معلومة

خطوات لتأكيد ما إذا كانت miRNA المتوقعة جيدة أم سيئة

خطوات لتأكيد ما إذا كانت miRNA المتوقعة جيدة أم سيئة


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قمت بمحاذاة جميع miRNAs المتاحة للحاويات الفائقة لجينوم معين مع معلمات معينة (قيمة e تبلغ 0.01 ومطابقة كلمة على الأقل 7 كما هو مقترح في هذه الورقة). لقد قمت أيضًا بعزل pre-miRNAs (+100 نيوكليوتيد من أي من طرفي منطقة المطابقة). ما الذي تقترحه كطرق ab-initio مثالية لتأكيد وجود هذه الجزيئات الدقيقة في ذلك الجينوم المحدد؟ بعض الأوراق التي وجدتها تستخدم mFOLD مثل هذا.

ما هي أفضل الخطوات التي تقترحها لتأكيد ما إذا كان الجينوم متوقَّعًا أم لا.


لن يكون هناك أي تكرارات في miRBase (لكائن حي معين). اختر التصنيف الأقرب لكائنك إذا كنت تقوم باكتشاف قائم على التماثل. إذا كنت تريد أن تأخذ كل / العديد من الكائنات الحية ، فيمكنك استخدامهاfastx_collapserلطي التسلسلات الزائدة عن الحاجة. ومع ذلك ستفقد اسم ميرنا. يمكنك استخدامawkأيضًا لهذا وسيحتفظ برأس التسلسل من الكائن الأول في القائمة.

awk '/> / {$ 0 = h}! (/> /) {if ($ 0 in a) {next} else {a [$ 0]؛ print h " n" $ 0}}' organism1.fa organism2.fa… الكائن الحي

تأكد من عدم وجود أسطر جديدة إضافية ، وإلا فقد تحتاج إلى تعديل بسيط

لمعرفة ما إذا كان شيء ما هو ميرنا معبرًا ، ستحتاج إلى إجراء تسلسل صغير من الحمض النووي الريبي. هناك بعض الأدوات مثل mirdeep و mirSVR التي يمكنك استخدامها لاكتشاف تسلسلات miRNA.


تحريض miR-493 أثناء التسرطن يمنع التسوية النقيلية لخلايا سرطان القولون في الكبد

ورم خبيث في الكبد هو أحد المضاعفات المميتة الرئيسية المرتبطة بسرطان القولون ، وتعد خطوات ما بعد التوغل للورم النقيلي مهمة للتدخل السريري. من أجل تحديد microRNAs المثبطة (miRNAs) لهذه الخطوات ، أجرينا & # x02018dropout شاشات لمكتبة miRNA في نموذج فأر لورم خبيث في الكبد. أظهرت التحليلات الوظيفية أن miR-493 وبدرجة أقل miR-493 & # x0002a كانت قادرة على تثبيط ورم خبيث في الكبد. يمنع miR-493 الاحتفاظ بالخلايا المنتشرة في حمة الكبد ويسبب موتها الخلوي. تم تحديد IGF1R كهدف مباشر لـ miR-493 ، وقد أدى تثبيطه جزئيًا إلى ظهور التأثيرات المضادة للنقائل. كانت المستويات العالية من miR-493 و miR-493 & # x0002a ، ولكن ليس pri-miR-493 ، في سرطان القولون الأولي مرتبطة عكسًا بوجود ورم خبيث في الكبد ، وتعزى إلى زيادة تعبير miR-493 أثناء التسرطن. نقترح ، في مجموعة فرعية من سرطان القولون ، منع تنظيم miR-493 أثناء التسرطن من ورم خبيث في الكبد عن طريق تحريض موت الخلايا للخلايا المنتشرة.


1 المقدمة

تعد الطفرات إحدى القوى الأساسية للتطور لأنها تغذي التباين في المجموعات السكانية وبالتالي تمكن من التغيير التطوري. استنادًا إلى تأثيرها على اللياقة ، يمكن تقسيم الطفرات إلى ثلاث فئات رئيسية: & # x02018good & # x02019 أو ميزة تزيد من اللياقة ، و & # x02018bad & # x02019 أو ضارة تقللها و & # x02018 غير مختلفة & # x02019 أو محايدة. لا تتأثر بالاختيار لأن آثارها صغيرة جدًا. في حين أن هذا الرأي التبسيطي يخدم جيدًا كقاعدة أولية لفهم مصير الطفرات ، فقد كشفت الأبحاث في العقود الأخيرة عن شبكة معقدة من التفاعلات. على سبيل المثال ، (1) غالبًا ما تعتمد تأثيرات الطفرات على وجود أو عدم وجود طفرات أخرى ، (2) يمكن أن تعتمد آثارها أيضًا على البيئة ، (3) قد يعتمد مصير الطفرات على حجم وهيكل السكان ، والتي يمكن أن تحد بشدة من قدرة الاختيار على التمييز بين الأنواع الثلاثة (مما يجعل الجميع يبدو تقريبًا & # x02018 غير مختلف & # x02019) ، و (4) يمكن أن يعتمد مصير الطفرات أيضًا على مصير الآخرين الذين لديهم تأثيرات أكثر وضوحًا وهم في القرب من نفس الكروموسوم.

الهدف النظري الرئيسي في دراسة الجينات السكانية للطفرات هو فهم كيف تغير الطفرات السكان على المدى الطويل. تحقيقا لهذه الغاية ، يتعين علينا النظر في العديد من سمات التطور والمجموعات الموجودة على كل من المستوى الظاهري والجزيئي ، ونسأل كيف يمكن تفسيرها من حيث معدلات وأنواع الطفرات وكيف تتأثر بالقوى التي تؤثر على مصائرهم .

لدينا كميات متزايدة من المعلومات المتاحة لنا لمساعدتنا في الإجابة على هذه الأسئلة. يوفر التحسين المستمر لتكنولوجيا تسلسل الحمض النووي مزيدًا من الأنماط الجينية المفصلة على المزيد من الأنواع ورصد المزيد من الظواهر على المستوى الجيني. نحن نكتسب أيضًا مزيدًا من الفهم للعمليات التي تؤدي من التغييرات على مستوى الأنماط الجينية من خلال التغيرات الجزيئية الوسيطة المختلفة في الأفراد إلى أنماط ظاهرية مرئية جديدة. يقدم استخدام هذه المعرفة الجديدة فرصًا وتحديات لفهمنا ، وقد تم تطوير طرق جديدة لمواجهتها.

كان بريان تشارلزوورث في طليعة العديد من التطورات في علم الوراثة السكانية للطفرات ، سواء في جمع وتحليل البيانات الجديدة أو في تقديم نماذج جديدة لشرح الملاحظات التي قدمها هو وآخرون. هذه القضية تحت عنوان فيل. عبر. R. Soc. ب تم تكريسه له للاحتفال بعيد ميلاده الخامس والستين. قدم مؤلفو الأوراق المصاحبة مساهمات مهمة في هذا المجال بشكل فردي وارتبطوا بعمله بشكل مباشر أو تأثروا به بشكل غير مباشر.

في هذه المجموعة من الأوراق ، يتم النظر في الجوانب المختلفة بالتفصيل ، وفي هذه المقدمة ، نهدف إلى تقديم نظرة عامة كأساس للعلاجات المتعمقة التالية. نحدد بعض النظريات التي تعمل كأساس كمي لمزيد من الأسئلة التطبيقية وقد تم تطويرها مع الأهداف الرئيسية التالية: (1) قياس المعدلات التي تحدث بها أنواع مختلفة من الطفرات في الطبيعة ، (2) التنبؤ الكمي بمصيرها اللاحق في السكان ، و (3) تقييم كيفية تأثيرها على بعض خصائص السكان وبالتالي يمكن استخدامها للاستدلال. يتم ترتيب الأوراق اللاحقة على نطاق واسع في سلسلة متصلة من أسئلة محددة لتقدير المعلمات الأساسية (قوة الطفرة ، الاختيار ، إعادة التركيب) ، عبر تلك التي تساهم في مجموعة من النظريات والبيانات البيولوجية حول هذه المعلمات ، إلى تلك التي تتناول في الغالب نظريات بيولوجية أوسع.

هناك مجموعة هائلة من التأثيرات الطفرية على اللياقة ، وتوجد اختلافات كبيرة في قوة القوى التطورية الأخرى التي تعمل على السكان. يولد هذا مجموعة من الظواهر المعقدة التي تستمر في تحدي قدرتنا على فهم التطور ميكانيكيًا. لجعل المشكلات قابلة للتتبع ، قسم المنظرون مساحة المعلمة إلى مناطق أصغر بحيث يمكن وضع افتراضات تبسيط محددة. تشتمل هذه عادةً على افتراض عدم وجود أحداث معينة (على سبيل المثال عدم إعادة التركيب) أو وجود توازن معين (مثل توازن اختيار الطفرات). بعد ذلك ، غالبًا ما يتم تطوير نظريات جديدة يتم فيها تخفيف هذه الافتراضات لتضييق الفجوة إلى الواقع ، بما في ذلك عادةً المزيد من التفاعلات بين القوى التطورية المختلفة ، وإن كان ذلك على حساب أن تصبح أقل قابلية للتحليل.

تهيمن الصدفة على ديناميكيات الطفرات ، ومع ذلك فإننا نبحث عن مبادئ عامة مستقلة عن أحداث عشوائية معينة. ينعكس هذا التوتر في النماذج المستخدمة. تبدأ جميع الطفرات كنسخ فردية ويتم فقد معظمها مرة أخرى عن طريق الصدفة ، لذلك يمكننا في أفضل الأحوال التنبؤ باحتمالات مصائر معينة ، لكن النماذج العشوائية التي يمكنها التعامل بصرامة مع العشوائية غالبًا ما تكون معقدة للغاية بحيث يتعذر تحليلها للحصول على سيناريوهات واقعية. إذا كنا مهتمين فقط بالنتيجة المتوسطة للعديد من الأحداث العشوائية الفردية ، فقد نقوم بتقريب العملية من خلال نماذج حتمية تتنبأ بنتيجة دقيقة ولكن هذه التقريبات يمكن أن تنهار إذا كان هناك عدد قليل من الأفراد أو الأحداث النادرة.

لتسهيل الأوصاف الموجزة ، هناك تاريخ طويل في علم الوراثة السكانية لاستخدام الرموز الرياضية كاختصارات لمعايير وملاحظات مختلفة ، ولكن لسوء الحظ لا توجد مصطلحات فريدة. لمحاولة تحقيق هدفين متعارضين من الإيجاز وسهولة القراءة ، قمنا بإدراج بعض المعلمات التطورية المهمة واختصاراتها الشائعة في الجدول & # x000a01. ومع ذلك ، ولأسباب وجيهة للتاريخ أو التقاليد المحلية ، تم تعريف بعض هذه الرموز بشكل مختلف في بعض الأوراق في هذه المجموعة.

جدول & # x000a01.

بعض المعلمات في علم الوراثة السكانية للطفرات *.

يومعدل الطفرة لكل جيل لكل سياق فحص الجينوم لتأثيرات الطفرات
جيه, جيحجم الجينوم الفرداني الفعال (جميع أزواج القواعد الوظيفية) ، إجمالي حجم الجينوم الفرداني (مع المواقع المحايدة)
& # x003bc, & # x003bc10, & # x003bc01معدل الطفرة لكل موقع أو لكل موقع لكل جيل ، بعيدًا عن القاعدة المفضلة ، والعودة
& # x003ba، تينيسي / تلفزيونالتحيز الطفري: & # x003bc10/& # x003bc01، نسبة الانتقال / التحويل
صه, صشارك, صGCمعدل إعادة التركيب الفعال ، معدل العبور ، معدل التحويل الجيني
سيقيس معامل الاختيار التغييرات في سياق فحص اللياقة للحصول على تعريفات دقيقة (متماثلة اللواقح أو متغايرة الزيجوت إيجابية أو سلبية)
حمعامل الهيمنة بحيث ش هو تأثير الطفرات متغايرة الزيجوت
DME (أو DFE)توزيع التأثيرات الطفرية على اللياقة
دبليوأملاءمة Wrightian للنمط الجيني A (إحدى الطرق العديدة التي يمكن من خلالها تحديد اللياقة البدنية)
& # x003b5epistasis: تفاعلات التأثيرات الطفرية. إذا كانت اللياقة مضاعفة ، & # x003b5 = دبليوAB & # x02212 دبليوأدبليوب
نه, نحجم السكان الفعال ، حجم التعداد السكاني
ممعدل الهجرة
صيصلحاحتمال تثبيت أليل (متحور)
تييصلح, تيخسارةوقت التثبيت ، الخسارة في الأجيال
كأ, كس (أو دن, دس)معدل تباعد الحمض النووي لكل موقع بين نوعين مصححين لعدة زيارات (انظر سياق الطريقة) يمكن أن تكون البدائل غير مترادفة (تغيير الأحماض الأمينية) ، أو مرادفة (أو صامتة) (تحقق من السياق)
& # x003c0أ, & # x003c0س, & # x003b8WA, & # x003b8WSتنوع الحمض النووي داخل السكان لكل موقع: & # x003c0 هو متوسط ​​تنوع النوكليوتيدات الزوجي ، & # x003b8دبليو هو تقدير واترسون لشرح المؤشرات انظر كأ, كس
D ، D & # x02032 ، ص 2 مقاييس اختلال التوازن (LD)
الخامسجيالتباين الجيني في سمة كمية
الخامسمزيادة في الخامسجي من الطفرات الجديدة لكل جيل
الخامسهالتباين البيئي في سمة كمية

* لأسباب تاريخية ونظرًا لمحدودية الأبجدية ، فإن العديد من الرموز لها معاني مختلفة في سياقات مختلفة. أمثلة: ح 2 = توريث سمة كمية ص = معدل التعرّف على الذات ص = معدل النمو السكاني د = & # x02018 تاجيما D & # x02019 ، أين د & # x0003c 0 قد تشير إلى التوسع السكاني أو اختيار الاتجاه و د & # x0003e 0 تحديد عنق الزجاجة أو موازنة.

بطبيعة الحال ، لا يمكن لمراجعة بهذا الطول أن تغطي جميع جوانب الجينات السكانية للطفرات. على سبيل المثال ، تلعب الطفرة دورًا محوريًا في نظرية الاندماج (Hein وآخرون. 2005) وفي بناء خرائط النمط الجيني & # x02013 النمط الظاهري التي هي في صميم بعض الجهود لفهم المناظر الطبيعية التكيفية ، والتي توفر نموذجًا لفهم العديد من الجوانب الأوسع لعلم الوراثة السكانية من منظور الطفرات الفردية (& # x02018 تسبب السرطان أو لا & # x02019) ، كما تمت مراجعته في مكان آخر (Loewe 2009). نحن هنا نركز بشكل شبه كامل على كيفية تغير مجموعات الأفراد من خلال الأعداد الكبيرة من الطفرات التي لها تأثيرات محددة على اللياقة البدنية.

في & # x000a72 من هذه الورقة ، نناقش ما هو معروف عن تنوع الطفرات ، وهنا وبعد ذلك نشير إلى أوراق أخرى في هذا الموضوع تحت عنوان توفر معلومات أكثر تعمقًا. في & # x000a73 ، نراجع بعض النظريات ذات الصلة في علم الوراثة السكانية ، بدءًا من (1) النظريات البسيطة التي تعالج مصير الطفرات الفردية بمعزل قبل الانتقال إلى نماذج أكثر تعقيدًا تأخذ في الاعتبار (2) الترابط ، (3) الإرسالية ، (4) مناهج علم الوراثة الكمية ، و (5) التحديات التي تواجه عند محاولة دمج كل هذه. بعد ذلك ، نقدم نظرة عامة على العديد من الأسئلة العامة التي تم حلها وغيرها من الأسئلة المتبقية (& # x000a74) وأخيراً بعض الاستنتاجات (& # x000a75).


2. الإجراءات التجريبية

2.1. أورام الساركوما العضلية المخططة البشرية

تم تضمين سبعة عشر مريضًا تم علاجهم من الساركوما العضلية المخططة في مركز L & # x000e9on B & # x000e9rard في هذه الدراسة. تم الحصول على أربعة أورام مجمدة وثلاثة عشر أورامًا مضمنة بالبارافين مثبتة بالفورمالين من الخزعات التي تحققت عند التشخيص. تم تحقيق تشخيص الورم من قبل أخصائي علم التشريح المرجعي لهذا المرض عن طريق الكيمياء المناعية ، FISH ، و qPCR.

2.2. خطوط الخلايا السرطانية

تم الحصول على خمسة خطوط من الخلايا السرطانية من ATCC (ماناساس ، فرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية): ساركوما عظمية بشرية MNNG / HOS Cl # 5 [R-1059-D] (المرجع CRL-15-47) و Saos-2 (HTB-85) الخلايا ، وخط خلية الساركوما الغضروفية SW1353 (HTB-94) وخلايا بوركيت الليمفاوية الداودي (CCL-213) وخلايا نامالوا (CRL-1432). نمت خلايا الساركوما العظمية والساركوما الغضروفية في DMEM (Gibco ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مكملًا بنسبة 10 ٪ من مصل العجل الجنيني (Lonza ، بازل ، سويسرا) ، 10 & # x02009mL البنسلين الستربتوميسين (10 & # x02009U / mL / 10 & # x02009& # x003bcg / mL ، Gibco ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، و 5 & # x02009mL L-glutamin (200 & # x02009mM Gibco) عند 37 & # x000b0C جو مرطب يحتوي على 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون2. نمت خلايا الليمفوما في RPMI (جيبكو ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تعرضت الخلايا لـ 100 & # x02009nM RAD-001 (نوفارتيس) ، 50 & # x02009& # x003bcM ifosfamide (ifos، Baxter) أو 1 & # x02009& # x003bcM سيسبلاتين (CDDP ، TEVA) أو 100 & # x02009& # x003bcM ميثوتريكسات (MTX ، TEVA) لمدة 24 و 48 و 72 & # x02009h.

2.3 نموذج الفئران العظمية

تم تنفيذ إجراءات رعاية الحيوان وفقًا للإرشادات المؤسسية والوطنية. تم تخدير الحيوانات في جميع الإجراءات الجراحية والتصويرية باستخدام الأيزوفلورين / الأكسجين (2.5٪ / 2.5٪ ، حجم / حجم) (مينيرف ، إستيرناي ، فرنسا). تم وصف نموذج ساركومة عظمية الفئران القابلة للزرع والقابل للزرع سابقًا [21 & # x0201323]. يحاكي هذا النموذج نظيره البشري من حيث العدوانية والانتشار النقيلي والنمط الظاهري للمقاومة الكيميائية [21 & # x0201323]. تم تصنيف جميع الأورام التي تم الحصول عليها على أنها عظمية بعد التحليلات النسيجية. باختصار ، تم تطعيم شظايا الورم الصغيرة (100 & # x02009mm 3) المأخوذة من منطقة ورم عظمي مفرط التكاثر في جرذان Sprague-Dawley ذات الكفاءة المناعية البالغة من العمر 3 أسابيع (Charles River Laboratories ، Wilmington ، MA ، USA). باستخدام نهج جانبي ، تم وضع جزء من الورم بالقرب من شلل الظنبوب بعد تآكل السمحاق ، ثم تم خياطة الجروح الجلدية والعضلية. بعد أربعة عشر يومًا من زرع الورم ، خضعت الحيوانات لأول مسح ضوئي 18 F & # x02212 FDG PET وتم تعيينها عشوائيًا لمجموعة تحكم عولجت بمحلول ملحي أو مجموعة معالجة تعرضت لجرعة تحت الجلد من 10 & # x02009mg / kg ifosfamide (ifos ، باكستر ، ديرفيلد ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 7 أيام متباعدة (في اليومين 15 و 22 بعد زراعة الورم). تم إجراء مسح ضوئي آخر 18 F & # x02212 FDG PET Scan بعد 7 أيام من إدارة ifos الثانية. تم التضحية بالحيوانات بعد أسبوع من انتهاء العلاج. تم جمع أجزاء الورم والأنسجة الطبيعية (العضلات والعظام والرئة) لاستخراج الحمض النووي الريبي.

2.4 استخراج الحمض النووي الريبي والكمي في الوقت الحقيقي PCR

تم تحليل أورام FFPE لمدة 24 & # x02009h في المخزن المؤقت ATL (Qiagen ، فرنسا) المكمّل بالبروتيناز K (Qiagen) عند 60 & # x000b0C في التحريض الدوراني بعد عمليات غسل مختلفة باستخدام التولوين والإيثانول و tris / EDTA بهذا الترتيب. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الورم أو الكريات الخلوية باستخدام بروتوكول استخراج الفينول / الكلوروفورم الفردي مع Trizol ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة (Invitrogen ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إخضاع خمسمائة نانوجرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل ميكروفلويديك التي تقوم بها شركة أبلايد بيوسيستمز (فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). باختصار ، تم عكس نسخ الحمض النووي الريبي ، باستخدام بادئات ميرنا محددة متعددة الإرسال من مجموعة Taqman MicroRNA Reverse Transcription. تتكون الخطوة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي على TLDA: يتم إدخال منتجات RT من خلال القنوات الدقيقة في الآبار المصغرة التي يتم تحميلها مسبقًا بمواد أولية ومسبار محددة مجففة. في الآونة الأخيرة ، أصدرت النظم الحيوية التطبيقية الإصدار الثاني من TLDA ، والذي يتكون من بطاقتين A و B. تم إجراء التحليلات لـ 377 miRNAs على البطاقة A و 290 على البطاقة B.

2.5 تطبيع بيانات PCR

لكل ميرنا ، تم حساب دورة العتبة (Ct) بواسطة برنامج ABI 7900 Sequence Detection System (تحليل لوحة من لوحة Ct يدويًا مع عتبة عند 0.25 وخط أساس تلقائي). تم إجراء جميع معالجات البيانات الإضافية باستخدام البرامج النصية R. تم تطبيق قطع قدره 32 لتجاهل قيم Ct المتأخرة ، باستثناء تحليل RMS. اجتاز حوالي 60 ٪ من miRNAs معايير التصفية واستخدمت لمزيد من التحليل. لكل TLDA ، تم إجراء ضوابط الجودة على البيانات الأولية عن طريق التحقق من الضوابط الداخلية واستخدام مخطط مربع ومخططات مخطط مبعثر. تم تجاهل العينات التي تحتوي على أي نوع من المشكلات حتى لا تؤدي إلى التحيز أثناء إجراءات التطبيع التالية. اختبرنا طرقًا مختلفة للتطبيع نظرًا لأن عامل التطبيع الموصى به & # x0201cpseudo & # x0201d mammU6 المرسوم في كل بطاقة لم يتم التعبير عنه بثبات في عيناتنا المختلفة. لم يكن التطبيع مع اثنين من miRNAs الأكثر استقرارًا التي تم تحديدها بواسطة GeNorm هو الأمثل أيضًا. أخيرًا ، تم اختيار التطبيع العالمي بواسطة الوسيط لموثوقيته على التجارب. تمت معالجة الأنسجة المتضمنة في تحليل معين تمامًا ، وتم تطبيق إجراء التطبيع بشكل منفصل لنوعي البطاقات ، A و B. وتم التحقق من توزيع البيانات الطبيعية باستخدام مخططات الصندوق ومخططات الارتباط. تم استخدام الصيغة التالية لتصحيح قيم Ct لكل بطاقة:

من خلال هذا النهج ، يمكن اعتبار القيمة المتوسطة الجديدة المشتركة بين جميع العينات نوعًا من الجين المثالي & # x0201cvirtual التدبير المنزلي & # x0201d. لذلك ، يمكن استخدام الطريقة المعيارية & # x00394 & # x00394Ct لتحديد الكميات النسبية (RQ) على النحو التالي:

بالنسبة لحساب & # x00394 & # x00394Ct ، كان من المناسب أكثر للتحليلات الإحصائية استخدام متوسط ​​جميع & # x00394Ct التي تم الحصول عليها عبر العينات لكل miRNA ، بدلاً من استخدام & # x00394Ct لعينة مرجعية

2.6. توقعات الهدف ميرنا

قمنا بتجميع 4 قواعد بيانات لتحديد أهداف ميرنا: TargetScan 5.1 و MiRanda و PICTAR وقواعد بيانات miRbase.تبحث قواعد البيانات هذه عن وجود مواقع 8mer و 7mer محفوظة على الأجزاء 3 & # x02032UTR من الرنا المرسال التي تتطابق مع منطقة البذور لكل ميرنا. كما أنه يتنبأ بفعالية الاستهداف لكل موقع مطابق. لقد أنشأنا قاعدة البيانات الخاصة بنا والتي جمعت كل ميرنا مع معرف الجين لجميع أهداف البروتين الخاصة بهم ، للفئران والبشر. لقد حافظنا فقط على الأزواج miRNA / geneID الموجودين في قاعدتي بيانات على الأقل.

2.7. تنبؤات مسارات إشارات الخلايا التي تنظمها miRNA

استخدمنا & # x0201cG-language microarray & # x0201d تطبيق الويب ، والذي يسمح بتعيين مجموعة البيانات الجزيئية على & # x0201cKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes & # x0201d (KEGG) خرائط المسار [24]. نقوم أولاً بإدخال البروتينات المستهدفة للـ miRNA ومجموع قيم RQ لجميع miRNAs التي تنظم هذه البروتينات ، الموجودة بين 1 و 50 ، ثم يولد البرنامج بيانات KEGG لإنشاء رسومات FLASH لمسارات إشارات الخلية التي تشارك فيها البروتينات. تختلف شدة لون البروتين المميز باختلاف قوة تنظيمه بواسطة miRNAs.

2.8. فحص الانتشار

تم طلاء الخلايا في 96 طبقًا جيدًا عند 5000 & # x02009cells / بئر وتعرضت لـ 100 & # x02009nM RAD-001، 50 & # x02009& # x003bcM ifosfamide، 100 & # x02009& # x003bcM ميثوتريكسات ، أو 1 & # x02009& # x003bcم سيسبلاتين أم لا (NT). تم قياس نمو الخلية 24 و 48 و 72 & # x02009h لاحقًا بـ 20 & # x02009& # x003bcكاشف L Cell Titer Glo المضيء (Promega ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 10 & # x02009min. تم تسجيل التلألؤ باستخدام قارئ Microbeta (PerkinElmer ، Fremont ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.9 لطخة ويسترن

تم تعليق الخلايا المحببة في محلول تحلل (Tris 50 & # x02009mM pH 7.4 ، NaCl 250 & # x02009mM ، EDTA 5 & # x02009mM ، NaF 50 & # x02009mM ، Triton X-100 0.1٪ ، orthovanadate 1 & # x02009& # x003bcM) بالإضافة إلى مثبطات الأنزيم البروتيني لمدة 30 & # x02009 دقيقة على الجليد. بعد الطرد المركزي عند 14000 & # x02009rpm لمدة 10 & # x02009min ، تم غلي المواد الطافية لمدة 5 & # x02009min في مخزن عينة Laemmli (Biorad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء تحليل لمحتوى البروتين على هلام متدرج 4٪ & # x0201312٪. بعد الفصل الكهربي ، 30 & # x02009& # x003bcتم نقل بروتينات g إلكترونيًا على غشاء ثنائي فلوريد البوليفينيلدين (Immobilon P ، Millipore corp. ، Bedford ، MA ، USA). تم بعد ذلك حظر الغشاء لمدة 1 & # x02009h في درجة حرارة الغرفة مع عامل مانع بنسبة 0.2 ٪ في PBS / Tween 0.1 ٪ ، وتم فحصه طوال الليل باستخدام جسم مضاد أولي للأرنب ضد البروتين المعني ، وكشف أخيرًا باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للأرنب HRP مترافق (Upstate Biotechnology ، Lake Placid، NY، USA) ونظام ECL Advance (GEhealthcare، Chicago، IL، USA). تم الحصول على الجسم المضاد الأولي المستخدم من Cell Signaling (New England Biolabs ، Beverly ، MA ، USA) المستخدمة في 1/1000. ال & # x003b2 تم استخدام الأكتين كمرجع (سيجما).

2.10. صفيف CGH

تم إجراء تحليل ميكروأري المستند إلى قليل النوكليوتيد باستخدام ميكروأري لجينوم كامل الفئران مصمم خصيصًا ، 244K ، تم تصنيعه بواسطة Agilent Technologies (سانتا كلارا ، كاليفورنيا). تم إجراء وسم الحمض النووي الجيني وتهجين الصفيف والغسيل على النحو المحدد من قبل الشركة المصنعة (Agilent Technologies). تم عرض نتائج مكالمات الانحراف المكونة من ثلاث أوليغوس متتالية أو أكثر باستخدام برنامج تحليل CGH قليل النوكليوتيد المخصص (Genespring).

2.11. تحليل احصائي

تم إدخال بيانات RQ المعيارية مباشرة في موقع TIBCO Spotfire DecisionSite لبرنامج تحليل الجينوم الوظيفي. أجرينا مجموعات هرمية غير خاضعة للإشراف لتصنيف العينات حسب المجموعات. تم تحديد اختيار الجزيئات المجهرية المفيدة للتنبؤ باستجابة الورم للعلاج إحصائيًا باستخدام اختبارات ANOVA مع ص قيم & # x02009 & # x02009.05 على الأقل. تم التحقق من النتائج من خلال المجموعات الهرمية الخاضعة للإشراف.

ثم تم استخدام البيانات من قوائم miRNA ذات الأهمية كمتغيرات في تحليل مكون رئيسي ثلاثي الأبعاد (PCA) تم إجراؤه باستخدام حزمة R 2.9.0 لإثبات قدراتها على التمييز بين أنواع الأورام. يوفر PCA صورة مبسطة ثلاثية الأبعاد لمجموعة البيانات متعددة المتغيرات الخاصة بنا لقيم miRNA RQ. من خلال الجمع الرياضي للقيم وفقًا لقوتها ، يتم إنشاء ثلاثة مكونات رئيسية تمثل قدر الإمكان تباين البيانات. وهكذا ، تمتلك الأورام ثلاثة إحداثيات جديدة في فضاء ثلاثي الأبعاد. وفقًا لتوطينها في هذا الفضاء ، تشكل الأورام مجموعات ، ويمكن التنبؤ بأنواعها الفرعية.


3. مناقشة

قد تقلل إمكانية التجدد المتزايدة لقلب الإنسان بعد التلف الإقفاري من حدوث قصور القلب لدى المرضى. هنا ، حددنا استجابة النسخ القصيرة إلى طويلة المدى في قلوب الزرد بعد كريوينجوري لاكتساب نظرة ثاقبة لديناميكيات الرنا المرسال ومنظمي الرنا الدافع أثناء تجديد قلب الزرد. على حد علمنا ، هذه هي أكبر دراسة لبيانات متعددة omics لمراقبة تجديد القلب حتى 160 نقطة في البوصة في سمك الزرد. بينما تم إثبات أن تقنية cryoinjury هي نموذج جيد لتقليد احتشاء عضلة القلب [6،8] ، فإن تأثير الجراحة السابقة يؤثر بشكل واضح على الترنسكربيتوم ويجب أن يؤخذ في الاعتبار ، على سبيل المثال ، مع استخدام أدوات التحكم المزيفة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تعديل تغييرات النسخ مع زيادة العمر باستخدام عناصر التحكم المطابقة للعمر. ومن ثم ، يوصى باستخدام أدوات التحكم المطابقة للعمر والتي يتم تشغيلها بطريقة وهمية لدراسة أفضل استجابة متعلقة بالتجديد في أسماك الزرد.

ومع ذلك ، فإن إعداد عناصر تحكم مزيفة ومتوافقة مع العمر لكل نقطة زمنية يزيد من وقت التشغيل والنفقات بشكل ملحوظ. في حين أن الدراسات الأخرى استخدمت إما أدوات التحكم المزيفة والتي تم استردادها في نقطة زمنية واحدة [12،16] أو عناصر تحكم صحية [34] ، استخدمنا مجموعة تحكم مع أوزان تعتمد على الوقت للأسماك المزيفة (تم استعادتها عند 1 نقطة في البوصة) وغير خاضعة للتشغيل أسماك صحية تغطي جميع الأعمار لاستخراج تغييرات تجديد القلب التي تحدثها الإصابة بالتبريد. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يكمن وراء افتراض الانحلال الأسي لتأثير الجراحة ، ولا يمكن إلا لعناصر التحكم المزيفة في كل نقطة زمنية أن تحاكي تمامًا التأثير الجراحي في التغييرات النسخية. قد تكون عناصر التحكم التي يديرها الشام مهمة بشكل خاص لدراسة التغييرات في بعض الجزيئات الدقيقة للأسماك المصابة بالتبريد في نقاط زمنية متأخرة لأنه حتى عند 160 نقطة في البوصة ، لا تزال العينات منفصلة عن عناصر التحكم الصحية (الشكل 2 ب). بدلاً من ذلك ، قد يشير هذا إلى حدوث تغيير دائم محتمل في الجير بعد إصابة القلب.

باستخدام مجموعة ضابطة مختلطة ، أظهر تحليل التعبير التفاضلي أكبر التغييرات في النسخ في نقاط زمنية مبكرة (1 & # x020137 نقطة في البوصة) مما يشير إلى استجابة رئيسية وسريعة للجروح الباردة. تتوافق أبرز المسارات مع دورة الخلية وعمليات تكرار الحمض النووي ، والتي تتوافق مع الدراسات السابقة [4،12،16] وحقيقة أن التجديد يحدث بشكل رئيسي عن طريق تكاثر CM بدلاً من عمليات التمايز [10،11]. أثناء الاستجابة الوسيطة (14 & # x0201345 نقطة في البوصة) لا تزال عمليات دورة الخلية منظمة ، لكن عمليات تنظيم ECM أصبحت أكثر بروزًا ، مما يشير إلى استمرار إعادة تشكيل النسيج الندبي. في النقاط الزمنية المتأخرة (60 & # x02013160 نقطة في البوصة) ، لاحظنا عدم وجود تغييرات مهمة في دورة الخلية ، مما يشير إلى اكتمال تجديد القلب وإعادة تشكيل الأنسجة حتى 60 نقطة في البوصة بعد الإصابة بالتبريد. ومع ذلك ، لم يتم تحقيق الانتعاش الوظيفي الكامل ، حيث لا تزال عمليات استعادة وظائف القلب تخضع للتنظيم عند 60 & # x02013160 نقطة في البوصة ، مثل تطور القلب والأوعية الدموية وتقلص القلب والنمو.

تم تأكيد هذه النتائج بشكل أكبر من خلال تحديد استجابة النسخ باستخدام تقنيات التجميع اللينة. هنا ، أظهرت منظمات الانتشار زيادة سريعة تصل إلى 4 & # x020137 نقطة في البوصة وانخفاض بطيء يعود إلى خط الأساس حتى 45 نقطة في البوصة ، مما يؤكد البيانات المظهرية التي لوحظت سابقًا لحجم الندبة [7،8]. بمجرد إعادة تكوين أنسجة القلب ، يتم تنشيط العمليات التي تستعيد وظيفة القلب. يمكن ملاحظة ذلك بالنسبة للمجموعتين 3 و 4 ، اللتين لم ترجعوا إلى مستويات خط الأساس عند 160 نقطة في البوصة وتم إثرائهم لتنمية القلب وعمليات الالتصاق. لذلك ، فإن استجابة النسخ لتجديد القلب بعد الإصابة بالبرد هي عملية طويلة تصل إلى 160 نقطة في البوصة [6] ، والتي تتوافق أيضًا مع ملاحظات النمط الظاهري لـ Hein et al. الذين ما زالوا يجدون إزاحة محدودة للجدار الشعاعي ووجود نسيج ندبي بدقة 180 نقطة في البوصة [8].

باستخدام بيانات النسخ التي تم حلها مكانيًا [15] ، قمنا بتعيين المجموعات الديناميكية مع مواقع مواقعها الأساسية في القلب المصاب. تم التعبير عن الجينات المشاركة في عمليات الانتشار بأعلى مستوى داخل موقع الإصابة في القلب ، مما يدل على أن الأنسجة المصابة هي المصدر الرئيسي للتكاثر ، ربما من خلال غزو CM من عضلة القلب غير المصابة [13].

نظرًا لأنه يُقترح أن تلعب الجزيئات المجهرية دورًا رئيسيًا في تنظيم تجديد القلب [19] ، فقد قمنا بفحص كل من الرناومي والميرناوم. من خلال ربط الرنا المرسال بديناميكيات ميرنا ، حددنا الجينات المستهدفة ميرنا ذات القمع المرئي (مضاد الارتباط) في التعبير ، وبالتالي قللنا مواقع الارتباط الإيجابية الخاطئة التي غالبًا ما تكون موجودة في قواعد بيانات التفاعل الهدف ميرنا [21]. من بين أفضل 10 جزيئات من الجزيئات الدقيقة التي تنظم معظم الجينات ، وجدنا مرشحين جديدين موصوفين ومحتملين مسبقًا.

حددنا miR-144 ليتم تنظيمه في الاستجابة الأولية (1 & # x0201321 dpi الشكل التكميلي S5) واستهداف الجينات في الغالب في المجموعات 3 و 5 التي تم تنظيمها في البداية. ومن المثير للاهتمام ، أن miR-144 ظهر أنه يلعب دورًا مهمًا في تكون الدم وتطور الأوعية الدموية في أسماك الزرد من خلال تثبيط meis1 [35] ، ولكن في بياناتنا تم تعديل كل من miR-144 و meis1 حتى 21 نقطة في البوصة ، مما يشير إلى آلية مختلفة . ومع ذلك ، يمكننا تأكيد إثراء GO: 0048534 لتطور الأعضاء المكونة للدم أو اللمفاوي للجينات الخاضعة للتنظيم في الاستجابة المبكرة والمتأخرة والمتوسطة ، وهو ما يتطابق مع ديناميكية miR-144 ودورها في تكون الدم. في حين أنه يمكن الافتراض بأن هذه الجزيئات الدقيقة تعيق عملية التجديد ، فإننا نعتقد أن التنظيم السفلي للجينات في المجموعتين 3 و 5 ينتمي إلى عملية تجديد منسقة بشكل جيد وهي ضرورية في البداية عندما يكون الانتشار أكثر أهمية.

من ناحية أخرى ، كان miR-218b خاضعًا للتنظيم في البداية وارتبطت جيناته المستهدفة (التي تخضع للتنظيم الأعلى) بتكرار الحمض النووي (الشكل التكميلي S5). في السرطان ، يعمل مير -218 كمثبط للورم عن طريق تثبيط التكاثر والهجرة في خلايا الورم الدبقي [36] وسرطان المثانة [37] وسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة [38] ، مما يشير إلى آليات مماثلة فيما يتعلق بالتكاثر.

علاوة على ذلك ، يمكن ربط التنظيم السفلي لعائلة miR-148/152 بالتنظيم الأعلى للجينات المشاركة في الغالب في عمليات الانتشار (المجموعة 2) ، مما يشير إلى دور مثبط للتكاثر أثناء تجديد القلب في الزرد. أيضًا ، في عملية التسرطن ، وجد أن miR-148 يمنع الانتشار من خلال استهداف الجينات المؤيدة للتكاثر وبالتالي العمل كقمع للورم [39] ، مشيرًا إلى دور مماثل وإمكاناته متعددة الوظائف. كما تم ربطه بقمع الهجرة والغزو في الخلايا السرطانية [39] ، والتي تلعب دورًا مهمًا مرة أخرى في تجديد القلب [13]. في 160 نقطة في البوصة ، تم تنظيم miR-148/152 ، مما يشير إلى وجود آلية إيقاف محتملة لعمليات الانتشار.

علاوة على ذلك ، حددنا التنظيم السفلي لعائلة miR-19 باعتباره التنظيم الرئيسي لزيادة الانتشار (المجموعة 2) ، حيث لوحظ سابقًا أن miR-19b خاضع للتنظيم المنخفض أثناء تجديد قلب الزرد [24].

من بين منظمات miRNA المعروفة لتجديد قلب الزرد ، أكدنا الدور المهم لعائلة miR-133 ، التي ثبت أن نضوبها يعزز تكاثر CM [23]. لقد ثبت أن MiR-26a يستهدف منشطات دورة الخلية ويحفز التثبيط تكاثر خلايا عضلة القلب في قلوب الفئران بعد الولادة [25] مما يؤكد أهميته في تجديد قلب كل من أسماك الزرد والفئران.

بالنسبة إلى miR-101a ، يمكننا تأكيد ديناميكيات التعبير المماثلة في قلوب أسماك الزرد المصابة كما ورد سابقًا [24]. في حين أن miR-101a هو مبدئيًا (1 & # x020133 dpi) خاضع للتنظيم بعد البتر ويظهر أنه يعزز تكاثر CM [24] ، إلا أنه يظل خاضعًا للتنظيم حتى 120 نقطة في البوصة بعد الإصابة بالتبريد. في وقت لاحق بعد البتر (7 & # x0201314 نقطة في البوصة) ، تصبح miR-101 منظمة أكثر من القلوب غير المصابة ، والتي يمكن أن تترافق مع إزالة الأنسجة الندبية [24]. ومع ذلك ، في الأسماك المصابة بالتبريد ، لا يحدث التنظيم الأعلى حتى 160 نقطة في البوصة ، مما يشير إلى استجابة تجديد مماثلة ولكن أبطأ بكثير مقارنة بتجارب الاستئصال (الشكل التكميلي S5).

مرشح معروف آخر هو miR-29b الذي يثبط الجينات المشاركة في ECM ، مما يؤكد النتائج في الفئران ، حيث تبين أن التنظيم المنخفض لعائلة miR-29 ينظم التليف بعد احتشاء عضلة القلب [31].

أيضًا ، وجد أن miR-142a يلعب دورًا مهمًا في سلامة الأوعية الدموية وتكوين الأوعية في النمو ، حيث يؤدي الإفراط في التعبير إلى فقدان هذه الوظائف [40]. ومن المثير للاهتمام أن miR-142a يتم تنظيمه أثناء تجديد القلب ، مما يشير إلى أن miR-142 مضاد لتجدد القلب. ومع ذلك ، قد يكون فقدان هذه العمليات ضروريًا أيضًا لبداية الاستجابة.

أخيرًا وليس آخرًا ، حددنا miR-16c باعتباره لاعبًا جديدًا لتجديد القلب في أسماك الزرد مع ارتباط بعمليات دورة الخلية.

للبحث في إمكانات الأنواع المتقاطعة للمرشحين المحددين في عمليات تكاثر تجديد قلب الزرد ، قمنا بمقارنة نتائجنا مع خط خلية H9c2 متمايز يفقد قدرته على التكاثر مع التمايز المستمر [33]. ومن المثير للاهتمام ، وجدنا ارتباطًا مهمًا بين جينات المجموعة 2 في الزرد والجينات الخاضعة للتنظيم السفلي في خلايا الفئران المتمايزة التي تشبه CM ، حيث يشارك كلاهما في عمليات الانتشار. علاوة على ذلك ، كانت الجينات المستهدفة للـ miRNAs المشاركة في تجديد قلب الزرد مرتبطة بالجينات الخاضعة للتنظيم في النمط الظاهري غير التكاثري للخلايا الشبيهة بـ CM المتمايزة ، مما يشير إلى آليات مماثلة فيما يتعلق بالتكاثر. ومع ذلك ، فإن miRNAs المرتبطة بالانتشار في خط الخلايا H9c2 تضمنت فقط عائلة miR-133 كلاعب مشترك بين الزرد والفئران ، مما عزز دورها المهم في الانتشار لكل من النوعين والتصاميم التجريبية. علاوة على ذلك ، تضمن التحليل miR-125a ، والذي وجد أنه يمنع الانتشار في الخلايا العضلية C2C12 من خلال استهداف E2F3 [41] ، وهو تفاعل يمكننا تأكيده في خط الخلية H9c2 (الشكل 6 د) و miR-128 ، والذي تم تحديد الخسارة لـ تعزيز انتشار CM وتجديد القلب في الفئران بعد الولادة [42]. يمكن تفسير التناقضات بين الكائنات الحية المدروسة من خلال (1) الإعدادات التجريبية: في الجسم الحي مقابل في المختبر. لم يتم التعبير عن معظم miRNAs التي لعبت دورًا مهمًا في الإعداد الحي لأسماك الزرد في الإعداد المختبر لخط خلية H9c2. في المقابل ، تم التعبير عن جميع miRNAs في نموذج فأر في الجسم الحي [25]. (2) تكوين الخلية: قلوب كاملة مقابل الخلايا العضلية التي تتمايز إلى خلايا تشبه CM ، (3) الاختلافات في مواقع ربط ميرنا بين الأسماك والفئران [22] و (4) محفز / توقف الانتشار: cryoinjury مقابل التمايز . كل هذه يمكن أن تؤدي إلى تعبير مختلف عن ميرنا ، مما يعوق التحليل المقارن بين النظامين. علاوة على ذلك ، من أجل التغلب على هذه التناقضات ، سنجري مزيدًا من تجارب التحقق من صحة ميرنا المرشحة المتوقعة في أسماك الزرد ، على سبيل المثال ، باستخدام morpholino oligos لمنع ميرنا ، لفهم التأثير الفعلي لل miRNAs المتوقعة في تجديد القلب.


3 المواد والأساليب

3.1 مجموعات البيانات

3.1.1 MiRNAs وجيناتها المستهدفة

توفر الكثير من قواعد البيانات العامة معلومات مستهدفة لـ miRNAs ، مثل TarBase (Vlachos وآخرون.، 2015) ، TargetScan (لويس وآخرون.، 2003) ، PicTar (Krek وآخرون.، 2005) ، ميرندا (جون وآخرون.، 2004) DIANA-microT-v4 (Reczko وآخرون.، 2012) و mirDB (Wong and Wang، 2015). يضم TarBase تفاعلات الجينات ميرنا التي تم التحقق من صحتها تجريبياً ، بينما يوفر الآخرون أدوات حسابية للتنبؤ بالأهداف ميرنا. من أجل تمكين تحليل مجموعة بيانات miRNA واسعة النطاق ، نقوم بتنزيل معلومات هدف miRNA من قاعدتي بيانات ، أي microRNA.org و mirDB ، اللتان تعتمدان miRanda و MirTarget V3 كأداة للتنبؤ ، على التوالي. يوفر موقع microRNA.org (الذي تم إصداره في أغسطس 2010) أهدافًا متوقعة حسابيًا مع درجات mirSVR جيدة لكل من miRNAs البشرية المحفوظة وغير المحفوظة من www.microrna.org ، بما في ذلك 1100 miRNAs (هنا تعني `` درجة mirSVR الجيدة '' أن قيمة mirSVR هي أقل من -0.1) بينما يغطي mirDB (الإصدار 5.0 الذي تم إصداره في أغسطس 2014) عددًا أكبر من miRNAs (2588 miRNAs بشريًا). لاحظ أن قاعدتي البيانات هاتين لهما إعدادات مختلفة من الصرامة للأهداف المتوقعة. على وجه التحديد ، متوسط ​​عدد الأهداف لكل ميرنا في microRNA.org و mirDB هو 717 و 4016 ، على التوالي ، مما يشير إلى أن موقع microRNA.org لديه عتبة ثقة أقل بكثير لتحديد الأهداف.

3.1.2 بناء مجموعة معيارية للتوطين الخلوي ميرنا

قم بتنزيل جميع إدخالات miRNA البشرية البالغ عددها 7449 مع توطين خلوي منظم من قاعدة بيانات RNAlocate ، ودمجها في 1048 miRNAs فريدة من نوعها ، حيث أن miRNAs متعددة المواقع لها سجلات متعددة في قاعدة البيانات (نتحقق من الأسماء المستعارة في miRBase.org)

قم بإزالة miRNAs التي لم يتم تغطيتها في microRNA.org واحصل على 813 miRNAs ، بما في ذلك 266 منها أحادية الموقع و 547 متعددة المواقع

قم بإزالة ثلاثة مواقع أخرى ، أي الشبكة الإندوبلازمية والحويصلة خارج الخلية والنواة ، لأنها تحتوي على عدد قليل جدًا من العينات.

توزيع البيانات للمجموعة المعيارية للتوطين الخلوي ميرنا

موقع . # ميرنا.
السيتوبلازم 206
الحويصلة الدقيقة 329
ميتوكوندريا 294
نواة 319
تعميم 419
إكسوسوم 712
التصنيف الإجمالي # 2279
إجمالي miRNA # 813
موقع . # ميرنا.
السيتوبلازم 206
الحويصلة الدقيقة 329
ميتوكوندريا 294
نواة 319
تعميم 419
إكسوسوم 712
التصنيف الإجمالي # 2279
إجمالي miRNA # 813

توزيع البيانات للمجموعة المعيارية للتوطين الخلوي ميرنا

موقع . # ميرنا.
السيتوبلازم 206
الحويصلة الدقيقة 329
ميتوكوندريا 294
نواة 319
تعميم 419
إكسوسوم 712
التصنيف الإجمالي # 2279
إجمالي miRNA # 813
موقع . # ميرنا.
السيتوبلازم 206
الحويصلة الدقيقة 329
ميتوكوندريا 294
نواة 319
تعميم 419
إكسوسوم 712
التصنيف الإجمالي # 2279
إجمالي miRNA # 813

3.1.3 مجموعات البيانات المعيارية لرابطة أمراض ميرنا

خلال العقد الماضي ، تم تطوير الكثير من الأساليب الحسابية للتنبؤ بجمعيات مرض ميرنا ، وتم دمج العديد من قواعد البيانات العامة ومجموعات البيانات المعيارية ، مثل HMDD (Li وآخرون.، 2013) و miR2Disease (جيانغ وآخرون.، 2009) ، والتي تضم جمعيات أمراض ميرنا المذكورة في الأدبيات الموجودة.من أجل مقارنة مقياس التشابه الوظيفي المقترح مع المقاييس الأخرى ، نختار مجموعتين من المعايير المستخدمة على نطاق واسع ، ونطلق عليها اسم Data1 و Data2 على النحو التالي.

البيانات 1 يحتوي على جميع السجلات في قاعدة بيانات HMDD (الصادرة في سبتمبر 2009) التي أنشأها وانج وآخرون. (2010) ، بما في ذلك 1616 جمعية أمراض ميرنا. من أجل توليد درجات MISIM (mi RNA sim ilarity) ، وانغ وآخرون. (2010) دمج السجلات مع نفس miRNAs الناضجة (مثل hsa-mir-376a-1 و hsa-mir-376a-2) ، ثم تضم المجموعة 1395 جمعية ، تغطي 271 miRNAs و 137 مرضًا. في هذه المجموعة ، 267 miRNAs لها معلومات مستهدفة في microRNA.org. وبالتالي ، فإن مجموعة البيانات النهائية المستخدمة في تجربتنا تشمل 1388 جمعية و 267 miRNAs و 137 مرضًا.

البيانات 2 في البداية من HMDD و miR2Disease بواسطة Jiang وآخرون. (2010) ، ويحتوي على 270 جمعية لأمراض الرنا الميكروي تم التحقق منها تجريبياً. بعد ذلك ، استخدم Chen and Zhang (2013) مجموعة البيانات هذه للتحقق من صحة أساليبهم المقترحة ، PBSI و MBSI و NetCBI ، والتي تعتمد أيضًا على MISIM ، وقاموا بإزالة 19 miRNAs التي لم يتم تغطيتها في MISIM ، وبالتالي تبقى 242 miRNA –رابطات ، بما في ذلك 99 miRNAs و 51 مرضًا. من أجل مقارنة نتائجنا بهذه الطرق الثلاثة ، نعتمد المجموعة المخفضة (242 ارتباطًا) في تجاربنا ، حيث يتم تغطية جميع miRNAs في miRGOFS.

3.2 الطرق

3.2.1 تشابه مصطلح GO

كما هو مذكور في القسم 2.1 ، بالنسبة للطرق المستندة إلى IC ، يتم قياس تقارب زوج من مصطلحات GO عادةً بواسطة IC لأسلافهم المشتركين الأدنى (LCAs). في هذه الدراسة ، لا نأخذ في الاعتبار LCAs فحسب ، بل أيضًا HCDs (السلالة الأكثر شيوعًا) ، والتي غالبًا ما تم إهمالها في الدراسات السابقة. يتم توضيح أهمية المعلومات التابعة في الشكل 1. بالنسبة للزوجين ، (أ1, أ2) و (ب1, ب2) ، فإن LCAs هي سلفهم المجاور ، ه، لكن الهيكل المحلي أسفل الزوجين مختلف تمامًا. فيما يبدو، أ1 و أ2 أكثر تشابهًا من ب1 و ب2.

مثال لزوجين من العقد التي لها نفس السلف ولكن بنية محلية مختلفة للأحفاد

مثال لزوجين من العقد التي لها نفس السلف ولكن بنية محلية مختلفة للأحفاد

وفقًا لتعريف LCA (Bender وآخرون.، 2005) ، إذا كانت العقدة سلفًا مشتركًا لـ x و ذ، وليس سلفًا لأي سلف مشترك آخر x و ذ، ثم تنتمي العقدة إلى مجموعة LCA. يمكن تعريف مجموعة HCD بالقياس. على سبيل المثال ، في الشكل التكميلي S1 ، GO: 0006119 هو HCD لـ GO: 0006091 و GO: 0016310 ، و GO: 000977 هو أيضًا HCD منهم على الرغم من أنه أقل من GO: 0006119 في DAG.

من السهل تبرير هاتين القاعدتين. بشكل عام ، بالنسبة إلى زوج من مصطلحات GO ، فكلما زاد عدد LCAs / HCDs التي يشاركونها ، زاد تشابههم. وفقًا لقاعدة التقاطع ، سيؤدي المزيد من LCAs إلى مجموعة أصغر تحتوي على محتوى معلومات أعلى بينما باستخدام قاعدة الاتحاد ، يؤدي المزيد من HCDs إلى مجموعة أكبر ذات محتوى معلومات أقل. ويؤدي ارتفاع IC من LCAs وانخفاض IC لـ HCDs إلى درجة تشابه كبيرة ، كما هو موضح في Eq. (3).

لتوضيح هاتين العمليتين المجموعتين ، نقوم باستخراج GO DAG الجزئية من قاعدة بيانات GO كما هو موضح في الشكل التكميلي S1. خذ زوج GO: 0006091 و GO: 0016310 كمثال ، هما LCAs لـ GO: 0042773 و GO: 0009777. تتضمن مجموعة التقاطع لأحفادهم GO: 0006119 ، GO: 0009777 ، أحفاد GO: 0006119 والأحفاد من GO: 0009777 ، بينما تتكون مجموعة اتحاد أحفادهم من جميع أحفاد GO: 0006091 و GO: 0016310. من الواضح أن مجموعة التقاطع من LCAs لن تكون فارغة أبدًا ، والتي تحتوي على الأقل على زوج الاستعلام من العقد. ومع ذلك ، قد لا يحتوي فترتا GO على HCD على الإطلاق. في مثل هذه الحالة ، مكافئ. (3) سوف تتدهور إلى مجموع المصطلحين الأولين.

3.2.2 التشابه بين miRNAs

يتم تنفيذ طريقة miRGOFS في C # باستخدام مكتبة المهام المتوازية (TPL) ، والتي تتيح تشغيل خيوط متعددة بشكل متوازٍ. وكود المصدر متاح على https://github.com/yangy09/MiRGOFS.

3.2.3 حكم الاستدلال

نظرًا لقيم الارتباط ، نستخدمها لرسم منحنى ROC لتقييم الأداء في التنبؤ برابطة مرض ميرنا ، والتي تحتوي على عدد كبير من الملصقات (الأمراض) بينما بالنسبة للتوطين الخلوي ميرنا ، نتعامل معها على أنها مشكلة تصنيف متعددة التسميات ، وتحويل قيم الارتباط إلى متجهات الميزات كما هو مقترح في Zhou وآخرون. (2017). افترض أن هناك ما مجموعه ك المواقع ، نقوم بإنشاء ملف ك-Dim vector لكل ميرنا ، حيث تكون عناصر المتجه هي قيم الارتباط بـ ك مواقع على التوالي. نظرًا لأن فئات GO الثلاث ، BP و MF و CC ، تنتج أوجه تشابه مختلفة لـ miRNAs ، والتي قد تكون متكاملة مع بعضها البعض ، فإننا ننتج ك- ناقلات قاتمة لكل فئة GO ودمجها كمتجه (3 × ك) -Dim.


كيف يشجع الحمض النووي الريبي غير المشفر نمو السرطان والورم الخبيث

قال باحثون في جامعة كارولينا الجنوبية الطبية (MUSC) في مقال نُشر على الإنترنت قبل الطباعة إن الآلية التي تدفع جينًا معينًا لإنتاج شكل غير مشفر من الحمض النووي الريبي بدلاً من بديله المشفر للبروتين يمكن أن تعزز نمو السرطان. في 21 أغسطس 2017 بواسطة بيولوجيا خلية الطبيعة. يمتص الحمض النووي الريبي غير المشفر الرنا الميكروي الذي يمنع انتقال الظهارة إلى اللحمة المتوسطة ، وهي إحدى السمات الرئيسية لتطور الورم.

من جين واحد ، يمكن للخلايا في كثير من الأحيان إنتاج أشكال مختلفة من الحمض النووي الريبي. يجب قطع النسخة الدقيقة قبل الحمض النووي الريبي لخيط واحد من الحمض النووي في الجين وتجميعها في شكلها النهائي من الحمض النووي الريبي ، أو عدة أشكال ، في عملية تُعرف باسم التضفير البديل. ومع ذلك ، في حين أن هذه الأشكال البديلة من الحمض النووي الريبي يمكنها تشفير بروتينات مختلفة ، يكتشف العلماء أن العديد من أنواع الحمض النووي الريبي لا تفعل ذلك ، وبدلاً من ذلك تؤدي وظائف مختلفة إلى حد كبير تنظم مصير الخلية وسلوكها. على سبيل المثال ، تحتوي MicroRNAs على بعض أنواع RNA المشفرة للبروتين وتساعد في تحللها.

إنها فئة أخرى ، تسمى RNAs طويلة غير مشفرة (lncRNA) ، وهي ذات أهمية خاصة لفيليب إتش هاو ، دكتوراه ، رئيس قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية ، ورئيس Hans and Helen Koebig في طب الأورام في مركز السرطان MUSC هولينجز. وجد Howe وفريقه أنه يمكن تقطيع ما قبل RNA لبروتين يسمى PNUTS لتشكيل lncRNA الذي يساهم في تطور السرطان. لا يقوم PNUTS lncRNA بتشفير البروتين ، بل يمتص مثل الإسفنج جزيءًا دقيقًا معينًا من الحمض النووي الريبوزي (microRNA) والذي عادة ما يكون مهمته منع انتقال الظهارة إلى اللحمة المتوسطة ، وهي سمة أساسية لنمو الورم وانتشاره.

ربطت مجموعة Howe عددًا من النقاط لشرح كيفية حدوث ذلك. أولاً ، وجدوا أن خلايا سرطان الثدي تحتوي على PNUTS lncRNA أكثر من الخلايا الظهارية للثدي الطبيعي - وهي علامة أولية جيدة على أن الحمض النووي الريبي غير المشفر مرتبط بتطور السرطان. كانت هذه الخلايا أيضًا أكثر لحمة متوسطة ، مما يعني أنها كانت أكثر عرضة لتشكيل الأورام.

قاموا بعد ذلك بفحص بروتين نووي ريبوني يسمى hnRNP E1 ، والذي يرتبط بما قبل الحمض النووي الريبي ويثبط التضفير البديل. الأهم من ذلك ، أنهم عرفوا أن TGF-beta ، الذي يتم إطلاقه بكميات كبيرة بواسطة الخلايا السرطانية ، يمكن أن يمنع ارتباطه ، مما قد يسمح بصنع أشكال بديلة. تنبأت نماذج الكمبيوتر بأن هذا البروتين النووي يمكن أن يرتبط بـ PNUTS pre-RNA في موقع التضفير البديل. في خطوط خلايا سرطان الرئة والثدي ، أكدت تحقيقات RNA المصممة خصيصًا أن موقع الربط الدقيق هذا كان أكثر تعرضًا عندما تم هدم البروتين النووي وأن تلك الخلايا تحتوي على المزيد من PNUTS lncRNA. عندما تعرضت الخلايا لـ TGF-beta بمرور الوقت ، تم تصنيع PNUTS lncRNA بكميات متزايدة. اتضح أن البروتين النووي كان مرتبطًا بشكل أكثر إحكامًا بموقع اللصق البديل. في الظروف العادية ، سمح هذا بتصنيع بروتين PNUTS ، ولكن في الأورام ، تعرض موقع اللصق البديل وتم صنع المزيد من lncRNA بدلاً من ذلك.

ومع ذلك ، أرادت المجموعة أن تؤكد بالضبط كيف يمكن أن تشجع PNUTS lncRNA على تكوين الورم. تنبأت عمليات المحاكاة الحاسوبية الإضافية ، بناءً على تسلسلها ، بوجود سبعة مواقع محتملة على PNUTS lncRNA لربط microRNA-205. يربط هذا الرنا الميكروي ويدمر منظمًا نسخيًا يسمى ZEB1 يشجع الخلايا على الانفصال عن بعضها البعض والانتشار - وهي خطوة رئيسية تسمح بحدوث الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة. كما هو متوقع ، بدون مواقع الربط المحتملة هذه ، لم يتمكن lncRNA و microRNA من الارتباط معًا. ساعد هذا الخلايا على الالتصاق ببعضها البعض والانتشار بشكل أقل ، حتى مع إضافة TGF-beta لدفعها للانتشار.

يبدو أن PNUTS lncRNA كان يمتص microRNA-205 ، الذي حرر ZEB1 لتشجيع الخلايا على العمل مثل الأورام. للتأكد من أن هذا كان صحيحًا ، علقت المجموعة جزيئات الفلورسنت على ZEB1 لتتبعها ووجدت أن المزيد منها كان موجودًا عندما كان هناك المزيد من PNUTS lncRNA.

كما هو متوقع ، كشفت النماذج قبل السريرية أن أورام الثدي والرئة نمت بشكل أسرع وأكبر عندما تحتوي خلاياها على المزيد من PNUTS lncRNA. من خلال ربط جميع النقاط ، أظهرت مجموعة Howe أن جينًا واحدًا يمكن أن يصنع إما RNA مشفرًا للبروتين أو RNA طويل غير مشفر. مع TGF-beta ، امتص lncRNA microRNA-205 مثل الإسفنج ، مما أدى إلى تحرير ZEB لدفع التحول الظهاري إلى اللحمة المتوسطة ، وهو حدث مهم في تطور السرطان وانتشاره.

هذه هي الدراسة الأولى التي تُظهر بالضبط كيف يقود TGF-beta السرطان من خلال تكوين RNA طويل غير مشفر. يجري Howe وفريقه تجارب للعثور على رنا طويلة أخرى غير مشفرة تتبع نفس الآلية في السرطان ، بهدف تطوير علاجات لاستهدافها.

يقول Howe: "توقعي هو أن هذه الآلية لم تتطور لصنع رنا طويل واحد غير مشفر". "من المحتمل أن يكون هناك آخرون تم إنشاؤها بنفس الطريقة."


مقدمة

ابيضاض الدم الليمفاوي ب المزمن (CLL) ، وهو أكثر أنواع اللوكيميا شيوعًا في الدول الغربية 1 ، يتميز بأعداد مرتفعة من الخلايا البائية النسيليّة المنتشرة. كان يُنظر إليه بشكل كلاسيكي على أنه ناتج عن تراكم الخلايا البائية ذات الحد الأدنى من التجديد الذاتي كنتيجة لموت الخلايا المبرمج المعيب. 2 ، 3 عادة ما تكون معظم خلايا CLL الطرفية في G0/ ز1 يميل إلى أن يكون مستريحًا حركيًا ، ويتم تنشيطه ظاهريًا ومحفزًا للحساسية وظيفيًا مع انخفاض مستويات مكونات مستقبلات مستضد الخلايا البائية IgM و IgD و CD79b مع معظم الخلايا B الخبيثة أكثر من التعبير عن بروتين سرطان الغدد الليمفاوية B المضاد للخلايا B 2 (Bcl-2). 4 ، 5 ، 6 ومع ذلك ، تشير الدلائل الحديثة إلى أن CLL ليس مرضًا ثابتًا ينتج ببساطة عن تراكم الخلايا الليمفاوية طويلة العمر ، ولكن كعملية ديناميكية تتكاثر فيها الخلايا وتموت ، غالبًا عند مستويات ملحوظة. يُظهر 7 CLL مسارًا سريريًا شديد التباين يمتد من السلوكيات العدوانية السريعة إلى السلوكيات البطيئة تمامًا. 5 تم وصف العديد من الواسمات البيولوجية التي يمكن أن تتنبأ بالمسار السريري وهي مفيدة لفصل المرضى إلى مجموعتين رئيسيتين وفقًا للحالة الطفرية للجين المناعي ثقيل السلسلة متغير المنطقة (IgVح) ، ومستويات التعبير عن ZAP-70 tyrosine kinase و CD38 + ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 بالإضافة إلى وجود تشوهات خلوية ، مثل عمليات الحذف 11q أو 17p. 12 المرضى الذين يعانون من الحيوانات المستنسخة التي لديها IgV غير متحول (NM)ح الجينات أو ذات التعبير العالي عن حذف CD38 أو ZAP-70 و / أو 11q أو 17p غالبًا ما يكون لها مسار قاتل سريعًا على الرغم من العلاج العدواني ، في حين أن المرضى الذين يعانون من استنساخ متحور (M) أو تعبير CD38 أو ZAP-70 منخفض وليس لديهم تشوهات خلوية ضارة لديهم مسار بطيء وكثيرا ما يموتون بسبب أمراض لا علاقة لها. على الرغم من التطورات الحديثة في بيولوجيا CLL ، فإن الآلية الجزيئية المشاركة في بدايتها وتطورها لا تزال بعيدة المنال. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد فئة جديدة من الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر الذي يطلق عليه microRNAs (miRNAs) في النباتات والحيوانات. 13 ، 14 miRNAs الناضجة بطول 19-24 nt تنظم التعبير الجيني المستهدف بعد النسخ من خلال الاقتران الأساسي داخل مناطق 3′-UTR من RNAs المرسل المستهدف الذي يؤدي إلى التدهور و / أو تثبيط الترجمة. 13 ، 15 على الرغم من أن الوظائف البيولوجية للـ miRNAs ليست مفهومة تمامًا بعد ، فقد ثبت أنها تشارك في تنظيم توقيت النمو ، وموت الخلايا ، وتكاثر الخلايا ، والتمثيل الغذائي للدهون ، وتكوين الدم ، وتشكيل الجهاز العصبي. تشير النتائج التي توصلت إليها أن أكثر من نصف الجزيئات المجهرية البشرية المعروفة تقع في مناطق مرتبطة بالسرطان في الجينوم إلى أن الجزيئات المجهرية قد تلعب دورًا واسعًا في التسبب في الإصابة بالسرطان. 17 بما يتفق مع هذه الفكرة هو التعبير الشاذ الملحوظ عن mRNAs في أنواع فرعية مختلفة من السرطان ، بما في ذلك سرطان الغدد الليمفاوية في بوركيت ، و 18 سرطان القولون والمستقيم ، و 19 سرطان الرئة ، و 20 سرطان الثدي 21 ، والورم الأرومي الدبقي. 22 تشير الأدلة التجريبية المتزايدة إلى أن الجزيئات المجهرية إما كجينات مسرطنة أو مثبطات للورم. 23 ، 24 ، 25 ، 26 في الآونة الأخيرة ، تم استخدام استراتيجيتين مختلفتين لتشكيل تعبير ميرنا في CLL. من خلال نهج ميكروأري ، ارتبط توقيع تعبير محدد يتكون من 13 miRNAs ، بما في ذلك miR-15a و miR-16 ، بالعوامل النذير ذات الصلة. 29 عقب تقرير بي سي إل -2 كهدف فسيولوجي لهذين الميكرناين ، تم اقتراح دور مير -15 أ و مير -16 في التسبب في الإصابة بسرطان الروماتيزم من خلال تنظيم بي سي إل -2. ومع ذلك ، كشفت التقارير الأخيرة أن الانخفاض الكبير في مستويات التعبير miR-15 و / أو miR-16 في CLL لم يوازيه أي تغيير كبير في بي سي إل -2. في دراسة حديثة أخرى باستخدام استراتيجية قائمة على الاستنساخ ، أظهر ملف تعريف التعبير الشاذ للـ miRNAs في CLL أن miR-21 و miR-150 و miR-155 قد تم التعبير عنها بشكل مفرط. 28 تعتبر أساليب Microarray قوية للتحليل العالمي ولكن لها قيودًا تقنية عند استخدامها مع miRNAs نظرًا لحجمها القصير وتشابه التسلسل بين أفراد الأسرة. بالإضافة إلى ذلك ، والأهم من ذلك ، يتم توجيه دراسات ميكروأري نحو miRNAs المبلغ عنها ، باستثناء تحليل المرشحين غير الموضحين. لذلك ، لاكتساب نظرة ثاقبة على دور miRNAs في CLL ، استخدمنا نهجًا قائمًا على الاستنساخ جنبًا إلى جنب مع فحوصات اللطخة الشمالية الصارمة لدراسة الحمض النووي الريبي الصغير من مرضى CLL. تظهر نتائجنا التقلب العالمي لمستويات التعبير عن ميرنا في خلايا CLL مقارنة بالخلايا B الطبيعية وتحديد خمسة مرشحين جدد من خلايا الحمض النووي الريبي من خلايا CLL. ترتبط التغييرات الملحوظة بإفراط كبير في التعبير عن miR-155 بالاشتراك مع تقليل miR-181a ، Let-7a و miR-30d. والجدير بالذكر أن المظهر التفاضلي لتعبير ميرنا يرتبط بالعوامل النذير الجزيئية والمسار السريري في CLL.


الملخص

تشارك تعديلات MicroRNA (miRNA) في بدء السرطان البشري وتطوره. يمكن تفسير أسباب التعبير التفاضلي الواسع النطاق لجينات ميرنا في الخبيثة مقارنة بالخلايا الطبيعية من خلال موقع هذه الجينات في المناطق الجينومية المرتبطة بالسرطان ، من خلال الآليات اللاجينية والتغيرات في آلية معالجة ميرنا. حدد تحديد ملامح تعبير MiRNA للأورام البشرية التوقيعات المرتبطة بالتشخيص ، والتدريج ، والتقدم ، والتشخيص ، والاستجابة للعلاج. بالإضافة إلى ذلك ، تم استغلال التنميط لتحديد جينات ميرنا التي قد تمثل أهدافًا لاحقة للمسارات الورمية المنشطة ، أو التي تستهدف جينات ترميز البروتين المتورطة في السرطان.


التنميط ميرنا: كيفية تجاوز الصعوبات الحالية في تشخيص وعلاج الساركوما

تنقسم الساركوما إلى مجموعة بها تعديلات معينة ومجموعة ثانية تقدم نمطًا نوويًا معقدًا ، يصعب تشخيصه أحيانًا أو تتوفر خيارات علاجية قليلة. قمنا بتقييم ما إذا كان التنميط ميرنا بواسطة صفائف TaqMan منخفضة الكثافة يمكن أن يتنبأ باستجابة الساركوما العضلية المخططة غير المتمايزة (RMS) وساركوما العظام للعلاج. لقد أظهرنا أن توقيعات miRNA استجابةً لعامل علاجي (العلاج الكيميائي أو مثبط mTOR RAD-001) كانت خاصة بالخلية والأدوية على خطوط الخلايا ونموذج ساركومة عظمية الفئران. ارتبط توقيع ميرنا هذا بحساسية الخلية أو الورم لهذا العلاج وقد لا يكون بسبب الانحرافات الصبغية ، كما يتضح من تحليل مجموعة CGH لأورام الفئران. اللافت للنظر أن التنميط ميرنا أعطى نتائج واعدة لساركوما عضلية مخطط للمريض ، تميز جميع أنواع RMS: (Pax +) أو RMS السنخية غير المتمايزة وكذلك RMS الجنيني. كما أوضحت هذه النتائج ، يظهر التنميط ميرنا كأداة تشخيص جزيئي قوية لساركوما النمط النووي المعقدة.

1 المقدمة

الساركوما هي أورام خبيثة نادرة تظهر في الأنسجة الضامة مثل الدهون والعضلات والعظام والغضاريف. وفقًا للتعديلات الوراثية الخلوية الجزيئية ، يمكن تقسيم الأورام اللحمية إلى فئتين: (1) الأورام اللحمية ذات التعديلات المحددة (الانتقال ، الطفرة الورمية) بما في ذلك ساركوما إوينغ ، وأورام اللحمية المعدية المعوية ، والساركوما العضلية المخططة السنخية (2) الأورام اللحمية ذات النمط النووي المعقد مثل الساركوما العضلية الليفية. ، أو الساركوما العظمية. الساركوما العظمية هي أورام العظام الخبيثة الأولية الأكثر شيوعًا ، وتتميز بقوتها النقيلية خاصة في مواقع الرئة ومقاومتها للعلاجات التقليدية مثل العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي [1]. حتى لو تم تحسين متوسط ​​البقاء على قيد الحياة لمرضى الساركوما العظمية من خلال الإعطاء قبل الجراحة لعوامل العلاج الكيميائي ، يوجد في الوقت الحاضر حوالي 40٪ من المرضى المستجيبين الضعيفين [2]. في الواقع ، غالبًا ما تقاوم أورام الساركوما العظمية أو تنتكس إلى العلاج الكيميائي قبل الجراحة ، ولا يوجد سوى عدد قليل من الخيارات العلاجية الممكنة وغير العلاجية بشكل عام [3]. يتم حاليًا إجراء علاج مكثف ثانٍ من العلاج الكيميائي في هذه الحالة. وبالتالي ، يبدو من الضروري تطوير أداة تشخيص للتنبؤ باستجابة الورم للعلاج الكيميائي لتجنب إدارة الأدوية غير الفعالة. هناك أيضًا حاجة لبدائل علاجية فعالة تعتمد على اكتشاف أهداف جديدة تشارك في تكوّن الأورام الساركوما العظمية.

الساركوما العضلية المخططة (RMS) هي واحدة من أكثر أنواع ساركوما الأنسجة الرخوة شيوعًا. لوحظت ثلاثة أنواع من RMS: RMS السنخي (20٪) ، RMS الجنيني (eRMS ، 60٪) ، و RMS متعدد الأشكال (20٪). يقدم 70٪ من aRMS انتقالًا محددًا لعامل النسخ Pax3 عند الطرف الثالث من FOXO1 ، مما يخلق عامل نسخ فعال قادرًا على تحفيز تكوين العضل والبقاء على قيد الحياة [4]. تقدم 10٪ aRMS انتقالًا لـ Pax7 مع FOXO1 [5]. إن التكهن بـ aRMS سيئ مقارنةً بـ eRMS ، خاصةً تلك التي تحتوي على جين الانصهار Pax3 [6].وبالتالي ، يبدو أنه من الأساسي الحصول على أداة تشخيص تحدد بدقة الأنواع الفرعية لـ RMS ، وخاصة التمييز بين Pax-aRMS و eRMS ، يصعب فصلها وفقًا لخصائص بقاء المريض ، وملفات تعريف التعبير الجيني ، ومصفوفات CGH [7].

تعد Micro-RNAs (miRNAs) مؤشرات حيوية للتشخيص واعدة بخصائص أنسجتها ومشاركتها في عملية تكون الأورام [8]. miRNAs عبارة عن جزيئات RNA صغيرة غير مشفرة يتم تصنيعها من مناطق intronic مع نطاق حجم من 16 إلى 35 نيوكليوتيد. تتم معالجتها بواسطة مجمعات محددة من البروتينات التي تحتوي على Drosha و Dicer لتنضج ودمجها أخيرًا في مجمعات RISC [9 ، 10]. تتطابق الجزيئات المجهرية الناضجة مع التسلسلات التكميلية في الرنا المرسال مما يؤدي إلى تثبيط الترجمة وتدهور الرنا المرسال المتسارع [11]. مستويات التعبير ميرنا مميزة لنسيج واحد لتنظيم التعبير الجيني أثناء النمو والتطور ، كما ظهر في الأنسجة الهيكلية وتطور العضلات [12-14]. يتم تحرير تعبيرهم أيضًا في العديد من السرطانات [15 ، 16] ، مما أدى إلى توقيع الورم ميرنا ، والذي يمكن أن يكون مفيدًا لتصنيفهم بما يتماشى مع أصل الأنسجة والتغيرات الجزيئية [17-19]. وبالتالي ، فهي تشكل حاليًا مؤشرات حيوية قوية لتشخيص السرطان [18 ، 20] مع قدرتها على الكشف عنها في مصل المريض. يمكن أن تكون أداة التشخيص غير الغازية التي تعتمد على الحمض الريبي النووي الريبي (miRNAs) في الساركوما العظمية مفيدة جدًا لتكييف بروتوكولات العلاج الكيميائي مع الخصائص البيولوجية للورم.

في هذه الدراسة ، أجرينا التنميط ميرنا لخطوط الخلايا الساركوما ، البشرية أو أورام الفئران ، لتقييم ما إذا كانت ميرنا يمكن أن تشكل مؤشرات حيوية قوية لتجاوز القيود الحالية لتشخيص الساركوما العضلية المخططة وعلاج الساركوما العظمية. تم تحديد مستويات تعبير miRNA باستخدام بطاقات ميكروفلويديك التي تقوم بأداء صفيفات TaqMan منخفضة الكثافة عالية الإنتاجية (TLDA) ، وهي مقايسات PCR الكمية في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) استنادًا إلى تقنية TaqMan. درسنا أولاً تأثيرات عوامل العلاج الكيميائي المختلفة على ملامح خلية ساركوما عظمية ميرنا لاحظنا أن توقيعات ميرنا هذه كانت خاصة بالخلية ومخصصة للأدوية. كشفت مجموعة CGH من أورام الساركوما العظمية التي تم الحصول عليها من نموذج الفئران أن توقيع ميرنا ، المحفوظ في الفئران والخلايا البشرية ، كان مستقلاً عن إعادة ترتيب الكروموسومات ، مما يشير إلى أن ملامح ميرنا مرتبطة بالأنماط الظاهرية للورم بدلاً من خلفيتها الجينية. من الأهمية بمكان ، تحديد توقيع ميرنا في أورام الساركوما العضلية المخططة من المرضى وفقًا للانتقال الجزيئي Pax3 أو Pax7. كان هذا التوقيع في الواقع أداة فعالة لتمييز RMS السنخي (Pax-) عن RMS الجنيني ، لا يمكن تمييزه بواسطة التقنيات الجزيئية المستخدمة حاليًا. في الختام ، يشكل توصيف ميرنا تقنية واعدة كبديل أو شريك للتقنيات الجزيئية المعتادة للتغلب على الصعوبات الحالية في تشخيص وعلاج الأورام اللحمية.

2. الإجراءات التجريبية

2.1. أورام الساركوما العضلية المخططة البشرية

تم تضمين سبعة عشر مريضًا تم علاجهم من الساركوما العضلية المخططة في مركز ليون بيرارد في هذه الدراسة. تم الحصول على أربعة أورام مجمدة وثلاثة عشر أورامًا مضمنة بالبارافين مثبتة بالفورمالين من الخزعات التي تحققت عند التشخيص. تم تحقيق تشخيص الورم من قبل أخصائي علم التشريح المرجعي لهذا المرض عن طريق الكيمياء المناعية ، FISH ، و qPCR.

2.2. خطوط الخلايا السرطانية

تم الحصول على خمسة خطوط من الخلايا السرطانية من ATCC (ماناساس ، فرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية): ساركوما عظمية بشرية MNNG / HOS Cl # 5 [R-1059-D] (المرجع CRL-15-47) و Saos-2 (HTB-85) الخلايا ، وخط خلية الساركوما الغضروفية SW1353 (HTB-94) وخلايا بوركيت الليمفاوية الداودي (CCL-213) وخلايا نامالوا (CRL-1432). نمت خلايا الساركوما العظمية والساركوما الغضروفية في DMEM (Gibco ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مكملًا بنسبة 10 ٪ من مصل العجل الجنيني المنحل (Lonza ، بازل ، سويسرا) ، 10 مل من البنسلين الستربتومايسين (10 U / mL / 10 ميكرومترجم / مل ، جيبكو ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، و 5 مل من الجلوتامين (200 ملي جيبكو) عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2. نمت خلايا الليمفوما في RPMI (جيبكو ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تعرضت الخلايا لـ 100 نانومتر RAD-001 (نوفارتيس) ، 50 ميكرومترM ifosfamide (ifos ، باكستر) أو 1 ميكرومترM سيسبلاتين (CDDP ، TEVA) أو 100 ميكرومترM ميثوتريكسات (MTX ، TEVA) لمدة 24 و 48 و 72 ساعة.

2.3 نموذج الفئران العظمية

تم تنفيذ إجراءات رعاية الحيوان وفقًا للإرشادات المؤسسية والوطنية. تم تخدير الحيوانات في جميع الإجراءات الجراحية والتصويرية باستخدام الأيزوفلورين / الأكسجين (2.5٪ / 2.5٪ ، حجم / حجم) (مينيرف ، إستيرناي ، فرنسا). تم وصف نموذج ساركومة عظمية الفئران القابلة للزرع والقابل للزرع سابقًا [21-23]. يحاكي هذا النموذج نظيره البشري من حيث العدوانية ، والانتشار النقيلي ، والنمط الظاهري للمقاومة الكيميائية [21-23]. تم تصنيف جميع الأورام التي تم الحصول عليها على أنها عظمية بعد التحليلات النسيجية. باختصار ، تم تطعيم شظايا الورم الصغيرة (100 مم 3) المأخوذة من منطقة ورم عظمي مفرط التكاثر في جرذان Sprague-Dawley ذات الكفاءة المناعية البالغة من العمر 3 أسابيع (Charles River Laboratories ، Wilmington ، MA ، USA). باستخدام نهج جانبي ، تم وضع جزء من الورم بالقرب من شلل الظنبوب بعد تآكل السمحاق ، ثم تم خياطة الجروح الجلدية والعضلية. بعد أربعة عشر يومًا من زرع الورم ، خضعت الحيوانات لأول مسح ضوئي 18 F-FDG PET وتم تعيينها عشوائيًا لمجموعة تحكم عولجت بمحلول ملحي أو مجموعة معالجة تعرضت لجرعة تحت الجلد من 10 مجم / كجم من ifosfamide (ifos ، Baxter ، Deerfield ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 7 أيام متباعدة (في اليومين 15 و 22 بعد زراعة الورم). تم إجراء مسح ضوئي آخر 18 F - FDG PET Scan بعد 7 أيام من إدارة ifos الثانية. تم التضحية بالحيوانات بعد أسبوع من انتهاء العلاج. تم جمع أجزاء الورم والأنسجة الطبيعية (العضلات والعظام والرئة) لاستخراج الحمض النووي الريبي.

2.4 استخراج الحمض النووي الريبي والكمي في الوقت الحقيقي PCR

تم تحلل أورام FFPE لمدة 24 ساعة في المخزن المؤقت ATL (Qiagen ، فرنسا) المضاف إليه بروتيناز K (Qiagen) عند 60 درجة مئوية في التحريض الدوراني بعد عمليات غسل مختلفة باستخدام التولوين والإيثانول و tris / EDTA بهذا الترتيب. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الورم أو الكريات الخلوية باستخدام بروتوكول استخراج الفينول / الكلوروفورم الفردي مع Trizol ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إخضاع خمسمائة نانوجرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل ميكروفلويديك التي تقوم بها شركة أبلايد بيوسيستمز (فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). باختصار ، تم عكس نسخ الحمض النووي الريبي ، باستخدام بادئات ميرنا محددة متعددة الإرسال من مجموعة Taqman MicroRNA Reverse Transcription. تتكون الخطوة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي على TLDA: يتم إدخال منتجات RT من خلال القنوات الدقيقة في الآبار المصغرة التي يتم تحميلها مسبقًا بمواد أولية ومسبار محددة مجففة. في الآونة الأخيرة ، أصدرت النظم الحيوية التطبيقية الإصدار الثاني من TLDA ، والذي يتكون من بطاقتين A و B. تم إجراء التحليلات لـ 377 miRNAs على البطاقة A و 290 على البطاقة B.

2.5 تطبيع بيانات PCR

لكل ميرنا ، تم حساب دورة العتبة (Ct) بواسطة برنامج ABI 7900 Sequence Detection System (تحليل لوحة من لوحة Ct يدويًا مع عتبة عند 0.25 وخط أساس تلقائي). تم إجراء جميع معالجات البيانات الإضافية باستخدام البرامج النصية R. تم تطبيق قطع قدره 32 لتجاهل قيم Ct المتأخرة ، باستثناء تحليل RMS. اجتاز حوالي 60 ٪ من miRNAs معايير التصفية واستخدمت لمزيد من التحليل. لكل TLDA ، تم إجراء ضوابط الجودة على البيانات الأولية عن طريق التحقق من الضوابط الداخلية واستخدام مخطط مربع ومخططات مخطط مبعثر. تم تجاهل العينات التي تحتوي على أي نوع من المشكلات حتى لا تؤدي إلى التحيز أثناء إجراءات التطبيع التالية. اختبرنا طرقًا مختلفة للتطبيع نظرًا لأن عامل التطبيع "الزائف" الموصى به mammU6 المرسوم في كل بطاقة لم يتم التعبير عنه بشكل ثابت في عيناتنا المختلفة. لم يكن التطبيع مع اثنين من miRNAs الأكثر استقرارًا التي تم تحديدها بواسطة GeNorm هو الأمثل أيضًا. أخيرًا ، تم اختيار التطبيع العالمي بواسطة الوسيط لموثوقيته على التجارب. تمت معالجة الأنسجة المتضمنة في تحليل معين تمامًا ، وتم تطبيق إجراء التطبيع بشكل منفصل لنوعي البطاقات ، A و B. وتم التحقق من توزيع البيانات الطبيعية باستخدام مخططات الصندوق ومخططات الارتباط. تم استخدام الصيغة التالية لتصحيح قيم Ct لكل بطاقة:

من خلال هذا النهج ، يمكن اعتبار القيمة المتوسطة الجديدة المشتركة بين جميع العينات نوعًا من "جين التدبير المنزلي الافتراضي" المثالي. لذلك ، يمكن استخدام طريقة ΔΔCt القياسية لتحديد الكميات النسبية (RQ) على النحو التالي:

بالنسبة لحساب Ct ، كان أكثر ملاءمة للتحليلات الإحصائية لاستخدام متوسط ​​كل Ct التي تم الحصول عليها عبر العينات لكل ميرنا ، بدلاً من استخدام ΔCt لعينة مرجعية

2.6. توقعات الهدف ميرنا

قمنا بتجميع 4 قواعد بيانات لتحديد أهداف ميرنا: TargetScan 5.1 و MiRanda و PICTAR وقواعد بيانات miRbase. تبحث قواعد البيانات هذه عن وجود مواقع 8mer و 7mer محفوظة على أجزاء 3′UTR من الرنا المرسال التي تتطابق مع منطقة البذور لكل ميرنا. كما أنه يتنبأ بفعالية الاستهداف لكل موقع مطابق. لقد أنشأنا قاعدة البيانات الخاصة بنا والتي جمعت كل ميرنا مع معرف الجين لجميع أهداف البروتين الخاصة بهم ، للفئران والبشر. لقد حافظنا فقط على الأزواج miRNA / geneID الموجودين في قاعدتي بيانات على الأقل.

2.7. تنبؤات مسارات إشارات الخلايا التي تنظمها miRNA

استخدمنا تطبيق الويب "G-language microarray" ، والذي يسمح برسم خرائط لمجموعة البيانات الجزيئية على خرائط مسار "موسوعة كيوتو للجينات والجينوم" (KEGG) [24]. نقوم أولاً بإدخال البروتينات المستهدفة للـ miRNA ومجموع قيم RQ لجميع miRNAs التي تنظم هذه البروتينات ، الموجودة بين 1 و 50 ، ثم يولد البرنامج بيانات KEGG لإنشاء رسومات FLASH لمسارات إشارات الخلية التي تشارك فيها البروتينات. تختلف شدة لون البروتين المميز باختلاف قوة تنظيمه بواسطة miRNAs.

2.8. فحص الانتشار

تم طلاء الخلايا في 96 لوحة جيدة عند 5000 خلية / بئر وتعريضها لـ 100 نانومتر RAD-001 ، 50 ميكرومترM ifosfamide ، 100 ميكرومترميثوتريكسات ، أو 1 ميكرومترم سيسبلاتين أم لا (NT). تم قياس نمو الخلية بعد 24 و 48 و 72 ساعة مع 20 ميكرومتركاشف L Cell Titer Glo المضيء (Promega ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 10 دقائق. تم تسجيل التلألؤ باستخدام قارئ Microbeta (PerkinElmer ، Fremont ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.9 لطخة ويسترن

تم تعليق الخلايا الحبيبية في محلول تحلل (Tris 50 ملي مولار درجة الحموضة 7.4 ، كلوريد الصوديوم 250 ملي مولار ، EDTA 5 ملي مولار ، NaF 50 ملي مول ، تريتون X-100 0.1٪ ، أورثوفانادات 1 ميكرومترM) بالإضافة إلى مثبطات الأنزيم البروتيني لمدة 30 دقيقة على الجليد. بعد الطرد المركزي عند 14000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ، تم غلي المواد الطافية لمدة 5 دقائق في محلول عينة Laemmli (بيوراد ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء تحليل لمحتوى البروتين على هلام متدرج بنسبة 4٪ - 12٪. بعد الفصل الكهربي ، 30 ميكرومترتم نقل بروتينات g إلكترونيًا على غشاء ثنائي فلوريد البوليفينيلدين (Immobilon P ، Millipore corp. ، Bedford ، MA ، USA). تم بعد ذلك حظر الغشاء لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة مع عامل مانع بنسبة 0.2 ٪ في PBS / Tween 0.1 ٪ ، وتم فحصه طوال الليل بجسم مضاد أولي للأرنب ضد البروتين المعني ، وكشف أخيرًا باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للأرنب HRP مترافق (Upstate Biotechnology ، ليك بلاسيد ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) ونظام ECL Advance (GEhealthcare ، شيكاغو ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على الجسم المضاد الأولي المستخدم من Cell Signaling (New England Biolabs ، Beverly ، MA ، USA) المستخدمة في 1/1000. ال β تم استخدام الأكتين كمرجع (سيجما).

2.10. صفيف CGH

تم إجراء تحليل ميكروأري المستند إلى قليل النوكليوتيد باستخدام ميكروأري لجينوم كامل الفئران مصمم خصيصًا ، 244K ، تم تصنيعه بواسطة Agilent Technologies (سانتا كلارا ، كاليفورنيا). تم إجراء وسم الحمض النووي الجيني وتهجين الصفيف والغسيل على النحو المحدد من قبل الشركة المصنعة (Agilent Technologies). تم عرض نتائج مكالمات الانحراف المكونة من ثلاث أوليغوس متتالية أو أكثر باستخدام برنامج تحليل CGH قليل النوكليوتيد المخصص (Genespring).

2.11. تحليل احصائي

تم إدخال بيانات RQ المعيارية مباشرة في موقع TIBCO Spotfire DecisionSite لبرنامج تحليل الجينوم الوظيفي. أجرينا مجموعات هرمية غير خاضعة للإشراف لتصنيف العينات حسب المجموعات. تم تحديد اختيار الجزيئات المجهرية المفيدة للتنبؤ باستجابة الورم للعلاج إحصائيًا باستخدام اختبارات ANOVA مع ص قيم .05 على الأقل. تم التحقق من النتائج من خلال المجموعات الهرمية الخاضعة للإشراف.

ثم تم استخدام البيانات من قوائم miRNA ذات الأهمية كمتغيرات في تحليل مكون رئيسي ثلاثي الأبعاد (PCA) تم إجراؤه باستخدام حزمة R 2.9.0 لإثبات قدراتها على التمييز بين أنواع الأورام. يوفر PCA صورة مبسطة ثلاثية الأبعاد لمجموعة البيانات متعددة المتغيرات الخاصة بنا لقيم miRNA RQ. من خلال الجمع الرياضي للقيم وفقًا لقوتها ، يتم إنشاء ثلاثة مكونات رئيسية تمثل قدر الإمكان تباين البيانات. وهكذا ، تمتلك الأورام ثلاثة إحداثيات جديدة في فضاء ثلاثي الأبعاد. وفقًا لتوطينها في هذا الفضاء ، تشكل الأورام مجموعات ، ويمكن التنبؤ بأنواعها الفرعية.

3. النتائج

3.1. توقيعات ميرنا لخطوط خلايا الساركوما العظمية

في دراستنا الأخيرة المنشورة في المجلة الدولية للسرطان ، أظهرنا أن خليتي الساركوما العظمية Saos-2 و CRL-15-47 (15-47) تحاكي الاستجابة البيولوجية للساركوما العظمية البشرية والأورام التي تم الحصول عليها من نموذج الفئران. في الواقع ، حددنا في نموذج الفئران الساركوما العظمية لوحة مكونة من 61 ميكرو آر إن إيه تميز الأورام باستجابة جيدة للإيفوسفاميد من أولئك الذين لديهم استجابة سيئة [25]. على أساس هذا التوقيع ، أدركنا تحليل مكون رئيسي يسمح بالتنبؤ باستجابة الورم. في مخطط PCA هذا ، يمكن أن نلاحظ أنه تم التنبؤ بخلايا Saos-2 على أنها حساسة للإيفوسفاميد على عكس 15-47 خلية (الشكل 3 (ب) [25]) ، وفقًا للنتائج التي تم الحصول عليها عن طريق اختبار الانتشار (الشكل 6 (أ) ) [25] والشكل S1). تم تأكيد ذلك من خلال تحليل PCA الذي تم تحقيقه باستخدام توقيع miRNA المحدد في الأورام البشرية (الشكل S2). لقد اعتبرنا أن هذين الخطين الخلويين كانا نموذجًا مثيرًا للاهتمام لدراسة أهمية miRNAs في استجابة الخلية للعلاج ولتحديد استراتيجيات علاجية جديدة.

3.2 توقيعات ميرنا لخطوط الخلايا السرطانية البشرية

أجرينا أولاً تحديدًا أوليًا لمرنا على نماذج خلوية مختلفة لمقارنة ملامح ميرنا لخلايا الساركوما العظمية المستخدمة في مختبرنا لأداء في المختبر التجارب ، خلايا Saos-2 و 15-47 ، مع خلايا الساركوما الغضروفية SW-1353 (chondro) وخلايا Burkitt lymphoma Daudi و Namalwa. في دراسة سابقة ، حددنا 61 miRNAs متورطة في استجابة خلايا الساركوما العظمية للعلاج [25]. لقد احتفظنا بهذه الجزيئات الدقيقة فقط لتحقيق تجمع هرمي غير خاضع للرقابة مع خطوط الخلايا السرطانية الخمسة. كما هو مبين في الشكل 1 (أ) ، كان توقيع ميرنا هذا ممثلاً لخطي خلايا ساركوما عظمية بشرية ، نظرًا لأن هاتين الخليتين تتجمعان معًا بشكل مستقل ولكن بشكل وثيق مع خلايا الساركوما الغضروفية. تم تصنيف خطوط الخلايا الثلاثة هذه في مجموعة متميزة من خليتي سرطان الغدد الليمفاوية Daudi و Namalwa. أكد هذا أن كل خط خلية سرطانية يقدم توقيع ميرنا وفقًا لأصلها ، كما هو موضح من قبل الآخرين [15 ، 16].


(أ)
(ب)
(ج)
(أ)
(ب)
(ج) كانت تواقيع الحمض النووي الريبي للخلايا السرطانية متوافقة مع أصل نسيجها ومع حساسيتها للإيفوسفاميد. (أ) حافظت هذه المجموعات الهرمية غير الخاضعة للرقابة فقط على 61 miRNAs التي ميزت خلايا الساركوما العظمية وفقًا لاستجابتها للعلاج. تتجمع خطوط خلايا الساركوما العظمية معًا بالقرب من خلايا الساركوما الغضروفية وبشكل مستقل عن خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الداودي وخلايا نامالوا. يمثل كل صف المستويات النسبية للتعبير لكل ميرنا ، ويظهر كل عمود مستويات التعبير لكل عينة. يشير اللون الأحمر أو الأخضر إلى تعبير مرتفع أو منخفض نسبيًا ، على التوالي ، بينما تشير المربعات الرمادية إلى عدم وجود ميرنا معبر. (ب) و (ج) ملامح ميرنا بعد التعرض إلى 50 ميكرومترM ifosfamide لمدة 24 ساعة. (ب) حافظت هذه المجموعات الهرمية غير الخاضعة للرقابة فقط على الـ 61 ميرنا المعبر عنها بشكل مختلف في خلايا الساركوما العظمية وفقًا لحساسيتها تجاه ifos بعد ANOVA (

). (ج) هذا التكتل الهرمي الخاضع للإشراف يحفظ miRNAs بشكل مختلف معبرًا عنه في الخلايا وفقًا لاستجابتها للعلاج بعد ANOVA (

3.3 كانت أنماط ميرنا استجابةً لعوامل العلاج الكيميائي خاصة بالخلايا

بعد ذلك ، قمنا بتقييم ما إذا تم تعديل ملفات تعريف miRNA على وجه التحديد استجابةً للعلاج الكيميائي. لقد اخترنا تعريض خلايا الساركوما العظمية وسرطان الغدد الليمفاوية إلى ifosfamide ، وهو عامل علاج كيميائي مؤلك يستخدم حاليًا في الساركوما العظمية لدى الأطفال. أظهر اختبار الانتشار بناءً على قياس ATP أن خط خلية Saos-2 الوحيد كان حساسًا بشكل معتدل لـ 50 ميكرومترM ifosfamide بعد التعرض لمدة 48 ساعة (تثبيط الانتشار حوالي 30٪) (الشكل S1). بناءً على هذه الملاحظة ، قررنا تعريض هذه الخلايا لـ 50 ميكرومترM ifosfamide لمدة 24 ساعة لتحقيق التنميط ميرنا. على أساس لوحة مكونة من 61 miRNAs تم تحديدها في دراستنا السابقة [25] ، كانت خلايا الساركوما العظمية مختلفة بشكل ملحوظ عن خلايا سرطان الغدد الليمفاوية ، مما يؤكد أن ملفات تعريف miRNA كانت خاصة بالخلية كما هو موضح في المجموعات الهرمية غير الخاضعة للرقابة في الشكل 1 (ب). يمكننا أن نلاحظ أن خلايا Saos-2 تقدم توقيعًا فريدًا من الحمض الريبي النووي الريبي (miRNA) حيث تم الإفراط في التعبير عن غالبية miRNAs (باللون الأحمر في الشكل 1 (ب)). كشفت مجموعة هرمية خاضعة للإشراف تم تحقيقها بعد ANOVA بين الخلايا الحساسة Saos-2 مقابل الخلايا المقاومة أنها تتجمع بشكل فعال وفقًا لحساسيتها لـ ifos: Saos-2 في يد واحدة ، بشكل مستقل عن 15-47 خلية وكلا خلايا سرطان الغدد الليمفاوية (الشكل 1 (ج)). أكدنا هذه الملاحظة مع عامل العلاج الكيميائي الآخر سيبلاتين. كما هو الحال سابقًا ، تم تصنيف الخلايا وفقًا لقابليتها للتأثر بـ CDDP على التجميع الهرمي الخاضع للإشراف في الشكل S3A (ANOVA): خلايا 15-47 و Namalwa ، حساسة لـ CDDP استنادًا إلى مقايسة الانتشار في الشكل S3B ، مجمعة معًا ، بشكل مستقل عن Daudi وخلايا Saos-2 مقاومة لهذا العلاج.

3.4. كانت ملامح خلايا الساركوما العظمية ميرنا محددة لكل عامل علاج كيميائي

وهكذا ، نظرًا لأن توقيعات ميرنا للخلايا غير المعالجة وكذلك الخلايا المعالجة كانت خاصة بالسرطان ، قمنا بتقييم ما إذا كان كل دواء علاجي كيميائي قد تسبب في ملف تعريف ميرنا مختلف في نفس الخلية.كما هو مقترح سابقًا لخلايا الساركوما العظمية ، أدى التعرض لسيسبلاتين و ifosfamide إلى ملفات تعريف miRNA مختلفة تمامًا. بعد تحليل إحصائي باستخدام ANOVA ، وجدنا فقط اثنين من miRNAs مشتركين في كل من توقيعات miRNA الناتجة عن ifos و CDDP في سطري الخلية (الشكل S3). في هذا السياق ، نقوم باختبار عامل ثالث سام للخلايا يتم إدارته حاليًا في أمراض الساركوما العظمية ، وهو الميثوتريكسات. كما هو مبين في المجموعات الهرمية غير الخاضعة للرقابة في الشكل 2 ، فقط الحفاظ على 61 miRNAs ذات الأهمية لاستجابة الساركوما العظمية ، كما هو موضح أعلاه ، يختلف توقيع miRNA في خليتي الساركوما العظمية Saos-2 و15-47 بشدة عن تلك التي لوحظت لـ ifsofamide و cisplatin . من المهم أن نلاحظ أن غالبية هذه miRNAs قد تم التعبير عنها بشكل مفرط في كلا خطي الخلايا استجابةً لـ MTX. كان هذا وثيق الصلة بحساسيتها تجاه MTX كما هو موضح في اختبار الانتشار في الشكل 2 (ب). باختصار ، يبدو أن تمييز miRNAs تم التعبير عنه بشكل مفرط في الخلايا بعد التعرض لعامل سام للخلايا ، والتي كانت حساسة لها ، كما ظهر أيضًا لـ ifosfamide في خلايا Saos-2 (الشكل 1 (ب)). وأكد هذا أيضًا أن الجزيئات المجهرية التي تتنبأ باستجابة الخلية للعلاج تختلف باختلاف الدواء.


(أ)
(ب)
(أ)
(ب) ملامح التعبير ميرنا كانت خلايا الساركوما العظمية محددة لكل عامل علاج كيميائي. (أ) حافظت هذه المجموعات الهرمية غير الخاضعة للرقابة على miRNAs التي تم تحديدها على أنها تمييزية لاستجابة ifosfamide بعد إزالة miRNAs التي يعتمد تعبيرها على أنواع الخلايا. يمثل كل صف المستويات النسبية للتعبير لكل ميرنا ، ويظهر كل عمود مستويات التعبير لكل عينة. يشير اللون الأحمر أو الأخضر إلى تعبير مرتفع أو منخفض نسبيًا ، على التوالي ، بينما تشير المربعات الرمادية إلى عدم وجود ميرنا معبر. (ب) تم قياس نمو الخلية بواسطة مقايسة Cell Titer GloLuminescent كما هو موضح في القسم 2.6 24 و 48 و 72 ساعة بعد التعرض لـ 100 ميكرومترميثوتريكسات. تم تمثيل النتائج على أنها النسبة المئوية المتوسطة للتكاثر الذي تم تطبيعه للخلايا غير المعالجة من تجربتين مستقلتين تم تحقيقهما في نسختين.

(أ)
(ب)
(أ)
(ب) أدى تثبيط mTOR بواسطة RAD-001 في الساركوما الغضروفية إلى تثبيط تكاثر الخلايا. (أ) تم قياس نمو الخلية بواسطة مقايسة Cell Titer GloLuminescent كما هو موضح في القسم 2.6 24 و 48 و 72 ساعة بعد التعرض لـ 100 نانومتر RAD-001. تم تمثيل النتائج على أنها النسبة المئوية المتوسطة للتكاثر الذي تم تطبيعه للخلايا غير المعالجة من تجربتين مستقلتين تم تحقيقهما في نسختين. تم إجراء اختبار فيشر ، يتوافق NS مع "غير مهم". (ب) تحليل اللطخة الغربية لتأثيرات RAD-001 على مسار mTOR في الساركوما الغضروفية وخلايا الساركوما العظمية 15-47 مكشوفة أو لا (NT) لدوكسوروبيسين (dox). 30 ميكرومترتم تحليل مستخلصات البروتين g بواسطة لطخة غربية بأجسام مضادة 1/1000 ضد الجهات الفاعلة في مسار mTOR (شكل فسفوري أم لا) (إشارة الخلية ، Beverly MA).

على أساس هذه الأولية في المختبر النتائج ، يمكننا أن نقترح أن ملفات تعريف miRNA ، نظرًا لخصوصية الأدوية الخاصة بها ، يمكن أن تكون أداة فعالة للتنبؤ باستجابة الخلايا السرطانية للعلاج. نظرًا لأن الساركوما العظمية مقاومة حاليًا للعلاجات التقليدية ، فإن التنبؤ باستجابتها لعامل واحد يمكن أن يكون تقدمًا لهذه الحالة المرضية.

3.5 استجابة الخلايا العظمية والغضروفية لمثبط mTOR RAD-001

كما أوضحت هذه البيانات السابقة ، تمكنا من تصنيف وتوقع استجابة خلايا الساركوما العظمية للعلاج الكيميائي. لم تكن الخوارزميات الخاصة بنا مثيرة للاهتمام فقط لعوامل العلاج الكيميائي ولكنها واعدة أيضًا لتحديد علاجات مستهدفة جديدة لمواجهة مقاومة الساركوما العظمية. وهكذا ، قمنا باختبار دواء فعال لعلاج الساركوما الهيكلية ، والذي يثبط بروتين mTOR المؤيد للورم ، المسمى RAD-001 (Everolimus ، Novartis). غالبًا ما يتم تنشيط mTOR بشكل شاذ في السرطانات ، ولا سيما في الساركوما الغضروفية [26] والساركوما العظمية [27]. تم وصف إشارات mTOR على أنها متورطة في تطور الورم ، ورم خبيث ، ومقاومة الأدوية [28 ، 29] وبالتالي ، فإن استهداف mTOR يمنع نمو الورم بنجاح ويجعلهم حساسين للعلاجات التقليدية [30 ، 31]. يتم اختبار RAD-001 ، الذي يعمل بطريقة مماثلة للراباميسين من خلال تثبيط مركبات mTORC1 ، في العديد من التجارب السريرية لسرطان الخلايا الكلوية (برنامج RECORD) ، والأورام الحليمية المتقدمة (RAPTOR) ، وأورام الغدد الصماء العصبية النقيلية (RAMSETE) ، أو الثدي السرطانات (بوليرو).

وهكذا ، قمنا بأداء في المختبر تجارب على خلايا الساركوما الغضروفية والساركوما العظمية باستخدام 100 نانومتر RAD-001. تم تقليل تكاثر خلايا Saos-2 والساركوما الغضروفية بنسبة 40 ٪ بعد التعرض لـ RAD-001 خلال 72 ساعة على عكس نمو الخلايا 15-47 (الشكل 3 (أ)). بالتوازي مع ذلك ، أدركنا وجود لطخة غربية مع RAD-001 على خلايا ساركوما غضروفية وخلايا ساركومة عظمية تتعلق بالجهات الفاعلة الرئيسية لمسارات إشارات خلية mTOR. أظهر هذا أن مسار mTOR تم تثبيته بواسطة RAD-001 في خلايا الساركوما الغضروفية على عكس 15-47 خلية ، ولا سيما eIF4G و p70 S6 كيناز الذي انخفض مستوى الفسفرة (الشكل 3 (ب)).

وبالتالي ، قمنا بتحليل ما إذا كانت توقيعات ميرنا لهذه الخلايا مختلفة ويمكن أن تفسر استجابتها التفاضلية لـ RAD-001. أجرينا تجميعًا هرميًا خاضعًا للإشراف بين خلايا Saos-2 غير المعالجة والساركوما الغضروفية و15-47 خلية بعد ANOVA مع. كشف هذا التجميع عن أن 16 miRNAs ميزت الساركوما الغضروفية وخلايا Saos-2 في يد واحدة والخلايا 15-47 من ناحية أخرى (الشكل 4). باستثناء miR-146 و Saos-2 والساركوما الغضروفية أفرطوا في التعبير عن هذه miRNAs المساهمة.


كانت ملامح تعبير ميرنا لخلايا الساركوما العظمية والساركوما الغضروفية متسقة مع حساسيتها لمثبط mTOR RAD-001. حافظت هذه المجموعة الهرمية فقط على ميرنا بشكل مختلف معبرًا عنه في الأورام وفقًا لاستجابتها للعلاج بعد ANOVA (

بعد ذلك ، كما أوضحنا في دراستنا السابقة حول الساركوما العظمية [25] ، يشكل التنميط ميرنا أداة فعالة لتحديد مسارات إشارات الخلايا التي تستهدف ميرنا من خلال في السيليكو مقاربة. في حالتنا ، بحثنا عما إذا كانت هذه الجزيئات الدقيقة تظهر على أنها معبر عنها بشكل مختلف في الخلايا وفقًا لاستجابتها لـ RAD-001 من المحتمل أن تستهدف مسار إشارات mTOR. أنشأنا قاعدة بيانات ، كما هو موضح في القسم 2.6 والتي تحدد الأهداف المتوقعة لهذه miRNAs الموصوفة في miRbase. بعد ذلك ، قمنا بتلخيص قيم RQ لكل ميرنا في خلايا Saos-2 والساركوما الغضروفية الحساسة لـ RAD-001 والمتسلسلة مع معرف الجين لأهداف البروتين الخاصة بهم. أخيرًا ، أدخلنا هذه البيانات في تطبيق الويب Microarray للغة G ، والذي يربط أهداف miRNA وفقًا لمشاركتها في مسارات KEGG مماثلة ، مسار mTOR في هذه الحالة. كما هو مبين في الشكل 5 ، يتم استهداف مسار mTOR بواسطة هذه الجزيئات الدقيقة وخاصةً بروتينات المصب المتورطة في إشارات VEGF وعمليات الالتهام الذاتي ، ولا سيما RICTOR و ATG1 و HIF-1a. وهكذا ، فإن خلايا Saos-2 وخلايا الساركوما الغضروفية أفرطت في التعبير عن miRNAs التي من المحتمل أن تمنع إشارات mTOR. يمكن لتثبيط هذه الجزيئات من خلال استخدام الحمض النووي المقفل (LNA) وقياس qPCR لـ RICTOR و ATG1 و HIF1a تأكيد هذا المفهوم.


تدخلت miRNAs المميزة في مسار mTOR. تمثل البروتينات ذات الألوان الصفراء والبرتقالية والحمراء أهدافًا للـ miRNAs ، ويمثل المربع الأصفر قمعًا ضعيفًا ، بينما يمثل اللون الأحمر أقصى قدر من القمع لم يتم استهداف المربعات الخضراء.

(أ)
(ب)
(ج)
(د)
(هـ)
(F)
(أ)
(ب)
(ج)
(د)
(هـ)
(F) تحليل CGH لستة أورام من نموذج الفئران الساركوما العظمية. هنا ، نمثل ستة كروموسومات من بين الكروموسومات العشرين + X الموجودة في جينوم الفئران. تم إجراء جميع التحليلات باستخدام نفس عينة العظام غير المعالجة كمرجع.

للاستئناف ، تشكل miRNAs مؤشرات حيوية قوية لتحديد مدى قابلية العلاج ويمكن أن تكون مفيدة جدًا لتحديد أهداف علاجية جديدة كبديل للعلاج الكيميائي للساركوما الغضروفية والساركوما العظمية التي غالبًا ما تكون مقاومة لهذا العلاج. في الخطوات التالية ، قمنا بتقييم ما إذا كانت هذه الملاحظات ذات صلة في الجسم الحي، مع نموذج من ساركوما عظمية الفئران وعينات المرضى.

3.6 ربما لم يكن التوقيع التنبئي للرنا الميرنا لنموذج ساركوما عظمية الجرذ مرتبطًا بانحرافات الحمض النووي

كما هو موضح في دراسات أخرى حققها أعضاء فريقنا [21 ، 22 ، 25] ، لدينا نموذج ساركومة عظمية في الفئران يحاكي علم الأمراض البشري فيما يتعلق بالعدوانية والمقاومة الكيميائية وظهور النقائل الرئوية (انظر القسم 2.6). ينتج عن علاج الحيوانات بالإيفوسفاميد مجموعتان ، الطيبة مقابل المستجيبين السيئين أو المستجيبين المعتدلين ، بنسبة أقرب إلى تلك التي لوحظت لدى المرضى. من خلال التنميط ميرنا ، تمكنا من التمييز بين الأورام الحساسة للإيفوسفاميد والأورام المقاومة لهذا الدواء وقبل كل شيء للتنبؤ باستجابة الأورام غير المعالجة بعشرة جزيئات من الحمض النووي الريبوزي من خلال استخدام الخوارزميات الإحصائية التي تم إنشاؤها في مختبرنا [25]. بعد هذه البيانات المثيرة للاهتمام ، نود أن نؤكد أن توقيع ميرنا هذا كان محددًا لاستجابة الورم للعلاج وليس مرتبطًا بخلفيات وراثية مختلفة للورم. وهكذا أدركنا تحليلاً في مصفوفة CGH باستخدام نفس الأورام المستخدمة في تحديد سمات ميرنا. قمنا بتحليل ورمين من كل نوع ، غير معالجين ، وعولجنا بإيفوسفاميد ومستجيب جيد ، أو عولجنا بإيفوسفاميد ومستجيب سيئ ، مقارنة بنفس عينة العظم غير المعالجة ، النسيج المرجعي في تحليل CGH. كانت غالبية الانحرافات الصبغية التي لوحظت في مجموعة CGH شائعة في الأورام غير المعالجة والأورام المعالجة ، بغض النظر عن استجابتها للعلاج (الشكل 6). ارتبطت بعض التشوهات المختلفة بشكل أساسي بالخصائص البيولوجية للورم الفردي.

قمنا بتجميع جميع التشوهات والتحقق منها في قاعدة البيانات "محلية الصنع" الخاصة بنا إذا كان أي جزيء من الحمض النووي الريبي (miRNA) ، الذي تم تحديده على أنه تمييز لاستجابة الورم ، موجودًا في مناطق الحمض النووي هذه. ومن المثير للاهتمام ، هذا في السيليكو كشف التحليل أيضًا أنه لا ميرنا ولا الجين كانا موجودين في الانحرافات التفاضلية القليلة التي لوحظت في هذه الأورام ، لا سيما في الكروموسوم 4 (الشكل S4) ، مما يشير إلى أن ملامح ميرنا المختلفة كانت مرتبطة إلى حد ما باستجابة الورم للعلاج وليس بسبب المنبع. إعادة ترتيب الكروموسومات. على الرغم من أننا لا نستطيع استبعاد أن بعض البروتينات العابرة المفعول يمكن تحريرها نتيجة لهذه الانحرافات ، فإن هذا يشير إلى أن جميع الأورام كانت متجانسة وأن الزيادة في بعض الجزيئات الجزيئية في الأورام الحساسة كانت بسبب تنظيمها وليس إلى تضخيم جيني.

يبدو أن التشخيص الجزيئي المعتمد على التنميط ميرنا يسلط الضوء على سلوك الورم ، أي استجابة للعلاج ، وبالتالي النمط الظاهري بدلاً من النمط الجيني مخالف لمجموعة CGH. يمكن أن تكون هاتان التقنيتان الجزيئيتان خيارين لتحسين رعاية المرضى الذين يعانون من أمراض يصعب تشخيصها حاليًا.

3.7 ارتبطت ملامح الساركوما العضلية المخططة ميرنا بأنواعها الفرعية النسيجية

أخيرًا ، لتأكيد الفكرة السابقة مع الأخذ في الاعتبار أن التنميط ميرنا يمكن أن يكون مفيدًا جدًا للتشخيصات غير المؤكدة ، أجرينا التنميط ميرنا لعينات الساركوما العضلية المخططة. في الواقع ، أظهرنا مؤخرًا أن التنميط ميرنا كان موثوقًا به لتشخيص الساركوما العظمية على 29 عينة من عينات البارافين المضمنة بالفورمالين (FFPE) للمرضى [25]. استنادًا إلى مستوى التعبير الخاص بلوحة مكونة من خمسة جزيئات من الجزيئات الدقيقة ، نجحنا في فصل المستجيبين الجيدين عن المستجيبين السيئين إلى العلاج. لذلك ، قمنا بتقييم ما إذا كانت منصة TLDA الخاصة بنا تنافسية أيضًا لتشخيص RMS. حصلنا على سبعة عشر ورمًا بما في ذلك مرضى RMS السنخية (Pax3 +) (3 مرضى) أو Pax7 + (2) ومرضى RMS الجنيني (6) ومرضى الانصهار السلبي (6). تم تشخيص جميع هذه الأورام من خلال استخدام الكيمياء النسيجية المناعية ، FISH و qPCR ، والتي تم التحقق من صحتها من قبل أخصائي علم التشريح المرجعي (الجدول S5). تكتل هرمي خاضع للإشراف على أورام الساركوما العضلية المخططة بعد أنوفا مع ص كشفت القيمة بين أنواع RMS الأربعة أن الأورام تتجمع وفقًا لتعديلاتها الجزيئية Pax3 / FOXO1 أو Pax7 / FOXO1 أو لا يوجد إزاحة ، على أساس مستوى التعبير عن 10 miRNAs (الشكل 7 (أ)). أورام (Pax +) ، خاصة تلك (Pax3 +) قد أفرطت في التعبير عن كل هذه الجزيئات. بعد ذلك ، أجرينا تحليلًا إحصائيًا باستخدام هذه الجزيئات الدقيقة العشرة بناءً على تحليل المكونات الرئيسية ، وهي طريقة تسمح بدراسة التباين بين مجموعة من المتغيرات. يتكون هذا من تعيين نظام جديد من ثلاثة إحداثيات لكل ميرنا مساهم من خلال إجراء رياضي. بعد ذلك ، يتم تعديل قيم RQ لكل ميرنا لكل ورم من خلال المعاملات الجديدة التي تم الحصول عليها مسبقًا وتلخيصها. وبالتالي ، تم تحقيق مخطط PCA ثلاثي الأبعاد مع الإحداثيات الثلاثة الجديدة لكل ورم (الشكل 7 (ب)). من خلال هذا التمثيل الرياضي ، يمكننا التمييز بين (Pax +) و aRMS سلبي الانصهار و eRMS. يشكل eRMS أيضًا مجموعة مستقلة ذات قيمة عالية للمكون 2 (ممثلة في المحور ص في الشكل 7 (ب)). تشكل aRMS السلبية الاندماج مجموعة منفصلة حتى لو كان من الصعب تصنيف بعض العينات وفقًا لتشخيصها غير المؤكد. حتى لو كان عدد العينات منخفضًا لكل مجموعة فرعية ، أظهر التحليل الإحصائي أهمية كبيرة ص القيمة بين (Pax3 +) و (Pax7 +) وبين (Pax +) و (Pax−) ، 0.05 و 0.0005 على التوالي (الشكل S6).


(أ)
(ب)
(أ)
(ب) كانت تواقيع الحمض الريبي النووي المخططي متسقة مع تغيراتها الجزيئية. (أ) هذا التجميع الهرمي الخاضع للإشراف فقط حفظ ميرنا بشكل مختلف معبرًا عنه في الأنواع الفرعية المختلفة من RMS بعد ANOVA (

أظهرنا أن التنميط ميرنا كان أداة قوية لتمييز الانصهار السلبي من RMS من الجنين. يمكن أن تكون miRNAs واصمات حيوية مفيدة لتحسين تشخيص هذا النوع من RMS ، حيث لا يمكن تمييز aRMS السلبي للانصهار حاليًا من الناحية الجزيئية عن نظام eRMS [7].

4. مناقشة

تُلاحظ توقيعات ميرنا للعديد من أنواع السرطانات ، مثل الساركوما [19] وسرطان الثدي وسرطان البروستاتا [18 ، 32]. تشكل هذه التواقيع أدوات فعالة للتشخيص والتشخيص لسرطان الدم الليمفاوي المزمن [33] أو سرطان القولون الغدي [34] أو سرطانات الرئة [35]. هنا ، أظهرنا أن خطوط خلايا الساركوما العظمية تعبر أيضًا عن أنماط ميرنا مختلفة عن تلك الموجودة في الساركوما الغضروفية وخلايا الليمفوما (الشكل 1 (أ)) والتي تسمح لنا بتمييز استجابة الخلية للعلاج الكيميائي (الأشكال 1 (ب) و 2 و S3) . بالإضافة إلى ذلك ، كانت توقيعات الساركوما العظمية ميرنا محددة للخلايا والأدوية (الشكل 2 (أ)). وقد لاحظ Song et al أيضًا خصوصية هذا الدواء في الساركوما العظمية. مع طعوم xenografts U2-OS الساركوما العظمية ، حيث تم إلغاء تنظيم miRNAs المختلفة استجابة لعوامل العلاج الكيميائي دوكسوروبيسين وسيسبلاتين وإيفوسفاميد فقط 3 miRNAs تم العثور عليها بشكل شائع محررة استجابة لجميع الأدوية [36]. مع خصوصيتها ، تشكل miRNAs مؤشرات حيوية واعدة لتوقع استجابة الورم للعلاج محل الاهتمام. كما أظهرنا مؤخرًا ، من خلال التنميط ميرنا ، تمكنا من التنبؤ باستجابة ورم الساركوما العظمية للعلاج الكيميائي لأورام الفئران وكذلك لخزعات المريض FFPE [25]. هنا ، أظهرنا أن ملامح ميرنا لخلايا الساركوما العظمية كانت متوافقة مع استجابتها لمثبط mTOR ، RAD-001 (الشكلان 3 و 4). تم تحرير miRNAs استجابة لهذا الدواء في الخلايا الحساسة ، واستهدفت بشكل فعال مسار mTOR ، ولا سيما بروتينات المصب eIF4G و p70 S6 كيناز (الشكل 3 (ب)) ، وربما RICTOR و ATG1 و HIF1a ، والتي يمكن التحقق من صحتها بواسطة qPCR التحليل (الشكل 5).

باختصار ، بدت miRNAs مفيدة جدًا في تحديد الأساليب العلاجية الجديدة المثيرة من خلال استهداف بعض أهداف بروتين miRNA أو بعض miRNAs المشاركة في تطور الورم نفسها. في المستقبل ، نود أن نؤكد تأثير هذه الجزيئات الدقيقة في استجابة العلاج في المختبر من خلال استخدام محاكاة ميرنا أو عكسياً للحمض النووي المقفل (LNA) ضد هذه الجزيئات. كما هو مذكور في هذه الدراسة ، لدينا شيء مثير للاهتمام في المختبر نموذج الساركوما العظمية ، والذي يمكننا من خلاله اختبار وظيفة ميرنا في وجود الأدوية المختلفة المستخدمة في هذا العمل. بعد التحقق من تورط ميرنا في المختبر، سنختبر أيضًا هذه المحاكاة أو LNAs في الجسم الحي في نموذج ساركوما عظمية الفئران. تم استخدام هذا النهج بنجاح في الساركوما العضلية المخططة من خلال التعبير الشرطي لـ miR-206 في الفئران [37] ويمكن أن يصبح استراتيجيات علاجية فعالة [38].

بالإضافة إلى تحديد أهداف جديدة ، تشكل ميرنا أيضًا بديلاً مثيرًا للاهتمام للتقنيات الجزيئية التقليدية المستخدمة بشكل روتيني لتشخيص السرطان. في الواقع ، تقدم الساركوما العظمية تغييرات معقدة في النمط النووي تجعل من الصعب تشخيصها باستخدام طرق التشخيص الحالية ، مثل مجموعة CGH [39]. مع نموذج ساركوما عظمية الفئران ، أكدنا أن الأورام قدمت العديد من الانحرافات الصبغية الطويلة (الشكل 6). كانت هذه التشوهات شائعة بشكل عام لجميع الأورام ، بغض النظر عن قابليتها للعلاج ولم يتم العثور على جزيئات الحمض النووي الريبي ذات الأهمية ولا الجينات في هذه المناطق (الشكل S4). حتى إذا كان من الممكن إلغاء تنظيم بعض البروتينات المشاركة في تنظيم تعبير ميرنا (العوامل العابرة أو عوامل تنظيم الوراثة اللاجينية) بعد هذه الطفرات ، فإن ملامح ميرنا التي لوحظت في أورام الفئران قد تكون مرتبطة بتأثيرات الأدوية السامة للخلايا على آلية ميرنا و لا لإعادة ترتيب الحمض النووي المنبع. حتى إذا كان من الممكن إخضاع الجزيئات المجهرية للتنظيم اللاجيني مثل الميثيل أو الأسيتيل ، فإن هذا يتعلق فقط بـ 5٪ إلى 10٪ من الجزيئات المجهرية ، ويمكننا اعتبار أن هذه العملية بسيطة بالنسبة لتوقيع ميرنا لأورام وخلايا الساركوما العظمية على أساس 61 ميلًا جزيئيًا [40 ، 41] . بحماسة ، عملنا هو الأول الذي يقترح أن توقيعات ميرنا لم تكن مرتبطة بتضخيم الحمض النووي ، كما لوحظ في الورم الأرومي العصبي [42] أو في ابيضاض الدم المختلط النسب [43]. على الرغم من أن مجموعتنا لم تكن مرضية تمامًا ، إلا أنه يبدو أن التنميط ميرنا يمكن أن يتنبأ باستجابة الورم للعلاج من خلال عكس الخصائص البيولوجية للورم وليس الخصائص الوراثية. يسلط هذا العمل الضوء أيضًا على قياس miRNA كشريك مثير للاهتمام لمجموعة CGH في حالة الأمراض ذات الأنماط النووية غير المستقرة. بنفس الطريقة ، Selvarajah وآخرون. كان أول من اقترح مزيجًا من مجموعة CGH والطور البيني FISH لفهم التسبب في الساركوما العظمية بشكل أفضل [44].

لم تكن أنماط ميرنا مرتبطة فقط بالخصائص المظهرية للساركوما العظمية ولكن أيضًا مع الأنواع الفرعية النسيجية للساركوما العضلية المخططة. من خلال التنميط ميرنا ، تمكنا من التمييز بين الأنواع الفرعية المختلفة من الساركوما العضلية المخططة: Pax3 + أو Pax7 + أو اندماج سلبي ، يصعب تشخيصه من خلال التحليل النسيجي (الشكل 7 (أ)). كان نمط miRNA هذا فريدًا لأن جميع miRNAS التي تم تحديدها على أنها تمييزية لم يتم وصفها أو وصفها بشكل ضعيف في الأدبيات. من المثير للاهتمام للغاية ، على أساس ملفات تعريف miRNA الخاصة بهم ، أن خوارزمياتنا تسمح لنا بتمييز RMS الجنيني عن الانصهار السالب لـ aRMS (الشكل 7 (ب)). كان متفقًا مع عمل Wachtel et al. تحديد ملفات تعريف التعبير المختلفة المرتبطة بـ aRMS (Pax +) و aRMS السلبي الاندماج و eRMS [45].

إجمالاً ، يبدو أن قياس miRNA مفيد للساركوما ذات النمط النووي المعقد ، لأن الاندماج السلبي للاندماج ، على غرار الساركوما العظمية ، يتميز بنمط نووي معقد مرتبط بعدم التوازن الأليلي ، وفقدان الزيجوت غير المتجانسة وملامح التعبير الجيني غير المتجانسة. على الرغم من أن التصنيف الجزيئي لـ RMS السلبي للاندماج مثير للجدل دائمًا ، فإن عملنا يؤيد دراسة Davicioni et al. مما يشير إلى أن Pax / FOXO1 يملي توقيع تعبير محدد في RMS عن طريق التنميط تعبير مصفوفة ميكروية قليلة النوكليوتيد [46].على العكس من ذلك ، يختلف هذا عن العمل الأخير الذي قام به ويليامسون والذي يقترح أن الساركومة العضلية المخططة السنخية السلبية الاندماج يصعب تمييزها عن الساركومة العضلية المخططة الجنينية فيما يتعلق بخصائص بقاء المريض وملامح التعبير الجيني ومصفوفات CGH [7]. في الواقع ، لم يكن عملنا وعملهم متناقضًا تمامًا ، لأنهم ركزوا فقط على التحليل الجيني. كما هو مقترح بالنسبة لساركوما العظام ، تعكس أنماط ميرنا خصائص الورم المظهرية بدلاً من خصائصها الوراثية ويمكن أن تكون بديلاً واعدًا لتشخيص RMS لتجاوز القيود الحالية للتحليل الجزيئي جنبًا إلى جنب مع التشريح المرضي التقليدي.

وبالتالي ، يبدو أن التنميط ميرنا يمكن أن يكون مفيدًا جدًا لتشخيص الساركوما العظمية والساركومة العضلية المخططة. هنا ، أظهرنا أنه على أساس عشرة miRNAs ، تمكنا من فصل الأنواع الفرعية المختلفة من RMS. لقد اقترحنا سابقًا أن لوحة مكونة من خمسة جزيئات من الجزيئات الدقيقة كانت كافية إحصائيًا للتمييز بين الاستجابة القوية لمرضى الساركوما العظمية للعلاج [25]. تقدم تقنية TLDA مزايا عديدة بما في ذلك حاجتها إلى كمية قليلة من إجمالي الحمض النووي الريبي والتحليل المحتمل لعينات FFPE ، كما أظهرها آخرون سابقًا [47-49]. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للكشف عن الجزيئات الدقيقة المنتشرة في مصل المريض ، وهو مجال ناشئ خلال العامين الماضيين [50 ، 51]. يمكن أن تكون أداة التشخيص الجزيئي القائمة على الدم من خلال تحديد سمات ميرنا من مصل المريض تقدمًا كبيرًا في الساركوما العظمية ، مما يتطلب خزعة لتشخيصها ، مما قد يؤدي إلى بتر ثانوي.

إجمالاً ، تفتح هذه النتائج الواعدة الطريق لأداة تشخيص جديدة تعتمد على ميرنا للساركوما العظمية وكذلك الساركوما العضلية المخططة ، والتي يمكن أن تحسن بقاء المريض في كلتا الحالتين من خلال التنبؤ باستجابة المريض للعلاج الكيميائي والتحديد الدقيق للأنواع الفرعية RMS ، على التوالي.

الاختصارات

CDDP:سيسبلاتين
كوندرو:خلايا الساركوما الغضروفية
ط م:دورة العتبة
دوكس:دوكسوروبيسين
FFPE:البارافين المثبت بالفورمالين مضمن
ifos:إفوسفاميد
KEGG:موسوعة كيوتو للجينات والجينومات
LNA:حمض نووي مغلق
NT:غير معالج
PCA:تحليل المكون الرئيسي
راد:RAD-001
RMS:الساركوما العضلية المخططة
RQ:الكمية النسبية
RT-qPCR:الوقت الحقيقي PCR الكمي
TLDA:مجموعة تقمان منخفضة الكثافة
15-47:خلايا ساركوما العظام البشرية CRL-15-47.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل Ligue Nationale contre le Cancer (منح من قسم العين) ، والمعهد الوطني للسرطان ، و Conticanet Consortium. يعترف المؤلفون بشركة Imaxio ، التي أدركت تحليل CGH.

مراجع

  1. روزمان ، إيه إم كليتون-يانسن ، وبي سي دبليو هوجندورن ، "علم أمراض أورام العظام والغضاريف الأولية الخبيثة ،" جراحة العظام الدولية، المجلد. 30 ، لا. 6 ، ص 437-444 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  2. S. Ferrari و E. Palmerini ، "العلاج الكيميائي المركب المساعد والمستحدث للساركوما العظمية" الرأي الحالي في علم الأورام، المجلد. 19 ، لا. 4، pp.341–346، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  3. جيه تشو ور. جورليك ، "مقاومة العلاج الكيميائي في الساركوما العظمية: التحديات الحالية والاتجاهات المستقبلية" مراجعة الخبراء للعلاج المضاد للسرطان، المجلد. 6 ، لا. 7 ، ص 1075-1085 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  4. F. G. Barr، N. Galili، J. Holick، J. A. Biegel، G. Rovera، and B. S. Emanuell، "إعادة ترتيب جين الصندوق المقترن PAX3 في الورم العضلي المخططي الصلب في الأطفال ،" علم الوراثة الطبيعي، المجلد. 3 ، لا. 2، pp. 113-117، 1993. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  5. R.J Davis ، و C.M D'Cruz ، و M.A Lovell ، و J.A Biegel ، و F.G Barr ، "Fusion of PAX7 to FKHR by the variant t (113) (p36q14) translocation in alveolar rhabdomyosarcoma،" ابحاث السرطان، المجلد. 54 ، لا. 11 ، ص 2869-2872 ، 1994. عرض على: الباحث العلمي من Google
  6. P. H. B. Sorensen ، J.C Lynch ، S. J. Qualman et al. ، "يعد اندماج الجينات PAX3-FKHR و PAX7-FKHR مؤشرات تنبؤية في الساركوما العضلية المخططة السنخية: تقرير من مجموعة أورام الأطفال ،" مجلة علم الأورام السريري، المجلد. 20 ، لا. 11 ، ص 2672-2679 ، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  7. ويليامسون ، إي ميسياغليا ، إيه دي رينيس وآخرون ، "الساركومة العضلية المخططة السنخية سلبية الجينات الاندماجية لا يمكن تمييزها إكلينيكيًا وجزيئيًا عن الساركومة العضلية المخططة الجنينية ،" مجلة علم الأورام السريري، المجلد. 28 ، لا. 13، pp. 2151–2158، 2010. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  8. A. Esquela-Kerscher و F.J. Slack ، "Oncomirs - microRNAs مع دور في السرطان ،" مراجعات الطبيعة للسرطان، المجلد. 6 ، لا. 4، pp.259–269، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  9. G. Hutvágner و P. D. Zamore ، "A microRNA في مركب إنزيم RNAi متعدد الدورات ،" علم، المجلد. 297 ، لا. 5589، pp.2056–2060، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  10. Y. Lee ، و C. Ahn ، و J. Han et al. ، "يبدأ RNase III Drosha النووي معالجة microRNA ،" طبيعة سجية، المجلد. 425 ، لا. 6956 ، ص 415-419 ، 2003. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  11. J.G Doench و P. A. Sharp ، "خصوصية اختيار الهدف microRNA في القمع متعدية ،" الجينات والتنمية، المجلد. 18 ، لا. 5 ، ص 504-511 ، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  12. Z. Li ، M.Q. Hassan ، M. Jafferji et al. ، "تساهم الوظائف البيولوجية لـ miR-29b في التنظيم الإيجابي لتمايز بانيات العظم ،" مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 284 ، لا. 23 ، ص 15676-15684 ، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  13. T. Sugatani و K. A. Hruska ، "MicroRNA-223 هي عامل رئيسي في تمايز ناقضات العظم ،" مجلة الكيمياء الحيوية الخلوية، المجلد. 101 ، لا. 4، pp. 996–999، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  14. K. Chen و N. Rajewsky ، "الانتقاء الطبيعي على مواقع ربط microRNA البشري المستنتج من بيانات SNP ،" علم الوراثة الطبيعي، المجلد. 38 ، لا. 12، pp.1452–1456، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  15. J. Lu ، G. Getz ، E. A. Miska et al. ، "ملفات تعريف تعبير MicroRNA تصنف السرطانات البشرية ،" طبيعة سجية، المجلد. 435 ، لا. 7043، pp.834–838، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  16. S. Volinia ، G.A Calin ، C.G Liu et al. ، "توقيع تعبير microRNA للأورام الصلبة البشرية يحدد أهداف جينات السرطان ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 103 ، لا. 7 ، ص 2257-2261 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  17. G.A Calin ، M. Ferracin ، A. Cimmino et al. ، "توقيع microRNA مرتبط بالتشخيص والتقدم في ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن ،" نيو انغلاند جورنال اوف ميديسين، المجلد. 353 ، لا. 17 ، ص 1793-1801 ، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  18. أ.إسرائيل ، ر. شاران ، إ. روبين ، وإي.غالون ، "زيادة نشاط الرنا الميكروي في السرطانات البشرية ،" بلوس واحد، المجلد. 4 ، لا. 6 ، معرف المقالة e6045 ، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  19. S. Subramanian ، و W. O. Lui ، و C.H Lee et al. ، "توقيع تعبير MicroRNA من الأورام اللحمية البشرية ،" الأورام، المجلد. 27 ، لا. 14، pp. 2015-2026، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  20. J.C Wittig، J. Bickels، D. Priebat et al.، “Osteosarcoma: a multidisciplinary to Diagnostic and treatment،” طبيب أسرة أمريكي، المجلد. 65 ، لا. 6 ، ص 1123-1136 ، 2002. عرض على: الباحث العلمي من Google
  21. A. Dutour ، D. Leclers ، J. Monteil et al. ، "يرتبط التصوير غير الجراحي بالخصائص النسيجية والجزيئية لنموذج الساركوما العظمية: تطبيق للكشف المبكر ومتابعة النمط الظاهري MDR ،" بحوث السرطان، المجلد. 27 ، لا. 6 ب ، ص 4171-4178 ، 2007. عرض على: الباحث العلمي من Google
  22. A. Dutour ، J. Monteil ، F. Paraf et al. ، "Endostatin cDNA / cationic liposome complexes كعلاج واعد للوقاية من نقائل الرئة في الساركوما العظمية: دراسة في ورم شبيه بالفئران يشبه الإنسان ،" العلاج الجزيئي، المجلد. 11 ، لا. 2، pp 311–319، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  23. M. Allouche و H.G Delbruck و B. Klein ، "أورام العظام الخبيثة الناتجة عن الحقن الموضعي للسيريوم الغرواني المشع في الفئران كنموذج لساركوما العظام البشرية ،" المجلة الدولية للسرطان، المجلد. 26 ، لا. 6 ، ص 777-782 ، 1980. عرض على: الباحث العلمي من Google
  24. K. Arakawa و N. Kono و Y. Yamada و H. Mori و M. Tomita ، "أداة تصور المسار المستندة إلى KEGG لبيانات omics المعقدة ،" في علم الأحياء السيليكو، المجلد. 5 ، لا. 4، pp.419–423، 2005. View at: Google Scholar
  25. A. Gougelet ، D. Pissaloux ، A. Besse et al. ، "ملامح miRNA في الساركوما العظمية كأداة تنبؤية لاستجابة العلاج الكيميائي لـ ifosfamide ،" المجلة الدولية للسرطان. في الصحافة. عرض على: الباحث العلمي من Google
  26. آر إي براون ، "صورة مورفوبروتيوميك لمسار mTOR في الساركوما الغضروفية اللحمية المتوسطة ،" حوليات العلوم السريرية والمخبرية، المجلد. 34 ، لا. 4 ، ص 397-399 ، 2004. عرض على: الباحث العلمي من Google
  27. Q. Zhou و Z. Deng و Y. Zhu و H. Long و S. Zhang و J. Zhao ، "يساهم مسار تحويل الإشارة mTOR / p70S6K في تقدم الساركوما العظمية وتوقعات المرضى ،" علم الأورام الطبية، المجلد. 27 ، لا. 4، pp. 1239–1245، 2010. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  28. B. H. Jiang و L. Z. Liu ، "دور mTOR في مقاومة الأدوية المضادة للسرطان: وجهات نظر لتحسين العلاج بالعقاقير ،" تحديثات مقاومة الأدوية، المجلد. 11 ، لا. 3 ، ص 63-76 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  29. X. Wan و A. Mendoza و C. Khanna و L.J Helman ، "يثبط Rapamycin السلوك المنتشر بوساطة إزرين في نموذج الفئران من الساركوما العظمية ،" ابحاث السرطان، المجلد. 65 ، لا. 6، pp.2406–2411، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  30. I. Beuvink ، A. Boulay ، S. Fumagalli et al. ، "يعمل مثبط mTOR RAD001 على تحسس الخلايا السرطانية لموت الخلايا المبرمج الناجم عن تلف الحمض النووي من خلال تثبيط ترجمة p21 ،" زنزانة، المجلد. 120 ، لا. 6 ، الصفحات من 747 إلى 759 ، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  31. S. Mabuchi ، D.A Altomare ، D.C Connolly et al. ، "RAD001 (Everolimus) يؤخر ظهور الورم وتطوره في نموذج فأر معدّل وراثيًا لسرطان المبيض ،" ابحاث السرطان، المجلد. 67 ، لا. 6، pp.2408–2413، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  32. S. Ambs ، R. L. Prueitt ، M. Yi et al. ، "التنميط الجيني للـ microRNA و messenger RNA يكشف عن تعبير الرنا الميكروي غير المنظم في سرطان البروستاتا ،" ابحاث السرطان، المجلد. 68 ، لا. 15، pp.6162–6170، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  33. G.A Calin ، M. Ferracin ، A. Cimmino et al. ، "توقيع microRNA مرتبط بالتشخيص والتقدم في ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن ،" نيو انغلاند جورنال اوف ميديسين، المجلد. 353 ، لا. 17 ، ص 1793-1801 ، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  34. A. J. Schetter ، S. Y. Leung ، J. J. Sohn et al. ، "ملفات تعريف تعبير MicroRNA المرتبطة بالتشخيص والنتائج العلاجية في سرطان القولون الغدي ،" مجلة الجمعية الطبية الأمريكية، المجلد. 299 ، لا. 4، pp.425–436، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  35. S. L. Yu ، و H. Y. Chen ، و G.C. Chang et al. ، "توقيع MicroRNA يتنبأ بالبقاء والانتكاس في سرطان الرئة ،" الخلايا السرطانية، المجلد. 13 ، لا. 1، pp.48–57، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  36. B. Song ، Y. Wang ، Y. Xi et al. ، "آلية المقاومة الكيميائية بوساطة miR-140 في ساركوما العظام البشرية وخلايا سرطان القولون ،" الأورام، المجلد. 28 ، لا. 46 ، ص 4065-4074 ، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  37. R. Taulli ، F. Bersani ، V. Foglizzo et al. ، "إن microRNA miR-206 الخاص بالعضلات يمنع نمو الساركوما العضلية المخططة البشرية في الفئران المزروعة بالجنين عن طريق تعزيز التمايز العضلي ،" مجلة التحقيقات السريرية، المجلد. 119 ، لا. 8 ، ص 2366-2378 ، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  38. R.N Veedu و J. Wengel ، "الأحماض النووية المقفلة: نظائر الحمض النووي الواعدة للتطبيقات العلاجية ،" الكيمياء والتنوع البيولوجي، المجلد. 7 ، لا. 3، pp.536-542، 2010. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  39. J.A Fletcher، M.C Gebhardt، and H.P Kozakewich، "الانحرافات الوراثية الخلوية في الساركوما العظمية: عمليات الحذف غير العشوائية ، والحلقات ، والكروموسومات ذات الدقائق المزدوجة ،" علم الوراثة السرطانية وعلم الوراثة الخلوية، المجلد. 77 ، لا. 1، pp.81–88، 1994. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  40. L. Han ، P. D. Witmer ، E. Casey ، D. Valle ، و S. Sukumar ، "مثيلة الحمض النووي تنظم تعبير الرنا الميكروي ،" بيولوجيا السرطان وعلاجه، المجلد. 6 ، لا. 8، pp.1284–1288، 2007. View at: Google Scholar
  41. Y. Saito و P. A. دورة الخلية، المجلد. 5 ، لا. 19، pp. 2220–2222، 2006. View at: Google Scholar
  42. براي ، ك.براين ، س.برنتر وآخرون ، "عدم تنظيم واسع النطاق لمركبات الحمض النووي الريبوزي من خلال تضخيم MYCN والاختلالات الصبغية في الورم الأرومي العصبي: ارتباط التعبير ميرنا بالبقاء ،" بلوس واحد، المجلد. 4 ، لا. 11 ، معرف المقالة e7850 ، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  43. S. Mi ، Z. Li ، P. Chen et al. ، "الإفراط في التعبير الشاذ ووظيفة مجموعة miR-17-92 في ابيضاض الدم الحاد الذي أعيد ترتيبه بواسطة MLL ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 107 ، لا. 8، pp.3710–3715، 2010. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  44. S. Selvarajah ، M. Yoshimoto ، O. Ludkovski et al. ، "التوقيعات الجينومية لعدم الاستقرار الكروموسومي وتطور الساركوما العظمية المكتشفة بواسطة مصفوفة عالية الدقة CGH والطور البيني FISH ،" بحوث الوراثة الخلوية والجينوم، المجلد. 122 ، لا. 1، pp.5–15، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  45. M. Wachtel ، M. Dettling ، E. Koscielniak et al. ، "تحدد توقيعات التعبير الجيني الأنواع الفرعية للساركوما العضلية المخططة وتكشف عن انتقال جديد t (22) (q35p23) يدمج PAX3 إلى NCOA1 ،" ابحاث السرطان، المجلد. 64 ، لا. 16، pp. 5539–5545، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  46. E. Davicioni و F.G Finckenstein و V. Shahbazian و J.D Buckley و T. ابحاث السرطان، المجلد. 66 ، لا. 14 ، ص 6936-6946 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  47. A.B. Hui ، W. Shi ، P. C. Boutros et al. ، "التنميط العالمي القوي للحمض النووي الريبي الدقيق باستخدام أنسجة سرطان الثدي المضمنة بالفورمالين المثبتة بالبارافين ،" تحقيقات المختبر، المجلد. 89 ، لا. 5 ، ص 597-606 ، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  48. K.RM Leite ، J.M.S Canavez ، S. T. Reis et al. ، "تحليل miRNA لسرطان البروستاتا عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي: مقارنة بين الأنسجة المضمنة بالبارافين المثبتة بالفورمالين والأنسجة المجمدة حديثًا ،" أورام المسالك البولية: الندوات والتحقيقات الأصلية. في الصحافة. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  49. A. Liu ، M. T. Tetzlaff ، P. VanBelle et al. ، "تنميط تعبير MicroRNA يتفوق في الأداء على تنميط تعبير mRNA في الأنسجة المضمنة بالبارافين المثبتة بالفورمالين ،" المجلة الدولية لعلم الأمراض السريرية والتجريبية، المجلد. 2 ، لا. 6 ، ص 519-527 ، 2009. عرض على: الباحث العلمي من Google
  50. X. Chen ، Y. Ba ، L. Ma et al. ، "توصيف الرنا الميكروي في المصل: فئة جديدة من المؤشرات الحيوية لتشخيص السرطان والأمراض الأخرى ،" أبحاث الخلايا، المجلد. 18 ، لا. 10، pp. 997–1006، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  51. بي إس ميتشل ، آر كيه باركين ، إي إم كروه وآخرون ، "تعميم جزيئات الحمض النووي الريبي كواسمات ثابتة قائمة على الدم لاكتشاف السرطان ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 105 ، لا. 30 ، ص 10513-10518 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل

حقوق النشر

حقوق النشر © 2011 Angélique Gougelet et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط الاستشهاد بالعمل الأصلي بشكل صحيح.


شاهد الفيديو: microRNAs, a bit different biomarkers From discovery to Dx application. BioVendor #16 (ديسمبر 2022).