معلومة

ما هي متطلبات البنية الثانوية لمجالات نقل بروتين AKA الببتيدات التي تخترق الخلايا

ما هي متطلبات البنية الثانوية لمجالات نقل بروتين AKA الببتيدات التي تخترق الخلايا


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

اختراق الخلايا الببتيدات.

الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) هي فئة من متواليات الأحماض الأمينية القصيرة والتي تكون كافية لعبور أغشية الخلايا وتوصيل نفسها مع أي شحنة متصلة في سيتوبلازم الخلايا. تم وصفها مؤخرًا بـ CPPs ، بينما تم استخدام مصطلح "مجال نقل البروتين" (PTD) في الأيام الأولى من دراستهم ، عندما تم عزل التسلسلات الضرورية عن البروتينات الأصلية ذات النشاط المخترق للخلايا (لا سيما HIV-1 Tat) .

تركز معظم المؤلفات العلمية التي وجدتها عن CPPs على أهميتها المحتملة لتوصيل الأدوية المستهدفة ، وتناقش في الغالب توصيل البروتينات والجسيمات النانوية عبر اندماج CPPs إلى الطرف N للبروتين المستهدف. يشير سؤال وجواب هذا الموقع الوحيد على CPPs أيضًا إلى مناقشة اندماج N-terminal لـ CPPs إلى ببتيد البضائع. ومع ذلك ، فقد قطعت الأبحاث حول الببتيدات المخترقة للخلايا شوطًا طويلاً منذ مقالة 2005 المشار إليها في ذلك المنشور.

تسلط مراجعة Milletti لعام 2012 الضوء على وجود زيادة كبيرة في عدد الفئات المختلفة من الببتيدات التي تخترق الخلايا ، بما في ذلك CPPs الكارهة للماء ، و CPPs الأولية amphipathic ، و CPPs amphipathic amphipathic alpha-helical ، و CPPs amphipathic ورقة بيتا ، و CPPs الغنية بالبرولين ، من بين أمور أخرى . وذلك بين عامي 2005 و 2012 فقط! يغطي مقال Milletti 2012 أيضًا بعض نقاط CPP المعزولة من فيروسات أخرى.

لم أتمكن من العثور على مراجعة تفصيلية مماثلة مكتوبة منذ ذلك الحين ، على الرغم من أنني متأكد من إحراز تقدم كبير في هذا المجال.

على الرغم من أن هذا ليس سؤالي الرئيسي ، إلا أنني سأقدر أي استشهادات لمزيد من المراجعات الحديثة التي تتناول التفاصيل حول الآلية الجزيئية لاختراق الخلايا لفئة أو أكثر من فئات CPPs - خاصة مراجعة وظيفة PTDs في بروتيناتها الأصلية.

لقد بدأت فقط في البحث عن CPPs و PTDs في بروتيناتهم الأصلية وفي إعداد توصيل الدواء لأنه أصبح واضحًا أن البروتين الذي أدرسه في أطروحة جامعية قد يكون له PTD داخلي وهو أمر ضروري لوظيفته. لست خبيرًا في هذا الموضوع وسأكون ممتنًا للحصول على معلومات حول CPPs / PTDs بما في ذلك المزيد من المرادفات لـ CPPs / PTDs للمساعدة في بحثي في ​​الأدبيات - خاصة المرادفات الخاصة بالبروتينات الأصلية ذات الوظائف المشابهة لـ CPP.

ما هي متطلبات البنية الثانوية للببتيدات المخترقة للخلايا؟

سؤالي هو ما إذا كانت CPPs الموصوفة مسبقًا و / أو الفئات الجديدة من CPPs الموصوفة في Milletti 2012 تعمل فقط كدمج N-terminal ، أو ما إذا كانت تعمل عادةً بكفاءة عندما يتم دمجها في حلقة داخلية (من حيث التسلسل الأولي ، ولكن لا يزال معرضًا للمذيب). ذكرت مقالة 2005 المذكورة في سؤال هذا الموقع السابق حول هذا الموضوع أن CPP المشتق من HIV-1 Tat يعتمد على البقايا 47-57 ، وهي مخلفات داخلية لبروتين الأحماض الأمينية 86 - وهو بروتين له نشاط اختراق الخلايا في دوره الأصلي في الإصابة بفيروس HIV-1.

لذلك ، سؤالي ليس ما إذا كان هذا يحدث أم لا - من الواضح أنه يفعل - ولكن إلى أي مدى يكون لـ CPPs المعزولة من التتابعات الداخلية للبروتينات الأصلية وظائف شبيهة بوظائف CPP في بروتيناتها الأصلية؟

النظام الذي أدرسه من أجل رسالتي هو فيروس ، لذا فإن أي معلومات خاصة عن وظائف CPPs و PTDs في البروتينات الأصلية للفيروسات ستكون مفيدة بشكل خاص.


مراجع

جونز ، إس دبليو ، كريستيسون ، آر ، بونديل ، كيه ، فويس ، سي جي ، بروكبانك ، إس إم في ، نيوهام ، بي ، وليندساي ، إم إيه (2005). توصيف توصيل الببتيد الذي يخترق الخلايا بوساطة الببتيد. المجلة البريطانية لعلم الأدوية ، 145 (8) ، 1093-1102. http://doi.org/10.1038/sj.bjp.0706279

ميليتي ، ف. (2012). مراجعة: الببتيدات المخترقة للخلايا: الفئات والأصل والمشهد الحالي. اكتشاف المخدرات اليوم ، 17850-860. دوى: 10.1016 / j.drudis.2012.03.002

Vivès، E.، Brodin، P.، & Lebleu، B. (1997). ينتقل المجال الأساسي لبروتين HIV-1 Tat المبتور بسرعة عبر غشاء البلازما ويتراكم في نواة الخلية. مجلة الكيمياء البيولوجية ، 272 (25) ، 16010-16017.

إذا كان أي شخص مهتم بالإجابة على هذا السؤال ليس خبيرًا ، فإن أفضل مورد يمكنني تقديمه حاليًا لقائمة CPPs المشتقة من البروتينات الطبيعية (إلى جانب مقالة Milletti 2012 أعلاه) هي:

Hallbrink، M.، Kilk، K.، Elmquist، A.، Lundberg، P.، Lindgren، M.، Jiang، Y.، &… Langel، U. (n.d). التنبؤ بالببتيدات التي تخترق الخلايا. المجلة الدولية لأبحاث وعلاجات الببتيد ، 11 (4) ، 249-259.


سأستمر في البحث في هذا الموضوع من أجل أطروحتي ، لذلك إذا كنت مهتمًا بالإجابة على هذا السؤال ولكنك تحتاج إلى مزيد من المعلومات ، فلا تتردد في التعليق لطلب معلومات محددة من شأنها أن تساعد.

شكرا لك!


لا يمكنني إعطاء تفسير لسؤالك كإجابة واحدة ولكني متأكد من أن المقالات المذكورة أدناه ستوضح شكوكك.

  1. الببتيدات المخترقة للخلية: استراتيجيات التصميم خارج الهيكل الأساسي و Amphipathicity - الجزيئات 2017 ، 22 (11) ، 1929 ؛ دوى: 10.3390 / جزيئات 22111929. PMID: 29117144

  2. الببتيدات المخترقة للخلايا وفائدتها في تعديلات وظائف الجينوم (مراجعة). إنت J مول ميد. 2017 ديسمبر ؛ 40 (6): 1615-1623. دوى: 10.3892 / ijmm.2017.3172. Epub 2017 4 أكتوبر. PMID: 29039455

  3. التحليل الطيفي للوميض الكمي وتحليلات قياس التدفق الخلوي لمسارات استيعاب الببتيدات المخترقة للخلايا: التحسين ، المزالق ، المقارنة مع القياس الكمي لقياس الطيف الكتلي. التقارير العلمية المجلد 6 ، رقم المادة: 36938 (2016). دوى: 10.1038 / srep36938


الببتيدات المخترقة للخلايا: من الآليات الجزيئية إلى العلاجات

الاكتشاف الأخير لجزيئات علاجية جديدة لا تصل إلى العيادة بسبب سوء التسليم وانخفاض التوافر البيولوجي جعل توصيل الجزيئات حجر الزاوية في التطور العلاجي. تم تصميم العديد من التقنيات لتحسين الامتصاص الخلوي للجزيئات العلاجية ، بما في ذلك CPPs (الببتيدات المخترقة للخلايا) ، والتي تمثل مفهومًا جديدًا ومبتكرًا لتجاوز مشكلة التوافر البيولوجي للأدوية. تشكل برامج حماية المستهلك أدوات واعدة للغاية وقد تم التقدم بطلب للحصول عليها بنجاح في الجسم الحي. تم وصف استراتيجيتين CPP حتى الآن ، تتطلب الأولى ارتباطًا كيميائيًا بين الدواء والناقل لاستيعاب الدواء الخلوي ، والثانية تعتمد على تكوين مجمعات مستقرة مع الأدوية ، اعتمادًا على طبيعتها الكيميائية. إن عائلات Pep و MPG عبارة عن ببتيدات أمفيباثيك قصيرة ، والتي تشكل جسيمات نانوية مستقرة مع البروتينات والأحماض النووية على التوالي. تدخل الجسيمات النانوية القائمة على MPG و Pep الخلايا بشكل مستقل عن المسار الداخلي وتوصيل الشحنات بكفاءة ، في شكل نشط بيولوجيًا بالكامل ، إلى مجموعة كبيرة ومتنوعة من خطوط الخلايا ، وكذلك في النماذج الحيوانية. تركز هذه المراجعة على العلاقة الهيكلية والوظيفية لاستراتيجيات MPG و Pep-1 غير التساهمية ، ومتطلباتها للامتصاص الخلوي للجزيئات الحيوية والتطبيقات في الخلايا المستنبتة والنماذج الحيوانية.

الاختصارات المستخدمة:


الملخص

يمكن للببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) نقل شحنات مختلفة عبر أغشية الخلايا الحية. منذ أن عانت الأجيال الأولى من CPPs من عدم كفاية انتقائية الخلايا والأنسجة ، والاستقرار ضد البروتياز ، والهروب من الإندوسومات ، تم تطوير جيل جديد من الببتيدات ، بخصائص محسنة. هذه إما مستمدة من مصادر طبيعية أو تم إنشاؤها من خلال مزيج من الهياكل متعددة التكافؤ. تسمح الطريقة الثانية بتحقيق كفاءة استيعاب عالية ، وانتقائية عالية للخلايا والأنسجة ، والإفراج عن الجسيمات الداخلية عبر الهياكل الهجينة ، والجمع بين متواليات التحرر الداخلي ، وتسلسل التوجيه ، وتسلسل التنشيط في الأنسجة المستهدفة والتسليم المحلي للبضائع. تشمل CPPs ذات الانتقائية الفطرية للورم أزورين ، كروتامين ، موروكالسين ، ليكوزين -1 ، جاموس كاثليسيدين ، وببتيد CB5005. يمكن لبعضها اختراق أغشية الخلايا الحية والتأثير على مسارات الإشارات داخل الخلايا ، وبالتالي ممارسة تأثيرات سامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية. للحصول على اختراق متعدد الطبقات واستقرار ضد التدهور التحلل للبروتين ، وكذلك لتحسين التعامل ، غالبًا ما يتم ربط CPPs بالجسيمات النانوية. مشكلة خاصة لعلاج الورم هي كفاءة نقل الدواء من خلال مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد. لذلك ، فإن قدرة CPPs على توصيل الدواء حتى إلى الأنسجة الأعمق لها أهمية حاسمة. والجدير بالذكر أن قدرة بعض CPPs على اختراق الحواجز مثل الجلد والحاجز الدموي الدماغي (BBB) ​​والقرنية أو ملتحمة العينين مكنت من استبدال الحقن الخطيرة والمؤلمة بالبخاخات المهدئة والكريمات والقطرات. ومع ذلك ، من الصعب ترتيب فعالية CPPs لأن كفاءة النقل وانتقائية الأنسجة لا تعتمد فقط على CPP نفسها ولكن أيضًا على النسيج أو العضو المستهدف ، وكذلك على الحمولة وطريقة اقتران CPP-البضائع. لذلك ، تصف المراجعة الحالية بعض الأمثلة على الجيل الجديد من CPPs وتهدف إلى تقديم المشورة حول كيفية العثور على أو إنشاء CPP المناسب لمهمة معينة.


الفصل 10 - توصيل الببتيد والبروتين مع الببتيدات التي تخترق الخلايا

الببتيدات الأكثر شيوعًا التي تخترق الخلايا (CPPs): تم إثبات كل من Tat و oligoarginine و transportan لتسهيل دخول شحنات البروتين / الببتيد إلى الخلايا في كل من المختبر والحي. في الأنظمة الخلوية ، أظهر النقل خصائص استيعاب أكبر من CPPs المذكورة أعلاه الغنية بالأرجينين ويمكن وصف كفاءة امتصاصها على النحو التالي: transportan & gt oligoarginine & gt Tat peptide. عند اختيار تسلسل CPP "الصحيح" لتسليم البضائع ، يجب مراعاة كلا الجانبين ، وعند استخدام تركيزات أقل ، يجب تفضيل الناقل أو oligoarginine. ومع ذلك ، في الجسم الحي ، لم يتم دراسة كفاءة الامتصاص والنوعية والسمية على نطاق واسع بالنسبة لـ CPPs المختلفة. ومع ذلك ، من الواضح أنه بالنسبة للتسليم المستهدف ، يجب إضافة بعض الزخارف الإضافية إلى تسلسل CPP. أحد الجوانب الواعدة إلى حد ما لتسليم الببتيدات / البروتينات بوساطة CPP هو أن الترانزيت في الخلايا البطانية يتطلب الكافولين. العديد من CPPs ، وخاصة الناقلات ، تستغل مسار الكهفولين لدخول الخلية ، مما قد يعطي النقل "ميزة" مفيدة في الجسم الحي. على الرغم من عدد العقبات والتحديات المعلقة التي لا تزال تواجه اليوم ، فإن العدد المتزايد من أمثلة التسليم في الجسم الحي ، Tat-HSP70 لإنقاذ الخلايا العصبية و Tat-Bcl-x (L) لتحسين بقاء الخلايا العصبية السليفة ، يؤكد أن المشاكل يمكن أن تكون التغلب بطريقة أو بأخرى.


لماذا تستخدم DDS؟

يطرح الكائن البشري العديد من الصعوبات من أجل التوصيل الآمن للمستحضرات الصيدلانية الفعالة إلى الخلية المستهدفة 14. تسمح الإدارة المنهجية والاستراتيجيات الوريدية بالتوافر البيولوجي بنسبة 100 ٪ ، وتجنب التدهور الأيضي المعوي والكبدي. بمجرد وصول الدواء إلى مجرى الدم ، يحتاج الرصاص إلى التغلب على بعض التحديات ، وتجنب استجابة الجهاز المناعي (تنشيط المكمل والبلعمة) ، وكذلك تراكم بروتين المصل وترشيح الكلى 24. بمجرد الاقتراب من الخلية المستهدفة ، سيشكل غشاء حقيقيات النواة مزيدًا من العوائق ، كونه حاجزًا غير منفذ لمعظم الكائنات الحية الدقيقة 11 ، 15 ، 24 ، 25. يسمح غشاء البلازما فقط بتدفق المركبات الصغيرة ، مما يتطلب ناقلات لمعظم الجزيئات الكبيرة المحبة للماء 17.

تنتج الحاجة إلى DDS للجزيئات الصغيرة والعلاجات المصممة حسب الجينات أيضًا من خصائصها الكيميائية الحيوية مثل ضعف الاستقرار ، ونقص امتصاص الخلايا وعدم كفاية القدرة على الوصول إلى الأهداف 18 ، 19 ، 26 ، 27. وبالتالي فإن هذه هي التحديات الرئيسية الجديدة في الطب - كيفية الحصول على عوامل علاجية فعالة تعمل محليًا مع تأثيرات ضارة محدودة خارج الهدف 26 ، مع عدم فقدان الفعالية الصيدلانية أو الحاجة إلى زيادة الجرعات.

تم تطوير العديد من DDS 14 ، 28 ، 29. أثناء تصور مثل هذه التكنولوجيا ، ينبغي للمرء أن يفكر في استخدام مواد متوافقة حيوياً لعمليات تجميع بسيطة ولكنها قوية. يعد تحسين المعلمات الفيزيائية الحيوية الكيميائية وضبطها لتحسين خصائص الحرائك الدوائية والديناميكية الدوائية لـ DDS من المتطلبات الملحة أيضًا في هذا المجال 14 ، 26. يجب أن يعمل DDS الناجح على أنسجة مختلفة ، وأن يكون له إطلاق سريع للجسيم الداخلي ، وأن يكون وظيفيًا بجرعات منخفضة ، وليس له سمية ، ويسهل إدارته فيما يتعلق بالتطبيقات العلاجية 18.

تم تطوير العديد من التقنيات وبعض الأمثلة على مناهج DDS هي: electroporation 30 ، توصيل البلازميد بالموجات فوق الصوتية 31 ، التوصيل الفيروسي 32 ، البخاخات 33 ، التعديل الكيميائي المباشر 34 ، والارتباط بمركبة التوصيل غير الفيروسية مثل الدهون 35 ، الجسيمات الشحمية 36 ، المتشعبات 37 ، البوليمرات الكاتيونية 38 ، الجسيمات غير العضوية 39 ، الأنابيب النانوية الكربونية 40 ، الجزيئات الصغيرة 41 ، روابط المستقبل 42 ، مؤخرًا ، البروتينات فائقة الشحن 43 ، 44 ، و CPP 18 ، 45 ، 46. ستركز هذه المراجعة على نوع واحد محدد من DDS ، CPP ، بشكل أساسي على ميزاته وتطبيقه على العلاجات السريرية. يوضح الشكل 1 حالة تقنيات DDS والشحنات التي تم تسليمها بالفعل إلى الخلايا باستخدام مسارات خلوية خلوية أو عن طريق نقل الغشاء المباشر.


تطبيق استراتيجيات CPP لتوصيل الجزيئات العلاجية

يتزايد عدد التطبيقات التي تستخدم CPPs بوعي ، وحتى الآن أكثر من 300 دراسة تستخدم استراتيجيات قائمة على التساهمية أو غير التساهمية من CPP من في المختبر إلى في الجسم الحي تم الإبلاغ عنها (Dietz and Bähr، 2004 Gros وآخرون.، 2006 موسكوس وآخرون.، 2007 باتل وآخرون.، 2007 Foerg and Merkle ، 2008). يعود الاهتمام بـ CPPs بشكل أساسي إلى انخفاض سميتها الخلوية وإلى حقيقة أنه لا يوجد حد لنوع البضائع. على الرغم من استخدام CPPs لتحسين تسليم البضائع التي تختلف اختلافًا كبيرًا في الحجم والطبيعة (الجزيئات الصغيرة ، قليل النوكليوتيد ، DNA البلازميد ، الببتيد ، البروتين ، الجسيمات النانوية ، التركيبة القائمة على الدهون ، الفيروسات ، النقاط الكمومية) تصف معظم التطبيقات توصيل oligopeptide / البروتين (Dietz and Bähr، 2004 Gros وآخرون.، 2006 باتل وآخرون.، 2007) والأحماض النووية أو النظائر (جوليانو وآخرون.، 2008) (الجدول 1).

الاستراتيجيات القائمة على CPP لتسليم الجينات

تشكل النفاذية الضعيفة لغشاء البلازما للخلايا حقيقية النواة للحمض النووي جنبًا إلى جنب مع انخفاض كفاءة الحمض النووي أو قليل النوكليوتيدات للوصول إلى هدفها داخل الخلايا حاجزين رئيسيين لتطوير هذه الجزيئات العلاجية. في العقد الماضي ، تم تطوير عدد من ناقلات الببتيد التي تجمع بين ربط الحمض النووي ، وخاصة المجال الكهروستاتيكي (بوليليسين وبوليارجينين) وخصائص مزعزعة لاستقرار الأغشية لتسهيل نقل الجينات إلى الخلايا المستزرعة والحيوانات الحية (Niidome and Huang ، 2002 Glover وآخرون.، 2005 موريس وآخرون.، 2008). الببتيدات Amphipathic مع أنشطة الانصهار والتحلل المعتمد على الأس الهيدروجيني مثل الببتيد الانصهار لـ HA2 أظهرت الوحدة الفرعية للإنفلونزا هيماجلوتينين ، أو نظائرها الاصطناعية GALA ، و KALA ، و JTS1 ، والببتيدات الغنية بالهيستيدين أنها تزيد من كفاءة تعداء العدوى عندما ترتبط بـ poly-L-lysine / DNA ، أو ببتيد مكثف / DNA ، أو دهون كاتيونية ، أو بولي إيثيلينيمين أو بولي أميدامين البوليمرات المتتالية (للمراجعة: موريس وآخرون.، 2008). سلاسل ببتيد مفردة قادرة على تكثيف الحمض النووي وتفضيل الهروب الداخلي (PPTG1) (Rittner وآخرون.، 2002) أو منع الامتصاص الداخلي (MPG: Morris وآخرون.، 1999) لتوصيل الجينات في الخلايا المستنبتة. ومع ذلك ، تم التحقق من صحة عدد قليل فقط من CPPs في الجسم الحي لتسليم الجينات وحتى الآن ، يشكل الببتيد الثانوي أمفيباثيك PPTG1 أحد الأمثلة الوحيدة التي تشير إلى في الجسم الحي استجابة التعبير الجيني بعد الحقن في الوريد (Rittner وآخرون.، 2002). ارتبطت CPPs Tat و Transportan و polyarginine مع طرق توصيل الجينات غير الفيروسية المستندة إلى الدهون ، بما في ذلك الجسيمات الشحمية ، PEI أو الهياكل النانوية (Branden وآخرون.، 1999 تونغ وآخرون.، 2002 اغناتوفيتش وآخرون.، 2003 رودولف وآخرون.، 2003 كيلك وآخرون.، 2005). ارتباط Tat و octa-arginine بالناقلات النانوية الصيدلانية ، الموصوفة بأنظمة توصيل غير فيروسية تعتمد على مفاهيم التعبئة الجديدة "التغليف المبرمج" جهاز NanoDevice متعدد الوظائف من نوع المغلف (MEND) (Kogure وآخرون.، 2004 ماكاي وآخرون.، 2008) ، لتحسين توصيل الجينات وتقديم ميزة الجمع بين عناصر التسليم والتعبئة والاستهداف داخل نفس الجسيمات (Torchilin ، 2008 Vivès وآخرون., 2008 ).

يتمثل العائق الرئيسي الثاني لأنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية في ضعف إزاحتها النووية ، وهو مع ذلك ضروري لترنسفكأيشن الخلايا غير المنقسمة والعلاج الجيني. من أجل تحسين التوصيل النووي لبلازميدات الحمض النووي ، تم تطبيق الببتيدات الاصطناعية التي تحتوي على NLS على نطاق واسع (Cartier and Reszka، 2002 Escriou وآخرون.، 2003). تم إجراء معظم هذه الدراسات بالتسلسل المشتق من مستضد T كبير الحجم SV40 NLS (PKKKRKV). ارتبط هذا التسلسل إما بالببتيدات المخترقة للأغشية أو الببتيدات الكاتيونية ، ولكنه أيضًا مرتبط بشكل مباشر بالشحنات أو تم دمجه مع طرق تعداء أخرى لتسهيل التوصيل إلى النواة. علاوة على ذلك ، ارتبطت تسلسلات NLS بمختلف CPPs الكارهة للماء من أجل تفضيل الاستهداف النووي وكذلك ربط الحمض النووي والضغط. لقد ثبت أن مجال NLS لـ MPG يحسن الانتقال النووي للأحماض النووية دون الحاجة إلى انهيار الغشاء النووي أثناء الانقسام. تم تطبيق تقنية MPG على كل من توصيل DNA البلازميد وأوليغنوكليوتيد بكفاءة عالية في عدد كبير من خطوط الخلايا الملتصقة والمعلقة (Simeoni وآخرون.، 2003 موريس وآخرون.، 2007 ب).

الاستراتيجيات القائمة على CPP للتسليم التناظري قليل النوكليوتيد

تشكل الكتلة المجسمة قليلة النوكليوتيد المحايدة الصغيرة بما في ذلك PNAs و phosphorodiamidate morphorodiamidate morpholino-oligomers (PMO) جزيئات قوية لتطبيق مضاد المعنى أو استراتيجيات تصحيح الربط mRNA. تم تطبيق العديد من CPPs بنجاح لتسليم PNA و PMO بدون شحن في المختبر و في الجسم الحي من خلال الاقتران التساهمي (Gait، 2003 Moulton and Moulton، 2004 Zatsepin وآخرون.، 2005 جوليانو وآخرون.، 2008). تم الإبلاغ عنها في الأصل مع Transportan لـ في الجسم الحي تسليم PNA مضاد للحساسية يستهدف مستقبلات الجالانين وتعديل انتقال الألم (Pooga وآخرون.، 1998) ، تم تمديد استخدام CPPs لتوصيل قليل النوكليوتيد الكتلي إلى Tat ، و penetratin ، و TP10 (نسخة قصيرة من Transportan) والببتيدات الغنية بالأرجينين. تم الإبلاغ عن العديد من الأساليب التساهمية القائمة على CPP لإيصال PNA المضاد (Koppelhus and Nielsen ، 2003). ومع ذلك ، تم استخدام عدد قليل فقط في الجسم الحي، وحتى وقت قريب لم يتم الإبلاغ عن أي منها نشط في التركيزات دون المولية (Gait ، 2003 Abes وآخرون.، 2007). أفادت دراسة تفصيلية لتسليم PNA بوساطة CPP أن القيد الرئيسي يرجع إلى عزلهم الداخلي (Koppelhus and Nielsen ، 2003) ، وقد تم وصف CPPs الجديدة مؤخرًا بواسطة مجموعات Lebleu و Gait بما في ذلك R6-penetratin و 6-aminohexanoic oligoarginine متباعد الحمض [(R-Ahx-R)4] ، والتي تُظهر عزلًا داخليًا محدودًا وتؤدي إلى استجابة مضادة للتضخم أو استجابة تصحيح التضفير (Abes وآخرون.، 2006 2007). تم التحقق من صحة هذه CPPs في الجسم الحي لتصحيح التضفير على نموذجين علاجين: ضمور دوشين العضلي (Fletcher وآخرون.، 2007) وتكاثر الفيروس التاجي في الفئران (Burrer وآخرون.، 2007). كما تم تطبيق الاستراتيجيات غير التساهمية لتوصيل جزيئات PNA و DNA المقلدة (Nan وآخرون.، 2005). تم تطبيق الببتيد Pep-3 ، وهو البديل من Pep-1 ، بنجاح لتسليم PNA والنظائر التي تستهدف البروتين التنظيمي لدورة الخلية cyclin B1 في المختبر و في الجسم الحي (موريس وآخرون.، 2004 ب 2007 ب). ومن المثير للاهتمام ، أن تنظيم الجسيمات النانوية لمركب Pep-3 / PNA يسمح بتوظيف الطبقة السطحية للجسيم ، ويحسن ربط الحامل بشكل كبير من فعالية الاستجابة عن طريق تثبيت المجمعات. تُظهر هذه الدراسة أن مثل هذا التعديل يحسن Pep-3 للإعطاء الجهازي في الفئران ، مما يسمح بتخفيض كبير في الجرعة المطلوبة للحث على استجابة بيولوجية محددة وقوية ، مما يحد بالتالي من التأثيرات السامة للخلايا غير المحددة الموصوفة عند العلاج بتركيزات عالية من مجمعات CPP-PNA المترافقة أو غير التساهمية (Morris وآخرون.، 2007 ب).

توصيل قليل النوكليوتيد وسيرنا

تشكل oligonucleotides الطعم و RNAs قصيرة التداخل (siRNA) أدوات طبية حيوية قوية للتحكم في تنشيط البروتين و / أو التعبير الجيني بعد النسخ. (البشير وآخرون.، 2001 هانون ، 2002). ومع ذلك ، فإن القيد الرئيسي لتطبيقات siRNA ، مثل معظم الاستراتيجيات القائمة على الحمض النووي أو المضاد للدلالة لا يزال ضعف امتصاصها الخلوي المرتبط بضعف نفاذية غشاء الخلية للأحماض النووية. تم اقتراح العديد من الاستراتيجيات الفيروسية وغير الفيروسية لتحسين إيصال النواقل التي تعبر عن siRNA أو siRNAs الاصطناعية في كل من الخلايا المستنبتة و في الجسم الحي (دي فوجيرول وآخرون.، 2007 جوليانو وآخرون.، 2008). تم تطوير استراتيجيات قائمة على CPP لتحسين توصيل قليل النوكليوتيدات على حد سواء في المختبر و في الجسم الحي. يعتبر توصيل قليل النوكليوتيد المشحون و siRNA أكثر صعوبة حيث تتفاعل الشحنات الأنيونية المتعددة للحمض النووي مع جزء CPP وتمنع الامتصاص عن طريق العائق الفراغي. تم تحقيق تسليم قليل النوكليوتيد المشحون باستخدام إما استراتيجيات التهجين غير التساهمية القائمة على الببتيد أو PNA. في الأخير ، ترتبط CPPs تساهميًا بـ PNA القادرة على التهجين باستخدام أليغنوكليوتيد مزدوج الشريطة يحتوي على سلسلة مرافقة مكملة لـ PNA. تم تطبيق استراتيجيات مع Transportan و TP10 CPP لتسليم طعم قليل النوكليوتيد المتفاعل مع NFkB أو Myc (Fisher وآخرون.، 2004 الأندلس وآخرون.، 2005). تم تطبيق نظام التوصيل المعتمد على الببتيد MPG بنجاح لإيصال أنواع مختلفة من الأحماض النووية ، بما في ذلك الفوسفوديستر - قليل النوكليوتيد الذي يستهدف بروتين فوسفاتيز cdc25C (موريس) وآخرون.، 1999) ، فوسفوروثيوات أليغنوكليوتيدات تستهدف محفز MDR-1 في خلايا سرطان الدم CEM البشرية (Marthinet وآخرون.، 2000) ومضادات قالب تيلوميراز thio-phosphoramidate في الخلايا السرطانية (Asai وآخرون.، 2003 جريزنوف وآخرون.، 2003). تم استخدام العديد من الاستراتيجيات القائمة على CPP لإيصال siRNA إلى الخلايا المستنبتة. siRNA مرتبطة تساهميًا بـ Transportan (Muratovska and Eccles ، 2004) و penetratin (Davidson وآخرون.، 2004) مع استجابة إسكات. ومع ذلك ، يبدو أن الاستراتيجيات غير التساهمية أكثر ملاءمة لتوصيل siRNA وتنتج استجابة بيولوجية مرتبطة كبيرة (Simeoni وآخرون.، 2003 كيم وآخرون.، 2006 فيلدوين وآخرون.، 2006 كرومبيز وآخرون.، 2007 كومار وآخرون.، 2007 Lundberg وآخرون.، 2007 Meade and Dowdy، 2007). تم الإبلاغ عن MPG peptide لتحسين توصيل siRNA إلى لوحة كبيرة من خطوط الخلايا بما في ذلك خطوط الخلايا الملتصقة والخلايا المعلقة والسرطان وخطوط الخلايا الأولية الصعبة (Simeoni وآخرون.، 2003 موريس وآخرون.، 2004a نجوين وآخرون.، 2006). تم التقدم بطلب للحصول على MPG في الجسم الحي إيصال siRNA الذي يستهدف OCT-4 في الخلايا الفطرية للفأر (زين الدين وآخرون.، 2006) و siRNA الذي يستهدف بروتين دورة الخلية الأساسية ، وقد ثبت أن الحقن الوريدي cyclin B1 لجزيئات MPG / cyclin B1 siRNA يمنع نمو الورم بكفاءة (Crombez) وآخرون.، 2007). تم أيضًا عرض متغير من MPG (MPG-alpha) يحتوي على خمس طفرات في المجال الكارهة للماء ، من أجل تفضيل التشكل الحلزوني للببتيد ، لتحسين توصيل siRNA (Veldhoen وآخرون.، 2006). ومع ذلك ، فإن مثل هذه التعديلات على MPG تزيد من السمية وتفضل الامتصاص الخلوي الداخلي (Deshayes وآخرون.، 2004c Veldhoen وآخرون.، 2006). تم تمديد هذا النهج غير التساهمي ليشمل CPPs الأخرى بما في ذلك polyarginine- (Kim وآخرون.، 2006 كومار وآخرون.، 2007) ، penetratin- (Lundberg وآخرون.، 2007) و Tat- (Meade and Dowdy ، 2007) مشتق من الببتيدات. تم الإبلاغ عن حظر ببتيد تات المرتبط بعنصر ربط الحمض النووي الريبي في الجسم الحي عامل نمو البشرة (EGF) ، الكوليسترول- Arg9 ثبت أنه يعزز توصيل siRNA في الجسم الحي ضد عوامل نمو بطانة الأوعية الدموية (Kim وآخرون.، 2006) ومؤخراً ، تم إثبات أن ببتيد صغير مشتق من بروتين سكري لفيروس داء الكلب المرتبط بالبولي أرجينين R9 يقدم سيرنا في الجهاز العصبي المركزي (كومار) وآخرون., 2007 ).


مقدمة

على مدى السنوات الخمس الماضية ، حدث ظهور مثير لجزيئات علاجية محتملة جديدة ، ويرجع ذلك أساسًا إلى تطور البروتينات وعلم الجينوم. ومع ذلك ، لا تزال هذه الجزيئات محدودة بسبب ضعف قدرتها على دخول الخلايا. من أجل جعلها أكثر قابلية للتطبيق على العلاج في الجسم الحي، هناك اهتمام متزايد بتطوير طرق توصيل غير فيروسية (Niidome and Huang، 2002 Torchilin، 2005). لهذا الهدف ، تم استخدام CPPs (الببتيدات المخترقة للخلايا) بنجاح لتحسين توصيل الجزيئات الكبيرة النشطة بيولوجيًا ، بما في ذلك الأحماض النووية والببتيدات والبروتينات ، في كل من زراعة الخلايا و في الجسم الحي (Järver and Langel، 2004 Gupta et al.، 2005). تم تطوير استراتيجيتين رئيسيتين. الأول يعتمد على PTDs الطبيعية أو الكيميرية (مجالات نقل البروتين) المرتبطة تساهميًا مع الشحنات ، والتي تشمل أكثرها تمثيلا الببتيد المشتق من بروتين HIV-1 Tat (Fawell et al.، 1994 Vivés et al.، 1997 Frankel and Pabo، 1998 Schwarze et al.، 1999)، polyarginine (Wender et al.، 2000 Futaki et al.، 2001)، الحلزون الثالث لـ pAnt (بروتين homodomain antennapedia) (Derossi et al.، 1994) و Transportan (Pooga et al.، 1994). آل ، 1998). والثاني مبني على الببتيدات البرمائية الأولية ، مثل MPG أو Pep-1 ، والتي تشكل مجمعات غير تساهمية ثابتة مع الشحنات (Morris et al. ، 1997 ، 2001 Simeoni et al. ، 2003 Gros et al. ، 2006). لقد ثبت أن آلية الامتصاص الخلوي لـ PTDs مرتبطة بشكل أساسي بالمسارات الداخلية (Richard et al. ، 2003 ، 2005 Nakase et al. ، 2004 Wadia et al. ، 2004). ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أدلة واضحة على مسارات متميزة لامتصاص الخلايا ، وبعضها مستقل عن المسار الداخلي ويتضمن إمكانات عبر الغشاء (Dom et al. ، 2003 Terrone et al. ، 2003 Thoren et al. ، 2003 Rothbard et al. ، 2004 Deshayes et al.، 2005 Pujals et al.، 2006).

يحدث الاتصال الأول الذي تقوم به CPP مع الخلايا من خلال مكونات المصفوفة خارج الخلية ، البروتيوغليكان ، التي تؤدي بعد ذلك إلى الامتصاص الخلوي. البروتيوغليكان عبارة عن بروتينات غير متجانسة تحمل واحدًا أو أكثر من سلاسل GAG (glycosaminoglycan) الجانبية ، والتي تختلف في الحجم والشكل (Kjellen and Lindahl ، 1991 Esko and Selleck ، 2002). تميل البروتيوغليكان إلى تكوين تفاعلات كهروستاتيكية مع الجزيئات ، والتي تتم بشكل أساسي بوساطة الشحن وتعتمد على عدد الشحنات (Ruoslahti ، 1998). لذلك فهي تشكل غشاء "مرساة" من خلال سلاسل GAG الخاصة بها لمجموعة كبيرة ومتنوعة من الروابط (Sawitsky et al.، 1996 Esclatine et al.، 2001 Juliano، 2002 Couchman، 2003). تم الإبلاغ عن مشاركة البروتيوغليكان في مسارات مختلفة تتحكم في حركة الخلية أو شكلها أو تكاثرها ، والتي ترتبط ارتباطًا مباشرًا بديناميكيات الهيكل الخلوي وشبكة الأكتين (Ruoslahti ، 1988 Sawitsky et al. ، 1996 Esclatine et al. ، 2001 Juliano ، 2002 Couchman، 2003 Beauvais and Rapraeger، 2004 Iozzo، 2005). يتفاعل سينديكان و جليكان HSPGs (بروتين كبريتات الهيباران) مع شبكة الأكتين عبر بروتين ارتباط الأكتين الذيل السيتوبلازمي ويشارك كلاهما في تنظيم `` مستقبلات '' الغشاء والامتصاص الخلوي للجزيئات الكبيرة (Couchman، 2003 Yoneda and Couchman، 2003 Beauvais and Rapraeger ، 2004). يلعب كل من GAG و HSPG دورًا مركزيًا في آلية الانتقال للحاملات متعددة الخلايا ، والجسيمات الشحمية (Mislick and Baldeschwieler ، 1996 Kopatz et al. ، 2004) و PTDs (Belting ، 2003). لقد تم اقتراح أن GAG يشكل مستقبل سطح الخلية للجزيئات الحاملة للببتيد خارج الخلية التي ترتبط أو لا ترتبط مع الشحنات (روسناتي وآخرون ، 1999 ، 2001 بيلتينج ، 2003). ترتبط الخطوة الأولية للعديد من CPPs ، بما في ذلك الببتيدات Tat و pAnt الغنية بالأرجينين ، بتفاعلات كهروستاتيكية قوية مع GAGs سالبة الشحنة ، والتي تؤدي إلى استيعابها عبر مسارات الالتقام المختلفة اعتمادًا على وجود وطبيعة الشحنة وقدرة CPP للتفاعل مع الدهون (Suzuki et al. ، 2002 Console et al. ، 2003 Nakase et al. ، 2004 Wadia et al. ، 2004 Richard et al. ، 2005).

ناقلات MPG عبارة عن ببتيدات برمائية تحمل مجال كاره للماء مشتق من مجال اندماج HIV-1 gp41 (بروتين سكري 41) ، و NLS (تسلسل توطين نووي) مع 5 شحنات إيجابية. MPGs قادرة على تكوين مجمعات مستقرة مع الأحماض النووية وتحسين امتصاصها الخلوي ، وبالتالي الاستجابة البيولوجية المرتبطة بها. لقد تم استخدامها إلى حد كبير لتحسين توصيل قليل النوكليوتيدات المضاد للحساسية (موريس وآخرون ، 1997) ، DNA البلازميد (Morris et al. ، 1999a) ، siRNAs (الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير) (Simeoni et al. ، 2003 Morris et al. ، 2004 Langlois et al. ، 2005) والببتيدات (Morris et al. ، 1999b). تم تطوير اثنين من الببتيدات MPG تسمى MPG-α و MPG-والتي تختلف في هيكلها الثانوي عندما تكون داخل الغشاء الدهني (Deshayes et al. ، 2004a ، 2004b). تم الإبلاغ عن أن آلية امتصاص MPG النشطة بيولوجيًا - مجمعات البضائع مستقلة عن المسار الداخلي وترتبط بقدرة MPG على التفاعل مع الدهون والحث على زعزعة استقرار الغشاء المحلي (Deshayes et al.، 2004a، 2004b). ومع ذلك ، لا تزال المعلمات المرتبطة ببدء آلية الامتصاص الخلوي لهذه CPPs غير مفهومة جيدًا. في العمل الحالي ، قمنا بالتحقيق في الخطوة الأولى من آلية الامتصاص الخلوي لكل من MPG-و MPG-α. لقد أثبتنا أن مجمعات البضائع MPG و MPG تتفاعل مع GAG سالبة الشحنة للمصفوفة خارج الخلية. يؤدي ربط MPG بـ GAG إلى تنشيط محدد لـ Rac1 GTPase ، والذي يرتبط بإعادة تشكيل شبكة الأكتين ، وبالتالي يشكل `` بداية '' الامتصاص الخلوي ويعزز الدخول إلى خلية MPG أو MPG - مجمعات DNA و ، معظم CPPs ، عن طريق زيادة سيولة الغشاء. تشير نتائجنا إلى أنه على الرغم من أن دخول الخلايا لـ CPPs يمكن أن يتبع مسارات مختلفة ، إلا أن هناك بعض الخطوات الأولية الشائعة التي تتضمن منصة GAG وتنشيط GTPase.


الببتيدات ومحاكيات الببتيد كمنظمين لتفاعلات البروتين والبروتين

تعد تفاعلات البروتين والبروتين ضرورية لجميع عمليات الخلية تقريبًا.

الببتيدات هي المرشحين المثاليين لاستهداف تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs).

نقوم بمسح طرق الفحص والتصميم المنطقي لتحديد الببتيدات لتثبيط مثبطات مضخة البروتون.

قد يؤدي تزايد شعبية الببتيدات كعلاجات إلى ظهور حقبة جديدة من اكتشاف الأدوية.

تعد تفاعلات البروتين والبروتين ضرورية لجميع العمليات البيولوجية داخل الخلايا وخارجها تقريبًا. يعد تنظيم تفاعلات البروتين والبروتين إحدى الاستراتيجيات لتنظيم مصير الخلية بطريقة انتقائية للغاية. على وجه التحديد ، تعتبر الببتيدات مرشحة مثالية لتثبيط تفاعلات البروتين والبروتين لأنها يمكن أن تحاكي سطح البروتين للتنافس بشكل فعال على الارتباط. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الوصول إلى الببتيدات صناعياً ويمكن تثبيتها عن طريق التعديلات الكيميائية. In this review, we survey screening and rational design methods for identifying peptides to inhibit protein–protein interactions, as well as methods for stabilizing peptides to effectively mimic protein surfaces. In addition, we discuss recent applications of peptides to regulate protein–protein interactions for both basic research and therapeutic purposes.


1 Cell-penetrating peptides: what are they?

The identification of proteins that can enter cells was first reported in the late eighties, contradicting the acknowledged understanding that the plasma membrane is impermeable to hydrophilic molecules. Thus, it has been demonstrated that the Trans-Activator of Transcription (Tat) protein of the Human Immunodeficiency Virus was able to efficiently enter tissue-cultured cells and promote the viral gene expression [1, 2] . Moreover, Antennapedia homeodomain, a transcription factor of Drosophilia melanogaster, was also shown to enter nerve cells and regulate neural morphogenesis [3] . The interesting spontaneous entry of both proteins led to extensive structure/function studies to find the shortest amino acid sequence necessary for the uptake. This resulted in the identification of the first CPPs: Tat peptide, corresponding to the basic domain of HIV-1 Tat protein [4, 5] and penetratin, corresponding to the third helix of the Antennapedia homeodomain [6] . Ever since, various peptides showing the same penetrating capacities have been discovered or rationally designed.

1.1 Definition and classification of CPPs

The field of CPPs evolved rapidly, ever since the first sequences were described. This makes it hard to have a general definition covering the characteristics of the different CPPs discovered. So far, one can say that CPPs are short peptides (generally not exceeding 30 residues) that have the capacity to ubiquitously cross cellular membranes with very limited toxicity, via energy-dependent and/or independent mechanisms, without the necessity of a chiral recognition by specific receptors. Most common CPPs are positively charged peptides, though the presence of few anionic or hydrophobic CPPs was also demonstrated. A primary or secondary amphipathic character is also implicated but not strictly required for the internalization.

According to their origin, we can distinguish three main classes of CPPs: peptides derived from proteins, chimeric peptides that are formed by the fusion of two natural sequences, and synthetic CPPs which are rationally designed sequences usually based on structure–activity studies (Table 1). Other attempts to classify CPPs, in spite of their diversity, were based on the physico-chemical characteristics of the sequences (e.g., their amphipathicity [7] , or their hydrophobicity [8] ). A recent review summarizes the different classifications and the physico-chemical properties of the so-far described CPPs [9] .

الببتيد أصل Sequence المرجعي
Protein-derived
Penetratin Antennapedia (43–58) RQIKIWFQNRRMKWKK [6]
Tat peptide Tat(48–60) GRKKRRQRRRPPQ [5]
pVEC Cadherin(615–632) LLIILRRRIRKQAHAHSK [10]
Chimeric
Transportan Galanine/Mastoparan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL [11]
MPG HIV-gp41/SV40 T-antigen GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV [12]
Pep-1 HIV-reverse transcriptase/SV40 T-antigen KETWWETWWTEWSQPKKKRKV [13]
اصطناعي
Polyarginines Based on Tat peptide (R) ن 6 < ن < 12 [14, 15]
MAP من جديد KLALKLALKALKAALKLA [16]
ر6دبليو3 Based on penetratin RRWWRRWRR [17]

1.2 Applications

CPPs can transport inside living cells a variety of covalently or non-covalently linked cargoes, as has been reviewed for nanoparticles [18] , peptides [18, 19] , proteins [20, 21] , antisense oligonucleotides [20, 22] , small interfering RNA [23] , double stranded DNA [18] and liposomes [18] .

The transport of the smallest cargo to large 120 kDa proteins had been successfully carried out both in vitro and in vivo. For instance, activable CPPs (ACPPs) were recently employed in vivo to target cancer cells over-expressing metalloproteinase-2 [24] , while treatment of various inflammatory diseases by inhibition of NF-κB was also effective in vivo by coupling the inhibitors to different CPPs [25] . Tumor-targeting was also achieved in vivo for the (د)ر8–doxorubicin conjugate [26] . It is difficult to keep track of the various applications because the field is emerging rapidly. Recently, a novel class of intrinsically bioactive CPPs, baptized bioportide, made an appearance with the description of a CPP sequence derived from cytochrome c that mimicked the apoptotic role of the entire protein once it entered inside cells [27, 28] . Another in vitro study on mouse neuronal hypothalamic cells revealed that the N-terminal sequence derived from the prion protein could penetrate cells and disabled the formation of prions [29] .


أساليب

Cell Culture

All cell lines were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) and passaged using standard techniques. The HeLa cell line was maintained and tested in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) high glucose, 10% fetal calf serum (FCS), and 1% antibiotic𠄺ntimycotic (ABAM) solution. The MDA-MB-231 cell line culture medium was Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium 1640 (Gibco) supplemented with 9.5% FCS, 0.25 IU mL 𠄱 human insulin (Actrapid Penfill), and 20 mM HEPES (Gibco). The MCF-10A culture medium consisted of DMEM/F12 (Gibco) supplemented with 5% horse serum, human insulin (10 μg mL 𠄱 ), hydrocortisone (0.5 μg mL 𠄱 ), EGF (20 ng mL 𠄱 ), and cholera toxin (100 ng mL 𠄱 ).

تخليق الببتيد

All peptides were prepared, either commercially (Purar Chemicals, Australia) or in-house, by solid-phase peptide synthesis using Fmoc chemistry and Rink amide resin (except for FITC-labeled peptides, which utilized Fmoc-Val-Wang resin) and cleavage from the resin using standard procedures. The solution concentration of the peptides was determined spectrophotometrically at 280 nm using extinction coefficients determined from the amino acid content, 36 except for FITC-labeled peptides that were quantitated on the basis of the absorbance of fluorescein at 498 nm. 37

Biotinylated Penetratin Biotin-P16 (biotin-ahx-RQIKIWFQNRRMKWKK, where ahx = 1,6-aminohexanoic acid) was prepared with biotin linked N-terminally via the ahx group that served as a spacer. The peptide was purified to homogeneity using reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC), and its identity was confirmed using mass spectrometry (calcd م/ض120ح194ن38ا22س2) 5+ : 517.7 found (C120ح194ن38ا22س2) 5+ : 518.1).

Biotinylated N-terminal seven residues of Penetratin Biotin-P7 (biotin-βG-RRMKWKK, where βG = β-glycine) was prepared with biotin linked N-terminally via the β-glycine residue that served as a spacer. The peptide was purified to homogeneity using RP-HPLC, and its identity was confirmed using mass spectrometry (calcd م/ض59ح101ن21ا10س2) 4+ : 332.9 found (C59ح101ن21ا10س2) 4+ : 333.0).

The control peptides Penetratin P16 (RQIKIWFQNRRMKWKK) and G7-18NATE (cyclo-CH2CO-WFEGYDNTFPC) were prepared as reported previously. 35,38

Cargo-containing peptides G7-18NATE-P16 (cyclo-(CH2CO-WFEGYDNTFPC-RQIKIWFQNRRMKWKK)) and G7-18NATE-P7 (cyclo-(CH2CO-WFEGYDNTFPC-RRMKWKK)) were synthesized as a continuous peptide chain and then cyclized via the formation of thioether between the N-terminus and the cysteine side chain post cleavage, as described for G7-18NATE. 38 The peptides were purified to homogeneity using RP-HPLC, and their identities were confirmed using mass spectrometry G7-18NATE-P16 (calcd م/ض171ح246ن48ا38س2) 6+ : 608.3 found (C171ح246ن48ا38س2) 6+ : 608.6) and G7-18NATE-P7 (calcd م/ض113ح159ن31ا26س2) 5+ : 487.03 found (C113ح159ن31ا26س2) 5+ : 487.25).

FITC-labeled peptides FITC-P16-NLS (FITC-ahx-RQIKIWFQNRRMKWKK-PKKKRKV), FITC-P7-NLS (FITC-ahx-RRMKWKK-PKKKRKV), and FITC-NLS (FITC-ahx-PKKKRKV) were prepared with FITC linked N-terminally via the ahx group (1,6-aminohexanoic acid), which served as a spacer. The peptides were purified to homogeneity using RP-HPLC, and their identities were confirmed using mass spectrometry FITC-P16-NLS (calcd م/ض171ح266ن50ا33س2) 6+ : 603.0 found (C171ح266ن50ا33س2) 6+ : 603.46), FITC-P7-NLS (calcd م/ض113ح179ن33ا21س2) 4+ : 600.59 found (C113ح179ن33ا21س2) 4+ : 601.03), and FITC-NLS (calcd م/ض67ح100ن16ا14S) 3+ : 462.58 found (C67ح100ن16ا14S) 3+ : 462.72).

Peptide Internalization Assay

HeLa cells were seeded in 96-well plates (30� cells per well) in a culture medium. After 24 h, the media was replaced with a media containing the peptide of interest (at 1 μM) and incubated for 15 min. The cells were washed three times in ice-cold phosphate-buffered saline (PBS), fixed with 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.5% Tween20/PBS. The endogenous alkaline phosphatase activity was neutralized by incubating the plates at 65 ଌ for 60 min. The cells were blocked using 3% bovine serum albumin (BSA)/PBS and treated with streptavidin APase (1 μg mL 𠄱 in 0.1% BSA/PBS) for 30 min at room temperature. Following three times washing with PBS, 50 μL of 100 mg.mL 𠄱 p-nitrophenol phosphate was introduced and incubated for 30 min at room temperature. The enzyme reaction was quenched using 2 M NaOH. The absorbance was measured at 405 nm using FLUOstar Omega. The samples were measured in triplicates, and the background absorbance was determined using untreated cells and subtracted from the test conditions. The statistical analysis was performed using GraphPad Prism6 (GraphPad Software, CA).

Wound-Closure Migration Assay

The MDA-MB-231 or MCF-10A cells were seeded until confluent in 24-well plates, wounded with a sterile pipette tip to create a cell-free gap and cell debris cleared away with fresh media. Lyophilized peptides were resuspended in sterile MQ, diluted to the appropriate concentration in fresh media, and added to the appropriate wells, with each treatment duplicated. The media also contained 1 ng mL 𠄱 EGF to stimulate migration. The Leica AF6000 LX live-cell-imaging system was used to capture images in real time (at 37 ଌ, 5% CO2), with images collected every 30 min from a minimum of five positions per well. The remaining gap area was measured using ImageJ (Fiji) at 0 and 12 h and averaged from all measured positions across the duplicates. At least three independent experiments were performed. To allow for a direct comparison, the results are displayed as the relative percentage of gap closure compared with the untreated control cells normalized to 100%.

Cellular Uptake Assay

MDA-MB-231 cells were seeded (50�) in 24-well plates and grown until 60�% confluent. The media was replaced with the peptide-treated media (at 20 μM) and incubated for 20 min at 37 ଌ. The cells were washed gently three times with the growth media and incubated with Hoechst-treated media (1 μM) for 5 min at 37 ଌ before being transferred to the Leica AF6000 LX live-cell-imaging system. Here, the cells were maintained at 37 ଌ and 5% CO2, and images were taken within 15 min using a 20× objective lens.

Expression and Purification of the Grb7-SH2 Domain

Grb7-SH2 (415� residues) was incorporated into the pGex2T plasmid and expressed and purified, as described previously. 39

Thermal Shift Assays

The lyophilized peptides of interest were resuspended in 50 mM NaPO4, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, and 5% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) and tested at a final concentration of 50 μM. Grb7-SH2, dialyzed in the same buffer (excluding DMSO), was tested at 40 μM. Using Rotor-Gene 3000 (Corbett Life Science), the temperature was increased in 0.5 ଌ increments from 50 to 70 ଌ with a holding time of 60 s. The wavelength of excitation/emission was measured at 530/555 nm. Each condition was measured in duplicate or triplicate with values averaged. Peptide-only and buffer-only control samples were measured and subtracted from the averaged test measurements. At least three independent experiments were conducted. The statistical analysis was performed using GraphPad Prism6 (GraphPad Software, CA).


شاهد الفيديو: التركيب الكيميائي للبروتينات: البنية الأولية والثانوية والثالثية والرابعية للبروتين (شهر فبراير 2023).