مفيد جدًا لإعادة البناء الجيني للمنتجين حيث يتم الجمع بين الطفرات المفيدة ، وقد تؤدي الأليلات إلى إنتاجية مختلفة [2 ، 41]. عدد 268 تعدد الأشكال الموجود في K051 أكبر من أن يدرس تأثيرها الفردي على تكوين المنتج ، ولكن قد يتم تقديم إمكانيات جديدة عند توفر المزيد من تسلسلات الجينوم. كان الضرب مور طفرة موجودة في K051. نقترح أن النشاط التحفيزي لـ UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: ligase meso-diaminopimelate في MurE-G81E يتم تقليله ، ونتيجة لذلك يتوفر المزيد من D ، L-diaminopimelate لتخليق L- ليسين. مور من C. الجلوتاميك يشبه MurE of السل الفطري و بكتريا قولونية، التراكيب البلورية المعروفة [42]. من هذه ، يمكن استنتاج أن G81E قريب من جزء النيوكليوزيد من UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu ، و L121F في المسوخ الثاني المحدد قريب من موقع ربط ATP. وبالتالي ، فإن النشاط المنخفض يكون ذا مغزى ، ويتماشى مع زيادة تكوين L-lysine الذي تم الحصول عليه مع جميع السلالات عند مور تم إدخال الطفرات في جينوماتهم. كما أنه يتماشى مع معدلات النمو المنخفضة لهذه المواد المؤتلفة الجديدة (الجدول S5 في ملف إضافي 1) ، حيث يتم توجيه أقل D ، L-diaminopimelate نحو تخليق جدار الخلية. بديل لتأثيرات توازن الكتلة البسيطة هو أن الافتقار إلى اللبنات الأساسية لجدار الخلية يبدأ استجابة عالمية لها تأثير إيجابي على التخليق الحيوي.

طبقنا أحد مستشعرات النسخ الخاصة بنا لفحص HT لمكتبة متحولة بها طفرات صبغية ، ولكن يمكن أيضًا استكشاف نفس المبدأ لفحص HT للخلايا التي تحمل مكتبات البلازميد. هذا أمر جذاب ، نظرًا لأن العديد من المستحضرات الصيدلانية التي يتم إنتاجها حاليًا من الناحية الميكروبية ، مثل amorpha-4،11-diene و taxadiene و lycopene ، تستخدم مسارات التخليق الحيوي المشفر بالبلازميد ، على سبيل المثال ، في بكتريا قولونية [2 ، 3 ، 13]. قد يؤدي استخدام جهاز استشعار مناسب جنبًا إلى جنب مع الفرز بمساعدة نظام مراقبة الأصول الميدانية إلى تسريع تطوير منتجي هذه الجزيئات الصغيرة بشكل كبير أيضًا. يسد روتين اختيار HT لعزل الطفرات الفجوة بين توليد HT للمكتبات الطافرة وتقنيات تسلسل HT ، وتجري تطبيقات أخرى لاستشعار الجزيئات الصغيرة في الخلايا المفردة ، مثل التحقق من تجانس مجتمع المنتج والفاصل الزمني المجهري C. الجلوتاميك في رقائق ميكروفلويديك [43].


محتويات

رابا نوي (جزيرة إيستر - تشيلي) تحرير

نشأت دراسة TOR في الستينيات من القرن الماضي من خلال رحلة استكشافية إلى جزيرة إيستر (المعروفة من قبل سكان الجزيرة باسم رابا نوي) ، بهدف تحديد المنتجات الطبيعية من النباتات والتربة ذات الإمكانات العلاجية المحتملة. في عام 1972 ، حدد Suren Sehgal جزيءًا صغيرًا من بكتيريا التربة Streptomyces hygroscopicus، تم تطهيره وذكر في البداية أنه يمتلك نشاطًا قويًا مضادًا للفطريات. أطلق عليها اسم rapamycin بشكل مناسب ، مشيرًا إلى مصدرها الأصلي ونشاطها (Sehgal et al. ، 1975). ومع ذلك ، كشفت الاختبارات المبكرة أن الراباميسين له أيضًا نشاط فعال مثبط للمناعة ومضاد للسرطان. لسوء الحظ ، لم يتلق الراباميسين اهتمامًا كبيرًا في البداية من صناعة المستحضرات الصيدلانية حتى الثمانينيات ، عندما دعم ويث آيرست جهود Sehgal لمواصلة التحقيق في تأثير الراباميسين على جهاز المناعة. وقد أدى ذلك في النهاية إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على أنها مثبط للمناعة بعد زراعة الكلى. ومع ذلك ، قبل موافقة إدارة الغذاء والدواء ، ظلت طريقة عمل الرابامايسين مجهولة تمامًا.

تحرير التاريخ اللاحق

نشأ اكتشاف TOR و mTOR من دراسات مستقلة عن المنتج الطبيعي rapamycin بواسطة جوزيف Heitman و Rao Movva و Michael N. Hall و Stuart L. Schreiber و David M. Sabatini و Robert T. Abraham. [14] [7] [8] في عام 1993 ، استنسخ جورج ليفي ومايكل إن هول بشكل مستقل الجينات التي تتوسط في سمية الراباميسين في الفطريات ، والمعروفة باسم جينات TOR / DRR. [15] [16] ومع ذلك ، لم يكن الهدف الجزيئي لمركب FKBP12-rapamycin في الثدييات معروفًا. في عام 1994 ، اكتشف ستيوارت إل.شرايبر وديفيد إم ساباتيني وروبرت تي أبراهام بشكل مستقل بروتينًا يتفاعل بشكل مباشر مع FKBP12-rapamycin ، والذي أصبح يُعرف باسم mTOR نظرًا لتماثله مع جينات الخميرة TOR / DRR. [6] [7] [8]

يوقف Rapamycin النشاط الفطري في المرحلة G1 من دورة الخلية. في الثدييات ، يثبط الجهاز المناعي عن طريق منع انتقال الطور G1 إلى S في الخلايا اللمفاوية التائية. [17] وبالتالي ، يتم استخدامه كمثبط للمناعة بعد زراعة الأعضاء. [18] تجدد الاهتمام بالراباميسين بعد اكتشاف المنتج الطبيعي المثبط للمناعة المرتبط بهيكلية FK506 في عام 1987. في 1989-90 ، تم تحديد FK506 وراباميسين لتثبيط مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ومسارات مستقبل IL-2 ، على التوالي . [19] [20] تم استخدام المنتجين الطبيعيين لاكتشاف البروتينات المرتبطة بـ FK506 و rapamycin ، بما في ذلك FKBP12 ، ولتقديم دليل على أن FKBP12 – FK506 و FKBP12 – rapamycin قد يعملان من خلال آليات اكتساب الوظيفة التي تستهدف الوظائف الخلوية. تضمنت هذه التحقيقات دراسات رئيسية قام بها فرانسيس دومون ونولان سيغال في شركة ميرك ، والتي ساهمت في إظهار أن FK506 ورابامايسين يتصرفان كمضاد متبادل. [21] [22] أشارت هذه الدراسات إلى تورط FKBP12 كهدف محتمل للراباميسين ، لكنها اقترحت أن المركب قد يتفاعل مع عنصر آخر من السلسلة الميكانيكية. [23] [24]

في عام 1991 ، تم تحديد الكالسينورين كهدف لـ FKBP12-FK506. [25] أن FKBP12-rapamycin ظل غامضًا إلى أن أثبتت الدراسات الجينية والجزيئية في الخميرة أن FKBP12 هو هدف الراباميسين ، وأوضحت TOR1 و TOR2 كأهداف لـ FKBP12-rapamycin في عامي 1991 و 1993 ، [14] [26] تليها في عام 1994 عندما اكتشفت عدة مجموعات ، تعمل بشكل مستقل ، أن إنزيم mTOR kinase كهدف مباشر له في أنسجة الثدييات. [6] [7] [18] كشف تحليل تسلسل mTOR أنه مقوم مباشر للبروتينات المشفرة بواسطة الخميرة هدف الراباميسين 1 و 2 (TOR1 و TOR2) الجينات ، التي حددها جوزيف هيتمان وراو موففا ومايكل إن هول في أغسطس 1991 ومايو 1993. بشكل مستقل ، أبلغ جورج ليفي وزملاؤه في وقت لاحق عن نفس الجينات ، التي أطلقوا عليها مقاومة رابامايسين المهيمنة 1 و 2 (DRR1 و DRR2)، في دراسات نشرت في أكتوبر 1993.

البروتين ، المسمى الآن mTOR ، تم تسميته في الأصل FRAP بواسطة Stuart L. Schreiber و RAFT1 بواسطة David M. Sabatini [6] [7] FRAP1 تم استخدامه كرمز جيني رسمي في البشر. بسبب هذه الأسماء المختلفة ، mTOR ، التي استخدمها لأول مرة روبرت تي أبراهام ، [6] تم تبنيها بشكل متزايد من قبل مجتمع العلماء الذين يعملون على مسار mTOR للإشارة إلى البروتين وتكريمًا للاكتشاف الأصلي لـ TOR بروتين في الخميرة تم تسميته TOR ، هدف Rapamycin ، بواسطة Joe Heitman و Rao Movva و Mike Hall. تم اكتشاف TOR في الأصل في Biozentrum و Sandoz Pharmaceuticals في عام 1991 في بازل بسويسرا ، ويشيد اسم TOR أيضًا بهذا الاكتشاف ، حيث أن TOR تعني المدخل أو البوابة باللغة الألمانية ، وكانت مدينة بازل ذات يوم محاطة بجدار يتخللها بوابات المدينة ، بما في ذلك Spalentor الشهير. [27] تعني كلمة "mTOR" في البداية "هدف حيوان ثديي للراباميسين" ، ولكن تم تغيير معنى "m" لاحقًا إلى "ميكانيكي". [28] وبالمثل ، مع الاكتشافات اللاحقة ، تم تسمية سمكة الحمار الوحشي TOR باسم zTOR ، وسميت Arabidopsis thaliana TOR باسم AtTOR ، وتم تسمية Drosophila TOR باسم dTOR. في عام 2009 ، تم تغيير اسم الجين FRAP1 رسميًا من قبل لجنة HUGO Gene Nomenclature (HGNC) إلى mTOR ، والتي تعني الهدف الميكانيكي للراباميسين. [29]

فتح اكتشاف TOR والتعريف اللاحق لـ mTOR الباب أمام الدراسة الجزيئية والفسيولوجية لما يسمى الآن مسار mTOR وكان له تأثير محفز على نمو مجال البيولوجيا الكيميائية ، حيث تُستخدم الجزيئات الصغيرة كمساسات لـ مادة الاحياء.

يدمج mTOR المدخلات من المسارات الأولية ، بما في ذلك الأنسولين وعوامل النمو (مثل IGF-1 و IGF-2) والأحماض الأمينية. [11] يستشعر mTOR أيضًا العناصر الغذائية الخلوية والأكسجين ومستويات الطاقة. [30] مسار mTOR هو منظم مركزي لعملية التمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء في الثدييات ، مع أدوار مهمة في وظيفة الأنسجة بما في ذلك الكبد والعضلات والأنسجة الدهنية البيضاء والبنية ، [31] والدماغ ، وهو غير منظم في الأمراض التي تصيب الإنسان ، مثل مثل مرض السكري والسمنة والاكتئاب وأنواع معينة من السرطان. [32] [33] يثبط الراباميسين mTOR عن طريق الارتباط بمستقبله داخل الخلايا FKBP12. [34] [35] يرتبط مركب FKBP12-rapamycin مباشرة بمجال ربط FKBP12-Rapamycin (FRB) لـ mTOR ، مما يثبط نشاطه. [35]

mTOR هي الوحدة التحفيزية لمجمعين متميزين هيكليًا: mTORC1 و mTORC2. [36] كلا المجمعين يتوضعان في مقصورات خلوية مختلفة ، مما يؤثر على تنشيطهما ووظيفتهما. [37] عند التنشيط بواسطة Rheb ، يتم توطين mTORC1 في مركب Ragulator-Rag على سطح الليزوزوم حيث يصبح نشطًا في وجود ما يكفي من الأحماض الأمينية. [38] [39]

تحرير mTORC1

يتكون مركب mTOR 1 (mTORC1) من mTOR ، وبروتين مرتبط بالتنظيم من mTOR (Raptor) ، وقاتل للثدييات مع بروتين SEC13 8 (mLST8) والمكونات غير الأساسية PRAS40 و DEPTOR. [40] [41] يعمل هذا المركب كمستشعر للمواد الغذائية / الطاقة / الأكسدة والاختزال ويتحكم في تخليق البروتين. [11] [40] يتم تنظيم نشاط mTORC1 بواسطة الرابامايسين ، والأنسولين ، وعوامل النمو ، وحمض الفوسفاتيدك ، وبعض الأحماض الأمينية ومشتقاتها (على سبيل المثال ، L -leucine و β-hydroxy β-methylbutyric acid) ، والمنبهات الميكانيكية ، والأكسدة ضغط عصبى. [40] [42] [43]

تحرير mTORC2

يتكون مركب mTOR 2 (mTORC2) من MTOR ، رفيق غير حساس للراباميسين من MTOR (RICTOR) ، MLST8 ، وبروتين كيناز المتفاعل 1 (mSIN1) في الثدييات. [44] [45] ثبت أن mTORC2 يعمل كمنظم مهم للهيكل الخلوي للأكتين من خلال تحفيز ألياف الإجهاد F-actin ، paxillin ، RhoA ، Rac1 ، Cdc42 ، وبروتين كيناز C α (PKCα). [45] mTORC2 أيضًا فسفوريلات سيرين / ثريونين بروتين كيناز Akt / PKB على بقايا سيرين Ser473 ، مما يؤثر على عملية التمثيل الغذائي والبقاء على قيد الحياة. [46] الفسفرة لبقايا سيرين Akt Ser473 بواسطة mTORC2 تحفز فسفرة Akt على بقايا ثريونين Thr308 بواسطة PDK1 وتؤدي إلى تنشيط Akt الكامل.[47] [48] بالإضافة إلى ذلك ، يُظهر mTORC2 نشاط كيناز بروتين التيروزين وفوسفوريلات عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGF-IR) ومستقبل الأنسولين (InsR) على بقايا التيروزين Tyr1131 / 1136 و Tyr1146 / 1151 ، على التوالي ، مما يؤدي إلى التنشيط الكامل لـ IGF-IR و InsR. [12]

تثبيط بواسطة Rapamycin Edit

يثبط Rapamycin mTORC1 ، ويبدو أن هذا يوفر معظم التأثيرات المفيدة للدواء (بما في ذلك تمديد مدى الحياة في الدراسات التي أجريت على الحيوانات). يحتوي Rapamycin على تأثير أكثر تعقيدًا على mTORC2 ، حيث يمنعه فقط في أنواع معينة من الخلايا تحت التعرض لفترة طويلة. ينتج عن اضطراب mTORC2 أعراض شبيهة بمرض السكري تتمثل في انخفاض تحمل الجلوكوز وعدم الحساسية تجاه الأنسولين. [49]

يكون مسار إشارات mTORC2 أقل تحديدًا من مسار إشارات mTORC1. تمت دراسة وظائف مكونات معقدات mTORC باستخدام الضربات القاضية والضربة القاضية ووجد أنها تنتج الأنماط الظاهرية التالية:

    : ضربة قاضية خفضت نشاط mTORC2 الذي يشار إليه عن طريق الفسفرة المنخفضة لركائز mTORC2. [50]: الإفراط في التعبير يؤدي إلى ورم خبيث وضربة قاضية تمنع عامل النمو الناجم عن الفسفرة PKC. [51] يؤدي الحذف التأسيسي لـ Rictor في الفئران إلى الموت الجنيني ، [52] بينما يؤدي حذف الأنسجة المحددة إلى مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية ، وهو نمط ظاهري شائع لحذف Rictor في الكبد والأنسجة الدهنية البيضاء وخلايا بيتا البنكرياسية وهو عدم تحمل الجلوكوز الجهازي والأنسولين المقاومة في واحد أو أكثر من الأنسجة. [49] [53] [54] [55] انخفاض تعبير Rictor في الفئران يقلل من عمر الذكور ، ولكن ليس الإناث. [56]
  • mTOR: تثبيط mTORC1 و mTORC2 بواسطة PP242 [2- (4-Amino-1-isopropyl-1H-pyrazolo [3،4-d] pyrimidin-3-yl) -1H-indol-5-ol] يؤدي إلى البلعمة الذاتية أو يمنع تثبيط موت الخلايا المبرمج لـ mTORC2 وحده بواسطة PP242 فسفرة موقع Ser-473 على AKT ويوقف الخلايا في المرحلة G1 من دورة الخلية. [57] التقليل الجيني لتعبير mTOR في الفئران يزيد بشكل كبير من العمر الافتراضي. [58]: الضربة القاضية هي أليل ضئيل الشكل مميت ينتج عنه حجم عضو أصغر وحجم الكائن الحي ولكن تنشيط AKT طبيعي. [59]: الفئران المصابة بالضربة القاضية تعاني من موت الخلايا المبرمج التلقائي (AKT1) ، والسكري الشديد (AKT2) ، والأدمغة الصغيرة (AKT3) ، ونقص النمو (AKT1 / AKT2). [60] زاد عمر الفئران المتغايرة الزيجوت لـ AKT1. [61]
  • TOR1 ، و S. cerevisiae تقويم العظام لـ mTORC1 ، هو منظم لكل من استقلاب الكربون والنيتروجين سلالات TOR1 KO تنظم الاستجابة للنيتروجين بالإضافة إلى توافر الكربون ، مما يشير إلى أنه محول غذائي رئيسي في الخميرة. [62] [63]

الشيخوخة تحرير

تم العثور على انخفاض نشاط TOR لزيادة العمر الافتراضي في S. cerevisiae, ايليجانس ، و D. melanogaster. [64] [65] [66] [67] تم التأكد من أن مثبط mTOR rapamycin يزيد عمر الفئران. [68] [69] [70] [71] [72]

من المفترض أن بعض الأنظمة الغذائية ، مثل تقييد السعرات الحرارية وتقييد الميثيونين ، تسبب إطالة العمر عن طريق تقليل نشاط mTOR. [64] [65] اقترحت بعض الدراسات أن إشارات mTOR قد تزداد أثناء الشيخوخة ، على الأقل في أنسجة معينة مثل الأنسجة الدهنية ، وقد يعمل الراباميسين جزئيًا عن طريق منع هذه الزيادة. [73] النظرية البديلة هي أن إشارات mTOR هي مثال على تعدد الأشكال العدائي ، وبينما تكون إشارات mTOR العالية جيدة خلال الحياة المبكرة ، إلا أنها يتم الحفاظ عليها عند مستوى عالٍ بشكل غير لائق في الشيخوخة. قد يعمل تقييد السعرات الحرارية وتقييد الميثيونين جزئيًا عن طريق الحد من مستويات الأحماض الأمينية الأساسية بما في ذلك الليوسين والميثيونين ، وهما من المنشطات القوية لـ mTOR. [74] تبين أن إعطاء الليوسين في دماغ الفئران يقلل من تناول الطعام ووزن الجسم عن طريق تنشيط مسار mTOR في منطقة ما تحت المهاد. [75]

وفقًا لنظرية الجذور الحرة للشيخوخة ، [76] تسبب أنواع الأكسجين التفاعلية ضررًا لبروتينات الميتوكوندريا وتقلل من إنتاج ATP. بعد ذلك ، عبر AMPK الحساس لـ ATP ، يتم تثبيط مسار mTOR ويتم تقليل تخليق البروتين الذي يستهلك ATP ، حيث يبدأ mTORC1 سلسلة الفسفرة التي تنشط الريبوسوم. [17] وبالتالي ، يتم تحسين نسبة البروتينات التالفة. علاوة على ذلك ، فإن اضطراب mTORC1 يثبط بشكل مباشر تنفس الميتوكوندريا. [77] يتم إبطال ردود الفعل الإيجابية على عملية الشيخوخة من خلال آليات الحماية: انخفاض نشاط mTOR (من بين عوامل أخرى) ينظم إزالة المكونات الخلوية المختلة عن طريق الالتهام الذاتي. [76]

mTOR هو البادئ الرئيسي للنمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP). [78] تم العثور على إنترلوكين 1 ألفا (IL1A) على سطح الخلايا الشائخة حيث يساهم في إنتاج عوامل SASP بسبب حلقة التغذية الراجعة الإيجابية مع NF-B. [79] [80] تعتمد ترجمة mRNA لـ IL1A بشكل كبير على نشاط mTOR. [81] يزيد نشاط mTOR من مستويات IL1A ، بوساطة MAPKAPK2. [79] يمنع تثبيط mTOR لـ ZFP36L1 هذا البروتين من تحطيم نصوص العديد من مكونات عوامل SASP. [82]

تحرير السرطان

يساهم التنشيط المفرط لإشارات mTOR بشكل كبير في بدء الأورام وتطورها ، وقد وجد أن نشاط mTOR غير منظم في العديد من أنواع السرطان بما في ذلك سرطان الثدي والبروستاتا والرئة وسرطان الجلد والمثانة والدماغ وسرطان الكلى. [83] أسباب التنشيط التأسيسي عديدة. من بين الطفرات الأكثر شيوعًا في مثبط الورم PTEN الجين. يؤثر PTEN phosphatase سلبًا على إشارة mTOR من خلال التداخل مع تأثير PI3K ، أحد المستجيبين المنبعين لـ mTOR. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحرير نشاط mTOR في العديد من أنواع السرطان نتيجة لزيادة نشاط PI3K أو Akt. [84] وبالمثل ، فإن الإفراط في التعبير عن مؤثرات mTOR النهائية 4E-BP1 و S6K و eIF4E يؤدي إلى سوء تشخيص السرطان. [85] أيضًا ، الطفرات في بروتينات TSC التي تثبط نشاط mTOR قد تؤدي إلى حالة تسمى معقد التصلب الجلدي ، والتي تظهر على شكل آفات حميدة وتزيد من خطر الإصابة بسرطان الخلايا الكلوية. [86]

تبين أن زيادة نشاط mTOR يؤدي إلى تقدم دورة الخلية وزيادة تكاثر الخلايا بشكل رئيسي بفضل تأثيره على تخليق البروتين. علاوة على ذلك ، يدعم mTOR النشط نمو الورم أيضًا بشكل غير مباشر عن طريق تثبيط الالتهام الذاتي. [87] وظائف mTOR المنشطة بشكل أساسي في إمداد خلايا السرطان بالأكسجين والمواد المغذية عن طريق زيادة ترجمة HIF1A ودعم تكوين الأوعية. [88] يساعد mTOR أيضًا في تكيف استقلابي آخر للخلايا السرطانية لدعم معدل نموها المتزايد - تنشيط التمثيل الغذائي للجلوكوز. Akt2 ، وهو ركيزة mTOR ، وتحديداً من mTORC2 ، ينظم التعبير عن إنزيم حال السكر PKM2 مما يساهم في تأثير واربورغ. [89]

اضطرابات الجهاز العصبي المركزي / تحرير وظائف الدماغ

تحرير التوحد

يتورط mTOR في فشل آلية "التقليم" للمشابك الاستثارة في اضطرابات طيف التوحد. [90]

تعديل مرض الزهايمر

تتقاطع إشارات mTOR مع أمراض مرض الزهايمر (AD) في عدة جوانب ، مما يشير إلى دورها المحتمل كمساهم في تطور المرض. بشكل عام ، تظهر النتائج أن mTOR يشير إلى فرط النشاط في أدمغة الزهايمر. على سبيل المثال ، تكشف دراسات ما بعد الوفاة لدماغ الإنسان عن خلل في التنظيم في PTEN و Akt و S6K و mTOR. [91] [92] [93] يبدو أن إشارات mTOR مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بوجود الأميلويد بيتا القابل للذوبان (Aβ) وبروتينات تاو ، والتي تتجمع وتشكل سمتين مميزتين للمرض ، لويحات Aβ والتشابك الليفي العصبي ، على التوالي. [94] أظهرت الدراسات في المختبر أن Aβ منشط لمسار PI3K / AKT ، والذي بدوره ينشط mTOR. [95] بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي تطبيق Aβ على خلايا N2K إلى زيادة التعبير عن p70S6K ، وهو الهدف النهائي لـ mTOR المعروف أن له تعبيرًا أعلى في الخلايا العصبية التي تطور التشابك الليفي العصبي في النهاية. [96] [97] تُظهر خلايا مبيض الهامستر الصيني المنقولة بطفرة 7PA2 العائلية نشاط mTOR أيضًا مقارنةً بالضوابط ، ويتم حظر النشاط المفرط باستخدام مثبط إفراز جاما. [98] [99] تشير هذه الدراسات في المختبر إلى أن زيادة تركيزات Aβ تزيد من إشارات mTOR ومع ذلك ، يُعتقد أن تركيزات Aβ الكبيرة السامة للخلايا تقلل إشارات mTOR. [100]

تمشيا مع البيانات التي لوحظت في المختبر ، تبين أن نشاط mTOR و p70S6K المنشط قد زاد بشكل كبير في القشرة والحصين من النماذج الحيوانية للإصابة بمرض الزهايمر مقارنة بالضوابط. [99] [101] الإزالة الدوائية أو الجينية لـ Aβ في النماذج الحيوانية لمرض الزهايمر يقضي على الاضطراب في نشاط mTOR الطبيعي ، مشيرًا إلى المشاركة المباشرة لـ Aβ في إشارات mTOR. [101] بالإضافة إلى ذلك ، عن طريق حقن أوليغومرات Aβ في حصين الفئران العادية ، لوحظ فرط نشاط mTOR. [101] يبدو أن الخلل الإدراكي المميز لمرض الزهايمر يتم توسطه عن طريق الفسفرة لـ PRAS-40 ، والتي تنفصل عن وتسمح بفرط mTOR عندما يتم فسفرته مما يمنع الفسفرة PRAS-40 من فرط نشاط mTOR الناجم عن Aβ. [101] [102] [103] بالنظر إلى هذه النتائج ، يبدو أن مسار إشارات mTOR هو إحدى آليات السمية التي يسببها Aβ في ميلادي.

يعد فرط الفسفرة لبروتينات تاو في التشابك الليفي العصبي أحد السمات المميزة لمرض الزهايمر. لقد ثبت أن تنشيط p70S6K يعزز تكوين التشابك وكذلك فرط نشاط mTOR من خلال زيادة الفسفرة وتقليل إزالة الفسفرة. [96] [104] [105] [106] كما تم اقتراح أن mTOR يساهم في أمراض تاو عن طريق زيادة ترجمة تاو والبروتينات الأخرى. [107]

اللدونة المشبكية هي مساهم رئيسي في التعلم والذاكرة ، وهما عمليتان تتعرضان لضعف شديد في مرضى الزهايمر. ثبت أن التحكم التحويلي ، أو الحفاظ على توازن البروتين ، ضروري لللدونة العصبية ويتم تنظيمه بواسطة mTOR. [99] [108] [109] [110] [111] يبدو أن كلاً من البروتين الزائد أو الناقص عن طريق نشاط mTOR يساهم في ضعف التعلم والذاكرة. علاوة على ذلك ، نظرًا لأن العجز الناتج عن فرط نشاط mTOR يمكن تخفيفه من خلال العلاج بالراباميسين ، فمن الممكن أن يلعب mTOR دورًا مهمًا في التأثير على الأداء الإدراكي من خلال اللدونة المتشابكة. [95] [112] المزيد من الأدلة على نشاط mTOR في التنكس العصبي يأتي من النتائج الحديثة التي تثبت أن eIF2α-P ، وهو هدف أولي لمسار mTOR ، يتوسط موت الخلايا في أمراض البريون من خلال التثبيط الانتقالي المستمر. [113]

تشير بعض الأدلة إلى دور mTOR في تقليل تطهير Aβ أيضًا. mTOR هو منظم سلبي للالتهام الذاتي [114] لذلك ، يجب أن يقلل النشاط المفرط في إشارات mTOR تخليص Aβ في الدماغ AD. قد تكون الاضطرابات في الالتهام الذاتي مصدرًا محتملاً للإمراض في أمراض اختلال البروتين ، بما في ذلك مرض الزهايمر. [115] [116] [117] [118] [119] [120] أظهرت الدراسات التي أجريت باستخدام نماذج الفئران لمرض هنتنغتون أن العلاج بالراباميسين يسهل إزالة تكتلات هنتنغتين. [121] [122] ربما تكون المعاملة نفسها مفيدة في إزالة رواسب Aβ أيضًا.

تخليق البروتين وتحرير نمو الخلايا

تنشيط mTORC1 مطلوب لتخليق بروتين العضلات الليفي العضلي وتضخم العضلات الهيكلية لدى البشر استجابة لكل من التمارين البدنية وابتلاع بعض الأحماض الأمينية أو مشتقات الأحماض الأمينية. [123] [124] التعطيل المستمر لإشارات mTORC1 في العضلات الهيكلية يسهل فقدان كتلة العضلات وقوتها أثناء هزال العضلات في الشيخوخة ، ودنف السرطان ، وضمور العضلات بسبب الخمول البدني. [123] [124] [125] يبدو أن تنشيط mTORC2 يتوسط في نمو العصبونات في الخلايا العصبية المتمايزة للفأر. [126] التنشيط المتقطع لـ mTOR في الخلايا العصبية قبل الجبهية بواسطة β-hydroxy β-methylbutyrate يمنع التدهور المعرفي المرتبط بالعمر المرتبط بالتشذيب الشجيري في الحيوانات ، وهي ظاهرة لوحظت أيضًا عند البشر. [127]

يثبط الضرر الليزوزومي mTOR ويحث على تحرير الالتهام الذاتي

يتم وضع mTORC1 النشط على الجسيمات الحالة. يتم تثبيط mTOR [129] عندما يتلف الغشاء الليزوزومي بواسطة عوامل خارجية أو داخلية مختلفة ، مثل البكتيريا الغازية ، والمواد الكيميائية النفاذة الغشائية التي تنتج منتجات نشطة تناضحيًا (يمكن تصميم هذا النوع من الإصابة باستخدام سلائف ثنائية الببتيد غشائية دائمة تتبلمر في الجسيمات الحالة) ، مجاميع بروتين الأميلويد (انظر القسم أعلاه حول مرض الزهايمر) والمحتويات العضوية أو غير العضوية السيتوبلازمية بما في ذلك بلورات اليورات والسيليكا البلورية. [129] تتم عملية تعطيل mTOR بعد الليزوزومات / الغشاء الداخلي بواسطة مركب البروتين المسمى GALTOR. [129] في قلب جالتور [129] يوجد galectin-8 ، وهو عضو في عائلة β-galactoside فائقة الارتباط من الليكتين العصاري الخلوي يطلق عليه galectins ، والذي يتعرف على تلف الغشاء الليزوزومي عن طريق الارتباط بالجليكان المكشوف على الجانب اللمعي من الغشاء الداخلي المحدد. بعد تلف الغشاء ، لم يعد galectin-8 ، الذي يرتبط عادةً بـ mTOR في ظل ظروف التماثل الساكن ، يتفاعل مع mTOR ولكنه الآن يرتبط الآن بـ SLC38A9 و RRAGA / RRAGB و LAMTOR1 ، مما يثبط وظيفة تبادل النوكليوتيدات الجوانين في Ragulator (LAMTOR1-5 )- [ 129]

TOR هو منظم سلبي للالتهام الذاتي بشكل عام ، وأفضل دراسة له أثناء الاستجابة للجوع ، [130] [131] [132] [133] [134] وهي استجابة أيضية. أثناء التلف الليزوزومي ، يعمل تثبيط mTOR على تنشيط استجابة الالتهام الذاتي في وظيفة مراقبة الجودة ، مما يؤدي إلى العملية المسماة lysophagy [135] التي تزيل الجسيمات الحالة التالفة. في هذه المرحلة ، يتفاعل جالكتين آخر ، galectin-3 ، مع TRIM16 لتوجيه الالتهام الذاتي الانتقائي للجسيمات الحالة التالفة. [136] [137] يجمع TRIM16 ULK1 والمكونات الرئيسية (Beclin 1 و ATG16L1) من المجمعات الأخرى (Beclin 1-VPS34-ATG14 و ATG16L1-ATG5-ATG12) لبدء الالتهام الذاتي ، [137] العديد منها تحت سيطرة سلبية من mTOR بشكل مباشر مثل مجمع ULK1-ATG13 ، [132] [133] [134] أو بشكل غير مباشر ، مثل مكونات الفئة III PI3K (Beclin 1 و ATG14 و VPS34) نظرًا لأنها تعتمد على تنشيط الفسفرة بواسطة ULK1 عندما لا يتم تثبيطها بواسطة mTOR. ترتبط مكونات قيادة الالتهام الذاتي هذه جسديًا ووظيفيًا مع بعضها البعض وتدمج جميع العمليات اللازمة لتشكيل البلعمة الذاتية: (1) يرتبط مجمع ULK1-ATG13-FIP200 / RB1CC1 بآلة اقتران LC3B / GABARAP من خلال التفاعلات المباشرة بين FIP200 / RB1CC1 و ATG16L1 ، [138] [139] [140] (ii) شركاء مجمع ULK1-ATG13-FIP200 / RB1CC1 مع Beclin 1-VPS34-ATG14 عبر التفاعلات المباشرة بين مجال ATG13's HORMA و ATG14 ، [141] (3) يتفاعل ATG16L1 مع WIPI2 ، والذي يرتبط بـ PI3P ، المنتج الأنزيمي من الفئة III PI3K Beclin 1-VPS34-ATG14. [142] وهكذا ، بدأ تعطيل mTOR من خلال GALTOR [129] عند تلف الجسيمات ، بالإضافة إلى التنشيط المتزامن عبر galectin-9 (الذي يتعرف أيضًا على خرق الغشاء الليزوزومي) لـ AMPK [129] الذي يؤدي مباشرة إلى الفسفرة وتنشيط المكونات الرئيسية (ULK1 ، [ 143] Beclin 1 [144]) من أنظمة الالتهام الذاتي المذكورة أعلاه ويثبط نشاط mTORC1 ، [145] [146] يسمح بتحريض الالتهام الذاتي القوي وإزالة البلعمة الذاتية للجسيمات التالفة.

بالإضافة إلى ذلك ، هناك عدة أنواع من أحداث التواجد في كل مكان موازية للعمليات التي يحركها الجلكتين وتكملها: يؤدي استخدام TRIM16-ULK1-Beclin-1 إلى تثبيت هذه المجمعات لتعزيز تنشيط الالتهام الذاتي كما هو موضح أعلاه. [137] ATG16L1 له ألفة ارتباط جوهرية مع يوبيكويتين [140]) في حين أن التواجد بواسطة ليغاز ubiquitin الخاص بـ FBXO27 الممنوح لبروتين سكري يحتوي على العديد من بروتينات الغشاء الليزوزومي المعرضة للتلف مثل LAMP1 و LAMP2 و GNS / N-aclosuc قد يساهم sulfatase و TSPAN6 / tetraspanin-6 و PSAP / prosaposin و TMEM192 / بروتين الغشاء 192 [147] في تنفيذ lysophagy عبر مستقبلات البلعمة الذاتية مثل p62 / SQSTM1 ، والتي يتم تجنيدها أثناء lysophagy ، [140] أو غير ذلك وظائف محددة.

تحرير تصلب الجلد

تصلب الجلد ، المعروف أيضًا باسم التصلب الجهازي ، هو مرض مناعي ذاتي جهازي مزمن يتميز بالتصلب (صلبة) من الجلد (ديرما) الذي يصيب الأعضاء الداخلية في أشكالها الأكثر حدة. [148] [149] يلعب mTOR دورًا في الأمراض التليفية والمناعة الذاتية ، كما أن حصار مسار mTORC قيد التحقيق كعلاج لتصلب الجلد. [9]

تحرير الزرع

مثبطات mTOR ، على سبيل المثال الراباميسين ، يستخدم بالفعل لمنع رفض الزرع.

تعديل مرض تخزين الجليكوجين

ذكرت بعض المقالات أن الرابامايسين يمكن أن يثبط mTORC1 بحيث يمكن زيادة فسفرة GS (غليكوجين سينثيز) في العضلات الهيكلية. يمثل هذا الاكتشاف نهجًا علاجيًا جديدًا محتملاً لمرض تخزين الجليكوجين الذي ينطوي على تراكم الجليكوجين في العضلات.

تحرير مكافحة السرطان

هناك نوعان من مثبطات mTOR الأساسية المستخدمة في علاج السرطانات البشرية ، تيمسيروليموس وإيفيروليموس. وجدت مثبطات mTOR استخدامها في علاج مجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة ، بما في ذلك سرطان الخلايا الكلوية (تيمسيروليموس) وسرطان البنكرياس وسرطان الثدي وسرطان الخلايا الكلوية (إيفروليموس). [150] الآلية الكاملة لهذه العوامل غير واضحة ، ولكن يُعتقد أنها تعمل عن طريق إعاقة تكوين الأوعية الورمية والتسبب في إعاقة انتقال G1 / S. [151]

تحرير مكافحة الشيخوخة

قد تكون مثبطات mTOR مفيدة في علاج / منع العديد من الحالات المرتبطة بالعمر ، [152] بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون. [153] بعد العلاج قصير الأمد بمثبطات dactolisib و everolimus ، لدى كبار السن (65 عامًا وما فوق) ، كان لدى الأشخاص الذين عولجوا عدد أقل من العدوى على مدار عام. [154]

تم الإبلاغ عن العديد من المركبات الطبيعية ، بما في ذلك epigallocatechin gallate (EGCG) ، والكافيين ، والكركمين ، والبربارين ، والكيرسيتين ، والريسفيراترول ، و pterostilbene ، لتثبيط mTOR عند تطبيقها على الخلايا المعزولة في الثقافة. [155] [156] [157] حتى الآن لا يوجد دليل عالي الجودة على أن هذه المواد تمنع إشارات mTOR أو تطيل العمر الافتراضي عند تناولها كمكملات غذائية من قبل البشر ، على الرغم من النتائج المشجعة في الحيوانات مثل ذباب الفاكهة والفئران. تجارب مختلفة جارية. [158] [159]


أساليب

المواد النباتية والظاهرية

لإعادة تسلسل الجينوم ، استخدمنا 510 مدخلات من الحنطة السوداء الطرطرية تتكون من 32 مدخلات برية ، و 478 سلالة محلية ، و 7 أخرى فاجوبيروم أنواع الجنس (F. esculentum, F. leptopodum, F. qiangcai, F. pugense, F. روبيفوليوم, F. gracilipedoides, F. caudatum) كمجموعة خارجية ، والتي تم الحصول عليها من مقتنيات البنك الوطني للمحاصيل الجينية في الصين (NCGC) ومجموعات مجموعات أبحاث الحنطة السوداء في جميع أنحاء العالم. تأتي هذه المدخلات بشكل أساسي من 20 مقاطعة في الصين وكذلك من كوريا الجنوبية واليابان وروسيا وبولندا والولايات المتحدة الأمريكية ونيبال وبوتان والهند وسلوفينيا وفرنسا وبلجيكا ، وتغطي معظم المناطق التي تُزرع فيها الحنطة السوداء الطرطرية حاليًا (ملف إضافي 2 : الجدول S1).

بالنسبة إلى التنميط الظاهري ، تم زراعة ما مجموعه 480 من مدخلات الحنطة السوداء الطرطرية في Liangshan (مقاطعة Sichuan ، 27 ° 59 ′ N ، 102 ° 50 ′ E) و Zhaotong (مقاطعة يونان ، 28 ° 36 ′ شمالًا ، 103 ° 49 شرقًا) في عام 2017 وزُرعت جميع البذور يدويًا في ثلاث مكررات في 12 نيسان / أبريل ، وحصدت البذور في منتصف شهر تموز / يوليو. تم استخدام ثلاث نباتات فردية من كل سلالة في كل تكرار لقياس ارتفاع النبات (PH). تم تحديد فترة النمو بأكملها (GP) على أنها أيام النمو من البذر إلى النضج. تم حصاد البذور الناضجة من ستة نباتات مختارة لقياسات وزن 1000 حبة (GW) ، محصول الحبوب لكل نبات (GYPP) ، طول البذور (SLE) ، عرض البذور (SWD) درجة دائرية (SCD) ، جناح البذور (SCD) SWI) ولون القشرة (PC) وقطر البذور (SD).

قياس محتوى الفلافونويد

تم سحق البذور وترشيحها بواسطة منخل 40 شبكة بعد تجفيفها مسبقًا عند 105 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وحفظها عند 65 درجة مئوية بوزن ثابت. تم استخراج العينات (0.2 جم) بالموجات فوق الصوتية في 20 مل ميثانول 80٪ عند 50 درجة مئوية و 40 كيلو هرتز لمدة 25 دقيقة. تم بعد ذلك ترشيح المحلول من خلال مرشح عضوي دقيق مسام 0.22 ميكرومتر وتحليله بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء (HPLC ، سلسلة Agilent G6500 HPLC-QTOF). تم تشغيل عمود RP18 (2.1 مم × 75 مم × 2.7 ميكرومتر) عند 40 درجة مئوية. تتكون المرحلة المتحركة من خليط من (أ) ماء / حمض الفورميك (99.9 / 0.1 ، حجم / حجم) و (ب) ميثانول / حمض الفورميك (99.9 / 0.1 ، حجم / حجم). تم تعيين برنامج التدرج على النحو التالي: 0-13 دقيقة ، 20٪ (ب) 13-13.5 دقيقة ، ارتفع تدريجيًا إلى 50٪ (ب) 13.5-17 دقيقة ، وانخفض تدريجيًا إلى 20٪ (ب) 17-18 دقيقة ، احتفظ 20٪ (ب) و 18.1 دقيقة ، توقف. محتويات روتين (RC) ، كيرسيتين (QC) ، و kaempferol-3-ا-روتينوسيد (KC) تم حسابها من خلال مقارنة منطقة ذروة HPLC مع المعايير المعتمدة (Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء ثلاث مكررات لكل عينة.

استخراج الحمض النووي وتسلسله

تم استخلاص الحمض النووي الجيني من الأوراق الصغيرة باستخدام طريقة سيتيل ترايميثيل أمونيوم بروميد (CTAB). تم استخدام ما لا يقل عن 1 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني لكل سلالة لإنشاء مكتبة تسلسل وفقًا للتعليمات المقدمة من البائع (Illumina). تم ترتيب مكتبات التسلسل ذات النهاية المزدوجة بحجم إدراج يبلغ حوالي 350 نقطة أساس على منصة Illumina NovaSeq 6000 في Berry Genomics. تم استخدام Trimmomatic v0.33 لتقليم Illumina fastq وإزالة المحولات استنادًا إلى تسلسل محول الشركة المصنعة. تمت معالجة البيانات الأولية بتنسيق fastq من خلال نصوص بيرل الداخلية. في هذه الخطوة ، تم الحصول على بيانات نظيفة عن طريق إزالة القراءات التي تحتوي على المحول ، والقراءات التي تحتوي على poly-N ، والقراءات منخفضة الجودة من البيانات الأولية.

اقرأ المحاذاة والاتصال البديل

تم تعيين جميع القراءات المتسلسلة لكل مُدخل إلى جينوم التجميع [11] (http://www.mbkbase.org/Pinku1/) باستخدام برنامج Burrows-Wheeler Aligner [39] (BWA 0.7.5a) مع المعلمات الافتراضية. قمنا بفرز المحاذاة وفقًا لتعيين الإحداثيات في samtools [40 ، 41] (0.1.19). بعد إزالة القراءات بجودة تعيين منخفضة (MQ & lt 30) ، تم استخدام كل من القراءات الموصوفة ذات النهاية المزدوجة والطرف الواحد لاكتشاف SNP عبر مجموعة عينات كاملة من مدخلات الحنطة السوداء باستخدام مجموعة أدوات GATK [42] (الإصدار 3.4-46-gbc02625 ). قراءات بمتوسط ​​عمق 12 × تقريبًا لكل فرد و GT تم الاحتفاظ بمعدل رسم خرائط بنسبة 70 ٪ لجينوم الحنطة السوداء لاستدعاء SNP. تم استدعاء SNPs و indels الصغيرة (1–50 bp) باستخدام وحدة GATK UnifiedGenotyper للنسخ الثنائية مع -stand_call_conf 50-stand_emit_conf 10-dcov 1000 لاستدعاء المتغيرات. قمنا بتصفية المتغيرات لكل من السكان والفرد باستخدام GATK وفقًا لمعايير التصفية الصارمة. بالنسبة إلى SNPs لمرشح السكان: (أ) QUAL & gt 30.0 (b) QD & gt 5.0 (c) FS & lt 60.0 (d) MQ0 ≥ 4 & amp & amp ((MQ0 / (1.0 * DP)) & gt 0.1) (e) DP & gt 5 . نحن نعمل على كائن غير نموذجي ولا توجد بيانات SNP متاحة ، لذلك باتباع البرنامج التعليمي لأفضل ممارسات GATK ، اخترنا طريقة التصفية الصعبة بدلاً من طريقة إعادة المعايرة المتغيرة (VQSR) لتصفية مجموعة استدعاء المتغيرات (https: //gatk.broadinstitute .org / hc / en-us / articles / 360036434492-VariantFiltration). وفقًا لمجموعة أدوات GATK ، إذا كان هناك أكثر من 3 SNPs مجمعة في نافذة 10 نقاط أساس ، فقد تم اعتبار جميع أشكال SNP الثلاثة كإيجابيات كاذبة وتمت إزالتها وفقًا لمجموعة أدوات GATK. تم تعيين جميع أشكال SNPs و indels إلى مناطق جينومية وجينات معينة باستخدام ANNOVAR [43] استنادًا إلى التعليقات التوضيحية لجينوم الحنطة السوداء. للتأكد من أن SNPs التي تم استدعاؤها من بيانات إعادة تسلسل الجينوم بالكامل معقولة ، تم تطبيق طيف تردد الموقع (SFS) [44] مع مجموعة النداء على مستوى السكان بناءً على MAF & gt 0.05 والمعدل المفقود & lt 0.1.

التحقق من SNP

تم اختيار ما مجموعه 510 SNPs بشكل عشوائي واكتشافها عن طريق التسلسل المستند إلى PCR في 10 مدخلات من الحنطة السوداء الطرطرية ، باستخدام التسلسل المستند إلى PCR في أكثر من 3 مكررات (ملف إضافي 2: الجدول S4). قمنا بمحاذاة جميع منتجات PCR مع الجينوم المرجعي مع برنامج DNAMAN.

تحليلات التطور والتركيب السكاني

أزلنا جميع SNPs بتردد أليل ثانوي ≤ 0.05 ومعدل مفقود و GT 10٪ في جميع المدخلات. تم استخدام مجموعة فرعية من 1،094،031 SNPs لتحليل النشوء والتطور السكاني. تم تحويل ملفات Vcf إلى تنسيق hapmap بنصوص بيرل مخصصة وملف تنسيق PLINK بواسطة PLINK v1.90 (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/). تحت نموذج مسافات p مع التمهيد (100) ، تم إنشاء شجرة ربط مجاورة لجميع العينات باستخدام TreeBest 1.9.2 [45]. تم استخدام SNPRelate [46] (1.18.1) لإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) ، أولاً عن طريق إنشاء مصفوفة العلاقة الجينية التي تم استخلاص النواقل الثلاثة الأولى منها. تم استخدام fastStructure [47] (الإصدار 1.0) لاستنتاج بنية السكان من مجموعات بيانات النمط الجيني SNP الكبيرة. ك تم تعيين القيم من ك = 3 إلى ك = 5. لكل منهما ك تم الحصول على القيمة ، كعدد مفترض للمجموعات من 1 إلى 10 ، من خلال خمسة أشواط مستقلة ببذور بداية مختلفة. تم ضبط طول فترة الاحتراق وعدد مرات تكرار MCMC بعد الاحتراق على 50،000 و 100،000 على التوالي. العدد الأمثل للمجموعات الفرعية (ك) بناءً على احتمالية تسجيل البيانات (lnP (ك)) وإحصائية مخصصة Δك طريقة. لتأكيد نتيجة الهيكل بشكل أكبر ، تم استخدام التحليل المميز للمكونات الرئيسية (DAPC) لتجميع الأنماط الجينية بشكل مستقل عن تعيين النمط الفرداني المسبق باستخدام حزمة R adegenet v. 1.4.2 [48].

تحديد عمليات المسح الانتقائي

لاكتشاف عمليات المسح الانتقائي ، تم إجراء اختبار نسبة الاحتمالية المركبة عبر السكان XP-CLR v1.0 [49]. قارنا HR مع SL و HR مع مجموعة NL في نوافذ منزلقة 200 كيلو بايت بحجم خطوة 100 كيلو بايت. تم اعتبار أعلى قيم XP-CLR ، التي تمثل 5 ٪ من الجينوم ، كمناطق مختارة. تم تجميع النوافذ المجاورة ذات XP-CLR العالي في منطقة واحدة لتمثيل تأثير المسح الانتقائي الفردي. بالإضافة إلى XP-CLR ، تم إجراء نهج مركب غير مرتبط للإشارات المتعددة (DCMS) [50] ومقارنة التنوع الجيني (πبري/ πسلالة) لتحديد عمليات المسح الانتقائية باستخدام نفس النافذة المنزلقة 200-100 كيلو بايت.

تحديد التمايز الجينومي

مستوى التمايز الجيني (Fشارع) بين السكان على فترات 200 كيلو بايت باستخدام PopGenome [51]. لاكتشاف المناطق المتمايزة ، المتوسط Fشارع تمت مقارنة جميع النوافذ المنزلقة عبر المجموعة II و NM.

GWAS وتحديد الجينات المرشحة

تم استخدام SNPs مع MAF ≥ 0.05 والمعدل المفقود 0.1 لـ GWAS ، مما أدى إلى 844،290 و 885،276 و 1،094،031 SNPs لـ SL و NL وجميع السكان (SL و NL و HW) ، على التوالي. تم إجراء تحليل الارتباط باستخدام برنامج eXpedited Association ذو النموذج المختلط الفعال (EMMAx) [52] والنماذج المختلطة الخطية المحولة طيفيًا (FaST-LMM) [53]. تم تقدير العدد الفعال لـ SNPs المستقلة بـ 988،845 ، وبالتالي ، تم تقدير عتبة الأهمية تقريبًا ص = 10 −6 .

وفقًا للمواقع المرتبطة التي حددتها GWAS ، تم تحديد أنواع ومواقع SNP باستخدام الجينوم المرجعي [11]. تم تحليل الجينات الإجمالية في كل منطقة مرشحة وشرحها عن طريق مقارنة متماثلة مع نبات الأرابيدوبسيس لتضييق نطاق الجينات المرشحة.

فحوصات الإنزيم

ال قدم 3 تم إدخال CDS في متجه تعبير الاندماج pMAL-C2X MBP [54] وتحويله إلى بكتريا قولونية BL21. تم استخراج بروتينات الانصهار MBP وتثبيتها على حبات الأميلوز (New England Biolabs) مع محلول استخلاص البروتين (20 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، 0.2 M NaCl ، و 1 ملي مولار EDTA). تمت التصفية من البروتين باستخدام 20 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، و 0.2 M NaCl ، و 1 ملي مول EDTA ، و 10 ملي مولت مالتوز.

تمت إضافة خليط التفاعل (الأس الهيدروجيني 8.0 ، 100 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك ، 14 ملي مولار- مركابتو إيثانول ، 9 ملي مولار UDP- جلوكوز ، و 100 ميكرو مولار كايمبفيرول) إلى 5 ميكروغرام بروتين منقى وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم إنهاء التفاعل بواسطة مجفف التجميد عند - 40 درجة مئوية. تمت إعادة إذابة منتجات التفاعل المجففة في 80٪ ميثانول ، وتم تحليل 5 ميكرولتر من المحلول بواسطة LC-MS (Agilent G6500 Series HPLC-QTOF) لتحديد المنتج باستخدام معايير kaempferol و kaempferol-3-ا-جلوكوزيد (سيجما الدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية).

الجذور المشعرة المعدلة وراثيا

ال قدم 3 تم إدخال CDS في ناقل pCAMBIA 1307 وتحويله إلى أجروباكتريوم A4 لتوليد الجذور الشعرية المعدلة وراثيًا باتباع الطرق السابقة [55،56،57]. تم قطع شتلات معقمة عمرها أسبوعين من الحنطة السوداء الطرطريّة واستُخدمت كزراعة نباتية للعدوى بجرثومة الطرطري. أجروباكتريوم لمدة 10 دقائق. بعد الثقافة المشتركة على وسط صلب MS في الظلام لمدة 48 ساعة عند 25 درجة مئوية ، تم غسل إإكسبلنتس بوسط سائل MS يحتوي على 300 مجم / مل من سيفوتاكسيم وماء معقم ، ثم تم تربيتها على وسط صلب MS يحتوي على 300 مجم / مل سيفوتاكسيم في حجرة النمو لتحريض الجذور المشعرة. تمت إزالة خطوط الجذر المشعر المفردة المستحثة من إإكسبلنتس بعد أسبوعين ووضعت على وسط صلب MS مع 100 مجم / مل سيفوتاكسيم لإزالة السموم والنمو. تم اختبار الخطوط المعدلة وراثيا إيجابيا بواسطة PCR وانتقلت إلى وسط سائل MS مع اهتزاز سيفوتاكسيم 100 مجم / مل لمدة أسبوعين في الظلام عند 22 درجة مئوية ، 160 دورة / دقيقة. ثم تم حصاد الجذور المشعرة وتجفيفها لقياس kaempferol-3.ا-روتينوسيد كما هو موضح أعلاه.

خميرة واحدة هجينة (Y1H)

ال رابطة الدول المستقلة-عناصر GCC-box (AGTGCCAAAمجلس التعاون الخليجيACACCCCT) و mGCC-box (AGTGCCAAAاجتذابACACCCCT) في ناقل pABAi كمراسلين ، على التوالي. تم تحويل المراسلين الخطيين باستخدام إنزيم التقييد BbsI وتحويلهم إلى سلالة ذهب Y1H. قدم طليعة و قدم علاء تم إدخالها في ناقل pGADT7 الذي يحتوي على مجال تنشيط نسخ GAL4 كمؤثرات ، على التوالي. تم تحويل المؤثرات إلى سلالة الذهب Y1H التي تحتوي على الجين المراسل ، على التوالي. تم طلاء المحولات على وسيط جلوكوز محدد (SD) صناعي يفتقر إلى Leu (-L) وتم اختيارها على وسط SD-L باستخدام Aureobasidin A. تم إجراء اختبار Y1H وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Matchmaker One-Hybrid System Clontech http: // www.clontech.com/).

التحليلات الكمية RT-PCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي لشتلات الحنطة السوداء التي يبلغ عمرها 7 أيام بواسطة مجموعة RNApre Pure Plant Plus Kit (DP441 ، Tiangen ، بكين ، الصين). تم إجراء النسخ العكسي باستخدام HiScript III RT SuperMix لـ qPCR (R323-01 ، Vazyme ، Nanjing ، الصين) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إجراء qRT-PCR كبروتوكول لـ ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Q711 ، Vazyme ، Nanjing ، الصين).


نماذج حيوانية لعلم الأمراض الجزيئي

4 B6 × 129 / سيفرت

تُستخدم نماذج الضربة القاضية الجينية (KO) على نطاق واسع لدراسة وظيفة الجينات ، بما في ذلك دورها في مرض الذئبة الحمراء. في تقنية KO ، عادةً ما يتم تعطيل الجين أولاً في الخلايا الجذعية الجنينية (ES) عن طريق إعادة التركيب المتماثل مما يؤدي إلى تعطيل أو إزالة جزء من الحمض النووي داخل هذا الجين. بعد ذلك ، يتم إدخال الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة وراثيًا في التجويف الداخلي للخلية الأريمية ، مما ينتج عنه أجنة كيميرية تُعاد إلى إناث الفئران. عادة ما يتم استخدام خطوط الخلايا الجذعية الجنينية من 129 سلالة وخلايا أرومية من سلالة B6 بسبب كفاءتها وموثوقيتها. وبالتالي ، فإن فئران KO التي تم إنشاؤها حديثًا تكون عادةً ذات خلفية مختلطة B6 و 129. بعد ذلك يمكن استنساخ الجين المعطل على خلفية B6 لتخفيف مساهمة الجينوم 129 ، ولكن على الأقل منطقة كبيرة تحيط بـ KO يبقى الجين من أصل 129 ، ما لم يتم اتخاذ تدابير قصوى لاختيار إعادة التركيب بين علامات مرتبطة بإحكام. 14 ومن المثير للاهتمام أن المرض الشبيه بمرض الذئبة هو أحد أكثر النتائج شيوعًا لـ KO الوراثي في ​​الفئران وتتأثر أنماط الذئبة الظاهرية لفئران KO إلى حد كبير بكمية 129 جينوم تحملها. أدى نقص C1q إلى التعبير الكامل عن مرض يشبه الذئبة في خلفية B6 × 129 ، والتي اختفت تمامًا بعد سبعة أجيال من التقاطع العكسي على B6. تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة 35،36 بشكل متقطع لـ KO الأخرى ، مثل MFG-E8 ، 37،38 مما يشير إلى أن الخلفية B6 × 129 تهيئ الفئران لتطوير SLE. حدد تحليل التهجين بين السلالات B6 و 129 عددًا من مواقع الحساسية التي ساهمت في كلتا السلالتين ، وأقوى 939-42 منها يقع على كروموسوم التيلومير 1 من سلالة 129. لذلك ، قد يكون التفاعل بين جينوم B6 و 129 مسؤولاً عن بعض سمات المناعة الذاتية التي شوهدت في نماذج KO لخلفية B6 × 129 ، وقد تم استبدال 129 خلية ES بشكل كبير بخلايا ES مشتقة من B6 لاستهداف الجينات التي يشتبه في مساهماتها في المناعة الذاتية. .


شكر وتقدير

تم الحصول على الكاشف التالي من خلال MR4 كجزء من مستودع موارد BEI ، NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة: المتصورة المنجلية سلالات 3D7 (MRA-102) المودعة بواسطة D.J. كاروتشي.

التمويل

تم دعم هذه الدراسة مالياً من قبل المعاهد الوطنية للصحة (منح R01 AI85077-01A1 و R01 AI06775-01 إلى KGLR) وجامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد (NIFA-Hatch-225935 إلى KGLR). لم يكن للجهات الممولة أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها أو في كتابة المخطوطة.

توافر البيانات والمواد

يمكن الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي MudPIT الكاملة (الملفات الأولية ، ملفات الذروة ، ملفات البحث ، وكذلك ملفات نتائج DTASelect) من قاعدة البيانات الضخمة (ftp://massive.ucsd.edu/) أو ProteomeXchange (http: // www. .proteomexchange.org /) باستخدام أرقام الانضمام MSV000079612 / PXD003866 و MSV000079613 / PXD003867 للبروتينات المرتبطة بالـ mRNA ومجموعات البيانات المرتبطة بالبروتينات المتعددة ، على التوالي ، كأسماء مستخدمين بكلمة مرور EVB12529. يمكن أيضًا الوصول إلى البيانات الأصلية التي تستند إليها هذه المخطوطة من Stowers Original Data Repository على http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1054.

مساهمات المؤلفين

صممت EMB و KGLR المشروع الذي قامت به مؤسسة الإدارة الانتخابية ، و بريطانيا العظمى ، و AS بإجراء تجارب قام بها EMB ، و AS ، و LF بإجراء تحليل بيانات JP. المتصورة المنجلية الثقافات وساعدت في الإجراءات التجريبية ، كتب EMB و KGLR أن مخطوطة KGLR كانت مسؤولة عن الاستحواذ على التمويل. كل الكتاب قراءة وافقت على المخطوط النهائي.

تضارب المصالح

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

موافقة الأخلاق والموافقة على المشاركة

الموافقة الأخلاقية لا تنطبق على هذه الدراسة.


نقاش

محو البصمة الجينومية في الخلايا الجرثومية الأولية وخلايا EG وأجنة الخلايا الجرثومية واستنساخ PGC

من المقبول على نطاق واسع أن ذكريات بصمة الجينوم تمحى في الخلايا الجرثومية الأولية وأن إزالة ميثيل الحمض النووي عامل مهم في هذه العملية (Grant et al. ، 1992 Kafri et al. ، 1992 Brandeis et al. ، 1993 Szabo and Mann ، 1995 Kato et al. ، 1999). ومع ذلك ، لا يُعرف متى تبدأ عملية المسح هذه أو كيف تتطور في الخلايا الجرثومية الأولية. في هذه الدراسة ، تعاملنا مع هذه المشكلة من خلال تحليل الأجنة المستنسخة المنتجة من اليوم 11.5 إلى اليوم 13.5 الخلايا الجرثومية الأولية. أظهرت نتائجنا أن استنساخ PGC من اليوم 12.5 إلى اليوم 13.5 أظهر الحالات الافتراضية للتعبير الجيني عند فقد البصمة الجينية ، وأكدت أن الأجنة الخالية من البصمات لا تتطور أبدًا ، كما هو موضح سابقًا بواسطة Kato et al. (كاتو وآخرون ، 1999). أظهرنا أيضًا العديد من الحالات الوسيطة لعملية المحو في اليوم 11.5 استنساخ PGC. بالاقتران مع تحليلات مثيلة الحمض النووي من 10.5 إلى 12.5 يوم من الخلايا الجرثومية الأولية نفسها ، من المحتمل جدًا أن تكون عملية المحو قد بدأت بالفعل في الخلايا الجرثومية الأولية للغدد التناسلية عند 10.5 نقطة في البوصة.

في تقرير سابق ، أظهرت PGCs المعزولة من أجنة اليوم 11.5 تعبيرًا بياليليًا لـ Igf2r, إيغف 2, H19 و Snrpn، وخلص إلى أن المحو حدث قبل وصول الخلايا الجرثومية الأولية إلى حواف الأعضاء التناسلية (Szabo and Mann ، 1995). استخدم هؤلاء المؤلفون مزيجًا من مائة خلية جرثومية أولية ، وأظهرت بياناتهم تعبيرًا متحيزًا بين الأليلات الأب والأم لـ إيغف 2 و H19. من بياناتنا ، فإن اليوم 10.5 إلى اليوم 11.5 PGCs غير متجانسة ، بناءً على حالة مثيلة الحمض النووي ، يبدو أنهم في مراحل مختلفة من عملية المحو ، ولديهم القدرة على إظهار أنماط التعبير المطبوعة التي تختلف عن بعضها البعض. لذلك ، في وقت لاحق ، يمكن تفسير نتائج هؤلاء المؤلفين على أنها توضح عملية محو البصمة في هذه الجينات.

تمكننا تقنيات الاستنساخ الجسدي وتجارب الزرع النووي من فحص الإمكانات التنموية للنواة من خلايا متبرعة واحدة وملامح التعبير الجيني لهذه الأجنة. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن استنساخ PGC تمثل خاصية نوى PGC في التطور الجنيني ، وليس تلك الخاصة بـ PGCs نفسها. لذلك ، يجب أن نكون حذرين في تفسير المعلومات من الحيوانات المستنسخة PGC من خلال مقارنة النتائج مع تلك من الخلايا الجرثومية الأولية نفسها. هناك خلاف واضح بين نتائجنا وتلك الخاصة بالتعبير عن إيغف 2 و Igf2r في الحالة الافتراضية. في استنساخ PGC ، لم تظهر هذه الجينات أي تعبير ، في حين تم الإبلاغ عن أنها أظهرت تعبيرًا بياليليًا في الخلايا الجرثومية الأولية. لا يزال سبب هذا التناقض غير معروف. ومع ذلك ، فمن المقبول أن فقدان مثيلة الحمض النووي أسكت التعبير عن كليهما إيغف 2 و Igf2r. أظهرت تقارير أخرى فقدان التعبير عن هذه الجينات في دمنت 1 الفئران التي خرجت منها الضربة القاضية (Li et al. ، 1992 Li et al. ، 1993). لقد قمنا سابقًا بتحليل ملفات تعريف التعبير الجيني في البويضات غير النامية جنبًا إلى جنب مع البويضات الكاملة النمو ، وأظهرنا أنه تم إنشاء بصمات خاصة بالأم أثناء نضج البويضات (Obata et al. ، 1998). في المفهوم غير المتنامي / المعاد تكوينه بالكامل المنتج في تجربة نقل نووي ، ربط الجينات من الأليلات غير المتنامية باستثناء إيغف 2 تم التعبير عن جينات Meg (بما في ذلك Igf2r) إلا H19 تم إسكاتهم. كما لم يكن هناك تعبير عن إيغف 2 و Igf2r في أجنة الخلايا الجرثومية المنتجة من الذكور اليوم 14.5 إلى اليوم 16.5 PGCs (Kato et al. ، 1999).تشير هذه النتائج أيضًا إلى أن هذه الجينات يتم إسكاتها في جينومات خالية من البصمات وتتوافق مع نتائجنا. وبالتالي ، من الممكن أن يكون التعبير الأساسي لهذه الجينات في اليوم 11.5 PGCs منخفضًا جدًا ، لذلك لم تظهر أي اختلافات بين الأليلات الأبوية. بدلاً من ذلك ، قد يؤدي نزع ميثيل الحمض النووي إلى إعادة تنشيط الأليلات المسكونة في الخلايا الجرثومية الأولية ، بينما تحفز هذه الحالات غير الميثيلية حالات صامتة في التطور الجنيني.

التوقيت الفعلي لنزع ميثيل الحمض النووي في الخلايا الجرثومية الأولية مهم أيضًا. لابوسكي وآخرون (لابوسكي وآخرون ، 1994) فحص خلايا EG (ماتسوي وآخرون ، 1992 ريسنيك وآخرون ، 1992) المشتقة من الخلايا الجرثومية الأولية في مراحل النمو من اليوم الثامن إلى اليوم 12.5. لقد أظهروا أن المنطقة 2 من Igf2r كان الجين غير ميثيل تمامًا في خلايا EG من اليوم 12.5 PGCs. ومع ذلك ، فإن نصف خطوط خلايا EG من يوم 8.0 إلى 8.5 يوم PGCs كان لديها أنماط مثيلة طبيعية ، كما لوحظ في الخلايا الجسدية ، والنصف المتبقي كان غير ميثيل تمامًا ، مما يشير إلى أن الذكريات المطبوعة لبعض الأيام من 8.0 إلى 8.5 PGCs كانت تمحى. ومع ذلك ، لا يزال من الممكن تغيير حالة مثيلة الحمض النووي للجينات المطبوعة أثناء التأسيس والثقافة الخلوية اللاحقة لخلايا EG.

في الآونة الأخيرة ، ساتو وآخرون. (Y. Matsui ، الاتصال الشخصي) بتحليل حالة مثيلة الحمض النووي للمنطقة 2 من Igf2r الجين في الخلايا الجرثومية الأولية المعزولة من 4 أكتوبر / GFP الفئران المعدلة وراثيا هباII- طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل. أظهروا أن إزالة ميثيل الحمض النووي من هبالم يحدث الموقع الثاني 3 في ترحيل الخلايا الجرثومية الأولية في الأيام 8.5 أو 9.5 ، وتم اكتشافه لأول مرة في اليوم 11.5 الخلايا الجرثومية الأولية في التلال التناسلية. نتائجهم متوافقة مع بياناتنا. الجمع بين هذه المعلومات ، فمن المحتمل أن عملية طبع الذاكرة محو ، بما في ذلك Igf2r، يبدأ في حوالي اليوم 10.5 من الحمل (الشكل 5). لتحديد التوقيت الدقيق لبدء طباعة محو الذاكرة ، من الضروري تحليل المثيلة لترحيل الخلايا الجرثومية الأولية أو الخلايا الجرثومية الأولية غير التناسلية في اليوم 10.5 ، وذلك باستخدام الخلايا الجرثومية الأولية المعزولة من 4 أكتوبر / GFP الفئران المعدلة وراثيًا التي تحتوي أيضًا على تعدد أشكال الحمض النووي ، مما يسمح بالتمييز بين الأليلات المشتقة من كل والد.

عملية محو البصمة الجينومية

أظهر اليوم 11.5 PGCs مجموعة متنوعة من الحالات ، تتراوح من أنماط التعبير الجيني المطبوع تقريبًا (E1-E3) إلى الفقد الكامل تقريبًا للتعبير أحادي الموازي (E8-E9). ترتبط هذه التغييرات في نمط التعبير بانخفاض في مثيلة الحمض النووي في DMRs. نظرًا لأنه لوحظ أيضًا إزالة ميثيل الحمض النووي في نفس المناطق في اليوم 10.5 واليوم 11.5 PGCs أنفسهم ، فقد خلصنا إلى أن التغييرات في ملف تعريف التعبير الجيني الذي شوهد في اليوم 11.5 أجنة استنساخ PGC نشأت من محو ذكريات بصمة الجينوم. بافتراض أن العملية تبدأ عندما تدخل الخلايا الجرثومية الأولية إلى حواف الأعضاء التناسلية ، فإن البصمة المتغيرة التي لوحظت في هذه الأجنة يمكن أن تمثل مراحل زمنية في هجرة PGC للمانحين. من المعروف أن الخلايا الجرثومية الأولية تصل إلى التلال التناسلية وتبدأ في الدخول في حوالي اليوم 10.5 ، وتكتمل الهجرة بحلول اليوم 11.5 (Rugh ، 1990 Yeom et al. ، 1996 Molyneaux et al. ، 2001). هذا يعني أن الخلايا الجرثومية الأولية (PGCs) الفردية في حواف الأعضاء التناسلية يجب أن تختلف خلال 24 ساعة على الأكثر في وقت النمو. لذلك ، من المفترض أن يمثل التسلسل في الشكل 2 المسار الزمني لعملية المحو (انظر أيضًا الشكل 5).

جميع الجينات المطبوعة (بما في ذلك الهريس 2) في استنساخ PGC في إحدى الحالتين الافتراضيتين: التعبير biallelic أو عدم التعبير (الأشكال 2 ، 5). وتجدر الإشارة إلى أن الجينات في هاتين الفئتين أظهرت سمات مختلفة تمامًا. حدث التحويل Biallelic في أوقات مختلفة ، في حين بدا أن التحويل إلى non-expression في ستة جينات يحدث بشكل متزامن (الشكل 5). يمكن تفسير تعبير Biallelic بالدرجة المختلفة في تقدم إزالة ميثيل الحمض النووي بين الجينات المطبوعة ، مثل ننات, H19 و ربط 10 (الشكل 4). في حالة ربط 10ومع ذلك ، فإن حساسية الجين لمستوى إزالة الميثيل من الحمض النووي قد تكون أيضًا عاملاً مهمًا في محو البصمة الجينية (الشكل 3 ب). على العكس من ذلك ، يظهر التحول إلى الحالة غير المعبر عنها أيضًا في الجينات التي لها حساسيات مختلفة لمثيلة الحمض النووي: إيغف 2 و Igf2r (حساس) (لي وآخرون ، 1993) ، p57 (مقاومة) (Caspary وآخرون ، 1998) و الهريس 2 (مقاومة عالية) (Caspary et al. ، 1998 Tanaka et al. ، 1999). لذلك ، يبدو من المحتمل أن هناك عوامل أخرى تتعاون مع مثيلة الحمض النووي لإحداث تغييرات في البصمة.

على الرغم من أن أنماط مثيلة الحمض النووي للحيوانات المستنسخة PGC و PGCs نفسها أظهرت اتفاقًا جيدًا ، فمن الواضح أن أنماط مثيلة الحمض النووي التي لوحظت في أجنة PGC هذه لم تعكس بدقة تلك الخاصة بـ PGCs المتبرع الفردي. إذا تم حفظ أنماط مثيلة الحمض النووي الأولية لنواة المتبرع تمامًا في أجنة استنساخ PGC ، يجب أن يظهر نمط مثيلة الحمض النووي فقط من كل أليل أبوي. ومع ذلك ، اكتشفنا العديد من أنماط إزالة الميثيل الوسيطة من الأليلات الأبوية المطبوعة في حالات H19, Igf2r, ننات و ربط 10. تشير هذه النتائج إلى استمرار إما إزالة الميثيل أثناء تطوير استنساخ PGC لما لا يقل عن ثلاثة إلى أربعة أقسام خلوية ، أو أنه قد لا يتم الحفاظ على الأنماط الميثيلية بشكل ثابت فقط في اليوم 11.5 استنساخ PGC ، على الرغم من أن هذا الأخير غير مرجح. لذلك ، لم نتمكن من التأكد في هذه التجارب مما إذا كان نزع الميثيل النشط أو السلبي يمثل الأنماط التي لوحظت. ومع ذلك ، لا يؤثر هذا على الاستنتاج القائل بأن التغيير الأولي في عملية المحو يستمر في اليوم 10.5 على الأقل واليوم 11.5 PGCs.

في الحالة الافتراضية ، يتم إسكات معظم الأوتاد بينما تُظهر معظم الأوتاد تعبيرًا biallelic ، مع استثناءات H19, إيغف 2 (لايتون وآخرون ، 1995) ، ميج 3 (ميوشي وآخرون ، 2000) و Dlk1 (كوباياشي وآخرون ، 2000 شميدت وآخرون ، 2000 تاكادا وآخرون ، 2000) ، مما يشير إلى وجود آليات تحكم مختلفة للجينات الأخيرة. في هذه الحالات ، توجد DMRs الظاهرة فقط في مناطق المنبع من Megs ، ويبدو أن الأوتاد يتم تنظيمها بشكل متبادل تحت سيطرة مناطق Meg. توقيت التحويل إلى الشكل biallelic في اثنين ميغ (H19 و ميج 3) وعدم التعبير في الأوتاد (إيغف 2 و Dlk1) يبدو منسقًا ، مما يشير إلى شبكات تنظيمية مشتركة إضافية في كلتا مجموعتي الجينات. في الآونة الأخيرة ، يشير نموذج عازل (نموذج منافسة محسن محسّن) إلى أن ارتباط بروتين CTCF بمواقع محددة في DMR لـ H19 ينظم كلاهما H19 (القمع الأبوي والتعبير الأمومي) و إيغف 2 (التعبير الأبوي والقمع الأمومي) تم طرحهما في وقت واحد (Bell and Felsenfeld، 2000 Hark et al.، 2000). في تجربتنا ، فقدان بصمة H19 لا يبدو منسقًا تمامًا مع ذلك الخاص بـ إيغف 2 (الشكل 2I ، J ، الشكل 5). في ثلاثة أجنة (E4-E6) ، تحول الجين السابق إلى تعبير biallelic ، لكن الجين الأخير حافظ على التعبير الأبوي. لوحظ نفس الوضع في ميج 3 و Dlk1 (الشكل 2K ، L والشكل 5). ربما يتم تفسير هذا التناقض في التوقيت بين Megs و Pegs من خلال تعبير biallelic غير مكتمل في E4-6. في هذه الأجنة ، تم التعبير عن 30-60٪ فقط من الأليلات الأبوية المكبوتة ، لذلك من الممكن أن نصف الخلايا أصبحت بياليليلية ، بينما احتفظ النصف المتبقي بنمط التعبير أحادي الموازي.

طريقة الاستنساخ الجسدي لتوضيح آلية البصمة الجينومية

لقد أبلغنا سابقًا أن حالة الطبع كانت طبيعية تقريبًا في مستنسخات Sertoli (Ogura et al. ، 2000). غالبًا ما تحتوي الحيوانات المستنسخة الجسدية للفأر على مشيمة كبيرة. على الرغم من أن الكثير من التعبير الجيني غير طبيعي في مصطلح المشيمة لهذه الحيوانات المستنسخة ، إلا أن مستويات التعبير وأنماط التعبير أحادية الموازي للجينات المطبوعة ، مثل إيغف 2, Igf2r و H19، كانت طبيعية (Inoue et al. ، 2002). علاوة على ذلك ، أظهرت معظم الجينات المطبوعة التي تم فحصها في هذه الدراسة تعبيرًا طبيعيًا مطبوعًا في أجنة استنساخ سيرتولي في اليوم 9.5 (Inoue et al. ، 2002). تشير هذه البيانات إلى أن الذكريات ذات الطابع الجينومي لا يمكن أن تتعرض للاضطراب أثناء النقل النووي ، حتى من خلال عملية إعادة البرمجة ، وعادة ما يتم الاحتفاظ بها في الحيوانات المستنسخة الجسدية.

هذه الفكرة مدعومة بدراسة تعطيل X للفئران المستنسخة (Eggan et al. ، 2000). في الأنسجة الجنينية الإضافية للإناث ، يحدث التعطيل دائمًا في الكروموسوم X المشتق من الأب ، بينما يحدث التعطيل العشوائي في الخلايا الجنينية بعد الانغراس. عندما يتم إنتاج الفئران المستنسخة من الخلايا الجسدية الأنثوية ، يكون للخلايا المانحة إما كروموسوم X النشط من الأب أو الأم. في مشيمة هذه الحيوانات المستنسخة الجسدية ، تم الحفاظ على ذكريات تعطيل X للخلايا الجسدية ولوحظ التعبير غير العشوائي عن كروموسوم X للأب أو الأم وفقًا لنوع خلية المتبرع. في الآونة الأخيرة ، أظهرت الفئران المستنسخة المنتجة من الخلايا الجذعية الجنينية المستزرعة تعبيرًا غير طبيعي عن بعض الجينات المطبوعة ، مثل H19 و إيغف 2 (Humpherys وآخرون ، 2001). ومع ذلك ، فمن المحتمل جدًا أن التعبير غير الطبيعي في استنساخ ES يعكس ببساطة خصائص الخلايا الجذعية الجنينية المستخدمة كمانحين. لم نكتشف مثل هذه التشوهات في الحيوانات المستنسخة الجسدية من خلايا الركام أو طرف الذيل أو خلايا سيرتولي ، كما هو موضح أعلاه (Inoue et al. ، 2002). لوحظ هذا النوع من الشذوذ أيضًا في الخلايا الجذعية الجنينية بعد الممرات المتتالية (دين وآخرون ، 1998). باختصار ، يمنحنا تطبيق تقنيات الاستنساخ معرفة مهمة بالبيولوجيا الأساسية (Eggan et al. ، 2000). توضح هذه الدراسة أيضًا إمكانية استنساخ PGC لتوضيح عملية إعادة برمجة البصمة الجينية. تؤدي النتائج أيضًا إلى ظهور مفارقة جديدة: يمكن أن تولد الحيوانات المستنسخة من خلايا جسدية ، ولكن ليس من خلايا جرثومية. يجب إعادة النظر في الأدوار الحاسمة للطبع الجينومي كآلية فوق جينية في تطور الثدييات.

تطوير الأجنة المشتقة من البويضات المستأصلة المحقونة بنواة الخلية الجرثومية البدائية (PGC). (أ) ثقافة وتطوير الخلايا المنقولة PGC من يوم 11.5 إلى يوم 13.5. * بعد 72 ساعة في المزرعة ** تمت زراعة بعض الأجنة لمدة 48 ساعة ونقلها إلى قنوات البيض للإناث الحامل الكاذبة في اليوم الأول. (ب) صور اليوم 12.5 (أعلى) واليوم 11.5 أجنة استنساخ PGC (وسط) في dpc 10.5 (يسار) و 11.5 (يمين). تم استخدام الأجنة التي تم إنتاجها عن طريق التلقيح الصناعي (IVF ، أسفل) كعناصر تحكم لمقارنة مراحل تطور أجنة استنساخ PGC.

تطوير الأجنة المشتقة من البويضات المستأصلة المحقونة بنواة الخلية الجرثومية البدائية (PGC). (أ) ثقافة وتطوير الخلايا المنقولة PGC من يوم 11.5 إلى يوم 13.5. * بعد 72 ساعة في المزرعة ** تمت زراعة بعض الأجنة لمدة 48 ساعة ونقلها إلى قنوات البيض للإناث الحامل الكاذبة في اليوم الأول. (ب) صور فوتوغرافية ليوم 12.5 (أعلى) ويوم 11.5 أجنة استنساخ PGC (وسط) في dpc 10.5 (يسار) و 11.5 (يمين). تم استخدام الأجنة التي تم إنتاجها عن طريق التلقيح الصناعي (IVF ، أسفل) كعناصر تحكم لمقارنة مراحل تطور أجنة استنساخ PGC.

نسب التعبير الجنيني استنساخ PGC وحالة الطبع. تم تقدير مستويات التعبير النسبي في أجنة استنساخ PGC في اليوم 9.5 بواسطة RT-PCR الكمي. يتم عرض مستويات التعبير عن أجنة التحكم في التلقيح الاصطناعي على أنها 1. تم تحديد التعبير الأليلي عن طريق تحليل تعدد أشكال الحمض النووي بين C57BL6 (عضلات المصحف) و JF1 (Mus Musculus molossinus). تُظهر الأشرطة الزرقاء والحمراء ملفات تعريف التعبير الأليلي الأبوي والأمومي ، على التوالي ، والتي تشبه الحالات المطبوعة العادية. في أجنة استنساخ 11.5 PGC ، يبدأ التعبير الخاص بالأليل للأوتاد (AD ، J ، L) و Megs (EI ، K) في التحويل إلى حالتين مما يسمى بالحالات الافتراضية: تعبير biallelic (أشرطة بيضاء) أو غير تعبير (أشرطة سوداء). يختلف توقيت عملية المسح هذه باختلاف جينات البصمة الفردية ، لكن عدم التمييز بين الخلايا الجرثومية الذكرية (رقم العينة مكتوب باللون الأزرق) والإناث (الأحمر) يشير إلى أن عملية المحو تتم في وقت واحد في كلا الخطين الجرثومية. نسب التعبير الجيني المطبوع في الحيوانات المستنسخة PGC المحذوفة و Dnmt1 ج / ج كانت الأجنة (أشرطة رمادية فاتحة) هي نفسها بشكل أساسي. تم فحص التعبير المشيمي في حالة الهريس 2. (M) عدد الجينات المطبوعة الجينومية التي تظهر نمط تعبير مطبوع أحادي الموازي.

نسب التعبير الجنيني استنساخ PGC وحالة الطبع. تم تقدير مستويات التعبير النسبي في أجنة استنساخ PGC في اليوم 9.5 بواسطة RT-PCR الكمي. يتم عرض مستويات التعبير عن أجنة التحكم في التلقيح الاصطناعي على أنها 1. تم تحديد التعبير الأليلي عن طريق تحليل تعدد أشكال الحمض النووي بين C57BL6 (عضلات المصحف) و JF1 (Mus Musculus molossinus). تُظهر الأشرطة الزرقاء والحمراء ملفات تعريف التعبير الأليلي الأبوي والأمومي ، على التوالي ، والتي تشبه الحالات المطبوعة العادية. في أجنة استنساخ 11.5 PGC ، يبدأ التعبير الخاص بالأليل للأوتاد (AD ، J ، L) و Megs (EI ، K) في التحويل إلى حالتين مما يسمى بالحالات الافتراضية: تعبير biallelic (أشرطة بيضاء) أو غير تعبير (أشرطة سوداء). يختلف توقيت عملية المسح هذه باختلاف جينات البصمة الفردية ، لكن عدم التمييز بين الخلايا الجرثومية الذكرية (رقم العينة مكتوب باللون الأزرق) والإناث (الأحمر) يشير إلى أن عملية المحو متزامنة في كلا الخطين الجرثومية. نسب التعبير الجيني المطبوع في الحيوانات المستنسخة PGC المحذوفة و Dnmt1 ج / ج كانت الأجنة (أشرطة رمادية فاتحة) هي نفسها بشكل أساسي. تم فحص التعبير المشيمي في حالة الهريس 2. (M) عدد الجينات المطبوعة الجينومية التي تظهر نمط تعبير مطبوع أحادي الموازي.

مثيلة DMR والتعبير عن H19 و ربط 10 في اليوم 11.5 الأجنة استنساخ PGC. (أ) مثيلة الحمض النووي H19 DMR. (ب) مثيلة الحمض النووي ربط 10 DMR. تم تحليل مثيلة الحمض النووي عن طريق التسلسل الجيني للبي سلفيت. تميزت الأليلات الأبوية والأمومية بتعدد أشكال الحمض النووي بين B6 و JF1 في متواليات DMR. تشير الأشكال البيضاوية السوداء إلى CpGs الميثيلية والأشكال البيضاوية البيضاء تشير إلى CpGs غير الميثيل. (ج) معدلات التعبير من الأليلات المكبوتة في الأصل. تم حساب معدلات التعبير من خلال مقارنة كثافة منتجات RT-PCR بواسطة طرق RFLP في H19 أو بمقارنة عدد النسائل الفرعية التي تحتوي على مواقع متعددة الأشكال للحمض النووي عن طريق تسلسل الحمض النووي في ربط 10.

مثيلة DMR والتعبير عن H19 و ربط 10 في اليوم 11.5 الأجنة استنساخ PGC. (أ) مثيلة الحمض النووي H19 DMR. (ب) مثيلة الحمض النووي ربط 10 DMR. تم تحليل مثيلة الحمض النووي عن طريق التسلسل الجيني للبي سلفيت. تميزت الأليلات الأبوية والأمومية بتعدد أشكال الحمض النووي بين B6 و JF1 في متواليات DMR. تشير الأشكال البيضاوية السوداء إلى CpGs الميثيلية والأشكال البيضاوية البيضاء تشير إلى CpGs غير الميثيل. (ج) معدلات التعبير من الأليلات المكبوتة في الأصل. تم حساب معدلات التعبير من خلال مقارنة كثافة منتجات RT-PCR بواسطة طرق RFLP في H19 أو بمقارنة عدد النسائل الفرعية التي تحتوي على مواقع متعددة الأشكال للحمض النووي عن طريق تسلسل الحمض النووي في ربط 10.

مثيلة الحمض النووي ننات (المعروف سابقًا باسم ربط 5 أ) H19 (فرقة ربط 10 (C) في اليوم 10.5 إلى اليوم 12.5 PGCs. تم تحليل حالة إزالة ميثيل الحمض النووي لثلاثة جينات مطبوعة تحتوي على محو سريع ومتوسط ​​وبطيء للتعبير المطبوع ، باستخدام الحمض النووي الجيني المعالج بالبي سلفيت من الخلايا الجرثومية الأولية المعزولة من التلال التناسلية من اليوم 10.5 إلى اليوم 12.5 الأجنة. كانت النتائج متوافقة مع حالة مثيلة الحمض النووي لليوم 11.5 واليوم 12.5 استنساخ PGC الموضحة في الشكل 3.

مثيلة الحمض النووي ننات (المعروف سابقًا باسم ربط 5 أ) H19 (فرقة ربط 10 (C) في اليوم 10.5 إلى اليوم 12.5 PGCs. تم تحليل حالة إزالة ميثيل الحمض النووي لثلاثة جينات مطبوعة تحتوي على محو سريع ومتوسط ​​وبطيء للتعبير المطبوع ، باستخدام الحمض النووي الجيني المعالج بالبي سلفيت من الخلايا الجرثومية الأولية المعزولة من التلال التناسلية من اليوم 10.5 إلى اليوم 12.5 الأجنة. كانت النتائج متوافقة مع حالة مثيلة الحمض النووي لليوم 11.5 واليوم 12.5 استنساخ PGC الموضحة في الشكل 3.

مخطط محتمل لمحو ذاكرة الطباعة الجينومية في الخلايا الجرثومية الأولية. تنقسم عملية المحو إلى نمطين ، ينتقلان إلى التعبير biallelic كحالة افتراضية واحدة (أربعة أوتاد ، و H19 و ميج 3) أو غير تعبير كحالة افتراضية أخرى (أربعة ميغس ، و إيغف 2 و Dlk1). في النمط السابق ، يعتمد توقيت تحويل الحالة على الجينات الفردية في النمط الأخير ، ومع ذلك ، حدث التحويل في وقت واحد تقريبًا في جميع الجينات التي تم فحصها.

مخطط محتمل لمحو ذاكرة الطباعة الجينومية في الخلايا الجرثومية الأولية. تنقسم عملية المحو إلى نمطين ، ينتقلان إلى التعبير biallelic كحالة افتراضية واحدة (أربعة أوتاد ، و H19 و ميج 3) أو غير تعبير كحالة افتراضية أخرى (أربعة ميغس ، و إيغف 2 و Dlk1). في النمط السابق ، يعتمد توقيت تحويل الحالة على الجينات الفردية في النمط الأخير ، ومع ذلك ، حدث التحويل في وقت واحد تقريبًا في جميع الجينات التي تم فحصها.


شاهد الفيديو: تنظيم التعبير الجيني في بدائيات النواة (ديسمبر 2022).