معلومة

8.3: تحضير العينة - علم الأحياء

8.3: تحضير العينة - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تحضير العينات الخاصة بك للرحلان الكهربائي أثناء معالجة الجل عن طريق إضافة عازلة تحميل مركزة. يحتوي المخزن المؤقت للتحميل أيضًا على الجلسرين ، مما يجعل العينة كثيفة بدرجة كافية لتغرق في قاع العينة جيدًا.

إضافة 4 ميكرولتر من 6X تحميل المخزن المؤقت مباشرة إلى كل من تفاعلات PCR 20 ميكرولتر من المختبر الأخير. باختصار ، قم بالطرد المركزي لكل أنبوب لخلط الصبغة والعينات ، إذا لزم الأمر. ستستخدم نصف كل عينة في المواد الهلامية. قم بتخزين العينة المتبقية في الثلاجة.


8.3: تحضير العينة - علم الأحياء

مبدأ الصفحة الأصلية:

تستخدم الصفحة الأصلية نفس واجهات أيون الجليسين والكلوريد المتقطع مثل SDS-PAGE لتشكيل حدود متحركة تتراكم ثم تفصل عديد الببتيدات حسب نسبة الشحنة إلى الكتلة. يتم تحضير البروتينات في عينة عازلة غير مقلصة وغير مفسدة للطبيعة ، والتي تحافظ على البنية الثانوية للبروتينات وكثافة الشحنة الأصلية. لذلك يمكنك بسهولة رؤية نطاقات متعددة من لقطة الكاميرا الخاصة بهلام PAGE الأصلي إذا كان البروتين المستهدف يحتوي على أشكال بلمرة في عينتك. في الرحلان الكهربي الأصلي PAGE ، تحتوي معظم البروتينات على pl حمضية أو قاعدية قليلاً (نقطة متساوية الكهربي) (

3-8) والهجرة نحو القطب السالب. إذا كان حجم البروتين أكبر من 8،9 ، على سبيل المثال ، فمن المحتمل أن تقوم بعكس الأنود وتشغيل هلام PAGE الأصلي.

تعرف على المزيد حول Native-PAGE:

  • بالنسبة لنظام الرحلان الكهربائي ، يوصى باستخدام نظام إشعاع حيوي.
  • للحصول على هلام التراص PAGE الأصلي 5 مل

*: تمت إضافته مباشرة قبل كل استخدام.

للحصول على هلام فصل PAGE الأصلي 10 مل:

نسبة مادة الأكيلاميد 6% 8% 10% 12% 15%
أكريلاميد / ثنائي أكريلاميد (30٪ / 0.8٪ وزن / حجم) 2 مل 2.6 مل 3.4 مل 4 مل 5 مل
0.375 م تريس- حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8.8) 7.89 مل 7.29 مل 6.49 مل 5.89 مل 4.89 مل
* 10٪ (وزن / حجم) بيرسلفات الأمونيوم (AP) 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر
* تيميد 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر

*: تمت إضافته مباشرة قبل كل استخدام.

عينة المخزن المؤقت (2x):

62.5 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 6.8
25٪ جلسرين جلسرين
1٪ بروموفينول بلو

25 ملم تريس
192 ملي جليكاين

ملاحظة: يجب أن يكون تشغيل المخزن المؤقت

8.3 درجة الحموضة. لا تقم بضبط الأس الهيدروجيني.

بروتوكول تشغيل الجل:

1. تحضير كمية مناسبة من هلام الفصل في دورق صغير ، ثم إضافة حجم معين. من AP و TEMED وقم بتدوير الأداة برفق لضمان الخلط الكافي. امص محلول الجل في الفجوة بين الألواح الزجاجية لصب الجل (لا تملأ بالكامل). املأ المساحة المتبقية بالماء (بدلاً من الأيزوبروبانول). اسمح لمدة 20-30 دقيقة للحصول على هلام كامل.

2. يمكنك تحضير محلول التراص بينما هلام الفصل هو الهلام. قم بإعداد كمية مناسبة من هلام التراص في وعاء صغير واخلطه مع 10٪ AP و 1٪ TEMED. اسكب الماء في الخطوة الأولى واضرب محلول هلام التراص في الفجوة وأدخل المشط. السماح لمدة 20-30 دقيقة للسماح لها بالهلام.

3. مزج عينتك مع عينة عازلة. لا تسخن عينتك!

4. قم بتحميل خليط العينة واضبط الجهد الكهربي المناسب لتشغيل الرحلان الكهربي.

ملاحظة: من الأفضل وضع النظام على الجليد وعدم ضبط فولت مرتفع نسبيًا في حالة تحلل البروتينات.

5. وصمة عار كما تفعل مع بروتوكول كوماسي الأزرق القياسي أو انتقل إلى إجراء النشاف المناعي (لطخة ويسترن).


8.3: تحضير العينة - علم الأحياء

بروتوكول PAGE-SDS Laemmli


٪ أكريلاميد 10% 10% 12% 12% 15%
عدد Minigels 5 8 5 8 5
1.5M TrisHCl درجة الحموضة 8.3 + 0.4٪ SDS 7.0 مل 10.5 مل 7.0 مل 10.5 مل 7.0 مل
30% أكريلاميد 0.8٪ ميثيلين مكرر أكريلاميد 9.3 مل 13.9 مل 11.3 مل 16.9 مل 13.9 مل
ح 2 ا 12.3 مل 18.4 مل 9.3 مل 13.9 مل 6.3 مل
10٪ APS 100 ميكرولتر 150 ماي 100 ميكرولتر 150 ماي 100 ميكرولتر
تيميد 23 ماي 35 ماي 23 ماي 35 ماي 23 ماي

٪ أكريلاميد 10% 10% 12% 12% 15%
عدد Minigels 5 8 5 8 5
1.5M TrisHCl درجة الحموضة 8.3 + 0.4٪ SDS 7.0 مل 10.5 مل 7.0 مل 10.5 مل 7.0 مل
40% أكريلاميد / ميثيلين مكرر أكريلاميد (النسبة: 37.5: 1) 7.2 مل 10.8 مل 8.6 مل 12.9 مل 10.8 مل
ح 2 ا 14.4 مل 21.5 مل 12 مل 17.9 مل 9.4 مل
10٪ APS 100 ميكرولتر 150 ماي 100 ميكرولتر 150 ماي 100 ميكرولتر
تيميد 23 ماي 35 ماي 23 ماي 35 ماي 23 ماي

أضف TEMED و APS في النهاية. قم بتدوير القارورة برفق حتى تختلط ، مع الحرص على عدم توليد فقاعات. ماصة المحلول إلى مستوى 4 سم من الأعلى. أضف 0.3 مل من n- بيوتانول. ستظهر واجهة سائلة حادة جدًا في غضون 10-20 دقيقة. دع بلمرة الجل لمدة ساعة أخرى على الأقل. اشطف سطح الجل بالماء قبل صب جل التكديس.

جل التراص

عدد Minigels 2 5 8
عدد Minigels 2 5 8
0.5 م TrisHCl درجة الحموضة 6.8+ 0.4٪ SDS 2.5 مل 4.0 مل 5.2 مل 0.5 م TrisHCl درجة الحموضة 6.8+ 0.4٪ SDS 2.5 مل 4.0 مل 5.2 مل
30 ٪ أكريلاميد 0.8٪ ميثيلين مكرر أكريلاميد 1.0 مل 1.5 مل 2.0 مل 40 ٪ أكريلاميد / ميثيلين مكرر أكريلاميد (النسبة: 37.5: 1) 0.75 مل 1.1 مل 1.4 مل
ح 2 ا 6.4 مل 9.6 مل 12.8 مل ح 2 ا 6.6 مل 10 مل 13.4 مل
10٪ APS 100 ميكرولتر 150 ماي 200 ميكرولتر 10٪ APS 100 ميكرولتر 150 ماي 200 ميكرولتر
تيميد 10 ماي 15 ماي 20 ماي تيميد 10 ماي 15 ماي 20 ماي

املأ كل شطيرة بمحلول التراص الجل وأدخل مشطًا في كل مكان مع الحرص على عدم حبس أي فقاعات أسفل الأسنان. يجب أن يتبلمر الجل بالكامل بعد ساعة واحدة. قم بتغطية الجل بغطاء نايلون. احتفظ بالجل لمدة لا تزيد عن أسبوعين عند 4 درجة مئوية.

قبل إضافة المخزن المؤقت للعينة ، احتفظ بالعينات عند 0 درجة مئوية. أضف المخزن المؤقت لعينة SDS (RT) إلى العينة (لا يزال على الجليد) ، ويغلي عند 100 درجة مئوية على الفور من 3 إلى 5 دقائق. لا تترك العينة في المخزن المؤقت لعينة SDS بدون تسخين البروتياز الداخلي المنشأ فهو نشط للغاية في المخزن المؤقت لعينة SDS ويمكن أن يسبب تدهورًا شديدًا. بمجرد تسخينها ، يمكن أن تجلس العينة عند درجة حرارة الغرفة لفترة قصيرة حتى التحميل ، أو عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترة طويلة.
للحصول على سمك جل يبلغ 0.75 مم و 15 بئراً ، يتم تطبيق بروتين 10-25 ميكروغرام من خليط معقد ، عند التلوين باستخدام Coomasie Blue و 0.5 إلى 5ug لعينات لبروتين واحد أو عدد قليل من البروتينات. إذا تم استخدام بقعة الفضة ، فيمكن استخدام بروتين أقل من 10 إلى 100 ضعف.
يمكن أن تتركز العينات أو يتم التخلص من التداخلات (الأملاح ، إلخ) باستخدام TCA ، والأسيتون ، و TCA-DOC ، والإيثانول ، وما إلى ذلك (انظر البروتوكول المرفق). يجب إزالة أيونات البوتاسيوم على وجه الخصوص لأنها تعجل SDS.
تتطلب بعض البروتينات مثل البروتينات النووية غير الهيستون والبروتينات الغشائية وجود 8 أمتار من اليوريا في المخزن المؤقت لعينة SDS للحصول على الذوبان الكامل.
تخضع بعض البروتينات المرتبطة بالغشاء للتجمع عند درجات حرارة أعلى من 40-50 درجة مئوية. في هذه الحالة احتضان 30 دقيقة في 40 & degC مع عينة عازلة.
تحول في مسافات هجرة البروتينات
مع جسور ثاني كبريتيد داخلية يمكن ملاحظتها عن طريق احتضان العينات في SDS في وجود أو عدم وجود عوامل الاختزال (مركابتوإيثانول ، DTT ، DTE ، إلخ)


محتويات

تحرير إعداد المكتبة

الخطوات العامة لإعداد مكتبة DNA (cDNA) التكميلية للتسلسل موصوفة أدناه ، ولكنها غالبًا ما تختلف بين المنصات. [8] [3] [9]

  1. عزل الحمض النووي الريبي:يتم عزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة ويخلط مع ديوكسي ريبونوكلياز (الدناز). يقلل DNase من كمية الحمض النووي الجيني. يتم فحص مقدار تدهور الحمض النووي الريبي باستخدام هلام ورحلان كهربائي شعري ويستخدم لتعيين رقم سلامة الحمض النووي الريبي للعينة. تؤخذ جودة RNA والمقدار الإجمالي لبدء RNA في الاعتبار أثناء خطوات إعداد المكتبة وتسلسلها وتحليلها اللاحقة.
  1. اختيار / نضوب الحمض النووي الريبي (RNA): لتحليل الإشارات ذات الأهمية ، يمكن إما الاحتفاظ بـ RNA المعزول كما هو ، ويتم ترشيحه لـ RNA مع ذيول 3 'polyadylated (poly (A)) لتشمل فقط mRNA ، المستنفد من RNA الريبوسومي (rRNA) ، و / أو تمت تصفيته لـ RNA الذي يربط تسلسلات محددة (طرق اختيار واستنفاد الحمض النووي الريبي الجدول أدناه). يتكون الحمض النووي الريبي ذو ذيول 3 'poly (A) بشكل أساسي من متواليات ناضجة ومعالجة ومشفرة. يتم إجراء اختيار Poly (A) عن طريق خلط RNA مع أوليغومرات بولي (T) المرتبطة تساهميًا بركيزة ، حبات مغناطيسية عادةً. [10] [11] اختيار Poly (A) له قيود مهمة في اكتشاف النمط الحيوي لـ RNA. العديد من الأنماط الحيوية للحمض النووي الريبي ليست متعددة الأدينيلات ، بما في ذلك العديد من نسخ الحمض النووي الريبي غير المشفر وبروتين هيستون النواة ، أو يتم تنظيمها عبر طول ذيلها المتعدد (على سبيل المثال ، السيتوكينات) وبالتالي قد لا يتم اكتشافها بعد اختيار بولي (أ). [12] علاوة على ذلك ، قد يؤدي اختيار poly (A) إلى زيادة انحياز 3 '، خاصة مع انخفاض جودة RNA. [13] [14] يمكن تجنب هذه القيود مع نضوب الريبوسوم ، وإزالة الرنا الريباسي الذي يمثل عادةً أكثر من 90٪ من الحمض النووي الريبي في الخلية. كل من خطوات التخصيب المتعدد (A) واستنفاد الريبوسوم تتطلب عمالة مكثفة ويمكن أن تؤدي إلى تحيزات ، لذلك تم تطوير مناهج أكثر بساطة لتجاهل هذه الخطوات. [15] يمكن عزل أهداف الحمض النووي الريبي الصغيرة ، مثل ميرنا ، بشكل أكبر من خلال اختيار الحجم باستخدام المواد الهلامية أو الحبيبات المغناطيسية أو المجموعات التجارية.
  1. توليف (كدنا): يتم نسخ الحمض النووي الريبي بشكل عكسي إلى (كدنا) لأن الحمض النووي أكثر استقرارًا ويسمح بالتضخيم (الذي يستخدم بوليميراز الحمض النووي) والاستفادة من تقنية تسلسل الحمض النووي الأكثر نضجًا. ينتج عن التضخيم اللاحق للنسخ العكسي فقدان السلاسل ، والذي يمكن تجنبه بالوسم الكيميائي أو تسلسل الجزيء الفردي. يتم إجراء تحديد التجزئة والحجم لتنقية التسلسلات ذات الطول المناسب لآلة التسلسل. يتم تجزئة الحمض النووي الريبي أو (كدنا) أو كليهما بواسطة الإنزيمات أو الصوتنة أو البخاخات. يقلل تجزئة الحمض النووي الريبي (RNA) من 5 تحيز للنسخ العكسي العشوائي وتأثير مواقع الربط التمهيدي ، [11] مع الجانب السلبي المتمثل في تحويل النهايتين 5 و 3 إلى DNA بشكل أقل كفاءة. يتبع التجزئة اختيار الحجم ، حيث تتم إزالة التسلسلات الصغيرة أو تحديد نطاق ضيق من أطوال التسلسل. نظرًا لفقدان الحمض النووي الريبي الصغير مثل الجزيئات الدقيقة ، يتم تحليلها بشكل مستقل. يمكن فهرسة (كدنا) لكل تجربة برمز شريطي سداسي أو ثماني ، بحيث يمكن تجميع هذه التجارب في حارة واحدة للتسلسل متعدد الإرسال.

تحرير تسلسل الحمض النووي التكميلي (cDNA-Seq)

يتم بعد ذلك تسلسل مكتبة (كدنا) المشتقة من الأنماط الحيوية للحمض النووي الريبي إلى تنسيق يمكن قراءته بواسطة الكمبيوتر. هناك العديد من تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية لتسلسل cDNA بما في ذلك الأنظمة الأساسية التي طورتها Illumina و Thermo Fisher و BGI / MGI و PacBio و Oxford Nanopore Technologies. [16] بالنسبة لتسلسل قراءة قصيرة من Illumina ، وهي تقنية شائعة لتسلسل cDNA ، يتم ربط المحولات بـ cDNA ، ويتم توصيل الحمض النووي بخلية التدفق ، ويتم إنشاء المجموعات من خلال دورات تضخيم الجسر وإحداث تغيير في الطبيعة ، ويكون التسلسل تلو التوليف هو يتم إجراؤها في دورات تخليق خيوط تكميلية وإثارة بالليزر للقواعد ذات أجهزة إنهاء قابلة للانعكاس. يتم توجيه اختيار النظام الأساسي المتسلسل والمعلمات من خلال التصميم التجريبي والتكلفة. تشمل اعتبارات التصميم التجريبي الشائعة تحديد طول التسلسل ، وعمق التسلسل ، واستخدام التسلسل أحادي الطرف مقابل التسلسل المزدوج ، وعدد التكرارات ، وتعدد الإرسال ، والعشوائية ، والارتفاع الإضافي. [17]

تعديل تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير / غير المشفر

عند تسلسل الحمض النووي الريبي بخلاف mRNA ، يتم تعديل إعداد المكتبة. يتم تحديد الحمض النووي الريبي الخلوي بناءً على نطاق الحجم المطلوب. بالنسبة لأهداف الحمض النووي الريبي الصغيرة ، مثل ميرنا ، يتم عزل الحمض النووي الريبي من خلال اختيار الحجم. يمكن إجراء ذلك باستخدام هلام استبعاد الحجم ، أو من خلال الخرز المغناطيسي لاختيار الحجم ، أو باستخدام مجموعة مطورة تجاريًا. بمجرد عزلها ، تتم إضافة الروابط إلى نهايتي 3 'و 5' ثم تنقيتها. الخطوة الأخيرة هي توليد (كدنا) من خلال النسخ العكسي.

تحرير تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر

نظرًا لأن تحويل الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) ، فقد ثبت أن الربط والتضخيم ومعالجات العينات الأخرى تقدم تحيزات ومصنوعات قد تتداخل مع كل من التوصيف الصحيح والقياس الكمي للنصوص ، [18] وقد تم استكشاف تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر لجزيء واحد من قبل الشركات بما في ذلك Helicos (إفلاس) ، أكسفورد نانوبور تكنولوجيز ، [19] وآخرون. تقوم هذه التقنية بترتيب جزيئات الحمض النووي الريبي مباشرة بطريقة متوازية بشكل كبير.

تحرير تسلسل الحمض النووي الريبي في الوقت الحقيقي لجزيء واحد

تم استكشاف جزيء واحد متوازي بشكل كبير من RNA-Seq كبديل لـ RNA-Seq التقليدي ، حيث قد يؤدي تحويل RNA-to-cDNA والربط والتضخيم وخطوات معالجة العينة الأخرى إلى التحيزات والتحف. [20] منصات التكنولوجيا التي تؤدي جزيء واحد في الوقت الحقيقي RNA-Seq تشمل Oxford Nanopore Technologies (ONT) Nanopore Sequences ، [19] PacBio IsoSeq ، و Helicos (المفلسة). يحافظ تسلسل الحمض النووي الريبي في شكله الأصلي على التعديلات مثل المثيلة ، مما يسمح بفحصها بشكل مباشر وفي وقت واحد. [19] فائدة أخرى من جزيء واحد من RNA-Seq هي أنه يمكن تغطية النصوص كاملة الطول ، مما يسمح باكتشاف وتقدير شكل إسوي عالي الثقة مقارنة بتسلسل القراءة القصيرة. تقليديا ، تتميز طرق RNA-Seq أحادية الجزيء بمعدلات خطأ أعلى مقارنة بتسلسل القراءة القصيرة ، ولكن الأساليب الأحدث مثل ONT RNA-Seq المباشر تحد من الأخطاء عن طريق تجنب التجزئة وتحويل cDNA. أظهرت الاستخدامات الحديثة لـ ONT RNA-Seq المباشر للتعبير التفاضلي في مجموعات الخلايا البشرية أن هذه التكنولوجيا يمكن أن تتغلب على العديد من قيود تسلسل cDNA القصير والطويل. [21]

تحرير تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (تسلسل سكرنا)

تحلل الطرق القياسية مثل المصفوفات الدقيقة وتحليل RNA-Seq القياسي السائب التعبير عن الحمض النووي الريبي من مجموعات كبيرة من الخلايا. في مجموعات الخلايا المختلطة ، قد تحجب هذه القياسات الاختلافات الحرجة بين الخلايا الفردية داخل هذه المجموعات السكانية. [22] [23]

يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-Seq) ملفات تعريف التعبير للخلايا الفردية. على الرغم من أنه من غير الممكن الحصول على معلومات كاملة عن كل RNA التي تعبر عنها كل خلية ، نظرًا للكمية الصغيرة من المواد المتاحة ، يمكن تحديد أنماط التعبير الجيني من خلال تحليلات التجميع الجيني. يمكن أن يكشف هذا عن وجود أنواع خلايا نادرة داخل مجموعة خلايا ربما لم يسبق رؤيتها من قبل. على سبيل المثال ، تم تحديد خلايا متخصصة نادرة في الرئة تسمى الخلايا الشاردة الرئوية التي تعبر عن منظم توصيل الغشاء عبر التليف الكيسي في عام 2018 من قبل مجموعتين تقومان بإجراء scRNA-Seq على ظهارة مجرى الهواء الرئوي. [24] [25]

تحرير الإجراءات التجريبية

تتضمن بروتوكولات scRNA-Seq الحالية الخطوات التالية: عزل خلية واحدة و RNA ، والنسخ العكسي (RT) ، والتضخيم ، وإنشاء المكتبة والتسلسل. يتم فصل الخلايا المفردة ميكانيكيًا إلى ميكروويلز (على سبيل المثال ، BD Rhapsody ، Takara ICELL8 ، Vycap Puncher Platform ، أو CellMicrosystems CellRaft) أو مغلفة في قطرات (على سبيل المثال ، 10x Genomics Chromium ، Illumina Bio-Rad ddSEQ ، 1CellBio InDrop ، Dolomite Bio Nadia). [26] يتم تمييز الخلايا المفردة عن طريق إضافة خرزات تحتوي على قليل النوكليوتيدات المشفرة ، حيث يتم توفير كل من الخلايا والخرز بكميات محدودة بحيث يكون الإشغال المشترك مع خلايا وحبيبات متعددة حدثًا نادرًا جدًا. بمجرد اكتمال النسخ العكسي ، يمكن خلط cDNAs من العديد من الخلايا معًا لتسلسل النصوص من خلية معينة بواسطة الرمز الشريطي الفريد لكل خلية. [27] [28] يمكن ربط المعرف الجزيئي الفريد (UMIs) بالتسلسلات المستهدفة mRNA / cDNA للمساعدة في التعرف على القطع الأثرية أثناء إعداد المكتبة. [29]

تشمل التحديات التي تواجه scRNA-Seq الحفاظ على الوفرة النسبية الأولية لـ mRNA في الخلية وتحديد النصوص النادرة. [30] تعتبر خطوة النسخ العكسي أمرًا بالغ الأهمية لأن كفاءة تفاعل RT تحدد مقدار تعداد الحمض النووي الريبي للخلية الذي سيتم تحليله في النهاية بواسطة جهاز التسلسل. قد تؤثر عملية النسخ العكسية والاستراتيجيات الأولية المستخدمة على إنتاج cDNA كامل الطول وتوليد مكتبات منحازة نحو نهاية الجينات 3 أو 5.

في خطوة التضخيم ، يتم استخدام PCR أو النسخ في المختبر (IVT) حاليًا لتضخيم (كدنا). تتمثل إحدى مزايا الطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في القدرة على توليد (كدنا) كامل الطول. ومع ذلك ، قد يتم أيضًا تضخيم كفاءة PCR المختلفة على تسلسلات معينة (على سبيل المثال ، محتوى GC وهيكل snapback) بشكل كبير ، مما ينتج عنه مكتبات ذات تغطية غير متساوية. من ناحية أخرى ، في حين أن المكتبات التي تم إنشاؤها بواسطة IVT يمكن أن تتجنب تحيز التسلسل الناجم عن PCR ، فقد يتم نسخ تسلسلات محددة بشكل غير فعال ، مما يتسبب في ترك التسلسل أو إنشاء تسلسلات غير كاملة. [31] [22] تم نشر العديد من بروتوكولات scRNA-Seq: Tang et al. ، [32] STRT ، [33] SMART-seq ، [34] CEL-seq ، [35] RAGE-seq ، [36] الكوارتز -seq [37] و C1-CAGE. [38] تختلف هذه البروتوكولات من حيث استراتيجيات النسخ العكسي وتوليف cDNA والتضخيم وإمكانية استيعاب الرموز الشريطية الخاصة بالتسلسل (أي UMIs) أو القدرة على معالجة العينات المجمعة. [39]

في عام 2017 ، تم تقديم طريقتين لقياس مرنا أحادية الخلية وتعبير البروتين في وقت واحد من خلال الأجسام المضادة التي تحمل علامات قليلة النوكليوتيد والمعروفة باسم REAP-seq ، [40] و CITE-seq. [41]

تحرير التطبيقات

أصبح استخدام سكرنا- Seq على نطاق واسع عبر التخصصات البيولوجية بما في ذلك التنمية ، وعلم الأعصاب ، [42] علم الأورام ، [43] [44] [45] أمراض المناعة الذاتية ، [46] والأمراض المعدية. [47]

قدم سكرنا- Seq نظرة ثاقبة في تطور الأجنة والكائنات الحية ، بما في ذلك الدودة أنواع معينة انيقةو [48] و المستوي التجديدي شميدتية البحر الأبيض المتوسط. [49] [50] كانت الحيوانات الفقارية الأولى التي تم رسم خرائط لها بهذه الطريقة هي الزرد [51] [52] و Xenopus laevis. [53] في كل حالة تمت دراسة مراحل متعددة للجنين ، مما يسمح بتخطيط عملية التطور بأكملها على أساس كل خلية على حدة. [8] اعترف العلم بهذه التطورات باعتبارها أفضل اختراقات للعام 2018. [54]

تحرير الاعتبارات التجريبية

يتم أخذ مجموعة متنوعة من المعلمات في الاعتبار عند تصميم تجارب RNA-Seq وإجرائها:

  • خصوصية الأنسجة: يختلف التعبير الجيني داخل الأنسجة وبينها ، ويقيس RNA-Seq هذا المزيج من أنواع الخلايا. هذا قد يجعل من الصعب عزل الآلية البيولوجية للفائدة. يمكن استخدام تسلسل الخلية الواحدة لدراسة كل خلية على حدة ، والتخفيف من حدة هذه المشكلة.
  • الاعتماد على الوقت: يتغير التعبير الجيني بمرور الوقت ، ولا يأخذ RNA-Seq سوى لقطة سريعة. يمكن إجراء تجارب الدورة الزمنية لمراقبة التغييرات في النسخ.
  • التغطية (تُعرف أيضًا بالعمق): يحمل الحمض النووي الريبي نفس الطفرات التي لوحظت في الحمض النووي ، ويتطلب الكشف تغطية أعمق. مع تغطية عالية بما فيه الكفاية ، يمكن استخدام RNA-Seq لتقدير تعبير كل أليل. قد يوفر هذا نظرة ثاقبة لظواهر مثل آثار البصمة أو اللوائح التنظيمية. يمكن استقراء عمق التسلسل المطلوب لتطبيقات محددة من تجربة تجريبية. [55]
  • عناصر إنشاء البيانات (المعروفة أيضًا باسم التباين التقني): يمكن أن تؤدي الكواشف (على سبيل المثال ، مجموعة إعداد المكتبة) ، والموظفين المعنيين ، ونوع جهاز التسلسل (مثل Illumina ، و Pacific Biosciences) إلى تحف فنية قد يتم تفسيرها بشكل خاطئ على أنها نتائج ذات مغزى. كما هو الحال مع أي تجربة علمية ، من الحكمة إجراء RNA-Seq في بيئة محكومة جيدًا. إذا لم يكن ذلك ممكنًا أو كانت الدراسة عبارة عن تحليل تلوي ، فإن الحل الآخر هو اكتشاف الآثار الفنية عن طريق استنتاج المتغيرات الكامنة (عادةً تحليل المكون الرئيسي أو تحليل العوامل) ثم تصحيح هذه المتغيرات لاحقًا. [56]
  • إدارة البيانات: عادة ما تكون تجربة RNA-Seq الفردية على البشر 1-5 جيجا بايت (مضغوط) ، أو أكثر عند تضمين الملفات الوسيطة. [57] يمكن أن يؤدي هذا الحجم الكبير من البيانات إلى حدوث مشكلات في التخزين. يتمثل أحد الحلول في ضغط البيانات باستخدام المخططات الحسابية متعددة الأغراض (على سبيل المثال ، gzip) أو المخططات الخاصة بعلم الجينوم. يمكن أن يعتمد الأخير على التسلسلات المرجعية أو de novo. حل آخر هو إجراء تجارب ميكروأري ، والتي قد تكون كافية للعمل الذي يحركه الفرضيات أو دراسات النسخ المتماثل (على عكس البحث الاستكشافي).

تحرير التجميع النسخ

تُستخدم طريقتان لتعيين قراءات التسلسل الأولي للسمات الجينية (أي تجميع النسخة النصية):

  • من جديد: لا يتطلب هذا النهج جينومًا مرجعيًا لإعادة بناء النسخ ، ويستخدم عادةً إذا كان الجينوم غير معروف أو غير مكتمل أو تم تغييره بشكل كبير مقارنةً بالمرجع. [58] تشمل التحديات عند استخدام قراءات قصيرة لتجميع de novo 1) تحديد القراءات التي يجب ضمها معًا في تسلسلات متجاورة (contigs) ، 2) متانة أخطاء التسلسل وغيرها من الأدوات ، و 3) الكفاءة الحسابية. انتقلت الخوارزمية الأساسية المستخدمة لتجميع de novo من الرسوم البيانية المتداخلة ، والتي تحدد جميع التداخلات الزوجية بين القراءات ، إلى الرسوم البيانية لـ De Bruijn ، والتي تقسم القراءات إلى تسلسلات بطول k وتنهار كل k-mers في جدول تجزئة. [59] تم استخدام الرسوم البيانية المتداخلة مع تسلسل سانجر ، ولكن لم يتم قياسها بشكل جيد لملايين القراءات التي تم إنشاؤها باستخدام RNA-Seq. من أمثلة المجمعات التي تستخدم الرسوم البيانية لـ Bruijn Trinity ، [58] Oases [60] (مشتقة من مجمع الجينوم Velvet [61]) ، Bridger ، [62] و rnaSPAdes. [63] يمكن لتسلسل القراءة الطويلة والمزدوجة من نفس العينة أن يخفف من أوجه القصور في تسلسل القراءة القصيرة من خلال العمل كقالب أو هيكل عظمي. تشمل المقاييس لتقييم جودة تجميع de novo متوسط ​​طول contig وعدد contigs و N50. [64]
  • توجيه الجينوم: يعتمد هذا النهج على نفس الأساليب المستخدمة لمحاذاة الحمض النووي ، مع التعقيد الإضافي لمحاذاة القراءات التي تغطي الأجزاء غير المستمرة من الجينوم المرجعي. [65] هذه القراءات غير المستمرة هي نتيجة تسلسل النصوص المقسمة (انظر الشكل). عادةً ما تحتوي خوارزميات المحاذاة على خطوتين: 1) محاذاة أجزاء قصيرة من القراءة (على سبيل المثال ، زرع الجينوم) ، و 2) استخدام البرمجة الديناميكية للعثور على محاذاة مثالية ، أحيانًا بالاقتران مع التعليقات التوضيحية المعروفة. تتضمن أدوات البرمجيات التي تستخدم المحاذاة الموجهة بالجينوم Bowtie ، [66] TopHat (الذي يبني على نتائج BowTie لمحاذاة وصلات الوصلات) ، [67] [68] Subread ، [69] STAR ، [65] HISAT2 ، [70] و GMAP . [71] يمكن استخدام ناتج أدوات المحاذاة (رسم الخرائط) الموجهة للجينوم بشكل أكبر بواسطة أدوات مثل أزرار الكم [68] أو StringTie [72] لإعادة بناء تسلسلات نصية متجاورة (بمعنى آخر.، ملف FASTA). يمكن قياس جودة التجميع الموجه للجينوم باستخدام كل من 1) مقاييس التجميع de novo (على سبيل المثال ، N50) و 2) مقارنات مع النسخ المعروفة ، وتقاطع الوصلة ، والجينوم ، وتسلسل البروتين باستخدام الدقة ، والتذكر ، أو مجموعتهم (على سبيل المثال ، درجة F1). [64] بالإضافة إلى ذلك ، في السيليكو يمكن إجراء التقييم باستخدام قراءات محاكاة. [73] [74]

ملاحظة حول جودة التجميع: الإجماع الحالي هو أن 1) يمكن أن تختلف جودة التجميع اعتمادًا على المقياس المستخدم ، 2) أدوات التجميع التي سجلت نتائج جيدة في أحد الأنواع لا تؤدي بالضرورة أداءً جيدًا في الأنواع الأخرى ، و 3) قد يكون الجمع بين الأساليب المختلفة هو الأكثر موثوقية. [75] [76] [77]

تحرير التعبير الجيني الكمي

يتم قياس التعبير الكمي لدراسة التغيرات الخلوية استجابة للمنبهات الخارجية ، والاختلافات بين الحالات الصحية والمريضة ، وأسئلة بحثية أخرى. غالبًا ما تُستخدم مستويات النسخ كبديل لوفرة البروتين ، ولكنها غالبًا لا تكون مكافئة بسبب أحداث ما بعد النسخ مثل تداخل الحمض النووي الريبي (RNA) والاضمحلال غير المنطقي. [78]

يتم قياس التعبير عن طريق حساب عدد القراءات التي تم تعيينها لكل موضع في خطوة تجميع النسخ. يمكن قياس التعبير عن exons أو الجينات باستخدام contigs أو شروح النص المرجعي. [8] تم التحقق من صحة أعداد قراءة RNA-Seq المرصودة بقوة مقابل التقنيات القديمة ، بما في ذلك المصفوفات الدقيقة للتعبير و qPCR. [55] [79] الأدوات التي تحدد الأعداد هي HTSeq ، [80] FeatureCounts ، [81] Rcount ، [82] maxcounts ، [83] FIXSEQ ، [84] و Cuffquant. تحدد هذه الأدوات أعداد القراءة من بيانات RNA-Seq المتوافقة ، ولكن يمكن أيضًا الحصول على تعدادات خالية من المحاذاة مع سمكة ابو شراع [85] وكاليستو. [86] يتم بعد ذلك تحويل أعداد القراءة إلى مقاييس مناسبة لاختبار الفرضيات والانحدارات والتحليلات الأخرى. معلمات هذا التحويل هي:

  • عمق التسلسل / التغطية: على الرغم من أن العمق محدد مسبقًا عند إجراء العديد من تجارب RNA-Seq ، إلا أنه سيظل يختلف بشكل كبير بين التجارب. [87] لذلك ، عادةً ما يتم تسوية العدد الإجمالي للقراءات التي تم إنشاؤها في تجربة واحدة عن طريق تحويل الأعداد إلى أجزاء ، أو قراءات ، أو تعداد لكل مليون قراءة معينة (FPM ، أو RPM ، أو CPM). تم اشتقاق الفرق بين RPM و FPM تاريخيًا أثناء التطور من التسلسل أحادي الطرف للشظايا إلى التسلسل ثنائي النهاية. في التسلسل أحادي النهاية ، توجد قراءة واحدة فقط لكل جزء (بمعنى آخر.، RPM = FPM). في التسلسل المزدوج النهاية ، هناك قراءتان لكل جزء (بمعنى آخر.، RPM = 2 × FPM). يشار أحيانًا إلى عمق التسلسل باسم حجم المكتبة ، وهو عدد جزيئات cDNA الوسيطة في التجربة.
  • طول الجين: سيكون للجينات الأطول شظايا / قراءات / أعداد أكثر من الجينات الأقصر إذا كان تعبير النص هو نفسه. يتم ضبط ذلك عن طريق قسمة FPM على طول الميزة (والتي يمكن أن تكون جينًا أو نسخة أو إكسون) ، مما ينتج عنه الأجزاء المترية لكل كيلو قاعدة للميزة لكل مليون قراءة معينة (FPKM). [88] عند النظر إلى مجموعات الميزات عبر العينات ، يتم تحويل FPKM إلى نصوص لكل مليون (TPM) بقسمة كل FPKM على مجموع FPKM في عينة. [89] [90] [91]
  • إجمالي إخراج عينة الحمض النووي الريبي: نظرًا لاستخراج نفس الكمية من الحمض النووي الريبي من كل عينة ، فإن العينات التي تحتوي على المزيد من إجمالي الحمض النووي الريبي ستحتوي على عدد أقل من الحمض النووي الريبي لكل جين. يبدو أن هذه الجينات قد قللت من التعبير ، مما أدى إلى نتائج إيجابية خاطئة في تحليلات المصب. [87] استراتيجيات التطبيع بما في ذلك Quantile و DESeq2 و TMM و Median Ratio تحاول حساب هذا الاختلاف من خلال مقارنة مجموعة من الجينات المعبر عنها بشكل غير تفاضلي بين العينات والقياس وفقًا لذلك. [92]
  • التباين لكل تعبير جيني: تم تصميمه لحساب خطأ أخذ العينات (مهم للجينات ذات عدد القراءة المنخفض) ، وزيادة القوة ، وتقليل الإيجابيات الكاذبة. يمكن تقدير التباين كتوزيع ذي حدين طبيعي أو بواسون أو سلبي [93] [94] [95] وغالبًا ما يتحلل إلى تباين تقني وبيولوجي.

Spike-ins للتقدير الكمي المطلق واكتشاف التأثيرات على مستوى الجينوم

ارتفاعات الحمض النووي الريبي هي عينات من الحمض النووي الريبي بتركيزات معروفة يمكن استخدامها كمعايير ذهبية في التصميم التجريبي وأثناء التحليلات النهائية للتقدير الكمي المطلق واكتشاف التأثيرات على نطاق الجينوم.

  • التقدير المطلق: القياس الكمي المطلق للتعبير الجيني غير ممكن مع معظم تجارب RNA-Seq ، والتي تحدد التعبير بالنسبة لجميع النصوص. من الممكن عن طريق إجراء RNA-Seq مع spike-ins ، عينات من الحمض النووي الريبي بتركيزات معروفة. بعد التسلسل ، يتم استخدام عدد مرات القراءة للتسلسل المفاجئ لتحديد العلاقة بين عدد قراءة كل جين والكميات المطلقة للشظايا البيولوجية [11] [96] في أحد الأمثلة ، تم استخدام هذه التقنية في Xenopus Tropicalis الأجنة لتحديد حركية النسخ. [97]
  • الكشف عن التأثيرات على مستوى الجينوم: التغييرات في المنظمين العالميين بما في ذلك أجهزة إعادة تشكيل الكروماتين ، وعوامل النسخ (على سبيل المثال ، MYC) ، ومجمعات أسيتيل ترانسفيراز ، وموضع النوكليوزوم لا تتوافق مع افتراضات التطبيع ويمكن أن توفر أدوات التحكم في الارتفاع تفسيرًا دقيقًا. [98] [99]

تحرير التعبير التفاضلي

إن أبسط استخدام لـ RNA-Seq ولكنه الأكثر قوة هو إيجاد اختلافات في التعبير الجيني بين حالتين أو أكثر (على سبيل المثال، تعامل مقابل لا تعامل) تسمى هذه العملية التعبير التفاضلي. غالبًا ما يشار إلى المخرجات على أنها جينات معبر عنها تفاضليًا (DEGs) ويمكن أن تكون هذه الجينات إما أعلى أو منخفضة التنظيم (بمعنى آخر.، أعلى أو أقل في حالة الفائدة). هناك العديد من الأدوات التي تقوم بالتعبير التفاضلي. يتم تشغيل معظمها في R أو Python أو سطر أوامر Unix. تشمل الأدوات المستخدمة بشكل شائع DESeq ، [94] edgeR ، [95] و voom + limma ، [93] [100] وكلها متاحة من خلال R / Bioconductor. [101] [102] هذه هي الاعتبارات الشائعة عند تنفيذ التعبير التفاضلي:

  • المدخلات: تتضمن مدخلات التعبير التفاضلي (1) مصفوفة تعبير RNA-Seq (جينات M x عينات N) و (2) مصفوفة تصميم تحتوي على شروط تجريبية لعينات N. تحتوي أبسط مصفوفة تصميم على عمود واحد ، يتوافق مع تسميات الحالة التي يتم اختبارها. يمكن أن تتضمن المتغيرات المشتركة الأخرى (يشار إليها أيضًا بالعوامل أو الميزات أو الملصقات أو المعلمات) تأثيرات الدُفعات والتحف المعروفة وأي بيانات وصفية قد تربك أو تتوسط في التعبير الجيني. بالإضافة إلى المتغيرات المشتركة المعروفة ، يمكن أيضًا تقدير المتغيرات المشتركة غير المعروفة من خلال مناهج التعلم الآلي غير الخاضعة للإشراف بما في ذلك تحليلات المكون الرئيسي والمتغير البديل [103] و PEER [56]. غالبًا ما يتم استخدام التحليلات المتغيرة المخفية لبيانات RNA-Seq للأنسجة البشرية ، والتي عادةً ما تحتوي على عناصر أثرية إضافية لم يتم التقاطها في البيانات الوصفية (على سبيل المثال، الوقت الإقفاري ، الاستعانة بمصادر من مؤسسات متعددة ، السمات السريرية الأساسية ، جمع البيانات عبر سنوات عديدة مع العديد من الموظفين).
  • أساليب: تستخدم معظم الأدوات إحصاءات الانحدار أو غير المعلمية لتحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا ، وهي إما تستند إلى عدد القراءة المعين لجينوم مرجعي (DESeq2 ، limma ، edgeR) أو بناءً على عدد القراءة المشتق من القياس الكمي الخالي من المحاذاة (الاستقصاء ، [104) ] Cuffdiff ، [105] Ballgown [106]). [107] بعد الانحدار ، تستخدم معظم الأدوات إما تعديلات معدل الخطأ العائلي (FWER) أو معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) لتعديل الفرضيات المتعددة (في الدراسات البشرية ،

20000 جين أو

تأتي التحليلات النهائية لقائمة الجينات المعبر عنها تفاضليًا في نكهتين ، للتحقق من صحة الملاحظات وإجراء استنتاجات بيولوجية. نظرًا لمخاطر التعبير التفاضلي و RNA-Seq ، يتم تكرار الملاحظات المهمة باستخدام (1) طريقة متعامدة في نفس العينات (مثل PCR في الوقت الفعلي) أو (2) تجربة أخرى ، مسجلة مسبقًا في بعض الأحيان ، في مجموعة جديدة . يساعد هذا الأخير في ضمان التعميم ويمكن عادةً اتباعه بتحليل تلوي لجميع الأفواج المجمعة. الطريقة الأكثر شيوعًا للحصول على فهم بيولوجي عالي المستوى للنتائج هي تحليل إثراء مجموعة الجينات ، على الرغم من استخدام أساليب الجينات المرشحة في بعض الأحيان. يحدد إثراء مجموعة الجينات ما إذا كان التداخل بين مجموعتين من الجينات ذا دلالة إحصائية ، وفي هذه الحالة التداخل بين الجينات المعبر عنها تفاضليًا ومجموعات الجينات من المسارات / قواعد البيانات المعروفة (على سبيل المثال، علم الوجود الجيني ، KEGG ، أنطولوجيا النمط الظاهري للإنسان) أو من التحليلات التكميلية في نفس البيانات (مثل شبكات التعبير المشترك). تشمل الأدوات الشائعة لإثراء مجموعة الجينات واجهات الويب (على سبيل المثال، ENRICHR، g: profiler، WEBGESTALT) [114] وحزم البرامج. عند تقييم نتائج الإثراء ، فإن أحد الأساليب التجريبية هو البحث أولاً عن إثراء البيولوجيا المعروفة كفحص للعقل ثم توسيع النطاق للبحث عن بيولوجيا جديدة.

تحرير الربط البديل

يعد تضفير الحمض النووي الريبي جزءًا لا يتجزأ من حقيقيات النوى ويساهم بشكل كبير في تنظيم البروتين وتنوعه ، ويحدث في & gt90٪ من الجينات البشرية. [115] هناك العديد من أوضاع التضفير البديلة: تخطي exon (وضع التضفير الأكثر شيوعًا في البشر وحقيقيات النوى الأعلى) ، exons الحصري المتبادل ، مواقع مانحة أو متقبلة بديلة ، احتباس الإنترون (وضع التضفير الأكثر شيوعًا في النباتات والفطريات والبروتوزوا) ، موقع بدء النسخ البديل (المروج) ، والبولي أدينيل البديل. [115] أحد أهداف RNA-Seq هو تحديد أحداث التضفير البديلة واختبار ما إذا كانت تختلف بين الظروف. تسلسل القراءة الطويلة يلتقط النص الكامل وبالتالي يقلل من العديد من المشكلات في تقدير وفرة الشكل الإسوي ، مثل تخطيط القراءة الغامض. للقراءة القصيرة لـ RNA-Seq ، هناك طرق متعددة لاكتشاف التضفير البديل الذي يمكن تصنيفه إلى ثلاث مجموعات رئيسية: [116] [89] [117]

  • على أساس العدد (أيضًا على أساس الحدث ، التضفير التفاضلي): estimate exon retention. Examples are DEXSeq, [118] MATS, [119] and SeqGSEA. [120]
  • Isoform-based (also multi-read modules, differential isoform expression): estimate isoform abundance first, and then relative abundance between conditions. Examples are Cufflinks 2 [121] and DiffSplice. [122]
  • Intron excision based: calculate alternative splicing using split reads. Examples are MAJIQ [123] and Leafcutter. [117]

Differential gene expression tools can also be used for differential isoform expression if isoforms are quantified ahead of time with other tools like RSEM. [124]

Coexpression networks Edit

Coexpression networks are data-derived representations of genes behaving in a similar way across tissues and experimental conditions. [125] Their main purpose lies in hypothesis generation and guilt-by-association approaches for inferring functions of previously unknown genes. [125] RNA-Seq data has been used to infer genes involved in specific pathways based on Pearson correlation, both in plants [126] and mammals. [127] The main advantage of RNA-Seq data in this kind of analysis over the microarray platforms is the capability to cover the entire transcriptome, therefore allowing the possibility to unravel more complete representations of the gene regulatory networks. Differential regulation of the splice isoforms of the same gene can be detected and used to predict their biological functions. [128] [129] Weighted gene co-expression network analysis has been successfully used to identify co-expression modules and intramodular hub genes based on RNA seq data. Co-expression modules may correspond to cell types or pathways. Highly connected intramodular hubs can be interpreted as representatives of their respective module. An eigengene is a weighted sum of expression of all genes in a module. Eigengenes are useful biomarkers (features) for diagnosis and prognosis. [130] Variance-Stabilizing Transformation approaches for estimating correlation coefficients based on RNA seq data have been proposed. [126]

Variant discovery Edit

RNA-Seq captures DNA variation, including single nucleotide variants, small insertions/deletions. and structural variation. Variant calling in RNA-Seq is similar to DNA variant calling and often employs the same tools (including SAMtools mpileup [131] and GATK HaplotypeCaller [132] ) with adjustments to account for splicing. One unique dimension for RNA variants is allele-specific expression (ASE): the variants from only one haplotype might be preferentially expressed due to regulatory effects including imprinting and expression quantitative trait loci, and noncoding rare variants. [133] [134] Limitations of RNA variant identification include that it only reflects expressed regions (in humans, <5% of the genome), could be subject to biases introduced by data processing (e.g., de novo transcriptome assemblies underestimate heterozygosity [135] ), and has lower quality when compared to direct DNA sequencing.

RNA editing (post-transcriptional alterations) Edit

Having the matching genomic and transcriptomic sequences of an individual can help detect post-transcriptional edits (RNA editing). [3] A post-transcriptional modification event is identified if the gene's transcript has an allele/variant not observed in the genomic data.

Fusion gene detection Edit

Caused by different structural modifications in the genome, fusion genes have gained attention because of their relationship with cancer. [136] The ability of RNA-Seq to analyze a sample's whole transcriptome in an unbiased fashion makes it an attractive tool to find these kinds of common events in cancer. [4]

The idea follows from the process of aligning the short transcriptomic reads to a reference genome. Most of the short reads will fall within one complete exon, and a smaller but still large set would be expected to map to known exon-exon junctions. The remaining unmapped short reads would then be further analyzed to determine whether they match an exon-exon junction where the exons come from different genes. This would be evidence of a possible fusion event, however, because of the length of the reads, this could prove to be very noisy. An alternative approach is to use paired-end reads, when a potentially large number of paired reads would map each end to a different exon, giving better coverage of these events (see figure). Nonetheless, the end result consists of multiple and potentially novel combinations of genes providing an ideal starting point for further validation.

RNA-Seq was first developed in mid 2000s with the advent of next-generation sequencing technology. [139] The first manuscripts that used RNA-Seq even without using the term includes those of prostate cancer cell lines [140] (dated 2006), ميديكاغو truncatula [141] (2006), maize [142] (2007), and نبات الأرابيدوبسيس thaliana [143] (2007), while the term "RNA-Seq" itself was first mentioned in 2008 [144] The number of manuscripts referring to RNA-Seq in the title or abstract (Figure, blue line) is continuously increasing with 6754 manuscripts published in 2018. The intersection of RNA-Seq and medicine (Figure, gold line) has similar celerity. [145]

Applications to medicine Edit

RNA-Seq has the potential to identify new disease biology, profile biomarkers for clinical indications, infer druggable pathways, and make genetic diagnoses. These results could be further personalized for subgroups or even individual patients, potentially highlighting more effective prevention, diagnostics, and therapy. The feasibility of this approach is in part dictated by costs in money and time a related limitation is the required team of specialists (bioinformaticians, physicians/clinicians, basic researchers, technicians) to fully interpret the huge amount of data generated by this analysis. [146]

Large-scale sequencing efforts Edit

A lot of emphasis has been given to RNA-Seq data after the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) and The Cancer Genome Atlas (TCGA) projects have used this approach to characterize dozens of cell lines [147] and thousands of primary tumor samples, [148] respectively. ENCODE aimed to identify genome-wide regulatory regions in different cohort of cell lines and transcriptomic data are paramount in order to understand the downstream effect of those epigenetic and genetic regulatory layers. TCGA, instead, aimed to collect and analyze thousands of patient's samples from 30 different tumor types in order to understand the underlying mechanisms of malignant transformation and progression. In this context RNA-Seq data provide a unique snapshot of the transcriptomic status of the disease and look at an unbiased population of transcripts that allows the identification of novel transcripts, fusion transcripts and non-coding RNAs that could be undetected with different technologies.

This article was submitted to WikiJournal of Science for external academic peer review in 2019 (reviewer reports). The updated content was reintegrated into the Wikipedia page under a CC-BY-SA-3.0 license ( 2021 ). The version of record as reviewed is: Felix Richter et al. (17 May 2021). "A broad introduction to RNA-Seq". WikiJournal of Science. 4 (2): 4. doi:10.15347/WJS/2021.004. ISSN 2470-6345. Wikidata Q100146647.


1 An introduction to statistics

1.3 Why biologists have to repeat everything

1.4 Why biologists have to bother with statistics

1.5 Why statistical logic is so strange

1.6 Why there are so many statistical tests

1.7 Using the decision chart

2 Dealing with variability

2.2 Examining the distribution of data

2.3 The normal distribution

2.4 Describing the normal distribution

2.5 The variability of samples

2.7 Presenting descriptive statistics and confidence limits

2.8 Introducing computer programs

2.9 Calculating descriptive statistics

2.10 Self-assessment problems

3 Testing for normality and transforming data

3.1 The importance of normality testing

3.3 What to do if your data has a significantly different distribution from the normal

3.4 Examining data in practice

3.6 The complete testing procedure

3.7 Self-assessment problems

4 Testing for differences from an expected value or between two groups

4.2 Why we need statistical tests for differences

4.3 How we test for differences

4.4 One- and two-tailed tests

4.5 The types of t test and their non-parametric equivalents

4.9 Introduction to non-parametric tests for differences

4.10 The one-sample sign test

4.11 The Wilcoxon matched pairs test

4.12 The Mann–Whitney U test

4.13 Self-assessment problems

5 Testing for differences between more than two groups: ANOVA and its non-parametric equivalents

5.3 Deciding which groups are different – post hoc tests

5.4 Presenting the results of one-way ANOVAs

5.5 Repeated measures ANOVA

5.6 The Kruskal–Wallis test

5.9 The Scheirer–Ray–Hare Test

5.11 Self-assessment problems

6 Investigating relationships

6.2 Examining data for relationships

6.5 Statistical tests for linear relationships

6.8 Studying common non-linear relationships

6.9 Dealing with non-normally distributed data: rank correlation

6.10 Self-assessment problems

7 Dealing with categorical data

7.2 The problem of variation

7.3 The x2 test for differences

7.4 The x2 test for association

7.7 Self-assessment problems

8.3 Excluding confounding variables

8.4 Replication and pseudoreplication

8.5 Randomisation and blocking

8.6 Choosing the statistical test

8.7 Choosing the number of replicates: power calculations

8.8 Dealing with your results

8.9 Self-assessment problems

9 More complex statistical analysis

9.1 Introduction to complex statistics

9.2 Experiments investigating several factors

9.3 Experiments in which you cannot control all the variables

9.4 Investigating the relationships between several variables

9.5 Exploring data to investigate groupings

10 Presenting and writing about statistics

10.1 Introduction – less is more!

10.2 The introduction section

10.5 The discussion section

10.6 The abstract or summary

Table S1: Critical values for the t statistic

Table S2: Critical values for the correlation coefficient r

Table S3: Critical values for the x2 statistic

Table S4: Critical values for the Wilcoxon T distribution

Table S5: Critical values for the Mann–Whitney U distribution

Table S6: Critical values for the Friedman x2 distribution

Table S7: Critical values for the Spearman rank correlation coefficient r


Sample Preparation with Nanomaterials. Next Generation Techniques and Applications. Edition No. 1

Sample Preparation with Nanomaterials: Next Generation Techniques for Sample Preparation delivers insightful and complete overview of recent progress in the use of nanomaterials in sample preparation. The book begins with an overview of special features of nanomaterials and their applications in analytical sciences. Important types of nanomaterials, like carbon nanotubes and magnetic particles, are reviewed and biological sample preparation and lab-on-a-chip systems are presented.

The distinguished author places special emphasis on approaches that tend to green and reduce the cost of sample treatment processes. He also discusses the legal, economical, and toxicity aspects of nanomaterial samples. This book includes extensive reference material, like a complete list of manufacturers, that makes it invaluable for professionals in analytical chemistry.

Sample Preparation with Nanomaterials offers considerations of the economic aspects of nanomaterials, as well as the assessment of their toxicity and risk. Readers will also benefit from the inclusion of:

  • A thorough introduction to nanomaterials in the analytical sciences and special properties of nanomaterials for sample preparation
  • An exploration of the mechanism of adsorption and desorption on nanomaterials, including carbon nanomaterials used as adsorbents
  • Discussions of membrane applications of nanomaterials, surface enhanced raman spectroscopy, and the use of nanomaterials for biological sample preparation
  • A treatment of magnetic nanomaterials, lab-on-a-chip nanomaterials, and toxicity and risk assessment of nanomaterials

Perfect for analytical chemists, materials scientists, and process engineers, Sample Preparation with Nanomaterials: Next Generation Techniques for Sample Preparation will also earn a place in the libraries of analytical laboratories, universities, and companies who conduct research into nanomaterials and seek a one-stop resource for sample preparation.

1 Nanomaterials (NMs) in Analytical Sciences
1.1 Introduction
1.2 Types of NMs
1.3 Applications of NMs
1.4 Conclusions
مراجع

2 Special Properties of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
2.1 Introduction
2.2 Mechanical Properties of NMs
2.3 Thermal Properties of NMs
2.4 Electrical Properties of NMs
2.5 Optical Properties of NMs
2.6 Magnetic Properties of NMs
2.7 Adsorption Properties of NMs
2.8 Conclusions
مراجع

3 Adsorption Mechanism on Nanomaterials (NMs)
3. 1Introduction
3.2 Adsorption Process
3.3 Conclusions and Future Perspective
مراجع

4 Carbon Nanomaterials (CNMs) as Adsorbents for SamplePreparation
4.1 Introduction
4.2 Carbon Nanomaterials (CNMs)
4.3 Adsorption on CNMs
4.4 Applications of CNMs
4.5 Conclusions
مراجع

5 Membrane Applications of Nanomaterials (NMs)
5.1 Introduction935.2Traditional Membranes
5.2 Traditional Membranes
5.3 Carbon Nanomaterial-based Membranes
5.4 Nanoparticle-based Membranes
5.5 Molecularly Imprinted Polymer (MIP)-based Membranes
5.6 Conclusions
مراجع

6 Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) withNanomaterials (NMs)
6.1 Introduction
6.2 Theory of SERS
6.3 SERS Mechanisms
6.4 Determination of SERS Enhancement Factor
6.5 Selection Rules
6.6 Fabrications of SERS Substrates
6.7 Applications of SERS
6.8 Conclusions
مراجع

7 Nanomaterials (NMs) for Biological Sample Preparations
7.1 Introduction
7.2 The Use of NMs in Diagnostic Platforms
7.3 NMs-based Lab-on-a-chip (LOC) Platforms
7.4 Biomedical Applications of NMs
7.5 Sensor Applications of NMs
7.6 Conclusions

8 Magnetic Nanomaterials for Sample Preparation
8.1 Introduction
8.2 Synthesis of Magnetic Nanoparticles
8.3 Solid-Phase Extraction (SPE)
8.4 Magnetic Solid-Phase Extraction (MSPE)
8.5 Conclusions and Future Trends
مراجع

9 Lab on Chip with Nanomaterials (NMs)
9.1 Introduction
9.2 Lab-on-a-Chip (LOC) Concept
9.3 NM-Based LOC Platforms
9.4 Conclusions and Future Perspectives
مراجع

10 Toxicity and Risk Assessment of Nanomaterials
10.1 Introduction
10.2 Hazard Assessment of Nanomaterials
10.3 Toxicity Mechanism of Nanomaterials
10.4 The Traditional Risk Assessment Paradigm
10.5 Strategies for Improving Specific Risk Assessment
10.6 Conclusions
مراجع

11 Economic Aspects of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
11.1 Introduction
11.2 Toxicity Concerns of NMs
11.3 Global Market for NM-Based Products
11.4 Conclusions
مراجع

12 Legal Aspects of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
12.1 Introduction
12.2 Safety Issues of NMs
12.3 Regulatory Aspects of NMs
12.4 Conclusions
مراجع

13 Monitoring of Nanomaterials (NMs) in the Environment
13.1 Introduction
13.2 Toxicity and Safety Concerns of NMs
13.3 Main Sources and Transport Routes of Nanopollutants
13.4 Requirements of Analytical Approaches
13.5 Sampling of NMs in Environmental Samples
13.6 Separation of NMs in Environmental Samples
13.7 Detection Techniques for the Characterization of NMs
13.8 Conclusions
مراجع

14 Future Prospect of Sampling
14.1 Introduction
14.2 Sampling
14.3 Sample Preparation
14.4 Green Chemistry
14.5 Miniaturization of Analytical Systems
14.6 Conclusions
مراجع


4. مناقشة

Given the urgent need to control the COVID-19 pandemic, vaccine development is being accelerated into the clinical trials phase [4] , [7] , [8] , even though understanding of the immunologic features of the antigens of SARS-CoV-2 remains poor. In this phase I trial, a study was performed to investigate the safety and immunogenicity of this inactivated vaccine in 191 subjects. The data collected show several notable features. First, the clinical safety observations among the 191 subjects suggest that there were no severe adverse reactions related to vaccination, and the most frequently reported events were mild, including redness, itching and swelling at the inoculation site and a few cases of slight fatigue there were no significant differences between the vaccine and control groups. These data support the clinical safety of this vaccine. However, based on the current concern about the possibility of immunopathology due to SARS-Cov-2 infection [16] , we extended our safety observations to the investigation of variations in immune cell populations and cytokine levels in the peripheral blood. The test results suggested that there were no abnormalities in most of the 48 detected cytokines and the proportions of immune cells. Second, not only did serological detection show the presence of neutralizing antibodies, antibodies against the S protein, the N protein and the complete virion antigens were also found in ELISA assays to have been elicited in the vaccinated population, and there were dynamic alterations in the levels of these antibodies based on the dose and the vaccination schedule. However, the medium and high doses in both the 0, 14 and 0, 28 schedule groups led to 100% seroconversion of ELISA anti-S antibody after two inoculations, and interestingly, the medium dose group assigned to the 0, 14 schedule reached 100% seroconversion of the neutralizing antibody with the highest GMT value. However, the high-dose group exhibited lower seroconversion and GMT values. According to our understanding, this result might be due to the medium dose providing suitable signal stimulation to the immune system or the limited sample size. Therefore, further investigations in phase II and III trials are necessary. Additionally, the neutralizing antibody can neutralize different pandemic strains with diverse mutations. However, the GMT of neutralizing antibodies measured in this trial is obviously lower than the GMTs observed in the trials of mRNA vaccines developed by Moderna and Pfizer [17] , [18] this difference suggests that characteristic immune responses are elicited by mRNA vaccines and vaccines against the inactivated virus and that these vaccines should be evaluated based upon their clinical protective efficacy [19] . At the time of the antibody response, a CTL response with IFN-gamma specificity against the S, N and virion antigens was detected in immunized individuals in comparison with individuals receiving the placebo this suggests that any one of these three antigens enables the specific activation of T cells even if the immune response does not show dose-dependent effects. These immunological indexes indicate that a systemic immune response was elicited by our vaccine in the human population. To examine the genetic diversity of the specific immunity elicited by the vaccine, we examined the mRNA gene profile of the PBMCs from vaccinated individuals and found that most of the expressed mRNA genes were related to various signaling pathways of the innate and adaptive immune systems, and the immune functions were upregulated in comparison with the placebo group. Here, activation of the multiple signaling pathways involved in the immune response resulted in variations in hundreds of genes related to activation of innate immunity at day 7 after booster immunization regardless of the immunization schedule however, the cytokines that were found to have elevated levels in COVID-19 patients had only mild variations and were at levels similar to those in the placebo control group, which corresponded with those detected in the serum. The activation of genes related to T cells, B cells, DCs and mononuclear cells/macrophages with varying dynamics is evidence of the immune resonse elicited by the vaccine. All the data obtained in this trial support the safety and immunogenicity of this inactivated vaccine and are encouraging with regard to further studies of its efficacy in the future.

A limitation of this study is the lack of analysis of the protective efficacy of the vaccine and the lack of a comparative transcriptional analysis of PBMCs from vaccinated individuals and COVID-19 patients the latter comparison was not possible because few blood samples have been obtained from COVID-19 patients in mainland China at this time.


The Exams

The external assessment

The IB uses a criterion based approach to assessment. This means that students work is judged against identified levels of attainment and not against the work of other students. At the grade award meeting which takes place once all the papers have been marked levels of attainment, in the form of grade boundaries are agreed. There is consideration of the difficulty of the exams and the performance of students and a committee of people are involved.

Several methods of assessment are used: Assessment criteria when the task in open ended, Markbands with a range of level descriptors used to judge students answers to some extended response questions, Analytic markschemes where a particular kind of response is required, and Marking notes are used to clarify assessment criteria.

Examiners are monitored throughout the marking process and ever effort is made to ensure consistency in marking.

Standard Level

Multiple choice questions are quite challenging and students need practice with the style.

Each question has a "distractor" or answer which is almost correct. Usually one or two answers are quite obviously wrong.

The data analysis questions at the beginning of this paper require good skills in the interpretation of graphs but also an ability to cope with unfamiliar material.

The short answer questions are the least complicated part of the external assessment. If a student knows the biology these questions resemble the work a student often does using text books and worksheets in lessons. The challenge is to be prepared to answer questions on any part of the IB Biology guide.

There is a choice of two extended response questions, students must answer all three sections of one question. Care is required in reading the questions, in particular the command term so that students give the right sort of answers. Often there is one part which requires a diagram.

Historically, many students find this exam easier than paper 2 because there is less syllabus coverage and students can prepare more thoroughly for the option material. There are two or three questions in section A which will test knowledge of practical experiment skills and analysis of results from any part of the core topics and the prescribed experiments. Section B resembles the short answer section of paper 2 except that it covers only material from the chosen option. Students should be trained in choosing the correct option and only answering questions from one option.

Internal Assessment

This investigation is assessed by the teacher in school and a sample of work is moderated by the IB and adjustments made to marks so that all centres are awarding marks in a similar standard. For further details see The Investigation pages.

Higher Level

Although the length of all the exams for HL is longer than the SL exams, the structure of all examinations and the investigation is the same as for SL.

The only exception is in Paper 2 where students will have a choice of two out of three extended response questions. The weighting of paper two is slightly less that the SL paper 2 to allow for assessment of the extra HL material in the option paper.


Riffle Sample Splitters with chutes

Riffle sample Splitters, also called Sample Dividers with Chutes, allow dividing samples into two representative subsamples with a good accuracy.

Riffle Sample Splitter is the most universally used sampling device for preparing representative splits of dry, free-flowing granular product.

The technique is rapid and the equipment is economical.

It is precisely designed to reduce the bulk of material to a convenient representative size for laboratory analysis. When used properly, it provides an accuracy that is recognized through out the industry

With Riffle Sample Splitters, a homogenous, dry, free-flowing sample is poured evenly into the hopper / funnel. The material flows through the alternately arranged passages in the opposite direction (chutes / riffle bank) into the two collecting pans under the dividing head outlets. With every operation the feed sample is divided in two representative subsamples. The operation can be repeated as many times as necessary, until the required dividing quantity has been obtained.


8.3: Sample preparation - Biology

There are two methods to transform بكتريا قولونية cells with plasmid DNA - chemical transformation and electroporation. For chemical transformation, cells are grown to mid-log phase, harvested and treated with divalent cations such as CaCl2. Cells treated in such a way are said to be competent. To chemically transform cells, competent cells are mixed with the DNA , on ice, followed by a brief heat shock. Then, cells are incubated with rich medium and allowed to express the antibiotic resistant gene for 30-60 minutes prior to plating. For electroporation, cells are also grown to mid-log phase but are then washed extensively with water to eliminate all salts. Usually, glycerol is added to the water to a final concentration of 10% so that the cells can be stored frozen and saved for future experiments. To electroporate DNA into cells, washed بكتريا قولونية are mixed with the DNA to be transformed and then pipetted into a plastic cuvette containing electrodes. A short electric pulse, about 2400 volts/cm, is applied to the cells causing smalls holes in the membrane through which the DNA enters. The cells are then incubated with broth as above before plating.

For chemical transformation, there is no need to pre-treat the DNA. For electroporation, the DNA must be free of all salts so the ligations are first precipitated with alcohol before they are used.

تصميم تجريبي :

To determine the efficiency of transformation, a positive control transformation should be done using 1 ng of uncut plasmid DNA, e.g. pUC19. The efficiency of transformation is calculated as the number of transformants/&mug of input DNA. A negative control should also be included that contains cells with no added DNA.

A negative control with cells only (no added DNA) should also be included.

For most cloning applications, we use DH5&alpha host cells. These cells are compatible with لاكز blue/white selection procedures, are easily transformed, and good quality plasmid DNA can be recovered from transformants. One notable exception is when transforming with plasmid constructs containing recombinant genes under control of the T7 polymerase. These constructs are typically transformed into DH5&alpha for the cloning phase, but need to be transformed into a different bacterial strain, BL21(DE3) for expression of the recombinant protein (BL21 strains carry the gene for expression of the T7 polymerase).

Electroporation of بكتريا قولونية:

  • Sterile centrifuge bottles &ndash 250 ml for GSA rotor
  • SOB medium
  • بكتريا قولونية host strain such as DH5&alpha
  • WB (10% redistilled glycerol, 90% distilled water, v/v) chilled to 4°C&ndash need 500 ml of WB for each 250 ml of culture
  • tRNA (5-10 µg/ml &ndash used as a mass carrier to increase the efficiency of precipitation)
  • 5 M ammonium acetate
  • 100% ethanol
  • 70% ethanol
  • 0.5X TE or EB (10 mM Tris, pH 8.3)
  • SOC medium
  • transformation plates

I. Preparation of بكتريا قولونية cells for electroporation.

1. Use a fresh colony of DH5&alpha (or other appropriate host strain) to inoculate 5 ml of SOB (without magnesium) medium in a 50 ml sterile conical tube. Grow cells with vigorous aeration overnight at 37°C.

2. Dilute 2.5 ml of cells into 250 ml of SOB (without magnesium) in a 1 liter flask. Grow for 2 to 3 hours with vigorous aeration at 37°C until the cells reach an OD550 = 0.8.

3. Harvest cells by centrifugation at 5000 RPM in a GSA rotor for 10 min in sterile centrifuge bottles. (Make sure you use autoclaved bottles!).

4. Wash the cell pellet in 250 ml of ice-cold WB as follows. First, add a small amount of WB to cell pellet pipet up and down or gently vortex until cells are resuspended. Then fill centrifuge bottle with ice cold WB and gently mix. NOTE- the absolute volume of WB added at this point is not important.

5. Centrifuge the cell suspension at 5,000 RPM for 15 min and carefully pour off the supernatant as soon as the rotor stops. Cells washed in WB do not pellet well. If the supernatant is turbid, increase the centrifugation time.

6. Wash the cell pellet a second time by resuspending in 250 ml of sterile ice-cold WB using the same technique described above. Centrifuge the cell suspension at 5000 RPM for 15 min.

7. Gently pour off the supernatant leaving a small amount of WB in the bottom of the bottle. Resuspend the cell pellet in the WB - no additional WB needs to be added &ndash and the final volume should be about 1 ml. Cells can be used immediately or can be frozen in 0.2 ml aliquots in freezer vials using a dry ice-ethanol bath. Store frozen cells at -70°C.

II. Preparing DNA for Electroporation

DNA for electroporation must have a very low ionic strength and a high resistance. The DNA may be purified by either dilution, precipitation or dialysis.

  • For transformation of purified plasmid DNA, dilute DNA in 10 mM Tris pH 8-8.3 to about 1-50 ng/µl (do not use TE). Use 1 µl for transformation.
  • For ligation reactions, use the following procedure.

Purifying DNA by Precipitation:

1. Add 5 to 10 &mug of tRNA to a 20 &mul ligation reaction in a 1.5 ml tube. Add 22 &mul 5M ammonium acetate (or an equal volume of ligation reaction with added tRNA). اخلط جيدا.

2. Add 100 &mul absolute ethanol (or 2.5 volumes of ligation reaction, tRNA and salt). Ice 15 min.

3. Centrifuge at >12,000 x g for 15 min at 4°C. Carefully decant the supernatant.

4. Wash the pellet with 1 ml of 70% ethanol. Centrifuge at >12,000 x g for 15 min at room temperature. Remove the supernate.

5. Air dry the pellet (speed vac okay but don't overdry).

6. Resuspend the DNA in EB buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3) or 0.5X TE buffer [5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA (pH 7.5)] to a concentration of 10 ng/ul of DNA. For ligation reactions, it is convenient to resuspend in 10 µl. Use 1 &mul per transformation of 20 &mul of cell suspension.

ثالثا. Electroporation.

1. Mark the required number of micro centrifuge tubes. Place the required number of Micro-electroporation Chambers on ice. Fill the temperature control compartment of the Chamber Safe with

250 ml of ice-water slurry and place the Chamber Rack in the Chamber Safe.

2. Thaw an aliquot of cells that have prepared as in Section I and aliquot 20 µ l of cells to the required number of microfuge tubes on ice. Add 1 µ l of the DNA (or ligation reaction) prepared as in Section II.

3. Using a micro pipette, pipette 20 µ l of the cell-DNA mixture between the bosses in a Micro-Electroporation Chamber. Do not leave an air bubble in the droplet of cells the pressure of a bubble may cause arcing and loss of the sample. Place the chamber in a slot in the Chamber Rack and note its position. Repeat the process if more than one sample is to be pulsed. Up to 4 samples can be placed in the Chamber Rack at one time. Handle the chambers gently to avoid accidentally displacing the sample from between the bosses.

4. Close the lid of the Chamber safe and secure it with the draw latch.

5. Plug the pulse cable into the right side of the Chamber safe.

6. Turn the chamber selection knob on top of the Chamber Safe to direct the electrical pulse to the desired Micro-Electroporation Chamber.

7. Set the resistance on the Voltage Booster to 4 k&Omega set the Pulse Control unit to LOW and 330 µ F double check connections.

8. Charge the Pulse Control unit by setting the CHARGE ARM switch on the Pulse Control unit to CHARGE and then pressing the UP voltage control button until the voltage reading is 5 to 10 volts higher than the desired discharge voltage. ل بكتريا قولونية, the standard conditions are 2.4 kv, which means setting the Pulse Control unit to 405 volts (400 volts is the desired discharge voltage + 5). The voltage booster amplifies the volts by

6-fold such that the total discharge voltage is 2400 volts, or 2.4 kv. The actual peak voltage delivered to the sample will be shown on the Voltage Booster meter بعد، بعدما the pulse is delivered.

9. Set the CHARGE/ARM switch to the ARM position. The green light indicates that the unit is ready to deliver a DC pulse. Depress the pulse discharge TRIGGER button and hold for 1 second.

NOTE: The DC voltage display on the Pulse Control unit should read <10 volts after a pulse has been delivered. If not, discharge the capacitor using the DOWN button.

10. For additional samples, turn the chamber selection knob to the next desired position and repeat steps 8 and 9 until all samples are pulsed.

11. For ampicillin selection, inoculate the samples into 2 ml of SOC medium and shake for 30 minutes (for amp), 60 minutes (for Kan) to allow expression of the antibiotic gene. Plate cells on LB medium with appropriate antibiotic or screening reagent (e.g. 100 µg/ml ampicillin, and/or 40 &mul of 20 mg/ml X-Gal, XP, and 40 &mul of 100 mM IPTG) .

This Web page is maintained by Julie B. Wolf, UMBC
Last updated on 3/2/2010

is designed for students interested in careers in industrial and biomedical sciences.


شاهد الفيديو: العينات غير الاحتمالية (ديسمبر 2022).