معلومة

منتجات PCR مع عدم وجود شريط في هلام

منتجات PCR مع عدم وجود شريط في هلام


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا طالب دكتوراه ولا أزال محتجزًا في نتائج الهلام.

أنا أستخدم ما يلي

  • 1 ميكرولتر برايمر R (20 ملم)
  • 1 ميكرولتر برايمر f (20 ملم)
  • 1 ميكرولتر dNTP (10 ملم)
  • قالب DNA 1 ميكروليتر (448 نانوغرام)
  • 1 ميكرولتر TAQ بوليميراز
  • تمت إضافة 5 ميكرولتر عازلة (10x) MgCl2 بنسبة 1: 1
  • 30 ميكرولتر ماء بدرجة PCR

برنامج:

  • 95 لمدة 4 دقائق
  • 95 لمدة 45 ثانية
  • 55-65 لمدة 1.20 دقيقة
  • 72 لمدة 1 دقيقة
  • دورة التدرج 35
  • 72 لمدة 4 دقائق

جل:

110 فولت ، 200 ميللي باسكال لمدة 30-45 دقيقة

أحصل على منتجات PCR كما في الصور. لا توجد عصابات بينما توجد شرائط مكثفة في الأسفل وبعض الآبار.

سؤالي هل هذا في أسفل المنتجات ؟؟ ما الذي يمكن عمله لجعلها حقيقية؟ إذا لم يكن كذلك ، فلماذا توجد اختلافات بين مسارين من الآبار. تمثل كل 12 بئر نوعًا واحدًا من قالب الحمض النووي (استخدمت ثلاثة كائنات مختلفة DNA).


استخدم بادئات التحكم التي تستهدف شيئًا ما يعطي بالتأكيد منتجًا. إذا لم يكن لديك أي شيء ، فاسأل زملائك أو استبعد بعض الأدبيات. تأكد من أن منتجك صغير بما يكفي لتضخيمه في الوقت المحدد وتحقق من النطاق الصحيح باستخدام إنزيم التقييد.


لست متأكدًا من مقياس سلمك ، لكن بغض النظر عن الحمض النووي الذي يسبب النطاقات ، فهو صغير جدًا. هم على الأرجح ثنائيات التمهيدي. أود التحقق من تسلسل التمهيدي للتأكد من عدم وجود الكثير من التكامل. يمكنك أيضًا محاولة معالجة ظروف التفاعل مثل تركيز كلوريد المغنيسيوم أو البادئات نفسها وما إلى ذلك. أود تشغيل مجموعة تحسين من تفاعلات تفاعل البوليميراز مع ظروف تفاعل متغيرة.


تخميني الأول هو أنك تستخدم الكثير من قوالب الحمض النووي لهذه الظروف. تضيء آبارك قليلاً ، 448 نانوغرام هي أيضًا في الجانب المرتفع.

جرب تركيزات أقل من قالب DNA (1-100 نانوغرام) ، ربما فقط بخطوة تلدين 55 درجة مئوية. في الوقت الحالي ، ليس لديك أي منتج على الإطلاق ، لذلك لا داعي للقلق بشأن عدم التحديد حتى الآن (و 10 درجات مئوية هي أيضًا نطاق صغير جدًا لإصلاح ذلك).

الأشياء الأخرى التي تبرز:

  • أفترض أنه 20 أوم التمهيدي ، وليس مم
  • أنت تضيف الكثير من المخزن المؤقت
  • يبدو أنك تقوم بكل رد فعل على حدة (بالنظر إلى مقادير القوالب في أول 12) ، أقترح عمل مزيج رئيسي وقسمة.
  • لديك مساحة كافية لتشغيل الجل لفترة أطول ، وقد يكون ذلك مفيدًا جدًا إذا حصلت على بعض المنتجات.

يجب أن يكون لديك المزيد من المعلومات أيضًا. ما هو حجم المنتجات التي تتوقعها؟ هل تستخدم كائنات عالية GC؟ هل كانت هذه البادئات تعمل من قبل لأشخاص آخرين؟ هل عمل الحمض النووي الجينومي من قبل لأشخاص آخرين؟

لدى NEB الكثير من المعلومات المفيدة حول PCR وأعمال الحمض النووي الأخرى على موقع الويب الخاص بهم ، تحقق من ذلك: https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with -tq-dna-polymerase


ما يمكنك تجربته هو حلول مخزن مؤقت مختلفة (10 ×) ، أيضًا مع أو بدون MgCl2. في المعمل حيث كنت أعمل مع PCR ، كان لدينا لوحة من مخازن PCR مختلفة في المجمد. اختبرنا بعضًا منها ، لمعرفة أيهما أكثر ملاءمة (ومن ثم أيهما أعطى النطاق المناسب للحجم). تمامًا مثل تدرج درجة الحرارة لديك ، لمعرفة أيهما أفضل أداءً.


يمكنك محاولة الهبوط PCR. غالبًا ما يكون مفيدًا في حالة عدم وجود فرقة.


7.4: التمرين 2 - توقع أحجام منتجات PCR

  • بمساهمة من Clare M. O & rsquoConnor
  • أستاذ مشارك فخري (علم الأحياء) في كلية بوسطن

في المختبر التالي ، ستحلل منتجات تفاعل PCR على هلام الاغاروز الذي يفصل جزيئات الحمض النووي وفقًا لأحجامها. لتفسير هذه النتائج ، سيكون من المهم أن تحسب الأحجام المتوقعة لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من ردود أفعالك. للمساعدة في هذه الحسابات ، قم بإعداد خريطة بسيطة للمنطقة الجينومية تحتوي على الجين الخاص بك مع تسلسل التمهيدي المتوافق مع تسلسل الجينوم. يجب أن تحتوي جميع منتجات PCR على جزء من التقى الجين و rsquos 5 & rsquo-flanking region بسبب التمهيدي A. قد يحتوي منتج PCR أو لا يحتوي على أجزاء من التقى gene & rsquos CDS ، اعتمادًا على ما إذا كنت تقوم بتحليل سلالة مع الأم أو معطلة التقى الجين. لتكوين خريطتك ، يمكنك الاستفادة من سجلات تسلسل الجينوم الخاصة التي أعدها القيمون على SGD. تحتوي هذه السجلات على CDS الخاص بك التقى الجين مع 1 كيلو بايت من المنبع و 1 كيلو بايت من تسلسل المصب. أنشأ القيمون على SGD هذه السجلات لأن الباحثين غالبًا ما يهتمون بدراسة العناصر التنظيمية التي تتحكم في نسخ الجين ومعالجة نسخ الجينات. في S. cerevisiae، عادة ما توجد هذه العناصر التنظيمية في حدود 1 كيلو بايت من CDS.

A هو 357 نيوكليوتيدات المنبع من SAM1بدء الكودون (نيوكليوتيد 1001). تضيف منتجات Primer B المرتكزة 280 نقطة أساس من أقراص CDS إلى منتج PCR. الحجم المتوقع لمنتج PCR هو 357 + 280 نقطة أساس ، أو 637 نقطة أساس. إذا تم استخدام سلالة الحذف لـ PCR ، فإنSAM1 لا ينتج عن البادئات A و B منتج PCR. في حين أن، SAM1 التمهيدي أ وكان ر سيولد التمهيدي B منتج 607 نقطة أساس (357 + 250) ، لأن كان ر التمهيدي B يرتبط بالنيوكليوتيدات 231-250 من كان ر CDS.

ستحتاج إلى نافذتي متصفح لهذا التمرين. يجب أن يعمل كل عضو في المجموعة بجين واحد.

ابحث عن التسلسل الجيني لجينك.

& bull انتقل إلى صفحة ملخص الجينات و rsquos في SGD (yeastgenome.org)
& bull انقر فوق علامة تبويب التسلسل أعلى صفحة الملخص.
& bull المؤشر وصولاً إلى تسلسل الجينات لـ S288C. حدد & ldquo تسلسل جينومي +/- 1 كيلو بايت و rdquo من مربع القائمة المنسدلة.
& bull لاحظ أسفل إحداثيات البداية والنهاية للتسلسل وحساب طول التسلسل. (يجب أن ترى كود بدء ATG عند النيوكليوتيدات 1001-1003.)

طول التسلسل (بي بي) __________

طول تسلسل الترميز ___________

محاذاة تسلسل التمهيدي مع التسلسل الجيني.

للعثور على موضع البادئات في التسلسل الجيني ، سنستخدم أداة NCBI & rsquos BLAST. يرمز "بلاست" إلى "أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية" ويمكن استخدامه لمحاذاة تسلسل البروتين أو الحمض النووي. سوف تتعلم المزيد عن خوارزميات بلاست في الفصل التاسع.

  • قم بتوجيه المستعرض الخاص بك إلى موقع NCBI وحدد BLAST من قائمة الموارد الموجودة على اليمين.
  • حدد Nucleotide BLAST من قائمة برامج BLAST الأساسية.
  • انقر فوق المربع ldquo ومحاذاة تسلسلين أو أكثر. & rdquo انسخ & ldquoالتسلسل الجيني +/- 1kb و rdquo من عند

SGD والصق التسلسل في مربع تسلسل الموضوع السفلي.

هي 25 نيوكليوتيدات طويلة. هذا أقصر من القيمة الافتراضية 28 لـ & ldquowords & rdquo في BLASTN (خوارزمية لمقارنة تسلسل النوكليوتيدات). لن يقوم BLAST بمحاذاة تسلسلين إذا كان التطابق أصغر من 28 نيوكليوتيد. قم بتوسيع معلمات الخوارزمية & ldquoalgorithm & rdquo في أسفل الصفحة. حدد حجم & ldquoword & rdquo أقل من 28.

ارسم خريطة لمواقع الربط الجيني والتمهيدي في المساحة أدناه. قم بتضمين كود البدء والمسافات في bp.


هيكل الاغاروز

Agarose ، المنتج من الأعشاب البحرية ، هو أجار متعدد السكاريد. أثناء البلمرة ، ترتبط بوليمرات الاغاروز بشكل غير تساهمي وتشكل شبكة من الحزم. تتكون هذه الشبكة من مسام لها خصائص الترشيح الجزيئي.

التقديم المفاهيمي لجل الاغاروز على المستوى المجهري.

يحدث فصل الحمض النووي بسبب الطبيعة الشبيهة بالشبكة لجيل الاغاروز. يمكن لشظايا الحمض النووي الأصغر أن تتحرك بسرعة عبر المسام ، بينما تحصل الأجزاء الأكبر منها القبض وبالتالي السفر ببطء.

دعونا نلقي نظرة على كيفية عمل كل هذا. تحت مجهر قوي ، سيبدو الجل مساميًا ، لكن بالعين المجردة ، يبدو مثل الجيلاتين الناعم المعتم على شكل مربع به آبار بالقرب من أحد طرفي السطح. البئر عبارة عن جيب مجوف في الهلام حيث يتم تحميل الحمض النووي. بسبب العمود الفقري للفوسفات سالب الشحنة ، يحمل الحمض النووي شحنة سالبة طفيفة تسمح للجزيء بالانتقال إلى القطب الموجب الشحنة. تتناسب مسافة انتقال جزيئات الحمض النووي داخل هلام الاغاروز مع سجل وزنها الجزيئي.


المواد والأساليب

المخازن والحلول -

يتم تحضير مخازن Tris acetate-EDTA (TAE) و Tris-EDTA (TE) (10 ×) كما وصفها Sambrook و Russell [4]. يحتوي المخزن المؤقت Topoisomerase 1 (10 ×) على Tris-HCl (0.5 M) ، ودرجة الحموضة 7.5 KCl (0.5 M) MgCl2 (0.1 م) EDTA (1.0 م م) ديثيوثريتول (DTT) (5.0 م م) ، وألبومين مصل الأبقار (300 ميكروغرام / مل). يحتوي محلول تخزين Topoisomerase (1 ×) على فوسفات البوتاسيوم (30 م M ، درجة الحموضة 7.0) DTT (5.0 م م) EDTA (0.1 م م) جلسرين (50٪ حجم / حجم) و Triton X-100 (0.1٪ وزن / حجم) . تم الحصول على محلول React ™ 3 من Invitrogen (كارلسباد ، كاليفورنيا). يحتوي محلول عينة هلام الحمض النووي على 0.1٪ (وزن / حجم) أزرق برومفينول 10٪ (حجم / حجم) جلسرين في 0.05 مولار تريس ، الرقم الهيدروجيني 7. يحتوي محلول تلطيخ إيثيديوم بروميد على 10 ميكرولتر من محلول 10 مجم / مل من بروميد الإيثيديوم في 100 مل من الماء منزوع الأيونات.

DNA البلازميد -

DNA البلازميد (pUC118، Genbank accession no. U07649.1، 3162 bp) [5] محضر من 250 مل مزارع من الإشريكية القولونية التي تم تحويلها باستخدام pUC118 ونمت كما هو موصوف في Sambrook و Russell [4]. بعد الحصاد بالطرد المركزي ، يتم الحصول على DNA البلازميد من حبيبات البكتيريا عن طريق التحلل القلوي باستخدام SDS ويتم تنقيته عن طريق الطرد المركزي المتوازن في التدرجات المستمرة لكلوريد السيزيوم بروميد الإيثيديوم. يتم تعليق البلازميد المنقى في محلول TE لإعطاء تركيز DNA نهائي قدره -1 مجم / مل ويتم تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية. ينتج عن مزرعة واحدة سعة 250 مل حوالي 0.5 - 1 مجم من الحمض النووي. يعطي DNA البلازميد المحضر بهذه الطريقة نتائج أفضل باستمرار لهذه العملية التي يتم تحضيرها بواسطة طرق كروماتوجرافية تعتمد على الراتنج.

DNA M13—

ثقافة بكتريا قولونية JM109 مصاب بالعاثية M13mp18 [6] (Genbank accession no. M77815.1، 7250 nt) كما هو موصوف في Sambrook و Russell [4]. تضاف الخلايا المصابة إلى 250 مل من وسط Luria Bertani في قوارير سعة 2 لتر ويتم تحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات مع تهوية قوية. يتم فصل الخلايا المصابة وجزيئات الملتهمة عن طريق الطرد المركزي. يتم ترسيب جزيئات الملتهمة بواسطة البولي إيثيلين جلايكول ويتم تكويرها بالطرد المركزي. يتم عزل الحمض النووي الدائري أحادي الخيط من هذه الحبيبات من خلال الإجراءات الموضحة في Sambrook و Russell [4]. يتم عزل الشكل الدائري المغلق تساهميًا للحمض النووي M13 من الحبيبات البكتيرية بواسطة إجراء التحلل القلوي الموصوف أيضًا في Sambrook و Russell [4] ، ويتم تنقيته بواسطة الطرد المركزي المتوازن في كلوريد السيزيوم بروميد الإيثيديوم كما هو موصوف أعلاه. يتم تعليق كلا الشكلين من الحمض النووي بتركيز مناسب (0.5-1 مجم / مل) في محلول TE وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

الإنزيمات -

يتم الحصول على نوكلياز القيد EcoRI و DNA Topoisomerase DNA من العجل من Invitrogen. يتم تخفيف DNA Topoisomerase I في المخزن المؤقت لتخزين topoisomerase مباشرة قبل التجربة.

محلول جل الاغاروز -

هذه مصنوعة من محلول 0.7٪ من الاغاروز في TAE العازلة.

الجلستان 1 و 2

علبة جل أفقية مع مشط (10 بئر ، الجلسة 1 20 بئر ، الجلسة 2). مصدر طاقة مناسب.

100 مل من 0.7٪ [اغروس) في 1 × TAE العازلة. (ذاب وعقد عند 55 درجة مئوية في حمام مائي. لا تضيف بروميد الإيثيديوم إلى الاغاروز.)

1 × TAE عازلة كافية لجهاز الجل المستخدم.

100 مل من محلول تلطيخ بروميد إيثيديوم.

أنابيب ميكروسينتريفوج 1.5 مل.

ماصات قابلة للضبط (2-20 ميكرولتر ، 20-200 ميكرولتر ، 0.1-1.0 مل) مع رؤوس مناسبة.

الجلسة 1

70 ميكرولتر من DNA البلازميد (∼0.5-1 مجم / مل) في محلول TE.

مقياس الطيف الضوئي قادر على القراءات عند 260 نانومتر.

1 مل كوفيتات شفافة للأشعة فوق البنفسجية.

الجلسة الثانية

20 ميكرولتر من DNA البلازميد (200 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت TE).

20 ميكرولتر من M13 CCC DNA (200 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت TE).

20 ميكرولتر من الحمض النووي الدائري أحادي السلسلة M13 (200 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت TE).

10 ميكرولتر من العجل الغدة الصعترية DNA Topoisomerase I (Invitrogen) (وحدة واحدة / ميكرولتر مخففة في محلول تخفيف التوبويزوميراز مباشرة قبل بدء العملية العملية).

15 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل توبويزوميراز (10 ×).

20 ميكرولتر من خليط من 1 كيلو بايت معايير حجم الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (Invitrogen 1 كيلو بايت سلم).


طرق المختبر في علم الإنزيمات: DNA

1 النظرية

مطلوب فصل الأحماض النووية بناءً على حجمها للعديد من الممارسات المختبرية الشائعة (على سبيل المثال ، الاستنساخ الفرعي ، تشخيص النمط الجيني ، RT-PCR). يعمل فصل الأحماض النووية عن طريق الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز عن طريق تسخير الشحنة السالبة للعمود الفقري الفوسفات للأحماض النووية. تحتوي جزيئات DNA و RNA على صافي شحنة سالبة موزعة بالتساوي على طولها بالكامل بحيث تنتقل عبر مصفوفة agarose في مجال كهربائي باتجاه القطب الموجب. ستكون الأحماض النووية الأقصر قادرة على الهجرة عبر المصفوفة أسرع من الأحماض الأكبر خلال فترة زمنية معينة. اعتمادًا على النسبة المئوية للأغاروز المستخدم في صنع الهلام ، سيختلف نطاق الفصل الخطي.


لا تضخيم

1. جرب رد الفعل مرة أخرى ، ربما تكون قد تركت شيئًا.

2. تأكد من إذابة المخزن المؤقت للبوليميراز تمامًا وخلطه جيدًا.

3. تأكد من أن البادئات قد تم تخفيفها إلى التركيز الصحيح.

4. قم بإعداد حل dNTP جديد. يمكن تدمير dNTPs عن طريق دورات التجميد-الذوبان المتكررة.

5. أعد صنع قالب DNA ، خاصة إذا كنت تعمل بالحمض النووي الجيني. قد تتدهور المخزونات القديمة أو تنفصل.

6. استخدم بوليميراز مختلف. إذا كان التضخيم يمثل مشكلة مع بوليميراز التدقيق اللغوي ، فغالبًا ما أحاول استخدام Taq القديم الجيد وهذا غالبًا يحل المشكلة. تذكر تسلسل الإدخال على الرغم من & # 8211 إذا كنت محظوظًا فلن يكون هناك أي طفرات مهمة ويمكنك استخدام الملحق كما هو. خلاف ذلك ، أعد إجراء PCR بمزيج من Taq و 1 / 10th تركيز إنزيم إثبات القراءة الخاص بك ويجب أن تحصل على نفس التضخيم مع معدل خطأ أقل.

7. تغيير درجة حرارة التلدين. إذا كانت درجة حرارة التلدين عالية جدًا ، فمن الواضح أنك لن تحصل على أي تحضير حسب التسلسل الذي تريده. من ناحية أخرى ، يمكن أن تؤدي درجة حرارة التلدين المنخفضة جدًا إلى مثل هذا التمهيد غير المحدد الذي لا يسمح بنشوء نطاقات محددة. أفضل طريقة للعثور على درجة الحرارة المثلى هي استخدام دورة التدرج واختبار نطاق من أدنى تمهيدي Tm إلى 10 درجة مئوية أدناه بزيادات 1 درجة مئوية.

8. جرب ردود الفعل بتركيزات مختلفة للقالب. قد يكون تركيز القالب الخاص بك منخفضًا جدًا أو قد يكون تركيز الشوائب في الإعداد الخاص بك مرتفعًا جدًا. جرب 5-10 تفاعلات متوازية بتركيزات من 10 إلى 200 نانوغرام في تفاعل 50 ميكرولتر.

9. تحقق من الدوّار & # 8211 هل درجات الحرارة والأوقات كما تتوقع؟

10. جرب رد الفعل في دورة أخرى & # 8211 قد تكون معايرة التي تستخدمها متوقفة.

11. جرب مادة مضافة. أجد أن DMSO مفيد بشكل خاص في التضخيم الإشكالي.

12. إعادة تصميم البادئات & # 8211 حاول الالتزام بالمبادئ التوجيهية بأكبر قدر ممكن.


استكشاف أخطاء PCR وإصلاحها

ماذا يجب أن تفعل عندما يحدث خطأ في تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بك؟ يمكن أن تضعك الأسئلة الشائعة أدناه على طريق نحو PCR ناجح.

للحصول على نصائح حول كيفية إنقاذ تجاربك من تلوث PCR ، راجع مقالة المدونة هذه.

إذا لم يتم الحصول على منتجات تضخيم ، فما المعلمات التي يجب مراعاتها أولاً عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها؟

ضع في اعتبارك ما يلي:

  • أولاً ، تأكد من تضمين جميع مكونات PCR في التفاعلات. يجب دائمًا تضمين عنصر تحكم إيجابي لضمان وجود كل مكون وعمله.
  • إذا لم تكن هناك مشاكل في الإعداد التجريبي ، فقم بزيادة عدد دورات PCR (3 & ndash5 دورات في كل مرة) ، حتى 40 دورة. يمكن أن تؤدي زيادة رقم الدورة إلى التغلب على المشكلات المتعلقة بقالب الوفرة المنخفضة أو عدم إمكانية الوصول إلى القالب بسبب الشوائب أو ضعف كفاءة التحضير في البادئات.
  • إذا لم تؤدي زيادة رقم الدورة إلى تحسين النتائج ، فقد تكون شروط PCR صارمة للغاية بالنسبة لمجموعة أو قالب التمهيدي المعين. ضع في اعتبارك تعديل شروط PCR على النحو التالي:
    • اخفض درجة حرارة التلدين بزيادات قدرها 2 درجة.
    • زيادة وقت التمديد.
    • قم بزيادة مبلغ القالب. ارجع إلى الإرشادات المتوفرة مع الإنزيم لتحديد المقدار الأمثل للقالب.

    ضع في اعتبارك هذه الأسباب المحتملة الإضافية لفشل تفاعل البوليميراز المتسلسل:

    • مثبطات PCR في نموذج النموذج
      في حالة وجود مثبطات PCR ، فإن استخدام القالب المخفف قد يزيد من كفاءة PCR. بدلاً من ذلك ، قد يحتاج القالب إلى التنقية باستخدام مجموعة مثل NucleoSpin Gel و PCR Clean-up kit. إذا لم يكن تنقية القالب أمرًا محتملاً ، فقد يؤدي الإنزيم الذي يتمتع بقدرة أعلى على تحمل الشوائب ، مثل Terra PCR Direct polymerase ، إلى تحسين النتائج.
    • يحتوي القالب على & gt65٪ محتوى GC
      عند التضخيم من قوالب ذات محتوى عالٍ من GC ، استخدم إنزيمًا تمت صياغته لهذه الحالة. قم بزيارة دليل اختيار تفاعل البوليميراز المتسلسل للعثور على الإنزيم المناسب.
    • الاشعال ليس هو الأمثل
      تحقق من البرايمر وأعد تصميمه بعناية إذا لزم الأمر. ضع في اعتبارك أيضًا إعادة تضخيم منتج PCR الأساسي باستخدام تخفيفات بمقدار 10 أضعاف (1: 100 إلى 1: 10000) باستخدام بادئات متداخلة.

    عند استخدام PrimeSTAR HS DNA Polymerase ، ضع في اعتبارك:

    • استخدام كمية مناسبة من القالب. إذا كان القالب عبارة عن DNA جيني بشري أو مكتبة cDNA ، فلا تستخدم أكثر من

    عند استخدام PrimeSTAR Max DNA Polymerase ، ضع في اعتبارك:

    • ضبط وقت التمديد إذا كان خليط التفاعل يحتوي على قالب زائد. إذا تجاوزت كمية القالب 200 نانوغرام في خليط تفاعل 50- وميكروول ، فاضبط وقت التمديد بين 30 ثانية / كيلو بايت و 1 دقيقة / كيلو بايت.
    • زيادة تركيز البادئات.

    عند استخدام SpeedSTAR HS DNA Polymerase ، ضع في اعتبارك:

    • زيادة وقت التمديد. على الرغم من أن وقت التمديد القياسي هو 10 ثوانٍ / كيلو بايت ، إلا أنه يمكن زيادة وقت التمديد إلى

    إذا كانت هناك نطاقات تضخيم غير محددة ، فما الذي يمكن فعله لتحسين الخصوصية؟

    جميع بوليمرات Takara Bio PCR

    مشكلة:

    حل:

    استخدم محاذاة بلاست لتحديد ما إذا كانت الأطراف الثلاثة للبادئات مكملة لمواقع أخرى غير الموقع (المواقع) المستهدفة. أعد تصميم البادئات إذا لزم الأمر أو قم بتعديل شروط PCR.

    مشكلة:

    شروط PCR ليست صارمة بما فيه الكفاية.

    حلول:

    • زيادة درجة حرارة التلدين بزيادات قدرها 2 درجة.
    • استخدام اللمس PCR.
    • استخدم بروتوكول PCR من خطوتين.
    • تقليل عدد دورات PCR.

    مشكلة:

    تم استخدام قالب أكثر من اللازم.

    حل:

    قلل الكمية بمقدار 2 و ndash5 أضعاف.

    PrimeSTAR HS و PrimeSTAR Max DNA polymerases

    مشكلة:

    وقت التلدين طويل جدا.

    حل:

    لتحقيق تضخيم محدد ، من الضروري استخدام وقت تلدين قصير (5 & ndash15 ثانية) عند إجراء PCR من ثلاث خطوات.

    PrimeSTAR GXL DNA polymerases

    مشكلة:

    الاشعال لها T دون المستوى الأمثلم القيم.

    حل:

    لتضخيم الأهداف & lt1 kb ، صمم البادئات باستخدام T.م القيم & gt55 & degC ، واستخدام درجة حرارة التلدين 60 درجة مئوية. إذا كان التمهيدي T.م القيم هي & lt55 & degC ، جرب وقت تمديد أقصر يتراوح بين 5 و 10 ثوانٍ / كيلو بايت.

    تاكارا السابق طق وتاكارا لا طق بوليميرات الحمض النووي

    مشكلة:

    التمهيدي غير محدد التلدين في درجات حرارة منخفضة.

    حل:

    قد تعمل إصدارات البدء السريع من هذه الإنزيمات على تحسين النتائج لبعض البادئات.

    SpeedSTAR HS DNA Polymerase

    مشكلة:

    تلطيخ نطاقات منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على مادة هلامية.

    حل:

    قد تؤدي فترات التمديد الطويلة للغاية إلى تلطيخ. التوصية العامة لتمديد الوقت لهذا الإنزيم هي 10 & ndash20 ثانية / كيلو بايت. إذا كان عائد PCR منخفضًا ، فحاول زيادة عدد الدورات بمقدار 5.

    إذا كان تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يولد مسحة بعد وضع المنتجات على مادة هلامية ، فما الذي يمكن فعله لتحسين النتائج؟

    أولاً ، حدد مصدر اللطاخة باستخدام عناصر تحكم موجبة وسلبية (بدون قالب). يمكن أن يحدد هذا ما إذا كان سبب اللطاخة هو التلوث أو التدوير الزائد ، أو إذا كانت اللطاخة ناتجة عن مواد أولية سيئة التصميم أو ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) دون المستوى الأمثل.

    إذا كان عنصر التحكم السلبي فارغًا ، فلا يوجد تلوث. بدلاً من ذلك ، يجب تحسين شروط PCR مراعاة ما يلي عند ضبط شروط PCR:

    • تقليل حجم القالب.
    • زيادة درجة حرارة التلدين.
    • استخدام اللمس PCR.
    • تقليل عدد دورات PCR.
    • إعادة تصميم البرايمر.
    • استخدم مواد أولية متداخلة.
    • أعد تضخيم المنتج. (يمكن إزالة سدادة صغيرة من الجل باستخدام طرف الماصة الدقيقة ، ويمكن استعادة الحمض النووي عن طريق إضافة السدادة إلى 200 وماكرول من الماء ثم الحضانة عند 37 درجة مئوية. 5 & ميكرول من هذا المحلول يمكن استخدامه كقالب PCR لإعادة تضخيم.)

    إذا تم تلطيخ التحكم السلبي أيضًا ، فهناك تلوث. سوف تحتاج إلى تحديد مصدر هذا التلوث. قد يكون من الضروري استبدال كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل وتطهير الماصات ومحطة العمل الخاصة بك (انظر الأسئلة أدناه للحصول على مزيد من المعلومات حول التلوث).

    ما هي بعض مصادر تلوث تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

    هناك أربعة مصادر رئيسية لتلوث تفاعل البوليميراز المتسلسل:

    1. المصدر الأكثر شيوعًا للتلوث هو منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من التضخمات السابقة (يُطلق عليه "التلوث المرحل"). عندما يتم إنشاء كميات كبيرة من منتج PCR (10 12 جزيء) بشكل متكرر على مدى فترة من الزمن ، تزداد احتمالية التلوث.
    2. مصدر آخر للتلوث هو الحمض النووي المستنسخ الذي تم تداوله سابقًا في المختبر.
    3. يمكن أن يحدث تلوث من عينة إلى عينة أيضًا. من المرجح العثور على مصدر التلوث هذا في العينات التي تتطلب معالجة مكثفة قبل التضخيم.
    4. يمكن أن تتلوث التفاعلات أيضًا بالحمض النووي الخارجي في البيئة ، بما في ذلك الحمض النووي الموجود في معدات المختبرات وفي الكواشف المستخدمة لاستخراج الحمض النووي و PCR.

    كيف يمكن تجنب التلوث؟

    تتطلب حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل عدم تلوث العينات بأي حمض نووي خارجي أو أي منتجات تم تضخيمها سابقًا من بيئة المختبر. نوصي باستخدام مناطق متميزة لتحضير العينة وإعداد PCR وتحليل ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل.

    يوصى بخزانة التدفق الرقائقي المجهزة بمصباح UV لتحضير خلائط التفاعل. يجب إنشاء محطتين منفصلتين ماديًا عن بعضهما البعض.

    • قم بإنشاء "منطقة ما قبل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل" المخصصة لإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل فقط. يجب عدم إدخال أي عناصر من "منطقة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل" في هذه المنطقة ، بما في ذلك عناصر مثل أجهزة الكمبيوتر المحمولة والأقلام.
    • إنشاء "منطقة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل" التي تُستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتنقية الحمض النووي المضخم لـ PCR ، وقياس تركيز الحمض النووي ، وتشغيل المواد الهلامية agarose ، وتحليل منتجات PCR.

    يجب أيضًا أن تقتصر المعدات على هذه المناطق. يجب وضع جهاز PCR وجهاز التفريد في منطقة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. يوصى بشدة باستخدام الماصات وأطراف الماصات المزودة بمرشحات الهباء الجوي المخصصة لعينة الحمض النووي وإعداد خليط التفاعل فقط. تشمل التوصيات الإضافية ما يلي:

    • وجود مجموعات منفصلة من الماصات وأطراف الماصات ، ومعاطف المختبر ، وصناديق القفازات ، وسلال النفايات لمناطق ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل وما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    • وضع ملصقات على عناصر ما قبل وما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بحيث لا تتم إزالتها من منطقة العمل المخصصة لها.
    • باتباع القاعدة الذهبية لـ PCR: لا تجلب أبدًا أي كواشف أو معدات أو ماصات مستخدمة في منطقة ما بعد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    • تحضير وتخزين كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل منفصل واستخدامها فقط للغرض المخصص لها. يجب تقسيم الكواشف في أجزاء صغيرة وتخزينها في مناطق معينة اعتمادًا على ما إذا كانت تستخدم في تطبيقات ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب تخزين القسامات بشكل منفصل عن عينات الحمض النووي الأخرى.

    يجب دائمًا إجراء تفاعل تحكم يحذف قالب الحمض النووي لتأكيد عدم وجود تلوث. بالإضافة إلى ذلك ، يجب الإبقاء على عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى الحد الأدنى ، لأن المقايسات شديدة الحساسية تكون أكثر عرضة لتأثيرات التلوث.

    كيف يمكنني إزالة التلوث إذا كنت مصابًا بتلوث تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

    1. اترك الماصات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. يشجع التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية الارتباط المتقاطع لبقايا الثيميدين ، مما يؤدي إلى إتلاف الحمض النووي المتبقي.
    2. رش محطات العمل / المعدات / الماصات بنسبة 10٪ مبيض ثم امسحها نظيفة.
    3. تقوم محطات العمل المتغيرة بنقل منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى موقع آخر تم تنظيفه مسبقًا.
    4. لا تستخدم أي أدوات أو ماصات استخدمتها من قبل.

    ماذا يمكنني أن أفعل إذا كان PCR يولد أخطاء؟

    لتجنب الأخطاء أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، نوصي باستخدام إنزيم عالي الدقة (انظر دليل الاختيار). بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من تجنب ما يلي:

    1. الإفراط في التدوير
      تجاوز تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل غالبًا:
      • يغير الرقم الهيدروجيني للتفاعل بطريقة تزعزع استقرار الحمض النووي.
      • يزيد من كمية منتج PCR ، وبالتالي يقلل من كفاءة البوليميراز ويعزز الأخطاء.
      • يقلل من كمية dNTPs ، وبالتالي يزيد من احتمالية سوء الدمج الأساسي بسبب تركيز dNTP غير المتوازن. (في حالة استخدام إنزيمات PCR من Takara Bio ، يتم تحسين تركيز dNTP إلى 200 نانومتر ، مما يؤدي إلى زيادة تركيز dNTP إلى التلاعب.)
      • يتسبب في تراكم الحمض النووي أحادي الجديلة ومزدوج الجديلة.
    2. تركيز عال ملغ 2+
      يتراوح تركيز Mg 2+ من 1 و ndash5 ملم. قد يؤدي استخدام تركيز عالي من Mg 2+ إلى زيادة العائد ، ولكنه قد يؤثر أيضًا على نشاط التدقيق اللغوي للأنزيمات. ومع ذلك ، يجب أن يكون تركيز Mg 2+ دائمًا أعلى من تركيز dNTP.
    3. تلف قالب الحمض النووي
      الحد من وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية عند تحليل أو إخراج منتجات PCR من المواد الهلامية.

    ما هي مثبطات PCR؟

    تُعرف الشوائب التي تتداخل مع تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باسم مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل. توجد مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل في مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع العينات وقد تؤدي إلى انخفاض حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل أو حتى نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل السلبية الكاذبة. قد يكون لمثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أصول عضوية وغير عضوية (شريدر 2012).

    تشمل مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل غير العضوية:

    • الكالسيوم أو أيونات المعادن الأخرى التي تتنافس مع المغنيسيوم
    • EDTA الذي يرتبط بالمغنيسيوم ويقلل من تركيزه

    تتضمن بعض مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل العضوية:

    • السكريات المتعددة والجليكوليبيدات التي تحاكي بنية الأحماض النووية ، وتتداخل مع المواد الأولية المرتبطة بالقالب
    • الميلانين والكولاجين اللذان يشكلان مركبًا عكسيًا مع بوليميراز الحمض النووي
    • الأحماض الدبالية التي تتفاعل مع قالب الحمض النووي والبوليميراز ، مما يمنع التفاعل الإنزيمي ، حتى عند التركيزات المنخفضة
    • اليوريا التي قد تؤدي إلى تحلل البوليميراز

    تشمل المركبات العضوية الأخرى التي يمكن أن تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل ما يلي:

    • الهيموجلوبين واللاكتوفيرين والغلوبولين المناعي في عينات الدم أو المصل أو البلازما
    • مضادات التخثر مثل الهيبارين
    • البوليفينول والبكتين والزيلان من النباتات
    • الإيثانول أو كحول الأيزوبروبيل أو الفينول أو المنظفات مثل SDS

    إذا كانت المثبطات موجودة في إعداد القالب ، فقد يؤدي التخفيف بمقدار 100 ضعف لقالب البداية إلى تخفيف المانع بشكل كافٍ والسماح بالتضخيم. بدلاً من ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى ترسيب الإيثانول في القالب لحل المشكلة.

    مراجع

    شريدر ، سي. وآخرون. مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل وظهورها وخصائصها وإزالتها. J أبل ميكروبيول. 113: 1014 و ndash1026 (2012).

    ما هو الإفراط في استخدام PCR؟ كيف أعرف ما إذا كان المنتج الخاص بي قد أفرط في التدوير؟

    يحدث الإفراط في تدوير تفاعل البوليميراز المتسلسل عندما يتجاوز ركوب الدراجات المرحلة الأسية للتضخيم. يحدث الإفراط في التدوير عندما تحدث الأحداث التالية أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل:

    • نضوب الركائز (dNTPs أو الاشعال).
    • لم تعد الكواشف (dNTPs أو الإنزيمات) مستقرة عند درجة حرارة التمسخ.
    • يتم تثبيط بوليميراز PCR بواسطة المنتج (بيروفوسفات ، DNA مزدوج).
    • التنافس على الكواشف (dNTPs والبادئات) بواسطة منتجات غير محددة.
    • خفض الرقم الهيدروجيني للتفاعل.
    • تمسخ غير كامل / فصل حبلا للمنتجات بتركيزات عالية من المنتج.

    مؤشر استخدام PCR المفرط هو مسحة خلفية مكثفة مع نطاقات لا يمكن تمييزها عندما يتم حل التفاعل على هلام الاغاروز. يوصى دائمًا بإجراء اختبار أولي لتحديد الحد الأدنى من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل اللازمة لإنتاج منتج كافٍ. يبقى منتج PCR في المرحلة الخطية للتضخيم إذا زاد إنتاجية المنتج بشكل ملحوظ كل 3 & ndash5 دورات. نجد ذلك زيادة التدوير لا تنتج (كدنا) قالبًا مناسبًا لأي تطبيق لاحق.

    ما أنواع الطفرات التي يمكن أن تسببها تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

    يمكن أن تقدم بوليمرات PCR أنواعًا مختلفة من الطفرات ، بما في ذلك الاستبدالات أحادية القاعدة ، والحذف ، والإدخال. عادةً ما تحدث بدائل القاعدة عن طريق الخطأ في دمج dNTP غير الصحيح أثناء تخليق الحمض النووي.

    قد تولد البوليميرات طفرات في المواقع التي يتم فيها فقد أو اكتساب واحد أو أكثر من النيوكليوتيدات. يمكن أن يعتمد تواتر هذا النوع من الطفرات على التسلسل ، وقد يكون أعلى في التسلسلات شديدة التكرار. الطفرة الأكثر شيوعًا هي فقدان نيوكليوتيد واحد ، والذي يمكن أن يكون نتيجة لخلل في محاذاة القالب التمهيدي داخل تسلسل متماثل متكرر. يمكن أن تحدث إعادة ترتيب الحمض النووي أيضًا عندما ينهي البوليميراز التوليف على خيط DNA واحد ويستمر في التوليف بعد حدوث التهيئة على حبلا تكميليًا (على سبيل المثال ، تبديل الجديلة أو القفز PCR). يحدث هذا النوع من الطفرات عندما يكون هناك تجانس كبير بين مناطق مختلفة من الحمض النووي. قد يؤدي أيضًا قالب الحمض النووي الزائد في التفاعل إلى تعزيز هذا النوع من الطفرات.

    ما هي العوامل التي تساهم في حدوث الطفرات التي تدخل في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟

    يمكن أن تساهم العوامل التالية في حدوث الطفرات التي تدخل في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR):

    • تركيزات dNTP غير المتوازنة
      يمكن أن تؤدي الكميات غير المتكافئة من dNTPs الأربعة إلى زيادة الاستبدال الأساسي بمقدار ثمانية أضعاف. يعد استخدام تركيزات متساوية من dNTPs الأربعة أمرًا بالغ الأهمية لتقليل معدل الخطأ في البوليميراز.
    • تركيز انزيم عالي
    • فترات حضانة طويلة
    • عدم وجود نشاط نوكلياز خارجي 3 'و rarr5'
    • تركيز المغنيسيوم
      تبلغ الدقة القصوى عندما يكون تركيز Mg 2+ متساويًا مع التركيز الكلي لـ dNTPs. تنخفض الدقة عند زيادة تركيز الكاتيونات ثنائية التكافؤ الحرة.
    • درجة الحموضة للتفاعل
      يمكن أن يؤدي خفض الرقم الهيدروجيني للتفاعل بمقدار ثلاث وحدات إلى زيادة البدائل الأساسية حتى 60 ضعفًا. قد يؤدي انخفاض درجة الحموضة (& lt6.0) إلى فقدان البيورين تلقائيًا.
    • تلف الحمض النووي
      يمكن أن يحدث تلف الحمض النووي في درجات حرارة عالية ، مما قد يزيد من معدل الطفرات. الطفرة المتكررة هي نزع أمين السيتوزين لإنتاج اليوراسيل.
    • يمتد وجود A في تسلسل التمهيدي
    • الإفراط في التدوير
      يزداد معدل الخطأ عندما يزداد تركيز الحمض النووي خلال دورات PCR النهائية. يجب الحفاظ على العدد الإجمالي للدورات عند الحد الأدنى لإنتاج منتج PCR المطلوب دون أخطاء.

    ما هي مصنوعات PCR؟

    فيما يلي عيوب PCR الشائعة:

    • التمهيدي ديمرز
      يتم تشكيل ثنائيات التمهيدي من خلال التكامل الذاتي في نهاية 3 'من بادئات التضخيم. يشتبه في ثنائيات التمهيدي إذا تم إنتاج المنتج في تفاعل خالٍ من القالب (تحكم سلبي). لتجنب ثنائيات البرايمر ، لا ينبغي أن تحتوي البرايمر على تكامل في نهاياتها الثلاثة.
    • منتجات Chimeric PCR
      يمكن أن تكون منتجات Chimeric PCR ناتجة عن قالب ممتد بشكل غير كامل. بعبارة أخرى ، يمكن للقالب أحادي الخيط الذي لم يتم نسخه بشكل كامل بسبب إنهاء البوليميراز السابق لأوانه أن يصلب إلى قالب متجانس جزئيًا. هذا يخلق منتجات PCR خيالية. لتقليل الكيميرا ، استخدم أقل عدد ممكن من دورات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    • تحيز PCR
      يحدث تحيز تفاعل البوليميراز المتسلسل عندما يتم تضخيم بعض التسلسلات بشكل أكثر كفاءة من غيرها بسبب الارتباط التفضيلي بواسطة بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل. إذا تم تضخيم تسلسل واحد بنسبة 10٪ أكثر من تسلسل آخر في دورة واحدة ، فسيكون أكثر وفرة بمقدار 17.4 مرة بعد 30 دورة. لتقليل تحيز تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم معدل منحدر مرتفع بين خطوات التمسخ والصلب واستخدم درجات حرارة التلدين المنخفضة. يجب تجنب فترات التمديد الطويلة (& gt180 ثانية).
    • الانجراف PCR
      يرجع انجراف تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى التقلب العشوائي في تفاعلات كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل ، خاصة في الدورات المبكرة عندما يكون تركيز القالب منخفضًا جدًا. لوحظت هذه القطعة الأثرية في فحوصات تعدد الإرسال ، حيث يحدث فقدان الحساسية بسبب التفاعلات بين مجموعات مختلفة من البادئات. من المهم أن تصمم بعناية مواد أولية لهذه الأنواع من المقايسات.
    • ينتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) منتجات ذات وزن جزيئي عالٍ بالكاد تنتقل من خلال هلام الاغاروز
      لا يوجد تفسير جيد لهذه الأداة. يفترض معظم الباحثين أن هذا ناتج عن التدوير المفرط ، لأنه في المراحل اللاحقة من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تتراكم الجزيئات المفردة والمزدوجة. يمكن أن يؤدي تراكم مثل هذه الجزيئات أحادية الجديلة إلى حدوث مضاعفات مضاعفة غير متجانسة عن طريق التنافس مع البادئات. عدم اكتمال التمسخ في المراحل اللاحقة ، عندما يكون هناك تركيز عالٍ من منتجات PCR ، يمنع فصل خيوط الحمض النووي ، وبالتالي قد يظل amplicon المشكل حديثًا مرتبطًا بالقالب المصنوع مسبقًا. يمكن أن تتكرر هذه العملية ، محاصرة نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل في شبكة من الجزيئات.

    التفسير الآخر لأصل اللطاخات عالية الوزن الجزيئي هو الامتداد الجزئي للقوالب أثناء دورات PCR الأولية. يمكن إنشاء الامتدادات الجزئية عن طريق القفز على القطع الأثرية و [مدش] عندما يصلب دنا تمهيدي أو أحادي الجديلة ويمتد من موقع فتيل واحد ، ثم يصلب جزئيًا إلى جزء متماثل في مكان آخر (انظر منتجات PCR الكيميرية ، أعلاه). يمكن للجزيئات الممتدة جزئيًا أن تعمل بمثابة بادئات جديدة ، لأنها تحتوي على 3'-OH مجانًا ، ويمكن أن تولد جزيئات خيمرية تجمع بين موقع التمهيد الأولي وموقع "القفز".

    أخيرًا ، يمكن أيضًا إنشاء هذا النوع من القطع الأثرية عند استخدام قالب خام لـ PCR. يمكن أن تصبح المنتجات التي يتم تضخيمها مباشرة من الأنسجة الحيوانية أو النباتية محاصرة في بقايا الخلايا ، مما يمنعها من الانتقال في الهلام. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق هضم بروتيناز K لمنتج PCR المضخم:

    • قبل تحميل العينات على مادة هلامية ، أضف 1 وميكرول من المخزن المؤقت للتحميل الذي يحتوي على بروتيناز K إلى 4 وماكرول من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

    Takara Bio USA، Inc.
    الولايات المتحدة / كندا: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & Bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
    لأغراض البحث فقط. ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص. & نسخ 2021 Takara Bio Inc. جميع الحقوق محفوظة. جميع العلامات التجارية مملوكة لشركة Takara Bio Inc. أو الشركات التابعة لها في الولايات المتحدة و / أو البلدان الأخرى أو أصحابها المعنيين. قد لا يتم تسجيل بعض العلامات التجارية في جميع الولايات القضائية. يتوفر المنتج الإضافي والملكية الفكرية ومعلومات الاستخدام المقيد على takarabio.com.

    Takara Bio Europe عضو في Takara Bio Group ، وهي شركة رائدة في علوم الحياة ملتزمة بتحسين حالة الإنسان من خلال التكنولوجيا الحيوية. من خلال علاماتنا التجارية Takara و Clontech و Cellartis ، تتمثل مهمتنا في تطوير أدوات وخدمات مبتكرة عالية الجودة لتسريع الاكتشاف.


    الاستنساخ الجزيئي لمنتجات PCR: دليل تقييد الهضم

    الاستنساخ عبارة عن تقنية متعددة الخطوات منتشرة في كل مكان في مختبرات البيولوجيا الجزيئية ، وتنطوي على إدخال جين مستهدف (إدخال) في عمود فقري متجه بلازميد دائري مزدوج الشريطة ذاتي التكاثر يحمل جينًا مقاومًا للمضادات الحيوية (غالبًا الأمبيسيلين أو الكانامايسين) . أصبح هذا ممكنًا عن طريق الهضم المقيد ، وهي عملية تضمن أن الجين المستهدف والناقل المستقبِل لهما نهايات متوافقة. بعد ربط الجين بالناقل ، يتم إدخال جزيء الحمض النووي المؤتلف الناتج الإشريكية القولونية الخلايا (التحول) ، ويتم تطبيق ضغط المضادات الحيوية لاختيار تلك البكتيريا التي تحمل البلازميد. يمكن بعد ذلك استخدام هذه البكتيريا المحولة لتكرار DNA البلازميد المؤتلف (تحضير البلازميد). في حالات أخرى ، يمكن توجيه الآلية الخلوية البكتيرية للتعبير عن الجين المستهدف وتوليف البروتين المقابل (التعبير البروتيني).

    الاستنساخ عبارة عن تقنية متعددة الخطوات منتشرة في كل مكان في مختبرات البيولوجيا الجزيئية ، وتنطوي على إدخال جين مستهدف (إدخال) في عمود فقري متجه بلازميد دائري مزدوج الشريطة ذاتي التكاثر يحمل جينًا مقاومًا للمضادات الحيوية (غالبًا الأمبيسيلين أو الكانامايسين) . أصبح هذا ممكنًا عن طريق الهضم المقيد ، وهي عملية تضمن أن الجين المستهدف والناقل المستقبِل لهما نهايات متوافقة. بعد ربط الجين بالناقل ، يتم إدخال جزيء الحمض النووي المؤتلف الناتج الإشريكية القولونية الخلايا (التحول) ، ويتم تطبيق ضغط المضادات الحيوية لاختيار البكتيريا التي تحمل البلازميد. يمكن بعد ذلك استخدام هذه البكتيريا المحولة لتكرار DNA البلازميد المؤتلف (تحضير البلازميد). في حالات أخرى ، يمكن توجيه الآلية الخلوية البكتيرية للتعبير عن الجين المستهدف وتوليف البروتين المقابل (التعبير البروتيني).

    في سلسلة المنشورات التالية ، سأستكشف كل خطوة (بدءًا من استيعاب القيود) وسأناقش النصائح لضمان النجاح والحد الأدنى من استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

    حصر الهضم

    1. نوكليازات تقييدية: REs هي إنزيمات بكتيرية تتعرف على تسلسل الحمض النووي القصير (6-8 أزواج قاعدية) تسمى مواقع التقييد ، وتشق (هضم) الحمض النووي المزدوج الشريطة في هذه المواقع. معظم المتغيرات المتفاعلة متناغمة: تشبه إلى حد كبير متناظرات اللغة (سيدتي أنا آدم) ، تقرأ هذه الإنزيمات نفس التسلسلات على كل من خيوط الحمض النووي في اتجاه 5 إلى 3. تخلق بعض الإنزيمات بروزات مفردة الجديلة ، تسمى أيضًا نهايات لزجة أو متماسكة. تقوم الإنزيمات الأخرى بقطع منتصف التسلسل المستهدف مباشرة ولا تترك أي بروزات ، بل نهايات غير حادة أو متدفقة. لأغراض الاستنساخ ، غالبًا ما يتم استخدام العناصر الأرضية التي تخلق أطرافًا لزجة لأنها تؤدي إلى كفاءة استنساخ أعلى بكثير.

    2. المنهجية: لتحضير الملحق (على سبيل المثال منتج PCR) للاستنساخ ، وغالبًا ما يتم قصه باستخدام اثنين من العناصر المتفاعلة المختلفة ، ويتم استخدام نفس هذه العناصر المتفاعلة لهضم المتجه. هذا يضمن إنتاج نهايات غير متوافقة داخل نفس الجزيء ، ويفرض استنساخ الإدخال في اتجاه واحد (الاستنساخ الاتجاهي) ، ويمنع الربط الذاتي للناقل. من ناحية أخرى ، نظرًا لأن الإدخال والناقل يتم هضمهما بنفس الإنزيمات ، يتم إنشاء ذيول متوافقة مع ناقل الإدخال. يمكن أن تتزاوج هذه النهايات ، ويمكن أن تنضم لاحقًا بواسطة DNA ligase ، وبالتالي تشكل جزيء خيمري. إذا تم هضم الإدخال باستخدام إنزيم واحد فقط ، فسيتم إنشاء نفس النهايتين على كلا الطرفين ، ويمكن إدخال الهدف في أي اتجاه. يجب فحص أي مستنسخات تم الحصول عليها لتحديد أن اتجاه الجين صحيح. سيحتاج الناقل الذي يتم هضمه بإنزيم واحد فقط إلى إزالة الفسفرة لمنع الارتباط الذاتي. سيتم تحويل المتجه الذي يربط على نفسه بشكل أكثر كفاءة إلى بكتريا قولونية وبالتالي سيقلل من كفاءة تفاعل الاستنساخ.

    3. نصائح من أجل ملخص ناجح للتقييد:

    أ. إذا كان الإدخال الخاص بك هو منتج PCR ، فمن المحتمل أن تضيف مواقع التقييد إلى الطرف 5 من كل من بادئات PCR. لضمان الربط والهضم بشكل فعال ، تأكد من تضمين ستة قواعد بين موقع التعرف وطرف 5 'من التمهيدي. تذكر أن تؤكد أن مواقع التقييد التي تحددها لا تحدث ضمن إدخالك!

    ب. تأكد من خلو الحمض النووي من الملوثات ، مثل الفينول والكلوروفورم والإيثانول والملح. في حالة استخدام منتج PCR ، يمكنك استخدام مجموعة تنظيف PCR. إذا كان تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل يولد نطاقًا غير محدد ، فسيتعين عليك قطع النطاق المستهدف من الجل وتنقية المنتج باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي.

    ج. يجب ألا تزيد كمية الإنزيم المستخدم عن 10٪ من حجم التفاعل ، لأن الجلسرين المرحل من محلول تخزين الإنزيم قد يثبط التفاعل.

    د. أضف مكونات التفاعل بالترتيب التالي: محلول إنزيم التقييد ، الماء (يمكن تغيير طبيعة الإنزيم إذا تمت إضافته مباشرة بعد المخزن المؤقت المركز) ، الحمض النووي ، الإنزيم.

    ه. احتفظ بالإنزيم على الثلج أو في كتلة تبريد أثناء إعداد التفاعل.

    F. تخلط مكونات التفاعل عن طريق سحب خليط التفاعل بلطف لأعلى ولأسفل. تجنب توليد فقاعات الهواء لأن الإنزيم قد يعلق في واجهة الهواء السائل ويتحول إلى طبيعته. اتبع ذلك بلفافة سريعة في جهاز الطرد المركزي الصغير. لا تقم بتدوير رد الفعل.

    ز. تحقق من نجاح رد فعل الهضم لديك عن طريق تشغيل المنتج المهضوم مقابل غير المهضوم جنبًا إلى جنب على هلام الاغاروز. NEBcutter هي أداة مفيدة من New England BioLabs يمكنها مساعدتك في التنبؤ بنتيجة تفاعل الهضم.

    ح. أخيرًا ، وقبل الشروع في الربط ، يجب تعطيل تفاعل الطاقة المتجددة الموجود في التفاعل. وبخلاف ذلك ، فإن أي طاقة متفاعلة نشطة متبقية ستهضم أي منتجات مرتبطة. يمكن تعطيل العديد من مصادر الطاقة المتجددة بالحرارة. بالنسبة لأولئك الذين لا يستطيعون ، يوصى بخطوة لتنقية الجل.

    Quartzy هو النظام الأساسي رقم 1 في العالم لإدارة المختبرات. نحن نساعد العلماء بسهولة في تنظيم الطلبات وإدارة المخزون وتوفير المال. نحن أحرار وسنظل كذلك دائمًا. قم بزيارة Quartzy.com أو تواصل معنا على [email protected]

    هل أنت مهتم بالكتابة لـ The Q؟ مراسلتنا على البريد الاليكتروني!


    مقدمة

    تعزز معايير علوم الجيل التالي فهم الأفكار الأساسية بالإضافة إلى تطوير الممارسات العلمية ، وتؤكد بشكل خاص على استخدام الأدلة لتوليد تفسيرات للمشاكل العلمية (NGSS Lead States، 2013). تعد الأنشطة القائمة على الاستفسار وسيلة ممتازة لمساعدة الطلاب على فهم وتقدير المفاهيم والتقنيات العلمية المستخدمة في علم الأحياء الحديث ، خاصة إذا كان من الممكن أن تكون مرتبطة بحياة الطلاب خارج الفصل الدراسي. علاوة على ذلك ، تسمح هذه الأنشطة للطلاب بالانخراط في الطريقة العلمية مباشرة من خلال طرح الأسئلة والأدلة والاستنتاجات في بيئة معملية عملية. كوسيلة لإدخال أدوات البيولوجيا الجزيئية الأساسية مثل عزل الحمض النووي ، والرحلان الكهربي لهلام الاغاروز ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وتسلسل الحمض النووي ، وتحليل قاعدة بيانات الحمض النووي ، فقد صممنا تمرينًا مختبريًا لاكتشاف الأسماك التي تحمل علامة خاطئة (مثل "الاحتيال على الأسماك" ) من المطاعم ومحلات السوبر ماركت المحلية. استخدمت الدراسات السابقة البيانات التي تم جمعها في دورات المدرسة الثانوية أو المرحلة الجامعية للتحقيق في وضع العلامات الخاطئة على المأكولات البحرية (Naaum & amp Hanner ، 2015 Willette et al. ، 2017) ، ووصفت التدريبات المعملية التي يقوم فيها الطلاب بتحليل تسلسل الحمض النووي للأسماك (Hallen-Adams، 2015 Cline & amp Gogarten ، 2012). تعتمد مقالتنا على هذا العمل من خلال تحديد مشروع متعدد الأيام يقوم فيه الطلاب بإجراء بحث قائم على الاستقصاء من البداية إلى النهاية ، ومن خلال دمج تحليل التسلسل والتطور لأنواع الأسماك من عائلات وأوامر متعددة. لقد قمنا أيضًا بتضمين عدد من التمارين المصممة لتوسيع فهم الطلاب لتصميم التمهيدي وبنية تسلسل الحمض النووي وتحليله ، ولتحفيز المناقشة متعددة التخصصات حول الاستدامة البيئية والاقتصاد المتضمن في وضع العلامات الخاطئة على المأكولات البحرية.

    أنفق المستهلكون الأمريكيون ما يقدر بنحو 91.7 مليار دولار على منتجات مصايد الأسماك في عام 2013 ، واستهلكوا ما معدله 14.6 رطلاً من الأسماك والمحار للفرد سنويًا بين عامي 2000 و 2009 (NMFS ، 2014). لسوء الحظ ، اكتشفت التحقيقات الحديثة استبدال الأنواع والتسميات الخاطئة لمنتجات المأكولات البحرية. وجدت دراسة على الصعيد الوطني أجرتها Oceana من 2010 إلى 2012 أن 33 في المائة من 1215 عينة من المأكولات البحرية تم تصنيفها بشكل خاطئ (Warner et al. ، 2013). ووجدت اختبارات الحمض النووي التي أجريت مؤخرًا لـ 174 قطعة من المنتجات السمكية من قبل إدارة الغذاء والدواء أن 15 بالمائة تم تصنيفها بشكل غير صحيح (FDA ، 2013). يتضمن الجدول 1 قائمة بالأسماك التي يتم استبدالها بشكل شائع.

    الأنواع المسمى. الأنواع الفعلية.
    ألاسكا / سمك القد الباسيفيكي بنغاسيوس ("سمك السلور" الآسيوي) ، سمك القد الأطلسي ، ثريدفين ، سليكهيد ، ألاسكا بولوك
    سمك السلمون (بري ، ملك ، سوكي) سلمون الأطلسي المستزرع
    سمك باس البحر سمكة أنتاركتيكا المسننة ، سمكة باتاغونيا المسننة
    سمك أحمر أنواع مختلفة من النهاش ، سمك الفرخ في المحيط الهادئ ، الأسماك الصخرية ، البلطي ، القاروص الأبيض ، الدنيس
    نعل الليمون سمك مفلطح ، نعل مسطح الرأس
    تونة بيضاء إسكولار
    رمادية فاتحة اللون سوجر
    الأنواع المسمى. الأنواع الفعلية.
    ألاسكا / سمك القد الباسيفيكي بنغاسيوس ("سمك السلور" الآسيوي) ، سمك القد الأطلسي ، ثريدفين ، سليكهيد ، ألاسكا بولوك
    سمك السلمون (بري ، ملك ، سوكي) سلمون الأطلسي المستزرع
    سمك باس البحر سمكة أنتاركتيكا المسننة ، سمكة باتاغونيا المسننة
    سمك أحمر أنواع مختلفة من النهاش ، سمك الفرخ في المحيط الهادئ ، الأسماك الصخرية ، البلطي ، القاروص الأبيض ، الدنيس
    نعل الليمون سمك مفلطح ، نعل مسطح الرأس
    تونة بيضاء إسكولار
    رمادية فاتحة اللون سوجر

    قد تبدو العديد من أنواع الأسماك وطعمها متشابهين ، لذلك غالبًا ما يكون اختبار الحمض النووي ضروريًا لتحديد الهوية الحقيقية للعينة. تعتمد تقنية تحديد الرمز الشريطي للحمض النووي على مقارنة تسلسل الحمض النووي من منطقة محددة من الجينوم بقاعدة بيانات تسلسل الجينوم من الأنواع المعروفة من الأسماك. بالنسبة لهذا المشروع ، قمنا بتحليل ما يقرب من 700 زوج أساسي (bp) من الجين الفرعي الأول للسيتوكروم c أوكسيديز للميتوكوندريا (COI). تم استخدام هذه المنطقة من الجينوم على نطاق واسع في تشفير الحمض النووي للحيوانات (Hebert et al. ، 2003). تم تطوير بادئات PCR العالمية لتضخيم قسم من جين COI في جينوم الأسماك (Ward وآخرون ، 2005) ، ووجدنا أن هذه البادئات المنشورة تعمل بشكل جيد جدًا في تضخيم PCR لجميع عيناتنا.

    تم استخدام هذا التمرين المخبري الاستقصائي بنجاح في دورة صيفية لمدة أسبوعين لطلاب المدارس الثانوية ، وفي دورة علم الوراثة في السنة الثانية في كلية كارلتون. تم تصميم هذا المشروع ليشمل أربع فترات معملية مدة كل منها 3 ساعات (الجدول 2) ، ولكن يمكن تعديله ليناسب الأطر الزمنية الأخرى. يمكن تكييف التدريبات مع مجموعة متنوعة من جماهير الطلاب: من مقدمة في علم الأحياء الجزيئي لطلاب المدارس الثانوية ، إلى مشروع بحث متقدم لدورة معملية جامعية. في قسم الملخص والملحقات ، نصف الأنشطة للطلاب الذين يحتاجون إلى ممارسة إضافية ، بالإضافة إلى المزيد من فرص التعلم المستقلة للطلاب المتقدمين. عمل طلابنا في مجموعات من 2-4 ، مما ساعد على تعزيز التعاون العلمي ومهارات الاتصال. الهدف من هذا المعمل هو أن يحقق الطلاب ما يلي:

    . قبل المختبر. معمل 1. معمل 2. معمل 3. معمل 4.
    أنشطة المختبرالحصول على عينات الأسماك عزل الحمض النووي عن الأسماك (
    . قبل المختبر. معمل 1. معمل 2. معمل 3. معمل 4.
    أنشطة المختبرالحصول على عينات الأسماك عزل الحمض النووي عن الأسماك (

    نقدر فائدة الاختبار القائم على الحمض النووي.

    فهم وتنفيذ مجموعة متنوعة من تقنيات البيولوجيا الجزيئية: استخراج الحمض النووي ، ورحلان هلام الاغاروز الكهربائي ، وتفاعل البلمرة المتسلسل.

    الاحتفاظ بدفتر أبحاث شامل ومستقل.

    تنقل في أدوات المعلوماتية الحيوية (على سبيل المثال ، BLAST ، محاذاة التسلسل) لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي.

    تجميع النتائج وتقديم الاستنتاجات.

    نقدر الروابط بين العلوم الاستقصائية وحياتهم اليومية.


    كيف تفسر نتائج تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل من الرحلان الكهربائي؟

    أنا & # x27m في فصل علم الأحياء 101 لمتطلبات التعليم العام الخاصة بي (أنا & # x27m تخصص غير علمي) ، وأواجه صعوبة في فهم ما أبحث عنه بالضبط عندما يتعلق الأمر بنتائج PCR.

    تم تضمين صورة النتائج: http://imgur.com/BSo0u1T

    النطاق 1 هو السلم ، والنطاق 2 هو النطاق التجريبي ، والنطاق 3 هو التحكم السلبي ، والنطاق 4 هو التحكم الإيجابي.

    كانت التجربة محاولة لتضخيم أحد الجينات الورمية في جينوم الخلايا السرطانية. النطاق 2 هو عينة الحمض النووي من الخلايا السرطانية.

    ما هي نقطة السلم؟ ما الذي أنظر إليه بالضبط عندما يتعلق الأمر بالنتائج هنا؟

    أنا & # x27m في حيرة من أمري ، ومعلمي لا يساعدني. أنا & # x27d أقدر أي مساعدة يمكن أن تقدمها لي!

    نظرًا لأنك تخصص غير علمي ، فأنا أحاول أن أختصر هذا الموضوع ومباشرًا:

    أفترض أنك تعرف ما هو تفاعل البوليميراز المتسلسل وما يفعله (قدم الأشخاص الآخرون هنا أوصافًا جيدة ، إذا كنت بحاجة)

    يفصل الرحلان الكهربي الحمض النووي بناءً على حجم القطعة باستخدام شحنة كهربائية (الحمض النووي سلبي قليلاً ، لذلك يتحرك نحو الشحنة الموجبة). كلما كان الجزء أصغر ، زاد تحركه (الأجزاء الأصغر تحتوي على & # x27drag & # x27 أقل). نظرًا لأن الحمض النووي يبدأ في الآبار في الجزء العلوي ، فكلما كان الشريط السفلي على الجل ، كان حجمه أصغر.

    يستخدم السلم فقط للتحقق من حجم الأجزاء في عينتك. يجب أن تعرف حجم كل نطاق في سلمك ، اعتمادًا على السلم الذي استخدمته ، وقارن ذلك بعينتك لتحديد حجم أجزاء العينة.

    التحكم السلبي فارغ ، وهذا جيد. فقط تجاهله الآن.

    يُظهر عنصر التحكم الإيجابي حجم جزء الحمض النووي الذي تهتم به & # x27re. قارن الآن ذلك بالعينة التجريبية. انظر كيف يوجد شريط في عينتك بنفس حجم عنصر التحكم الإيجابي؟ هذا يعني أن عينتك التجريبية ربما تحتوي على الجين الورمي المحدد الذي كنت تبحث عنه (سيتعين عليك ترتيبها أو إجراء اختبار آخر لتكون إيجابية بنسبة 100٪).

    يمكن أن تكون الفرقة الأخرى الأصغر والأكثر إشراقًا أشياء كثيرة. ربما نسخة مختلفة من الجين أو بعض التضخيم الجيني غير المستهدف. على أي حال ، تجاهلها فقط لهذه المشكلة. الجزء الأكثر أهمية هو وجود شريط في عينتك بنفس حجم عنصر التحكم الإيجابي ، لذلك يمكنك القول أن العينة التجريبية تحتوي على الأرجح على الجين الورمي المحدد.

    أتمنى أن يساعدك هذا! لا تتردد في طرح الأسئلة

    يقوم PCR بتضخيم قسم معين من الحمض النووي ، عندما تقوم بتشغيل شظايا الحمض النووي على هلام الاغاروز ، فإنك تستغل حقيقة أن أطوال مختلفة من الحمض النووي يمكن أن تتحرك عبر الهلام بسرعات مختلفة (كلما كان الطول أطول كلما كان أبطأ).

    السلم عبارة عن مجموعة محددة مسبقًا من أزواج القواعد ذات الأطوال المعروفة المختلفة ، وهو أمر ضروري لأن المسافة التي يقطعها الحمض النووي تعتمد على العديد من الأجزاء ، لذا فأنت بحاجة إلى مرجع لمقارنته بها. حسنًا ، قد تتمكن من تحديد تسلسل أطول أو أقصر بدونه ، لكن السلالم تتيح لك أن تكون أكثر تحديدًا بشأن الطول. هذا مهم بشكل خاص إذا كنت & # x27re تضخيم شيء تعرف طوله بالفعل ، مثل الحمض النووي للبروتين أو علامة الورم. ستعرف حجمها في الجينوم حتى تتمكن من تحديد شظيتك في الهلام مع العلم أنك تتوقعها عند 750 نقطة أساس عند السلم يوضح أن لديك شريطًا في عينتك بهذا الطول تقريبًا.

    الآن بالنسبة لتجربتك ، فإن المسار 1 هو السلم ، ويجب أن تكون قادرًا على تحديد ما تعنيه كل فرقة من خلال البحث عن المعلومات من اسم السلم (على سبيل المثال ، NEB 1kbp DNA ladder) ومقارنتها بمثالهم المرجعي. هذا من أجل الدقة ، ولكن إذا كانت لديك عناصر تحكم معروفة ، فيجب أن تكون قادرًا بشكل عام على التعرف عليها بدون هذا (وأعتقد أنه من المحتمل أن يكون كافياً لمطالبك العامة). لتوجيه نفسك ، يكون الجزء العلوي من الجل هو المكان الذي تضع فيه عينتك ، مما يعني أنه كلما انخفض الشريط الموجود في الصورة ، قل طول الحمض النووي.

    للوصول إلى الممرات التجريبية ، يمكنك أن ترى أن الممر 3 فارغ للتحكم في Neg ، وهذا أمر جيد. المسار 4 هو عنصر التحكم الإيجابي ، مما يعني أن هذا هو المكان الذي يجب أن تتوقع أن ترى فيه الفرقة الخاصة بك ، إذا نجحت ، في تجربتك. الآن بالنسبة إلى حارة التجربة ، من المحتمل أن ترى نطاقًا خافتًا حول مستوى عنصر التحكم الإيجابي ، ولكن نطاقًا أقوى في الأسفل. يشير هذا إلى أنه على الرغم من أنك قمت باستنساخ جزء بطول مماثل لطول التحكم الإيجابي ، إلا أن شيئًا ما لم يكن صحيحًا تمامًا لأن لديك المزيد من الحمض النووي بطول أصغر. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن النطاق العلوي متشابه في الطول ، إلا أن هذا لا يعني بالضرورة أنه العلامة المكبرة ، لأنه من الناحية الفنية كان بإمكانك تضخيم شيء بنفس الطول من مكان آخر في الجينوم.

    للمقارنة هنا جل جريت. المسار 1 هو سلم الحمض النووي ، والممر 2 هو التجربة والمسار 3 هو عنصر التحكم السلبي. ترى العصابات القوية في الجزء العلوي في الممر الثالث ، وهذه تشير إلى الحمض النووي الجينومي غير المضخم ، لأنه & # x27s كبير جدًا في الحجم لم & # x27t (أو لم يكن & # x27t) يتحرك كثيرًا في الهلام ، في حين أن الممر الثاني هو my experiment shows a single band of appropriate base pairs in length and no other bands (meaning it only amplified a region of that length and nothing else).

    As for what happened and why, well it generally the biggest cause is a poorly designed primer (these are a short collection of nucleotides that bind to the corresponding area of DNA and help to initiate the cloning, they basically identify ماذا او ما part of the DNA is going to get cloned), or procedural errors during the experiment. If you get multiple bands in a PCR experiment it's usually a sign that your primer annealed to more than one area of the genome. When designing primers there are a number of factors you need to take into account. Since these are of short length,

    20 base pairs, if you don't design them with specificity to your target area they may amplify other things as well. This is why we tend to use tools like Primer-BLAST which, after entering a primer sequence, helps to identify what sequences in the genome will be amplified, to double check that you only get what you want. This also helps to design your primers with specific criteria such as including an intron in the primer (which prevents you from amplifying mRNA, since this doesn't have introns only the genomic DNA should be amplified). Identifying the length of the smallest band in your DNA ladder can also give you clues as to the identity of that lower band in your experiment, and running primer-blast can help confirm this too (but I don't know how much of this is what you were given or actually did in class).

    Now you do need to bear in mind what you are trying to achieve, I only wanted to clone a specific genetic sequence, whereas if you are working with a tumour cell there may inherently be changes in the genome of the cell so seeing something slightly different doesn't always mean your experiment went wrong. It could be that the tumour cell simply has mutations in the genome resulting in a smaller gene. As you can see a lot about science and experimentation is not only trying to get the damn thing to work but trying to understand and explain when things go wrong.

    Hope this has helped, Iɽ be happy to answer any questions you have as well!


    شاهد الفيديو: دهن الخنزير وحقيقة المادة E. انواع الاضافات الغذائية (شهر فبراير 2023).