معلومة

11.1: نوكليازات تقييدية - بيولوجيا

11.1: نوكليازات تقييدية - بيولوجيا


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنظمة تقييد / تعديل البكتيريا تحمي من الغزاة

كان اكتشاف إنزيمات التقييد ، أو نوكليازات التقييد (REs) ، محوريًا في تطوير الاستنساخ الجزيئي. تحدث الكواشف المتفاعلة بشكل طبيعي في البكتيريا ، حيث تتعرف تحديدًا على الامتدادات القصيرة للنيوكليوتيدات في الحمض النووي وتحفز تكسير الشرائط المزدوجة عند أو بالقرب من
موقع التعرف (المعروف أيضًا باسم موقع التقييد). حتى الآن ، تم وصف الآلاف من REs ذات الخصائص المميزة. قد تتساءل لماذا تأوي البكتيريا هذه الإنزيمات المدمرة. REs هي جزء من نظام دفاع بكتيري ضد الحمض النووي الغريب ، مثل العاثية المعدية. مواقع الطاقة المتجددة في الحمض النووي للبكتيريا محمية من الانقسام لأنها تم تعديلها بواسطة ميثيل ترانسفيراز الذي يعدل مواقع الطاقة المتجددة على وجه التحديد. يشار إلى الأنشطة المشتركة للنوكلياز الداخلي و methyltransferase كنظام تقييد / تعديل. اليوم ، لا يتم تنقية معظم العناصر المتفاعلة المتاحة تجارياً من مصادرها الطبيعية .. وبدلاً من ذلك ، عادةً ما تُعزل الكيميائيات عن البكتيريا التي تُفرِط في التعبير عن كميات كبيرة من الكيميائيات من البلازميدات. غالبًا ما تم تصميم هذه العناصر المترابطة من قبل علماء الأحياء الجزيئية لتشمل تغييرات الأحماض الأمينية التي تزيد من النشاط التحفيزي أو استقرار الطاقة المتجددة.

لفهم كيفية عمل الطاقة المتجددة ، سوف نستخدم EcoRI ، أحد أفضل مصادر الطاقة المتجددة التي تمت دراستها ، كمثال. على الرغم من أن أسماء المتعلمين الفردية قد تبدو إلى حد ما مثل حديث الأطفال ، إلا أن التسمية هي في الواقع منهجية للغاية وتستند إلى مصدرها البيولوجي. تم العثور على EcoRI بشكل طبيعي في سلالة RY13 الإشريكية القولونية. يبدأ اسمها بالجنس والأنواع (Eco for بكتريا قولونية) ، متبوعًا بمعرف السلالة (R لـ RY13) ، وينتهي برقم روماني يميز العناصر المتفاعلة المختلفة الموجودة في السلالة. سلالة RY13 من بكتريا قولونية يحتوي على العديد من مصادر الطاقة المتجددة ، ولكن فقط EcoRI و EcoRV ، يستخدمان على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية.

تشق إنزيمات التقييد مواقع محددة في الحمض النووي

كثيرا ما تسمى إنزيمات التقييد مثل EcoRI 6-cutters ، لأنها تتعرف على تسلسل 6-nucleotide. بافتراض التوزيع العشوائي لـ A و C و G و Ts في DNA ، يتنبأ الاحتمال بأن موقع التعرف على قاطع 6 يجب أن يحدث مرة واحدة تقريبًا لكل 4096 نقطة أساس (46) في الحمض النووي. بطبيعة الحال ، فإن توزيع النيوكليوتيدات في الحمض النووي ليس عشوائيًا ، لذا فإن الأحجام الفعلية لشظايا الحمض النووي التي تنتجها EcoRI تتراوح من مئات إلى عدة آلاف من أزواج القواعد ، ولكن متوسط ​​الحجم يقترب من 4000 زوج قاعدي. تعتبر أجزاء الحمض النووي بهذا الطول مفيدة في المختبر ، لأنها طويلة بما يكفي لاحتواء تسلسل الترميز للبروتينات ويتم حلها جيدًا على المواد الهلامية agarose.

يتعرف EcoRI على تسلسل G A T T C في DNA مزدوج الشريطة. تسلسل التعرف هذا هو متناظر مع محور تناظر ذو شقين ، لأن القراءة من 5 "إلى 3" على أي من خيطي اللولب تعطي نفس التسلسل. إن الطبيعة المتجانسة لموقع التقييد أكثر وضوحًا في الشكل أدناه. تشير النقطة الموجودة في وسط موقع التقييد إلى محور التناظر. يعمل EcoRI على تحفيز التحلل المائي لروابط الفوسفوديستر بين G و A على كل من خيوط الحمض النووي. شظايا التقييد المتولدة في التفاعل لها ذيول قصيرة أحادية الجديلة في الأطراف الخمسة. غالبًا ما يشار إلى هذه النهايات باسم "النهايات اللاصقة" ، نظرًا لقدرتها على تكوين روابط هيدروجينية مع تسلسل الحمض النووي التكميلي.

يُشار أحيانًا إلى REs بالمقصات الجزيئية نظرًا لقدرتها على توليد أجزاء تقييدية تنتهي بتسلسلات محددة. هذه "النهايات اللاصقة" مهمة لتقنية الحمض النووي المؤتلف ، لأنها تمكن الباحثين من بناء جزيئات DNA مصممة. يمكن ربط أي جزيئين من الحمض النووي لهما نهايات لاصقة متوافقة معًا بواسطة روابط DNA التي تعمل بمثابة "معجون" عن طريق إعادة إحكام غلق روابط الفوسفوديستر المكسورة. لن نقوم بتوليد جزيئات مؤتلفة في هذه الفئة ، ولكن من المهم أن نفهم أهميتها في علم الأحياء الحديث. ضع في اعتبارك البلازميدات pBG1805 و pYES2.1. من خرائط البلازميد في الفصل 10 ، يمكنك أن ترى أن هذه البلازميدات المعقدة قد شُيدت عن طريق تجميع تسلسلات DNA معًا من مصادر تطورية متميزة.


عند الانتهاء من موضوع هذه الوحدة ، سوف:

  1. تكون قادرًا على تحديد مواقع التقييد المتوافقة للاستنساخ.
  2. تكون قادرة على إجراء عملية الهضم المقيد لتحضير شظايا الحمض النووي والناقلات لبناء الحمض النووي المؤتلف.
  3. تكون قادرة على إعادة تجميع جزء من الحمض النووي المهضوم وناقل البلازميد في تفاعل ربط لجعل DNA البلازميد المؤتلف يحمل جينًا مهمًا.
  4. تكون قادرة على إجراء تفاعل التحول البكتيري لتحويل الخلايا البكتيرية المختصة مع DNA البلازميد المؤتلف.
  5. تكون قادرة على صنع لوحات وسائط انتقائية لطلاء الخلايا البكتيرية المحولة وتنميتها (انتقائية للمضادات الحيوية أو X-gal).
  6. تكون قادرة على صفيحة الخلايا البكتيرية المحولة على لوحات انتقائية وتحديد المستعمرات المقاومة.
  7. تكون قادرة على فحص المستعمرات المقاومة للجين المعني عن طريق تضخيم الحمض النووي للمستعمرات البكتيرية الفردية من خلال إنزيم تقييد الهضم.
  8. أن تكون قادرًا على صنع هلام الاغاروز ، وتحميل الجل بعينات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وإجراء الرحلان الكهربي لجيل الاغاروز للعينات.
  9. تكون قادرة على عزل المستعمرات البكتيرية الحاملة للبلازميد عن طريق تحليل هلام الاغاروز وتحديد العينات التي تحتوي على الجين المعني.
  10. تكون قادرة على صنع وسائط سائلة انتقائية معقمة لتنمو إحدى المستعمرات البكتيرية التي تحتوي على الجين المعني لإنتاج كميات كبيرة من DNA البلازميد المطلوب.

مقدمة

تسمى إنزيمات التقييد أيضًا & quot ؛ مقص جزيئي & quot ؛ لأنها تشق الحمض النووي في أو بالقرب من تسلسل التعرف المحدد المعروف باسم مواقع التقييد. تصنع هذه الإنزيمات شقًا واحدًا على كل من خيوط الحمض النووي وتسمى أيضًا نوكليازات التقييد. 4

تصيب الفيروسات الخلايا المضيفة بحقن حمضها النووي في الخلايا. يختطف هذا الحمض النووي الفيروسي آلية الخلية المضيفة لتكاثر النسل الفيروسي ، مما يؤدي إلى موت الخلية المضيفة. للتغلب على العدوى الفيروسية ، طورت العديد من البكتيريا والعتائق عدة آليات. تتضمن آلية الحماية الرئيسية استخدام إنزيمات التقييد لتحطيم الحمض النووي الفيروسي الغازي عن طريق شقه في مواقع تقييد محددة. في الوقت نفسه ، تحمي الخلية المضيفة الحمض النووي الخاص بها من الانقسام عن طريق استخدام إنزيمات أخرى تسمى methylases ، والتي تقوم بميثيلات الأدينين أو قواعد السيتوزين ضمن تسلسل التعرف على المضيف. لكل من إنزيم التقييد ، تنتج الخلية المضيفة ميثيلاز مقابل ميثيل ويحمي DNA المضيف من التدهور. تشكل هذه الإنزيمات أنظمة تعديل التقييد (RM).

تعمل إنزيمات التقييد على تحفيز التحلل المائي للرابطة بين ذرة 3-أكسجين وذرة الفوسفور في العمود الفقري للفوسفوديستر في الحمض النووي. تتطلب الإنزيمات Mg 2+ أو أيونات ثنائية التكافؤ أخرى لنشاطها.


شاهد الفيديو: Restriction Enzyme - Dr. Sara Almasri (كانون الثاني 2023).