معلومة

ما هي الشروط التي يجب أن أستخدمها لتلوين الجل الأحمر؟

ما هي الشروط التي يجب أن أستخدمها لتلوين الجل الأحمر؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما هي ظروف التصبغ المثلى عند استخدام Gel Red؟ حتى الآن ، منذ أن بدأنا في استخدامه ، كانت المواد الهلامية التي يتم تشغيلها في مختبرنا ذات جودة رديئة للغاية. العصابات غير واضحة للغاية وغالبًا ما يتعذر تمييزها. لقد جربنا كلاً من التلوين المسبق واللاحق ، جنبًا إلى جنب مع تركيزات متفاوتة من الجل الأحمر.

أي نصيحة حول كيفية حل هذه المشكلة؟


لقد نجحت مع 1.5 ٪ من المواد الهلامية agarose في TBE الملون مسبقًا بـ gelred. أستخدم محلول مخزون 10000x من gelred المباع بواسطة http://biotium.com. أتخيل الجل على جهاز ترانسلومينيتور للأشعة فوق البنفسجية قديم.

بعد ذوبان الاغاروز في الحجم المناسب من TBE في الميكروويف ، تركته يبرد إلى حوالي 50 درجة مئوية (يمكنني لمس القارورة بظهر يدي دون انتزاعها بعيدًا) ثم أضف الحجم المناسب من المخزون الهلامي.

جل الاغاروز 30 مل 1.5٪:

  1. مزيج 0.45 جم الاغاروز + 30 مل 1x TBE
  2. الميكروويف حتى يغلي محلول الاغاروز ويصفى
  3. دعها تبرد إلى حوالي 50 درجة مئوية
  4. إضافة 3 ميكرولتر هلام
  5. حرك الخليط
  6. يلقي الجل (لا تنس المشط)

هذا عادة يعمل بالنسبة لي. أقوم بتشغيل الجل في مخزن مؤقت 1x TBE عند حوالي 120 فولت.


لا أعتقد أنه يجب عليك تغيير تركيز GelRed. جاء منجم مع تعليمات للتركيز الدقيق وكيفية التخفيف. اختياريًا ، يمكن إضافة الملح ، وهو ما فعلته ، وقد نجح معي.

لقد فعلت هذا فقط مع تلطيخ لاحق. 1-2.5٪ [اغروس) مع TAE. تم استخدام حل 10،000x من أبحاث Phenix. يجب الاحتفاظ بمخزون gelred ومحلول العمل في الظلام. أفترض أن لديك ترانسيلوميتور ومرشحات (اختيارية) للمرئية بالرغم من ذلك. يحتوي GelRed على خصائص [الطول الموجي] للإثارة والانبعاث مثل EtBr ، لذلك يجب أن يعمل جهاز الإنارة والمرشح القياسي دون أي تغييرات. لن يكون مرئيًا بالعين المجردة.

ومع ذلك ، هناك الكثير من الأشياء التي يمكن أن تسوء في صب الجل ، والرحلان الكهربائي ، والتلطيخ ، والتخيل. إذا كانت العصابات مرئية ولكن ضبابية فقط كنت أظن أن هناك مشكلة أكبر في إنشاء الهلام أو الرحلان الكهربائي. تأكد من أن الاغاروز نظيف تمامًا ومبرد قليلًا قبل الصب. بخلاف ذلك ، يعد الجهد الكهربائي أحد الأشياء الرئيسية التي لاحظتها والتي يمكن أن يكون لها تأثيرات كبيرة على كيفية ظهور العصابات الحادة أو الباهتة. يمكنك تجربة أنواع مختلفة من المواد الهلامية وفولتية مختلفة. هناك صيغ يمكن أن تساعدك في تقدير أفضل قيمة لكل منها.


جل البروتين اللوميتين بخطوة واحدة ، البيوتيوم

Avantor & reg ، إحدى شركات Fortune 500 ، هي المزود العالمي الرائد للمنتجات والخدمات ذات المهام الحرجة للعملاء في مجال الأدوية الحيوية والرعاية الصحية والتعليم والحكومة والتقنيات المتقدمة وصناعات المواد التطبيقية. تُستخدم محفظتنا في كل مرحلة تقريبًا من مراحل أنشطة البحث والتطوير والإنتاج الأكثر أهمية في الصناعات التي نخدمها. تأتي إحدى أعظم نقاط قوتنا من امتلاك بنية تحتية عالمية ذات موقع استراتيجي لدعم احتياجات عملائنا. تمكننا بصمتنا العالمية من خدمة أكثر من 225000 موقع للعملاء وتمنحنا وصولاً مكثفًا إلى مختبرات البحث والعلماء في أكثر من 180 دولة. نضع العلم في حركة لخلق عالم أفضل. للحصول على معلومات ، قم بزيارة www.avantorsciences.com وتجدنا على LinkedIn و Twitter و Facebook.

& نسخ 2021 VWR International، LLC. كل الحقوق محفوظة.
& نسخ 2021 FORTUNE Media IP Limited جميع الحقوق محفوظة. مستخدمة بموجب ترخيص.

لا يدعم موقع الويب هذا إصدار Internet Explorer الخاص بك. نوصيك بالترقية إلى Internet Explorer 11 أو مستعرض آخر مدعوم ، والتحقق لمعرفة ما إذا كنت تستخدم IE11 في وضع عرض التوافق.


تقنية الجل الكهربية: الخطوات والتطبيق

الرحلان الكهربائي للهلام هو أحد أنواع تقنيات الرحلان الكهربائي ، ويجب تسليط الضوء على الإجراء الخاص به في هذه الوحدة. يتم استخدام المواد والخطوات والخطوات التالية في تقنية الفصل الكهربائي للهلام:

انقر هنا لشراء دفاتر علم الأحياء الدقيقة

  • يستخدم Agarose gel لأداء الرحلان الكهربائي للهلام في مختبر الأحياء الدقيقة أو البيولوجيا الجزيئية. من الجدير بالذكر أن مسحوق أجار المستخدم في الرحلان الكهربائي للهلام يختلف عن مسحوق أجار المسحوق المستخدم في تحضير لوحات وسائط الثقافة الروتينية للزراعة الميكروبية. في الرحلان الكهربائي للهلام ، الاغاروزهلام يستخدم المسحوق لتحضير الجل. يتم تحضير هلام الاغاروز بخلط كمية معينة من مسحوق الاغاروز (على سبيل المثال 1.5٪) في محلول منظم أو ماء منزوع الأيونات. يمكن تصنيع هلام الاغاروز بتركيزات مختلفة من الاغاروز تتراوح بين 0.6٪ & # 8211 3٪ وهذا يعتمد عادة على حجم شظايا الحمض النووي التي يرغب الباحث في حلها أو فصلها. يتم فصل الأجزاء الأكبر من الأحماض النووية أو حلها بشكل أفضل في مادة هلامية مع نسبة أقل من الاغاروز بينما يتم فصل شظايا الحمض النووي الأصغر بشكل أفضل في هلام مع نسبة أعلى من الاغاروز. لتحضير 1.5٪ من هلام الاغاروز على سبيل المثال ، قم بقياس 1.5 جرام من مسحوق الاغاروز وقم بإذابه في محلول 100 مل أو ماء منزوع الأيونات في دورق مخروطي. قلب الخليط بشكل صحيح لتفتيت جميع الكتل وتسخين الخليط عن طريق الغليان عند درجة حرارة معينة (على سبيل المثال 1-2 دقيقة) في فرن الميكروويف حتى يصبح المحلول صافياً مثل الماء. يمكن أيضًا استخدام شعلة موقد بنسن لتسخين محلول الاغاروز في الأماكن التي لا يتوفر فيها فرن الميكروويف. يجب تسخين محلول هلام الاغاروز حتى يتم تكوين محلول متجانس. بعد التسخين ، يجب ترك الهلام المتجانس ليبرد إلى حوالي 60 درجة مئوية قبل صب الهلام على جهاز أو لوح صب الهلام. Agarose ، مسحوق أبيض ومحلول عازلة هما المكونان الأساسيان لهلام agarose وكلاهما يحتاج إلى التسخين بدرجة كافية لصنع الجل المطلوب لتشغيل تقنية الترحيل الكهربائي للهلام.
  • مشط ذو أسنان (شكل 1) لتشكيل الآبار المعروفة باسم آبار العينات في هلام الاغاروز. وبالتالي ، يجب وضع المشط المسنن في جهاز أو صينية صب الهلام قبل صب الجل بحيث يتم تشكيل الآبار بشكل مناسب. تتم إزالة المشط المسنن قبل إدخال عينات الحمض النووي في الآبار. عادة ما يعتمد عدد الآبار أو الثقوب المتكونة على عدد العينات أو الكائنات الحية المراد تحليلها ، وبالتالي يختلف نوع المشط المسنن المستخدم في تجربة هلام الاغاروز. يتم تلقيح عينات تحليل الرحلان الكهربي للهلام بشكل فردي أو توزيعها في كل من الآبار المسننة باستخدام الماصة المجهرية (الشكل 2). أطراف ماصة متعددة (الشكل 3) موجودة أيضًا لتحليلات متعددة أثناء تجارب البيولوجيا الجزيئية.
  • الاستغناء عن المحلول المتجانس المبرد في جهاز أو صينية صب الهلام (الشكل 4). يجب أن يتم الصب ببطء ، ويجب إزالة جميع فقاعات الهواء المتكونة أثناء الصب باستخدام ماصة يمكن التخلص منها. يمكن أن تؤثر فقاعات الهواء بشكل عام على شكل الآبار إذا سمح لها بالاستقرار حول المشط.
شكل 1. رسم توضيحي لأمشاط مسننة بأحجام مختلفة تستخدم في صنع عينات الآبار في هلام الاغاروز. توجد الأمشاط المسننة بأحجام مختلفة ، ويعتمد النوع المستخدم بشكل أساسي على عدد العينات التي يرغب الباحث في تشغيلها. يعتبر المشط المسنن مهمًا في الرحلان الكهربائي للهلام لأنه يخلق تجاويف تعرف عمومًا بآبار في هلام الاغاروز وفي هذه الآبار يتم سحب عينات الحمض النووي إليها. من الجدير بالذكر أنه يتم إدخال المشط المسنن في غرفة الهلام الكهربائي قبل سكب هلام الاغاروز المنصهر وتركه للهلام. الشكل 2. الماصات ذات الرأس الواحد. الشكل 3. الماصة الدقيقة متعددة الأطراف مع حاوية طرف لأطراف الماصة. الشكل 4. جهاز صب جل. يتم تشكيل لوح هلام الاغاروز في جهاز أو صينية صب الهلام ، ثم يتم نقله إلى خزان الرحلان الكهربائي لمزيد من التحليل. من الأهمية بمكان التأكد من وضع جهاز أو صينية صب الهلام على سطح أفقي قبل صب الجل بحيث يكون الجل المتشكل موحدًا. يجب إدخال المشط المسنن قبل صب هلام الاغاروز المنصهر في جهاز الصب الهلامي.
  • يُسمح بالجيل المصبوب في جهاز الصب الهلامي لبضع دقائق (على سبيل المثال 20 دقيقة) حتى يتشكل أو يتشكل هلام [اغروس) جل بلاطة. جهاز الصب الهلامي يعطي الهلام المصبوب شكله الأفقي المميز المطلوب لتقنية الاغاروز الكهربائي للهلام. بمجرد تبريده وتبليره ، يصبح الجل جاهزًا الآن لتجربة الاغاروز الكهربائي للهلام. ثم يتم إدخاله في المصفوفة أو الحجرة الكهربية التي يضاف إليها أيضًا محلول مؤقت. في الممارسة العملية ، يتم غمر لوح هلام الاغاروز في المحلول المخزن في الخزان الكهربي.

امص العينات الفردية في آبار العينة التي تم إنشاؤها في هلام الاغاروز بواسطة المشط (الشكل 5). تأكد من تغيير طرف الماصة لكل عينة ماصة. يتم إضافة جزء أو سلم DNA (بحجم معروف أو قياسي) في أحد الآبار (عادة البئر الأول) ويستخدم السلم لمقارنة أجزاء الحمض النووي المنفصلة (بأحجام غير معروفة). في بعض تجارب هلام الاغاروز ، يضاف محلول بروميد الإيثيديوم (EtBr) جنبًا إلى جنب مع محلول الحمض النووي المراد تحليله. ومع ذلك ، يضاف EtBr عادة إلى الجل المحضر بعد التبريد وقبل السكب في خزان الرحلان الكهربائي للهلام.

يعمل EtBr كعامل تلطيخ كيميائي يساعد على تصور نطاقات أو شظايا الحمض النووي بعد تجربة الرحلان الكهربائي. (EtBr هي صبغة ترتبط بالحمض النووي وتحدد بوضوح موضع شظايا الحمض النووي الفردية). في بعض تجارب هلام الاغاروز ، لا تتم إضافة صبغة التلوين (في هذه الحالة EtBr) جنبًا إلى جنب مع محلول الحمض النووي ليتم عزله بالكهرباء. ولكن يتم إضافته قبل أو بعد تحليل الرحلان الكهربائي لأن وظيفته الرئيسية هي المساعدة في تصور شظايا الحمض النووي. ملحوظة: EtBr مسبب للطفرات أو مسرطن بطبيعته ، وبالتالي يجب التعامل معه بحذر. SYBR الأخضر ، صبغة هلام الحمض النووي هي عامل تلطيخ آخر يمكن استخدامه في تقنية الرحلان الكهربائي للهلام لتصور شظايا الحمض النووي المنفصلة. ومع ذلك ، فإن محلول EtBr هو الصبغة الأكثر استخدامًا في تجارب الرحلان الكهربي للهلام ، ومن الأهمية بمكان أن يرتدي الباحث قفازات عند التعامل مع EtBr نظرًا لأن الصبغة مطفرة ويمكن أن يمتصها الجلد بسهولة لتسبب مشاكل صحية في الفرد.

الشكل 5. رسم توضيحي لتحميل العينات على الآبار التي تم إنشاؤها على هلام الاغاروز. عند تحميل العينات ، يجب إمساك الماصة بزاوية لتجنب ثقب الآبار. سوف تتسبب الآبار المثقوبة في تسرب عينات الحمض النووي إلى المخزن المؤقت و / أو الخزان الكهربائي وهذا سيؤدي إلى تلوث عملية الفصل الكهربائي.
  • يتم تمرير تيار كهربائي (على سبيل المثال 100 فولت) عبر الهلام ويسمح للعملية بالعمل في الوقت المناسب. الحمض النووي ، جزيء سالب الشحنة ينتقل من القطب السالب الشحنة (الكاثود) نحو القطب الموجب (القطب الموجب). ينتقل الحمض النووي عبر مصفوفة الهلام ، وتتحرك الجزيئات الأصغر بشكل أسرع من الجزيئات الأكبر. يتم إيقاف الشحنة أو التيار الكهربائي بمجرد اكتمال عملية الفصل الكهربائي.
  • يتم تصوير شظايا الحمض النووي المنفصلة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وتصويرها بعد نقع لوح الهلام في EtBr أو أي صبغة تلطيخ أخرى.

ألبرتس ب ، براي د ، لويس جيه ، راف إم ، روبرتس ك ، واتسون جيه دي (2002). البيولوجيا الجزيئية للخلية. الطبعة الرابعة. نيويورك ، جارلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية.

كوبر جي إم و هاوسمان ري (2004). الخلية: نهج جزيئي. الطبعة الثالثة. الصحافة ASM.

دايل ج (2003). علم الوراثة الجزيئية للبكتيريا. جيريمي دبليو ديل وسيمون بارك (الطبعة الرابعة). John Wiley & amp Sons Ltd ، ويست ساسكس ، المملكة المتحدة. ص. 312-313.

لويس آر (2004). علم الوراثة البشرية: المفاهيم والتطبيقات. الطبعة السادسة. ماكجرو هيل للنشر ، الولايات المتحدة الأمريكية.

نوسباوم ورودريك آر ماكينز وهنتنغتون ف.ويلارد (2001). علم الوراثة في الطب. فيلادلفيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. ناشرو سوندرز.

سامبروك ، ج. ، راسل ، د. (2001). الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل ، الطبعة الثالثة. مطبعة كولد سبرينج هاربور ، نيويورك.

تمارين روبرت إتش (2002). مبادئ علم الوراثة. الطبعة السابعة. شركة تاتا ماكجرو هيل للنشر المحدودة ، دلهي.

تويمان آر إم (1998). علم الأحياء الجزيئي المتقدم: مرجع موجز. ناشرو علم الأحياء. أكسفورد ، المملكة المتحدة.


كيف تقارن صبغة الجل ببقع الخشب التقليدية؟

  • يتم تطبيق طلاء الجل على سطح الخشب ولكن لا يتم فركه مثل البقع التقليدية ، حيث يكون التطبيق أكثر قابلية للمقارنة مع الطلاء على طبقات رقيقة متعددة.
  • وصمة عار الجل سميكة مثل الحلوى وليست سائلة.
  • في حين أن صبغة الهلام تصبح سميكة وتجلس على سطح الخشب ، وجدت أنه لا يزال بإمكانك رؤية حبيبات الخشب الطبيعية الموجودة تحتها والشعور بها ، على عكس الطلاء. مع خزانات البلوط ، كانت الحبوب واضحة جدًا بعد تلطيخها.
  • لن تتطلب صبغة الجل أن تقوم برمل المنتج حتى يصل إلى تشطيب الخشب الخام. يمكن تطبيقه على القطع المصقولة بشكل خفيف فقط أيضًا.
  • لا تلعب حالة الخشب دورًا كبيرًا في النتيجة النهائية للطلاء الهلامي - ستبدو العقد في أشجار الصنوبر المعقدة أقل وضوحًا عند الانتهاء من المهمة.
  • لقد وجدت أن صبغة الجل أكثر تسامحًا لأنك ستحتاج إلى عمل طبقات متعددة ، حتى أنه يمكنك التخلص من النهاية بمرور الوقت.
  • نظرًا لأن صبغة الجل أكثر سمكًا ، يمكن استخدامها لمزيد من التطبيقات الإبداعية أيضًا ، مثل طلاء حبيبات خشبية صناعية.

إذا كنت تبحث عن تلطيخ الخزانات بالطريقة التقليدية ، فاطلع على هذا البرنامج التعليمي لتلوين الخزانات الخشبية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستمر في القراءة من خلال كيفية رؤية بقعة الجل وهي تعمل!


ما هي الشروط التي يجب أن أستخدمها لتلوين الجل الأحمر؟ - مادة الاحياء

مبدأ الصفحة الأصلية:

تستخدم الصفحة الأصلية نفس واجهات أيون الجليسين والكلوريد المتقطع مثل SDS-PAGE لتشكيل حدود متحركة تتراكم ثم تفصل عديد الببتيدات حسب نسبة الشحنة إلى الكتلة. يتم تحضير البروتينات في عينة عازلة غير مقلصة وغير مفسدة للطبيعة ، والتي تحافظ على البنية الثانوية للبروتينات وكثافة الشحنة الأصلية. لذلك يمكنك بسهولة رؤية نطاقات متعددة من لقطة الكاميرا الخاصة بهلام PAGE الأصلي إذا كان البروتين المستهدف يحتوي على أشكال بلمرة في عينتك. في الرحلان الكهربي الأصلي PAGE ، تحتوي معظم البروتينات على pl حمضية أو قاعدية قليلاً (نقطة متساوية الكهربي) (

3-8) والهجرة نحو القطب السالب. إذا كان حجم البروتين أكبر من 8،9 ، على سبيل المثال ، فمن المحتمل أن تقوم بعكس الأنود وتشغيل هلام PAGE الأصلي.

تعرف على المزيد حول Native-PAGE:

  • بالنسبة لنظام الرحلان الكهربائي ، يوصى باستخدام نظام إشعاع حيوي.
  • للحصول على هلام التراص PAGE الأصلي 5 مل

*: تمت إضافته مباشرة قبل كل استخدام.

للحصول على هلام فصل PAGE الأصلي 10 مل:

نسبة مادة الأكيلاميد 6% 8% 10% 12% 15%
أكريلاميد / ثنائي أكريلاميد (30٪ / 0.8٪ وزن / حجم) 2 مل 2.6 مل 3.4 مل 4 مل 5 مل
0.375 م تريس- حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8.8) 7.89 مل 7.29 مل 6.49 مل 5.89 مل 4.89 مل
* 10٪ (وزن / حجم) بيرسلفات الأمونيوم (AP) 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر
* تيميد 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر

*: تمت إضافته مباشرة قبل كل استخدام.

عينة المخزن المؤقت (2x):

62.5 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 6.8
25٪ جلسرين جلسرين
1٪ بروموفينول بلو

25 ملم تريس
192 ملي جليكاين

ملاحظة: يجب أن يكون تشغيل المخزن المؤقت

8.3 درجة الحموضة. لا تقم بضبط الأس الهيدروجيني.

بروتوكول تشغيل الجل:

1. تحضير كمية مناسبة من هلام الفصل في دورق صغير ، ثم إضافة حجم معين. من AP و TEMED وقم بتدوير الأداة برفق لضمان الخلط الكافي. امص محلول الجل في الفجوة بين الألواح الزجاجية لصب الجل (لا تملأ بالكامل). املأ المساحة المتبقية بالماء (بدلاً من الأيزوبروبانول). اسمح لمدة 20-30 دقيقة للحصول على هلام كامل.

2. يمكنك تحضير محلول التراص بينما هلام الفصل هو الهلام. قم بإعداد كمية مناسبة من هلام التراص في وعاء صغير واخلطه مع 10٪ AP و 1٪ TEMED. اسكب الماء في الخطوة الأولى واضرب محلول هلام التراص في الفجوة وأدخل المشط. السماح لمدة 20-30 دقيقة للسماح لها بالهلام.

3. مزج عينتك مع عينة عازلة. لا تسخن عينتك!

4. قم بتحميل خليط العينة واضبط الجهد الكهربي المناسب لتشغيل الرحلان الكهربي.

ملاحظة: من الأفضل وضع النظام على الجليد وعدم ضبط فولت مرتفع نسبيًا في حالة تحلل البروتينات.

5. وصمة عار كما تفعل مع بروتوكول كوماسي الأزرق القياسي أو انتقل إلى إجراء النشاف المناعي (لطخة ويسترن).


أفضل 5 أنواع من التلوين (مع رسم بياني) | علم الاحياء المجهري

توضح النقاط التالية أهم خمسة أنواع من التلوين. الأنواع هي: 1. تلطيخ بسيط 2. تلطيخ تفاضلي 3. تلطيخ غرام 4. تلطيخ حمض سريع 5. تلطيخ إندوسبور.

تلطيخ اكتب رقم 1. تلطيخ بسيط:

يسمى تلوين الكائنات الحية الدقيقة عن طريق تطبيق صبغة واحدة على مسحة ثابتة التلوين البسيط. يقوم أحدهم بتغطية اللطاخة الثابتة بالبقعة لفترة محددة ، وبعد ذلك يتم غسل هذا المحلول بالماء ثم تجفيفه بواسطة تجفيف. غالبًا ما تستخدم الأصباغ الأساسية مثل البنفسجي الكريستالي والأزرق الميثيلين والكاربولفوشين في تلطيخ بسيط لتحديد حجم وشكل وترتيب الخلايا بدائية النواة. (الشكل 5.1)

تلطيخ نوع # 2. تلطيخ تفاضلي:

تُستخدم إجراءات التلوين هذه لتمييز الكائنات الحية بناءً على خصائص التلوين. إنها أكثر تفصيلاً قليلاً من تقنيات التلوين البسيطة التي قد تتعرض لها الخلايا لأكثر من صبغة أو صبغة واحدة ، على سبيل المثال استخدام صبغة جرام التي تقسم البكتيريا إلى فئتين - سالبة الجرام وإيجابية الجرام.

تلطيخ نوع # 3. تلوين غرام:

إنها واحدة من أهم تقنيات التلوين التفاضلي المستخدمة على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة. تم تقديم هذه التقنية في عام 1884 من قبل الطبيب الدنماركي كريستيان جرام. تم توضيح إجراء تلطيخ الجرام في الشكل 5.2.

في الخطوة الأولى ، يتم تلطيخ المسحة بصبغة كريستالية بنفسجية أساسية (صبغة أولية) تليها معالجة بمحلول اليود الذي يعمل كرائحة.

يزيد اليود من التفاعل بين صبغة الخلية وصبغة الأمبير بحيث تتلطخ الخلايا بشدة. يتم إزالة لون اللطاخة بعد ذلك عن طريق الغسيل بالإيثانول أو الأسيتون. تولد هذه الخطوة الجانب التفاضلي لبقع غرام. تحتفظ البكتيريا الموجبة للجرام بالبنفسج الكريستالي وتصبح عديمة اللون.

أخيرًا ، يتم تلطيخ المسحة بصبغة أساسية بسيطة مختلفة في اللون عن اللون البنفسجي الكريستالي. الزعفران هو أكثر البقع المضادة شيوعًا والتي تلون البكتيريا سالبة الجرام من اللون الوردي إلى الأحمر وتترك البكتيريا موجبة الجرام بنفسجي غامق. (الشكل 5.2)

يمكن أن تكون الاختلافات في استجابات تلطيخ صبغة جرام مرتبطة بالاختلاف الكيميائي والفيزيائي لجدران الخلايا. جدار الخلية البكتيرية سالبة الجرام عبارة عن بنية رقيقة ومعقدة متعددة الطبقات وتحتوي على نسبة عالية من الدهون نسبيًا بالإضافة إلى البروتين والببتيد المخاطي.

يتم إذابة الكمية الأعلى من الدهون بسهولة عن طريق الكحول ، مما ينتج عنه معلومات عن وجود مسام كبيرة في جدار الخلية ، مما يسهل تسرب مركب اليود البلوري البنفسجي & # 8211 (CV-I) مما يؤدي إلى إزالة لون الخلية البكتيرية.

والتي تأخذ فيما بعد بقعة مضادة وتظهر باللون الأحمر. على النقيض من ذلك ، يكون جدار الخلية للبكتيريا gram + ve سميكًا وبسيطًا كيميائيًا ، ويتكون أساسًا من mucopeptides. عند معالجته بالكحول ، فإنه يسبب الجفاف وإغلاق مسام جدار الخلية ، وبالتالي لا يسمح بفقدان مركب (CV-I) وتبقى الخلية أرجوانية.

تلطيخ نوع # 4. تلطيخ حمض سريع:

إنه إجراء آخر مهم للتلوين التفاضلي. هو الأكثر استخداما لتحديد Mycobacterium spp. تحتوي هذه البكتيريا على جدار خلوي يحتوي على نسبة عالية من الدهون مثل حمض الميكوليك - وهي مجموعة من دهون هيدروكسي متفرعة السلسلة ، والتي تمنع الأصباغ من الارتباط بالخلايا بسهولة.

يمكن تلطيخها بطريقة Ziehl-Nulsen ، التي تستخدم الحرارة والفينول لاشتقاق الفوكسين الأساسي في الخلايا. المتفطرة النيابة. تم اختراقها باستخدام الفوكسين الأساسي ، ولا يمكن فك ألوانها بسهولة عن طريق الكحول المحمض (كحول حامض) ، وبالتالي يقال إنها سريعة الحمضية.

يتم إزالة لون البكتيريا السريعة غير القاحلة بواسطة الكحول الجاف ، وبالتالي يتم تلطيخها باللون الأزرق بواسطة بقعة الميثيلين الزرقاء المضادة.

تلطيخ نوع # 5. Endospore تلطيخ:

يحدث تكوين الأبواغ في بعض الأجناس البكتيرية لتحمل الظروف غير المواتية. لا يمكن لجميع البكتيريا تكوين أبواغ ، فقط عدد قليل من الأجناس البكتيرية بما في ذلك العصوية ، المطثية ، Desulfotomaculum تنتج بنية أبواغ داخل الخلايا النباتية تسمى endospore.

تختلف مورفولوجيا Endospore وموقعها باختلاف الأنواع وهي ذات قيمة في التعرف على Endospores ليست ملطخة جيدًا بواسطة معظم الأصباغ ، ولكن بمجرد تلطيخها ، فإنها تقاوم بشدة إزالة اللون.

في إجراء Schaffer-Fulton ، يتم تلطيخ الأبواغ أولاً عن طريق تسخين البكتيريا باللون الأخضر الملكيت ، وهي بقعة قوية جدًا يمكنها اختراق الأبواغ الداخلية. بعد المعالجة الخضراء بالملكيت ، يتم غسل باقي الخلية خالية من الصبغة بالماء ويتم تلطيخها بالسافرانين. ينتج عن هذه التقنية بوغ داخلي أخضر به خلية نباتية حمراء. (الشكل 5.3)


لماذا يغير GelRed هجرة الحمض النووي؟

هناك عدد من الأسباب التي تجعل GelRed TM يؤثر على هجرة الحمض النووي. تذكر أن جميع أصباغ الأحماض النووية سيكون لها تأثير معين على طريقة تحرك الحمض النووي. GelRed TM هو صبغة أثقل بكثير من EtBr ، وتقارب GelRed للحمض النووي يعني أنه كلما زاد عدد الحمض النووي الذي يتم تحميله في مادة هلامية ، كلما زاد ارتباط GelRed TM بالحمض النووي ويؤدي إلى انحراف حركة تلك القطعة.

بعض التوصيات لمنع أو تقليل تأثير GelRed TM على الترحيل هي: استخدمه كمادة بعد وصمة عار (لا يمكننا التأكيد على هذا بدرجة كافية). تأكد من تخفيف محلول مخزون GelRed TM بشكل مناسب. قد تحتاج أيضًا إلى تقليل كمية الحمض النووي الذي تستخدمه لتقليل تأثير تداخل الترحيل.


بروتوكول SDS PAGE:

1. اصنع ملف هلام فصل:

ضع إطارات الصب (ثبت لوحين زجاجيين في إطارات الصب) على حوامل الصب.

تحضير محلول الجل (كما هو موضح أعلاه) في دورق صغير منفصل.

قم بتدوير المحلول برفق ولكن بشكل كامل.

الماصة كمية مناسبة من محلول الهلام المنفصل (المذكور أعلاه) في الفجوة بين الألواح الزجاجية.

لجعل الجزء العلوي من هلام الفصل أفقيًا ، املأ الماء (إما الأيزوبروبانول) في الفجوة حتى يفيض.

انتظر لمدة 20-30 دقيقة للسماح لها بالهلام.

اعمل ال هلام التراص:

تخلص من الماء ويمكنك رؤية الهلام الفاصل المتبقي.

الماصة في التراص هلام حتى فيض.

أدخل المشط جيد التشكيل دون حبس الهواء تحت الأسنان. انتظر لمدة 20-30 دقيقة للسماح لها بالهلام.

2. تأكد من تكوين هلام كامل من هلام التكديس وإخراج المشط. أخرج الألواح الزجاجية من إطار الصب وضعها في سد الخلية العازلة. صب المخزن المؤقت للتشغيل (العازلة الكهربائي) في الغرفة الداخلية واستمر في التدفق بعد الفائض حتى يصل سطح العازلة إلى المستوى المطلوب في الغرفة الخارجية.

امزج العينات مع عينة المخزن المؤقت (تحميل المخزن المؤقت).

سخنيهم في الماء المغلي لمدة 5-10 دقائق.

4. قم بتحميل العينات المعدة في الآبار وتأكد من عدم تجاوزها. لا تنس تحميل علامة البروتين في المسار الأول. ثم قم بتغطية الجزء العلوي وقم بتوصيل الأنودات.

5. اضبط الفولت المناسب وقم بتشغيل الرحلان الكهربي عند الانتهاء من كل شيء.

6. بالنسبة إلى إجمالي وقت التشغيل ، أوقف تشغيل SDS-PAGE عندما تصل العلامة السفلية لعلامة البروتين (إذا لم تكن هناك علامة مرئية ، استفسر من الشركة المصنعة) تقريبًا عن خط قدم اللوحة الزجاجية. بشكل عام ، حوالي ساعة واحدة لجهد 120 فولت و 12٪ هلام فصل. بالنسبة للهلام المنفصل الذي يحتوي على نسبة أعلى من مادة الأكيلاميد ، فإن الوقت سيكون أطول.

ملحوظة: عوامل مختلفة تؤثر على خواص الهلام الناتج.


قواعد بيانات تسلسل الجينوم: الجينوم ، بناء المكتبات

Agarose Gel الكهربائي المستخدم في بناء مكتبة الجينوم

يستخدم Agarose gel electrophoresis لفصل الحمض النووي حسب الحجم أو الطوبولوجيا باستخدام مجال كهربائي يحفز جزيئات DNA سالبة الشحنة على الانتقال إلى القطب الموجب من خلال مصفوفة مسامية من الاغاروز. في بناء المكتبة ، يتم استخدامه في كل من تحضير ناقلات وعزل قطع DNA الجينومية ذات حجم معين. يهاجر المتجه الدائري بسرعة أكبر عبر هلام الاغاروز مقارنة بالناقل الخطي بنفس الوزن الجزيئي ، وبالتالي يمكن فصله عن المتجه الذي تم تحويله خطيًا بعد الهضم باستخدام إنزيم التقييد. يمكن أيضًا فصل المتجه الذي تم ربطه عن المتجه الذي لم يتم ربطه وظل خطيًا باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. بعد تفتيت الحمض النووي الجيني ، يتم فصل تجمعات الأجزاء المتولدة وفقًا لوزنها الجزيئي. يمكن فصل أجزاء DNA التي تقل عن 20 كيلو بايت بشكل كافٍ باستخدام هلام agarose قياسي 1٪. يمكن تحسين دقة قطع أصغر من الحمض النووي (& lt1 kbp) عن طريق زيادة نسبة الاغاروز في الهلام إلى 2٪ ، بينما يمكن أن يؤدي خفض محتوى الاغاروز إلى 0.8٪ إلى تحسين دقة القطع الأكبر من الحمض النووي. إذا كانت هناك حاجة إلى حل قطع أكبر من الحمض النووي ، فيمكن استخدام الرحلان الكهربائي للهلام النبضي (الذي يستخدم مجالًا كهربائيًا متناوبًا) لتحقيق دقة أعلى.

يجب حل الأجزاء الأكبر أو القطع الهشة من الحمض النووي التي تكون حساسة للقص باستخدام المواد الهلامية المصنوعة من نقطة انصهار منخفضة agarose ، والتي لا تتطلب خطوات دوامة أو طرد مركزي لاستخراج الحمض النووي المضمّن ، بل تعتمد على ذوبان الجل في درجات حرارة منخفضة متبوعة بـ الحضانة مع β-agarase I لهضم الاغاروز بعيدًا عن الحمض النووي المضمن.

يجب ربط الحمض النووي داخل هلام الاغاروز بصبغة من أجل التصور. الصبغة الأكثر استخدامًا لتلوين المواد الهلامية الاغاروز هي بروميد الإيثيديوم (EtBr). EtBr هي صبغة فلورية تتداخل بين قواعد الحمض النووي المكدسة. تتعرض EtBr للإثارة بواسطة الأشعة فوق البنفسجية وتنبعث منها طاقة عند 590 نانومتر ، متألقة بلون أحمر برتقالي. تعرض الصبغة المرتبطة بالحمض النووي زيادة تقارب 20 ضعفًا في غلة الفلورسنت ، مما يسمح باكتشاف أقل من 10 نانوغرام من الحمض النووي. إذا تم استخدام EtBr لتصور الحمض النووي المحمل على هلام الاغاروز ، فمن المهم جدًا تقليل كمية الأشعة فوق البنفسجية ذات الطول الموجي القصير التي تتعرض للحمض النووي ( الأشكال 2 و 3 ). تبين أن التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية قصير الموجة يضر بالحمض النووي ويقلل من كفاءة الاستنساخ. بالإضافة إلى ذلك ، يعتبر EtBr مطفرًا قويًا وسامًا معتدلًا ، لذلك غالبًا ما تكون البدائل أو الأصباغ الأكثر أمانًا التي يمكن رؤيتها دون مساعدة الأشعة فوق البنفسجية مرغوبة. تشمل الأصباغ البديلة الكريستال البنفسجي أو الأزرق الميثيلين أو SYBR Safe (Invitrogen أو Carlsbad أو CA) أو الأزرق النيلي.

الشكل 2 . كفاءة الاستنساخ النسبية لـ pUC19 بعد التعرض لضوء UV قصير أو طويل الطول. تم تحويل الحمض النووي pUC19 السليم بعد عدم التعرض للأشعة فوق البنفسجية ("بدون الأشعة فوق البنفسجية") أو التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية 302 نانومتر لمدة 30 أو 60 أو 120 ثانية (30 ثانية 302 نانومتر ، 60 ثانية 302 نانومتر ، 120 ثانية 302 نانومتر) أو 360 نانومتر ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 120 ثانية (120 ثانية 360 نانومتر). تم حساب كفاءات الاستنساخ بالنسبة إلى DNA pUC19 غير المشع. أعيد طبعها بإذن من Lucigen Corporation (www.lucigen.com).

الشكل 3. يجب عدم تعريض الحمض النووي المهضوم لاستخدامه في الخطوات اللاحقة لضوء الأشعة فوق البنفسجية. بعد تحميل السلم في الممر 1 ، يجب وضع جزء من الحمض النووي المهضوم في الممر 2 والباقي في الممر 3. بعد تشغيل الجل (أ) ، يجب فصل الممر 1 و 2 عن الممر 3 باستخدام مشرط (ب) وفحصها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يجب إزالة جزء الحمض النووي المطلوب من الممر 2 ، ويجب جمع كلتا قطعتي الهلام معًا (ج) للحصول على قطعة جزء الحمض النووي المرغوبة.


جل البروتين One-Step Blue® ، البيوتيوم

Avantor & reg ، إحدى شركات Fortune 500 ، هي مزود عالمي رائد للمنتجات والخدمات ذات المهام الحرجة للعملاء في مجال الأدوية الحيوية والرعاية الصحية والتعليم والحكومة والتقنيات المتقدمة وصناعات المواد التطبيقية. تُستخدم محفظتنا في كل مرحلة تقريبًا من مراحل أنشطة البحث والتطوير والإنتاج الأكثر أهمية في الصناعات التي نخدمها. تأتي إحدى أعظم نقاط قوتنا من امتلاك بنية تحتية عالمية ذات موقع استراتيجي لدعم احتياجات عملائنا. تمكننا بصمتنا العالمية من خدمة أكثر من 225000 موقع للعملاء وتمنحنا وصولاً مكثفًا إلى مختبرات البحث والعلماء في أكثر من 180 دولة. نضع العلم في حركة لخلق عالم أفضل. للحصول على معلومات ، قم بزيارة www.avantorsciences.com وتجدنا على LinkedIn و Twitter و Facebook.

& نسخ 2021 VWR International، LLC. كل الحقوق محفوظة.
& نسخ 2021 FORTUNE Media IP Limited جميع الحقوق محفوظة. مستخدمة بموجب ترخيص.

لا يدعم موقع الويب هذا إصدار Internet Explorer الخاص بك. نوصيك بالترقية إلى Internet Explorer 11 أو مستعرض آخر مدعوم ، والتحقق لمعرفة ما إذا كنت تستخدم IE11 في وضع عرض التوافق.


شاهد الفيديو: MSU Chorale: Soos n Wildsbok - arr. Renette Bouwer (شهر فبراير 2023).