معلومة

9.7: التنوع الفيروسي - علم الأحياء

9.7: التنوع الفيروسي - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

9.7: التنوع الفيروسي

الفيروسات في النظم البيئية للتربة: كمية غير معروفة داخل منطقة غير مستكشفة

يمكن أن تتراوح الوفرة الفيروسية في التربة من أقل من حدود الكشف في الصحاري الساخنة إلى أكثر من مليار لكل جرام في الأراضي الرطبة. يبدو أن الوفرة تتأثر بشدة بتوافر المياه ودرجة الحرارة ، لكن الافتقار إلى معايير إعلامية يخلق صعوبات لتحليل الدراسات الشاملة. يتم التقليل من أهمية التنوع الفيروسي في التربة وقلة العينات ، على الرغم من أن المقاييس الحالية للثراء الفيروسي أعلى بالنسبة للتربة مقارنة بالنظم الإيكولوجية المائية. أثارت كل من التحليلات المورفومترية والميتاجينومية أسئلة حول انتشار فيروسات ssDNA غير السامة في التربة. التربة معقدة وذات أهمية حاسمة للتنوع البيولوجي الأرضي والحضارة البشرية ، ولكن آثار الأنشطة الفيروسية على خدمات النظام الإيكولوجي للتربة غير مفهومة جيدًا. بينما تشير المعلومات من النظم المائية وعلم الأحياء الدقيقة الطبية إلى إمكانية التأثيرات الفيروسية على دورات المغذيات ، وتفاعلات شبكة الغذاء ، ونقل الجينات ، والعمليات الرئيسية الأخرى في التربة ، يتوفر عدد قليل جدًا من البيانات التجريبية. لفهم فيروم التربة ، لا يزال هناك الكثير من العمل.

الكلمات الدالة: عاثيات التربة الفيروسية البيئية الفيروسية الفيروسية.


خلفية

الفيروسات منتشرة في كل مكان وهي أكثر الميكروبات تعددًا في البيئات البحرية. كشفت التحليلات السابقة باستخدام المجهر الإلكتروني ، والفحص المجهري epifluorescence والتدفق الخلوي عن وجود 10 6 إلى 10 9 جسيمات شبيهة بالفيروس لكل مليلتر من ماء البحر [1-3]. تصيب الفيروسات الكائنات البحرية من العوالق النباتية المنتجة للأكسجين إلى الحيتان ، وتنظم تعداد العديد من الكائنات البحرية وهي مؤثرات مهمة للتدفقات البيوجيوكيميائية العالمية [4 ، 5]. أصبح من الواضح أيضًا أن الفيروسات تمتلك تنوعًا وراثيًا كبيرًا في الجينوميات المقارنة [6 ، 7] وكشفت دراسات الميتاجينوميات المستهدفة للفيروسات [8-10] عن وجود قدر كبير من التسلسلات الفيروسية التي لا تحتوي على متماثلات يمكن اكتشافها في قواعد البيانات. كمستودع للجينات "الجديدة" وكذلك نواقل الجينات "القديمة" ، قد تساهم الفيروسات بشكل كبير في تطور الكائنات الحية الدقيقة في النظم البيئية البحرية.

على الرغم من هذا التقدم في توصيف الأهمية البيئية للفيروسات ، لا يزال يتعين إجراء وصف كمي للفيروسفير البحري. وهذا يشمل تحديد الوفرة النسبية لعائلات الفيروس وتقييم مستوى تنوعها الجيني. في هذا السياق ، تشكل الفيروسات الكبيرة ، التي يمكن أن يتجاوز حجم جسيماتها تلك الموجودة في البكتيريا الصغيرة [11] ، مصدر قلق خاص. معظمهم مثل الشوكميبا polyphaga [12] ، يمكن الاحتفاظ بها على المرشحات 0.16-0.2 μpore المستخدمة على وجه التحديد في دراسات الميتاجينوميات المستهدفة للفيروس وقد لا يتم جمعها في الجزء المرتبط تقليديًا بالتسلسلات الفيروسية [11]. تم إصدار مجموعة بيانات التسلسل الميتاجينومي البحري التي تم إصدارها مؤخرًا ، والتي أنتجتها المرحلة الأولى من بعثة Sorcerer II العالمية لأخذ عينات المحيطات (GOS) [13] ، وتوفر فرصة للتحقيق الكمي في التنوع الفيروسي في البيئات البحرية. تشتمل بيانات GOS على مجموعة كبيرة من تسلسل البنادق البيئية ، مع 7.7 مليون قراءة متسلسلة مجمعة في 4.9 مليار نقطة أساس. في بعثة GOS ، تم جمع العينات الميكروبية بشكل أساسي من مياه البحر السطحية ، وتم جمع البعض الآخر من البيئات المائية غير البحرية. تم استخراج معظم عينات الحمض النووي من جزء بحجم 0.1-0.8 ، والذي تهيمن عليه البكتيريا. ويليامسون وآخرون. [14] ذكرت مؤخرًا أن ما لا يقل عن 3٪ من البروتينات المتوقعة الموجودة في بيانات النظام العالمي للرصد (GOS) هي من أصل فيروسي. وتجدر الإشارة إلى أن عددًا من التسلسلات الأكثر تشابهًا مع جينوم الفيروس الميمي العملاق تم العثور عليه في مجموعة البيانات الميتاجينومية لبحر سارجاسو [15] ، التي تم إنتاجها من خلال دراسة تجريبية لبعثة حكومة السودان الاستكشافية [16] ، وكذلك في GOS metagenomic الجديدة مجموعة البيانات [17].

إن تحديد التوزيع التصنيفي ، المشار إليه باسم "binning" ، هو الخطوة الأولى لتحليل التجمعات الميكروبية في التسلسلات الميتاجينومية [18]. يستخدم نهج binning البسيط برامج البحث في قاعدة البيانات مثل BLAST للعثور على أفضل تسلسل تسجيل للأنواع المعروفة. يمكن استخدام قاعدة الأغلبية لتعيين مجموعة تصنيفية إلى تسلسل ميتاجينومي [14 ، 19]. على غرار أفضل معيار تم استخدامه لتحديد الجينات المتعامدة في الجينوم الكامل [20 ، 21] ، تم استخدام عمليات البحث BLAST ثنائية الاتجاه لاكتشاف التسلسلات "الشبيهة بالفيروسات" في البيانات الميتاجينومية [15 ، 17]. يمكن أن تؤدي المعالجة اللاحقة لنتائج بحث التماثل إلى تحسين دقة التخصيص التصنيفي. ومع ذلك ، فإن استخدام برامج البحث عن التنادد له عيوب خطيرة [22]. على سبيل المثال ، تكون درجات BLAST شديدة الحساسية لأحجام المحاذاة وعمليات الإدراج / الحذف. علاوة على ذلك ، من الصعب استنتاج المسافات التطورية بين النتائج عالية الدرجات فقط من نتائج بلاست.

يظل التحليل الوراثي أقوى طريقة لتحديد التوزيع التصنيفي للتسلسلات الميتاجينومية. استخدمت شركة Short and Suttle [23] طرقًا للتطور الوراثي لتصنيف تسلسل الجينات المتضخمة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل واقترح وجود فيروسات طحلبية غير معروفة سابقًا في المياه الساحلية. تم إجراء دراسات جينية مماثلة لتقييم تنوع العاثيات من النوع T4 [24] أو فيروسات الحمض النووي الريبي [25 ، 26] في البيئات البحرية. في هذه الدراسات ، تم تضخيم الواسمات المختلفة ، مثل الجينات القفيصة الرئيسية أو تسلسل الجين البوليميريز RNA المعتمد على الحمض النووي الريبي ، بواسطة PCR أو RT-PCR وتم تحليلها بواسطة طرق النشوء والتطور. لفحص التوزيع التصنيفي لفيروسات الدنا الكبيرة في مجموعة متوالية ميتاجينومية ، فإن بوليميراز الحمض النووي من عائلة B (PolB) هو علامة مفيدة [23 ، 27 ، 28]. يتم حفظ متواليات PolB في جميع الأعضاء المعروفين في فيروسات الحمض النووي الكبيرة nucleocytoplasmic (NCLDVs) [29] ، والتي تشمل "Mimiviridae" [30] و Phycodnaviridae و Iridoviridae و Asfarviridae و Poxviridae. تم العثور على جينات PolB أيضًا في فيروسات حقيقية النواة الأخرى ، مثل فيروسات الهربس والفيروسات baculovirus والفيروسات الأسكوية والفيروسات nimiruses ، في بعض العاثيات (على سبيل المثال ، T4-phage ، cyanophage P-SSM2) ، وفي بعض الفيروسات البدائية (على سبيل المثال ، Halovirus HF1). حقيقيات النوى لها أربعة نظائر PolB (وحدات فرعية تحفيزية من α و و ε و DNA polymerases). تم العثور على جينات PolB في جميع السلالات الأثرية الرئيسية (Nanoarchaeota و Crenarchaeota و Euryarchaeota). وجود متماثلات PolB في البكتيريا (النموذج الأولي الإشريكية القولونية DNA polymerase II) محدود توجد PolBs في Proteobacteria و Acidobacteria و Firmicutes و Chlorobi و Bacteroidetes. جينات PolB مناسبة لتصنيف فيروسات الدنا الكبيرة [31 ، 32] بفضل حفظها القوي في التسلسل والتردد المنخفض على ما يبدو للنقل الأفقي الأخير [28 ، 33].

عند تطبيق طرق النشوء والتطور على متواليات البنادق البيئية ، تتطلب معالجة التسلسلات القصيرة اهتمامًا خاصًا. تظهر هذه التسلسلات تباينًا كبيرًا في الحجم وربما تتوافق مع أجزاء مختلفة من جين العلامة المحدد. لا يوفر تجميع متواليات قصيرة متعددة على علامات تمثيلية من كائنات معروفة محاذاة مناسبة (أيًا كان البرنامج المستخدم) مع إشارات كافية لتحليل النشوء والتطور اللاحق. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة جديدة قائمة على نسالة. الطريقة التي تسمى "رسم الخرائط الجينية" تحلل التسلسلات الميتاجينومية الفردية واحدة تلو الأخرى وتحدد مواضعها باستخدام محاذاة تسلسل مرجعي متعدد (MSA) وشجرة مرجعية. كمحاولة للتحقيق في الوجود والثراء التصنيفي والوفرة النسبية لفيروسات الحمض النووي الكبيرة المختلفة في البيئات البحرية ، قمنا بتحليل مجموعة بيانات GOS باستخدام تسلسلات PolB كمرجع لنا. لا تتناول دراستنا وفرة فيروسات الحمض النووي الصغيرة أو فيروسات الحمض النووي الريبي [14 ، 34].


9.7: التنوع الفيروسي - علم الأحياء

نقترح نظامًا للمراقبة المستمرة لمسببات الأمراض الفيروسية المنتشرة في أعداد كبيرة من البشر. نبني هذا النظام على العزل المادي للفيروسات من عينات مجمعة كبيرة من مصل الدم والبلازما البشرية (على سبيل المثال ، العينات المهملة من مختبرات التشخيص) ، متبوعة بتسلسل بندقية الصيد للجينومات الناتجة. تم تطوير تقنية تركيز الفيروسات من مجلدات سعة 100 لتر سابقًا في مختبر أوك ريدج الوطني ، كما تم تطوير وسائل تنقية وتركيز الفيروسات من الأحجام بالميكرولتر مؤخرًا. في الوقت نفسه ، طور علماء الفيروسات البحرية طرقًا فعالة لتركيز وتضخيم وتسلسل الخلائط الفيروسية المعقدة التي تم الحصول عليها من المحيط. بالنظر إلى هذه القاعدة التكنولوجية الحالية ، نعتقد أنه يمكن تنفيذ نظام متكامل وآلي ومحكم لمراقبة "الفيروس" البشري في غضون سنة إلى سنتين. يمكن لمثل هذا النظام أن يراقب مستويات الفيروسات المعروفة لدى البشر ، ويكتشف بسرعة تفشي المرض ، ويكتشف بشكل منهجي فيروسات بشرية جديدة أو مختلفة.

العملية التقليدية لاكتشاف فيروسات بشرية غير معروفة من قبل ، أو متغيرات فيروسات معروفة ، ليست سريعة ولا منهجية تمامًا. غالبًا ما يكون الوقت بين العدوى الأولية المحسوبة بأثر رجعي والتعرف النهائي عدة أسابيع أو شهور أو حتى سنوات. بالنسبة لعامل جديد تمامًا ، فإن الفترة المقدرة بين الإصابة الأولية والتوصيف التفصيلي متغيرة وتعتمد على وجود أعراض غير عادية ، والفشل في التعرف على الفيروس بعد استخدام جميع الاختبارات المحددة المتاحة ، والتعرف على مشكلة فريدة ، وفي الماضي ، القدرة على تنمية العامل في الثقافة.

تتناقض الطبيعة الخصوصية لاكتشاف الفيروسات مع مقاربات المسح الواسع المميزة لعلم الجينوم والبروتيوميات. فقط في مجال فيروسات المحيطات الصغير نسبيًا ، تم اختبار نهج فهرسة أكثر شمولاً. وبتيسير من السهولة النسبية التي يمكن بها عزل الفيروسات عن مياه البحر (باستخدام المرشحات التجارية) ، قام الباحثون في هذا المجال بفحص مجموعة واسعة وغير متحيزة أساسًا من العوامل الفيروسية على مستوى تسلسل الجينوم (بما في ذلك العاثيات) وتقدير عدد الجينومات المختلفة هدية (

5,000) (13). قد يتوقع المرء أن إجراء مسح شامل للفيروسات البشرية ، وتحديد ما يمكن أن نطلق عليه "الفيروس الفيروسي" البشري سيكون ، على الأقل من الناحية المفاهيمية ، أكثر وضوحًا.

شكل. تمثيل تخطيطي لعملية الاكتشاف المنهجي للفيروسات البشرية. تعتمد العملية الأساسية (سلسلة الخطوات الرأسية اليسرى) على العزل المادي وتسلسل البندقية للحصول على تسلسل متكرر.

نهجنا المقترح (الشكل) ، الذي يتم فيه مراقبة أعداد كبيرة من السكان باستمرار بحثًا عن فيروسات جديدة معدية للإنسان ، لم يُعتبر مجديًا تقنيًا أو ضروريًا من الناحية الطبية في الماضي. لأغراض المراقبة الواسعة ، نقترح استخدام تجمعات من المصل أو البلازما من أعداد كبيرة من الأشخاص ، والمصدر الأكثر احتمالاً هو المواد الزائدة التي تم جمعها للأغراض السريرية الروتينية. سيتم تجميع هذه العينات ومعالجتها باستخدام التكنولوجيا المتاحة لعزل جزيئات الفيروس بشكل جماعي ، واستعادة الأحماض النووية الفيروسية ، وإنتاج مكتبات بنادق صيد مكبرة ، وتنفيذ تسلسل البنادق لمزيج الجينومات الفيروسية ، وإعادة بناء هذه الجينومات في السيليكو باستخدام التقنيات التي تم تطويرها في الأصل لتسلسل الجينوم البشري بأكمله من شظايا عشوائية. الهدف المركزي هو تكرار عملية المراقبة هذه باستمرار لتحديد العوامل التي تتغير بكثرة بمرور الوقت ، والعثور على العوامل غير المكتشفة الموجودة بالفعل ، واكتشاف الفيروسات الجديدة عند ظهورها. إذا نجحت ، فسنحصل لأول مرة على صورة شاملة "لما يجري". من المثير للدهشة أن معظم الأنظمة والتكنولوجيا لتنفيذ هذه العملية موجودة في شكل أساسي وتم توظيفها بنجاح لمسح مجموعات فيروس الحمض النووي شديدة التنوع في المحيطات. ما تبقى عمله ، لإنشاء نظام قابل للتطبيق على البشر ، هو في المقام الأول تكامله وتحسينه وتنفيذه في بيئة آمنة. نستكشف بإيجاز مكونات هذه العملية هنا ونقترح إمكانية تشغيلها في أقل من عام.

توافر عينات مجمعة كبيرة

تتخلص مختبرات التشخيص التجارية الرئيسية في الولايات المتحدة من 500 لتر من المصل البشري الزائد أو البلازما كل أسبوع. تمثل هذه المادة مقطعًا عرضيًا واسعًا للمرضى والأمراض. إن الأحمال الفيروسية في البلازما كدالة للوقت بعد ظهور المرض غير معروفة لمعظم الأمراض الفيروسية ، ولكن يبدو أنها أعلى في مراحل الحمى الأولية. نظرًا لأن إحدى الخطوات الأولى في علاج مرض حموي مجهول المصدر هي الحصول على عينة دم ، فإننا نتوقع أن تحتوي شبكات التشخيص الحالية على كميات كبيرة من الفيروسات. يمكن أيضًا اختيار عينات من المجموعات السكانية الفرعية المخصبة لمرض فيروسي محتمل. بالنسبة لتلك الأمراض الفيروسية التي تسبق فيها الإصابة بالفيروسات المرض الكبير ، فإن إدراج أعداد كبيرة من العينات المكتسبة عشوائيًا في البركة (أي مجموعة غير منتقاة) يوفر أفضل فرصة للكشف. يجب أن يثير تحليل العينات المجمعة من عدد كبير من الأشخاص الحد الأدنى من مخاوف الخصوصية.

عزل الفيروس وتسلسله وتجميعه

هناك حاجة إلى طرق للعزل الروتيني لجميع فئات الفيروسات من عينة مجمعة ولتركيزها بواسطة عوامل تزيد عن مليون مع ضمان إزالة جميع الأحماض النووية غير الفيروسية. قد تكون المركزات معدية بشكل خطير ، وستكون هناك حاجة لأنظمة احتواء متطورة.

تم تطوير التكنولوجيا المفضلة لتركيز الفيروسات من الأحجام الكبيرة بواسطة مشروع تطوير أجهزة الطرد المركزي النطاقية المشتركة بين NIH-AEC في مختبر أوك ريدج الوطني ، أوك ريدج ، تينيسي ، الولايات المتحدة الأمريكية ، ومصنع أوك ريدج لانتشار الغازات في الستينيات (4). في البداية ، أراد الباحثون تحديد ما إذا كانت الفيروسات كفئة تختلف بطريقة منهجية عن جميع الجسيمات الصغيرة الأخرى في الطبيعة. عندما تم رسم معاملات الترسيب للفيروسات المعروفة آنذاك مقابل كثافات النطاقات المتساوية الخاصة بها ، سقطت جميع الفيروسات تقريبًا في منطقة خالية بشكل أساسي في وسط قطعة الأرض ، محاطة بكثافة أعلى أو أقل ومعاملات ترسيب أعلى أو أقل من قبل العديد من العضيات دون الخلوية والجزيئات الكبيرة. كانت هذه المنطقة تسمى "نافذة الفيروس" (5). وبالتالي ، تظهر الفيروسات حجمًا فريدًا ونطاق كثافة ولها كثافة نطاقات تعكس محتوياتها المجمعة من البروتين والحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم حماية الأحماض النووية الفيروسية من الهجوم بواسطة نوكليازات بحيث يمكن تدمير الجسيمات التي تحتوي على الحمض النووي الملوثة (بشكل أساسي الحمض النووي الجيني من الخلايا المبرمجة أو المعطلة) بشكل انتقائي بواسطة نوكليازات مضافة (6). قواعد عزل الفيروس هي التالية: 1) معدل الترسيب (يعتمد بشكل كبير على حجم الجسيمات) يقع في نطاق معين 2) كثافة النطاقات في التدرج تقع في نطاق معين 3) الجينوم محمي من هجوم نوكلياز حتى البروتين (+/- الدهن) معطل و 4) البروتينات الرئيسية الموجودة لها تسلسلات تتفق مع جزء على الأقل من الجينوم.

يتطلب استغلال نافذة الفيروس فصلًا ثنائي الأبعاد يعتمد على معدل الترسيب (S) في أحد الأبعاد وكثافة النطاق (rho) في الآخر ، وعادة ما يتم ذلك بالترتيب: S-ρ. بالنسبة للعزل والتنقية على نطاق واسع ، كان التحدي يتمثل في إجراء عمليات الفصل هذه بشكل مستمر ومتزامن في دوارات كبيرة من أجهزة الطرد المركزي ذات التدفق المستمر والتي تدور بسرعة عالية في الفراغ.

في هذا المخطط ، يمر تيار متدفق إلى الداخل بتدرج كثافة رقيق غير متدفق ، مثبت في مكانه مقابل جدار الدوار بواسطة قوة الطرد المركزي. يشكل الفيروس المسترد نطاقًا ضيقًا في التدرج اللوني ، والذي يتم استعادته بعد إعادة توجيه التدرج اللوني للراحة في نهاية التشغيل. إذا كان التدفق من خلال جهازي طرد مركزي متتالي ، يعمل الأول بسرعة أقل من الثاني ، يمكن إزالة الجسيمات ذات معدل S أعلى من الفيروسات من التدفق المتدفق ، ثم تتركز الفيروسات وتجمع في جهاز الطرد المركزي الثاني عالي السرعة ، وبالتالي توفير فصل S-كبير الحجم.

تضمنت النتيجة النهائية لهذا العمل تصميم وبناء جهاز الطرد المركزي الفائق واسع النطاق K-II (710). تم تصميم هذا الجهاز لاستعادة الفيروس في حالة نقاء عالية من دفعات 100 لتر من لقاح الأنفلونزا الخام في يوم 8 ساعات (11,12) وبعد ذلك تم استخدامه لتنقية مستضد سطح التهاب الكبد B (أستراليا) على نطاق واسع (13,14) من مصل بشري لاستخدامه كلقاح ولعزل جماعي لأجسام متضمنة متعددة السطوح (15). دخلت أجهزة الطرد المركزي K حيز الاستخدام في جميع أنحاء العالم لعزل الفيروسات على نطاق واسع وكانت متاحة تجاريًا مع القليل من التعديلات على الدوار على مدار الـ 35 عامًا الماضية (16,17). تم بناء ما يقرب من 200 من هذه الأنظمة.

تتوفر الآن طرق لتنقية مكونات المخاليط الفيروسية المعقدة ، لترسيب الفيروسات من خلال التدرجات التي تحتوي على مناطق غير متماسكة (على سبيل المثال ، نوكليازات) ، وتركيزها حتى عشرات الميكرولتر (18,19) للتسلسل أو التحليل الطيفي الكتلي.

فيروسات المحيطات

خلال مشروع تطوير أجهزة الطرد المركزي في Oak Ridge ، كانت هناك حاجة إلى كميات كبيرة من مواد الاختبار ، وتم فحص مياه البحر ، من بين مصادر أخرى ، كمصدر محتمل للفيروس. تم العثور على المحيط يحتوي على أمثلة لكل شكل فيروسي معروف تقريبًا عند التتر العالي (20) ، والبدء في استكشاف علم الفيروسات البحرية (13,2130). تشير البيانات الحديثة في هذا المجال إلى أن محيطات العالم تحتوي على ما يقرب من 10 31 جسيمًا من العاثيات من الفيروسات (27) (حوالي 22 مليون طن متري) ، يتحول الكثير منها مرة واحدة يوميًا بما في ذلك بعض مسببات الأمراض البشرية (28). محرك الطفرات الهائل هذا ، حتى لو افترض المرء معدل طفرات ضئيل ، يولد ما يعادل مئات الجينومات البشرية الكاملة الجديدة يوميًا. تم إثبات وجود الفيروسات في كل مكان في المحيط من خلال الدراسات التي أجريت على العينات المسترجعة في مواقع منفصلة على نطاق واسع من أنظمة الترشيح المثبتة على السفن السطحية (29) والغواصات النووية (3) والمركبات التي تعمل عن بعد (30). في الواقع ، يحتوي المحيط بأكمله على محتوى فيروسي متوسط ​​في النطاق الأدنى من الأحمال الفيروسية المبلغ عنها للبلازما البشرية من مرضى الفيروس. في الواقع ، اقترب علماء الفيروسات البحرية من تنفيذ نظام مراقبة مثل ما نقترحه على البشر. بميزانيات محدودة ، طور هؤلاء الباحثون وسائل لاستعادة الفيروسات البحرية من الأحجام الكبيرة عن طريق الترشيح (مناسبة بشكل جيد لمثل هذه العينة المخففة) ، لإنتاج مكتبات طلقات نارية منها عن طريق التضخيم العشوائي (1). بدأ علماء الفيروسات البحرية أيضًا في تقدير تنوع الفيروسات البحرية (13,27,30) وإعادة بناء أعداد كبيرة من الجينومات الفيروسية الكاملة. في دراسة واحدة (2) ، تم تركيز عينة سعة 200 لتر من مياه البحر السطحية

تم استرداد 2 × 10 12 جسيمًا فيروسيًا ، وتم قص الحمض النووي واستنساخه بشكل عشوائي وتم تسلسل 1934 شظية. أظهر تحليل التاريخ أن معظم التسلسلات كانت من فيروسات غير معروفة سابقًا. تداخل ما يقرب من 3.5 ٪ من إجمالي عينات التسلسل ، مما يشير إلى أن المجتمع الفيروسي البحري كان شديد التنوع. تحليل رياضي فريد (2) اقترح كذلك أن أقل من 10 4 أنواع فيروسية مختلفة كانت موجودة وأن تسلسل البنادق الأكثر وفرة يمكن إجراؤه ، مع المرافق الموجودة ، في شهر واحد. على الرغم من أن الجهود المبذولة حتى الآن تركز على الفيروسات ذات جينومات الحمض النووي ، فإن معظم مسببات الأمراض الفيروسية البشرية لديها جينومات الحمض النووي الريبي. لذلك يجب تحضير مكتبات التسلسل الجينومي من مزيج من فيروسات الحمض النووي الريبي المفرد والمزدوج الشريطة (يتم إنشاء الأخير عن طريق النسخ العكسي).

تنبع جدوى تجميع الجينوميات ومكونات التعليق التوضيحي لهذا المشروع من إثبات أن الجينوم البشري بأكمله يمكن تجزئة ، وتسلسل الشظايا ، وإعادة بناء التسلسل الأصلي من التداخلات ، حيث توجد الآن قدرة التسلسل الوفيرة في البحث عن مشاريع ذات قيمة عالية و أن علماء الفيروسات البحرية قد نجحوا في مشاريع موازية. ويتمثل التحدي في تقصير وقت العملية برمتها بحيث يمكن الحصول بسرعة على بيانات الاستجابة الوبائية والإرهاب الفيروسي المفيدة.

التحديات المتبقية

يبدو أن استعادة الفيروسات من تجمعات كبيرة من مصل الدم والبلازما البشرية واستنساخ الأحماض النووية الفيروسية وتسلسلها بشكل روتيني (باستخدام نهج البندقية) أمر ممكن تقنيًا. وبالتالي ، يمكن تقدير عيارات العديد من مسببات الأمراض الفيروسية البشرية المعروفة بشكل روتيني ، ويمكن اكتشاف فيروسات جديدة (مسببة للأمراض وغير مسببة للأمراض) بشكل منهجي.

الاختيار الأولي بين الترشيح والطرد المركزي. تحتوي مياه البحر على القليل من المواد الملوثة لحجم وكثافة جزيئات الفيروس ، والترشيح بسيط وفعال ، ولم يتم الإبلاغ عن أحماض نووية حرة. يمثل البلازما والمصل مشاكل مختلفة ، معقدة بسبب وجود كميات كبيرة من البروتين ، وبعض الجسيمات غير الفيروسية في نافذة الفيروس ، وكميات متغيرة من الأحماض النووية غير الفيروسية القابلة للذوبان (31) التي يجب إزالتها. تتمثل إحدى ميزات طرق الطرد المركزي في أن جميع عمليات الفصل ، وصولاً إلى النطاقات في تدرجات ميكروليتر ، يمكن (وقد تم) القيام بها مع الفيريونات المعلقة ، وهي عملية تتجنب التجميع الذي قد يحدث على أسطح المرشح.

لا يزال يتعين معالجة العديد من الأسئلة الرئيسية في مشروع عملي: 1) هل يمكن تنفيذ هذه العملية بالسرعة الكافية لدعم الاستجابة العلاجية أو الوقائية في الوقت المناسب لعامل جديد (طبيعي أو مصمم هندسيًا)؟ 2) هل سيتم استرداد واكتشاف الفيروسات الجديدة التي نشأت من شخص مصاب أو عدد قليل جدًا من الأشخاص؟ 3) هل يمكن تحديد مكان المتضررين؟

سرعة العملية

يمكن جمع العينات أسبوعياً ، ونقل المواد بسرعة إلى موقع معالجة واحد أو أكثر. يتطلب عزل الفيروسات ، وبناء المكتبة ، وإعداد النسخ للتسلسل 7 أيام ، ولكن قد يتم ضغط الوقت لمدة 4 أيام مع تشغيل لمدة 24 ساعة في اليوم. سيتم تحديد وقت التسلسل حسب السعة المتاحة ، ولكن نظرًا لأن السعة وفيرة ، مع وجود زيادات كبيرة في الأفق ، يمكن تنفيذ تسلسل مكتبة واسع النطاق (على سبيل المثال ، 10-100 ميجا بايت) في 2 إلى 3 أيام. ستكون هناك حاجة إلى أقل من يوم واحد لتجميع الجينومات الفيروسية مثل contigs في silico. من خلال توصيل كل خطوة بالتسلسل ، يمكن إكمال التحول (تجمع المصل إلى بيانات التسلسل الأولي) في حوالي 10 أيام تشغيل. قد يتطلب الأمر وقتًا إضافيًا لتحليل المعلوماتية الحيوية للبيانات والتعليقات التوضيحية ، ولكن يجب أن تكون الاستنتاجات المتعلقة بالانتشار والحداثة متاحة على الفور تقريبًا. تفترض هذه التقديرات وجود نظام متكامل ومتطور بالكامل في عملية مستمرة ، مشابه في بعض النواحي لأولئك الذين يراقبون فيروسات الكمبيوتر.

حساسية

من الصعب تقدير كتلة الفيروس التي تم استردادها في النهاية من البلازما البشرية المجمعة مسبقًا. إذا كان متوسط ​​كتلة الفيروس 1.0 × 10-15 جم إذا كان متوسط ​​عيار الشخص المصاب هو 10 6 فيريونات / مل ، وإذا كانت نسبة 0.1٪ من العينات من مرضى فيروسي ، إذن

سيتم استرداد 0.5 ميكروغرام من الفيروسات من كل تجمع سعة 500 لتر ، أي أكثر بكثير من عدد النانوجرامات القليلة المطلوبة لإنشاء مكتبة كبيرة مع التكنولوجيا الحالية (1,2). إذا كان متوسط ​​العينة المساهمة في البركة 1 مل ، وإذا كان الفيروس المركز النهائي في 1 مل ، فإن التركيز النهائي لفيروس جديد تمامًا سيكون قريبًا من ذلك في العينة الفردية الأصلية. وبالتالي ، فإن إمكانية اكتشاف جميع الفيروسات التي تتوفر لها مواد أولية لتفاعلات البلمرة المتسلسلة (PCR) ، وصولاً إلى مساهمات المرضى الفرديين.

مدى ديناميكي

يمكن معالجة مشكلة النطاق الديناميكي بثلاث طرق. أولاً ، نظرًا لقدرة التسلسل الكبيرة ، يمكن للمرء أن يتسلسل بعمق في المكتبات (ملايين من الحيوانات المستنسخة بدلاً من بضعة آلاف) ، وبالتالي يكتشف أجزاء لكل مليون تسلسل. ثانيًا ، يمكن للمرء تطبيق طرق تقارب قائمة على الجسم المضاد لاستنفاد الجسيمات الفيروسية المعروفة من العينة الفيروسية المركزة الأولية. ثالثًا ، يمكن للمرء استخدام التهجين الطرحي لإزالة التسلسلات الجينومية الفيروسية المعروفة لزيادة إثراء المكتبات في الجينومات الجديدة. يمكن تمديد النهجين الأخيرين بشكل تدريجي حيث يتم تمييز الفيروسات لتوفير زيادة مستمرة في الحساسية للعوامل الجديدة (الشكل).

تحديد المصادر الفيروسية

يمكن استخدام طريقتين ، إذا لزم الأمر ، لربط الفيروسات بالمرضى. في النهج الأول ، سيتم تتبع الفيروسات جغرافيًا ، أولاً من حيث المناطق الكبيرة ، ثم بالتتابع ، من حيث المناطق الأصغر. وبالتالي ، سيتكرر اكتشاف عامل جديد في عينات مجمعة كبيرة في تجمعات محلية أصغر حجمًا تم دمجها بشكل هرمي لإنشاء المجموعة الأكبر (32).

يتضمن النهج الأكثر كفاءة تداخلًا في المسابح الفرعية المصممة بحيث يمكن تقييم تسلسل فيروسي جديد (على سبيل المثال ، عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل) في الوحدات الفرعية والأشخاص المتأثرين المحددين في خطوة واحدة. لتحقيق هذه النتيجة ، تتم إضافة كل عينة إلى سلسلة من التجمعات المختلفة ، وتوفر هوية هذه المجمعات الفرعية "عنوانًا" للعينة (33). يمكن تصور هذه العملية عن طريق القياس على رقعة الشطرنج ثلاثية الأبعاد ، حيث يمثل كل موضع عينة ، والوحدات الفرعية هي المستويات المختلفة الموازية للجزء العلوي والأمامي والجانب: ستساهم كل عينة في ثلاث مجموعات فرعية. من الناحية العملية ، سيتم إنشاء مجمعات إضافية لتوفير وسيلة لا لبس فيها نسبيًا للتراجع عن نمط المجموعات الفرعية الإيجابية لتسلسل محدد إلى شخص واحد أو عدد قليل من الأشخاص.

مسببات الأمراض الفيروسية التي قد تكون مفقودة

لن يتم اكتشاف جميع مسببات الأمراض الفيروسية البشرية بسهولة عن طريق تحليل عينات البلازما أو المصل. توجد الفيروسات الموجه للأعصاب مثل داء الكلب ، على سبيل المثال ، في الخلايا والأنسجة ولا تظهر خالية في المصل أو البلازما بكميات ملحوظة. وبالتالي ، فإن هذه الفيروسات سوف تفلت من نظام الفحص الموصوف حتى هذه النقطة. على الرغم من أن استخدام داء الكلب للإرهاب الفيروسي أمر غير مرجح ، فإن مثل هذه الفيروسات لها أهمية كبيرة للصحة العامة ، ويجب في النهاية بذل الجهود لإدراجها في أي نظام فحص عالمي.

يشير الدوران السريع للفيروسات الموجودة في البلازما إلى إزالتها في الخلايا ، ويبدو أن هذا صحيح بشكل عام. تم تطوير تقنية الطرد المركزي S-في الأصل لتجزئة الخلايا بهدف عزل الفيروسات من الأورام والخلايا والأنسجة (5). يمكن إضافة كميات ضئيلة من الفيروس إلى متجانسات الأنسجة واستعادتها في حالة عالية من النقاء. لذلك توجد التكنولوجيا الأساسية لعزل الفيروسات من الخلايا الليمفاوية ومجموعة متنوعة من الأنسجة المختلفة. في مرحلة لاحقة ، يجب تطبيق النهج المقترح على الدم الكامل (مع إفراز الخلايا قبل التعافي من الفيروس) ، وغسيل الأنف ، والأنسجة ، والعينات الأخرى التي يحتمل أن تكون محملة بالفيروسات.

الأتمتة والاحتواء

للكشف بشكل روتيني عن فيروسات جديدة وربما قاتلة ، قد يحتاج الباحثون إلى إنشاء مختبرات مؤتمتة بالكامل ومحتوية تبحث باستمرار عن الفيروسات وتسلسلها من مجموعة متنوعة من المصادر لصقل المهارات لإثبات الكفاءة وتطوير أنظمة وطرق وكواشف محسنة.

كان الاحتواء مصدر قلق كبير في مشروع مانهاتن الأصلي للتعامل مع المخاطر الإشعاعية ، وفي مشروع أوك ريدج للطرد المركزي (34) لاحتواء العوامل المعدية. تطورت أنظمة الاحتواء منذ ذلك الحين في اتجاهين. في العلوم البيولوجية ، تركز الاهتمام على المخططات للسماح للباحثين بالعمل في بيئة آمنة باستخدام نفس الأدوات التي قد يستخدمونها على مقاعد البدلاء المفتوحة. ونتيجة لذلك ، تطورت التصاميم التي تم تضمين المشغلين البشريين فيها في "بدلات فضائية". في المقابل ، في البرامج النووية (حيث نشأت أنظمة الاحتواء فعليًا) ، يتم عزل المشغلين تمامًا عن محتويات "الخلايا الساخنة" ، وتتم العمليات في هذه الخلايا عن بُعد باستخدام معدات مصممة خصيصًا. نظرًا للحاجة الملحة على المستوى الوطني للأنظمة الآلية للدراسات الفيروسية ، يجب تطوير أنظمة آلية آلية تمامًا ، مماثلة لتلك المستخدمة في الأبحاث النووية ، لأن 1) العينات المركزة المراد تحليلها يحتمل أن تكون خطيرة للغاية ، 2) يجب أن يتم العمل دون انقطاع ، و 3) تعتمد السرعة والدقة على الأتمتة. على الرغم من أن أجهزة الطرد المركزي K-II لم يتم تشغيلها آليًا حتى الآن للتشغيل عن بُعد تمامًا ، بما في ذلك التنظيف بين عمليات التشغيل ، إلا أن هذه ليست مشكلة ساحقة ويجب أن تشتمل على أجهزة طرد مركزي متتالية ، كما حدث للعزل الشامل لأجسام Tussock Moth متعددة السطوح (15).

الإيجابيات الكاذبة والسلبيات الكاذبة وثمن الأخطاء

جميع الاختبارات التشخيصية الحالية لديها القدرة على الحصول على نتائج سلبية كاذبة وإيجابية كاذبة. ومع ذلك ، في جو الهجوم الإرهابي الفعلي بعامل بيولوجي ، فإن عواقب هذه النتائج الكاذبة تضع ضغطًا هائلاً على الخدمات العامة ، كما يتضح من حلقات الجمرة الخبيثة الأخيرة. تؤدي النتيجة الإيجابية الخاطئة إلى استجابات مزعجة للغاية ، في حين أن النتيجة السلبية الكاذبة تعرض السكان لمخاوف صحية واضحة. النهج الموصوف هنا يقلل من إمكانية حدوث مثل هذه النتائج ويفترض فقط أن الفيروس لديه الخصائص الفيزيائية الحيوية المتوقعة للحجم والكتلة والجينوم الداخلي. إذا تزامن جسيم مع الخصائص الفيزيائية الحيوية المناسبة مع جينوم داخلي يرمز للبروتينات الهيكلية الموجودة أيضًا في نفس الكسر ، فإن العدد المحتمل للخطأ الإيجابي الخاطئ يكون صغيرًا بشكل مقبول وهناك آليات قليلة يمكن بواسطتها وجود دليل كاذب لعدم وجود حقًا قد ينبثق التسلسل الفيروسي من العملية الموصوفة. لا يعتمد مستوى السلبيات الكاذبة على الجودة الإجمالية للتحليل فحسب ، بل يعتمد أيضًا على حساسيته للأحداث النادرة ، أي النطاق الديناميكي. بالنسبة للتحليلات المستندة إلى التسلسل ، تعتمد الحساسية على التردد الذي يظهر به التسلسل في مكتبة الأجزاء ، وعدد النسخ المستنسخة ، وكفاءة طرح الفيروسات المعروفة (إذا تم تطبيقها) ، وعدد النسخ المختلفة المتسلسلة.

عدد الإيجابيات الكاذبة المتعمدة (الخداع) مسألة أخرى وواحدة لها جانبان. أولاً ، الإدخال المتعمد لمسببات الأمراض غير المتوقعة أو جيناتها في نظام تحليلي عالمي هو بحد ذاته عمل إرهابي ويجب اكتشافه ومعرفته. لإدخال كمية كبيرة من الجسيمات الفيروسية القابلة للاسترداد في نظام جمع العينات ، سيتعين على الشخص الذي يحاول خداع النظام هندسة هذه الفيروسات وتنميتها - وهو عمل قريب بدرجة كافية من الاستخدام الفعلي للإرهاب البيولوجي الذي يتطلب الكشف ، سواء كان العامل خطيرًا الممرض البشري أم لا. يتعلق الجانب الثاني بأفضل رد على الاشتباه في حدوث مثل هذا الخداع. سيكون التسلسل الكامل للعامل (العوامل) المعني أمرًا مهمًا لأنه لا يمكن للمرء في البداية التمييز بين عينة حقيقية من تلك المستخدمة في الخداع. فقط بعد دراسات إضافية مكثفة وإثبات عدم حدوث تفشي ، يمكن تحديد أن العينة ليست من أصل المريض.

أعذر من أنذر. بالنظر إلى الإخطار المسبق ، حتى بأسابيع ، بانتشار الفيروس الوشيك ، فإن الأمل موجود في أن أدوات وتصورات البيولوجيا الجزيئية سوف تجد الوسائل اللازمة لإعداد بعض دفاع بيولوجي فعال.

المساهمات الطبية للمراقبة العالمية

مشكلة تطوير عوامل جديدة مضادة للفيروسات ، خاصة تلك الخاصة بمرض فيروسي واحد أو عدد قليل من الأمراض الفيروسية ، هي مشكلة دائرية. بدون مثل هذه العلاجات ، لا يكون التحديد السريع للعامل ضروريًا ، ولكن بدون هذا التحديد لا يوجد مبرر تجاري ملح لتطوير عوامل مضادة للفيروسات محددة (باستثناء فيروس نقص المناعة البشرية) لأنه لن يتم استخدامها على نطاق واسع. لكي تكون ناجحًا ، يجب ربط التشخيص والعلاج. سيساعد هذا المشروع في إقامة هذا الارتباط.

استنتاج

Isolating and sequencing the genomes of a wide variety of viruses from pools of the excess human serum and plasma currently collected and discarded by large diagnostic laboratories is now technically feasible. This collection and analysis process could allow new or unknown pathogens to be identified in the first, or at most second, round of infection. Not all human viral pathogens will be present in such mixtures, but they will include a large fraction of all known highly infectious viral agents. Since the core technologies, though varied, are highly developed, we believe that the initial feasibility studies could be completed in 1 year.

Former Senator Sam Nunn and William H. Wulf, president of the National Academy of Engineering, have both proposed setting up a project concerned with bioterrorism, modeled after the Manhattan Project. We believe that the project described could form the nucleus of such an effort and suggest that lessons learned in the Oak Ridge centrifuge project may apply. As noted by Alvin Weinberg, that project was the first (and hopefully not the last) large-scale project in the biological sciences in which facile access to a wide range of technologies was provided, on the model of the original Manhattan Project (35).

In separate articles, we will discuss the possibility of linking rapid detection to rapid responses, including vaccine and therapeutic antibody development, in an attempt to abort epidemics caused by new viruses while they are in progress.

Dr. Anderson was director of the Molecular Anatomy Program at the Oak Ridge National Laboratory, held a similar position at the Argonne National Laboratory, was chief scientist at Large Scale Biology Corporation, and is now president of the Viral Defense Foundation. His chief interests include proteomics, virology, and biophysical separations.

إعتراف

We acknowledge with gratitude the continuing support and encouragement of Alvin Weinberg, who was director of the Oak Ridge National Laboratory when the original development was done.

مراجع

شكل

يرجى استخدام النموذج أدناه لإرسال المراسلات إلى المؤلفين أو الاتصال بهم على العنوان التالي:

* Norman G. Anderson, Viral Defense Foundation, Box 2126, Kensington, MD 20891, USA fax: 301-770-9091

أرسل التعليق بنجاح ، شكرا لك على ملاحظاتك.


Bats as unique virus hosts

Viral persistence in bat cells and populations

Shedding of zoonotic viruses from bat populations can vary considerably in space and time 29 , with peaks in shedding sometimes coinciding with spillover to other species 30,31 . Understanding the mechanisms that drive the circulation of bat viruses in populations, including causes of peaks in shedding, is necessary to predict when and where spillover may occur. Another key requirement is understanding the biology of these infections in bats. If zoonotic infections cause a simple dynamic of acute infection followed by recovery and resistance 32 , as originally assumed for henipaviruses and sometimes assumed for filoviruses 33 , then epidemic cycles will be driven by oscillating herd immunity, connectivity, population size and other factors that drive transmission among bats 34 . Some observations have been inconsistent with this susceptible-infectious-resistant framework, for example, the lack of an association between high virus prevalence and large host population size 35 , whereas other observations suggest that this dynamic may be possible, for example, the short infectious periods in bats inoculated in captivity 36 . Other studies hint at persistent and/or recurrent infection in bats. If bats are persistently infected, immune competence may control shedding, and factors such as stress would drive shedding peaks 34 . For example, there is anecdotal evidence of captive bats seroconverting against Nipah virus after a period of seronegativity, suggesting that persistent infection and episodic shedding may be possible 17,34 . A recent observation of bats synchronously shedding multiple paramyxoviruses during a pulse of Hendra virus shedding is more easily explained by a population-level stressor affecting host immune competence however, there could be other explanations 37 . Curiously, naive Rousettus aegyptiacus bats became infected with Marburg virus months after an inoculation and transmission experiment had ceased, suggesting that Marburg virus persisted within the small group of 36 experimental bats for 7 months 38 . A parsimonious explanation for this is persistent infection in one or more individuals.

Within-host cycles of infection in bats have been extremely difficult to determine, and the data required to assess competing hypotheses have not yet been available. Results from inoculation experiments in bats have been difficult to interpret 36 , and the limited duration of almost all bat virus experiments precludes investigations into viral persistence within hosts 34 . Ideally, genetic data from viruses infecting individually marked bats over time could be used to determine if viruses persist within individuals 34 , but recapturing most bats is extremely difficult, and few studies collect data longitudinally 29 . Recently, researchers have been able to make inferences about viral circulation in bats by fitting mathematical models of disease dynamics to longitudinal serological data. A study using such methods 39 determined that persistence or reinfection of a circulating henipavirus was likely in Eidolon helvum bats. Research combining longitudinal sampling of bats with viral genomics, antibody surveys and mathematical models will be required to infer zoonotic pathogen circulation in bats 34 .

Intrinsic bat resistance

Bats are seemingly refractory to viral pathogenesis, and their metabolism has been at the centre of the long-standing ‘flight as fever’ hypothesis underlying this phenomenon 40,41 . Several groups have speculated that the high-energy metabolic demands of flight lead to elevated body temperatures in bats, mimicking the fever that occurs in other animals during immune activation, which may broadly impact viral pathogenesis. However, experimental studies have shown that filoviruses replicate similarly in bat cells regardless of ambient temperatures 37,42 . Beyond body temperature, knowledge gaps on bat reservoir species and their flight behaviour, immunity and metabolism obscure how bat metabolism relates to immunity.

Innate bat immunity

Although viruses such as Nipah virus and Marburg virus have been experimentally shown to replicate in and shed from their bat host species, a striking feature of these infections is that the bats lack overt signs of pathology 36,43,44,45 . The observation that bats may be refractory to, or tolerant of, viral infection was noted as early at 1936 (ref. 46 ), yet the immunological mechanisms that underpin this phenotype have only begun to be elucidated in the past few years. Current data suggest that the classical pathology caused by strong activation of the immune system in response to viral infection that is seen in humans and laboratory animal models does not occur in bats 37,47 . The lack of pathology observed in bats is likely due to a combination of differences in viral tissue tropism and host immune responses 48 . Viral replication and shedding in bats in combination with an apparent lack of disease may allow for the efficient maintenance and dissemination of viruses.

Interferon-ɑ (IFNα), IFNβ and IFNɣ pathways vary in their level of activation between bat and human cells in response to viral infection 49,50,51,52 . Some of these studies have shown dampened immune responses in bats, whereas others have shown heightened responses to infection. The consequences of these differences for overall pathology in bats are still to be determined. A notable finding common to all of these studies is that, regardless of the host species, all of the bat cell lines tested support filovirus infection, suggesting that the innate immune pathways assessed in these cell culture assays do not form barriers to infection.

Broader characterizations of bat innate immunity have provided some insights into the differences between bat and human immune responses. على سبيل المثال، Pteropus النيابة. bats have a substantially smaller type I interferon genomic locus than other mammals, yet they have constitutive basal expression of their IFNɑ genes, regardless of stimulation 53 . How a smaller type I interferon locus might influence viral disease is unknown but, presumably, a smaller locus will translate into a different type of response than the one observed in other animals. Additionally, compared with Rousettus النيابة. bats, which have a more diverse type I interferon locus and strongly induce type I interferon in response to viral infection 54,55 , bats in the genus Pteropus mount a stronger type III interferon response 56 . However, given that there are 21 bat families, over 200 genera and 1,400 extant species of bats 1 , conclusions regarding general features of bat immunity and their implications for viral infection should be reserved.

Adaptive bat immunity

The adaptive humoral immune response, mediated by antibodies, is as enigmatic as the innate immune system in bats. Long-term laboratory experiments with Marburg virus challenge in the Egyptian fruit bat 57 and with rabies virus challenge in the insectivorous big brown bat 58 showed that, although antibodies to the respective pathogens arose, they rapidly waned below detectable levels after

3 and 5 months, respectively. Although bats had low levels of antibodies to Marburg virus 22 months after the initial challenge, re-challenge resulted in dramatically reduced dissemination and viral spread 57 . ومن المثير للاهتمام، R. aegyptiacus challenged with Ebola virus, Marburg virus or Sosuga virus generated detectable antibody responses post challenge, but none of the antisera could neutralize the live virus, suggesting that antibody-dependent cell-mediated responses are crucial in the viral clearance of these viruses 59 . By contrast, bats generate virus-neutralizing antibodies to Nipah virus 60 and rabies virus 61 upon experimental challenge however, live virus may be concurrently detected in saliva or urine, suggesting incomplete virus clearance. Curiously, Sosuga virus and Nipah virus are both paramyxoviruses and yet elicit different types of antibody responses — the mechanisms and underlying reasons are unclear. Recent studies support the notion that the immune response in bats is adapted for pathogen tolerance and regulated to mitigate immunopathology, potentially promoting incomplete viral clearance and asymptomatic infection 55,62 . Undoubtedly, the complex evolutionary history between bats and their viruses plays a role in how and when the bat immune system is stimulated in response to viral infection thus, broad conclusions from single pathogen and single host studies should remain tempered.

Challenges of studying viral infections in bats

A major problem facing all studies of bat-derived virus cell biology is the lack of available reagents and animal models (Box 2), compounded by the enormous taxonomic diversity of these animals. Most mammalian cell lines currently available are not derived from bats and do not support replication of the majority of viruses being discovered. For example, the isolation of bat-derived coronaviruses has been challenging owing to a limited ability to infect the standard, typically primate-derived, cell lines used in most laboratories 14,63,64 . Even cell lines derived from the same bat species that the viruses were originally sequenced from may fail to support replication owing to loss of expression of the host receptor 65 . Thus, there is an urgent need for more cell culture reagents that can better facilitate virus isolation, either new cell lines capable of supporting replication of bat viruses or genetically modified versions of existing cells, such as Vero cells, to increase their susceptibility to viral infection with bat viruses. Ideally, these new cell lines should be derived from a wide range of species and tissues. In addition, organoid systems incorporating multiple cell types within a 3D architecture to reproduce tissue-specific functional properties could potentially facilitate the translation from in vitro single-cell type studies to organ-specific host–pathogen interaction studies. Lastly, live animal models will also be crucial for understanding the implications of molecular findings in bat cells for the course of infection in the natural host.

Whereas large-scale CRISPR–Cas9-mediated knockout and activation screens have been valuable for identifying human proteins involved in viral infection, they have yet to be applied to other host species, including bats. Given that an annotated transcriptome is now available for the R. aegyptiacus bat 66 , similar screens could be performed in Rousettus cells to elucidate the factors involved in filovirus infection, for example. The ambitious Bat1K project has begun the process of generating genome sequence data for all extant bat species 67 , and the results of this effort will undoubtedly be an invaluable resource in elucidating specific bat–pathogen interactions.

Many of the earliest studies of bat immunity focused on the humoral adaptive immune response in bats, yet we still lack an understanding of the regulation of B cell proliferation, affinity maturation and the mechanisms underlying the transitory nature of bat antibody responses. Countless studies have conducted serological surveillance for antibodies to specific viruses in wild bats however, there is relatively little experimental data with bats as a model system, particularly spanning longer periods of time. The information available from field-collected samples is limited by the unknown history of sampled bats with regard to their reproductive status, age, sex, nutritional status and infection status, with any number of pathogens potentially influencing the immune response.

Box 2 Bats as animal models

Although a growing number of laboratories are studying infectious diseases that emerged from bats in laboratory settings, there are few examples of bat species being successfully established as animal models 170 . This is in part owing to the unique handling requirements for volant animals, challenges with keeping many insectivorous bats fed and healthy and difficulties in supporting complex behavioural adaptations (for example, hibernation for temperate bats). These challenges are compounded by a limited availability of breeding stock, regulations on importation of live animals and the high costs of maintaining animals in biosafety level 3 or 4 facilities, which are required for virus studies. Nevertheless, several bat species have been established as animal models, including Pteropus النيابة. for Nipah and Hendra virus, Eidolon helvum for African Henipaviruses, Rousettus aegyptiacus for Marburg virus, Artibeus jamaicensis for Zika virus, MERS-CoV and rabies virus and Myotis lucifugus for the fungal disease white nose syndrome 36,43,60,120,171,172,173,174 . These studies have led to valuable discoveries, for example, showing that R. aegyptiacus, from which Marburg virus was isolated, is refractory to infection with many other viruses that are associated with other bat reservoir species 19,44,45,120,121 , making the broad use of this bat species in disease pathology modelling questionable. Beyond the technical challenges of working with these animals, a bigger issue with bats as animal models lies in our fundamental approach to disease modelling: almost all currently established animal models in virology are centred on severe disease phenotypes and high levels of viral replication. This custom contrasts with our current understanding of bat virus biology, which assumes that bats exhibit minimal pathology and likely low levels or short temporal bursts of viral replication. Recent experimental infection studies with Tacaribe virus and Lagos bat virus in their respective natural reservoir bat species 175,176 resulted in severe disease and mortality, showing that the paradigm that bats are resistant to highly pathogenic viruses should be addressed at the level of specific host–pathogen interactions rather than as a generalization for a complete animal order. Comparative studies between animal models of human disease and bat animal models are needed to understand the mechanisms responsible for the differences in disease severity of bat-borne viruses observed in natural reservoir and spillover host species.


MM and HC drafted the article. MM and HC provided critical revision of the article. SB carried out native editing. NP and AE developed the theory to investigate a specific aspect and supervised the findings of the work, as well as conceived the presented idea. MM, HC, AS, SB, NP and AE discussed the results and contributed to the final manuscript submitted for publication.

Mohamadian M, Chiti H, Shoghli A, Biglari S, Parsamanesh N, Esmaeilzadeh A. COVID�: Virology, biology and novel laboratory diagnosis . J Gene Med . 2021 23 :e3303 10.1002/jgm.3303 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Malihe Mohamadian and Hossein Chiti contributed equally to this work.


Frequently bought together

إعادة النظر

Viruses interact with host cells in ways that uniquely reveal a great deal about general aspects of molecular and cellular structure and function. Molecular and Cellular Biology of Viruses leads students on an exploration of viruses by supporting engaging and interactive learning. All the major classes of viruses are covered, with separate chapters for their replication and expression strategies, and chapters for mechanisms such as attachment that are independent of the virus genome type. Specific cases drawn from primary literature foster student engagement. End-of-chapter questions focus on analysis and interpretation with answers being given at the back of the book. Examples come from the most-studied and medically important viruses such as HIV, influenza, and poliovirus. Plant viruses and bacteriophages are also included. There are chapters on the overall effect of viral infection on the host cell. Coverage of the immune system is focused on the interplay between host defenses and viruses, with a separate chapter on medical applications such as anti-viral drugs and vaccine development. The final chapter is on virus diversity and evolution, incorporating contemporary insights from metagenomic research.

Key features: Readable but rigorous coverage of the molecular and cellular biology of viruses Molecular mechanisms of all major groups, including plant viruses and bacteriophages, illustrated by example Host-pathogen interactions at the cellular and molecular level emphasized throughout Medical implications and consequences included Quality illustrations available to instructors Extensive questions and answers for each chapter.

"Lostroh does an excellent job of balancing information with detail to produce a textbook that will be valuable to both instructors and students of introductory virology."

- Pranav Danthi, Indiana University, Bloomington, Indiana

About the Author

Professor Phoebe Lostroh is a molecular microbiologist whose research has focused on bacterial "sex." She has recruited a diverse team of undergraduate researchers at Colorado College where she has won multiple awards, such as the Theodore Roosevelt Collins Outstanding Faculty award for teaching, mentoring, and advising students of color and first-generation students. Her research has been supported by the NSF (2009-2018), NIH (1994-2003), and the Keck foundation (2001-2003). She’s a volunteer comedienne with Science Riot, which brings science to the public through stand-up routines, and is the lead singer on Rejoice! an album of songs for activists.


شاهد الفيديو: تطبيق رياضي على مربع بانيت (ديسمبر 2022).