معلومة

صور جنين حقيقي: كيف تُعرف المناطق المختلفة (منظم speeman ، مناطق هامشية ...)؟

صور جنين حقيقي: كيف تُعرف المناطق المختلفة (منظم speeman ، مناطق هامشية ...)؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في العديد من الكتب المدرسية ، يتم رسم أشكال للجنين ، ولكن في الواقع ، كيف يعرف عالم الأحياء أي منطقة هي واحدة من جنين في ملعب المعدة؟ باستثناء الشفة الظهرية ، لا يمكنني تحديد موقع أي شيء آخر.


يعزز Arkadia الإشارات ذات الصلة بالعقدة للحث على الأديم المتوسط

ينظم أعضاء عائلة عامل النمو المحول (TGF) المرتبط بالعقيدات تحريض الأديم المتوسط ​​والأديم الباطن والأديم المتوسط ​​، وهو نسيج خاص بمنظم Spemann 1،2،3،4،5،6،7. كيف تتشكل هذه الأنسجة المختلفة استجابة لجزيئات الإشارة نفسها ليست مفهومة تمامًا. لقد تم اقتراح أن التأثيرات المعتمدة على التركيز ، بوساطة العوامل المساعدة والمناهضات خارج الخلية ، هي المسؤولة عن الاختلافات 1،8،9،10. نوضح هنا أن البروتين النووي Arkadia يقوي على وجه التحديد النشاط الذي يحفز الأديم المتوسط ​​لمجموعة فرعية من أفراد عائلة TGF-. الأنشطة المشتركة من Arkadia و Xenopus ذات الصلة العقدية -1 كافية للحث على الأديم المتوسط ​​وقمع الأديم المتوسط. Arkadia ظهري الأنسجة البطنية ، مما يؤدي إلى تحريض التعبير الجيني الخاص بالمنظم. يمنع حجب الإشارات العقدية خارج الخلية هذه التأثيرات. يؤثر Arkadia على النشاط العقدي عند التعبير المشترك ويمكن أن يعمل في الخلايا المجاورة لتلك التي تنتج الإشارة العقدية. النتائج التي توصلنا إليها ، جنبًا إلى جنب مع الملاحظة التي تفيد بأن الفئران المتحولة في Arkadia تفتقر إلى العقدة والأديم المتوسط ​​المشتق من العقدة ، تحدد Arkadia كمُعدِّل أساسي لسلسلة الإشارات العقدية التي تؤدي إلى تحريض منظم Spemann.


الملخص

يصادف هذا العام ، 2019 ، الذكرى المئوية لاكتشاف عالم الأجنة E. E. Just لما يُعرف باسم الكتلة السريعة لتعدد البذور. أدت ملاحظة جست للتغيرات الطفيفة التي تحدث على سطح البويضة أثناء الإخصاب (وفي التوالد العذري التجريبي) إلى افتراض أن البويضة ، وفي الواقع كل خلية ، تمتلك خاصية أطلق عليها تهيج مستقل، والذي يمثل قدرة الخلية على الاستجابة بطريقة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لمجموعة متنوعة من الإشارات أو المحفزات. في هذه الورقة ، أزعم أن مفهوم جست للتهيج المستقل أبلغه المعاصر يوهانس هولتفريتر حيث حاول هولتفريتر شرح ظاهرة الاستقراء الجنيني والكفاءة وأن هولتفريتر ، بدوره ، أثر على مارك كيرشنر وجون جيرهارت في صياغتهما لنظرية التيسير. الاختلاف. يتضح تأثير Just بشكل خاص في عروض Gerhart و Kirschner لما يسمونه ضعف الارتباط—خاصية للأنظمة الحية تسمح للعمليات والمكونات الأساسية أن تختلط ومطابقتها بطرق مختلفة لتوليد سمات جديدة. لسوء الحظ ، ظلت العلاقة بين عمل Holtfreter و Just's مخفية. تقدم هذه الورقة أمثلة على الظواهر التي تُظهر ارتباطًا ضعيفًا ، وتوضح الحالة التي مفادها أن مفهوم جست للتهيج المستقل ، من خلال هولتفريتر وجيرهارت وكيرشنر ، قد تسلل إلى الخلية الحديثة وعلم الأحياء التطوري على نطاق واسع.

"ومع ذلك ، فإن التطورات العظيمة الأخيرة في [فهمنا لأهمية سطح الخلية] تتطلب منا العودة إلى كتاب Just's [بيولوجيا سطح الخلية] لإعادة تقييم أهميتها المعاصرة. ربما ، ربما ، ربما يكون مندل أو ميشر آخر ، يقوم بعمل أساسي لم يُقدَّر لعقود بعد وفاته "(جلاس ، 1984).


المواد والأساليب

البويضات والأجنة

تم تجفيف البويضات يدويًا واستزراعها كما هو موضح سابقًا (Kofron et al. ، 1999). تم حقن البويضات مع oligos في وسط استزراع البويضات (OCM) باستخدام حقنتين استوائيتين لكل بويضة لـ XTcf3 oligos ، أو حقنة نباتية واحدة لـ VegT و Axin oligos ، تم تربيتها عند 18 درجة مئوية وتخصيبها باستخدام تقنية نقل المضيف كما هو موضح سابقًا (Zuck et آل ، 1998). أجريت تجارب الإنقاذ على النحو الموصوف في النص إما عن طريق حقن mRNA استوائيًا في البويضات ، بعد 24 ساعة من القلة (الشكل 2F) ، أو عن طريق الحقن في أجنة من 4 خلايا (الشكل 2E). تم تجريد البويضات وتخصيبها باستخدام معلق للحيوانات المنوية والحفاظ على الأجنة عند 0.2 × MMR. لحقن mRNA بعد الإخصاب (الشكل 2E) ، تم فك الأجنة ونقلها إلى 2٪ Ficoll في 0.5 × MMR في مرحلة الخلية الواحدة. تم تخفيف mRNAs بالماء المقطر المعقم وحقنها في blastomeres.

بالنسبة لمقايسات غطاء الحيوان ، تم وضع أجنة منتصف بلاستولا على أطباق agarose بنسبة 2 ٪ في 1 × MMR وتم تشريح أغطية الحيوانات باستخدام ملقط حاد. ثم تمت زراعة القبعات في OCM حتى وصلت أجنة الأشقاء إلى مرحلة منتصف إلى أواخر المعيدة. بالنسبة للإكسبلنتس الاستوائية ، تم وضع الأجنة على أطباق agarose بنسبة 2 ٪ في مرحلة منتصف الأجاروز وتم تشريح المناطق الاستوائية باستخدام إبر التنجستن (Xanthos et al. ، 2001) وتم تربيتها في OCM حتى وصلت أجنة الأخوة إلى مرحلة منتصف العصب. للفصل إلى نصفين ظهرى وبطنى فى مرحلة المعدة ، تم تمييز الجانب الظهرى للأجنة فى المرحلة المكونة من أربع خلايا باستخدام بلورات النيل الأزرق. تم التعرف على المحور الظهري المركزي في المرحلة المكونة من أربع خلايا من خلال اختلافات التصبغ في الجانبين الظهري والبطني. عندما وصلت الأجنة من النوع البري إلى المرحلة 10 ، تم وضع جميع الدُفعات في أطباق agarose بنسبة 2 ٪ في 1 × MMR pH 7.6 وتم تقسيمها إلى نصفين ظهراني وبطني ، وتم تجميدها في مجموعات من 4 أجنة نصف كل ساعتين من خلال المعدة مراحل.

Oligos و mRNAs

كانت oligodeoxynucleotides المستخدمة في مضادات المعنى هي HPLC المنقى من phosphorothioate-phosphodiester chimeric oligonucleotides (Sigma / Genosys) مع التركيبة الأساسية:

XTcf3 T1: 5′-C * G * A * G * GGATCCCAGTC * T * T * G * G-3 ′.

XTcf3 T2: 5′-G * A * G * ATAACTCTGA * T * G * G-3 ′.

تعد أوليجوس XTcf3 مكملة تمامًا لجميع المتغيرات الأربعة لـ XTcf3. تمثل العلامات النجمية (*) روابط الفوسفوروثيوات. تم إعادة تعليق Oligos في ماء معقم ومفلتر وحقن بجرعات كما هو موضح في النص. مكتمل الطول XTcf3 في المتجه pGlomyc خطي مع Xbaأنا وتوجت XTcf3 تم تصنيع mRNA باستخدام مجموعة T7 mMessage mMachine (Ambion). تم استخراج الفينول RNAs ، وترسب الإيثانول ثم أعيد تعليقه في ماء مقطر معقم للحقن.

تحليل التعبير الجيني باستخدام RT-PCR في الوقت الحقيقي

تم تحضير إجمالي الحمض النووي الريبي من البويضات والأجنة والإكسبلانتس باستخدام بروتيناز K ثم تمت معالجته باستخدام DNase الخالي من RNase كما هو موصوف سابقًا (Zhang et al. ، 1998). تم استخدام ما يقرب من سدس الجنين من الحمض النووي الريبي في تخليق (كدنا) مع بادئات oligo (dT) متبوعة بـ RT-PCR في الوقت الحقيقي والتقدير الكمي باستخدام LightCycler ™ System (Roche) كما وصفه Kofron et al. (كوفرون وآخرون ، 2001). يتم سرد الاشعال وظروف ركوب الدراجات المستخدمة في الجدول 1. تم حساب قيم التعبير النسبي بالمقارنة مع منحنى قياسي تم إنشاؤه بواسطة التخفيف التسلسلي للتحكم غير المحقون (كدنا). تم تطبيع العينات لمستويات أورنيثين ديكاربوكسيلاز (ODC) ، والذي تم استخدامه كعنصر تحكم في التحميل. عينات من الماء وحده أو عناصر تحكم تفتقر إلى النسخ العكسي في تفاعل تخليق (كدنا) فشلت في إعطاء منتجات محددة في جميع الحالات.


درجات لمحاور الجسم الأولية في الفرات

هناك نوعان من محاور الجسم الأساسية ، الأمامي الخلفي (AP) والظهر الباطني (DV). ومع ذلك ، عادةً ما يُفترض وجود منظم واحد فقط - المنظم من نوع Spemann. كيف يمكن اثنين تظهر أنظمة المعلومات الموضعية المتعامدة تحت تأثير أ غير مرتبطة منظم؟ هل هناك منظم آخر تم تجاهله حتى الآن؟ هناك حجج جيدة مفادها أن منظم نمط AP ليس Spemann-Organizer بل المنطقة الهامشية بأكملها (Meinhardt 2006). في بداية المعدة ، Wnt يتم إنتاجه في المنطقة الهامشية باستثناء المنطقة المنظمة (Christian and Moon 1993). Wnt يوفر معلومات موضعية للانفصال إلى الدماغ الأمامي والمتوسط ​​(Kiecker and Niehrs 2001 Nordström et al. 2002 Dorsky et al. 2003). نظام تشكيل الأنماط هذا قديم جدًا من الناحية التطورية. تُظهر مقارنة بين التعبيرات الجينية في الهيدرا والمعدة الفقارية المبكرة تطابقًا مفاجئًا ، مما يشير إلى أن نمذجة دماغ الفقاريات والقلب تطورت من نظام كان في السابق مسؤولاً عن تشكيل جسم سلف يشبه الهيدرا (الشكل 2 ب). ) (Meinhardt 2002). في هذا العرض ، يعد منظم الهيدرا وثقب الفقاريات ، أي المنطقة الهامشية ، وحلقة الجرثومة ، وما إلى ذلك ، هياكل متجانسة مسؤولة عن نمط AP.

على عكس منظم الهيدرا ، تطور ثقب الانفجار الفقاري إلى حلقة ضخمة مع منظم Spemann الذي شكل رقعة صغيرة على هذه الحلقة. يُفترض بعد ذلك أن يقوم منظم Spemann بنمذ محور DV ، ولكنه يفعل ذلك بشكل غير مباشر عن طريق إنشاء خط الوسط الظهري ، والحبل الظهري ، ولوحة الأرضية - "خط مرتفع" وليس "نقطة عالية" لنقش DV. تشكل كلتا المنطقتين المنظمتين ، الحفرة المتفجرة لـ AP والخط الوسط لمحور DV ، نظام إحداثيات ديكارتي قريب يسمح بنمذجة اندماجية على طول كلا المحورين (الشكل 2 ج). إن إنشاء "خط مرتفع" واحد طويل ممتد لنقش DV هو عملية دقيقة لتشكيل النموذج. إن حل الفقاريات ليس الحل الوحيد. في الحشرات ، على سبيل المثال ، يمارس المنظم الظهري أ القمع ، مما تسبب في ظهور خط الوسط في الجانب البطني المقابل (Meinhardt 2004 ، 2008) ، على عكس الفقاريات التي يبدأ فيها المنظم ويطيل خط الوسط ظهريًا. يوفر هذا النموذج سببًا منطقيًا للموقع الظهري أو البطني للجهاز العصبي المركزي في الفقاريات والحشرات ، على التوالي.


نموذج التحجيم المعتمد على Chordin / Sizzled

لقد أبلغنا مؤخرًا عن الآلية الجزيئية للقياس في الشطر Xenopus الأجنة (إينوماتا وآخرون. 2013). يجب أن يشكل نصف الجنين الظهري تدرج Chordin مناسبًا وفقًا لحجم الجنين من خلال تنظيم ثلاثة عوامل ، التوليف والانتشار والتدهور. ومع ذلك ، إذا غيرت العوامل الثلاثة قيمتها ديناميكيًا ، فسيكون من الصعب تحليل نظام القياس. للقضاء على هذا التعقيد ، أنشأنا خلايا مصدر بشكل مصطنع ، والتي صنعت كمية ثابتة من بروتين Chordin دون أن تتأثر بحجم الجنين أو نشاط BMP (اختبار إعادة تشكيل المحور D-V). أولاً ، تم حقن الأجنة كاتينين β-MO و chordin / noggin-MO (βCN-MO) للقضاء على الخلايا المصدر (المنظم) والتعبير عن عوامل الظهارة الداخلية ، على التوالي (الشكل 4) (Heasman وآخرون. 2000 أوليجشلاجر وآخرون. 2003 أ). بعد ذلك ، باستخدام هذه الأجنة البطينية تمامًا التي تفتقر إلى التدرج اللوني ، يتم حقنها محليًا كوردين mRNA لإنشاء تدرج Chordin خارجيًا في الجنين. أدى ذلك إلى تكوين ثلاث مناطق متميزة ، المنطقة الظهرية (D) ، الجانبية (L) ، والبطنية (V) ، كما هو الحال في جنين التحكم. عندما تم تحسين معدل إنتاج بروتين Chordin عن طريق الحقن بأربعة أضعاف كوردين mRNA ، أظهرت الأجنة تغيرًا معتدلًا في تشكيل المحور D-V. لذلك ، يبدو أن شكل التدرج اللوني Chordin ينظم بشكل أساسي عن طريق التدهور.

من هذه النتائج ، ركزنا على الارتباط بين Chordin و Sizzled ، الذي يتحكم في استقرار بروتين Chordin (الشكل 2 ب). لفحص معدل الانتشار ، أجرينا استعادة الفلورة بعد فحص التبييض الضوئي (FRAP) أو مطيافية الارتباط الفلوري (FCS) ووجدنا أن Chordin و Sizzled ، وكذلك الشكل الإفرازي لـ mEGFP ، انتشر بسرعة. في المقابل ، كان معدل تحلل كل بروتين مختلفًا بشكل واضح. كان بروتين Sizzled مستقرًا في الجنين ، في حين أن بروتين Chordin (26.7 fmol لكل جنين) يتحلل بسرعة كبيرة مع عمر نصف يبلغ حوالي 30 دقيقة. تم حظر عدم استقرار بروتين Chordin تمامًا بسبب الكمية الزائدة من Sizzled ، مما يشير إلى أن غالبية تحلل Chordin يعتمد على metalloproteases BMP1 و Xlr. علاوة على ذلك ، غيّر تدرج Chordin شكله ديناميكيًا من شديد الانحدار إلى ضحل اعتمادًا على تركيز Sizzled ، حتى عندما تم تثبيت معدل إنتاج Chordin بواسطة مقايسة إعادة تشكيل المحور D-V. أشارت هذه النتائج إلى أن شكل تدرج Chordin تم تنظيمه بشكل أساسي من خلال التحلل الذي يعتمد معدله على كمية البروتين Sizzled.

بناءً على الملاحظة التجريبية ، اقترحنا نموذج التحجيم المعتمد على Chordin / Sizzled المذكور أدناه. قبل المعدة ، bmps والجين المستهدف أزيز تم التعبير عنها في الجنين كله (الشكل 5 أ). ومع ذلك ، عندما تم تشكيل المنظم (الخلايا المصدر) محليًا في الجنين في مرحلة المعوية المبكرة ، انتشر Chordin المركب في الفضاء خارج الخلية وقمع تدريجيًا أزيز منطقة التعبير عن طريق تثبيط نشاط BMPs (الشكل 5 أ). خلال هذه العملية ، يتراكم بروتين الأزيز تدريجياً في الجنين بسبب معدل تحلله المنخفض (الشكل 5 ب). بالنظر إلى جنين النصف الظهري ، فإن أزيز تم قمع منطقة التعبير بسرعة عن طريق انتشار Chordin (الشكل 5A أسفل). أصبح تراكم الأزيز أقل من ذلك في جنين التحكم (الشكل 5 ب القاع). في هذا النصف الظهري منخفض الأزيز ، تم تحسين تدهور Chordin وشكل تدرجًا حادًا مناسبًا للجنين الصغير (الشكل 5C).

في نموذج القياس هذا ، اقترحنا أن حجم الجنين ينظم استقرار بروتين Chordin من خلال تراكم بروتين Sizzled. لمعالجة هذا الاحتمال ، تم إصلاح إنتاج Chordin باستخدام مقايسة إعادة تشكيل المحور D-V ، وتم تغيير حجم الجنين بشكل مصطنع عن طريق التنصيف. على الرغم من الإنتاج الثابت ، تم الكشف عن انخفاض بروتين Chordin في الأجنة المشقوقة. تمشيا مع نموذج التحجيم المعتمد على Chordin / Sizzled ، تم التخلص من هذا التغيير في استقرار بروتين Chordin عندما تم استنفاد Sizzled بواسطة morpholino. علاوة على ذلك ، قمنا ببناء نموذج رياضي بناءً على النتائج التجريبية: (1) معدل انتشار متطابق لـ Chordin و Sizzled (2) انخفاض معدل تحلل Sizzled من معدل Chordin (3) التنظيم المعتمد على Sizzled لتدهور Chordin و (4) قمع من منطقة التعبير Sizzled عن طريق نشر Chordin. في هذا النموذج الرياضي ، أكدنا أن ثلاث مناطق متميزة ، الظهرية والجانبية والبطنية ، يمكن أن تتناسب مع حجم الجنين من خلال تراكم الأزيز.


مناقشة

ال Xenopus قدم منظم Spemann أرضًا خصبة لصيد الأسماك لاكتشاف البروتينات المفرزة التي تنظم التطور. كان من المتوقع أن يتم عزل عوامل النمو الجديدة ، ولكن بدلاً من ذلك ، وجد أن منظم Spemann يتوسط في التحريض الجنيني من خلال إفراز خليط من مضادات عامل النمو (4 ، 5). في هذه الدراسة ، استخدمنا التسلسل العميق للتحقيق في الاختيار بين البشرة والأنسجة العصبية.

مصدر غني بالنسخ.

نسخة من خلايا الغطاء الحيواني التي تم فصلها لعدة ساعات (مما تسبب في تحييد) ، وكذلك تلك الخاصة بالأديم الظاهر إكسبلنتس المحقونة مع عدد من mRNAs التي تحفز الأنسجة العصبية ، مثل كوردين, سيربيروس، و FGF8، تم تحديده بواسطة RNA-seq. درسنا أيضًا تأثير محفز الأديم الباطن Xnr2، محفز البشرة BMP4، ومعدل كفاءة تحريض الأديم المتوسط xWnt8 (32). يتم توفير هذه البيانات ، التي تشتمل على ما لا يقل عن 45 × 10 9 نيوكليوتيدات متسلسلة من الحمض النووي الريبي ، في مجموعات البيانات S1 - S3 ، والتي يمكن تعدينها بسهولة بواسطة مجتمع البحث. يشكل هذا مصدرًا مفتوحًا مهمًا لعلماء الأحياء التطوريين المهتمين بتمايز الطبقة الجرثومية.

عزل مثبط Wnt.

من خلال البحث عن جينات الحث العصبي التي يتم تنشيطها عن طريق تفكك الخلايا (الذي يتسبب في تنشيط MAPK) (19) ومن خلال البحث عن سيربيروس, كوردين، و xWnt8 mRNAs ، حددنا بروتينًا أطلقنا عليه اسم Bighead بسبب النمط الظاهري للتعبير المفرط. بشكل غير متوقع ، لم يتم التعبير عن هذا الجزيء في الأديم الظاهر لمرحلة المعوية المتأخرة 12 عندما تم تحضير مكتبات RNA-seq. في هذه المرحلة ، يتم التعبير عن الرنا المرسال ذو الرأس الكبير في الأديم الباطن ، لا سيما في منظم Spemann الظهري. تم العثور على تعبير المنظم في الأديم الباطن العميق ولكنه لا يتداخل مع الأديم الباطن الأمامي الأمامي (الذي يؤدي إلى المعى الأمامي والكبد) ، والذي يعبر عن سيربيروس و Dkk1 (24 ، 41). في ضوء متطلبات Bighead لتطوير الرأس ، يبدو أن مناهضات Wnt يجب أن تنبثق أيضًا من أكثر مناطق الأديم الباطن الخلفية للمنظم لتمكين خصائصها التي تحفز الرأس بشكل كامل.

من غير المحتمل أن يؤدي تفكك أغطية الحيوانات إلى تحفيز الأديم الباطن ، منذ علامة الأديم الباطن الشاملة سوكس 17 لم يتم التعبير عنها (Dataset S1). يبدو من المحتمل أن تفكك أغطية الحيوانات يؤدي إلى التنشيط المبكر للمجالات العصبية للتعبير ذو الرأس الكبير ، والتي ، في الجنين غير المضطرب ، يتم ملاحظتها في مراحل عصبية لاحقة. كان التعرف على Bighead محظوظًا ، لأنه أثبت أنه بروتين مثير للاهتمام.

حيث X. laevis هو allotetraploid ، يتم ترميز Bighead بجينين من الأشكال S و L (20). كلاهما يشفر البروتينات من حوالي 270 aa مع إشارة الببتيد ويتم إفرازها. في تجارب الإفراط في التعبير ، تسبب Bighead في ظهور أنماط ظاهرية مشابهة جدًا لمضاد Wnt النموذجي Dkk1 (41). كبير الرأس قام mRNA بتوسيع التعبير عن عدد من علامات الرأس ، وحظر التعبير عن En2 الجين المستهدف Wnt ، منع تكوين المحور الثانوي بعد حقنة واحدة من xWnt8 مرنا ، وانخفاض تحريض أهداف Wnt المبكرة سياموا و Xnr3. علاوة على ذلك ، أدت إضافة البروتين كبير الرأس إلى تثبيط إشارات Wnt الكنسية في فحوصات الجينات لمراسل لوسيفيراز. وبالتالي ، يتصرف Bighead كمضاد لإشارات Wnt الكنسي ، وكثير منها معروف بتعزيز نمو الرأس (48).

أظهرت عمليات البحث المكثفة عن متماثلات من الحيوانات ذات الرأس الكبير في الكائنات الحية الأخرى أنها موجودة فقط في الأسماك والبرمائيات. على سبيل المثال ، في سمك الزرد ، يتوافق Bighead مع LOC571755 ، وهو بروتين غير معروف الوظيفة. تطور البروتين بسرعة ، ولكن تم حفظ سيستينه الست في العديد من الأنواع. يشير توقع SWISS-MODEL إلى أن المنطقة الطرفية C في Bighead متوافقة مع التركيب البلوري لنطاق أولي لـ TGF-s مثل myostatin / GDF8 (38 ، 40) ربما جزءًا من Bighead مشتق من مجال هيكلي في منطقة القديمة TGF-β.

لم يتم العثور على متماثلات في الزواحف أو الطيور أو الثدييات. يعد فقدان الجينات شائعًا جدًا أثناء التطور. على سبيل المثال ، وصفنا شبكة قديمة ذاتية التنظيم من Chordin / BMP / Tolloid تنظم نمذجة D / V في الفقاريات واللافقاريات (49). ومع ذلك ، على الرغم من هذا الحفظ العميق ، فقد بعض مكونات الشبكة. البروتين المورفوجيني المضاد للظهر (ADMP) هو عبارة عن BMP تم فقده في خلد الماء (Ornithorhynchus) (50). يتواجد الهلال و Sizzled في sFRPs في الطيور وخلد الماء ، ولكن ليس في الثدييات الأعلى التي فقدت صفار البيض. بالإضافة إلى ذلك ، لا توجد sFRPs في أي لافقاريات (51). يبدو أن الشرط الجنيني لمستوى التنظيم المقدم من Bighead قد فُقد مع اختراع السلى. على الرغم من ذلك ، تُظهر دراساتنا حول استنفاد الرأس الكبير بواسطة MOs وجود متطلبات قوية بشكل ملحوظ لهذا الجين في تكوين الرأس أثناء نمو الضفادع.

لماذا الكثير من الخصوم Wnt؟

يضيف Bighead إلى قائمة كبيرة من خصوم Wnt المفرز. وتشمل هذه بروتينات Dkk (48) ، sFRPs ، عامل مثبط Wnt 1 (WIF-1) (52) ، SOST / Sclerostin (53) ، Notum (هيدروليز يزيل البالميتوليليت من Wnt في الفضاء خارج الخلية) (54) ، و Angptl4 (6). بالإضافة إلى ذلك ، بروتينات الغشاء مثل Shisa (بروتين متورط في تهريب مستقبلات Frizzled إلى سطح الخلية) ، Tiki (بروتياز يشق النهاية الأمينية لـ Wnts) (56) و Znrf3 / RNF43 (ubiquitin ligase الذي تستهدف مستقبلات Frizzled و Lrp6 للتدهور الليزوزومي) (57 ، 58) تنظيم إشارات Wnt.

كما هو موضح في هذه الدراسة ، يرتبط Bighead بـ Lrp6 ، مما يحفز الالتقام السريع في الجسيمات الحالة. نتيجة لذلك ، تتم إزالة Lrp6 من سطح الخلية ويتحلل في الجسيمات الداخلية. تشبه هذه الآلية الجزيئية إلى حد كبير تلك الخاصة بمضادات Wnt Dkk1 و Angptl4. يرتبط Dkk1 بـ Lrp6 و Kremen1 / 2 ، والمجمع داخلي. Angptl4 هو بروتين مُفرَز يشتهر بدوره كمثبط ليباز البروتين الدهني (LPL) ، وهو الإنزيم الرئيسي في إزالة الدهون الثلاثية من بلازما الدم (59). دراسات في Xenopus أظهرت أن Angptl4 يرتبط بسطح الخلايا المتلازمية (وهي عبارة عن بروتيوغليكان عبر الغشاء) وأن هذا التفاعل يؤدي إلى حدوث الالتقام الخلوي لـ Lrp6 (6). في حالة Bighead ، من غير المعروف ما إذا كان المُستقبِل مطلوبًا لاستيعاب Lrp6. ما هو واضح ، مع ذلك ، هو أن هذه الخصوم الثلاثة Wnt تؤدي إلى استيعاب Lrp6 في مجموعة endolysosomal التي لا تشارك في توليد الإشارات.

يؤكد وجود العديد من الهيئات التنظيمية على التعقيد الثري لمسار إشارات Wnt. عادة ما نفكر في Wnt الكنسي كإشارة تزيد فقط من مستويات الكاتينين النووية لتنظيم النسخ بواسطة عامل T-cell / عامل ربط المحسن اللمفاوي (TCF / LEF). ومع ذلك ، فإن Wnt لها تأثيرات إضافية. على سبيل المثال ، في تثبيت البروتينات المعتمد على Wnt ، تستقر مئات البروتينات الخلوية ، مما يؤدي إلى زيادة حجم الخلية (60 ، 61). يحدث هذا بسبب عزل GSK3 داخل الجسيمات الداخلية المتأخرة / الأجسام متعددة الحبيبات (MVBs) (62 ، 63) ، مما يقلل من فسفرة الفسفوجرونات في بروتينات العصارة الخلوية التي تؤدي عادةً إلى تدهورها في البروتيازومات. بالإضافة إلى GSK3 ، يتم عزل إنزيم خلوي هام آخر ، وهو بروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز 1 (PRMT1) ، داخل MVBs عندما يتم اندماج مستقبلات Wnt مع يجند Wnt (64). إن الإدراك الأخير بأن Wnt3a يحفز بشكل كبير الالتقام الخلوي غير المستقبلي لـ BSA-DQ من الوسط خارج الخلية (64) يشير إلى أن Wnt هو منظم رئيسي لتهريب الأغشية. نقترح أن Lrp5 / 6 هو منظم رئيسي ليس فقط لتهريب Wnts ولكن أيضًا للسائل الخلوي العام وامتصاص المغذيات. الالتقام الخلوي هو خاصية خلوية عالمية يمكن تنظيمها بواسطة Dkk1 و Angptl4 و Bighead. لا يزال هناك الكثير لنتعلمه عن فسيولوجيا مسار إشارات Wnt الرائع (65 ، 66).


شكر وتقدير

نشكر F. Cong لتوفير بنيات ZNRF3 D. Koinuma لتوفير بنيات ALK C. Janda لتوفير بناء بديل WNT R. Thomas لخلايا H1581. نعترف بـ G. Roth و Aska Pharmaceuticals Tokyo على كرمهما في تقديم قوات حرس السواحل الهايتية. نشكر NXR (RRID: SCR_013731) و Xenbase (RRID: SCR_004337) و EXRC من أجل Xenopus مصادر. نشكر فابيو دا سيلفا على القراءة النقدية للمخطوطة. نقدر بامتنان الدعم الفني الخبير من قبل المرفق الأساسي DKFZ للفحص المجهري الضوئي ومختبر الحيوانات المركزي في DKFZ. تم تمويل هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) - SFB1324 - رقم المشروع 331351713.


المنجل Endoblast (الثانوي HYPOBLAST)

تشكل الأرومة الداخلية المنجلية طبقة أحادية الخلية بعيدة الامتداد تتكاثر من الحافة الوسطى لمنجل Rauber أو الأرومة الداخلية المفصلية في اتجاه الجاذبية المركزية والجمجمة أثناء الحضانة المبكرة (Callebaut and Van Nueten ، 1994 Callebaut et al. ، 1999 الشكل 13). بشكل أساسي ، يحتوي على γ ooplasm.

ينتمي المنجل Endoblast إلى نفس سلالة الخلايا مثل منجل Rauber وله سلوك مماثل ولكن يهيمن عليه Rauber's Sickle

إذا تم وضع جزء من الأرومة الداخلية المنجلية للسمان على المنطقة المضادة للمنجل لأديم الدجاج غير المحضن الذي تم كشط منجل راوبر بشكل انتقائي منه ، فإن جنينًا كاملاً مع PS ، وأديم باطن نهائي ، وعقدة Hensen ، وصفيحة عصبية تتطور في اتجاه متعارض تمامًا ، بدءًا من منطقة مكافحة المنجل (كاليبو وآخرون ، 2003 أ ، ب). يحدث الشيء نفسه عندما يتم وضع جزء من الأرومة الداخلية المنجلية للسمان على الجزء المركزي المعزول من دجاج بلاستودرم غير محتضن (كاليبو وآخرون ، 2002 ج). الأوبلازم المركزي تحت الجراثيم الموضوعة بشكل مصطنع على مادة منجل Rauber أو الأرومة الداخلية المنجلية في الثقافة ، يمكن أن تعمل كركيزة للتكاثر الخلوي مع تحفيز و / أو تجديد القدرات مرة أخرى في الطبقة العليا المجاورة (Callebaut et al. ، 2000c). حتى تنشيط تكوين الجنين يمكن أن يحدث عن طريق السمان المتفجر غير المخصب (كاليبو وآخرون ، 2000 د).

عندما يتم وضع الأرومة الداخلية المنجلية السمان على المنطقة المعزولة المضادة للمنجل من الأديم المتفجر للدجاج غير المحضن في المزرعة ، تتطور صفيحة عصبية مبكرة. على النقيض من ذلك ، عندما يتم وضع قطعة من الأرومة الداخلية منجل السمان على المنطقة المضادة للمنجل لدجاجة كاملة غير محضنة في الثقافة ، لا يكون لها تأثير محفز. تشير هذه النتيجة إلى أن منجل Rauber يهيمن أو يثبط الأرومة الداخلية المنجلية الموضوعة خارج الرحم ، والتي تشتق من نفس سلالة الخلية. هذه الأرومة الداخلية المنجلية ، إذا تم سحبها من تأثير منجل راوبر ، لها فاعلية تحفيز معدة و / أو عصبية على الطبقة العليا من الأديم غير المحتضن ، ولكن ليس لها تأثير على تكوين جزيرة الدم. يتم التعبير عن جين cHex المثلية في الخلايا الداخلية المنجلية والمنجلية لـ Rauber (Yatskievych et al. ، 1997). تم اكتشاف نسخ cHex أيضًا داخل جزر الدم بدءًا من المرحلة 4 (هامبرغر وهاملتون ، 1951) وفي الخلايا البطانية الوعائية خارج المضغية وداخل المضغة. نظرًا لأننا أظهرنا أن منجل Rauber والأرومة الداخلية الوصلة لها تأثير محفز على تكوين جزر الدم ، يمكننا افتراض علاقة غير معروفة مع جين cHex.

تأثير الأرومة الداخلية المنجلية على العصب والجهاز الهضمي

تمت دراسة الأساس الجزيئي للحث العصبي على نطاق واسع في Xenopus laevis، وقد وجد أنه مرتبط بإحكام بإنشاء المحور الظهري المركزي (De Robertis and Sasai ، 1996 Hemmati-Brivanlou and Thomsen ، 1995 Hemmati-Brivanlou and Melton ، 1997). في الضفادع ، يتم تحفيز الأديم الظاهر المحتمل بواسطة BMPs. في المقابل ، يتطلب التطور العصبي تعطيل BMPs ويتم تحقيقه من خلال التكوين المعقد المباشر بين BMPs والعوامل المحفزة العصبية مثل chordin أو noggin أو follistatin (Piccolo et al. ، 1996 Zimmermann et al. ، 1996). في الأديم الأرملي للكتاكيت في المراحل المبكرة ، تتميز البشرة المرتقبة بالتعبير عن الجين المثلي DLX5 ، الذي يظل علامة على البشرة أثناء التكون المعدي والعصب ويمكّن من تمييزه عن الصفيحة العصبية الأكثر مركزية (بيرا وآخرون ، 1999 ). أوضح المؤلفون الأخيرون أن الإشارات الرأسية من الطبقة السفلية ضرورية لإنشاء الصفيحة العصبية من خلال عمليات الاستئصال المتكررة للأرومة الداخلية الكامنة. في حالة عدم وجود الطبقات الجرثومية السفلية ، امتدت البشرة إلى المنطقة التي تشكل عادة الصفيحة العصبية.

Knoetgen وآخرون. (1999 أ ، ب) حلل GANF (جالوس الطية العصبية الأمامية) - إحداث إمكانات لأنسجة مختلفة في مراحل مختلفة أثناء نمو الصيصان عن طريق الزرع إلى الحافة الخارجية للمنطقة الشفافة ، حيث تتجه الخلايا الخارجية إلى البشرة (Spratt ، 1952 Rosenquist ، 1966 Schoenwolf and Sheard ، 1990 Bortier and Vakaet، 1992 Garcia-Martinez et al.، 1993). أدت عمليات زرع عقدة Hensen (HH3 + / HH4) على الجلد المتفجر بالكامل إلى تحريض بنية جلدية عصبية مع تعبير قوي عن GANF في هامشها القحفي. تسبب تطعيم عملية الرأس الشاب (HH4) في منطقة الجمجمة الجانبية pellucida في زيادة سماكة الأديم الخارجي وتحريض تعبير GANF في الخلايا المجاورة.

جزيء مُفرَز يُدعى "سيربيروس" ، والذي يُعبر عنه في الأديم الباطن الأمامي ، له خاصية تحفيز هياكل الرأس المنتبذة عند حقنها بالميكرو في المناطق البطنية من Xenopus الأجنة (Bouwmeester et al.، 1996 Bouwmeester، 1997). وصف Pera and Kessel (1997) الزخرفة الخاصة بغطاء الدماغ الأمامي للكتاكيت بواسطة الصفيحة السابقة. وفقًا لهؤلاء المؤلفين أيضًا ، تظهر الصفيحة العصبية للطيور قبل دخول أول خلايا الأديم المتوسط ​​أو الأديم المتوسط ​​المحوري ، باستثناء الصفيحة السابقة والحبل الظهري كمصادر أولية للحث العصبي. أثناء التكون المعدي المبكر ، تغزو الخلايا من خلال طرف خط النمو وتنتشر شعاعيًا لتشكيل الأديم الباطن (الأمعاء) النهائي (Vakaet ، 1970). خلال هذا التمدد الشعاعي ، يقوم الأديم الباطن الأخير بدفع الأرومة الداخلية المنجلية أيضًا شعاعيًا (كاليبو وفان نويتن ، 1994 الشكل 13). تنزلق الأرومة الداخلية منجل نصف دائري الجمجمة تحت خلايا الطبقة العليا التي تتحول إلى لوحة عصبية نصف دائرية (Bortier and Vakaet ، 1992). تتمركز الخلايا الأخيرة بالقرب من المنطقة المضادة للمنجل السابقة ، بالضبط في تقعر الهلال الداخلي النازح من الجمجمة. يتم توطين الأرومة الداخلية المنجلية الأكثر ذيلية المتبقية تحت الطبقة العليا ، مما يؤدي إلى ظهور المنطقة المركزية المكونة لـ PS. ربما يمكن تفسير هذا التطور المختلف في منطقة الجمجمة (ضد المنجل) مقابل المنطقة المركزية (المنطقة المركزية) من خلال التفاعل المختلف في هاتين المنطقتين من الطبقة العليا (كاليبو وآخرون ، 2002 ج).

غياب الحث العصبي بعد تجارب التطعيم مع الطبقة العميقة على الجلد المتفجر بالكامل بواسطة Gallera و Nicolet (1969) و Knoetgen et al. (1999 أ ، ب) يمكن تفسيره على الأرجح من خلال الوجود الكامل لمادة راوبر المنجلية. تشير هذه النتيجة أيضًا إلى أنه يجب إعادة النظر في الاستنتاجات السابقة من تجارب التطعيم على الجلد المتفجر غير المحضن بالكامل (التي تحتوي على منجل Rauber ، أو المنظم الرئيسي الرئيسي ، أو على الجلد المتفجر PS ، الذي يحتوي على عقدة Hensen ، وهو منظم رئيسي ثانوي). لذلك ، لا يمكننا الاتفاق مع أي من استنتاجات Knoetgen et al. (1999 ب) أن الأرومة الداخلية من تلقاء نفسها تثير أي تغيير يمكن اكتشافه في الأرومة الخارجية للمضيف المجاور بعد الزرع أو أن منظم الطيور يقتصر على عقدة هنسن فقط. فولي وآخرون. (2000) درس الدور النهائي للطبقة العميقة المبكرة (endophyll و / أو الأرومة الداخلية المنجلية) على التعبير عن الواسمات الجزيئية Sox3 (Uwanogho et al. ، 1995) و Otx2 (Bally-Cuif et al. ، 1995) في الطبقة العليا. من مرحلة هامبرغر وهاملتون من المرحلة 6-7 فصاعدًا ، يتم التعبير عن Sox3 بشكل خاص في الصفيحة العصبية للدجاج بالكامل ويتم التعبير عن Otx2 في جميع أنحاء الدماغ الأمامي والدماغ المتوسط. فولي وآخرون. وجد (2000) أن الطبقة العميقة المبكرة تنظم مرحلة عابرة مبكرة من تعبير Otx2 و Sox3 في الطبقة العليا المجاورة. لذلك ، خلصوا إلى أن الطبقة العميقة المبكرة لا تحفز النسيج العصبي أو الدماغ الأمامي بشكل نهائي. ومع ذلك ، لم يتم إجراء تجارب الزرع الخاصة بهم على منجل Rauber - أو شظايا الأديم الداخلي الخالية من الأديم الداخلي الوصلي ولكن على الجلد الكامل. في الآونة الأخيرة ، وجد Knezevic and Mackem (2001) دليلاً على أن جينين ، ارتبطا لاحقًا بمنظم المعدة (Gnot-1 و Gnot-2) ، يتم تحفيزهما بواسطة إشارات الطبقة العميقة في الأجنة السابقة للكسر. وفقًا للمؤلفين الأخيرين ، ربما يمكن لهذه الجينات أن تنظم تكوين المحور في الجنين المبكر ، مما قد يفسر أيضًا تحريض خط في الجزء المعزول من المنطقة المركزية بواسطة الأرومة الداخلية المنجلية (كاليبو وآخرون ، 2003 ب).


الجزء 3: التطور المبكر للضفدع: كيفية صنع الشرغوف أو التوأم

00: 00: 0708 أنا ريتشارد هارلاند.
00: 00: 0808 أنا في جامعة كاليفورنيا في بيركلي.
00: 00: 0926 واليوم سأخبركم عن أنشطة الإشارات التي تؤدي إلى حدوث ذلك
00:00:1322 the neural plate, the forerunner of the spinal cord and brain in vertebrate embryos.
00:00:1914 In previous talks, I've talked about the introduction to the Xenopus embryo, why it has some advantages
00:00:2509 for experiments.
00:00:2609 And I've talked about the cell shape changes that have happened in the. in the embryo
00:00:3015 that lead to the three-layered ectoderm/mesoderm/endoderm structure that is the case, the.
00:00:3625 the state at which neural tissue formation happens.
00:00:4120 Let's initially start by just reviewing the classic experiment, the organizer experiment
00:00:4520 done by Hilde Mangold and Hans Spemann.
00:00:4819 And this is the one that really set the stage for what I'm going to talk about.
00:00:5304 In this experiment, they used marked embryos.
00:00:5607 They used newts of different colors: a dark-colored, pigmented newt, and a light-colored newt.
00:01:0104 And what they were. asking the question, what happens if we move pieces of the embryo around?
00:01:0814 Do they differentiate according to how they normally were set up in the embryo?
00:01:1209 It's self-differentiating according to their original fate?
00:01:1502 Or do they adopt the fate of their surroundings?
00:01:1728 Are they told to become the fate of their surroundings?
00:01:2017 Well, there was one particular experiment that was quite spectacular,
00:01:2426 where not only did the cells self-differentiate, but they recruited cells from the rest of the embryo
00:01:3025 to make new structures, the phenomenon of embryonic induction.
00:01:3604 So here, what they did was to take this embryo, here. the dark embryo is the host, and there's
00:01:4212 this paler donor.
00:01:4328 And what they did was to cut out this dorsal lip region from the pale embryo, flip it around,
00:01:5013 and graft it in to the ventral side of the host.
00:01:5318 So, not only does this have its normal organizer side but it has a new piece of dorsal mesoderm
00:01:5904 stuck in the ventral side.
00:02:0028 And what they found was that this was enough to make the embryo twin.
00:02:0602 And that's shown down here in a representation, this particular one done by Andrea Wills,
00:02:1014 who was a student with me.
00:02:1204 So, you can see that there's a normal primary axis with a head with two eyes.
00:02:1619 Then down here, there's a secondary axis, which is fused down at the tail, but it's
00:02:2116 a complete, proper, organized secondary axis.
00:02:2524 Now, the important thing was, since they were using marked issues, they could tell
00:02:3006 what is the contribution of the graft and the host.
00:02:3228 And so here's a. a representation of the section that was made by Hilde Mangold.
00:02:3702 Here's the primary axis, with the tissues that should be familiar to us by now:
00:02:4121 the nervous system, the notochord, and the muscle.
00:02:4510 And here's the secondary axis.
00:02:4626 And there's the pale graft.
00:02:4801 The pale graft invariably contributes just to the midline tissues.
00:02:5215 Here, it's contributing to the notochord and a little bit of the somites.
00:02:5707 Sometimes it would contribute to a bit of the spinal cord.
00:02:5926 But the consistent observation is that it contributes to the midline tissues,
00:03:0420 whereas the bulk of these tissues are recruited from the host: most of the nervous system,
00:03:0810 the muscle, and so on.
00:03:1202 So this graft really must be instructing the surroundings to make this second axis and
00:03:1620 organize it properly.
00:03:1805 Here's a modern equivalent of the experiment, also done by Andrea Wills, where she's
00:03:2216 labeled the donor embryo with a red stain.
00:03:2515 And you can see in this twin, where the two axes have arranged themselves conveniently
00:03:3013 next to each other.
00:03:3117 Here is the red-labelled graft.
00:03:3308 And you can see above it the induced neural tissue.
00:03:3613 So, it's not a phenomenon just of the 1920s, but can be done in the current times.
00:03:4221 Now, I'm really going to emphasize that this induction mechanism was not obvious.
00:03:4714 And in fact, Warren Lewis, who is not as famous as Spemann and Mangold, tried a similar experiment
00:03:5313 earlier than they did.
00:03:5504 But what he concluded -- largely because the embryos were not marked --
00:03:5915 was that the result he was getting was exclusively the result of self-differentiation of the grafted tissue.
00:04:0521 And he couldn't see any induction, because the tissues were not marked.
00:04:0922 And so the bottom line is that he'd. because of this assumption of self-differentiation,
00:04:1506 he missed on the phenomenon of induction.
00:04:1800 And so we remember Spemann and Mangold, and less so Lewis.
00:04:2201 Okay, let's go back to the whole embryo and remind ourselves what we're looking at.
00:04:2713 So, we know from molecular mapping that the organizer is gonna be the top of this
00:04:3323 when it loops around again.
00:04:3428 We're going through gastrulation and neurulation.
00:04:3804 And when we loop around again. here's the organizer up here.
00:04:4013 It's going inside the embryo and is opposed to this neural plate, and is able to
00:04:4615 instruct it to make the neural tissue.
00:04:4907 So again, if we look at this MRI movie, we can see that dorsal mesoderm moving up
00:04:5604 against this overlying neural plate.
00:04:5811 And during this process, where it's opposed to the neural plate, it's in the right place
00:05:0207 to be inducing the neural tissue.
00:05:0407 So, that's the normal organizer that's going up there and is thought to be signaling
00:05:1005 to induce the neural plate.
00:05:1113 Okay, so we're going to discuss this more.
00:05:1501 But we first need to understand how we get to that position.
00:05:1724 And I'm not going to go through this in detail, but I'm going to give a brief summary of the
00:05:2126 initial events that happen to set up the organizer.
00:05:2517 And it comes down largely to the activity of two different signaling pathways: the Nodal/Smad2 pathway
00:05:3221 and the Wnt/beta-catenin pathway.
00:05:3512 We don't need to know about these pathways in detail, but what we do know is the way
00:05:4018 they're turned on in the embryo.
00:05:4224 So initially, when the egg is laid, it's got this axis from animal to vegetal,
00:05:4822 from the pigmented to the yolky side.
00:05:5122 And subsequently it was found that there are a number of pre-localized components in that
00:05:5515 polarized egg.
00:05:5717 And I'm going to talk about this red mRNA, messenger RNA, that's pre-localized,
00:06:0300 called vegt, first described by Mary Lou King's group.
00:06:0612 And there's also, slightly less well-characterized, activators of the Wnt/beta-catenin pathway
00:06:1119 down here.
00:06:1303 So initially, this is cylindrically symmetrical about the animal-vegetal axis.
00:06:1618 And an important process here, as is widespread in embryology, is the symmetry breaking.
00:06:2118 So, you have to go from a cylinder to a bilaterally symmetrical egg.
00:06:2523 And this is achieved during normal development because the sperm is going to enter on one side.
00:06:3213 That makes this giant aster.
00:06:3504 So, these astral microtubules extend throughout the egg cytoplasm during the first cell cycle.
00:06:4115 And not only do they serve to pull the maternal pronucleus towards it, but they also
00:06:4603 serve to bias the way that microtubules polymerize. polymerize in the outside cortex,
00:06:5101 the outer ten-micron layer.
00:06:5313 So as a result of this bias, there's an oriented array of microtubules that go around the embryo,
00:06:5928 here.
00:07:0028 And they act as tracks for carriage via kinesins of some of these purple components.
00:07:0622 There's a selectivity.
00:07:0822 The purple components that activate the Wnt/beta-catenin pathway get smeared out along the
00:07:1413 entire dorsal side of the embryo, whereas the red do not do this.
00:07:1826 They're sort of passively released from the vegetal cortex and spread in a graded way
00:07:2417 through the egg.
00:07:2517 So, we now have a broken symmetry, where we have the red going from vegetal to animal
00:07:2926 and the Wnt/beta-catenin concentrated from dorsal to ventral.
00:07:3504 Now, these two molecules get together and turn on the. the Nodal genes.
00:07:4000 The Nodal genes are signaling proteins in the TGF-beta superfamily.
00:07:4307 And they're turned on in the margin.
00:07:4515 And in normal development, there's a cooperativity between the purple Wnt signal and, now,
00:07:5026 this yellow protein produced from the vegt RNA.
00:07:5409 So, they get together and turn on these Nodal genes.
00:07:5802 And they turn them on at a higher level on the dorsal side and the ventral side.
00:08:0216 But they do turn them on everywhere.
00:08:0500 And these Nodal genes induce mesoderm.
00:08:0710 So, the cells that are initially naive get told, in this marginal zone, to become
00:08:1310 the prospective mesoderm.
00:08:1504 But where this interaction is the strongest -- the strongest interaction of beta-catenin
00:08:1922 and the Nodal gene expression -- that converges on the promoters of organizer gene and
00:08:2512 turns them on, especially in this dorsal region here.
00:08:2822 So, the marginal zone. the mesoderm goes all the way across in the equator,
00:08:3224 but the organizer is special in that it's only turned on at the convergence, the strongest convergence
00:08:3702 of these signals.
00:08:3804 Okay, so we've discussed that.
00:08:4024 And let's just contrast that with what happens if this cortical rotation doesn't occur.
00:08:4701 And so you can see here what. there are various tricks to. to cause this to happen.
00:08:5024 One is to irradiate the vegetal side of the embryo with ultraviolet light.
00:08:5413 And that prevents the polymerization of microtubules.
00:08:5726 The alternative is to eliminate beta-catenin production by using a reagent that
00:09:0209 blocks beta-catenin production.
00:09:0324 We'll come back to that.
00:09:0611 Either way, what happens is that we get the release of the vegt and we get the
00:09:1014 graded vegt protein, which turns on Nodal, but, in the case of the lack of cortical rotation,
00:09:1626 then this purple signal stays down here.
00:09:2001 And so as a result, there is no synergy on this side.
00:09:2225 There's no overlap between the signals.
00:09:2522 And so this whole marginal zone behaves like the ventral marginal zone.
00:09:3008 You get a. a ventralized type of embryo with no organizer.
00:09:3506 Okay, so that symmetry-breaking event back here was important.
00:09:3902 But we're gonna use this trick in the next experiment, that proves that we need organizer signal
00:09:4327 to get the neural plate to be formed.
00:09:4905 Before we go into that, we're just gonna discuss a little bit more about the graded Nodal signaling.
00:09:5327 Because there. a quite widespread view in the field is that this graded Nodal signaling
00:09:5823 is important in setting out the pattern of the marginal zone.
00:10:0217 It seems quite obvious that if there's going to be a graded signal with more on this side
00:10:0620 than that side, it should be used for something.
00:10:0922 So, we're going to get a graded response, and the phospho-Smad2 is the intracellular effector,
00:10:1515 which is known to be distributed like this.
00:10:1804 There really is graded expression of Smad2 going from dorsal to ventral.
00:10:2226 And then this proceeds as a wave across the embryo.
00:10:2505 So, it seems perfectly reasonable to think that in normal development what ought to be
00:10:3002 happening is that that signal will tell the embryo to make different kinds of mesoderm.
00:10:3618 And indeed, that whole idea is supported by this experiment, where we can take,
00:10:4127 from the blastula stage, naive ectoderm from this so-called animal cap and put it in culture.
00:10:4822 By itself, it will self-differentiate into epidermis.
00:10:5125 But if we add a signal, and we can use either Nodal or more conveniently, Activin,
00:10:5619 another member of the TGF-beta superfamily.
00:10:5908 If one adds increasing doses of that Activin signal, the mesoderm-inducing signal,
00:11:0416 one can get caps that develop in a more ventral way, making mesenchyme, whereas as one
00:11:0923 doses in the signal, more and more dorsal tissues, like muscle and ultimately a lot of notochord.
00:11:1519 So, those kinds of experiments, the description of the graded expression, as well as
00:11:2107 this result, where one's reconstructing what may be going on in the embryo, suggest that
00:11:2502 that graded signal may cause pattern.
00:11:2616 But I'm going to argue that's not true.
00:11:2913 So, just to sum up, this normal pattern in the marginal zone -- from notochord through
00:11:3502 muscle, kidney, and blood -- could in principle be set up by that graded Nodal signaling.
00:11:4204 But this was explicitly tested in a series of experiments by Ron Stewart and John Gerhard,
00:11:4724 and other very similar experiments by Jonathan Slack.
00:11:5102 And so what I want to review briefly is this experiment that shows that there's not enough
00:11:5617 information imparted by that early signal to give substantial pattern in the marginal zone.
00:12:0228 Now, what they did. they wanted to assess the effectiveness of organizer grafts.
00:12:0815 And they did this at the late blastula stage.
00:12:1021 So, this is a really early stage, before gastrulation goes on and before there's much to. هناك.
00:12:1522 there certainly is pattern is the marginal zone later on.
00:12:1822 So, they took normal embryos and cut them in half, vertically, so they got two hemispheres.
00:12:2418 And they used that UV irradiation trick.
00:12:2607 So, they had a graft. they were able to graft these -- labeled grafts, of course --
00:12:3220 onto UV-irradiated hosts.
00:12:3320 So, they made this recombinant.
00:12:3611 In this case, the organizer is schematically illustrated in red.
00:12:4005 So, you've got a half organizer here.
00:12:4214 One of their first questions was, if you only put in a right organizer, do you only get
00:12:4612 a right embryo?
00:12:4714 And there are. the answer was no.
00:12:4822 You get a bilaterally symmetrical embryo.
00:12:5101 But also, in many cases this graft will give you a normal tadpole.
00:12:5517 So, you rescue development also, as shown by the lineage tracing experiment,
00:13:0009 from this ventralized half.
00:13:0215 But this is really the key one in my exper. in my view.
00:13:0615 So here, they've cut just 30 degrees off the dorsal midline axis, so they've cut the organizer
00:13:1228 into the right piece, and this piece has no organizer.
00:13:1607 Now, by the model I was discussing earlier, there should be some graded Activin signaling
00:13:2212 or graded. graded Nodal signaling in here that's inducing things like muscle.
00:13:2707 Well, we're gonna ask that question.
00:13:2819 We're gonna take this side and, again, fuse it to a naive ventralized piece,
00:13:3418 put them together, and ask what happens.
00:13:3806 And the result in most cases is there's absolutely no dorsal pattern in the embryo.
00:13:4411 And just to nail this home, I want to stress that.
00:13:4713 So, they're taking this ventralized piece and putting on this piece from a normal embryo
00:13:5305 that lacks just the organizer, but still has that dorsolateral prospective mesoderm
00:13:5714 that would make muscle if it were left alone.
00:14:0002 But in the context of this recombinant, you just get this completely ventralized embryo,
00:14:0518 as opposed to something that would make a little muscle and so on.
00:14:0819 So, this experiment shows I think quite well that the pattern that's induced by
00:14:1423 that graded Activin/Nodal signaling is not enough to have any permanent effect on this tissue.
00:14:2021 And that you actually need the organizer signaling.
00:14:2226 So, that sort of loss of organizer function proves that you need organizer signaling
00:14:2901 in normal development.
00:14:3219 Another is a sort of descriptive view, where we've looked at gene expression at different phases.
00:14:3715 And here's a case where we see two. expression of two different genes.
00:14:4016 This is noggin expressed in the organizer -- we'll come back to that -- and this
00:14:4422 prospective muscle gene, myod, that's expressed in a complementary way, in the non-organizer tissue.
00:14:5020 When it's first turned on, it's turned on fairly uniformly around the rest of the marginal zone.
00:14:5508 Later on, this expression turns off, and this gets enhanced by signaling from the organizer.
00:15:0022 But when it first turns on, it looks like the marginal zone is organized in a binary way.
00:15:0513 Now, this very rapidly changes.
00:15:0625 So, we see expression of genes such as this one, lhx1, that's high in the dorsal marginal zone
00:15:1127 and then graded off to the side.
00:15:1408 So, that's a later stage.
00:15:1524 We also see that with this split, where the blue and the brown genes are expressed
00:15:2010 in complementary domains at the end of the blastula stage, but very quickly become elaborated
00:15:2600 so that the brown gene, Wnt8, is restricted away from the organizer and just in the marginal zone.
00:15:3027 So, things are very dynamic.
00:15:3228 And one really has to look at this early stage to see this binary difference.
00:15:3624 By this stage, this tissue has already been instructed by the organizer to make muscle.
00:15:4125 But anyway, this descriptive experiment does support the idea that initially the marginal zone
00:15:4715 is split in a binary way and is not graded in this induction.
00:15:5017 So again, arguing that you need a signal from the organizer and it's not enough to have
00:15:5500 that graded Nodal signaling.
00:15:5824 This just reinforces that.
00:16:0106 And as that slides up, I'll say that we need. need now to figure out, what are these other signals?
00:16:0801 And at the time, there were a lot of experiments that were done using both cell biology,
00:16:1223 using secreted signals from cells and assaying them in embryos, and many of these signals do have
00:16:1716 important embryonic functions: fibroblast growth factors Nodals, Activins, and so on.
00:16:2318 But the dorsalizing molecules that are made from the organizer were not understood.
00:16:2816 So, how do we find those?
00:16:3027 And here I give much credit to Bill Smith, who's now a professor at UC Santa Barbara,
00:16:3418 who in the early '90s joined me and decided to use an expression cloning approach
00:16:4013 to try to find these molecules.
00:16:4122 And again, he used this trick of ventralizing embryos.
00:16:4513 But at the four-cell stage, he then took synthetic messenger RNAs made from a library.
00:16:5112 This library was a library of gastrula-specific RNAs in a plasmid that could be transcribed
00:16:5618 with this synthetic phage polymerase, SP6 polymerase, so that we could get a library of,
00:17:0204 in the first instance, 100,000 colonies, extract the DNA, and then transcribe
00:17:0820 that whole library of plasmids to make a complex mixture of synthetic RNA that we hoped mimicked
00:17:1315 what was in the embryo.
00:17:1524 Remarkably, that first injection of the synthetic RNA, when it was injected back at the four-cell stage,
00:17:2107 instead of these embryos looking like this -- complete belly pieces as Spemann would
00:17:2525 have called them -- they looked more like this.
00:17:2723 They had some tail structures, some muscle, and spinal cord.
00:17:3107 So, that RNA conferred a morphological rescue.
00:17:3421 At that point, we knew there was an active ingredient in the library, and it was
00:17:3909 just a question of sub-selection, where we would split the library into smaller and smaller pools,
00:17:4400 assaying those pools as we go along, and ask, is there a pool in there that
00:17:4908 confers this ability to dorsalize embryos?
00:17:5219 And sure enough, we. he did this a couple of times.
00:17:5502 The first time, he isolated a Wnt signal, which I won't discuss but is thought to mimic
00:17:5907 that early Wnt signal in dorsalizing the embryos.
00:18:0128 But for the purposes of this presentation, the second one he isolated was really exciting
00:18:0623 because it was completely new.
00:18:0824 And as a single RNA, as you can see in this picture, with increasing dose of the gene
00:18:1324 we called noggin RNA, you get this progressive rescue of structures to the normal state.
00:18:1917 And then when one overdoses the embryo, ultimately you end up with these little noggins,
00:18:2420 these little heads alone.
00:18:2520 So, that. that single RNA is able to transform, from the four-cell stage, a ventralized embryo.
00:18:3023 And if it's put in at enough dose, you get just a big head.
00:18:3604 This has been a very useful assay to isolate a number of other embryological activities,
00:18:4006 but that's the one I want to concentrate on, noggin.
00:18:4310 And so this is an in situ hybridization where we're looking at the messenger RNA
00:18:4810 that's expressed from the noggin gene in early development.
00:18:5100 And so let's look at this stage.
00:18:5319 This is a late blastula.
00:18:5504 Noggin has already turned on.
00:18:5613 And as you can see, it's turned on in just one side of the embryo.
00:18:5909 And we know this is the dorsal side.
00:19:0109 So, this gene is expressed. it not only has the right activity in these messenger
00:19:0614 RNA injections, but it's also expressed in the right place -- here's a vegetal pole view,
00:19:1025 remarkably it's a 60-degree sector, just the same as the sector that Ron Stewart identified
00:19:1622 in his activity assay -- and then in the gastrula stage it continues to be expressed
00:19:2408 in the dorsal marginal zone, in this involuting dorsal mesoderm that is lying just underneath
00:19:2915 the neural plate, and in the right place to induce the neural plate.
00:19:3218 Now, here's a neural. neurula stage where it continues to be expressed in the head,
00:19:3626 mesoderm, and notochord, again, in the right place to continue inducing the neural plate.
00:19:4304 So, the activity is promising, the extra expression is promising, but could we show that it
00:19:4817 had the right properties?
00:19:4924 So, we initially used a protein that we made in CHO cells that Teresa Lamb had transformed
00:19:5523 with noggin plasmids.
00:19:5624 But later in the collaboration with Regeneron Pharmaceuticals, they made a human noggin,
00:20:0210 particularly, Aris Economides, and gave us that recombinant human noggin for our experiments.
00:20:0706 So we were able to ask, now, can noggin protein mimic what we know are the embryological effects
00:20:1317 of grafting this tissue?
00:20:1705 So, again, this is the normal case, where noggin is expressed in this red dorsal mesoderm,
00:20:2218 and potentially instructing this overlying ectoderm to become neural plate.
00:20:2606 But how do we assay that activity?
00:20:2809 Well, again, we turned to our animal cap assay.
00:20:3021 And actually, we can turn to that assay in the gastrula stage, where the sensitivity
00:20:3616 of these cells up here has changed, and they're no longer responsive to the Activin/Nodal signal.
00:20:4402 But we know from recombination experiments that if we graft an organizer onto here
00:20:4903 neural induction will occur.
00:20:5111 So now we can replace the graft of organizer by soaking this tissue in noggin protein.
00:20:5720 And so this is a schematic, which we can do in the late blastula or the gastrula,
00:21:0124 where we take this prospective ectoderm off into culture.
00:21:0503 Normally, just makes a hollow ball of epidermis when left alone.
00:21:0825 As I mentioned before, with. with Activin or Nodal, you get a complex induction of
00:21:1504 dorsal mesodermal cell types.
00:21:1717 And those in turn can secondarily induce neural tissue.
00:21:1926 But the induction is not direct.
00:21:2120 The important thing for our purposes is that, when we treat this just with recombinant noggin,
00:21:2707 we get a clean neural induction.
00:21:2820 There's a little epidermis that's on the outside and an epithelial layer that's not so responsive,
00:21:3405 but all of the underlying cells, here, are trans. transformed into neural cells.
00:21:3809 So, we get a cleaner. clean neural tissue, and that can't be induced by any mesoderm
00:21:4300 because there's no mesoderm in this explant.
00:21:4611 We can also do this as at a time when the mesoderm can no longer be induced.
00:21:5004 So, if we do this at the gastrula stage instead of the late blastula stage, this experiment
00:21:5511 wouldn't work.
00:21:5611 Activin would have no effect.
00:21:5714 And yet noggin can still induce neural tissue.
00:22:0002 So this, then, really identified noggin as an authentic neural inducer, that it's expressed
00:22:0421 in the right place and time, and has the right activity to be doing the job in the normal embryo.
00:22:1117 Here are some pictures of the kind of results that we get.
00:22:1417 These are the works of. these are done by Anne Knecht in the lab.
00:22:1722 And so, here we have a molecular assay for neural tissue.
00:22:2022 This is a gene that's expressed throughout the nervous system.
00:22:2413 And here are some of these explants, the explants that lack noggin, and they don't stain
00:22:2922 for this gene.
00:22:3022 But the parallel explants that were soaked in noggin protein, as you can see, are robustly
00:22:3514 induced to make this marker gene, and so we can say they're neural.
00:22:3805 And that contrasts. again, I'll draw the contrast with the Activin mesoderm inducer.
00:22:4413 Here, we're looking down on the top of the embryo with the muscle and notochord in the middle.
00:22:4819 These are mesodermal structures that we've lit up with this collagen probe.
00:22:5226 If we take explants just like these ones, but treat them with Activin at the late blastula stage,
00:22:5714 we get lots of this mesoderm induced.
00:22:5909 But down here, we see that noggin induces no mesoderm.
00:23:0220 So, we do get neural tissue in the absence of mesoderm, and hence a clean neural induction.
00:23:0804 Just as an interesting side point -- I won't be discussing this much today -- that we
00:23:1315 also have to account for production of the entire neural plate from brain to spinal cord.
00:23:1811 So, what kind of tissue does noggin induce?
00:23:2111 Here we can use regional markers like this cement gland, this very anterior marker,
00:23:2612 or this forebrain-midbrain marker, otx2, and then this engrailed-2 is expressed just
00:23:3123 at the border of the hindbrain.
00:23:3326 And the noggin-treated explants will make these very anterior marker genes.
00:23:3904 they'll turn them on, but they don't turn on the more posterior ones.
00:23:4304 And so noggin, exclusively in this explant situation, induces anterior brain-like tissue.
00:23:5114 So, we have a molecule that works very well, but of course we then had to figure out how it works.
00:23:5820 And so, for this experiment, we for a long time labored under the delusion that
00:24:0220 we may have invented a new kind of signal transducer.
00:24:0600 At the time, it wasn't really appreciated that development gets by with a remarkably
00:24:0914 limited number of pathways.
00:24:1125 And so, here, what eventually turned out, with some very useful information from
00:24:1627 Chip Ferguson's lab, it was suggested that it may be impacting the BMP pathway.
00:24:2201 And Lyle Zimmerman was able to show that, because we had all these reagents in the lab
00:24:2523 at the. at the time.
00:24:2725 And the way that noggin actually works is not by activating any new signal transduction pathway,
00:24:3304 but rather by interfering with the BMP signaling pathway.
00:24:3611 Normally, BMP binds to its two receptors, brings them together, and that has the consequence
00:24:4117 of ventralizing the embryo.
00:24:4325 In this case, when noggin is present, it binds tightly to BMP, prevents this interaction,
00:24:5009 and then by default, instead of being ventralized, the embryo is dorsalized.
00:24:5513 So I'll stress that, that it's the absence of this BMP signal that is instructive to the embryo
00:25:0104 and allows the embryonic structures to make dorsal structures rather than BMP-induced
00:25:0712 ventral structures.
00:25:0901 And satisfyingly, this crystal structure from Jay Groppe shows that noggin, as a dimer,
00:25:1423 sort of embraces the dimer of BMP.
00:25:1626 So, it's not surprising that it, as Lyle Zimmerman showed, prevents the BMP from binding their receptors.
00:25:2606 It's a very high-affinity reaction, as was shown here by this competition experiment.
00:25:2913 And this was done again by Lyle Zimmerman.
00:25:3126 Here took iodinated BMP4 and was able to bind it to a chimeric human noggin, which has an
00:25:3926 immunoglobulin tail which makes it easy to precipitate.
00:25:4303 And so if one simply mixes these together, you get a very active binding and precipitation.
00:25:4916 But by mixing in different doses of different kinds of other TGF-betas, we could work out
00:25:5510 the affinity of this interaction.
00:25:5708 And so, notably, if we take BMP4, the red one, and plot how that interferes
00:26:0214 with binding of iodinated BMP4, we get this nice curve.
00:26:0714 And if we plot the half-maximal inhibition, it comes out that the interaction there is.
00:26:1202 it has a remarkably tight Kd of about 20 picomolar.
00:26:1626 Other BMPs, like BMP7, in blue here, have a lower affinity.
00:26:2305 And then yet other TGF-beta family members, like TGF-beta itself, have no measurable affinity.
00:26:2820 So, there is a variation in affinity, but very tight affinity for the BMP2 and -4 class.
00:26:3500 So, we come up with this general model that in normal development you set up the mesoderm
00:26:4026 with a special dorsal territory, this naive and fairly uniform ventral-lateral territory,
00:26:4626 and the rest of the patterning is mediated during gastrulation by dorsalizing signals
00:26:5128 like noggin that come from the dorsal-marginal zone, instruct the overlying epidermis
00:26:5713 to instead become nervous system, and instruct this ventral mesoderm to become things like muscle.
00:27:0222 So, is that it?
00:27:0420 Really, we've done this by add-back, but what about loss of function?
00:27:0900 And in the interim, a large number of other antagonists were discovered.
00:27:1213 And a lot of these were discovered by Eddy De Robertis' lab, so chordin and cerberus.
00:27:1916 Noggin, we discovered, Bill Smith discovered, as well as this Nodal-3 molecule.
00:27:2422 And follistatin had already been known about, but its activity as a dorsalizing molecule
00:27:2928 was worked out by Ali Brivanlou in Doug Melton's lab.
00:27:3302 So, looking at all these, they're all expressed in the organizer, and they all have some similar
00:27:3911 anti-BMP activities.
00:27:4113 You can see that they turn on at different times.
00:27:4316 This is the early stage, so some are turned on very early.
00:27:4718 And then some are turned on in slightly different territories.
00:27:5004 And perhaps that's important in how they work in detail, but so far, as far as we can tell,
00:27:5424 they all work essentially the same way.
00:27:5617 But there are a lot of them, and they probably have overlapping activity.
00:28:0108 And so if we try to knock down their activity, do we. can we knock down one and get a result,
00:28:0517 or do we have to knock down many?
00:28:0824 To do this experiment, we use morpholino oligonucleotides.
00:28:1114 These are synthetic, uncharged, and very stable oligonucleotides that can hybridize
00:28:1526 to the messenger RNA and interfere with translation, in this case.
00:28:2000 So, we can specifically use the information from base pairing to specifically knock down
00:28:2602 these individual RNAs.
00:28:2720 So, Mustafa Khokha, when he was in the lab, did this experiment using mixtures of morpholinos
00:28:3227 against follistatin, chordin, and noggin.
00:28:3517 And just as a side note, to make this simpler, we did it in the related species to Xenopus laevis,
00:28:4020 Xenopus tropicalis, which now had a sequenced genome, and so we could identify
00:28:4514 and design these oligonucleotides easily to target just single genes rather than two genes
00:28:5003 in the paleotetraploid, Xenopus laevis, genome.
00:28:5419 So, we can inject these morpholinos and then ask what happens.
00:28:5925 And we're going to use, for example, in the neurula stage, this neural marker, which at
00:29:0323 the mid-neurula stage has this nice ability to light up the neural plate.
00:29:1008 Because of worries about specificity of these reagents, which always become toxic if you
00:29:1404 put enough of them in, we do a specificity assay of rescuing.
00:29:1716 So, by cloning the pufferfish noggin, we could use that different sequence to put back BMP-antagonist activity,
00:29:2417 as we'll find out, and rescue the whole process.
00:29:2728 So, these are the kinds of results.
00:29:3009 So, we're going to do single, double, and triple knockdowns.
00:29:3410 And the results are pretty simple.
00:29:3527 When comparing the uninjected to the morpholino-injected, when we knocked down noggin we see no effect.
00:29:4203 Essentially no effect with follistatin.
00:29:4402 Some mild effect, as reported by De Robertis' group, for chordin.
00:29:4716 But then, when we knocked down two -- follistatin/noggin, chordin/noggin, chordin/follistatin --
00:29:5220 we see a more extreme effect.
00:29:5324 There's a smaller neural plate.
00:29:5511 Well, when we knocked down all three, there's a spectacular result, where now, instead of
00:29:5919 making the neural plate, the neural plate is eliminate. eliminated.
00:30:0328 Not only is the neural plate eliminated, but the underlying muscle is almost completely gone.
00:30:0908 And by this hedgehog control, the notochord and the floor plate are also gone.
00:30:1428 So, this is important to rescue.
00:30:1627 We can rescue it with this mixture of morpholinos, rescuing it with the pufferfish noggin.
00:30:2303 And as you see, we get back all of these tissues, demonstrating specificity.
00:30:2817 We can also rescue it by knocking down additional BMPs.
00:30:3206 So, instead of this horrendously high mixture of morpholinos, we're putting in
00:30:3614 even more morpholinos, but also knocking down BMPs.
00:30:3925 And again, you can see that rescue.
00:30:4102 So, we're pretty satisfied that this is a specific manipulation.
00:30:4421 So, knocking down the BMP antagonists eliminates the neural plate.
00:30:4921 You need the antagonists to make the neural plate.
00:30:5327 As we would expect, as you can see on the right of this picture, the loss of those
00:30:5814 dorsal structures is accompanied by a gain in ventrolateral structures.
00:31:0302 So here, for instance, let's. let's look at msx1.
00:31:0522 It's expressed just in the flank.
00:31:0802 But in this manipulated embryo, there's just a narrow stripe left of nonexpressing tissue.
00:31:1306 So, all these ventral tissues are expanded.
00:31:1708 We can also ask, when does this dorsal identity fail?
00:31:2010 When we knock down those antagonists, we clearly lose dorsal structures, but at what step does
00:31:2417 this happen?
00:31:2517 And of course, we would predict that it should fail at the time that normal genes are expressed,
00:31:2906 at the late blastula stage.
00:31:3128 We can start to look at that, and contrast the situation where we interfere with antagonist function
00:31:3802 in normal development, with what happens when we ventralize the embryo from
00:31:4212 the get-go, either with UV light or by depleting beta-catenin, actually also with a beta-catenin
00:31:4727 specific morpholino.
00:31:4902 So, in that case, we lose the beta-catenin purple signal, and we get just this ventralized embryo.
00:31:5611 Okay.
00:31:5711 So, in looking at those, we can see that in the. in the. in the morpholino-knockdown cases,
00:32:0515 where we've knocked down follistatin, chordin, and noggin, we have normal mesoderm,
00:32:0905 as marked by this brachyury gene, but in the case where we look for dorsal identity
00:32:1521 with the goosecoid marker -- here's the control, here's the follistatin/chordin/noggin knockdown --
00:32:2013 there's still dorsal identity.
00:32:2322 Whereas if we contrast that with the beta-catenin knockdown, where we've knocked down
00:32:2705 the early dorsal signal, then of course we never get a dorsal identity.
00:32:3023 So, there's a contrast here, showing that in the absence of the antagonists
00:32:3528 we still get a dorsal identity.
00:32:3713 But then that dorsal identity fails to execute. execute its function.
00:32:4404 And indeed, we can also look at these embryos to ask what happens to BMP signaling.
00:32:4818 And in particular, we can use this useful mark, vent2, because that's normally expressed
00:32:5313 everywhere except the organizer.
00:32:5515 And we also know it's a direct target of BMP signaling.
00:32:5921 So again, when we knock down the follistatin, chordin, and noggin, we see that that gap
00:33:0323 is filled in.
00:33:0508 So in other words, in the absence of the antagonists, there's a sign pretty early on of excess BMP signaling,
00:33:1100 which is going to mess up dorsal developments and lead to a ventralized embryo.
00:33:1519 And again, we get the similar effect, as we would expect, if we eliminate the organizer
00:33:2000 completely with beta-catenin.
00:33:2104 The same result is found with this early muscle marker, which.
00:33:2528 muscle development used to be thought to be development mostly on the graded signal
00:33:2911 from Nodal.
00:33:3011 But you can see here, clearly, that we need that BMP antagonist in order to amplify the
00:33:3506 expression of this muscle determinant in the early embryo.
00:33:3928 So overall, we conclude now that this pathway, of knockdown of BMP activity by these BMP antagonists,
00:33:4726 by a cocktail of BMP antagonists, is crucial to get dorsal development,
00:33:5224 and in order to get neural induction to occur.
00:33:5508 We can show that these molecules by themselves, as protein, induce neural tissue.
00:33:5826 We can show that the combination is essential.
00:34:0127 And they are expressed in the right time and the right place to be ex. executing this function.
00:34:0704 So all in all, it's a comprehensive statement that these are crucial for neural induction
00:34:1303 and dorsal development.
00:34:1513 We can add on the additional observation from the end, that even in the absence of.
00:34:2200 well, in the absence of these antagonists, the early events go by perfectly normal. normally,
00:34:2725 and we get dorsal specification in the marginal zone.
00:34:3108 But in the absence of the antagonists, that organizer can no longer execute its function.
00:34:3621 So all in all, we can conclude then that BMP antagonists are essential for
00:34:4202 the Spemann organizer phenomenon.
00:34:4327 Thank you.

  • Part 1: Early Frog Development: How to Make a Tadpole


شاهد الفيديو: لن تصدق ماذا وجدوا داخل بطن التمساح عندما امسكوا به. معجزة هزت الكون ورسالة من الله!! (شهر اكتوبر 2022).