معلومة

كيف يمكنك إخراج جين الإشريكية القولونية دون تعطيل بقية المجموعة الجينية؟

كيف يمكنك إخراج جين الإشريكية القولونية دون تعطيل بقية المجموعة الجينية؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا على دراية بطريقة بناء مجموعة Keio باستخدام حذف الجين المفرد باستخدام كاسيت مضاد حيوي. ومع ذلك ، ماذا يحدث عندما تكون هناك مجموعات جينية أو ORFs متداخلة وما زلت ترغب في إخراج جين واحد فقط؟


لنفترض أن لدينا الجين أ ، يليه الجين ب بحيث يتداخلان مع 100 قاعدة. إذا كنت تريد التخلص من الجين أ فقط ، فيمكنك القيام بما يلي:

  • PCR الجين A واستنساخه في ناقل
  • PCR الجين B واستنساخه في ناقل آخر
  • أدخل علامة مقاومة المضادات الحيوية في المنطقة المتداخلة من الجين A و B
    • الآن ليس لديك الجين الوظيفي A والجين B
  • قم بتحويل خلاياك فقط باستخدام المتجه الذي يحتوي على الجين ب

الآن لقد عطلت الجين أ فقط ولكن لديك الجين الوظيفي ب.


15.3 عوامل الضراوة لمسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية

أوضحنا في القسم السابق أن بعض مسببات الأمراض أكثر ضراوة من غيرها. هذا يرجع إلى عامل الفوعة الفريد س التي تنتجها مسببات الأمراض الفردية ، والتي تحدد مدى وشدة المرض الذي قد تسببه. يتم ترميز عوامل ضراوة العامل الممرض بواسطة الجينات التي يمكن تحديدها باستخدام افتراضات كوخ الجزيئية. عندما يتم تعطيل الجينات المشفرة لعوامل الفوعة ، تقل الفوعة في العامل الممرض. في هذا القسم ، ندرس أنواعًا مختلفة وأمثلة محددة لعوامل الفوعة وكيفية مساهمتها في كل خطوة من خطوات التسبب في المرض.

عوامل الضراوة للالتصاق

كما نوقش في القسم السابق ، فإن أول خطوتين في التسبب في المرض هما التعرض والالتصاق. تذكر أن المادة اللاصقة عبارة عن بروتين أو بروتين سكري موجود على سطح العامل الممرض الذي يرتبط بمستقبلات على الخلية المضيفة. تم العثور على المواد اللاصقة على مسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية والفطرية والأوليات. أحد الأمثلة على المادة اللاصقة البكتيرية هو النوع الأول من المادة اللاصقة الخميرية ، وهو جزيء موجود على أطراف الخمل من السموم المعوية. بكتريا قولونية (ETEC). تذكر أن fimbriae عبارة عن شعيرات بروتينية تشبه الشعر على سطح الخلية. يسمح النوع الأول من الالتصاق الخماسي لخلايا ETEC بالارتباط بجليكان مانوز المعبر عنه في الخلايا الظهارية المعوية. يسرد الجدول 15.7 المواد اللاصقة الشائعة الموجودة في بعض مسببات الأمراض التي ناقشناها أو سنراها لاحقًا في هذا الفصل.

بعض المواد اللاصقة البكتيرية ومواقع ارتباطها بالمضيف
العوامل الممرضة مرض لاصقة موقع المرفقات
الأبراج العقدية التهاب الحلق بروتين F الخلايا الظهارية التنفسية
العقدية الطافرة تسوس الأسنان يلتصق P1 أسنان
النيسرية البنية السيلان اكتب IV pili الخلايا الظهارية الإحليلي
تسمم معوي بكتريا قولونية (ETEC) اسهال المسافرين اكتب 1 fimbriae الخلايا الظهارية المعوية
ضمة الكوليرا كوليرا N- ميثيل فينيل ألانين بيلي الخلايا الظهارية المعوية

التركيز السريري

الجزء 3

يعد وجود البكتيريا في دم مايكل علامة على الإصابة بالعدوى ، حيث يكون الدم معقمًا بشكل طبيعي. لا يوجد ما يشير إلى أن البكتيريا دخلت الدم من خلال إصابة. بدلاً من ذلك ، يبدو أن بوابة الدخول كانت طريق الجهاز الهضمي. بناءً على أعراض مايكل ، ونتائج فحص دمه ، وحقيقة أن مايكل كان الوحيد في العائلة الذي تناول الهوت دوج ، يشتبه الطبيب في أن مايكل يعاني من حالة من مرض الليستريات.

الليسترية المستوحدة ، الممرض الاختياري داخل الخلايا الذي يسبب مرض الليستريات ، هو ملوث شائع في الأطعمة الجاهزة للأكل مثل لحوم الغداء ومنتجات الألبان. بمجرد تناولها ، تغزو هذه البكتيريا الخلايا الظهارية المعوية وتنتقل إلى الكبد ، حيث تنمو داخل الخلايا الكبدية. تعتبر الليستريات قاتلة في حوالي واحد من كل خمسة أشخاص أصحاء عاديين ، ومعدلات الوفيات أعلى قليلاً في المرضى الذين يعانون من حالات موجودة مسبقًا تضعف الاستجابة المناعية. مجموعة من جينات الفوعة المشفرة على جزيرة مسببة للأمراض هي المسؤولة عن الإمراضية L. monocytogenes. يتم تنظيم هذه الجينات بواسطة عامل نسخ يعرف باسم عامل إطلاق سلسلة الببتيد 1 (PrfA). أحد الجينات التي تنظمها PrfA هو مرحبا، الذي يشفر سمًا يعرف باسم الليستريوليسين O (LLO) ، والذي يسمح للبكتيريا بالهروب من الفجوات عند دخولها إلى الخلية المضيفة. الجين الثاني الذي ينظمه PrfA هو أكتا ، الذي يشفر بروتينًا سطحيًا يعرف باسم البروتين المحفز لتجميع الأكتين (ActA). يتم التعبير عن ActA على سطح الليستيريا ويبلمر الأكتين المضيف. وهذا يمكّن البكتيريا من إنتاج ذيول أكتين ، والتحرك حول سيتوبلازم الخلية ، والانتشار من خلية إلى أخرى دون الخروج إلى الحيز خارج الخلية.

بدأت حالة مايكل في التدهور. إنه يعاني الآن من تصلب في الرقبة وشلل نصفي (ضعف في جانب واحد من الجسم). قلقًا من انتشار العدوى ، يقرر الطبيب إجراء فحوصات إضافية لتحديد سبب هذه الأعراض الجديدة.

  • ما نوع العامل الممرض الذي يسبب مرض الليستريات ، وما عوامل الفوعة التي تساهم في العلامات والأعراض التي يعاني منها مايكل؟
  • هل من المحتمل أن تنتقل العدوى من دم مايكل؟ إذا كان الأمر كذلك ، فكيف يفسر ذلك أعراضه الجديدة؟

انتقل إلى مربع التركيز السريري التالي. ارجع إلى مربع التركيز السريري السابق.

الإنزيمات الخارجية البكتيرية والسموم كعوامل ضراوة

بعد التعرض والالتصاق ، فإن الخطوة التالية في التسبب في المرض هي الغزو ، والذي يمكن أن يشمل الإنزيمات والسموم. تؤدي العديد من مسببات الأمراض إلى الغزو عن طريق دخول مجرى الدم ، وهو وسيلة فعالة للانتشار لأن الأوعية الدموية تمر بالقرب من كل خلية في الجسم. الجانب السلبي لآلية التشتت هو أن الدم يشمل أيضًا العديد من عناصر الجهاز المناعي. تستخدم مصطلحات مختلفة تنتهي بكلمة "الدم" لوصف وجود مسببات الأمراض في مجرى الدم. يسمى وجود البكتيريا في الدم تجرثم الدم. يسمى تجرثم الدم الذي يصيب البيوجينات (البكتيريا المكونة للصديد) بييميا. عندما يتم العثور على فيروسات في الدم ، فإنها تسمى viremia. يصف مصطلح تسمم الدم الحالة التي توجد فيها السموم في الدم. إذا كانت البكتيريا موجودة وتتكاثر في الدم ، فإن هذه الحالة تسمى تسمم الدم.

يوصف المرضى الذين يعانون من تسمم الدم بالإنتان ، مما قد يؤدي إلى الصدمة ، وانخفاض ضغط الدم الذي يهدد الحياة (الضغط الانقباضي & lt90 ملم زئبق) مما يمنع الخلايا والأعضاء من تلقي ما يكفي من الأكسجين والمواد المغذية. يمكن أن تسبب بعض البكتيريا صدمة من خلال إطلاق السموم (عوامل الفوعة التي يمكن أن تسبب تلف الأنسجة) وتؤدي إلى انخفاض ضغط الدم. تبتلع البكتيريا سالبة الجرام بالبلعمات الجهاز المناعي ، والتي تفرز بعد ذلك عامل نخر الورم ، وهو جزيء يشارك في الالتهاب والحمى. عامل نخر الورم يرتبط بالشعيرات الدموية لزيادة نفاذه ، مما يسمح للسوائل بالمرور من الأوعية الدموية والأنسجة ، مما يسبب التورم ، أو الوذمة (الشكل 15.10). مع وجود تركيزات عالية من عامل نخر الورم ، يكون رد الفعل الالتهابي شديدًا ويفقد ما يكفي من السوائل من الدورة الدموية مما يؤدي إلى انخفاض ضغط الدم إلى مستويات منخفضة بشكل خطير. يمكن أن يكون لهذا عواقب وخيمة لأن القلب والرئتين والكلى تعتمد على ضغط الدم الطبيعي للوظيفة المناسبة ، وبالتالي يمكن أن يحدث فشل متعدد الأعضاء وصدمة وموت.

الإنزيمات الخارجية

تنتج بعض مسببات الأمراض إنزيمات خارج الخلية أو أنزيم خارجي سالتي تمكنهم من غزو الخلايا المضيفة والأنسجة العميقة. تحتوي الإنزيمات الخارجية على مجموعة متنوعة من الأهداف. يتم سرد بعض الفئات العامة من الإنزيمات الخارجية ومسببات الأمراض المرتبطة بها في الجدول 15.8. يعمل كل من هذه الإنزيمات الخارجية في سياق بنية نسيجية معينة لتسهيل الغزو أو دعم نموه والدفاع ضد جهاز المناعة. على سبيل المثال ، هيالورونيداز S ، وهو إنزيم ينتجه مسببات الأمراض مثل المكورات العنقودية الذهبية , الأبراج العقدية ، و المطثية الحاطمة ، يحلل جليكوسيد هيالورونان (حمض الهيالورونيك) ، والذي يعمل كإسمنت بين الخلايا بين الخلايا المجاورة في النسيج الضام (الشكل 15.11). هذا يسمح للممرض بالمرور عبر طبقات الأنسجة عند بوابة الدخول وينتشر في أي مكان آخر في الجسم (الشكل 15.11).

بعض فئات الإنزيمات الخارجية وأهدافها
فصل مثال وظيفة
جلايكوهيدرولازات هيالورونيداز إس في المكورات العنقودية الذهبية يحلل حمض الهيالورونيك الذي يربط الخلايا معًا لتعزيز الانتشار عبر الأنسجة
نوكلياز تم إنتاج DNAse بواسطة بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية يحط من الحمض النووي الناتج عن الخلايا المحتضرة (البكتيريا والخلايا المضيفة) التي يمكنها احتجاز البكتيريا ، وبالتالي تعزيز الانتشار
فسفوليباسات فسفوليباز ج عصيات الجمرة الخبيثة يحط من طبقة الفسفوليبيد الثنائية للخلايا المضيفة ، مما يتسبب في تحلل خلوي ، ويحلل غشاء البلعمة لتمكين الهروب إلى السيتوبلازم
البروتياز كولاجيناز في المطثية الحاطمة يحط من الكولاجين في النسيج الضام لتعزيز انتشاره

نوكليازات التي تنتجها العوامل الممرضة ، مثل DNAse التي تنتجها بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية، تحطيم الحمض النووي خارج الخلية كوسيلة للهروب والانتشار عبر الأنسجة. عندما تموت الخلايا البكتيرية والخلايا المضيفة في موقع الإصابة ، فإنها تتلاشى وتطلق محتوياتها داخل الخلايا. كروموسوم الحمض النووي هو أكبر جزيئات داخل الخلايا ، ويمكن لكتل ​​الحمض النووي خارج الخلية أن تحبس البكتيريا وتمنع انتشارها. بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية ينتج DNAse لتحطيم شبكة الحمض النووي خارج الخلية حتى يتمكن من الهروب والانتشار إلى الأنسجة المجاورة. هذه الاستراتيجية تستخدم أيضا من قبل بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية وغيرها من مسببات الأمراض لتفسخ وتهرب من شبكات الحمض النووي خارج الخلية التي تنتجها الخلايا البلعمية في الجهاز المناعي لاحتجاز البكتيريا.

تسمى الإنزيمات التي تحلل الفسفوليبيدات في أغشية الخلايا باسم phospholipases. أفعالهم محددة فيما يتعلق بنوع الدهون الفوسفورية التي يعملون عليها وحيث يشقون الجزيئات إنزيميًا. العامل الممرض المسؤول عن الجمرة الخبيثة ، الجمرة الخبيثة ، تنتج فسفوليباز C. متى الجمرة الخبيثة تبتلعها الخلايا البلعمية في الجهاز المناعي ، يقوم الفوسفوليباز C بتحطيم غشاء البلعمة قبل أن يندمج مع الليزوزوم ، مما يسمح للممرض بالهروب إلى السيتوبلازم والتكاثر. يمكن أن تستهدف Phospholipases أيضًا الغشاء الذي يحيط بالبلعمة داخل الخلايا البلعمية. كما هو موضح سابقًا في هذا الفصل ، هذه هي الآلية المستخدمة من قبل مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل L. monocytogenes و ريكتسيا للهروب من البلعمة والتكاثر داخل سيتوبلازم الخلايا البلعمية. لا يقتصر دور الفسفوليباز في الفوعة البكتيرية على الهروب البلعومي. تنتج العديد من مسببات الأمراض الفوسفوليبازات التي تعمل على تحلل أغشية الخلايا وتسبب تحلل الخلايا المستهدفة. تشارك هذه الفسفوليباسات في تحلل خلايا الدم الحمراء وخلايا الدم البيضاء وخلايا الأنسجة.

تنتج مسببات الأمراض البكتيرية أيضًا إنزيمات مختلفة لهضم البروتين أو البروتياز. يمكن تصنيف البروتياز وفقًا لهدف الركيزة (على سبيل المثال ، بروتينات سيرين بروتياز المستهدفة مع سيرين الأحماض الأمينية) أو إذا كانت تحتوي على معادن في موقعها النشط (على سبيل المثال ، تحتوي البروتياز المعدني بالزنك على أيون الزنك ، وهو أمر ضروري للنشاط الأنزيمي).

أحد الأمثلة على البروتياز الذي يحتوي على أيون معدني هو إنزيم كولاجيناز الخارجي. يعمل الكولاجيناز على هضم الكولاجين ، وهو البروتين المهيمن في النسيج الضام. يمكن العثور على الكولاجين في المصفوفة خارج الخلية ، وخاصة بالقرب من الأغشية المخاطية والأوعية الدموية والأعصاب وفي طبقات الجلد. على غرار الهيالورونيداز ، يسمح كولاجيناز للممرض بالاختراق والانتشار عبر الأنسجة المضيفة عن طريق هضم بروتين النسيج الضام هذا. الكولاجيناز الذي تنتجه البكتيريا موجبة الجرام المطثية الحاطمة ، على سبيل المثال ، يسمح للبكتيريا أن تشق طريقها عبر طبقات الأنسجة ثم تدخل وتتكاثر في الدم (تسمم الدم). C. بيرفرينجنز ثم يستخدم السموم و phospholipase لإحداث التحلل الخلوي والنخر. بمجرد موت الخلايا المضيفة ، تنتج البكتيريا الغازات عن طريق تخمير الكربوهيدرات العضلية. يعد النخر المنتشر للأنسجة والغازات المصاحبة من سمات الحالة المعروفة باسم الغرغرينا الغازية (الشكل 15.12).

ارتباط بالتعلم

نوعان من موت الخلايا هما موت الخلايا المبرمج والنخر. قم بزيارة هذا الموقع لمعرفة المزيد حول الاختلافات بين آليات موت الخلايا وأسبابها.

السموم

بالإضافة إلى الإنزيمات الخارجية ، فإن بعض مسببات الأمراض قادرة على إنتاج السموم س، سموم بيولوجية تساعد في قدرتها على غزو الأنسجة وإلحاق الضرر بها. تسمى قدرة العامل الممرض على إنتاج السموم لإلحاق الضرر بالخلايا المضيفة بالسموم.

يمكن تصنيف السموم على أنها سموم داخلية أو سموم خارجية. يسمى عديد السكاريد الدهني (LPS) الموجود على الغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام الذيفان الداخلي (الشكل 15.13). أثناء العدوى والمرض ، تطلق مسببات الأمراض البكتيرية سالبة الجرام الذيفان الداخلي إما عندما تموت الخلية ، مما يؤدي إلى تفكك الغشاء ، أو عندما تخضع البكتيريا للانشطار الثنائي. المكون الدهني للذيفان الداخلي ، الدهن A ، مسؤول عن الخصائص السامة لجزيء LPS. يتم حفظ الدهون نسبيًا عبر أجناس مختلفة من البكتيريا سالبة الجرام ، وبالتالي ، فإن الخصائص السامة للدهن أ متشابهة بغض النظر عن العامل الممرض سالب الجرام. بطريقة مشابهة لعامل نخر الورم ، يؤدي الدهن أ إلى الاستجابة الالتهابية للجهاز المناعي (انظر الالتهاب والحمى). إذا كان تركيز الذيفان الداخلي في الجسم منخفضًا ، فقد توفر الاستجابة الالتهابية للمضيف دفاعًا فعالًا ضد العدوى من ناحية أخرى ، يمكن أن تؤدي التركيزات العالية من الذيفان الداخلي في الدم إلى استجابة التهابية مفرطة ، مما يؤدي إلى انخفاض حاد في ضغط الدم وفشل أعضاء متعددة والموت.

الطريقة الكلاسيكية للكشف عن الذيفان الداخلي هي باستخدام ليمولوس اختبار المحللة الأميبية (LAL). في هذا الإجراء ، خلايا الدم (الخلايا الأميبية) لسرطان حدوة الحصان (ليمولوس بوليفيموس) مع مصل المريض. سوف تتفاعل الخلايا الأميبية مع وجود أي ذيفان داخلي. يمكن ملاحظة هذا التفاعل إما من حيث اللون (اللون) أو من خلال البحث عن التخثر (تفاعل التخثر) الذي يحدث داخل المصل. الطريقة البديلة التي تم استخدامها هي مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) التي تستخدم الأجسام المضادة للكشف عن وجود السموم الداخلية.

على عكس الدهون السامة أ من الذيفان الداخلي ، السموم الخارجية س هي جزيئات بروتينية يتم إنتاجها بواسطة مجموعة متنوعة من البكتيريا الحية المسببة للأمراض. على الرغم من أن بعض مسببات الأمراض سالبة الجرام تنتج سمومًا خارجية ، إلا أن معظمها ينتج عن مسببات الأمراض إيجابية الجرام. تختلف السموم الخارجية عن الذيفان الداخلي في العديد من الخصائص الرئيسية الأخرى ، ملخصة في الجدول 15.9. على عكس الذيفان الداخلي ، الذي يحفز الاستجابة الالتهابية العامة عند إطلاقه ، فإن السموم الخارجية أكثر تحديدًا في عملها والخلايا التي تتفاعل معها. يستهدف كل سم خارجي مستقبلات محددة على خلايا معينة ويدمر تلك الخلايا من خلال آليات جزيئية فريدة. يظل الذيفان الداخلي مستقرًا في درجات حرارة عالية ، ويتطلب تسخينًا عند 121 درجة مئوية (250 درجة فهرنهايت) لمدة 45 دقيقة حتى يتم تعطيله. على النقيض من ذلك ، فإن معظم السموم الخارجية قابلة للتغير للحرارة بسبب تركيبها البروتيني ، والعديد منها مشوه (معطل) عند درجات حرارة أعلى من 41 درجة مئوية (106 درجة فهرنهايت). كما نوقش سابقًا ، يمكن أن يحفز الذيفان الداخلي الاستجابة الالتهابية المميتة بتركيزات عالية جدًا ولديه LD مُقاس.50 من 0.24 مجم / كجم. على النقيض من ذلك ، يمكن أن تكون التركيزات الصغيرة جدًا من السموم الخارجية قاتلة. على سبيل المثال ، ذيفان البوتولينوم ، الذي يسبب التسمم الغذائي ، لديه صعوبة في التعلم50 0.000001 مجم / كجم (240.000 مرة أكثر فتكًا من الذيفان الداخلي).

مقارنة بين الذيفان الداخلي والسموم الخارجية التي تنتجها البكتيريا
صفة مميزة الذيفان الداخلي السموم الخارجية
مصدر البكتيريا سالبة الجرام البكتيريا موجبة الجرام (في المقام الأول) وسالبة الجرام
تكوين دهن A مكون من عديدات السكاريد الدهنية بروتين
التأثير على المضيف الأعراض الجهازية العامة للالتهاب والحمى تلف محدد للخلايا يعتمد على استهداف الخلايا بوساطة المستقبلات وآليات محددة للعمل
استقرار الحرارة استقرار الحرارة معظمها قابل للحرارة ، لكن بعضها مستقر للحرارة
LD50 عالي قليل

يمكن تصنيف السموم الخارجية إلى ثلاث فئات بناءً على هدفها: الاستهداف داخل الخلايا ، وتمزيق الأغشية ، والمواد المضادة الفائقة. يقدم الجدول 15.10 أمثلة على السموم جيدة التوصيف داخل كل فئة من هذه الفئات الثلاث.

بعض السموم الخارجية الشائعة ومسببات الأمراض البكتيرية المرتبطة بها
فئة مثال العوامل الممرضة الآلية والمرض
السموم التي تستهدف الخلايا سم الكوليرا ضمة الكوليرا تنشيط محلقة الأدينيلات في الخلايا المعوية ، مما يؤدي إلى زيادة مستويات الأدينوزين أحادي الفوسفات (cAMP) وإفراز السوائل والشوارد خارج الخلية ، مما يسبب الإسهال
توكسين الكزاز كلوستريديوم الكزازية يمنع إطلاق الناقلات العصبية المثبطة في الجهاز العصبي المركزي ، مما يسبب الشلل التشنجي
سم البوتولينيوم كلوستريديوم البوتولينوم يمنع إطلاق الناقل العصبي أستيل كولين من الخلايا العصبية ، مما يؤدي إلى شلل رخو
سم الخناق بكتريا الخناق الوتدية تثبيط تخليق البروتين ، مما يسبب موت الخلايا
السموم المعطلة للأغشية الستربتوليسين الأبراج العقدية البروتينات التي تتجمع في مسام في أغشية الخلايا وتعطل وظيفتها وتقتل الخلية
نيوموليسين العقدية الرئوية
ألفا توكسين المكورات العنقودية الذهبية
ألفا توكسين المطثية الحاطمة Phospholipases التي تحلل الفوسفوليبيدات في غشاء الخلية وتعطل وظيفة الغشاء وتقتل الخلية
فسفوليباز ج الزائفة الزنجارية
توكسين بيتا المكورات العنقودية الذهبية
Superantigens توكسين متلازمة الصدمة السامة المكورات العنقودية الذهبية يحفز التنشيط المفرط لخلايا الجهاز المناعي وإطلاق السيتوكينات (الوسطاء الكيميائيون) من خلايا الجهاز المناعي. والنتيجة هي الحمى والالتهابات والصدمة التي تهدد الحياة.
الذيفان الخارجي العقدي الأبراج العقدية
السموم المسببة للحمى الأبراج العقدية

استهداف السم داخل الخلايا س تتكون من مكونين: أ للنشاط و ب للربط. وبالتالي ، تُعرف هذه الأنواع من السموم باسم السموم الخارجية A-B (الشكل 15.14). المكون B مسؤول عن الخصوصية الخلوية للسم ويتوسط في الارتباط الأولي للسم بمستقبلات سطح الخلية المحددة. بمجرد أن يرتبط توكسين A-B بالخلية المضيفة ، يتم إحضاره إلى الخلية عن طريق الالتقام الخلوي ويعلق في فجوة. تنفصل الوحدتان A و B أثناء تحمض الفجوة.ثم تدخل الوحدة الفرعية A في سيتوبلازم الخلية وتتداخل مع الوظيفة الخلوية الداخلية المحددة التي تستهدفها.

أربعة أمثلة فريدة لسموم A-B هي السموم الدفتيريا والكوليرا والبوتولينوم والتيتانوس. يتم إنتاج سم الخناق بواسطة البكتيريا موجبة الجرام بكتريا الخناق الوتدية ، العامل المسبب للخناق الجلدي والبلعوم الأنفي. بعد أن تنفصل الوحدة الفرعية A من سم الخناق وتصل إلى السيتوبلازم ، فإنها تسهل نقل ثنائي فوسفات الأدينوزين (ADP) - الريبوز إلى بروتين عامل الاستطالة (EF-2) اللازم لتخليق البروتين. ومن ثم ، فإن سم الخناق يثبط تخليق البروتين في الخلية المضيفة ، مما يؤدي في النهاية إلى قتل الخلية (الشكل 15.15).

ذيفان الكوليرا هو سم معوي تنتجه البكتيريا سالبة الجرام ضمة الكوليرا وتتكون من وحدة فرعية واحدة وخمس وحدات فرعية ب. آلية عمل سم الكوليرا معقدة. ترتبط الوحدات الفرعية B بالمستقبلات الموجودة على الخلية الظهارية المعوية للأمعاء الدقيقة. بعد الدخول إلى سيتوبلازم الخلية الظهارية ، تقوم الوحدة الفرعية A بتنشيط بروتين G داخل الخلايا. يؤدي البروتين G المنشط بدوره إلى تنشيط إنزيم adenyl cyclase ، والذي يبدأ في إنتاج زيادة في تركيز AMP الدوري (جزيء مرسال ثانوي). يؤدي زيادة cAMP إلى تعطيل الفسيولوجيا الطبيعية للخلايا الظهارية المعوية ويؤدي إلى إفراز كميات مفرطة من السوائل والكهارل في تجويف الأمعاء ، مما يؤدي إلى الإسهال الشديد "براز ماء الأرز" المميز للكوليرا.

توكسين البوتولينوم (المعروف أيضًا باسم البوتوكس) هو سم عصبي تنتجه البكتيريا موجبة الجرام كلوستريديوم البوتولينوم . وهي أكثر المواد المعروفة سمية حتى الآن. يتكون السم من وحدة فرعية خفيفة A ووحدة فرعية من سلسلة البروتين الثقيلة B. ترتبط الوحدة الفرعية B بالخلايا العصبية للسماح لسموم البوتولينوم بدخول الخلايا العصبية عند التقاطع العصبي العضلي. تعمل الوحدة الفرعية A كبروتياز ، فتشطر البروتينات المشاركة في إطلاق العصبون لأسيتيل كولين ، وهو جزيء ناقل عصبي. عادة ، تطلق الخلايا العصبية الأسيتيل كولين للحث على تقلصات ألياف العضلات. تؤدي قدرة السموم على منع إفراز الأسيتيل كولين إلى تثبيط تقلصات العضلات ، مما يؤدي إلى استرخاء العضلات. هذا لديه القدرة على التوقف عن التنفس والتسبب في الوفاة. بسبب تأثيره ، يتم استخدام تركيزات منخفضة من مادة البوتوكس في الإجراءات التجميلية والطبية ، بما في ذلك إزالة التجاعيد وعلاج فرط نشاط المثانة.

ارتباط بالتعلم

انقر فوق هذا الارتباط لمشاهدة رسم متحرك لكيفية عمل سموم الكوليرا.

انقر فوق هذا الرابط لمشاهدة رسم متحرك لكيفية عمل توكسين البوتولينوم.

سم عصبي آخر هو ذيفان الكزاز ، الذي تنتجه البكتيريا موجبة الجرام كلوستريديوم الكزازية . يحتوي هذا السم أيضًا على وحدة فرعية A خفيفة ووحدة فرعية من سلسلة البروتينات الثقيلة B. على عكس توكسين البوتولينوم ، يرتبط ذيفان الكزاز بالعصبونات الداخلية المثبطة ، المسؤولة عن إطلاق الناقلات العصبية المثبطة الجلايسين وحمض جاما أمينوبوتريك (GABA). عادة ، ترتبط هذه الناقلات العصبية بالخلايا العصبية عند التقاطع العصبي العضلي ، مما يؤدي إلى تثبيط إطلاق الأسيتيل كولين. يمنع ذيفان الكزاز إفراز الجلايسين و GABA من العصبون الداخلي ، مما يؤدي إلى تقلص دائم للعضلات. يتمثل العَرَض الأول عادةً في تصلب الفك (فك الفك). يتبع ذلك تشنجات عضلية عنيفة في أجزاء أخرى من الجسم ، وعادة ما تبلغ ذروتها بفشل الجهاز التنفسي والوفاة. يوضح الشكل 15.16 تصرفات كل من سموم البوتولينوم والتيتانوس.

تؤثر السموم المسببة لاختلال الغشاء على وظيفة غشاء الخلية إما عن طريق تكوين المسام أو عن طريق تعطيل طبقة الفسفوليبيد الثنائية في أغشية الخلايا المضيفة. هناك نوعان من السموم الخارجية المسببة لاضطراب الغشاء هما الهيموليزين س و leukocidins ، التي تشكل مسامًا في أغشية الخلايا ، مما يتسبب في تسرب محتويات السيتوبلازم وتحلل الخلايا. كان يُعتقد في الأصل أن هذه السموم تستهدف خلايا الدم الحمراء (كريات الدم الحمراء) وخلايا الدم البيضاء (الكريات البيض) ، على التوالي ، لكننا نعلم الآن أنها يمكن أن تؤثر على الخلايا الأخرى أيضًا. البكتيريا موجبة الجرام الأبراج العقدية تنتج الستربتوليسين ، الهيموليزين القابل للذوبان في الماء والذي يرتبط بأجزاء الكوليسترول في غشاء الخلية المضيفة لتشكيل مسام. يتم تصنيف نوعي الستربتوليزين ، O و S ، من خلال قدرتهما على التسبب في انحلال الدم في كريات الدم الحمراء في غياب أو وجود الأكسجين. Streptolysin O غير نشط في وجود الأكسجين ، بينما يكون الستربتوليسين S نشطًا في وجود الأكسجين. تشمل السموم الأخرى المهمة التي تسبب اختلال الغشاء والتي تشكل المسام ذيفان ألفا المكورات العنقودية الذهبية و pneumolysin العقدية الرئوية .

الفسفوليباسات البكتيرية هي مادة سامة معطلة للأغشية س التي تعمل على تحلل طبقة الفسفوليبيد ثنائية أغشية الخلايا بدلاً من تكوين المسام. لقد ناقشنا بالفعل phospholipases المرتبطة جرثومة الجمرة الخبيثة ، L. المستروحة ، و ريكتسيا الأنواع التي تمكن هذه البكتيريا من التأثير على تحلل البلعمة. هذه الفسفوليباسات نفسها هي أيضًا هيموليزينات. تشمل فسفوليباسات أخرى تعمل مثل الهيموليزين سم ألفا المطثية الحاطمة ، فسفوليباز ج P. الزنجاريةوبيتا توكسين من المكورات العنقودية الذهبية.

بعض سلالات بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية ينتج أيضًا leukocidin يسمى Panton-Valentine leukocidin (PVL). يتكون PVL من وحدتين فرعيتين ، S و F. يعمل المكون S مثل الوحدة الفرعية B للسم الخارجي A-B من حيث أنه يرتبط بالجليكوليبيدات على غشاء البلازما الخارجي للخلايا الحيوانية. يعمل المكون F مثل الوحدة الفرعية A من السموم الخارجية A-B ويحمل النشاط الأنزيمي. يدخل السم ويتجمع في مسام في الغشاء. تتواجد الجينات التي تقوم بتشفير PVL بشكل متكرر في ملفات بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية السلالات التي تسبب التهابات الجلد والالتهاب الرئوي. 8 PVL يعزز الالتهابات الجلدية عن طريق التسبب في الوذمة والحمامي (احمرار الجلد بسبب تمدد الأوعية الدموية) ونخر الجلد. وقد ثبت أيضًا أن PVL يسبب الالتهاب الرئوي الناخر. يعزز PVL التأثيرات المؤيدة للالتهابات والسمية للخلايا على الكريات البيض السنخية. ينتج عن هذا إطلاق الإنزيمات من الكريات البيض ، والتي بدورها تتسبب في تلف أنسجة الرئة.

الفئة الثالثة من السموم الخارجية هي superantigen س. هذه هي السموم الخارجية التي تؤدي إلى تحفيز مفرط وغير محدد للخلايا المناعية لإفراز السيتوكينات (الرسل الكيميائي). ينتج عن الإنتاج المفرط للسيتوكينات ، الذي يُطلق عليه غالبًا عاصفة السيتوكين ، استجابة مناعية والتهابات قوية يمكن أن تسبب حمى شديدة مهددة للحياة ، وانخفاض ضغط الدم ، وفشل أعضاء متعددة ، وصدمة ، وموت. النموذج الأولي superantigen هو ذيفان متلازمة الصدمة السامة بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية. ترتبط معظم حالات متلازمة الصدمة السامة بالاستعمار المهبلي عن طريق إنتاج السموم بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية ومع ذلك ، يمكن أن يحدث استعمار مواقع الجسم الأخرى عند النساء في فترة الحيض. بعض سلالات الأبراج العقدية تنتج أيضًا مضادات فائقة ، يشار إليها باسم المكورات العنقودية الخارجية والسموم المسببة للحرارة.

تأكد من فهمك

  • صف كيف تساهم الإنزيمات الخارجية في الغزو البكتيري.
  • اشرح الفرق بين السموم الخارجية والسموم الداخلية.
  • قم بتسمية الفئات الثلاث للسموم الخارجية.

عوامل الضراوة للبقاء في المضيف والتهرب المناعي

إن تجنب الجهاز المناعي مهم أيضًا للغزو. تستخدم البكتيريا مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لتفادي البلعمة بواسطة خلايا الجهاز المناعي. على سبيل المثال ، تنتج العديد من البكتيريا كبسولات ، والتي تستخدم في الالتصاق ولكنها تساعد أيضًا في التهرب المناعي عن طريق منع البلعمة من الابتلاع. يمنع تكوين الكبسولة الخلايا المناعية من أن تكون قادرة على الالتصاق ثم البلعمة للخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تجعل الكبسولة الخلية البكتيرية أكبر بكثير ، مما يجعل من الصعب على الخلايا المناعية ابتلاع العامل الممرض (الشكل 15.17). البكتيريا المنتجة للكبسولات البارزة هي العامل الممرض موجب الجرام العقدية الرئوية ، الذي يسبب الالتهاب الرئوي بالمكورات الرئوية ، والتهاب السحايا ، وتسمم الدم ، والتهابات الجهاز التنفسي الأخرى. سلالات مغلفة من الرئوية الرئوية أكثر ضراوة من السلالات غير المغلفة ومن المرجح أن تغزو مجرى الدم وتسبب تسمم الدم والتهاب السحايا.

يمكن لبعض مسببات الأمراض أيضًا إنتاج البروتياز لحماية أنفسهم من البلعمة. كما هو موصوف في دفاعات المضيف المحددة التكيفية ، ينتج جهاز المناعة البشري أجسامًا مضادة ترتبط بجزيئات السطح الموجودة في بكتيريا معينة (على سبيل المثال ، الكبسولات ، fimbriae ، السوط ، LPS). يبدأ هذا الارتباط بالبلعمة وآليات أخرى للقتل والتصفية المضادة للبكتيريا. يحارب البروتياز القتل والتخلص بوساطة الأجسام المضادة عن طريق مهاجمة وهضم جزيئات الجسم المضاد (الشكل 15.17).

بالإضافة إلى الكبسولات والبروتياز ، تنتج بعض مسببات الأمراض البكتيرية عوامل ضراوة أخرى تسمح لها بالتهرب من جهاز المناعة. الخمل من أنواع معينة من العقدية تحتوي على بروتين M الذي يغير سطح العقدية ويمنع البلعمة عن طريق منع ارتباط الجزيئات التكميلية التي تساعد البلعمة في ابتلاع مسببات الأمراض البكتيرية. البكتيريا الحمضية السل الفطري (العامل المسبب لمرض السل) ينتج مادة شمعية تعرف باسم حمض الميكوليك في غلاف الخلية. عندما تبتلعها الخلايا البلعمية في الرئة ، فإن طبقة حمض الفطريات الواقية تمكن البكتيريا من مقاومة بعض آليات القتل داخل البلعمة.

تنتج بعض البكتيريا عوامل ضراوة تعزز العدوى عن طريق استغلال الجزيئات التي ينتجها المضيف بشكل طبيعي. على سبيل المثال ، معظم سلالات المكورات العنقودية الذهبية إنتاج إنزيم exoenzyme coagulase ، الذي يستغل الآلية الطبيعية لتخثر الدم لتفادي جهاز المناعة. عادة ، يتم تحفيز تخثر الدم استجابة لتلف الأوعية الدموية ، حيث تبدأ الصفائح الدموية في سد الجلطة ، وتحدث سلسلة من التفاعلات التي ينشطر فيها الفيبرينوجين ، وهو بروتين قابل للذوبان يصنعه الكبد ، إلى الفيبرين. الفيبرين عبارة عن بروتين شبيه بالخيوط غير قابل للذوبان يرتبط بالصفائح الدموية ويترابط ويتعاقد ليشكل شبكة من الصفائح الدموية المتكتلة وخلايا الدم الحمراء. الجلطة الناتجة تمنع فقدان المزيد من الدم من الأوعية الدموية التالفة. ومع ذلك ، إذا أطلقت البكتيريا تجلط الدم في مجرى الدم ، يتم تشغيل سلسلة الفبرينوجين إلى الفبرين في غياب تلف الأوعية الدموية. تقوم الجلطة الناتجة بتغطية البكتيريا في الفيبرين ، مما يحمي البكتيريا من التعرض للخلايا المناعية البلعمية المنتشرة في مجرى الدم.

في حين أن تجلط الدم يسبب تجلط الدم ، فإن الكينازات لها تأثير معاكس من خلال تحفيز تحويل البلازمينوجين إلى البلازمين ، والذي يشارك في هضم جلطات الفيبرين. من خلال هضم الجلطة ، تسمح الكينازات لمسببات الأمراض المحتجزة في الجلطة بالهروب والانتشار ، على غرار الطريقة التي يسهل بها الكولاجيناز والهيالورونيداز و DNAse انتشار العدوى. تتضمن أمثلة الكينازات العنقوديات والستربتوكينازات التي تنتجها المكورات العنقودية الذهبية و الأبراج العقدية ، على التوالى. من المثير للاهتمام أن بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية يمكن أن تنتج كلا من تجلط الدم لتعزيز التخثر والمكورات العنقودية لتحفيز هضم الجلطات. يوفر عمل إنزيم التخثر حاجزًا وقائيًا مهمًا من جهاز المناعة ، ولكن عندما تتضاءل إمدادات المغذيات أو تشير ظروف أخرى إلى حاجة العامل الممرض للهروب والانتشار ، يمكن أن يبدأ إنتاج الستافيلوكيناز هذه العملية.

الآلية النهائية التي يمكن لمسببات الأمراض استخدامها لحماية نفسها من الجهاز المناعي تسمى الاختلاف المستضدي ، وهو تغيير البروتينات السطحية بحيث لا يتعرف الجهاز المناعي للمضيف على العامل الممرض. على سبيل المثال ، البكتيريا بوريليا برغدورفيرية ، العامل المسبب لمرض لايم ، يحتوي على بروتين شحمي سطحي يعرف باسم VlsE. بسبب إعادة التركيب الجيني أثناء تكرار وإصلاح الحمض النووي ، يخضع هذا البروتين البكتيري لتباين مستضدي. في كل مرة تحدث فيها الحمى ، يدخل بروتين VlsE B. burgdorferi يمكن أن تختلف كثيرًا لدرجة أن الأجسام المضادة مقابل متواليات VlsE السابقة ليست فعالة. ويعتقد أن هذا الاختلاف في VlsE يساهم في القدرة B. burgdorferi لتسبب مرض مزمن. آخر مُمْرِض بكتيري بشري مهم يستخدم التباين المستضدي لتجنب الجهاز المناعي النيسرية البنية ، الذي يسبب مرض السيلان الذي ينتقل عن طريق الاتصال الجنسي. تشتهر هذه البكتيريا بقدرتها على الخضوع للتنوع المستضدي من النوع الرابع من الشعيرات لتجنب الدفاعات المناعية.

تأكد من فهمك

  • قم بتسمية طريقتين على الأقل توفرهما الكبسولة للحماية من جهاز المناعة.
  • إلى جانب الكبسولات ، قم بتسمية عاملين آخرين من عوامل الضراوة التي تستخدمها البكتيريا للتهرب من جهاز المناعة.

التركيز السريري

الدقة

استنادًا إلى الأعراض التي أبلغ عنها مايكل لتصلب الرقبة والشلل النصفي ، يشتبه الطبيب في أن العدوى ربما انتشرت إلى جهازه العصبي. يقرر الطبيب أن يأمر بالبزل الشوكي للبحث عن أي بكتيريا قد تكون قد غزت السحايا والسائل الدماغي النخاعي (CSF) ، والتي عادة ما تكون عقيمة. لإجراء البزل النخاعي ، يتم مسح أسفل ظهر مايكل بمطهر اليود ثم تغطيته بملاءة معقمة. تتم إزالة الإبرة بطريقة معقمة من العبوة البلاستيكية محكمة الغلق من قبل يدي الطبيب القفازات. يتم إدخال الإبرة ويتم سحب كمية صغيرة من السائل في أنبوب العينة المرفق. تتم إزالة الأنبوب وتغطيته ويتم لصق ملصق مُجهز ببيانات مايكل عليه. تنقسم عينة STAT (التحليل العاجل أو الفوري المطلوب) إلى ثلاثة أنابيب معقمة منفصلة ، كل منها يحتوي على 1 مل من السائل الدماغي النخاعي. يتم أخذ هذه الأنابيب على الفور إلى معمل المستشفى ، حيث يتم تحليلها في أقسام الكيمياء السريرية وأمراض الدم وعلم الأحياء الدقيقة. تشير النتائج الأولية من جميع الأقسام الثلاثة إلى حدوث عدوى دماغية شوكية ، حيث أبلغ قسم الأحياء الدقيقة عن وجود قضيب موجب الجرام في السائل الدماغي الشوكي مايكل.

تؤكد هذه النتائج ما كان طبيبه يشك فيه: الأعراض الجديدة لمايكل هي نتيجة التهاب السحايا ، التهاب حاد في الأغشية التي تحمي الدماغ والنخاع الشوكي. نظرًا لأن التهاب السحايا يمكن أن يهدد الحياة ولأن العلاج الأول بالمضادات الحيوية لم يكن فعالًا في منع انتشار العدوى ، فقد وصف مايكل دورة مكثفة من المضادات الحيوية ، الأمبيسلين والجنتاميسين ، ليتم إعطاؤها عن طريق الوريد. بقي مايكل في المستشفى لعدة أيام لتلقي الرعاية الداعمة والمراقبة. بعد أسبوع ، يُسمح له بالعودة إلى المنزل للراحة في الفراش وتناول المضادات الحيوية عن طريق الفم. بعد 3 أسابيع من هذا العلاج ، يتعافى تمامًا.

ارجع إلى مربع التركيز السريري السابق.

الفوعة الفيروسية

على الرغم من أن مسببات الأمراض الفيروسية لا تشبه مسببات الأمراض البكتيرية من حيث التركيب ، إلا أن بعض الخصائص التي تساهم في ضراوتها متشابهة. تستخدم الفيروسات مواد لاصقة لتسهيل الالتصاق بالخلايا المضيفة ، وتعتمد بعض الفيروسات المغلفة على التباين المستضدي لتجنب الدفاعات المناعية للمضيف. تمت مناقشة عوامل الفوعة هذه بمزيد من التفصيل في الأقسام التالية.

مواد لاصقة فيروسية

من أولى الخطوات في أي عدوى فيروسية التصاق الفيروس بمستقبلات محددة على سطح الخلايا. تتم هذه العملية بوساطة مواد لاصقة تشكل جزءًا من القفيصة الفيروسية أو غلاف الغشاء. يُحدِّد تفاعل المواد اللاصقة الفيروسية مع مستقبلات خلوية معينة المدارية (الاستهداف التفضيلي) للفيروسات لخلايا وأنسجة وأعضاء معينة في الجسم. يعتبر بروتين هيماجلوتينين السنبلة الموجود في فيروس الإنفلوانزا مثالاً على مادة لاصقة فيروسية تسمح للفيروس بالارتباط بحمض السياليك الموجود على غشاء الخلايا التنفسية والأمعاء المضيفة. لاصق فيروسي آخر هو بروتين سكري gp20 ، الموجود في فيروس نقص المناعة البشرية. لكي يصيب فيروس نقص المناعة البشرية خلايا الجهاز المناعي ، يجب أن يتفاعل مع مستقبلين على سطح الخلايا. يتضمن التفاعل الأول الارتباط بين gp120 والعلامة الخلوية CD4 الموجودة في بعض خلايا الجهاز المناعي الأساسية. ومع ذلك ، قبل أن يحدث دخول الفيروس إلى الخلية ، يجب أن يحدث تفاعل ثانٍ بين gp120 وواحد من اثنين من المستقبلات الكيميائية (CCR5 و CXCR4). يسرد الجدول 15.11 المواد اللاصقة لبعض مسببات الأمراض الفيروسية الشائعة والمواقع المحددة التي تسمح هذه المواد اللاصقة للفيروسات بالالتصاق بها.

بعض المواد اللاصقة الفيروسية ومواقع ارتباطها بالمضيف
العوامل الممرضة مرض لاصقة موقع المرفقات
فيروس الأنفلونزا الانفلونزا هيماجلوتينين حمض السياليك لخلايا الجهاز التنفسي والأمعاء
فيروس الهربس البسيط الأول أو الثاني الهربس الفموي ، الهربس التناسلي البروتينات السكرية gB ، gC ، gD كبريتات الهيبارين على الأسطح المخاطية للفم والأعضاء التناسلية
فيروس نقص المناعة البشرية فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز بروتين سكري gp120 CD4 و CCR5 أو CXCR4 لخلايا الجهاز المناعي

التباين الأنتيجيني في الفيروسات

يحدث التباين الأنتيجيني أيضًا في أنواع معينة من الفيروسات المغلفة ، بما في ذلك فيروسات الأنفلونزا ، والتي تظهر شكلين من التباين المستضدي: الانجراف المستضدي والتحول المستضدي (الشكل 15.18). الانجراف الأنتيجيني هو نتيجة الطفرات النقطية التي تسبب تغيرات طفيفة في بروتينات سبايك هيماجلوتينين (H) والنورامينيداز (N). من ناحية أخرى ، فإن التحول المستضدي هو تغيير رئيسي في بروتينات سبايك بسبب إعادة تجميع الجينات. يحدث هذا التجميع للتحول المستضدي عادةً عندما يصيب فيروسان مختلفان للإنفلونزا نفس المضيف.

معدل التباين المستضدي في فيروسات الأنفلونزا مرتفع للغاية ، مما يجعل من الصعب على الجهاز المناعي التعرف على العديد من السلالات المختلفة لفيروس الإنفلوانزا. على الرغم من أن الجسم قد يطور مناعة ضد سلالة واحدة من خلال التعرض الطبيعي أو التطعيم ، فإن التباين في المستضدات يؤدي إلى استمرار ظهور سلالات جديدة لن يتعرف عليها الجهاز المناعي. هذا هو السبب الرئيسي لضرورة إعطاء لقاحات ضد فيروس الأنفلونزا سنويًا. يوفر لقاح الإنفلونزا كل عام الحماية ضد السلالات الأكثر انتشارًا لذلك العام ، ولكن قد تكون السلالات الجديدة أو المختلفة أكثر انتشارًا في العام التالي.

ارتباط بالتعلم

للحصول على شرح آخر لكيفية حدوث التحول والانحراف المستضدي ، شاهد هذا الفيديو.


علم الوراثة - مراجعة الامتحان الرابع

استخدم كل من الأساليب التجريبية والمعلوماتية الحيوية لتحديد وتحليل العناصر الوظيفية التي تنظم التعبير عن الجينات البشرية (مثل مواقع بدء النسخ ، والمروجين ، والمعززات).

يدرس التعبير الجيني عن طريق الجينوم نوعيًا (تحديد ما يتم التعبير عنه وما لا يتم التعبير عنه) وكميًا (قياس مستويات مختلفة من التعبير).

يوفر معلومات حول بنية / وظيفة البروتين ، والتعديلات اللاحقة للترجمة ، والبروتين-البروتين ، والنيوكليوتيدات البروتينية ، وتفاعلات البروتين-المستقلب ، إلخ.

تعمل كمنظمات رابطة الدول المستقلة لأنها تعمل عندما تكون مجاورة للجينات التي تنظمها.

يتم التعبير عن بعض TF بطرق خاصة بالأنسجة أو بطرق زمنية محددة.

ترتبط أيضًا بمركب TFIID

13 بروتينًا تسمى TAFs (عوامل TATA المرتبطة).

النسخ لهذه الجينات ، التي تنقل الجالاكتوز إلى الخلية وتستقلبه ، يكون محرضًا.

في حالة عدم وجود الجالاكتوز ، يرتبط Gal4p بـ UAS. يرتبط Gal80p بـ Gal4p ويغطي مجال تنشيط النسخ (TAD).

يسمح التضفير البديل بالعديد من أشكال الرنا المرسال النهائي (و ∴ البروتين) من نفس ما قبل الرنا المرسال. الطفرات التي تؤثر على مسار التضفير تسبب العديد من الأمراض الوراثية.

21-23 ريبونوكليوتيدات في الطول) الناتجة عن دايسر.

هذه الرنا لها جيناتها الخاصة ويتم نسخها ولكن لا تترجم.

Drosha يشق حلقات جذعية من priRNA في سلائف mRNA أقصر تسمى pre-miRNA.


امتحان الأحياء الدقيقة 2

2) التنبيغ- نقل الحمض النووي بواسطة فيروس ، لا يلزم الاتصال بين الخلية والخلية.

خلية المتبرع الأصلية ميتة.

3) الاقتران- نقل الحمض النووي عن طريق الخلية المانحة إلى المستلم عن طريق اتصال الخلية بالخلية

2) المنافسة_ هي المرحلة التي تستطيع فيها البكتيريا امتصاص الحمض النووي من البيئة.

2) إعادة التركيب - إذا كان الحمض النووي خطيًا ، فيجب دمجه في جينوم الخلايا المضيفة ليتم الاحتفاظ به.

يجب أن يكون الحمض النووي الوارد مشابهًا في تسلسل الحمض النووي للمضيف.

يحل DNA الوارد محل الحمض النووي المضيف.

R: شكل غير مُمْرِض وغير مغطس.

R- غير ضار (الفأر الحي)
S- خبيث (الفأر الميت)
حار قتل S (الفأر على قيد الحياة)

كان مبدأ التحويل هو كبسولة السكاريد.

1) المعالجة الكيميائية - الصدمة الباردة ومعالجة الكالسيوم تليها الصدمة الحرارية والصدمة الباردة.

تضعف البرد والمواد الكيميائية جدار الخلية وتساعد الحمض النووي على الالتصاق بالسطح.

_ الكالسيوم = + الشحن ، الحمض النووي سلبي وسطح الخلية سالب ، يقلل من التنافر الإلكتروستاتيكي.

يسمح شحن الغشاء بتكوين المسام لأنها تعمل كمكثفات.

وتتحول الشظايا إلى خلية متلقية جديدة وتتحول التي تحتوي على المعلومات الجينية.

في كثافة الخلايا العالية يتم تشغيل نظام الكفاءة.

تقوم الخلايا بتشغيل T6SS وتبدأ في ثقب الخلايا الأخرى.

سوف تتلاشى الخلايا غير المناعية.

البلازميد - جزيء دائري من الحمض النووي يكرر نفسه.

توجد بشكل طبيعي في العديد من البكتيريا.

مصدر الجينات المقاومة للمضادات الحيوية.

ستحمل معظم الجسيمات الفيروسية الناتجة الحمض النووي للفيروس.

بشكل عام ، يحمل 1 من كل 10000 جزيئات فيروسية فقط الحمض النووي البكتيري عن طريق الخطأ (0.01)

التنبيغ المعمم (مثال P1: Phage)

أي جين بكتيري معين 1 من 500000 فيروس. [0002)

2) ملتهمة عرضية حزم الخلايا البكتيرية.

3) Phage ذات الحمض النووي البكتيري تصيب الخلايا الأخرى.

1) تصيب Lamda بكتيريا E. Coli وتدخل حمضها النووي الفيروسي في موقع معين في الكروموسوم البكتيري = Prophage

2) عادة عندما تتلف الإشريكية القولونية ، تقوم فجوة لامدا باستئصال الحمض النووي الخاص بها وتكرار المزيد من العاثيات لإصابة الخلايا الأخرى.

3) في بعض الأحيان يتم استئصال DNA Lamda بشكل غير صحيح ويتم أخذ بعض الحمض النووي البكتيري مع المضيف.

4) تصيب جسيمات لامدا المنسوخة حديثًا الخلية المضيفة وتصيب خلية جديدة ، الحمض النووي الفيروسي بالإضافة إلى جزء من كروموسومات المضيف.

يحدث الإدخال في مواقع محددة في الكروموسوم البكتيري.

تسلسل Inserstion: بقع متطابقة تقريبًا في تسلسل الحمض النووي بين البلازميد F والكروموسوم البكتيري.

يحتوي E coli على 19 موقعًا حيث يمكنه الاندماج في جينوم الخلايا المضيفة.

سلالة تحتوي على البلازميد F مندمجة في جينومها. (كروموسوم Hfr)

يسمح بنقل جينات الكروموسومات البكتيرية عالي التردد إلى الخلية المستقبلة.

تعتبر خلية مانحة لأنها تحتوي على جينات للنقل. (ترا)

الاقتران بين Hfr والخلية و F- الخلية

جانب رأس السهم من البلازميد F هو ما ينتقل أولاً ، يليه الكروموسوم. ، يليه البلازميد المتبقي.


الانتماءات

يعمل تيم فان أوبيجن في قسم الأحياء ، كلية بوسطن ، 140 شارع كومنولث ، 420 هيجينز هول ، تشيستنت هيل ، ماساتشوستس 02467 ، الولايات المتحدة الأمريكية.

يعمل أندرو كاميلي في معهد هوارد هيوز الطبي وقسم البيولوجيا الجزيئية وعلم الأحياء الدقيقة ، كلية الطب بجامعة تافتس ، 136 شارع هاريسون ، بوسطن ، ماساتشوستس 02111 ، الولايات المتحدة الأمريكية.

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

المؤلفون المراسلون


الكتابة

يرتبط التعبير الجيني ارتباطًا وثيقًا بتنظيم الكروماتين. يجب أن تحصل RNAP على إمكانية الوصول إلى DNA ge-nomic الذي يتم تنظيمه في nucleosomes ، وتنظم النيوكليوزومات الموضعية برنامج النسخ على مستوى الجينوم الكامل. وبالتالي ، من الأهمية بمكان فهم آليات النسخ من خلال النيوكليوسومات.

دراسات رائدة من قبل Studitsky et al. (95) أثبت أن Phage SP6 RNAP تم نسخه بشكل فعال من خلال nucleosome ، وكشف أنه يمكن نقل nucleosome في رابطة الدول المستقلة على الحمض النووي خلف البوليميراز المتحرك. في نموذج حلقات الحمض النووي ، تعمل RNAP EC على ثني الحمض النووي بشكل كافٍ لتسهيل تكوين اتصالات DNA جديدة للنيوكليوسوم خلف EC. نظرًا لأن المفوضية الأوروبية تقشر الحمض النووي بعيدًا عن سطح النواة ، يتم نقل جهات اتصال هيستون المكشوفة حديثًا إلى الحمض النووي العاري الموجود خلف EC المتطور (95).

إعادة النسخ في المختبر بواسطة S. cerevisiae أكد RNA polymerase III (pol III) أن الآلية الوسيطة للحمض النووي كانت صالحة أيضًا لـ RNAPs حقيقية النواة (96). قد يكون من غير المرجح أن يقوم Pol III ، وهو إنزيم يقوم بنسخ جينات قصيرة نسبيًا من الرنا الريباسي والرنا الريباسي ، بنسخ الأعداد الكبيرة الماضية من النيوكليوسومات في الجسم الحي. في المختبر ، ومع ذلك ، فإن pol III ينسخ من خلال nucleosome بطريقة مماثلة لتلك الخاصة بالعاثيات RNAPs (96).

هل يعطل RNAP بنشاط النيوكليوسومات؟

في حقيقيات النوى ، يقوم RNA polymerase II (pol II) بنسخ mRNA وقد يحتاج إلى التعامل بشكل متكرر مع الحواجز النووية. ومع ذلك ، في المختبر ، كانت النيوكليوسومات حاجزًا قويًا لكل من الخميرة والنسخ البشري للبول II (11 ، 50 ، 51 ، 55). علاوة على ذلك ، اختلفت آلية النسخ ومصير النيوكليوسومات بشكل ملحوظ مقارنة بما شوهد مع RNAPs (50 ، 55).

استخدم بوستامانتي وزملاؤه (8 ، 42) مقايسة ملاقط بصرية عالية الدقة أحادية الجزيء لدراسة آلية كيفية عبور pol II للحاجز النووي. استخدمت الدراسة نهج المصيدة البصرية المزدوجة كما هو موضح في الشكل 6. تم لصق حبة بوليسترين واحدة في نهاية جزيء الحمض النووي عبر تفاعل الديجوكسيجينين - الأنتيدجوكسيجين. تم تجميع pol II EC وتثبيته على حبة ثانية مطلية بالستربتافيدين. تم تجميع نيوكليوسوم واحد على تسلسل الحمض النووي Widom 601 الذي تم وضعه بقوة في اتجاه مجرى مروج RNAP (الشكل 6أ ). بدأت التفاعلات بعد ذلك بإضافة جميع rNTPs الأربعة ، وتم الكشف عن النسخ بواسطة pol II كتغيير في طول الحمض النووي بين الخرزتين.

فحص مصيدة بصرية للتحقيق في نسخ RNA polymerase II (RNAP II) بعد جسيم نووي. (أ) رسم تخطيطي لبناء الحمض النووي المستخدم في هذه الدراسة. تم لصق أحد طرفي الحمض النووي على حبة بوليسترين عبر تفاعل DIG & # x02013anti-DIG. تم تجميع pol II المعالج بالبيوتينيلات على معزز (أزرق) وملصقة على حبة ثانية مطلية بالستربتافيدين. أعيد تكوين النوكليوسوم على تسلسل DNA Widom 601 القوي لتحديد المواقع النووية (بنى). (ب) رسم توضيحي للإعداد التجريبي. تمت مراقبة نسخ RNAP كتغيير في طول الحمض النووي بين الفخدين البصريين. (ج) آثار النسخ الفردية للبول II كدالة لتركيز كلوريد الصوديوم. في الأملاح المنخفضة ، يتوقف البول الثاني عند الحاجز النووي. مع زيادة تركيز كلوريد الصوديوم ، يتوقف البول الثاني مؤقتًا وينتقل في النهاية إلى ما بعد الجسيم النووي. (د ) رسم بياني لاحتمال الاعتقال المعتمد على النواة. يتوقف البوليميراز مؤقتًا عند مواجهته للنيوكليوسوم ، لكن يمكنه نسخ تفاعلات حمض الهيستون والحمض النووي المعطلة بشكل عابر بتركيزات ملح أعلى. (ج ، د ) تظهر آثار النسخ على الحمض النووي العاري في آثار النسخ السوداء على الحمض النووي مع النيوكليوسومات تظهر بالألوان. تمثل المناطق المظللة في الرسوم البيانية موقع تسلسل تحديد موقع النواة. الاختصارات: EC ، معقد الاستطالة DIG ، الديجوكسيجينين.

كما هو متوقع ، فإن النسخ على الحمض النووي العاري يخضع للتوقف والتراجع عن RNAP EC (59 ، 75). ومع ذلك ، ازداد ميل الإيقاف المؤقت للبول II ومدد الإيقاف المؤقت بشكل ملحوظ مع اقتراب البوليميراز من النواة ، ولم يتمكن Polymerase من نسخ الجسيم النووي في ظروف منخفضة من كلوريد الصوديوم (42) (الشكل 6)ج ). في تركيزات أعلى من كلوريد الصوديوم ، حيث تضعف بشكل كبير التفاعلات الكهروستاتيكية النواة والحمض النووي ، يمكن أن يستمر النسخ بعد النواة ، وإن كان ذلك بسرعات منخفضة (42) (الشكل 6).

تتوافق البيانات مع النموذج الذي عمل فيه pol II كسقاطة تغزو نوكليوسوم غير مغلف تلقائيًا ، لكنها غير متوافقة مع النماذج التي تستدعي pol II & # x02013 النشط المعتمد على اتصالات هيستون والحمض النووي (42). تمت زيادة التوقف المؤقت للبوليميراز بشكل كبير مع اقتراب EC من المحور الثنائي للجزيء الأحادي عالي الدقة للجزيء الأحادي النوكليوزوم أوضحت التجارب أن هذه المنطقة لها تفاعلات قوية بشكل خاص بين هيستون والحمض النووي وأن هذه التفاعلات تتعطل عند قوى أيونية أعلى (39) . عند الوصول إلى محور dyad nucleosome ، فإن pol II إما يتراجع (انظر أدناه) أو يواصل النسخ من خلال بقية النواة. الأهم من ذلك ، استبعدت البيانات نموذجًا استخدم فيه pol II طاقة التحلل المائي NTP لفك النوكليوسوم بشكل نشط بدلاً من ذلك يبدو كما لو أن القطب II ينتظر أن ينفصل النواة تلقائيًا (42).

تم تحليل الحاجز النووي للنسخ بشكل أكبر من حيث المساهمات الفردية من تفاعلات هيستون والحمض النووي ، وتسلسل الحمض النووي الأساسي ، وذيول الهيستون (8). أثبت بوستامانتي وزملاؤه أن كل مكون من مكونات الحاجز النووي له تأثير عميق ومميز على معدل النسخ من خلال الجسيم النووي. أدت إزالة ذيول الهيستون إلى تحفيز النسخ المتجاوز للنيوكليوزوم عن طريق زيادة معدل الالتفاف التلقائي للهيستون والحمض النووي. في المقابل ، قد يتسبب تسلسل الحمض النووي الأساسي في توقف pol II مؤقتًا ، ويتم تضخيم هذه التوقفات المؤقتة عند حاجز nucleosome. تم العثور على نسخة RNA الوليدة لمنع تراجع pol II ، وإزالة النص باستخدام Rnase A ، مما أدى إلى تقليل النسخ بشكل كبير من خلال nucleosome (8).

تتأثر قوة الحاجز النووي للنسخ بشدة بتفاعلات هيستون والحمض النووي. يتم دعم وجهة النظر هذه من خلال اكتشاف أن طفرة نقطة واحدة في hi-stone H3 يمكن أن تنقذ خلايا الخميرة التي تفتقد إلى عامل إعادة تشكيل الكروماتين الأساسي (SWI / SNF) (54). هذه الطفرة المعروفة باسم الخطيئة (يعتمد على Swi-IN) ، يعطل تفاعلًا قويًا بين النوكليوسوم والحمض النووي ، مما يسمح بإزاحة أكثر استعدادًا للنيوكليوسومات حتى في حالة عدم وجود معيد تشكيل كروماتين SWI / SNF (54 ، 73). الأهم من ذلك ، كان النسخ بواسطة الإنسان pol II أكثر كفاءة بشكل ملحوظ من خلال الخطيئة النيوكليوسومات من النيوكليوسومات من النوع البري ، وتم تحفيزها حتى بالقرب من مستويات الحمض النووي العاري عن طريق إضافة عوامل استطالة النسخ TFIIS و TFIIF (44 ، 63). عندما يتم فحصه على مستوى الجزيء المفرد ، الخطيئة حفزت الطفرات في H3 و H4 النسخ من خلال nucleosome عن طريق خفض معدل إعادة التفاف هيستون-DNA العفوي (8). وبالتالي ، فإن قوة تفاعلات هيستون-دنا تلعب دورًا رئيسيًا في تعديل النسخ في المختبر وفي الجسم الحي.

تم أيضًا التحقيق في مصير النوكليوسوم من خلال استخدام التصوير أحادي الجزيء AFM. قد يحدد معدل النسخ مصير النيوكليوسومات (9). يسهل النسخ السريع لـ RNAP التفكك النووي من خلال عدم ترك وقت كافٍ للنواة غير المغلفة للانتقال خلف RNAP. بالنسبة للنسخ البطيء للبول II ، قد يؤدي اضطراب H2A / H2B إلى ترسب سداسي الشكل خلف المجموعة الأوروبية (9). قد تفسر هذه الملاحظات الاختلافات في فقدان الهيستون المرئي بين النسخ السريع لـ RNAPs و pol II (95) ، وتتفق مع الأدلة الموجودة في الجسم الحي للتبادل السريع H2A / H2B في الجينات المنسوخة بشكل معتدل (انظر أدناه) (56 ، 58).

يساعد RNAP الزائدة في التغلب على الحواجز النووية

يعد التراجع عن طريق RNAP EC ميزة عالمية لجميع RNAPs وقد يتداخل مع نسخ حواجز البروتين السابقة ويؤدي إلى عدم استقرار الجينوم (19 ، 75). في بدائيات النوى ، يمكن لأربع آليات رئيسية إنقاذ RNAP EC المتراجع: (أ) ترجمة النص الناشئ تمنع تراجع RNAP (83) (ب) عوامل مثل إنقاذ greA / greB المتوقفة عن طريق قص الرسالة المتخلفة لإعادة محاذاة النهاية 3 & # x02032-OH mRNA بالموقع الحفاز RNAP (74) (ج) يمكن لـ AT-Pases مثل Rho و Mfd إزالة RNAP المتوقفة من الحمض النووي (13 ، 25 ، 91) و (د ) cotranscription بواسطة اثنين من البوليمرات يقلل من التراجع عن طريق EC الرائد (24 ، 47).

يمكن أيضًا أن يؤدي النسخ Cotranscription بواسطة اثنين من RNAPs المرتبطين ارتباطًا وثيقًا إلى زيادة النسخ من خلال الجسيم النووي (47). تم استخدام ملاقط بصرية & # x02013-based DNA unzipping assay للتحقيق في كيفية تعاون اثنين من RNAPs T7 لنسخ ما وراء حاجز نووي (الشكل 7). من خلال فك ضغط الحمض النووي المزدوج ، قام المؤلفون بتعيين موضع موقع RNAP النشط مباشرةً. تم استخدام الرحلان الكهربائي الهلامي لرسالة الحمض النووي الريبي لتحديد طول النص بحساسية النوكليوتيدات المفردة. حددت مقارنة موقع RNAP بطول نسخة mRNA إلى أي مدى تراجع RNAP عند مواجهة حاجز نووي.

يتعاون اثنان من بوليمرات الحمض النووي الريبي (RNAPs) للتغلب على الحاجز النووي. تم استخدام ملاقط بصرية ومقايسة تستند إلى # x02013 لتعيين موضع موقع T7 RNAP النشط بعد أن واجه جسيمًا نوويًا. (أ) تتوقف RNAPs الفردية وتتراجع عند حاجز nucleosome. احتوى الحمض النووي على محفز T7 RNAP واحد (أزرق) ونيوكليوسوم متمركز بقوة (بنى). عند مواجهة النواة ، توقف RNAP وتراجع 75 نقطة أساس بعيدًا عن dyad nucleosome. لم تتم مشاهدة أي نسخ للقراءة تقريبًا بعد فترة حضانة استمرت 10 ثوانٍ. (ب) تم تقديم RNAP لاحقًا على مروج ثانٍ. لم يعد RNAP الرائد يتراجع ويتوقف مؤقتًا 60 نقطة أساس بعيدًا عن dyad nucleosome. كان جزء كبير من جزيئات RNAP قادرًا على النسخ من خلال الحاجز النووي.

تظهر في الشكل 7 مواقف الأفراد الذين تراجعوا عن مسار T7 RNAP بعد جولة مدتها 10 ثوانٍ من النسخ عبر النواة.أ . أشار الرحلان الكهربي للهلام للـ mRNA إلى أن النسخ توقف عند موضع & # x0221260 bp بالنسبة إلى الصبغ النووي. ومع ذلك ، تراجعت RNAP عن & # x0221215 bp إضافيًا بعيدًا عن 3 & # x02032-mRNA عند مواجهة النواة. علاوة على ذلك ، تم اختراق نسخ الجريان من خلال النواة بشكل كبير ، حتى بعد تفاعل النسخ لمدة 30 دقيقة (47).

حفز T7 RNAP EC الثاني بشكل كبير نسخ RNAP الرائد من خلال جسيم نووي. يظهر بناء الحمض النووي وموقع موقع RNAP النشط الرائد لهذا البناء في الشكل 7ب . تم تغيير موقع RNAP النشط الرائد بمقدار + 15 نقطة أساس ، بالنسبة إلى بنية T7 الفردية الموضحة في الشكل 7أ . علاوة على ذلك ، يمكن أن يحفز RNAP اللاحق النسخ من خلال خمسة أضعاف nucleosome ويقلل من الإيقاف المؤقت والتراجع لـ RNAP الرائد. على أساس هذه النتائج ، اقترح المؤلفون نموذجًا يوفر بموجبه RNAP المتأخر قوة مساعدة تنقذ RNAP الرائد المتراجع.

كانت النتائج مع اثنين من RNAPs الاتجاهية T7 في اتفاق قوي مع الدراسات البيوكيميائية لكليهما بكتريا قولونية ونسخ الخميرة RNAP من خلال جسيم نووي (24 ، 57). حفز القطب الثاني بشكل كبير قراءة النوكليوسوم من قبل المفوضية الأوروبية الرائدة وكان له تأثير قوي على مصير النوكليوسوم (57). عندما كانت RNAPs قريبة من بعضها البعض ، تم نقل النيوكليوسوم بكفاءة خلف EC اللاحق. عندما تم تقسيم البوليميرات بعيدًا عن بعضها البعض ، فقد الجسيم النووي. اقترح المؤلفون نموذجًا يمكن بواسطته ، إذا كان اثنان من RNAPs قريبين ، أن يتفاعل النيوكليوسوم جسديًا مع القطب اللاحق II وينتقل خلف كلا ECs. ومع ذلك ، إذا كان هناك مساحة على الحمض النووي بين اثنين من ECs ، فإن أول RNAP يرسب سداسيًا خلفه ، ثم يتم إزاحة هذا السداسي تمامًا من الحمض النووي عند مواجهة البوليميراز اللاحق.

مجتمعة ، تعطي هذه الملاحظات صورة أكثر عمومية عن كيفية نسخ RNAPs من خلال الحواجز النووية. النسخ السريع لـ RNAPs و الخميرة pol III قادران على إطالة ما وراء النواة بكفاءة ، ويتم تعديل النسخ إلى حد كبير عن طريق فك غلاف النواة العابرة. في المقابل ، أبطأ بكتريا قولونية تتوقف RNAP و pol II حقيقية النواة وتتراجع عند حاجز nucleosome ، بينما تحفز آليات التتبع المضاد تقدم pol II بعد nucleosome.

الوضع أكثر تعقيدًا في الخلايا الحية ، والعديد من عوامل إعادة تشكيل الكروماتين الإضافية ، مثل Asf1 و FACT ، تشارك في تنظيم النسخ على القوالب الكروماتينية (98 ، 100). تظهر عمليات إعادة التشكيل في المختبر أن هذه الإنزيمات ترتبط بـ RNAP II وتساعد في نسخ النيوكليوسومات السابقة. قد تساعد التجارب المستقبلية أحادية الجزيء في تحديد دور هذه العوامل وغيرها من العوامل المساعدة في تنظيم النسخ من خلال النيوكليوسومات.


مواد وطرق SI

سلالات وطرق الثقافة.

السلالات المستخدمة في هذا العمل مشتقة من EcM2.1 (ه. القولونية MG1655 mutS_mut dnaG_Q576A exoX_mut xonA_mut xseA_mut 1255700 :: tolQRA Δ (ybhB-bioAB) :: [λcI857 N (cro-ea59)::رباعي-بلوخ]) (33). يتكون وسط الاستزراع السائل من صيغة Lennox لمرق ليسوجيني (LB L) [1٪ (وزن / حجم) بكتو التربتون ، 0.5٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة ، 0.5٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم] (46) مع عوامل انتقائية مناسبة: كاربينيسيلين (50 ميكروغرام / مل) و SDS [0.005٪ (وزن / حجم)]. ل tolC تم استخدام عمليات الاختيار العداد ، كوليسين E1 (colE1) عند تخفيف 1: 100 من تنقية داخلية (47) والتي قست 14.4 ميكروغرام بروتين / ميكرولتر (22 ، 36) ، واستخدم فانكومايسين عند 64 ميكروغرام / مل. يتكون وسط الاستزراع الصلب من LB L معقم مع 1.5٪ (وزن / حجم) Bacto Agar (Fisher) يحتوي على نفس تركيزات المضادات الحيوية حسب الضرورة. تم إنشاء لوحات أجار ColE1 كما هو موضح سابقًا (33). تم تحديد مرات مضاعفة على قارئ صفيحة ميكروسكوبية BioTek Eon مع اهتزاز مداري عند 365 دورة في الدقيقة عند 34 درجة مئوية بين عشية وضحاها وتم تحليلها باستخدام نص Matlab المتاح على GitHub (https://github.com/churchlab/agr_recoding).

قليل النوكليوتيدات ، PCR ، والتجميع متساوي الحرارة.

يمكن العثور على جدول كامل من أليغنوكليوتيدات MAGE وبادئات PCR في Dataset S1.

تم تضخيم منتجات PCR المستخدمة في إعادة التركيب أو لتسلسل Sanger مع Kapa2G Fast polymerase وفقًا للبروتوكولات القياسية للشركة المصنعة. تم استخدام mascPCR في التنميط الجيني المتعدد لأحداث استبدال AGR باستخدام KAPA2G Fast Multiplex PCR Kit ، وفقًا للطرق السابقة (22 ، 48). تم تنفيذ تفاعلات Sanger-Sequence بواسطة طرف ثالث (GENEWIZ). تم تجميع بلازميدات CRAM من العمود الفقري البلازميدي الخطي باستخدام PCR (49) ، وتسلسلات CRISPR / PAM التي تم الحصول عليها في كتل G من تقنيات الحمض النووي المتكاملة ، باستخدام التجميع المتساوي الحرارة عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة (50).

إعادة تركيب لامدا الأحمر ، بركه ، و CoS-MAGE.

تم تنفيذ إعادة تركيب Lambda Red و MAGE و CoS-MAGE كما هو موضح سابقًا (33 ، 51). في عمليات إعادة التركيب المفردة ، تم استخدام MAGE oligo عند 1 ميكرومتر ، وكان قلة الانتقاء التجميلي 0.2 ميكرومتر ، وكان إجمالي تجمع oligo 5 ميكرومتر في عمليات إعادة التركيب المتعددة (7-14 oligos). عندما تم إعادة تجميع منتجات PCR مزدوجة الشريطة (على سبيل المثال ، إدخال tolC) ، تم استخدام 100 نانوغرام من منتج PCR مزدوج الشريطة. لأننا استخدمنا CoS-MAGE مع tolC اختيار لاستبدال أكواد AGR المستهدفة ، تم إقران كل إعادة تركيب مع عنصر تحكم تم إعادة تجميعه بالماء فقط للمراقبة tolC أداء الاختيار. تم إدراج بروتوكول CoS-MAGE القياسي لكل مجموعة oligo tolC، تعطيل tolC، اعادة تفعيل tolC، وحذف tolC. تم إجراء فحص mascPCR في tolC خطوات الإدراج والتعطيل والحذف. تمت متابعة جميع عمليات إعادة تركيب Lambda Red باسترداد في 3 مل LB L متبوعًا باختيار SDS (tolC إدراج، tolC التنشيط) أو اختيار العداد ColE1 (tolC تعطيل، tolC حذف) تم تنفيذه كما هو موضح سابقًا (33).

إستراتيجية استبدال AGR العامة.

تم العثور على أكواد AGR في الجينات الأساسية من خلال الإحالة المرجعية إلى شرح الجين الأساسي وفقًا لمصدرين تكميليين (31 ، 52) للعثور على المجموعة المشتركة (107 مناطق تشفير) ، والتي تحتوي على 123 كودون AGR فريدًا (82 AGA ، 41 AGG). استخدمنا optMAGE (35 ، 51) لتصميم oligos 90-mer (استهداف الخيط المتأخر لشوكة النسخ المتماثل) الذي يحول كل AGR إلى CGU. لقد قللنا العدد الإجمالي لأوليجوس استبدال AGR إلى 119 من خلال تصميم oligos لتشفير تعديلات متعددة حيثما أمكن ، مع الحفاظ على 20 نقطة أساس على الأقل من التماثل على طرفي 5 ′ و 3 من oligo. ثم تم تجميع القلة على أساس موضع الكروموسومات في 12 مجموعة MAGE oligo ذات تعقيد متفاوت (الحد الأدنى: 7 ، الحد الأقصى: 14) بحيث تكون علامة واحدة (tolC) بحد أقصى 564622 نقطة أساس في المنبع بالنسبة لاتجاه النسخ المتماثل لجميع الأهداف ضمن مجموعة معينة. ثم حددنا tolC مواقع الإدراج لكل من المجمعات الـ 12 في مناطق جينية أو جينات غير أساسية تفي بمعايير المسافة لمجمع معين. انظر الجدول 1 لوصف كل من 12 تجمع قليل.

استراتيجية استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

تم تعريف AGR المتمردة على أنها واحدة لم يتم تحويلها إلى CGU في واحدة من 96 نسخة على الأقل تم اختيارها بعد الخطوة الثالثة من عملية التحويل. ثم تم فرز كودون AGR المتمردة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها (العلامات النجمية في الشكل 3أ) في السلالة الأبوية (EcM2.1). أولاً ، تم فحص سياق تسلسل الكودون بحثًا عن أخطاء التصميم أو المشكلات المحتملة ، مثل التعليقات الخاطئة أو RBS المعطل للجين المتداخل. في معظم الحالات ، يمكن تصميم واختبار oligos المصححة بسهولة. إذا لم يكن من الممكن إعادة تصميم واضحة كهذه ، فقد حاولنا استبدال AGR بطفرات CGN. إذا فشلت محاولة استبدال AGR بـ CGN في إعطاء المؤتلات ، فقد اختبرنا الطفرات التعويضية المترادفة في نافذة 3-aa حول AGR المتمردة. إذا لزم الأمر ، قمنا أخيرًا بتخفيف التشدد المرادف عن طريق إعادة الاتحاد مع oligos لتشفير طفرات AGR-to-NNN.

بعد كل خطوة في سير عمل استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، قمنا بفحص 96 نسخة من عمليتي إعادة تركيب متتاليتين من CoS-MAGE باستخدام PCR الخاص بالأليل مع مواد أولية تتهجين مع النمط الجيني من النوع البري. التسلسلات التي فشلت في إنتاج amplicon من النوع البري كانت متسلسلة Sanger لتأكيد التحويل. قمنا أيضًا بقياس وقت المضاعفة لجميع الحيوانات المستنسخة في LB L لإقران بيانات التسلسل ببيانات اللياقة البدنية واخترنا الاستنساخ المعاد تجميعه بأقصر وقت مضاعفة. تم تحديد الوقت المضاعف من خلال الحصول على منحنى نمو على قارئ BioTek Eon أو H1plate وتم تحليله باستخدام برنامج إعادة ترتيب الجينوم مفتوح المصدر المستند إلى الويب والمتوفر على GitHub على https://github.com/churchlab/millstone. ثم تم تنفيذ هذا النمط الوراثي في ​​السلالة الكاملة في نهاية بناء السلالة باستخدام MAGE وتم تأكيده بواسطة فحص mascPCR.

أكواد AGR في الجينات غير الأساسية ذات التأثير على الجينات الأساسية.

في ه. القولونية MG1655 ، ثلاثة أكواد AGR فقط في الجينات غير الأساسية تتداخل مع أشكال mRNA و RBS الأولية للجينات الأساسية ، ومن المتوقع أن يطيع كودون CGN مرادف واحد على الأقل SRZ لجميع الحالات الثلاث. كما هو الحال في خط أنابيب استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، حاولنا استبدال أكواد AGR بطفرات CGT باستخدام MAGE. بعد أربع دورات من MAGE ، تم طلاء الخلايا وفحص 96 نسخة. كان استبدال الكودون المرادف ممكنًا للجينات rffT و المراو، ولكن ليس للجينات yidD. ثم قمنا بتخفيف التشدد المرادف عن طريق إعادة الاتحاد مع طفرات AGR-to-NNN للجينات التي ترميز oligos yidD ووجدت حلولًا بديلة متعددة بما في ذلك CGA و UGA و GUG و GCG و TAA. الأهم من ذلك ، كانت الحلول البديلة لـ CGA أقل إزعاجًا من CGU لقوة RBS وطي mRNA (Dataset S7) ، مما يؤكد قواعدنا كمبادئ توجيهية مفيدة.

طي mRNA وحسابات قوة RBS.

تم استخدام خط أنابيب Python المخصص (متاح على https://github.com/churchlab/agr_recoding) لحساب قيمة طي mRNA وقوة RBS لكل تسلسل. استند طي mRNA على حاسبة UNAFold (40) ، واستندت قوة RBS على حاسبة Salis (53). معلمات طي mRNA هي درجة الحرارة (37 درجة مئوية) والنافذة المستخدمة ، والتي كانت في المتوسط ​​بين 30 إلى +100 nt و 15 إلى +100 nt حول موقع بدء الجين واستندت إلى المرجع. 12. المعلمة الوحيدة لقوة RBS هي المسافة بين RBS والمحفز ، وبلغ متوسطنا بين 9 و 10 nt بعد الكودون المثير للاهتمام ، بناءً على Li et al. (20). تم إجراء تصور البيانات من خلال كود ماتلاب مخصص.

ل في السيليكو التنبؤات على الجينوم بأكمله ، تم تحليل جميع الـ 3222 AGR في الجينات nonphage باستخدام خط الأنابيب المخصص هذا. يتم تقديم البيانات في Dataset S7. لم يتم تحليل جينات Phage لتقليل تعقيد الجينوم ، مستوحاة من جهود الجينوم الأخرى المخفضة (54).

تسلسل الجينوم الكامل للسلالات التي تفتقر إلى أكواد AGR في جيناتها الأساسية.

تم الحصول على الحمض النووي الجيني المنفصمة عن طريق قص 130 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المنقى في الموجات فوق الصوتية المركزة Covaris E210. تم إجراء إعداد مكتبة الجينوم الكامل كما هو موضح سابقًا (55). باختصار ، تم قص 130 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المنقى بين عشية وضحاها في الموجات فوق الصوتية Covaris E210 مع البروتوكول التالي: دورة العمل 10٪ ، الكثافة 5 ، 200 دورة لكل انفجار ، الوقت 780 ثانية لكل عينة. تم فحص العينات للقص على هلام agarose ، وإذا كان التوزيع مقبولاً (توزيع الذروة ∼400 nt) ، تم اختيار العينات بالحجم بواسطة تنقية SPRI / reverse-SPRI كما هو موضح في المرجع. 55. ثم تم تفتيح الأجزاء ، وتم ربط محولات p5 / p7 ، تليها عملية إصلاح الحشو والفجوة (New England Biolabs). تم قياس كمية كل عينة qPCR باستخدام SYBR green و Kapa Hifi. تم استخدام هذه النتائج لتحديد عدد الدورات التي يجب استخدامها لتضخيم المكتبة الناتجة عن الترميز باستخدام بادئات P5-sol و P7-sol. تم قياس المكتبات الفردية الناتجة بواسطة NanoDrop (Thermo Scientific) وتم تجميعها. تم قياس المكتبة الناتجة بواسطة qPCR و Agilent TapeStation وتم تشغيلها على MiSeq 2 × 150. تم تحليل البيانات لتأكيد تحويلات AGR ولتحديد الطفرات غير المستهدفة باستخدام Millstone ، أداة إعادة ترتيب الجينوم مفتوحة المصدر على شبكة الإنترنت.

تسلسل NNN و CRISPR.

تم استخدام CRISPR / Cas9 لاستنفاد النمط الوراثي الأبوي من النوع البري عن طريق القطع الانتقائي للكروموسومات في مواقع مستهدفة غير معدلة بجوار تغييرات أكواد AGR المرغوبة. تم تحديد مواقع المرشحين باستخدام مكتشف الموقع المستهدف المدمج في Geneious بالقرب من كودون AGR المستهدف. تم اختيار المواقع إذا كانت أقل من 50 نقطة أساس في بداية كودون AGR ويمكن أن تتعطل بتغييرات مترادفة. إذا استوفت عدة مواقع هذه المعايير ، فقد تم اختيار الموقع الذي يحتوي على أدنى مستوى من تشابه التسلسل مع أجزاء أخرى من الجينوم. تم تصميم Oligos بطول ∼130 نقطة أساس لجميع الجينات الـ 14 التي تحتوي على كودون AGR في أول 30 nt بعد موقع بدء الترجمة. أدمجت تلك oligos كلاً من كودون NNN العشوائي في موضع AGR والعديد من التغييرات المترادفة (حتى ستة) في موقع هدف CRISPR على الأقل 50 نانومترًا في اتجاه المصب من كودون AGR. يعدل هذا التغيير موضع AGR ويعطل موقع هدف CRISPR في نفس الوقت ، مما يضمن التوزيع العشوائي للموقع بعد حذف النمط الوراثي الأبوي.

على وجه التحديد ، قمنا ببناء بلازميد يحتوي على جين بروتين SpCas9 [تفاصيل البلازميد: DS-SPcas (Addgene plasmid 48645): أصل cloDF13 ، specR ، محفز proC ، SPcas9 ، tracrRNA غير مستخدم (مع محفز أصلي ومنهي) ، مروج J23100 ، تكرار واحد ( تمت إضافته لتسهيل الاستنساخ في فاصل على نفس البلازميد)]. قمنا أيضًا ببناء 14 بلازميدًا يحتوي على دليل الحمض النووي الريبي الموجه نحو التسلسلات غير المعدلة (تفاصيل البلازميد: PM-! T4Y: p15a origin، chlor R، J23100 المروج ، المباعد التي تستهدف T4 ، تكرار واحد).

لكل من 24 جينًا ، تم إجراء خمس دورات من MAGE مع الطفرات النوعية للطفرات بتركيز 1 ميكرومتر. تم تزويد البلازميدات ذات المباعدة المتكررة من كريسبر بأدلة مصممة لاستهداف المواقع المختارة بالكهرباء في كل تجمع متنوع بعد آخر دورة إعادة تجميع. بعد ساعة واحدة من الاسترداد ، تم اختيار كل من SpCas9 والبلازميدات ذات الفاصل المتكرر وتمريرها في ثلاث سلالات متوازية لكل من 24 كودون AGR لمدة 144 ساعة. بعد ساعتين من الاختيار ، وفي كل فترة 24 ساعة ، تم أخذ العينات ، وتم تخفيف الخلايا بنسبة 1/100 في وسط انتقائي.

تم تضخيم كل مجموعة عشوائية باستخدام بادئات PCR مما يسمح بتضخيم محدد للسلالات التي تتضمن تعديلات موقع كريسبر. تم بعد ذلك تجميع المكتبات الثلاثية الناتجة لكل كودون AGR ورمزها الشريطي باستخدام بادئات P5-sol و P7-sol وتشغيلها على MiSeq 1 × 50. تم تحليل البيانات باستخدام كود Matlab المخصص المتاح على https://github.com/churchlab/ agr_recoding.

لكل جين وكل نقطة بيانات ، تمت محاذاة القراءات مع الجينوم المرجعي ، وتم حساب ترددات كل كودون. في الشكل 5 ، تم حساب انحراف بنية الرنا المرسال (الخط الأحمر) وانحراف قوة RBS (الخط الأزرق) في الوحدات التعسفية كمنتج للترددات والانحراف المقابل لكل كودون.


الملخص والتوجيهات المستقبلية

أحد الدروس المستفادة من دراسات الضربة القاضية الجهازية هو أن طفرات فقدان الوظيفة وحدها لا تكفي لاستنتاج وظائف الجينات. إذا كانت هناك حاجة إلى مناهج وراثية إضافية ، فأين نتجه إذن؟ من الصعب المجادلة بالنجاح ، ومن المؤكد أن دراسات الإفراط في التعبير لها تاريخ غني في إنشاء روابط وظيفية لأي عملية خلوية بشكل أساسي في العديد من الأنواع. كما تم تلخيصه هنا ، توفر دراسات الإفراط في التعبير مزايا عديدة: (1) إنها أداة متعددة الاستخدامات يمكن تطبيقها بعدة طرق في الخلفيات البرية والطفرة (2) يمكنها تحديد الخطوات التنظيمية للحد من المعدل (3) لها تأثيرات مهيمنة ، لذلك يمكن إجراؤه بسهولة في الكائنات ثنائية الصبغيات (4) فهو يوفر روابط وظيفية حتى للجينات الزائدة عن الحاجة و (5) يحدد التفاعلات التكميلية من شاشات فقدان الوظيفة.

من ناحية أخرى ، أعاق حاجزان على الأقل الاستخدام الأوسع للإفراط في التعبير. يمكن إجراء التعبير المفرط المستهدف لجين فردي في أي كائن حي بشكل أساسي ، لكن القيود التقنية ونقص الموارد المناسبة حالت دون شاشات الإفراط في التعبير الروتيني على مستوى الجينوم. ستظل القيود البيولوجية ، مثل عدم القدرة على الحفاظ على الدنا المُدخَل على هيئة بلازميدات ، في بعض الأنواع ، لكن نقص الموارد ليس تحديًا لا يمكن التغلب عليه. الحاجز الذي يصعب تقييمه هو الرأي المضلل القائل بأنه من الصعب استخلاص رؤى بيولوجية ذات مغزى عندما يتم التعبير عن الجينات على مستويات غير فسيولوجية. لا توجد طريقة تجريبية بدون تحذيراتها ، ولكن المخاوف من دراسة النمط الظاهري للتعبير المفرط لا تختلف عن تلك المرتبطة بأي خلايا خلفية متحولة أخرى ، بغض النظر عما إذا كان المسار قد تعطل بالضربة القاضية ، عن طريق طفرة مهيمنة في اكتساب الوظيفة ، أو عن طريق الإفراط في التعبير. على الرغم من أن التأثيرات الجديدة المربكة التي يحتمل أن تظل احتمالًا ، إلا أن التجربة والنتائج من أول شاشات منهجية واسعة النطاق (Sopko وآخرون. 2006) تشير إلى أنها نادرة ومتوازنة بشكل كبير من خلال الفوائد الوفيرة المقدمة. والأهم من ذلك ، أن الأمثلة المقدمة هنا هي مجرد قمة جبل الجليد ، مما يدل على أنه عند استخدامها بشكل مناسب مع معايير فحص ثانوية معقولة ، يمكن أن يكون الإفراط في التعبير فعالًا وغنيًا بالمعلومات ومتعدد الاستخدامات مثل أي تقنية فحص أخرى.

بالتوازي مع الاتجاهات التي تحدث في مجالات أخرى من علم الوراثة ، دخلت دراسات الإفراط في التعبير مرحلة جديدة. على الرغم من أن الإفراط في التعبير الموجه عن الجينات المفردة يوفر معلومات قيمة ، وستظل الشاشات العشوائية أداة قوية ذات مزايا متميزة ، فمن المرجح أن تهيمن الأساليب المنهجية للاستعلام عن الجينوم على العقد القادم. تم إجراء شاشات منهجية تجريبية في أنظمة الخميرة والذباب والنباتات والأنسجة البشرية باستخدام موارد تعبير مفرطة كبيرة ولكنها غير مكتملة. سيكون التحدي في المستقبل هو إكمال مجموعات الموارد وتطوير تقنيات الفرز عالية الإنتاجية لتسهيل استخدامها. على أساس دراسات فحص التعبير المفرط المنهجية الأولية في الخميرة ، يمكننا أن نتوقع أن تساهم شبكات تفاعل الإفراط في التعبير بروابط وراثية جديدة حيث يتم دمج النتائج مع مجموعات البيانات الكبيرة الأخرى مثل التفاعلات الفيزيائية ونتائج جمع الحذف.


مراجع

هارلان ، ج. المحاصيل والانسان الطبعة الثانية (الجمعية الأمريكية لعلم الزراعة ، 1992).

سيموندز ، ج. مسائل المجتمع: تاريخ من تثبيت النيتروجين البيولوجي وبحوث التعقيد ، 1965 إلى 1995. أطروحة دكتوراه ، معهد Rensselaer Polytechnic (2007).

Erisman ، J. ، Bleeker ، A. ، Galloway ، J. & amp Sutton ، M. انخفاض النيتروجين في البيئة والبيئة. بيئة. بولوت. 150, 140–149 (2007).

جيديس ، ب. إيه وآخرون. استخدام البكتيريا المستعمرة للنبات كهيكل لنقل النيتروجين2- تثبيت الحبوب. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 32, 216–222 (2015).

Zaim، S.، Bekkar، A. A. & amp Belabid، L. in بيولوجيا الجذور والتكنولوجيا الحيوية (محرران هانسن ، أ.ب وآخرون) 25-37 (سبرينغر ، 2017).

Nadarajah ، K. K. in بيولوجيا الجذور والتكنولوجيا الحيوية (محرران هانسن ، أ.ب وآخرون) 83-103 (سبرينغر ، 2017).

Gutierrez-Zamora، M. & amp Martınez-Romero، E. ريزوبيوم إتلي والذرة (زيا ميس L.). J. Biotechnol. 91, 117–126 (2001).

McInroy ، J.A & amp Kloepper ، J.W. مسح للخلايا الداخلية البكتيرية الأصلية من القطن والذرة الحلوة. تربة النبات 173, 337–342 (1995).

راماشاندران ، ف.ك ، إيست ، أ.ك ، كاروناكاران ، آر ، داوني ، ج.أ. & أمبير بول ، P. S. Adaptation of ريزوبيوم ليجومينوساروم إلى البازلاء والبرسيم وبنجر السكر التي تم فحصها بواسطة النسخ المقارنة. جينوم بيول. 12، R106 (2011).

فرانس ، جيه وآخرون. في تثبيت النيتروجين (إد. Gresshoff ، P.M) 33-44 (سبرينغر ، 1990).

Delmotte، N. et al. توفر مجموعة البيانات المرجعية الخاصة بالبروتينات والنسخ المتكاملة رؤى جديدة حول Bradyrhizobium japonicum التمثيل الغذائي البكتيري في عقيدات جذر فول الصويا. البروتيوميات 10, 1391–1400 (2010).

جيمس ، إي. تثبيت النيتروجين في التعايش الداخلي والترابطي. الدقة المحاصيل الحقلية. 65, 197–209 (2000).

Ars’ene، F.، Katupitiya، S.، Kennedy، I.R & amp Elmerich، C. IacZ الاندماج لدراسة التعبير عن نيف جينات Azospirillum brasilense. مول. تفاعل ميكروب النبات. 7, 748–757 (1994).

بودي ، آر إم وآخرون. في إدارة تثبيت النيتروجين البيولوجي لتطوير أنظمة زراعية أكثر إنتاجية واستدامة (محرران Ladha، J.K & amp Peoples، M.B) 195–209 (Springer، 1995).

بريمر ، إي ، جانزين ، هـ. & أمبير جيلبرتسون ، سي. دليل ضد الترابطي ن2 التثبيت كمصدر مهم للنيتروجين في قطع القمح طويلة الأجل. تربة النبات 175, 13–19 (1995).

الطباشير ، P. مساهمة تثبيت النيتروجين الترابطي والتكافلي في تغذية النيتروجين من غير البقوليات. تربة النبات 132, 29–39 (1991).

Hurek، T.، Reinhold-Hurek، B.، Van Montagu، M. & amp Kellenberger، E. Azoarcus ص. سلالة BH72 في الأعشاب. J. باكتيريول. 176, 1913–1923 (1994).

أميس ، إ. ، أوليفاريس ، إف ، بالداني ، ج. & amp Döbereiner ، J. Herbaspirillum، ديازوتروف داخلي يستعمر أنسجة الأوعية الدموية 3 الذرة الرفيعة ثنائية اللون إل مونش. J. إكسب. بوت. 48, 785–798 (1997).

Kapulnik، Y.، Feldman، M.، Okon، Y. & amp Henis، Y. مساهمة النيتروجين المثبتة بواسطة أزوسبيريلوم إلى التغذية N للقمح الربيعي في إسرائيل. الكيمياء الحيوية لبيولوجيا التربة. 17, 509–515 (1985).

Katupitiya، S. et al. متحولة Azospirillum brasilense ضعف Sp7 في التلبد بنمط استعمار معدل وتثبيت نيتروجين فائق بالاقتران مع القمح. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 61, 1987–1995 (1995).

مالك ، ك وآخرون. رابطة البكتيريا الجذرية المثبتة للنيتروجين والمعززة لنمو النبات (PGPR) مع عشب الكالار والأرز. تربة النبات 194, 37–44 (1997).

رينهولد هوريك ، ب. وأمبير هوريك ، ت.تفاعلات نباتات الجرامين مع Azoarcus النيابة. وغيرها من الديازوتروف: التحديد والتوطين ووجهات النظر لدراسة وظيفتها. كريت. القس علوم النبات. 17, 29–54 (1998).

Stoltzfus، J.، So، R.، Malarvithi، P.، Ladha، J. & amp De Bruijn، F. عزل البكتيريا الداخلية من الأرز وتقييم قدرتها على إمداد الأرز بالنيتروجين الثابت بيولوجيًا. تربة النبات 194, 25–36 (1997).

Triplett ، E.W.Diazotrophic endophytes: التقدم والآفاق لتثبيت النيتروجين في monocots. تربة النبات 186, 29–38 (1996).

Broek ، A. V. ، Michiels ، J. ، Van Gool ، A. & amp Vanderleyden ، J. Azospirillum brasilense على سطح جذر القمح والتعبير عن البكتيريا nifH الجين أثناء الارتباط. مول. تفاعل ميكروب النبات. 6, 592–600 (1993).

ياني ، واي جي وآخرون. في فرص التثبيت البيولوجي للنيتروجين في الأرز والبقوليات الأخرى (محرران Ladha، J.K et al.) 99-114 (Springer، 1997).

أوكون ، واي. أزوسبيريلوم كقاح محتمل للزراعة. اتجاهات التكنولوجيا الحيوية. 3, 223–228 (1985).

Cocking، E.C. الاستعمار الداخلي لجذور النباتات بواسطة البكتيريا المثبتة للنيتروجين. تربة النبات 252, 169–175 (2003).

Woodard ، H. & amp Bly ، A. نمو الذرة واستجابات الغلة للبذور الملقحة N2- تثبيت البكتيريا تحت ظروف إنتاج الأراضي الجافة. J. بلانت نوتر. 23, 55–65 (2000).

Igiehon، N. O. & amp Babalola، O. O. Rhizosphere microbiome modulators: مساهمات بكتيريا تثبيت النيتروجين نحو الزراعة المستدامة. كثافة العمليات J. البيئة. الدقة. الصحة العامة 15, 574 (2018).

Biswas ، J. ، Ladha ، J. & amp Dazzo ، F. تلقيح Rhizobia يحسن امتصاص المغذيات ونمو أرز الأراضي المنخفضة. علوم التربة. شركة أكون. ج. 64, 1644–1650 (2000).

Biswas، J.C، Ladha، J.K، Dazzo، F.B، Yanni، Y.G & amp Rolfe، B. G. أغرون. ج. 92, 880–886 (2000).

كامينغز ، إس بي وآخرون. الإيماء سيسبانيا من الأنواع ريزوبيوم (أجروباكتريوم) سلالة IRBG74 وغيرها من الجذور. بيئة. ميكروبيول. 11, 2510–2525 (2009).

Masson-Boivin، C.، Giraud، E.، Perret، X. & amp Batut، J. إنشاء تعايش مثبت للنيتروجين مع البقوليات: كم عدد وصفات ريزوبيوم؟ اتجاهات ميكروبيول. 17, 458–466 (2009).

هوفر ، T. R. ، Imperial ، J. ، Ludden ، P. W. & amp Shah ، V. K. Homocitrate هو أحد مكونات عامل الحديد الموليبدينوم المساعد للنيتروجين. الكيمياء الحيوية 28, 2768–2771 (1989).

ماندون ، ك وآخرون. دور الإصلاح منطقة Azorhizobium caulinodans في تثبيت النيتروجين الحر والتكافل. FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 114, 185–189 (1993).

تسوكادا ، إس وآخرون. التنميط النسبي المقارن على مستوى الجينوم Azorhizobium caulinodans نمت ORS571 في ظل ظروف العيش الحر والتكافل. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 75, 5037–5046 (2009).

Gopalaswamy، G.، Kannaiyan، S.، O’Callaghan، K. J.، Davey، M.R & amp Cocking، E.C The xylem of rice (أرز أسيوي) مستعمرة من قبل Azorhizobium caulinodans. بروك. بيول. علوم. 267, 103–107 (2000).

ويبستر ، جي وآخرون. يحفز نارينجينين الفلافونويد الاستعمار بين الخلايا لجذور القمح بواسطة Azorhizobium caulinodans. بيئة الخلية النباتية. 21, 373–383 (1998).

ويبستر ، جي وآخرون. في فرص التثبيت البيولوجي للنيتروجين في الأرز والبقوليات الأخرى (محرران Ladha، J.K et al.) 115-122 (Springer، 1997).

تريبليت ، E.W. ، Kaeppler ، S.M & amp Chelius ، M. K. الكلبسيلة الرئوية لقاحات لتعزيز نمو النبات. براءة الاختراع الأمريكية 7،393،678 (2008).

فوجي ، ت. وآخرون. تأثير التلقيح مع كليبسيلا أوكسيتوكا و الأمعائية المذرقية على تثبيت ثنائي النيتروجين بواسطة جمعيات بكتيريا الأرز. تربة النبات 103, 221–226 (1987).

الخواس ، H. & amp Adachi ، K. تحديد وتقدير الأكسينات في وسط الثقافة أزوسبيريلوم و كليبسيلا وتأثيرها على جذور الأرز. بيول. سماد. التربة 28, 377–381 (1999).

Palus، J. A.، Borneman، J.، Ludden، P. W. & amp Triplett، E.W. زيا ميس الأرض زيا الفخريون Iltis و Doebley. تربة النبات 186, 135–142 (1996).

ريديرس ، هـ وآخرون. تطوير وتطبيق أ dapb- نظام تكنولوجيا التعبير في الجسم الحي لدراسة استعمار الأرز بواسطة بكتيريا تثبيت النيتروجين الداخلية Pseudomonas stutzeri أ 15. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 69, 6864–6874 (2003).

Haahtela ، K. & amp Korhonen ، T. K. التصاق المختبر لـ N2- تثبيت البكتيريا المعوية في جذور الأعشاب والحبوب. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 49, 1186–1190 (1985).

Desnoues، N. et al. وراثة تثبيت النيتروجين وتنظيمه في أ Pseudomonas stutzeri سلالة مرتبطة بالأرز. علم الاحياء المجهري 149, 2251–2262 (2003).

بولسن ، آي تي ​​وآخرون. تسلسل الجينوم الكامل للمقايضة النباتية تألق الزائفة Pf-5. نات. التكنولوجيا الحيوية. 23, 873 (2005).

والش ، يو. إف ، موريسي ، جي بي & أمبير أوجارا ، إف. الزائفة للمكافحة الحيوية لمسببات الأمراض النباتية: من الجينوميات الوظيفية إلى الاستغلال التجاري. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 12, 289–295 (2001).

Dos Santos، P. C.، Fang، Z.، Mason، S.W، Setubal، J.C & amp Dixon، R. توزيع تثبيت النيتروجين والتسلسلات الشبيهة بالنيتروجين بين الجينومات الميكروبية. علم الجينوم BMC 13, 162 (2012).

بويد ، إي إس ، كوستاس ، إيه إم جي ، هاميلتون ، تي إل ، موس ، إف آند بيترز ، جي دبليو تطور نيتروجيناز الموليبدينوم أثناء الانتقال من الأيض اللاهوائي إلى الأيض الهوائي. J. باكتيريول. 197, 1690–1699 (2015).

Raymond، J.، Siefert، J.L، Staples، C.R & amp Blankenship، R.E. التاريخ الطبيعي لتثبيت النيتروجين. جزيء. بيول. Evol. 21, 541–554 (2004).

Rubio، L.M & amp Ludden، P. W. Biosynthesis of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. Annu. القس ميكروبيول. 62, 93–111 (2008).

Iki، T.، Aono، T. & amp Oyaizu، H. دليل على التمايز الوظيفي للنسخ المكررة nifH الجينات في Azorhizobium caulinodans. FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 274, 173–179 (2007).

Ratet، P.، Pawlowski، K.، Schell، J. & amp Bruijn، F. The Azorhizobium caulinodans الجين التنظيمي لتثبيت النيتروجين ، نيفا، يتم التحكم فيه عن طريق حالة النيتروجين والأكسجين الخلوية. مول. ميكروبيول. 3, 825–838 (1989).

بودل ، إس وآخرون. نقل الإلكترون إلى النيتروجيناز في خلفيات جينومية وأيضية مختلفة. J. باكتيريول. 200, 00757–00717 (2018).

Boyd، E. & amp Peters، J.W. رؤى جديدة في التاريخ التطوري لتثبيت النيتروجين البيولوجي. أمام. ميكروبيول. 4, 201 (2013).

شاه ، ف. ك. ، ستايسي ، ج. أند بريل ، دبليو جيه نقل الإلكترون إلى نيتروجيناز. تنقية وتوصيف البيروفات: فلافودوكسين أوكسيريدوكتاز. ال nifJ منتج الجينات. J. بيول. تشيم. 258, 12064–12068 (1983).

شميهل ، إم وآخرون. تحديد فئة جديدة من جينات تثبيت النيتروجين في كابسالاتوس رودوباكتر: مركب غشائي مفترض يشارك في نقل الإلكترون إلى النيتروجيناز. مول. الجنرال جينيه. 241, 602–615 (1993).

Edgren، T. & amp Nordlund، S. The إصلاح ABCX الجينات في رودوسبيريلوم روبوم ترميز مركب غشاء مفترض يشارك في نقل الإلكترون إلى نيتروجيناز. J. باكتيريول. 186, 2052–2060 (2004).

Pascuan ، C. ، Fox ، A. R. ، Soto ، G. & amp Ayub ، N. D. استكشاف آليات الأجداد لتنظيم النيتروجين المكتسبة أفقيًا. جيه مول. Evol. 81, 84–89 (2015).

يان ، واي وآخرون. جزيرة تثبيت النيتروجين وسمات كفاءة الجذور في الجينوم المرتبط بالجذر Pseudomonas stutzeri A1501. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 105, 7564–7569 (2008).

Kechris، K. J.، Lin، J.C، Bickel، P. J. & amp Glazer، A.N. الاستكشاف الكمي لحدوث نقل الجينات الجانبي باستخدام جينات تثبيت النيتروجين كدراسة حالة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 103, 9584–9589 (2006).

Thöny ، B. ، Anthamatten ، D. & amp Hennecke ، H. التحكم المزدوج في Bradyrhizobium japonicum عامل تنظيمي لتثبيت النيتروجين التكافلي fixR نيفا: تحليل عناصر رابطة الدول المستقلة وعناصر التحويل. J. باكتيريول. 171, 4162–4169 (1989).

Li، X.-X.، Liu، Q.، Liu، X.-M.، Shi، H.-W. & amp Chen، S.-F. استخدام البيولوجيا التركيبية لزيادة نشاط إنزيم النيتروجين. ميكروب. حقيقة الخلية. 15, 43 (2016).

هان ، واي وآخرون. نقل بين الأنواع وتنظيم Pseudomonas stutzeri A1501 جزيرة تثبيت النيتروجين في الإشريكية القولونية. J. ميكروبيول. التكنولوجيا الحيوية. 25, 1339–1348 (2015).

Dixon، R.A & amp Postgate، J.R. النقل الجيني لتثبيت النيتروجين من الكلبسيلة الرئوية إلى الإشريكية القولونية. طبيعة سجية 237, 102 (1972).

كانون ، إف ، ديكسون ، آر ، بوستجيت ، جيه آند أمب بريمروز ، إس. كليبسيلا جينات تثبيت النيتروجين في الإشريكية القولونية. علم الاحياء المجهري 80, 227–239 (1974).

Cannon، F.، Dixon، R.، Postgate، J. & amp Primrose، S. الإشريكية القولونية - كليبسيلا الرئوية الهجينة. علم الاحياء المجهري 80, 241–251 (1974).

وانج ، ل. وآخرون. الحد الأدنى من مجموعة جينات تثبيت النيتروجين من Paenibacillus ص. يتيح WLY78 التعبير عن النيتروجيناز النشط في الإشريكية القولونية. بلوس جينيت. 9، e1003865 (2013).

Temme، K.، Zhao، D. & amp Voigt، C. A. إعادة تشكيل الكتلة الجينية لتثبيت النيتروجين من كليبسيلا أوكسيتوكا. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 109, 7085–7090 (2012).

Smanski ، M. J. et al. التحسين الوظيفي لمجموعات الجينات من خلال التصميم التجميعي والتجميع. نات. التكنولوجيا الحيوية. 32, 1241 (2014).

Zhang، L.، Liu، X.، Li، X. & amp Chen، S. Expression of the N.2 عامل الجينات التثبيت Paenibacillus ص. WLY78 تحت سيطرة مروج T7 في الإشريكية القولونية BL21. التكنولوجيا الحيوية. بادئة رسالة. 37, 1999–2004 (2015).

Postgate، J.R & amp Kent، H. M. دليل نوعي للتعبير عن Klebsiella pneumoniae nif في Pseudomonas putida. علم الاحياء المجهري 133, 2563–2566 (1987).

سيتين ، ل. وآخرون. هندسة بروتينات Pseudomonas Pf-5 لتثبيت النيتروجين وتطبيقه لتحسين نمو النبات في ظل ظروف نقص النيتروجين. بلوس واحد 8، e63666 (2013).

Dixon، R. & amp Kahn، D. التنظيم الجيني لتثبيت النيتروجين البيولوجي. نات. القس ميكروبيول. 2, 621–631 (2004).

فيشر ، هـ. التنظيم البيئي لجينات تثبيت النيتروجين التكافلي الجذري. اتجاهات ميكروبيول. 4, 317–320 (1996).

Tsoy ، O. V. ، Ravcheev ، D. A. ، uklina ، J. & amp Gelfand ، M. S. تثبيت النيتروجين والأكسجين الجزيئي: إعادة البناء الجيني المقارن لتنظيم النسخ في Alphaproteobacteria. أمام. ميكروبيول. 7, 1343 (2016).

Hill، S.، Kennedy، C.، Kavanagh، E.، Goldberg، R.B & amp Hanau، R.nifL) تشارك في تنظيم الأكسجين لتخليق النيتروجين في K. peumoniae. طبيعة سجية 290, 424–426 (1981).

ماندون ، ك وآخرون. معدل دوران Poly-β-hydroxybutyrate في Azorhizobium caulinodans مطلوب للنمو ويؤثر نيفا التعبير. J. باكتيريول. 180, 5070–5076 (1998).

Little، R.، Reyes ‐ Ramirez، F.، Zhang، Y.، van Heeswijk، W.C & amp Dixon، R. Azotobacter vinelandii يتأثر نظام NIFL-NIFA التنظيمي بشكل مباشر بالتفاعل مع 2-oxoglutarate والبروتين التنظيمي PII. EMBO J. 19, 6041–6050 (2000).

Poole ، P. ، Ramachandran ، V. & amp Terpolilli ، J. Rhizobia: من النباتات الرخامية إلى المتعايشات الداخلية. نات. القس ميكروبيول. 16, 291–303 (2018).

Kong ، Q. ، Wu ، Q. ، Ma ، Z. & amp Shen ، S. حساسية الأكسجين لـ نيفلا مروج الكلبسيلة الرئوية. J. باكتيريول. 166, 353–356 (1986).

Brooks، S. J.، Collins، J. J. & amp Brill، W. J. قمع تثبيت النيتروجين في الكلبسيلة الرئوية في درجة حرارة عالية. J. باكتيريول. 157, 460–464 (1984).

الشعوب ، M. ، Ladha ، J. & amp Herridge ، D. التثبيت البيولوجي للنيتروجين: مصدر فعال للنيتروجين من أجل الإنتاج الزراعي المستدام؟ تربة النبات 174, 3–28 (1995).

Barakat، M.، Cheviron، B. & amp Angulo-Jaramillo، R. تأثير تقنية واستراتيجيات الري على دورة النيتروجين والميزانية: مراجعة. الزراعية. إدارة المياه. 178, 225–238 (2016).

Burger، M. & amp Jackson، L.E التثبيت الميكروبي للأمونيوم والنترات فيما يتعلق بمعدلات الأمونيا والنترة في أنظمة الزراعة العضوية والتقليدية. التربة بيول. بيوتشيم. 35, 29–36 (2003).

MacNeil، D. & amp Brill، W. الطفرات في نيف الجينات التي تسبب الكلبسيلة الرئوية يجب إلغاء ضغطه من أجل تخليق النيتروجيناز في وجود الأمونيوم. J. باكتيريول. 144, 744–751 (1980).

Bali، A.، Blanco، G.، Hill، S. & amp Kennedy، C. nifL متحولة Azotobacter vinelandii تحديد النيتروجين. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 58, 1711–1718 (1992).

Brewin، B.، Woodley، P. & amp Drummond، M. أساس إطلاق الأمونيوم في nifL المسوخ Azotobacter vinelandii. J. باكتيريول. 181, 7356–7362 (1999).

Arsène، F.، Kaminski، P. A. & amp Elmerich، C. Control of Azospirillum brasilense نشاط NifA بواسطة PII: تأثير استبدال مخلفات Tyr لمجال NifA N-terminal على نشاط NifA. FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 179, 339–343 (1999).

سوزا ، إي ، بيدروسا ، إف ، دروموند ، إم ، ريجو ، إل آند ييتس ، إم. Herbaspirillum seropedicae نشاط NifA بواسطة أيونات الأمونيوم والأكسجين. J. باكتيريول. 181, 681–684 (1999).

باشن ، أ ، دريبير ، ت. ، ماسبول ، ب. & amp كليب ، دبليو. رودوباكتر كبسولاتوس نيفا المسوخ وسيط نيف التعبير الجيني في وجود الأمونيوم. FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 200, 207–213 (2001).

Rey ، F. E. ، Heiniger ، E.K & amp Harwood ، C. S. إعادة توجيه عملية التمثيل الغذائي لإنتاج الهيدروجين البيولوجي. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 73, 1665–1671 (2007).

Smanski ، M. J. et al. البيولوجيا التركيبية للوصول إلى التنوع الكيميائي للطبيعة وتوسيعه. نات. القس ميكروبيول. 14, 135–149 (2016).

سكوبام ، أ.جيه وآخرون. التلقيح مع Sinorhizobium meliloti يزيد RMBPC-2 من محصول البرسيم مقارنة بالتلقيح بسلالة من النوع البري غير المهندسة. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 62, 4260–4262 (1996).

فوكس ، إيه آر وآخرون. تستفيد محاصيل الحبوب الرئيسية من التثبيت البيولوجي للنيتروجين عند تلقيحها ببكتيريا تثبيت النيتروجين بروتينات Pseudomonas Pf-5 X940. بيئة. ميكروبيول. 18, 3522–3534 (2016).

Suthar، H.، Hingurao، K.، Vaghashiya، J. & amp Parmar، J. Fermentation: عملية لإنتاج الأسمدة الحيوية. Microorg. الثورة الخضراء. 6, 229–252 (2017).

Lucy، M.، Reed، E. & amp Glick، B. R. تطبيقات البكتيريا الحية الجذرية المعززة لنمو النبات. أنتوني فان ليفينهوك 86, 1–25 (2004).

محمود ، أ ، تورجي ، أو سي ، فاروق ، م. وأمبير حياة ، ر. التقسيم الحيوي للبذور مع نمو النبات الذي يعزز البكتيريا الجذرية: مراجعة. FEMS ميكروبيول. ايكول. 92، fiw112 (2016).

Velusamy، P.، Immanuel، J. E.، Gnanamanickam، S. S. & amp Thomashow، L. المكافحة البيولوجية لفحة بكتيرية الأرز بواسطة البكتيريا المرتبطة بالنبات المنتجة 2، 4-diacetylphloroglucinol. علبة. J. ميكروبيول. 52, 56–65 (2006).

ميشرا ، ج. تطوير وتقييم الصيغة الحيوية القائمة على Pseudomonas لمكافحة الأمراض وتعزيز النمو في Zea Mays L. أطروحة دكتوراه ، جامعة باباصحب بهيمراو أمبيدكار (2016).

ويلر ، دي إم وآخرون. دور 2،4-ثنائي أسيتيل فلوروجلوسينول الفلوريسنت المنتجة الزائفة النيابة. في الدفاع عن جذور النبات. مصنع بيول. 9, 4–20 (2007).

كايزر ، سي وآخرون. استكشاف نقل التمثيل الضوئي للنباتات الحديثة إلى ميكروبات التربة: المسار الفطري مقابل النضح الجذري المباشر. فيتول جديد. 205, 1537–1551 (2015).

Mus ، F. وآخرون. تثبيت النيتروجين التكافلي والتحديات التي تواجه امتداده إلى غير البقوليات. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 82, 3698–3710 (2016).

بيرين ووكر ، إف إم ، براييتنو ، جيه ، رولف ، بي جي ، وينمان ، جيه جيه آند أمب هوكارت ، سي إتش. عملية العدوى وتفاعل جذور الأرز مع الريزوبيا. J. إكسب. بوت. 58, 3343–3350 (2007).

جوف ، سي وآخرون. مركبات الفلافونويد المحددة تعزز استعمار الجذور بين الخلايا نبات الأرابيدوبسيس thaliana بواسطة Azorhizobium caulinodans ORS571. مول. تفاعل ميكروب النبات. 10, 560–570 (1997).

O’Callaghan، K.J et al. تأثير الجلوكوزينات والفلافونويد على استعمار جذور napus براسيكا بواسطة Azorhizobium caulinodans ORS571. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 66, 2185–2191 (2000).

مونجيارديني ، إي جيه وآخرون. يشارك بروتين الالتصاق الجذري RapA1 في امتزاز الجذور إلى جذور النبات ولكن ليس في العقدة. FEMS ميكروبيول. ايكول. 65, 279–288 (2008).

Matilla، M.A، Espinosa-Urgel، M.، Rodríguez-Herva، J.J، Ramos، J.L & amp Ramos-González، M. I. يكشف التحليل الجينومي عن القوى الدافعة الرئيسية للحياة البكتيرية في منطقة الجذور. جينوم بيول. 8، R179 (2007).

Casas، M. I.، Duarte، S.، Doseff، A. I. & amp Grotewold، E. Flavone-rich maize: فرصة لتحسين القيمة الغذائية لمحصول سلعي مهم. أمام. علوم النبات. 5, 440 (2014).

Ogo، Y.، Ozawa، K.، Ishimaru، T.، Murayama، T. & amp Takaiwa، F. تقوم بذور الأرز المعدلة وراثيًا بتجميع مركبات الفلافونويد المتنوعة بمستويات عالية: منصة جديدة لإنتاج الفلافونويد مع الفوائد الصحية المرتبطة بها. التكنولوجيا الحيوية النباتية. ج. 11, 734–746 (2013).

Bacilio-Jiménez، M. et al. التوصيف الكيميائي لإفرازات الجذور من الأرز (أرز أسيوي) وتأثيراتها على الاستجابة الكيميائية للبكتيريا الداخلية. تربة النبات 249, 271–277 (2003).

بيني وآخرون. أجهزة الاستشعار الحيوية البكتيرية لوكس لرسم الخرائط الزمانية المكانية في الجسم الحي لإفراز الجذر. نبات فيزيول. 174, 1289–1306 (2017).

Ryan، P. R.، Dessaux، Y.، Thomashow، L. S. & amp Weller، D. M. Rhizosphere Engineering and Management for Sustainable Agriculture. تربة النبات 321, 363–383 (2009).

Dessaux، Y.، Grandclément، C. & amp Faure، D. هندسة جذور الغلاف الجوي. اتجاهات نباتية. 21, 266–278 (2016).

جيديس ، ب. إيه وآخرون. إشارات transkingdom الهندسية في النباتات للتحكم في التعبير الجيني في بكتيريا ريزوسفير. نات. بالاتصالات 10, 3430 (2019).

Arnold، W.، Rump، A.، Klipp، W.، Priefer، U. B. & amp Pühler، A. الكلبسيلة الرئوية. جيه مول. بيول. 203, 715–738 (1988).

de Salamone، I. G.، Döbereiner، J.، Urquiaga، S. & amp Boddey، R.M. التثبيت البيولوجي للنيتروجين في أزوسبيريلوم ارتباطات النمط الجيني للذرة والسلالة كما تم تقييمها بواسطة تقنية تخفيف نظير 15 N. بيول. فيرت. التربة 23, 249–256 (1996).

Pedrosa، F. & amp Elmerich، C. in جمعيات البكتريا والبكتيريا الزرقاء النقابية والداخلية (محرران Elmerich، C. & amp Newton، W.E) 41-71 (Springer، 2007).

ويلش ، إي إيه وآخرون. جينوم سيانوثيس 51142 ، وهي بكتيريا زرقاء ثنائية التغذية أحادية الخلية مهمة في دورة النيتروجين البحرية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 105, 15094–15099 (2008).

هاملتون ، ت.ل وآخرون. التنميط النسخي لتثبيت النيتروجين في Azotobacter vinelandii. J. باكتيريول. 193, 4477–4486 (2011).

أودا ، واي وآخرون. التحليل الجيني الوظيفي لثلاثة إنزيمات نيتروجيناز في بكتيريا التمثيل الضوئي Rhodopseudomonas palustris. J. باكتيريول. 187, 7784–7794 (2005).

Haselkorn، R. & amp Kapatral، V. in الجينوم وعلم الجينوم للكائنات المثبتة للنيتروجين (محرران Palacios، R. & amp Newton، W.E) 71-82 (Springer، 2005).

جيونج ، هـ. & amp Jouanneau ، Y. نشاط النيتروجين المعزز في سلالات كبسولات رودوباكتر الذي يفرط في التعبير عن rnf الجينات. J. باكتيريول. 182, 1208–1214 (2000).

Curatti، L.، Brown، C. S.، Ludden، P. W. & amp Rubio، L. M. الجينات المطلوبة للتعبير السريع عن نشاط النيتروجيناز في Azotobacter vinelandii. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 102, 6291–6296 (2005).

كامينسكي ، بي إيه وآخرون. توصيف الإصلاح منطقة Azorhizobium caulinodans ORS571 وتحديد جين تثبيت النيتروجين الجديد. مول. الجنرال جينيه. 214, 496–502 (1988).

وينتجينز ، ر. مشاركة جينات الإصلاح ABCX وسلسلة الجهاز التنفسي في نقل الإلكترون إلى النيتروجيناز في Azotobacter vinelandii. أطروحة دكتوراه ، الجامعة الزراعية (1993).

مكديرموت ، ج. إي وآخرون. نموذج للسلوك النسخي الدوري في البكتيريا الزرقاء سيانوثيس ص. ATCC 51142. مول. بيوسيست. 7, 2407–2418 (2011).

Sevilla، M.، Burris، R.H، Gunapala، N. & amp Kennedy، C. مقارنة الفائدة لنمو نبات قصب السكر و 15 N2 التأسيس بعد تلقيح النباتات المعقمة ديازوتروفيكوس أسيتوباكتر البرية من نوع و نيف سلالات متحولة. مول. تفاعل ميكروب النبات. 14, 358–366 (2001).

Eskin، N.، Vessey، K. & amp Tian، L. تقدم البحث ووجهات نظر بكتيريا تثبيت النيتروجين ، Gluconacetobacter diazotrophicus، في نباتات أحادية. كثافة العمليات J. أغرون. https://doi.org/10.1155/2014/208383 (2014).

Lee، S.، Reth، A.، Meletzus، D.، Sevilla، M. & amp Kennedy، C. توصيف مجموعة رئيسية من nif ، الإصلاح، والجينات المرتبطة بها في نبات قصب السكر ، ديازوتروفيكوس أسيتوباكتر. J. باكتيريول. 182, 7088–7091 (2000).

شانكس ، آر إم وآخرون. خميرة الخميرة- مجموعة أدوات جزيئية لمعالجة الجينات من البكتيريا سالبة الجرام. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 72, 5027–5036 (2006).

هاكوياما ، ت. وآخرون. يتغلب جينوم النبات المضيف على نقص الجين البكتيري لتثبيت النيتروجين التكافلي. طبيعة سجية 462, 514–517 (2009).

Li، GW، Oh، E. & amp Weissman، J. S. يؤدي التسلسل المضاد للتألق-Dalgarno إلى إيقاف الترجمة واختيار الكودون في البكتيريا. طبيعة سجية 484, 538–541 (2012).

لالان ، ج. - ب. وآخرون. التقارب التطوري لقياسات العناصر الكيميائية الخاصة بتعبير الإنزيم الخاص بالمسار. زنزانة 173, 749–761 (2018).

Li، G-W.، Burkhardt، D.، Gross، C. & amp Weissman، J. S. يكشف تحديد معدلات تخليق البروتين المطلقة عن المبادئ الأساسية لتخصيص الموارد الخلوية. زنزانة 157, 624–635 (2014).

Poza-Carrión، C.، Jiménez-Vicente، E.، Navarro-Rodríguez، M.، Echavarri-Erasun، C. & amp Rubio، L.M Kinetics of نيف التعبير الجيني في بكتيريا مثبتة للنيتروجين. J. باكتيريول. 196, 595–603 (2014).

Tezcan ، F. A. ، Kaiser ، J. T. ، Howard ، J.B & amp Rees ، D.C. دليل هيكلي لتفاعلات النوكليوتيدات غير المتكافئة في النيتروجيناز. جيه. تشيم. شركة 137, 146–149 (2014).

Klugkist، J. & amp Haaker، H. تثبيط نشاط النيتروجيناز بواسطة كلوريد الأمونيوم في Azotobacter vinelandii. J. باكتيريول. 157, 148–151 (1984).

سونج ، م وآخرون. التحكم في إفراز البروتين من النوع الثالث باستخدام نظام وراثي ضئيل. نات. بالاتصالات 8, 14737 (2017).

Guo، C.-J. وآخرون. اكتشاف المستقلبات المشتقة من الجراثيم التفاعلية التي تثبط البروتياز المضيف. زنزانة 168, 517–526 (2017).

Ren ، H. ، Hu ، P. & amp Zhao ، H. سير عمل إعادة هيكلة مسار التوصيل والتشغيل لأبحاث المنتجات الطبيعية في الإشريكية القولونية و خميرة الخميرة. التكنولوجيا الحيوية. بيونج. 114, 1847–1854 (2017).

MacLellan، S.R، MacLean، A.M & amp Finan، T.M. تنبؤ المروج في منطقة الريزوبيا. علم الاحياء المجهري 152, 1751–1763 (2006).

Ramírez-Romero، M. A.، Masulis، I.، Cevallos، M. A.، González، V. & amp Davila، G. The ريزوبيوم إتلي يتعرف عامل σ70 (SigA) على مروج إجماع متساهل. الدقة الأحماض النووية. 34, 1470–1480 (2006).

بيكر ، إيه وآخرون. التنظيم في البكتيريا البروتينية المرتبطة بالنبات. RNA بيول. 11, 550–562 (2014).

Robledo، M.، Frage، B.، Wright، P. R. & amp Becker، A. إن الحمض النووي الريبي الصغير الناجم عن الإجهاد يعدل تقدم دورة الخلية ألفا الجذرية. بلوس جينيت. 11، e1005153 (2015).

Giacomini، A.، Ollero، F. J.، Squartini، A. & amp Nuti، M. P. بناء خراطيش جينية متعددة الأغراض تعتمد على محفز اصطناعي جديد للتعبير الجيني عالي المستوى في البكتيريا سالبة الجرام. الجين 144, 17–24 (1994).

Khan، S.R، Gaines، J.، Roop، R.M & amp Farrand، S.K. نواقل التعبير ذات النطاق الواسع مع المروجين المنظمين بشكل صارم واستخدامها لفحص تأثير تعبير TraR و TraM على استشعار نصاب Ti plasmid. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 74, 5053–5062 (2008).

تيت ، أ.جيه وآخرون. نواقل قابلة للتنظيم للتعبير الجيني البيئي في Alphaproteobacteria. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 78, 7137–7140 (2012).

Mostafavi، M. et al. تحليل المروج المعتمد على التورين في Sinorhizobium meliloti التي تقدم تعديلاً محكمًا للتعبير الجيني. BMC ميكروبيول. 14, 295 (2014).

أندرسون ، جيه وآخرون. BglBricks: معيار مرن لتجميع الأجزاء البيولوجية. J. بيول. م. 4, 1 (2010).

فراسات ، إ. وآخرون. البحث الفعال ، ورسم الخرائط ، وتحسين النظم الوراثية متعددة البروتينات في البكتيريا المتنوعة. مول. نظم. بيول. 10, 731 (2014).

كامبراي ، ج. وآخرون. قياس ونمذجة نهايات النسخ الجوهرية. الدقة الأحماض النووية. 41, 5139–5148 (2013).

تشين ، Y.-J. وآخرون. توصيف 582 من النهايات الطبيعية والاصطناعية وتقدير قيود تصميمها. نات. أساليب 10, 659–664 (2013).

Temme، K.، Hill، R.، Segall-Shapiro، T.H، Moser، F. & amp Voigt، C. A. التحكم المعياري في مسارات متعددة باستخدام بوليميرات T7 المتعامدة الهندسية. الدقة الأحماض النووية. 40, 8773–8781 (2012).

Price، M.N، Arkin، A.P & amp Alm، E. دورة حياة الأوبرا. بلوس جينيت. 2، e96 (2006).

Touchon، M. & amp Rocha، E. P. Coevolution لتنظيم وهيكل جينومات بدائية النواة. كولد سبرينج حرب. بيرسب. بيول. 8، a018168 (2016).

Price، M.N، Huang، K.H، Arkin، A.P & amp Alm، E.Operon تشكيل مدفوع بالتنظيم المشترك وليس عن طريق نقل الجينات الأفقي. الدقة الجينوم. 15, 809–819 (2005).

Kaminski ، P. A. & amp Elmerich ، C. السيطرة على Azorhizobium caulinodans نيفا التعبير عن طريق الأكسجين والأمونيا وبواسطة HF ‐ I ‐ مثل البروتين ، NrfA. مول. ميكروبيول. 28, 603–613 (1998).

Pawlowski، K.، Klosse، U. & amp De Bruijn، F.J. توصيف الرواية Azorhizobium caulinodans ORS571 نظام تنظيمي مكون من عنصرين ، NtrY / NtrX ، يشارك في تثبيت النيتروجين والتمثيل الغذائي. مول. الجنرال جينيه. 231, 124–138 (1991).

Kaminski، P. & amp Elmerich، C. الإصلاح في تنظيم تثبيت النيتروجين في Azorhizobium caulinodans. مول. ميكروبيول. 5, 665–673 (1991).

كامينسكي ، ب ، ماندون ، ك ، أريجوني ، إف ، ديسنويس ، إن آند إلمريش ، سي. تنظيم تثبيت النيتروجين في Azorhizobium caulinodans: تحديد أ فيكس ك‐ مثل الجين ، منظم إيجابي لـ nifA. مول. ميكروبيول. 5, 1983–1991 (1991).

Michel-Reydellet، N. & amp Kaminski، P. A. J. Azorhizobium caulinodans تتحكم بروتينات PII و GlnK في تثبيت النيتروجين وامتصاص الأمونيا. J. باكتيريول. 181, 2655–2658 (1999).

دريبر ، تي وآخرون. دور GlnB و GlnK في التحكم في الأمونيوم لكل من نظامي النيتروجين في البكتيريا الضوئية كبسولات رودوباكتر. علم الاحياء المجهري 149, 2203–2212 (2003).

Martínez-García، E. & amp de Lorenzo، V. الأدوات الجزيئية والاستراتيجيات الناشئة لإعادة هيكلة الجينات / الجينوم العميقة الزائفة. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 47, 120–132 (2017).

Calero، P.، Jensen، S. I. & amp Nielsen، A. T. تتيح متجهات ProUSER ذات النطاق الواسع للمضيف توصيفًا سريعًا للمروجات المحفزة وتحسين إنتاج حمض الكوماريك في Pseudomonas putida KT2440. موالفة ACS. بيول. 5, 741–753 (2016).

تشوي ، ك. & amp Schweizer ، H. P. mini-Tn7 الإدراج في البكتيريا ذات مواقع attTn7 الفردية: مثال الزائفة الزنجارية. نات. بروتوك. 1, 153–161 (2006).

Poole، R.K & amp Hill، S. حماية الجهاز التنفسي لنشاط إنزيم النيتروجين في Azotobacter vinelandii—أدوار الأكسيدازات الطرفية. بيوسكي. اعادة عد. 17, 303–317 (1997).

Sabra، W.، Zeng، A.-P.، Lünsdorf، H. & amp Deckwer، W.-D. تأثير الأكسجين على تكوين وهيكل Azotobacter vinelandii الجينات ودورها في حماية النيتروجيناز. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 66, 4037–4044 (2000).

Schlesier، J.، Rohde، M.، Gerhardt، S. & amp Einsle، O. يقوم المفتاح المطابق بتشغيل حماية النيتروجيناز من تلف الأكسجين بواسطة بروتين Shethna II (FeSII). جيه. تشيم. شركة 138, 239–247 (2015).

ليدبيتر ، آر. ن. وآخرون. مجمع البروتين FixABCX المتشعب من الإلكترون من Azotobacter vinelandii: توليد مكافئات الاختزال منخفضة الإمكانات لتحفيز النيتروجيناز. الكيمياء الحيوية 56, 4177–4190 (2017).

لي ، ب. وآخرون. تحفز إفرازات الجذر تسهيلًا بين الأنواع من خلال تعزيز الإيماء و N2 تثبيت. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 113, 6496–6501 (2016).

Wang ، Y. ، Zhang ، J. ، Sun ، Y. ، Feng ، J. & amp Zhang ، X. تقييم القيمة المحتملة لحمض الكمون المنتج الطبيعي ضد الفطريات المسببة للأمراض النباتية في الخيار. جزيئات 22, 1914 (2017).

Zhou، X. & amp Wu، F. خيار حمض الفانيليك المتغير (نبات الخيار L.) الشتلات الجذرية البكتيرية الكلية ، الزائفة و عصية النيابة. مجتمعات. علوم. اعادة عد. 8, 4929 (2018).

Sun ، Y. ، Wang ، Y. ، Han ، L. ، Zhang ، X. & amp Feng ، J. نشاط مضاد للفطريات وطريقة عمل حمض الكمونيك من بذور Cuminum cyminum L. ضد أوكسيسبوروم الفيوزاريوم F. ص. نيفيوم (FON) يسبب ذبول الفيوزاريوم على البطيخ. جزيئات 22, 2053 (2017).

Wang ، Y. ، Sun ، Y. ، Zhang ، Y. ، Zhang ، X. & amp Feng ، J. نشاط مضاد للفطريات والاستجابة الكيميائية الحيوية لحمض الكمون ضد فيتوفثورا كابسسي ليونيان. جزيئات 21, 756 (2016).

Bais، H. P.، Weir، T. L.، Perry، L.G، Gilroy، S. & amp Vivanco، J.M. دور إفرازات الجذر في تفاعلات الجذور مع النباتات والكائنات الحية الأخرى. Annu. القس بيول النبات. 57, 233–266 (2006).

Rasmann، S. & amp Turlings، T. C. إشارات الجذر التي تتوسط التفاعلات المتبادلة في منطقة الجذور. بالعملة. رأي. مصنع بيول. 32, 62–68 (2016).

سوتو ، إم جيه ، سانجوان ، جيه آند أمب أوليفاريس ، ج. ريزوبيا والبكتيريا المسببة للأمراض النباتية: أسلحة العدوى الشائعة. علم الاحياء المجهري 152, 3167–3174 (2006).

Poonguzhali، S.، Madhaiyan، M. & amp Sa، T. إشارات استشعار النصاب الناتجة عن تعزيز نمو النبات بوركولديريا سلالات في المختبر وفي ظروف النبات. الدقة. ميكروبيول. 158, 287–294 (2007).

سانشيز كونتريراس ، إم ، باور ، دبليو دي ، جاو ، إم ، روبنسون ، جي بي أند ألان داوني ، جي تنظيم استشعار النصاب في الريزوبيا ودوره في التفاعلات التكافلية مع البقوليات. فيلوس. عبر. R. Soc. ب 362, 1149–1163 (2007).

شاغاس ، إف أوه ، دي كاسيا بيسوتي ، آر ، كارابالو رودريغيز ، إيه إم وأمبير بوبو ، إم تي الإشارات الكيميائية المشاركة في التفاعلات بين النبات والميكروبات. تشيم. شركة القس. 47, 1652–1704 (2018).

Schikora، A.، Schenk، S. T. & amp Hartmann، A. التأثيرات المفيدة للتواصل بين البكتيريا والنبات على أساس جزيئات استشعار النصاب في ن- مجموعة لاكتون اسيل هوموسيرين. مصنع مول. بيول. 90, 605–612 (2016).

Westervelt، P.، Bloom، M. L.، Mabbott، G.A & amp Fekete، F. A. Azomonas macrocytogenes. FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 30, 331–335 (1985).

Collinson، S.K، Doran، J.L & amp Page، W.J. إنتاج 3 ، 4-ثنائي هيدروكسي حمض البنزويك بواسطة Azomonas macrocytogenes و Azotobacter paspali. علبة. J. ميكروبيول. 33, 169–175 (1987).

Bhattacharya، A.، Sood، P. & amp Citovsky، V. أجروباكتريوم و ريزوبيوم عدوى. مول. مسار النبات. 11, 705–719 (2010).

ماتيسيوس ، يو وآخرون. استجابات واسعة النطاق ومحددة من حقيقيات النوى لإشارات استشعار النصاب البكتيري. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 100, 1444–1449 (2003).

Hernández-Reyes، C.، Schenk، S. T.، Neumann، C.، Kogel، K.H & amp Schikora، A. نتحمي البكتيريا المنتجة للاكتونات-أسيل-هوموسيرين النباتات من مسببات الأمراض النباتية والبشرية. التكنولوجيا الحيوية الميكروبية. 7, 580–588 (2014).

بيريز مونتانيو ، إف وآخرون. الأرز والفاصوليا إشارات استشعار النصاب بتقنية AHL تتداخل بشكل خاص مع القدرة على تكوين الأغشية الحيوية بواسطة البكتيريا المرتبطة بالنبات. الدقة. ميكروبيول. 164, 749–760 (2013).

بريسان ، إم وآخرون. ينتج الجلوكوزينولات الخارجية من قبل نبات الأرابيدوبسيس thaliana له تأثير على الميكروبات في الجذور وجذور النباتات. ISME J. 3, 1243–1257 (2009).

بدري ، دي في وآخرون. تغير طفرة ناقل ABC من نضح الجذور للمواد الكيميائية النباتية التي تثير إصلاحًا شاملًا لميكروبات التربة الطبيعية. نبات فيزيول. 151, 2006–2017 (2009).

عبد الغني ، S. E. ، Day ، I. ، Heuberger ، A. L. ، Broeckling ، C.D & amp Reddy ، A. S. أرابيدوبسيس باستخدام الجين البكتيري. علوم. اعادة عد. 6, 38483 (2016).

Oger، P.، Petit، A. & amp Dessaux، Y. النباتات المعدلة وراثيًا التي تنتج الأفيون تغير بيئتها البيولوجية. نات. التكنولوجيا الحيوية. 15, 369 (1997).

موندي ، س وآخرون. يؤدي التحيز المتزايد للكربون العيني في أنظمة النضح الاصطناعي وجذور النباتات المعدلة وراثيًا إلى زيادة إعادة تشكيل التجمعات البكتيرية. مول. ايكول. 23, 4846–4861 (2014).

ماير ، A. J. ، Segall-Shapiro ، T. H. ، Glassey ، E. ، Zhang ، J. & amp Voigt ، C. A. الإشريكية القولونية سلالات "ماريونيت" مع 12 مستشعرًا للجزيئات الصغيرة مُحسّنة للغاية. نات. تشيم. بيول. 15, 196–204 (2018).

بول ، P. S. ، Schofiel ، N.A ، Reid ، C.J ، Drew ، E.M & amp Walshaw ، D.L. تحديد الجينات الصبغية الموجودة في اتجاه مجرى النهر dctD التي تؤثر على الحاجة إلى الكالسيوم وطبقة عديدات السكاريد الدهنية ريزوبيوم ليجومينوساروم. علم الاحياء المجهري 140, 2797–2809 (1994).

ويلسون ، بي دبليو & أمبير نايت ، إس جي. تجارب في علم وظائف الأعضاء البكتيرية (بيرجس ، 1952).

Udvardi ، M. & amp Poole ، P. S. النقل والتمثيل الغذائي في تكافل البقوليات والجذريات. آن. القس بيول النبات. 64, 781–805 (2013).

Ferri، L.، Gori، A.، Biondi، E. G.، Mengoni، A. & amp Bazzicalupo، M. Plasmid electroporation of سينورهيزوبيوم السلالات: دور جين التقييد hsdR في نوع سلالة Rm1021. بلازميد 63, 128–135 (2010).

سيلبيتشكا ، دبليو وآخرون. توصيف recA الجينات و recA المسوخ ريزوبيوم ميليلوتي و ريزوبيوم ليجومينوساروم فيكيا بيوفار. مول. الجنرال جينيه. 229, 86–95 (1991).

Prell، J.، Boesten، B.، Poole، P. & amp Priefer، U. B. The ريزوبيوم ليجومينوساروم بف. فيكياي VF39 γ-aminobutyrate (GABA) جين aminotransferase (ثرثرة) يسببه GABA ويعبر عنه بشدة في البكتيريا. علم الاحياء المجهري 148, 615–623 (2002).

سيلفا روشا ، آر وآخرون. هندسة المتجهات الأوروبية القياسية (SEVA): منصة متماسكة لتحليل ونشر الأنماط الظاهرية بدائية النواة المعقدة. الدقة الأحماض النووية. 41، D666-D675 (2012).

Edgar، R. C.MusCLE: محاذاة تسلسل متعدد بدقة عالية وإنتاجية عالية. الدقة الأحماض النووية. 32, 1792–1797 (2004).

يان ، واي وآخرون. تحليل النسخ العالمي لتثبيت النيتروجين وقمع الأمونيوم في الجذر المرتبط Pseudomonas stutzeri A1501. علم الجينوم BMC 11, 11 (2010).

Jacob، G.، Schaefer، J.، Garbow، J. & amp Stejskal، E. Solid-state NMR studies of الكلبسيلة الرئوية نمت تحت ظروف تثبيت النيتروجين. J. بيول. تشيم. 262, 254–259 (1987).

Blomberg، P.، Wagner، E. & amp Nordström، K. التحكم في تكرار البلازميد R1: تتم معالجة الازدواج بين RNA المضاد للحساسية ، CopA ، وهدفه ، CopT ، على وجه التحديد في الجسم الحي وفي المختبر بواسطة RNase III. EMBO J. 9, 2331–2340 (1990).

Gorochowski ، T.E et al. توصيف الدوائر الجينية وتصحيح الأخطاء باستخدام RNA seq. مول. النظام. بيول. 13, 952 (2017).


المواد والأساليب

تسلسل الجينوم والتجميع والشرح

تم تسلسل السلالات التي لم يكن تسلسل الجينوم الخاص بها متاحًا بعد باستخدام العديد من منصات Illumina المقترنة (ملف تكميلي 1). تم فحص جودة قراءات التسلسل الناتجة باستخدام FastQC الإصدار 0.11.3 ، وتمت إزالة محولات التسلسل الملوثة باستخدام seq_crumbs الإصدار 0.1.9. تم تجميع القراءات باستخدام Spades (Bankevich et al. ، 2012) الإصدار 3.5.0 ، باستخدام أحجام مختلفة من k-mer وفقًا لطول القراءات ومع خيار "دقيق" لتقليل أخطاء التجميع التي تقل عن 200 زوج أساسي تم استبعادها. تم شرح contigs الناتج عن ترميز الجينات و RNAs الريبوسوم و tRNAs باستخدام Prokka (Seemann ، 2014) الإصدار 1.11.1. سلالات لا تنتمي إلى بكتريا قولونية تم استبعاد الأنواع من التحليل اللاحق بعد أن تم تسليط الضوء عليها بواسطة Kraken (Wood and Salzberg، 2014) الإصدار 0.10.5. عند توفرها ، تم استخدام معلومات الكتابة لتحديد تسلسل الجينوم غير الصحيح بسبب تلوث الثقافة أو عوامل أخرى تمت مقارنة كتابة السلالات المعروفة بتلك المتنبأ بها من تسلسل الجينوم باستخدام الإصدار 2.8 من mlst. تم تعديل أسماء السلالات عندما يكون ذلك ممكنًا (انظر عمود "الملاحظات" في الملف التكميلي 1). تم فحص مجموعة ECOR بعناية بحثًا عن التناقضات ، حيث أنه من المعروف أن "إصدارات" مختلفة من هذه المجموعة يتم تداولها في المجتمع العلمي (Johnson et al.، 2001 Clermont et al.، 2015). تم فحص تسلسل الجينوم بشكل أكبر بحثًا عن الجينوم المكرر: تم وضع علامة على سلالات ذات جينومات متشابهة للغاية ولكن أنماط ظاهرية شديدة التباين (ارتباط الأنماط الظاهرية S- درجة أقل من 0.6) وتمت إزالة الجينوم الذي ينتمي إلى السلالة غير الصحيحة على الأرجح. إذا تعذر حل التعارض (أي باستخدام معلومات الكتابة المعروفة) ، فقد تمت إزالة الجينومين. تم تعريف الجينومات المتشابهة للغاية على أنها تلك الجينومات التي تم العثور على مسافة أقل من 0.001 ، كما تم قياسها بواسطة الهريس (Ondov et al. ، 2016) ، الإصدار 1.1. على الرغم من حالة مسودة الجينومات المقدمة في هذه الدراسة ، فقد لاحظنا حجم جينوم أساسي مشابه للحجم المحسوب باستخدام مجموعة من 376 كاملة. بكتريا قولونية الجينومات التي تم تنزيلها من RefSeq الخاص بـ NCBI (البيانات غير معروضة).

الاتصال والتعليق التوضيحي SNP

نظرًا للتنوع في تقنيات التسلسل أو عدم وجود القراءات الأصلية للسلالات المتسلسلة بالفعل في المجموعة (N = 373) ، تم استدعاء SNPs من خلال محاذاة جينوم كاملة بين كل سلالة وجينوم الفرد المرجعي (الإشريكية القولونية شارع. K-12 Substr. MG1655 ، انضمام RefSeq: NC_000913.3 ، معرف مجموعة السلالة NT12001) ، باستخدام ParSNP (Treangen et al. ، 2014) الإصدار 1.2. تم تسليط الضوء على المناطق المتكررة في الجينوم المرجعي وإخفائها من خلال nucmer (Kurtz et al. ، 2004) الإصدار 3.1 و Bedtools (Quinlan and Hall ، 2010) الإصدار 2.26.0. تم بعد ذلك تقسيم SNPs على مراحل ، وشرحها باستخدام SnpEff (Cingolani et al. ، 2012) الإصدار 4.1g.

تحليل بانجينوم

تم تمييز الجينات الموجودة في الفرد المرجعي ولكنها غائبة في كل سلالة من خلال حساب مجموعة تقويم هرمية باستخدام OMA (Altenhoff et al. ، 2013) الإصدار 1.0.6. تمت إعادة شرح كل سلالة مسبقًا باستخدام Prokka (Seemann ، 2014) الإصدار 1.11 لتنسيق مكالمات الجينات.

علم الوراثة

تم حساب شجرة النشوء والتطور للسلالات باستخدام تحليل ParSNP واحد (Treangen et al. ، 2014) ، والذي يولد محاذاة كاملة للنيوكليوتيدات في الجينوم عبر جميع السلالات ، والتي تُستخدم بعد ذلك كمدخلات لـ FastTree (Price et al. ، 2010) الإصدار 2.1. 7. تم تصور الشجرة باستخدام مكتبة ete3 (Huerta-Cepas et al. ، 2016a) الإصدار 3.0.0.

تم حساب المسافات بين أزواج السلالات باستخدام تباينات مستقلة عن النشوء والتطور ، من أجل حساب الترابط بين السلالات النشوء والتطور (Felsenstein ، 1985). باختصار ، قمنا أولاً بتقييد بيانات النمط الظاهري لتلك السلالات والظروف التي تحتوي على بيانات مفقودة أقل من 10٪ ، ثم قمنا بحساب الباقي باستخدام متوسط ​​درجة S لكل سلالة ، باستخدام مكتبة scikit-Learn (Pedregosa et al. ، 2011 ) الإصدار 0.17.1. لكل حالة ، قمنا بعد ذلك بحساب التناقضات المستقلة للتطور عبر العقد الداخلية لشجرة السلالات ، وذلك باستخدام مكتبات القرود والجيجر والنباتات (Paradis et al. ، 2004 Harmon et al. ، 2008 Revell ، 2012) ، الإصدارات 5.0 ، 2.0 .6 و 0.6–20 على التوالي. بعد ذلك تم حساب المسافة المظهرية بين العقد باستخدام المسافة الإقليدية بين التباينات المستقلة للتطور في جميع الظروف ، باستخدام إصدار مكتبة nadist 0.1.0.

حساب جميع الطفرات المحتملة وتأثيرها

تم احتساب تأثير جميع الاستبدالات غير المجهولة المحتملة على الفرد المرجعي مسبقًا لتسريع عملية البحث. تم حساب التأثير الوظيفي للبدائل غير المجهولة باستخدام SIFT (Ng and Henikoff ، 2001) الإصدار 5.1.1 ، باستخدام uniref50 كقاعدة بيانات بحث متسلسلة. تم حساب التأثير الهيكلي للبدائل غير المجهولة باستخدام الإصدار 4 من FoldX (Guerois et al. ، 2002) ، تم استخدام كل من الهياكل ثلاثية الأبعاد الموجودة في قاعدة بيانات PDB ونماذج التماثل. تم إنشاء نماذج التماثل باستخدام ModPipe (Pieper et al. ، 2014) الإصدار 2.2.0. تم اشتقاق التحويل من إحداثيات PDB إلى إحداثيات مخلفات Uniprot من قاعدة بيانات SIFTS (Velankar et al. ، 2013).تم "إصلاح" هياكل PDB لإصلاح زوايا الالتواء البقايا واشتباكات Van der Waals قبل حساب تأثير المتغيرات غير المترادفة على الاستقرار الهيكلي. تتوفر جميع التأثيرات المحسوبة مسبقًا لجميع الاستبدالات غير المجهولة المحتملة من خلال قاعدة بيانات mutfunc (http://mutfunc.com).

حساب درجة الانقطاع

لكل سلالة وكل جينات ترميز بروتينية ، قمنا بحساب التأثير الكلي لجميع البدائل غير المجهولة وغير المنطقية ، في نهج مماثل لتلك المستخدمة في خميرة الخميرة (جيلير وآخرون ، 2011). تم تحويل ناتج كل متنبئ (احتمال ضار لـ SIFT وقيمة G لـ FoldX) إلى احتمال أن يكون الاستبدال محايدًا p (n e u t r a l). تم تنزيل الطفرات ذات التأثير المعروف على الفرد المرجعي من Uniprot (UniProt Consortium ، 2015 ، N = 3673) واستخدمت لاشتقاق مثل هذا التحويل حيث تم الإبلاغ عن 580 طفرة فقط لها تأثير محايد ، أضفنا جميع المتغيرات غير المجهولة التي تم ملاحظتها والتي تؤثر على الأساسيات المعروفة. الجينات (كما ورد في قاعدة بيانات OGEE ، Chen et al. ، 2017) إلى قائمة الطفرات التي يمكن تحملها. تم إهمال توزيع اللوغاريتم الطبيعي السلبي لاحتمال SIFT (بالإضافة إلى عدد زائف مكافئ لأدنى احتمال ملاحظ لـ SIFT) لجميع الطفرات الـ 6460 وتم حساب p (محايد) كنسبة من الطفرات المسموح بها على إجمالي عدد الطفرات في كل سلة. تم بعد ذلك تركيب منحنى الانحدار اللوجستي للتوزيع المهمل لاشتقاق التحويل بين احتمالية SIFT و p (n e u t r a l). بالنسبة إلى FoldX ، استخدمنا نهجًا مشابهًا ، ولكن باستخدام قيمة ΔΔG المحسوبة. أدت منحنيات الانحدار اللوجستي المجهزة إلى وظائف P (n e u t r a l) التالية:

تم تعيين القيمة P (المحايدة) المنسوبة إلى الطفرات غير المنطقية من خلال الاستدلال: إذا تم العثور على كودون الإيقاف الجديد ضمن آخر 16 بقايا من البروتين ، فقد تم إعطاؤه قيمة P (محايدة) بقيمة 0.99 ، مما يعكس عدم احتمال تعطيل وظيفة البروتين ، 0.01 خلاف ذلك. تم إعطاء قيمة P (n e u t r a l) عند فقدان رمز البداية أو الإيقاف ، حيث من المحتمل جدًا أن تضعف وظيفة البروتين.

لقد قدمنا ​​قيمة P (n e u t r a l) بقيمة 0.01 لتلك الجينات التي وُجدت في الفرد المرجعي ولكنها غائبة في السلالة المستهدفة ، مما يعكس حقيقة أن وظيفتها غالبًا ما تكون غائبة عن السلالة المستهدفة.

استنتجنا احتمال أن كل جين قد تأثرت وظيفته بمجموعة البدائل في كل سلالة عن طريق حساب درجة الاضطراب ، أي ما يعادل P (A F) (احتمال تأثر الوظيفة) المستخدمة في S. cerevisiae دراسة (Jelier et al. ، 2011).

أين ك هي مجموعة من الاستبدالات غير المترادفة وغير المنطقية التي لوحظت في كل جين. عندما كانت تنبؤات FoldX و SIFT متاحة لاستبدال معين ، استخدمنا تنبؤ SIFT فقط. لم يتم النظر في المتغيرات ذات التردد العالي نسبيًا (& gt = 10٪) في مجموعة السلالات ، وكذلك الجينات المرجعية التي لا توجد في عدد كبير من السلالات (& gt = 10٪) ، نظرًا لأننا استنتجنا أنه من غير المحتمل أن تكون كذلك ضارة نظرًا لتكرارها الملحوظ العالي. نظرًا لأن العديد من سلالات المجموعة مرتبطة ارتباطًا وثيقًا (مثل السلالات المشتقة من مجموعة LTEE) ، قمنا بتجميعها بناءً على مسافة التطور قبل تطبيق التصفية. لم نأخذ في الاعتبار أيضًا المتغيرات والجينات المرجعية الغائبة المشتركة بين جميع أعضاء مجموعة سلالات LTEE ، حيث توجد هذه المتغيرات في سلالة مؤسس المجموعة وبالتالي من غير المحتمل أن تؤثر على الأنماط الظاهرية المستنسخة المتطورة. يمكن العثور على درجات الاضطراب لجميع البروتينات عبر جميع السلالات في الملف التكميلي 5.

استخدام درجة الاضطراب كمؤشر ارتباط وظيفي

استخدمنا البروتينات الزوجية من ارتباط بيرسون بدرجات الاضطراب كمؤشر على الارتباطات الوظيفية للجينات. استخدمنا أربع مجموعات معيارية: العوامل المشتقة من قاعدة بيانات DOOR (Mao et al. ، 2014) ، ومجمعات البروتين والمسارات المشتقة من قاعدة بيانات EcoCyc (Keseler et al. ، 2013) ، وتفاعلات البروتين البروتين المستمدة من حديث حديث. تجربة الخميرة ثنائية الهجين (Rajagopala et al. ، 2014). تمت مقارنة توزيع ارتباط درجة الاضطراب لكل زوج من الجينات المرتبطة بنفس العدد من أزواج الجينات المستمدة عشوائيًا من جميع الجينات المرجعية. قمنا أيضًا بتقييم القوة التنبؤية لارتباطات نقاط الاضطراب من خلال رسم منحنى خصائص عامل الاستلام (ROC) عبر كل عتبة ارتباط ، باستخدام مكتبة scikit-Learn (Pedregosa et al. ، 2011) الإصدار 0.17.1.

سلالات النمط الظاهري

تم قياس الأنماط الظاهرية للسلالات بطريقة مماثلة لـ بكتريا قولونية الفحص الجيني العكسي (نيكولز وآخرون ، 2011). تم طلاء مجموعة السلالة في ثلاث ألواح أجار صلبة ، تحتوي كل واحدة على 1536 مستعمرة مفردة ، بحيث تم طلاء كل سلالة أربع مرات على الأقل في كل لوحة ، في كل مرة بسلالات مجاورة مختلفة. لكل حالة ، قمنا بإعداد ثلاث مكررات (كل واحدة تستخدم لوحة مصدر مختلفة لتقليل تأثيرات الدُفعات) مع التركيزات الموضحة في الملف التكميلي 2 وإضافة صبغة Cosmos (رقم CAS 573-58-0) و Coomasie الأزرق اللامع R- 250 (رقم CAS 6104-59-2). المحلول يلطخ المستعمرات عندما يتم تطوير الأغشية الحيوية الرقيقة. تم تخزين اللوحات في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، ما لم تتطلب الحالة المحددة خلاف ذلك (أي درجة حرارة أعلى) ، وتم التقاط صور للألواح حتى تم العثور على المستعمرات متضخمة في بعضها البعض. تم اختبار معظم الحالات (N = 197) في نفس الوقت وتحت نفس الظروف المختبرية مثل مجموعة KEIO KO (Herrera-Dominguez et al. ، غير منشورة).

تم استخراج سلسلة من معلمات المستعمرة من كل صورة ، باستخدام إصدار Iris (Kritikos et al. ، 2017) 0.9.4.71: حجم المستعمرة ، والتعتيم ، والاستدارة ، وكثافة اللون. تم تحديد النقطة الزمنية الأكثر ملاءمة لكل حالة من خلال فرض قيود على متوسط ​​حجم المستعمرة بين 1900 و 3600 بكسل لأول لوحين ، وبين 1300 و 3600 للوحة الأخيرة ، والتي تحتوي على السلالات المشتقة من تجارب التطور ، والتي تميل لتنمو أقل من العزلات الطبيعية. تم بعد ذلك فرز النقاط الزمنية التي تمر على العتبة الأولى حسب نسبة المستعمرات ذات الاستدارة العالية (& gt0.8) ، مما يدل على الجودة الإجمالية للوحة ، ونسبة المستعمرات فوق الحد الأدنى لمتوسط ​​عتبة حجم المستعمرة ، وانتشار المستعمرات. توزيع حجم المستعمرة (الأقل كان الأفضل) ، ويعني ارتباط حجم المستعمرة عبر التكرارات.

تم اتخاذ سلسلة من تدابير مراقبة الجودة الإضافية على معايير المستعمرة. من أجل إزالة عيوب التثبيت المنتظمة ، تمت إزالة المستعمرات التي تبدو مفقودة (حجم المستعمرة صفر بكسل) في أكثر من 66 ٪ من اللوحات المختبرة ، ما لم يتم العثور على جميع التكرارات الداخلية مفقودة. تمت إزالة المستعمرات ذات الاستدارة غير الطبيعية ، لأنها كانت في الغالب بسبب التعرف غير الصحيح على المستعمرة بواسطة البرنامج: تمت إزالة المستعمرات ذات الحجم الأقل من 1000 بكسل والدائرية أقل من 0.5 والمستعمرات ذات الحجم فوق 1000 بكسل والدائرية أقل من 0.3. تم رصد الملوثات المفترضة وإزالتها من خلال أسلوب مقبس التباين: أولاً ، تم تصحيح حجم صفين خارجيين ومستعمرات أعمدة لتتناسب مع متوسط ​​بقية اللوحة ، ثم لكل سلالة ، تم تصحيح كل من المضاعفات الأربعة داخل الصفيحة اختبار ما إذا كان قد ساهم في أكثر من 90٪ من إجمالي تباين حجم المستعمرة. إذا كان الأمر كذلك ، فقد تم وضع علامة على النسخة المكررة باعتبارها تلوثًا وإزالتها. تم تكرار نفس الأسلوب باستخدام دائرية المستعمرة ، مع عتبة تباين 95٪.

تم استخدام أحجام المستعمرات النهائية كمدخل لخوارزمية EMAP (Collins et al. ، 2006) ، مع المعلمات الافتراضية ، من أجل اشتقاق درجة S ، والتي تُعلم عن انحراف كل سلالة عن النمو المتوقع في كل حالة . تم تطبيع درجات S النهائية ، وتم تسليط الضوء على أنماط ظاهرية مهمة باستخدام تصحيح FDR بنسبة 5 ٪ مشابه لتلك المستخدمة في بكتريا قولونية عكس الشاشة الجينية (نيكولز وآخرون ، 2011) ، باستخدام الإصدار 0.6.1 من مكتبة statsmodels. البيانات المظهرية متاحة في الملف التكميلي 4.

احتساب الدرجة الشرطية وتقييمها

تم اشتقاق الجينات الأساسية المشروطة لكل حالة من حالات بكتريا قولونية تداخل الشاشة الوراثية العكسية مع الظروف المختبرة في مجموعة العزلات الطبيعية. تم اعتبار المسوخ ذات النمط الظاهري للنمو الكبير لاستنباط قائمة الجينات الأساسية المشروطة. تم حساب الدرجة الشرطية لكل سلالة ، والتي تشير إلى التنبؤ بالنمو ، على النحو التالي:

أين س و ج تمثل السلالة والحالة ، على التوالي ، ز كل جين أساسي شرطي للحالة ج (بحجم ل) ، و E s التي تمثل مصطلح تصحيح لدرجة الاضطراب ، من أجل إزالة تأثير مسافة النشوء والتطور (الشكل 2 - ملحق الشكل 1).

أين ن يمثل جميع الجينات المرجعية. يستخدم المصطلح W g، c لتقييم مساهمة كل جين أساسي مشروط في الدرجة الشرطية ، ويتم حسابه على النحو التالي:

حيث F g، c هي القيمة p للجين المصحح بواسطة FDR ز في حالة ج، C g هو عدد الشروط في شاشة الجينوميات الكيميائية حيث الجين ز يُظهر نمطًا ظاهريًا مهمًا ، و N ج العدد الإجمالي للظروف المختبرة في شاشة الجينوميات الكيميائية.

تم تقييم الدرجة الشرطية من خلال حساب منحنى Precision-Recall ، الذي تم استخدام منطقته (PR-AUC) كمقياس مباشر للقوة التنبؤية للطريقة التي اعتبرت فيها أنماط النمو إيجابية حقيقية. تم حساب منحنى العلاقات العامة والجامعة الأمريكية بالقاهرة باستخدام مكتبة scikit-Learn (Pedregosa et al. ، 2011) الإصدار 0.17.1. تم استخدام ثلاث طرق عشوائية لتوليد درجات شرطية للتحكم: واحدة باستخدام خلط السلالات ، وواحدة باستخدام مجموعات الجينات الأساسية المشروطة ، والأخرى باستخدام مجموعات الجينات الأساسية المشروطة العشوائية. تم استخدام كل استراتيجية توزيع عشوائي لتوليد 10000 درجة عشوائية ، والتي تم تحجيمها إلى المستوى الفعلي قبل التقييم.

تتوفر مجموعات الجينات الأساسية المشروطة والنتيجة الشرطية وقيم PR-AUC في الملف التكميلي 5.

رابطة الجينات الملحقة بالأنماط الظاهرية

تم حساب الجينات الملحقة من مجموعة سلالات pangenome من تعليقات الجينوم المنسقة التي قدمتها Prokka (Seemann ، 2014) ، باستخدام Roary (Page et al. ، 2015) الإصدار 3.6.1. ارتبطت الجينات الملحقة بالأنماط الظاهرية لكل حالة باستخدام Scoary (Brynildsrud et al. ، 2016) الإصدار 1.4.0 ، مع المعلمات الافتراضية. اعتبرت الجينات ذات القيمة الاحتمالية المصححة (Benjamini-Hochberg) التي تقل عن 0.05 مهمة. تم تقييم إثراء الجينات الأساسية المشروطة بين نتائج الجينات المرجعية المهمة من خلال اختبار فيشر الدقيق ، كما هو مطبق في مكتبة SciPy ، الإصدار 0.17.0.

التكامل المنهجي في السيليكو للجينات الأساسية المشروطة

تم التنبؤ بإمكانية استعادة الأنماط الظاهرية للنمو من خلال إدخال الأليلات المرجعية بشكل منهجي في كل سلالة عن طريق تغيير درجة الاضطراب إلى الصفر في كل جين أساسي شرطي ، والإبلاغ عن التغيير في الدرجة الشرطية: فيما يتعلق بأقصى درجة شرطية ممكنة:

حيث P m a x (A F) هي أقصى درجات الاضطراب الملحوظة عبر جميع الجينات والسلالات. تم اعتبار أي Δ S s ، c أعلى من 1 ٪ من S s ، c m a x قادرًا على استعادة النمط الظاهري للنمو.

التكامل التجريبي للجينات المسببة للنمط الظاهري المتوقع

من أجل التحقق من تنبؤاتنا تجريبياً ، قدمنا ​​الجين المرجعي (BW25113) في نسخة منخفضة من البلازميد. بالنسبة إلى slt الجين ، استخدمنا البلازميد المتاح من مكتبة TransBac (H. Dose و H. Mori ، مورد غير منشور ، Otsuka et al. ، 2015). ل أكرا, أكرب و glnD، استخدمنا البلازميد المتاح من مكتبة البلازميد المتنقلة (Saka et al. ، 2005). تضخيمنا أكراب, soxSR, proAB من BW25113 وربطها بـ pNTR-SD (بلازميد العمود الفقري لمكتبة البلازميد المتنقلة). المحذوفات من أكراب, soxSR, proAB في السلالة المرجعية باستخدام نهج إعادة التركيب الأحمر لامدا (Datsenko and Wanner ، 2000). تم إدخال البلازميدات السبعة الناتجة وعناصر تحكم البلازميد الفارغة في BW25113 (التحكم السلبي) ، في سلالات الحذف من مجموعة Keio أو التي أنشأناها (التحكم الإيجابي) وفي سلالات الأهداف. تم تثبيت جميع السلالات الناتجة باستخدام روبوت Singer Rotor في 10 ظروف مختلفة ، على لوحين أجار صلبين ، بحيث يتم تثبيت كل سلالة أربع مرات على الأقل لكل لوحة. تم تحضين الأطباق في درجة حرارة الغرفة وتم التقاط صور متعددة حتى تم العثور على مستعمرات تتكاثر في بعضها البعض. تم استخدام Iris (Kritikos et al. ، 2017) الإصدار 0.9.7 لاستخراج حجم المستعمرة من الصور.

توافر الكود والبيانات والسلالات

تم إيداع تسلسلات جينومية جديدة في أرشيف النيوكليوتيدات الأوروبي (ENA) برقم الانضمام PRJEB20550.


شاهد الفيديو: السلالة العربية حسب دراسة ناشيونال جرافيك j1 (شهر نوفمبر 2022).