معلومة

كفاءة التحول

كفاءة التحول


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

قمت بطريق الخطأ بتدوير الخلايا بعد العلاج بالصدمة الحرارية قبل إضافة الوسائط إلى الأنابيب أثناء إجراء التحويل؟ هل سينجح التحول؟


يصعب الإجابة على هذا نظرًا لأننا لا نعرف الظروف الدقيقة التي اخترتها ، نظرًا لأن هذه هي سرعة الدوران (أو أفضل g) ، ومدة تدويرها وأيضًا إذا كنت تستخدم جهاز طرد مركزي مبرد أم لا. من المهم أيضًا مدى رقة قيامك بإعادة تعليق الحبيبات.

ومع ذلك ، أود أن أضع هذه الخلايا ، بغض النظر عما حدث لأنك في الخطوة الأخيرة من الإجراء وليس لديك ما تخسره. قم بإجراء التخفيفات المعتادة التي تستخدمها لطلاء الخلايا الخاصة بك ثم أضف لوحة أخرى بمزيج تحويل غير مخفف. إذا كان لديك عدد قليل جدًا من الخلايا الباقية على قيد الحياة بعد خطأك ، فقد تحصل على نسخ مستنسخة على هذه اللوحة. إذا لم ينجح الأمر ، فسيتعين عليك تكرار التحول.


والسؤال هو التالي: هل حضنت الخلايا على الجليد قبل الدوران؟ البروتوكول ، على سبيل المثال هذا مقابل 5 دولارات أمريكية ألفا دولار ، يتطلب حضانة لمدة 10 دقائق فقط بعد الصدمة الحرارية:

صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية بالضبط لمدة 30 ثانية بالضبط. لا تخلط. ضعه على الجليد لمدة 5 دقائق. لا تخلط. ماصة 950 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة SOC في الخليط.

هل قمت بالطرد المركزي لأنابيبك بعد خطوة بخطوة جريئة؟ أراهن أن تدوير الخلايا (مع الأخذ في الاعتبار ما كتبه @ chris حول معلمات الطرد المركزي) لن يقلل بشكل كبير من كفاءة التحول. يجب أن يكون الحمض النووي موجودًا بالفعل في الخلايا بعد الخطوة ، كما هو موضح في الاقتباس.


قياس

يجب تحديد كفاءة التحويل في ظل ظروف زيادة الخلية. & # 911 & # 93 قد يتراوح عدد الخلايا القابلة للحياة في التحضير لتفاعل التحول من 2 × 10 8 إلى 10 11 من أكثر الطرق شيوعًا في بكتريا قولونية ينتج عن التحضير حوالي 10 10 خلايا قابلة للحياة لكل تفاعل. تستخدم البلازميدات المعيارية لتحديد كفاءة التحويل في الإشريكية القولونية هي pBR322 أو نواقل أخرى مماثلة أو أصغر حجمًا ، مثل سلسلة المتجهات pUC. ومع ذلك ، يمكن استخدام نواقل مختلفة لتحديد كفاءتها التحويلية. يمكن استخدام 10-100 بيكوغرام من الحمض النووي للتحويل ، وقد يكون المزيد من الحمض النووي ضروريًا للتحول منخفض الكفاءة (يتم الوصول إلى مستوى التشبع بشكل عام عند أكثر من 10 & # 160 نانوغرام). & # 912 & # 93

بعد التحول ، يتم طلاء 1٪ و 10٪ من الخلايا بشكل منفصل ، ويمكن تخفيف الخلايا في الوسائط حسب الضرورة لسهولة الطلاء. يمكن استخدام مزيد من التخفيف للتحويل عالي الكفاءة.

يمكن قياس كفاءة التحول في المحولات أو وحدة تشكيل المستعمرة (cfu) لكل ميكروغرام من الحمض النووي المستخدم. كفاءة تحويل 1 × 10 8 cfu / ميكروغرام لبلازميد صغير مثل pUC19 تعادل تقريبًا 1 في 2000 جزيء من البلازميد المستخدم يتم تحويله. في بكتريا قولونية، فإن الحد النظري لكفاءة التحويل للبلازميدات الأكثر استخدامًا سيكون أكثر من 1 × 10 11 cfu / μg. من الناحية العملية ، قد تكون أفضل نتيجة يمكن تحقيقها حوالي 2-4 × 10 10 cfu / μg لبلازميد صغير مثل pUC19 ، وأقل بكثير للبلازميدات الكبيرة.


كفاءة التحول - علم الأحياء

أهلا. لدي سؤال حول كفاءة التحول للإشريكية القولونية المختصة. أعلم أن الكفاءة تُحسب بناءً على كمية البلازميد المستخدمة في التحويل وندرة القولون الناتجة. هل يؤثر الحجم الأولي للخلايا المختصة على هذا على الإطلاق؟ تدعي الشركة المصنعة أن استخدام أقل من 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة في إجراء التحويل الخاص بي سيقلل من كفاءة التحول. لا أفهم هذا - إذا قللت أيضًا من كمية البلازميد التي أستخدمها ، ألا يجب أن تظل الكفاءة كما هي؟

هل يفترض حساب الكفاءة أن كل خلية تستهلك البلازميد؟

إذا كانت خلاياي تتمتع بكفاءة & lt 10 ^ 9 cfu / ng ، فهل يمكنني استخدام المزيد من الخلايا لتبدأ بها وينتهي بها الأمر بمستوى قابل للامتثال من المستعمرات؟
شكرا لمساعدتك.

يؤثر كل من حجم ونوع الأنبوب المستخدم على كفاءة التحويل. وذلك لأن درجة الحرارة النهائية التي تصل إليها الخلايا أثناء النبض الحراري تتأثر بهذه المعلمات. إذا كانت درجة الحرارة النهائية مرتفعة للغاية ، تموت الخلايا. إذا كانت درجة الحرارة النهائية منخفضة جدًا ، يتم تقليل كفاءة التحويل. تم نشر هذا في أوائل الثمانينيات في مقال BRL Focus. لقد نجحت في تحويل الخلايا التي تحتوي على بلازميد يحتوي على محفز ناتج عن درجة الحرارة عن طريق النبض عند 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. لكني لا أعرف ما إذا كانت تلك النقطة الزمنية هي الأمثل.

تأخذ الخلايا أكثر من بلازميد واحد ، وبالإضافة إلى ذلك ، فإن سطح الخلية مغطى بنسخ أخرى من البلازميد (بالإضافة إلى النسخ الزائدة من جزء إدخال الحمض النووي حيث أن نسبة الإدخال إلى الناقل تكون عادة أكبر من 1: 1) التي لم يتم تناولها.

قام كل من Invitrogen و Statagene بنشر كتيبات حول كفاءة التحويل وعدد المستعمرات المطلوبة لإنشاء مكتبة cDNA.

تنتج بروتوكولات كلوريد الكالسيوم عادةً 5e6 إلى 2e7 cfu / ug من DNA البلازميد الفائق الالتفاف أو 5000-10،000 cfu / ng من الحمض النووي المرتبط.
يولد بروتوكول هاناهان 5e8 cfu / ug من DNA البلازميد فائق الالتفاف أو 500000 cfu / ng من الحمض النووي المربوط.
تولد بروتوكولات Electroporation 1e9 إلى 1e10 cfu / ميكروغرام من DNA البلازميد فائق الالتفاف أو 5،000،000-10،000،000 cfu / ng من الحمض النووي المربوط.

يوجد أيضًا تأثير مستوى تشبع البلازميد. هضبة cfu / ng منخفضة بشكل مدهش ، ولكنها ستختلف وفقًا لنوع الكفاءة وسلالة الخلية.

شكرا. إذا فهمت إجابتك بشكل صحيح ، فلا داعي للقلق كثيرًا بشأن الكفاءة المثلى إذا كنت مجرد استنساخ للتسلسل ، بدلاً من إنشاء مكتبات.

سيكون من دواعي سرور الشركة المصنعة أن تستخدم 100 خلية وأكثر من الخلايا رقم 33))
أنا أستخدم 10 خلايا ul و 1 ul من البلازميد لإعادة تكوّن perposes. يعمل دائمًا & # 33


كفاءة التحول - علم الأحياء

من خلال مزج خلايا الإشريكية القولونية مع DNA البلازميد الذي يحمل جينًا مقاومًا للمضادات الحيوية ، يمكن عزل الخلايا التي أدرجت البلازميد كجزيء DNA مكرر بشكل مستقل. هذه عملية تحدث بشكل طبيعي ، تسمى التحويل ، ولكنها تحدث بتردد منخفض بطبيعته بحيث لا يكون مجديًا كطريقة روتينية للحصول على البلازميدات المؤتلفة في الإشريكية القولونية. يمكن الحصول على تواتر أعلى بكثير للتحول إذا عولجت خلايا الإشريكية القولونية بمحلول من الكاتيونات ثنائية التكافؤ (عادةً Ca) عند درجات حرارة منخفضة لجعلها "مؤهلة" لأخذ DNA البلازميد. يُعتقد أن أيونات Ca ++ تشكل جسرًا أيونيًا بين مجموعات الفوسفات سالبة الشحنة لكل من DNA و phospholipids الغشاء. تبلور درجة الحرارة الباردة الغشاء الذي يثبت هذا التفاعل. عندما تتعرض الخلايا لصدمة حرارية ، تمتص بعض الخلايا الحمض النووي. إذا تم السماح للخلايا بالتسخين فوق 4 درجات مئوية قبل خطوة الصدمة الحرارية ، فلن تكون مختصة. تأكد من استخدام تقنية تعقيم جيدة أثناء الإجراء بأكمله.

عادة ما يكون عدد الخلايا في التحول زائدًا ويكون "الكاشف" المحدد هو الحمض النووي. مقياس جودة الخلايا المختصة هو كفاءة التحويل. هذا هو عدد المحولات (المستعمرات التي تنمو على الصفيحة) التي تم الحصول عليها لكل ميكروغرام من DNA البلازميد. من أجل تحديد كفاءة التحويل ، يتم إجراء تحويل تحكم بكمية محددة من DNA البلازميد جنبًا إلى جنب مع التحويل التجريبي. يتم حساب عدد المستعمرات وضربها في عامل التخفيف المناسب للحصول على العدد الإجمالي للمحولات. هذا مقسوم على كمية الحمض النووي المستخدمة في التحويل ويتم التعبير عنها كمحولات لكل ميكروجرام من الحمض النووي. تمثل كفاءات التحول بين 10 ^ 6 و 10 ^ 9 النطاق الطبيعي لخلايا الإشريكية القولونية المختصة.

يتم حصاد خلايا الإشريكية القولونية بالطرد المركزي عندما تكون في مرحلة تسجيل النمو المتأخرة. يتم تبريدها ومعالجتها باستخدام محاليل جليدية تحتوي على تركيزات عالية نسبيًا (0.5 م) من الكاتيونات ثنائية التكافؤ (عادةً الكالسيوم ، ولكن المنغنيز تعمل أيضًا بشكل جيد). للحصول على أعلى كفاءة للخلايا يجب توخي الحذر الشديد للحفاظ على الخلايا باردة أثناء التحضير. تتضمن العملية العديد من عمليات الطرد المركزي ويمكن أن تكون صعبة للغاية. يشتري العديد من الباحثين قسامات من الخلايا المختصة التي تم تحضيرها تجاريًا وتجميدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. يجب أن تكون كفاءة التحويل لهذه الخلايا حوالي 10 ^ 9.

إجراء تحويل خلايا الإشريكية القولونية (اليوم نستخدم سلالة خلايا DH1-alpha المشتراة من Life Technologies)

1. ضع 2 أنبوب معقم 15 مل من البولي بروبلين على الثلج. قم بتسمية أحدهما باسم البلازميد الخاص بك والآخر باسم "التحكم".

2. أضف إلى كل أنبوب من أنابيب البولي بروبلين 50 ميكروليتر من الخلايا المختصة. تأكد من إبقاء الخلايا باردة أثناء عملية النقل.

3. أضف 1 ميكروليتر من مزيج الربط إلى أنبوب البولي بروبيلين الأول و 1 ميكرو لتر من الحمض النووي للتحكم (pUC18 عند 10 بيكوغرام / ميكرولتر) إلى أنبوب التحكم. تخلط بلطف وتحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة. تأكد من إبقاء الخلايا باردة أثناء عملية النقل.

4. تسخين نبض الأنابيب في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية بالضبط. يعد طول النبضة الحرارية أمرًا بالغ الأهمية للحصول على أعلى الكفاءات.

5. ضع الأنابيب على الجليد لمدة دقيقتين.

6. أضف 0.9 مل من مرق LB واحتضان الأنابيب في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

7. ضع اسم 3 رطل / أمبير على لوحات 3 رطل / أمبير مع اسمك البلازميد وألواح 3 رطل / أمبير مع "تحكم". قم بترقيم كل مجموعة من اللوحات 1-3.

8. ضع 0.1 مل من مزيج تحويل البلازميد على لوحة LB / Amp المسمى 1 وافرد المرق بالتساوي على اللوحة. ضع أيضًا 0.1 مل من مزيج تحويل البلازميد في أنبوب ثاني مع 0.9 مل من مرق LB. امزج وصفيحة 0.1 مل من هذا الخليط على لوحة LB / Amp المسمى 2. ضع 0.1 مل من التخفيف من الأنبوب الثاني في أنبوب ثالث مع 0.9 مل من مرق LB. امزج وصفي 0.1 مل من هذا الخليط على لوحة LB / Amp المسمى 3.

9. استخدم نفس إجراء الطلاء (الخطوة 8) لإخراج مزيج تحويل التحكم.

10. احتضان جميع الأطباق في 37 درجة مئوية لمدة 14-18 ساعة. لا تحضن أكثر من 18 ساعة. بعد انتهاء فترة الحضانة توضع الأطباق في الثلاجة لحين الحاجة.


كفاءة التحول - مساعدة & # 33 (مايو / 08/2006)

كنت بحاجة إلى بعض المساعدة الكبيرة في حساب كفاءة التحويل.

إذا كان تركيز الحمض النووي 15 نانوغرام / مل وكان حجم الطلاء 100 ميكرولتر. كان الحجم النهائي عند الانتعاش 100 ماي. كان عدد المحولات التي حصلت عليها 67. كيف يمكنني حساب كفاءة التحويل في وحدات المحولات / ميكروغرام من الحمض النووي.

سأقدر حقًا أي مساعدة في هذا.

هل استخدمت 900ul من SOC أو LB؟ هذا هو المثال الذي صادفته منذ فترة في بعض الكتالوجات. اخرج من هذا القبيل

& quot بعد تحويل 100 مايكرولتر من الخلايا المختصة باستخدام 0.1 نانوجرام من DNA البلازميد غير المقطوع ، يضاف تفاعل التحويل إلى 900 مايتر من وسط SOC (0.1 نانوجرام DNA / مل). يتم إجراء تخفيف 1:10 باستخدام وسط SOC (0.01ng DNA / ml) ، ويتم طلاء 100ul على كل من لوحين (0.001ng DNA / 100ul). إذا تم الحصول على 200 مستعمرة (بمعدل لوحين) ، فما كفاءة التحويل؟

(200 كفو / 0.001 نانوغرام) × (1 نانوغرام / 10 إلى قوة -3 ميكروغرام-ميكروغرام) = 2 × 10 إلى قوة 8 كفو / ميكروغرام DNA


نموذج 6 أ مختبر التحول

مقدمة:
يحدث التحول البكتيري عندما تأخذ الخلية البكتيرية الحمض النووي الغريب وتدمجه في الحمض النووي الخاص بها. يحدث هذا التحول عادة داخل البلازميدات ، وهي جزيئات DNA دائرية صغيرة منفصلة عن كروموسومها. يمكن أن يكون هناك من 10 إلى 200 نسخة من نفس البلازميد داخل الخلية. قد تتكاثر هذه البلازميدات عندما يتكاثر الكروموسوم ، أو قد تتكاثر بشكل مستقل. يحتوي كل بلازميد من 1،000 إلى 200000 زوج قاعدي. تحمل بلازميدات معينة ، تسمى بلازميدات R ، الجين الخاص بمقاومة المضادات الحيوية مثل الأمبيسلين ، الذي يستخدم في هذا المختبر.

تعمل البلازميدات في التحول بطريقتين مختلفتين. يمكنهم نقل الجينات التي تحدث بشكل طبيعي داخلها ، أو يمكن أن تعمل كناقلات لإدخال الحمض النووي الغريب. يمكن استخدام إنزيمات التقييد لقطع الحمض النووي الغريب وإدخاله في نواقل البلازميد. البكتيريا المستخدمة في هذا المختبر هي الإشريكية القولونية (E. coli). كانت مثالية لدراسة التحول هذه لأنه يمكن زراعتها بسهولة في مرق Luria أو على أجار ، ولها جينوم صغير نسبيًا يبلغ حوالي خمسة ملايين زوج أساسي.

التحول ليس الطريقة الوحيدة لنقل الحمض النووي داخل البكتيريا. الاقتران هو عملية نقل الحمض النووي التي تحدث بين خليتين من الخلايا البكتيرية. يتم تشكيل جسر بين الخليتين ويتم تداول المعلومات الجينية. في التنبيغ ، يتم استخدام الفيروس لنقل الحمض النووي الغريب إلى خلية بكتيرية.

فرضية:
سوف تكون الإشريكية القولونية المحولة مع الجين المقاوم للأمبيسيلين قادرة على النمو في ألواح الأمبيسلين ، لكن الإشريكية القولونية غير المتحولة لن تكون قادرة على النمو.

المواد:
كانت المواد اللازمة لهذا المختبر عبارة عن أنبوبين معقمين للاختبار ، و 500 ميكرولتر من الجليد البارد 0.05 متر كلوريد الكالسيوم ، وثقافات بكتيريا الإشريكية القولونية ، وحلقة تلقيح معقمة ، ومصاصة معقمة ، و 10 ميكرولتر من محلول pAMP ، وجهاز توقيت ، وثلج ، وحمام مائي ، 500 ميكرولتر من مرق لوريا ، قضيب منتشر ، 4 لوحات: 2 أمبيسلين + و 2 أمبيسيلين & # 8211 ، وحاضنة.

أساليب:
تم وضع علامة على أنبوب معقم & # 8220 + & # 8221 والآخر & # 8220 - & # 8220. تم استخدام ماصة مجهرية معقمة لنقل 250 ميكرولتر من الجليد البارد 0.05M CaCl إلى كل أنبوب. تم نقل مستعمرة كبيرة من الإشريكية القولونية بحلقة تلقيح لكل أنبوب. تم بعد ذلك خلط المعلق عن طريق الرسم المتكرر وإفراغ ماصة مجهرية معقمة. تمت إضافة 10 ميكرولتر من محلول pAMP إلى التعليق الخلوي في الأنبوب الذي يحمل علامة "+" وخلطه عن طريق النقر على الأنبوب. تم وضع كلا الأنبوبين على الجليد على الفور لمدة 15 دقيقة ثم نقعهما في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. ثم أعيدت الأنابيب إلى الجليد لمدة دقيقتين إضافيتين.

بعد الصدمة الحرارية ، تمت إضافة 250 ميكرولتر من مرق لوريا إلى كل أنبوب. تم خلط الأنابيب عن طريق النقر. تم تسمية لوحين من الأمبيسلين + أجار LB / AMP + و LB / AMP-. تم تسمية لوحين من الأمبيسلين أجار LB + و LB-. تم وضع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب & # 8220 + & # 8221 على لوحات LB + و LB / AMP +. تمت إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في الأنبوب "-" إلى لوحات LB- و LB / AMP. تم دهنها بقضيب ممتد تم تعقيمه بتمريره فوق اللهب بعد كل استخدام. تم السماح للألواح بالجلوس لعدة دقائق ثم تم تحضينها طوال الليل مقلوبة عند 37 درجة مئوية.

أسئلة:
1. قارن وقارن عدد المستعمرات على كل زوج من اللوحات التالية. ماذا تخبرك كل زوج من النتائج عن التجربة؟
LB + و LB- كلا الصفيحتين بهما عشب من البكتيريا. هذا يثبت أن البكتيريا قادرة على النمو على الأجار وأنه لا يوجد شيء يمنع النمو بجانب الأمبيسلين.

لم يشهد LB / AMP- و LB / AMP + LB / AMP- نموًا ، لكن LB / AMP + كان له نمو طفيف. هذا يدل على أن البكتيريا قد تحولت وطوّرت مقاومة للأمبيسيلين.

حقق LB / AMP + و LB + نموًا أقل من LB / AMP + من LB +. هذا يدل على أن التحول لم يكن فعالًا تمامًا ولم يحول سوى بعض الخلايا البكتيرية الأكثر كفاءة.

2. مجموع كتلة pAMP المستخدمة = 0.05 ميكروغرام

الحجم الإجمالي لتعليق الخلية = 510 ميكرولتر

ينتشر جزء من تعليق الخلية على اللوحات = 0.196

كتلة pAMP في تعليق الخلية = 0.0098

عدد المستعمرات لكل ميكروغرام من البلازميد = 0.0294

3. ما هي العوامل التي قد تؤثر على كفاءة التحويل؟ اشرح تأثير كل ما ذكرته.
يمكن أن تتأثر كفاءة التحول بحجم المستعمرة المضافة إلى الحل. في مستعمرة أكبر ، ستزداد الكفاءة لأنه سيكون هناك المزيد من الخلايا المستقبلة. عامل آخر هو كمية pAMP المضافة. كلما تمت إضافة pAMP ، زادت الكفاءة. يمكن أن تؤثر كمية مرق لوريا المضافة أيضًا على الكفاءة. إذا تم زيادة كمية مرق لوريا ، ستنخفض الكفاءة.

تحليل الأخطاء:
يحتوي هذا المعمل على عدة خطوات ، كل منها يعطي احتمالية حدوث خطأ. يجب أن تكون جميع القياسات دقيقة ودقيقة ، وكان توقيت الصدمة الحرارية أيضًا إجراءً معقدًا للغاية. قد يكون الخطأ في هذا المختبر ناتجًا عن تركيز CaCl2 نظرًا لحقيقة أن معظمه تم تجميده.

المناقشة والاستنتاج:
طورت البكتيريا المعالجة بمحلول pAMP مقاومة للأمبيسيلين وتمكنت من النمو على صفيحة الأمبيسلين +. أولئك الذين لم يعالجوا مع pAMP لم يتمكنوا من النمو على هذا الوسط. كانت اللوحات التي لا تحتوي على الأمبيسلين بمثابة عنصر تحكم لإظهار كيف ستبدو البكتيريا في الظروف الطبيعية. لا يكون التحول أبدًا فعالًا تمامًا ، فالخلايا التي تتمتع بالكفاءة الكافية هي فقط القادرة على امتصاص الحمض النووي الغريب. لذلك ، أظهرت لوحات الأمبيسلين نموًا أقل من لوحة التحكم.


كفاءة التحول - العوامل التي تؤثر على كفاءة التحول

هناك عدد من العوامل التي قد تؤثر على كفاءة التحويل:

حجم البلازميد - دراسة أجريت في بكتريا قولونية وجد أن كفاءة التحويل تنخفض خطيًا مع زيادة حجم البلازميد. الخلايا الفردية قادرة على تناول العديد من جزيئات الحمض النووي ، وأن وجود العديد من البلازميدات لا يؤثر بشكل كبير على حدوث أحداث التحول الناجحة.

أشكال الحمض النووي - يتمتع البلازميد فائق الالتواء بكفاءة تحويل أفضل قليلاً من البلازميدات المسترخية التي يتم تحويلها بنسبة 75٪ من كفاءة تلك البلازميدات فائقة الالتفاف. ومع ذلك ، فإن الحمض النووي الخطي والوحيد الذي تقطعت به السبل له كفاءة تحول أقل بكثير. يتم تحويل الحمض النووي أحادي الجديلة بكفاءة أقل بـ 104 من تلك التي تقطعت بهم السبل.

النمط الجيني للخلايا - قد تحتوي سلالات الاستنساخ على طفرات تعمل على تحسين كفاءة تحويل الخلايا. على سبيل المثال، بكتريا قولونية سلالات K12 مع deoR الطفرة ، التي وُجدت في الأصل لمنح قدرة الخلية على النمو في الحد الأدنى من الوسائط باستخدام إينوزين كمصدر وحيد للكربون ، لديها 4-5 أضعاف كفاءة تحويل السلالات المماثلة بدونها. للحمض النووي الخطي ، والذي يتحول بشكل سيئ إلى بكتريا قولونية, recBC أو تسجيل يمكن أن تحسن الطفرة بشكل كبير من كفاءة تحولها.

نمو الخلايابكتريا قولونية تكون الخلايا أكثر عرضة لتكون مؤهلة في مرحلة معينة من دورة نموها ، ربما عندما يكون حجم الخلية هو الأكبر. عند تحضير الخلايا المختصة ، يتم حصاد الخلايا عند كثافة بصرية معينة (عادةً حوالي 0.4 ، يمكن استخدام قيمة أعلى من 0.94-0.95 ولكنها غير عملية عندما يكون نمو الخلية سريعًا).

طرق التحول - طريقة تحضير الخلايا المختصة ، وطول فترة الصدمة الحرارية ، ودرجة حرارة الصدمة الحرارية ، والمواد المضافة المختلفة ، كلها يمكن أن تؤثر على كفاءة تحويل الخلايا. يمكن أن يؤدي وجود الملوثات بالإضافة إلى ligase في خليط الربط إلى تقليل كفاءة التحويل ، وقد يكون تعطيل حرارة ligase ضروريًا للتثقيب الكهربائي. يمكن أن يؤدي التحضير الطبيعي للخلايا المكونة إلى كفاءة تحويل تتراوح من 106 إلى 108 cfu / ميكروغرام DNA. ومع ذلك ، توجد بروتوكولات للطريقة الكيميائية لصنع خلايا فائقة الكفاءة قد تسفر عن كفاءة تحويل تزيد عن 1 × 109. تتميز طريقة Electroporation بشكل عام بكفاءة تحويل أفضل من الطرق الكيميائية التي تحتوي على أكثر من 1 × 1010 cfu / ميكروغرام من الحمض النووي ، وتسمح ببلازميدات كبيرة من حجم 200 كيلو بايت ليتم تحويله.

الاقتباسات الشهيرة التي تحتوي على عوامل الكلمات ، والتي تؤثر و / أو الكفاءة:

& ldquo اللغة تجعل من الممكن للطفل دمج والديه & # 146 المحظورات اللفظية ، لجعلها جزءًا من نفسه. نحن لا نتحدث عن ضمير حتى الآن في الطفل الذي يكتسب اللغة للتو ، ولكن يمكننا أن نرى بوضوح شديد كيف تلعب اللغة دورًا لا غنى عنه في تكوين الضمير. في الواقع ، الإنجاز الأخلاقي للإنسان ، مجمع عوامل التي تدخل في تنظيم الضمير تعتمد إلى حد كبير على اللغة. & rdquo
& [مدش] سلمى هـ. فرايبرغ (القرن العشرين)

& ldquo هناك قانون أعلى تؤثر علاقتنا بالصنوبر وكذلك بالرجال. قطع الصنوبر ، والصنوبر الميت ، ليس أكثر من صنوبر من جثة بشرية ميتة. & rdquo
& [مدش] هنري ديفيد ثورو (1817 & # 1501862)

& ldquo & # 147 ابدا عناق وتقبيل اطفالك! حب الأم قد يجعل أطفالك طفولتك & # 146s غير سعداء ويمنعهم من ممارسة مهنة أو الزواج! & # 148 هذا هو الهراء الكلي ، بالطبع. لكنه يظهر في مثال متطرف لما كان من المفترض أن تكون عليه أحدث التقنيات & # 147scientific & # 148 الأبوة والأمومة في أمريكا في أوائل القرن العشرين. بعد كل شيء ، كان هذا هو ذروة نجاعة الخبراء ودراسات الوقت والحركة وما شابه. & rdquo
& [مدش] لورانس كوتنر (القرن العشرين)


تخطيط استراتيجي

يعتبر جمع الأجنة غير الناضجة السليمة وفي مرحلة النمو الصحيحة عاملاً رئيسياً في تحول القمح. يجب تعديل ظروف غرف نمو البيئة الخاضعة للرقابة لتنمو المواد النباتية بقوة بحيث تصل الأجنة غير الناضجة إلى مرحلة الحليب المبكرة ، GS73 (Zadoks ، Chang ، & Konzak ، 1974) ، ∼14 يومًا بعد التخليق. بالإضافة إلى ذلك ، يجب توخي الحذر بشكل خاص للحد من مخاطر انتشار مسببات الأمراض. لا ينبغي رش النباتات الأم بالمبيدات الحشرية أو مبيدات الفطريات في أي مرحلة من مراحل النمو ، وبالتالي يجب الحفاظ على مستويات عالية من النظافة للنبات. مع تطور المادة النباتية إلى مرحلة النمو الصحيحة خلال 12-14 أسبوعًا ، يجب أن تزرع البذور من الصنف المراد تحويله كل أسبوع على دفعات صغيرة. سيضمن ذلك إمدادًا مستمرًا بالأجنة غير الناضجة في المرحلة التنموية الصحيحة للتحول.

1: زراعة القمح المتبرع

يصف هذا البروتوكول الأساسي زراعة النباتات المانحة المستخدمة لإنتاج أجنة غير ناضجة تستخدم في نظام التحول.

ملاحظة: زرع دفعات صغيرة من بذور القمح بالتتابع على فترات أسبوعية لضمان استمرار الإمداد بالأجنة غير الناضجة. تزرع النباتات المانحة عند درجة حرارة 20 ± 1 درجة مئوية في النهار ودرجات حرارة ليلية 15 ± 1 درجة مئوية ، ورطوبة 70٪ ، مع مستويات إضاءة تبلغ 600 ميكرولتر م 2 ث −1 يتم توفيرها بواسطة أنابيب الفلورسنت وإضاءة التنجستن في غرف نمو البيئة الخاضعة للرقابة.

المواد

  • غرفة نمو البيئة الخاضعة للرقابة
  • علبة بذور 24 قيراط مع خلايا بحجم 5 سم مربع
  • صينية البذور
  • دبر صغير (أو قلم رصاص)
  • ديبر متوسط ​​(اختياري)
  • أواني بقطر 13 سم
  • يمكن الري مع وردة جميلة

1. ضع ملحق 24 قيراطًا داخل صينية بذور واملأها بمزيج حبوب John Innes.

2. باستخدام دبر صغير (أو قلم رصاص) ، قم بعمل ثقب بعمق 1.5-2 سم في وسط مزيج الحبوب داخل كل وحدة

3. ضع حبة قمح واحدة في كل حفرة وقم بتغطيتها بقليل من مزيج الحبوب (إذا لزم الأمر). اضغط على الدرج لتسوية مزيج الحبوب.

4. باستخدام علبة سقي مع وردة ناعمة ، سقي البذور برفق.

5. ضع الدرج في غرفة بيئة مضبوطة حسب الظروف المذكورة أعلاه (ملاحظة). يجب مراقبة النباتات يوميًا. يجب أن يظل السماد رطبًا ولكن ليس مغمورًا بالمياه.

ستظهر الشتلات في غضون أسبوع من البذر. بعد 30 يومًا ، ستكون الشتلات كبيرة بما يكفي للزرع.

6. ملء الأواني بقطر 13 سم بمزيج حبوب John Innes.

7. اصنع ثقبًا صغيرًا في وسط السماد باستخدام دبر متوسط ​​الحجم أو إصبعك. يجب أن يكون الثقب بحجم الوحدات مقاس 5 سم التي نبتت فيها شتلات القمح.

8. سقي الشتلات التي توشك على الزرع. قم بفك جذور الشتلات من جدران الوحدة عن طريق الضغط بلطف وتحرير الشتلات.

9. حافظ على كرة الجذر سليمة قدر الإمكان عن طريق دعم الشتلات من أسفل. زرع الشتلات برفق في الحفرة في السماد الطازج. ثبتي السماد حول الجذور برفق.

10. الماء باستخدام إبريق سقي به وردة جميلة.

11. قم بزراعة النباتات في غرفة بيئية خاضعة للرقابة في ظل الظروف المذكورة أعلاه حتى تنتج أجنة مانحة (انظر البروتوكول الأساسي 3 واعتبارات الوقت). استمر في مراقبة النباتات يوميًا. يجب أن يبقى السماد رطبًا ولكن لا يفرط في الماء.

2: تحويل أجروباكتيريوم مع ناقل عن طريق الكهرباء

نوصي باستخدام بنية الجينات المراسل في تجاربك الأولية لتحسين البروتوكول وفقًا لظروفك المحلية. يحتوي pGoldenGreenGate (pGGG) الذي نصفه هنا على جين مقاومة hygromycin (hpt) و كات 1 intron تحت سيطرة الأرز أكتين 1 المروج ، وجين β-glucuronidase (GUS) مع اثنين من introns (GUS2Int) تحت سيطرة محفز يوبيكويتين الأرز (Addgene cat. رقم 165418) ، جنبًا إلى جنب مع البلازميد المساعد pAL155 الذي يحتوي على عنصر إضافي العذراء الجين (الشكل 1). أعطى هذا المزيج أعلى كفاءة تحويل داخل نظامنا (Hayta et al. ، 2019).

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في خزانة التدفق الصفحي تحت ظروف معقمة. تأكد من تبريد الخلايا وحاوية الكوفيت والحمض النووي على الجليد.

المواد

  • الخلايا الكهرومغناطيسية شديدة الضراوة أغروباكتريوم توميفاسيانز سلالة AGL1
  • ناقل ثنائي DNA لاستخدامه
  • DNA البلازميد المساعد ، في حالة استخدامه
  • LB متوسطة وصلبة وسائلة (برتاني ، 1951)
  • المضادات الحيوية لاختيار أجروباكتريوم ناقلات السلالة والثنائية المستخدمة (على سبيل المثال ، ريفامبيسين أو كاناميسين انظر الخطوة 7)
  • MG / L متوسط ​​، سائل
  • وسط لتلقيح القمح (WIM) ، سائل
  • 100 ملي أسيتوسيرنغون (انظر الوصفة)
  • كفيت كهربائي بفاصل 2 مم (Sarstedt Limited 67.742) ، مُجهز مسبقًا على الجليد
  • جهاز Bio-Rad GenePulser أو جهاز كهربائي مشابه
  • انابيب فالكون 15 مل معقمة (Life Sciences 430790)
  • شرائط بارافيلم (Parafilm®-PM-992)
  • شاكر كهربائي
  • ألواح بتري أحادية الفتحة مقاس 90 مم (Thermo Scientific 101R20)
  • أنبوب فالكون سعة 50 مل (Starlab E1450-0800)
  • ورق ألومنيوم

تحول أجروباكتريوم مع ناقلات

1. أذاب 50 ميكرولتر من الخلايا شديدة الضخامة أغروباكتريوم توميفاسيانز سلالة AGL1 على الجليد. يجب أن يستغرق هذا ∼5 دقائق.

2. أضف 1 ميكرولتر (100 نانوغرام) ناقل DNA ثنائي (ونفس الكمية من البلازميد المساعد ، في حالة الاستخدام) إلى الخلايا المختصة ، واخلطها برفق عن طريق النقر ، ثم ضعها مرة أخرى على الجليد.

3. نقل الخلايا ومزيج الحمض النووي إلى كفيت مُجهز مسبقًا على الجليد. انقر برفق للتأكد من وجود المحتويات أسفل الكوفيت. يحفظ على الجليد.

4. Electroporate باستخدام Bio-Rad GenePulser ، بالإعدادات 2.50 كيلو فولت ، 25 μFD ، 400 Ω ، وثابت الوقت بين 8.0 و 9.5 مللي ثانية.

5. قم على الفور بإضافة 100 ميكرولتر من وسط LB السائل إلى الكوفيت للسماح للخلايا بالتعافي. نقل الخلايا إلى وسط 500 ميكرولتر في أنبوب فالكون معقم. لف غطاء أنبوب فالكون ببارافيلم لتأمينه.

6. احضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة ، ضع أنبوب فالكون أفقيًا على شاكر ، ورجها برفق عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 4-6 ساعات.

7. انشر 20 و 40 ميكرولتر من المزرعة الكهربية ، على التوالي ، على لوحين من وسط LB صلب مع استكمال المضادات الحيوية المناسبة.

بالنسبة لسلالات C58 من الأجرعية (مثل AGL1) ، أضف ريفاميسين عند 50 ميكروغرام / مل للاختيار ، وعند استخدام pGGG ، استخدم كاناميسين عند 50 ميكروغرام / مل.

8. احتضان لوحة مقلوبة عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

تحضير الجراثيم للتحول

9. من اللوحة الملقحة ، حدد مستعمرات مفردة من أجروباكتريوم AGL1 ، الذي يحتوي على الناقل المطلوب ، وقم بتلقيح 10 مل من وسط LB السائل المحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. احتضان عند 28 درجة مئوية في شاكر دوارة ، واهتزت عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 65 ساعة.

10. الاستعداد أجروباكتريوم اللقاحات القياسية للتحول كما تم وصفها سابقًا بواسطة Tingay et al. (1997). امزج كميات متساوية من أجروباكتريوم الثقافة و 30٪ الجلسرين المعقم. جعل 400 ميكرولتر قسامة في 0.5 مل ميكروسينتريفوجي وتجميد في -80 درجة مئوية.

يتم تخزين قسامات اللقاح القياسية عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. يمكن تخزينها إلى أجل غير مسمى تقريبًا.

11. في اليوم السابق لتحويل القمح ، استخدم معيارًا واحدًا سعة 400 ميكرولتر أجروباكتريوم لقاح لتلقيح 10 مل من وسط سائل MG / L (Garfinkel & Nester ، 1980) بدون مضادات حيوية واحتضانها عند 28 درجة مئوية في شاكر دوار ، يتم رجها عند 200 دورة في الدقيقة طوال الليل (16 ساعة).

12. في يوم التحول ، قم بتكوير البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في أنبوب فالكون سعة 50 مل عند 3100 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 24 درجة مئوية. تجاهل المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا برفق في وسط تلقيح القمح سعة 10 مل (WIM) إلى كثافة بصرية تبلغ 0.5 OD (600 نانومتر). ثم أضف 100 ملي أسيتوسيرنغون (AS) إلى تركيز نهائي 100 ميكرومتر.

13. احتضان الثقافة لمدة 4-6 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع التحريض اللطيف (80 دورة في الدقيقة) في الظلام (لف أنبوب فالكون بورق الألمنيوم) قبل الانتقال إلى البروتوكول الأساسي 3.

3: بدء جمع المواد والتعقيم وتلقيح الجنين

يصف هذا البروتوكول مجموعة مواد البداية في المرحلة الصحيحة ، وتعقيمها ، ثم تلقيح الأجنة غير الناضجة.

المواد

  • مانح من نباتات القمح ذات المسامير (البروتوكول الأساسي 1)
  • 70٪ (حجم / حجم) إيثانول
  • ماء مقطر معقم
  • 10٪ (حجم / حجم) هيبوكلوريت الصوديوم (فلوكا 71696)
  • وسط تلقيح القمح (WIM انظر الوصفة)
  • سلويت إل 77
  • الأطباق المتوسطة لزراعة القمح المشتركة (انظر الوصفة)
  • دورق تعقيم سعة 150 مل
  • ملقط دقيق
  • أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل
  • ألواح بتري أحادية الفتحة بقطر 90 مم (Thermo Scientific No 101R20)
  • صفيحة بتري قطرها 50 مم ، معقمة
  • مقص
  • شريط Micropore

جمع وتعقيم البذور غير الناضجة

1. اجمع سنابل القمح 14 يومًا بعد التخليق ، عندما يبلغ قطر الأجنة غير الناضجة 1-1.5 مم وفي مرحلة الحليب المبكرة GS73 (الشكل 2 أ).

2. استخدم حبات من الزهيرات 1 و 2 (الشكل 2 ب) على السنيبلات المركزية (الشكل 2 ج) للتحول. قطع المظلات من الأذنين ∼3-5 مم من الحبوب.

يمكن إزالة غلاف البذرة ، لكن هذا ليس ضروريًا ما لم يكن من المتوقع حدوث مشاكل تلوث.

3. افصل الحبيبات غير الناضجة عن الأذن وضعها في وعاء تعقيم سعة 150 مل.

4. تعقيم الحبوب تحت ظروف معقمة (على سبيل المثال ، مجلس الوزراء تدفق الصفحي) باستخدام 70٪ (ت / ت) الإيثانول لمدة 1 دقيقة. شطف مرة واحدة بالماء المقطر المعقم ثم ضعه في 10 مل 10٪ (حجم / حجم) هيبوكلوريت الصوديوم واتركه لمدة 7 دقائق. ثم تغسل الحبوب ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم.

عزل الأجنة غير الناضجة ، والتلقيح بالبكتيريا الأجروية ، والزراعة المشتركة

5. عزل الأجنة (الشكل 3 أ) من الحبوب غير الناضجة باستخدام ملقط دقيق.

6. نقل الأجنة إلى أنابيب ميكروسينتريفوجية 1.7 مل تحتوي على 1 مل WIM مع 0.05٪ Silwet L-77 ، ووضع 100 جنين في كل أنبوب (الشكل 3 ب).

7. بعد عزل جميع الأجنة ، قم بإزالة WIM وأضف WIM جديدًا إلى أنبوب (أنابيب) جهاز الطرد المركزي الصغير. الطرد المركزي للأجنة المعزولة 10 دقائق عند 14000 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية (إيشيدا ، تسونشيما ، هيي ، وكوماري ، 2015).

8. قم بإزالة WIM باستخدام ماصة ، أضف 1 مل أجروباكتريوم الحل ، وقلب الأنابيب بشكل متكرر لمدة 30 ثانية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل.

9. بعد فترة الحضانة ، صب أجروباكتريوم التعليق مع الأجنة في لوحة بتري فارغة معقمة قطرها 50 مم ثم إزالة التعليق باستخدام الماصة.

10. انقل 25 جنيناً ، وجانب scutellum إلى أعلى ، إلى صفيحة (ألواح) جديدة من وسط زراعة القمح المشترك في ألواح بتري أحادية الفتحة قطرها 90 مم.

11. ختم لوحات بتري بشريط Micropore واحتضانها عند 24 ± 1 درجة مئوية في الظلام لمدة 3 أيام من الزراعة المشتركة (الشكل 3 ج).

4: اختيار ، تجديد ، تأصيل ، وإضفاء الطابع الرسمي على عمليات النقل

يصف هذا البروتوكول فترة الراحة بعد التحول مباشرة ، وعملية الاختيار ، وتجديد النبتة وتجذيرها ، وأخيراً التأقلم من الثقافة المختبرية إلى التربة. فترة الراحة هي فترة 5 أيام بعد الزراعة المشتركة التي أجروباكتريوم باستخدام timentin ، لا تخضع المادة النباتية لضغط الاختيار. تسمح فترة الراحة هذه للمواد بالتعافي من أجروباكتريوم العدوى ويبدأ تحريض الكالس. عملية الانتقاء التي تلي ذلك تضع الكالي المنتج من الأجنة غير الناضجة تحت ضغط الاختيار باستخدام المضاد الحيوي hygromycin. يمكن أن تتكاثر الخلايا التي تحتوي على T-DNA وبالتالي فهي مقاومة للهيغروميسين في وسط يحتوي على hygromycin. The selection pressure continues through the remaining in vitro steps however, it is these first two phases that are referred to as Selection 1 and 2. During these two selection stages it is important that subcultures are done at the scheduled time, as delay may result in the growth of latent أجروباكتريوم, causing overgrowth and browning of callus, and/or the reduced stringency of selection may result in the growth of “escapes”, i.e., non-transformed plants.

المواد

  • Inoculated wheat embryos (Basic Protocol 3)
  • Wheat callus induction medium (WCI see recipe), solid and liquid
  • Wheat regeneration medium (WRM see recipe), solid
  • Extract-N-Amp™ Plant Tissue PCR Kits (Sigma XNAP-1KT)
  • REDExtract-N-Amp PCR Reaction Mix (Sigma XNAS)
  • Primer pair HygF 5′-AGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTT-3′ and HygR 5′-AGCTGCATCATCGAAATTGCCGTC-3′
  • GUS solution (see recipe)
  • 90-mm-diameter petri plate (Thermo Scientific No 101R20)
  • Deep petri dishes (tissue culture dish, 90 mm diameter × 20 mm, Falcon 353003)
  • De Wit culture tubes (Duchefa W 1607)
  • De Wit tray (Duchefa T1608)
  • Clear plastic propagator lid
  • Micropore tape

Resting period, callus induction, and selection of transformed material

1. After 3 days of co-cultivation, excise the embryogenic axes from the embryos using forceps (Fig. 4A).

2. Transfer the embryos to fresh wheat callus induction medium plates (WCI) and incubate at 24 ± 1°C in the dark for 5 days.

Timentin is included in the WCI medium to control Agrobacterium growth during the resting period.

3. Selection 1: After the 5-day resting period, transfer the embryos, scutellum side up, to fresh WCI plates as described above with the addition of 15 mg/liter hygromycin (10 mg/liter for Cadenza Fig. 4B), and incubate at 24 ± 1°C in the dark for 2 weeks (Fig. 4C).

4. Selection 2: After 2 weeks, split the calli at the into clumps of ∼4 mm 2 . Callus pieces derived from a single embryo should be labelled to keep track of their origin. Transfer the calli to fresh selection plates (WCI plates) as above, but with 30 mg/liter hygromycin (15 mg/liter for Cadenza), reducing the number of calli per plate by approximately half. Incubate at 24 ± 1°C in the dark for 2 weeks (Fig. 4D).

5. After 2 weeks, transfer the calli to a lit culture room under fluorescent lights (100 μmol/m 2 /s) at 24 ± 1°C with a 16-hr photoperiod and covered with a single layer of paper towel for a further week.

During this period, putative transformed lines should start to green and produce small shoots (Fig. 5A).

The hygromycin level might vary depending on the variety being transformed (see medium recipes). We recommend making a kill curve when trying to set up a completely new transformation system with varieties other than those listed here.

Regeneration of transgenic plants

6. After the 3 weeks on the selection 2 plates, transfer the calli a final time to wheat regeneration medium (WRM) in deep petri dishes (90 mm diameter × 20 mm). Remove the tissue paper covering the plates. Culture calli under fluorescent lights (100 μmol/m 2 /s) at 24 ± 1°C with a 16-hr photoperiod.

When transforming different wheat varieties, Kronos and Cadenza prefer slightly different regeneration media (see medium recipes below). Also, the concentration of hygromycin is reduced to 15 mg/liter for Cadenza.

If shoots/calli need to grow for longer on WRM, culture should be subcultured onto fresh medium.

7. Transfer regenerated shoots that are 1-2 cm in length with visible roots (Fig. 5B) to De Wit culture tubes containing 8 ml WCI without growth regulators and supplemented with 15 mg/liter hygromycin.

Label all plantlets derived from single embryos to keep track of their origins.

Putative transformed plants develop a strong root system with root hairs (Fig. 5C).

Acclimatization

8. After ∼10 days, gently remove regenerated plantlets with strong root systems from the tubes using long forceps. Wash the roots with cool running water to remove any remaining tissue culture medium.

9. Plant the plants in cereal mix in 24CT trays and cover with a clear plastic propagator lid. The plants should remain covered with the propagator lid for ∼1 week to maintain high humidity around them while they become established in soil.

The plants are grown under the same conditions as donor plants within a controlled environment room.

10. Once the plants are well established in the soil, leaf samples can be collected for further analysis to confirm the presence of the introduced genes.

تحري

Successful transformation should be confirmed by PCR amplification of the hygromycin resistance gene and/or copy number analysis performed by quantitative PCR.

DNA extraction

11. Harvest 0.5- to 0.7-cm leaf samples into PCR tubes, and extract DNA with Extract-N-Amp™ Plant Tissue PCR Kits following the manufacturer's instructions.

HygR (hpt) polymerase chain reaction (PCR)

12. Amplify the 335-bp amplicon of the hygromycin resistance gene (hpt) by PCR using the primer pair HygF 5′-AGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTT-3′, HygR 5′-AGCTGCATCATCGAAATTGCCGTC-3′, along with REDExtract-N-Amp PCR Reaction Mix (cat. no. XNAS), in a 20-µl volume per reaction. Each reaction should comprise 10 µl 2× PCR Reaction Mix (REDExtract-N-Amp), 4 µl DNA extract (∼50 ng DNA), 1 µl (10 mM) of each primer (Hyg F and Hyg R), and 4 µl sterile laboratory-grade water, in 20 µl total volume.

13. Perform PCR in a thermal cycler under the following conditions:

Initial step: 3 min 95°C
34 cycles: 30 s 95°C (denaturation)
30 s 58°C (annealing)
1 min 72°C (extension)
Final extension: 7 min 72°C
Final hold: - 10°C.

14. Resolve the PCR products by gel electrophoresis on a 1% agarose gel containing 0.1 μg/ml ethidium bromide.

GUS histochemical assay

NOTE: We suggest carrying out initial experiments with a control vector expressing a reporter gene such as GUS to assess and optimize the system for your local conditions. Using a reporter construct will allow you to follow the transformation process through the different stages.

15. Immerse the plant material in GUS assay substrate at 37°C under dark conditions overnight (∼ 16 hr).

16. Remove the GUS solution, and for green plant material, immerse in 70% ethanol to remove chlorophyll. Leave all green samples in 70% ethanol to remove chlorophyll and other plant pigments prior to visualization and photography.

Determine GUS activity after co-cultivation, resting (Fig. 6A), Selection 1 (Fig. 6B), and rooting in medium (Fig. 6C). An example of transgene inheritance in T1 seeds in the next generation as demonstrated by a GUS histochemical assay is shown (Fig. 6D).


Improved in planta genetic transformation efficiency in bitter gourd (Momordica charantia L.)

Production of transformed bitter gourd plants through في المختبر regeneration is a laborious practice, which may also result in somaclonal variations. Thereby, in the current study, we have established a less tedious in planta protocol for more efficient genetic transformation of bitter gourd var. NBGH-470 (Apurva) using the seed as a target material. Bitter gourd seeds were transformed by أغروباكتريوم توميفاسيانز strain LBA4404 bearing the pCAMBIA1301 binary vector, and the transformed plants were selected against hygromycin B. The putatively transformed bitter gourd (Tا) plants were examined by GUS assay. Two parameters, including vacuum infiltration and sonication improving the in planta transformation, have been investigated in the present work. Amongst several time durations examined, the highest transformation rate (37%) was achieved upon subjecting the pre-cultured bitter gourd seeds to sonication for 15 min, followed by vacuum infiltration for 6 min in LBA4404 culture suspension. The transformed bitter gourd (T1) plants were selected against hygromycin B, and the transgene integration was evaluated by polymerase chain reaction (PCR), Southern hybridization, and reverse transcriptase PCR (RT-PCR). The developed protocol in the current study is suitable to genetically engineer the bitter gourd plants with disease and pest-resistant traits.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


مبدأ

Transformation process allows a bacterium to take up genes from its surrounding environment that is transformation involves the direct uptakes of fragments of DNA by a recipient cell and the acquisition of new genetic characteristics. There are two major parameters involved in efficiently transforming a bacterial organism. The first is the method used to induce competence for transformation. The second major parameter is the genetic constitution of the host strain of the organism being transformed. Competent cells are capable of uptaking DNA from their environment and expressing DNA as functional proteins. If a bacterium is said to be competent, it has to maintain a physiological state in which it can take up the donor DNA. Calcium chloride treatment is one of the best methods for the preparation of competent cells. Competence results from alterations in the cell wall that makes it permeable to large DNA molecules. This is a naturally occurring process and through this bacteria can transfer advantageous characteristics, such as antibiotic resistance. Bacteria can take DNA from the environment in the form of plasmid. Most of them are double stranded circular DNA molecules and many can exist at very high copy numbers within a single bacterial cell. Many naturally occurring plasmids carry an antibiotic resistant gene referred to as a marker.

In the process of transformation, the competent cells are incubated with DNA in ice. Then it is placed in a water bath at 42ºC and further plunging them in ice. This process will take up the DNA into the bacterial cell. Then it is plated in an agar plate containing appropriate antibiotic. The presence of an antibiotic marker on the plasmid allows for rapid screening of successful transformants. Blue &ndashwhite selection (Alpha complementation) can be used to determine which plasmids carry an inserted fragment of DNA and which do not. These plasmids contain an additional gene (lac Z) that encodes for a portion of the enzyme &beta &ndash galactosidase. When it transformed into an appropriate host, one containing the gene for the remaining portion of &beta &ndashgalactosidase, the intact enzyme can be produced and these bacteria form blue colonies in the presence of X &ndash gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D-galactoside) and a gratuitous inducer called IPTG (Isopropyl &beta-D- Thiogalactopyronoside). These plasmids contains a number of cloning sites within the lac Z gene, and any insertion of foreign DNA into this region results in the loss of the ability to form active &beta &ndashgalactosidase. Therefore colonies that carry the plasmid with the insert, ie, Transformants will remain white and the colonies without the foreign DNA (Non-Transformants) will remain Blue. We can also calculate the efficiency of transformation by using the concentration of DNA and number of transformed colonies.


شاهد الفيديو: كفاءة تحول الطاقة (كانون الثاني 2023).