معلومة

كيفية التعرف على الجينات المطلوبة لتكوين الأغشية الحيوية

كيفية التعرف على الجينات المطلوبة لتكوين الأغشية الحيوية


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هذا مجرد سؤال واجب منزلي:

س: لنفترض أن هناك مجموعة غير معروفة من جينات الإشريكية القولونية المطلوبة لتكوين الأغشية الحيوية. صِف تجربة جينية يمكنك إجراؤها لمحاولة التعرف على تلك الجينات.

الفكرة الوحيدة التي يمكنني التفكير فيها هي:

  • قارن السلالات التي تنتج الأغشية الحيوية مقابل السلالات التي لا تنتج الأغشية الحيوية. تسلسل الجينات ، والعثور على الاختلافات ، ومقاطعة الجينات في السلالات المنتجة للغشاء الحيوي وتأكيد ضعف قدرة الأغشية الحيوية.

هل هناك نهج أفضل من هذا؟


يمكنك القيام بأشياء مختلفة: أولاً ، يمكنك ، كما تقول أنت نفسك ، ترتيب الجينومات الكاملة للسلالات من الأغشية الحيوية ومقارنتها مع بعضها ، الذي لا يشكل أغشية حيوية. قد يعطيك هذا فكرة عن الجينات المتورطة عندما تكون موجودة في "جينوم الأغشية الحيوية" ولكن ليس في الآخر. سيكون الدليل هو تعطيل هذه الجينات إما عن طريق إزالتها أو تحويرها أو عن طريق تقنيات إسكات الجينات ومعرفة النتيجة.

من الممكن أيضًا أن تحدث الفرق فقط طفرة في الجين الموجود في العينة وجينوم التحكم. ومن ثم فإن الطفرات الموجهة بالموقع ستساعد في تحديد الجينات المهمة.

الاحتمال الثاني هو أنه لا يوجد فرق حقيقي في العينة وجينوم التحكم والاختلاف في تطوير غشاء حيوي "ببساطة" يكمن في اختلاف التعبير الجيني. عندئذٍ ، فإن عزل الحمض النووي الريبي (سواء الكلي أو الرنا المرسال فقط) سيساعد في العثور على الجينات المعنية. إذا كانت البيئة تحدث فرقًا في تطوير الأغشية الحيوية ، فيجب ألا تظهر أي (أو لا تظهر أي فرق تقريبًا) في الأغشية الحيوية وخلايا التحكم في ملفات تعريف التعبير الجيني عند زراعتها في ظل ظروف متطابقة. تحتاج بعد ذلك إلى اختبار التعبير الجيني لظروف بيئية مختلفة (بما في ذلك تلك التي تفضل تطوير الأغشية الحيوية) للعثور على الجينات المعنية.

ستؤدي هذه المقارنة بين الظروف المختلفة بعد ذلك إلى تقديم الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل فريد أو أكثر في مجموعة الأغشية الحيوية ، والكثير من الجينات التي يمكن مقارنتها في التعبير بعينة التحكم ، وبعض الجينات التي لها تعبير أقل من المجموعة الضابطة. من الجدير الآن النظر إلى الجينات الأعلى (أو الفريدة) والأدنى المعبر عنها ، ومعرفة وظيفتها ثم البدء في تحورها للتحقق من وظيفتها لتشكيل غشاء حيوي.

بالإضافة إلى ذلك ، هناك احتمال أن يقع الجين (الجينات) الضروري لتكوين الأغشية الحيوية على بلازميد كروموسومي إضافي. أود أيضًا فحص البلازميدات الموجودة في الأغشية الحيوية وعينة التحكم ، وتسلسلها (إن وجدت) ومعرفة الجينات التي تعبر عنها. يمكن بسهولة اختبار وظيفة تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة بتحويل بسيط.


إضافة إلى إجابة كريس.

إذا لم يكن لديك سلالة لا تنتج الأغشية الحيوية ، فسيتعين عليك فحص الجينات التي تشارك في إنتاج الأغشية الحيوية (وهذا ينطبق على أي نمط ظاهري).

في الأوقات السابقة ، اعتاد الناس على القيام بذلك عن طريق الطفرات العشوائية مع المطفرات مثل EMS (إيثيل ميثان سلفونات) أو الأشعة فوق البنفسجية. في الوقت الحاضر من الممكن بناء مكتبة من المطفرات المستهدفة ضد كل جين على سبيل المثال. مكتبة نوكليازات كريسبر كاس.


تحديد جينات Streptococcus sanguinis اللازمة لتكوين الأغشية الحيوية وفحص دورها في فوعة التهاب الشغاف

Streptococcus sanguinis هي واحدة من الرواد في الاستعمار البكتيري للأسنان وهي واحدة من أكثر الأنواع وفرة في الأغشية الحيوية الفموية التي تسمى لوحة الأسنان. S. sanguinis هي أيضًا أكثر أنواع المكورات العقدية للمجموعة viridans شيوعًا المتورطة في التهاب الشغاف المعدي. للتحقيق في ارتباط الغشاء الحيوي والتهاب الشغاف ، أنشأنا مقايسة الأغشية الحيوية وفحصنا تكوين الأغشية الحيوية مع مكتبة الطفرات المميزة بعلامات التوقيع من S. sanguinis. تم تحديد أربعة جينات لم تكن مرتبطة سابقًا بتكوين الأغشية الحيوية في أي بكتيريا أخرى ، بورب ، بييرل ، ترب ، وبير ، كمساهمة في تكوين الأغشية الحيوية في المختبر في S. sanguinis. من خلال فحص 800 طفرة للتوهين في نموذج التهاب شغاف الأرانب وللتقليل من تكوين الأغشية الحيوية في المختبر ، وجدنا بعض الطفرات التي كانت معيبة في الأغشية الحيوية ومضعفة من أجل التهاب الشغاف. ومع ذلك ، حددنا أيضًا طفرات ذات تكوين بيوفيلم منخفض فقط أو مع توهين فقط في نموذج التهاب الشغاف. تشير هذه النتيجة إلى أن القدرة على تكوين الأغشية الحيوية في المختبر لا ترتبط بضراوة التهاب الشغاف في الجسم الحي في S. sanguinis.

الأرقام

فحص تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة عن طريق ...

فحص تكوين البيوفيلم بواسطة سلالات متحولة ذات ضراوة منخفضة لالتهاب الشغاف. SK36 ...

تشكيل البيوفيلم من قبل الوالدين و ...

تشكيل البيوفيلم بواسطة سلالات الوالدين والمتحولة في وسائط مختلفة. SK36 والمختارة ...

تحليل STM للطفرات المعيبة للغشاء الحيوي ...

تحليل STM للطفرات المعيبة للغشاء الحيوي. النتائج المحددة من شاشة STM الخاصة بعلامة التوقيع ...

تنظيم الأغشية الحيوية المفترضة ...

تنظيم جينات الأغشية الحيوية المفترضة بين جينومات المكورات العقدية الفموية. المواقع و ...


جينات التكوُّن الحيوي من النوع الرابع ودورها في تكوين الأغشية الحيوية في عامل المكافحة البيولوجية إنزيمات الليزوباكتر أوه 11

ينتشر النوع الرابع بيلوس (T4P) في البكتيريا ، ومع ذلك فإن آلية التكوين الحيوي ووظائفه يتم توضيحها جزئيًا فقط في عدد محدود من الأنواع البكتيرية. هنا ، باستخدام سلالة OH11 ككائن نموذجي ، أبلغنا عن تحديد 26 بروتينًا مكونًا هيكليًا أو وظيفيًا (SFC) لـ T4P في سالبة الجرام. إنزيمات الليزوباكتر، وهو عامل تحكم بيولوجي يحتمل أن يستغل حركة الوخز بوساطة T4P للنشاط المضاد للفطريات. تم إخراج عشرين جينة من ترميز SFC بشكل فردي في الإطار لإنشاء مكتبة حذف T4P SFC. باستخدام الأساليب المظهرية والوراثية المشتركة ، وجدنا أن 14 من SFCs ، والتي تم التعبير عنها من أربعة عوامل تشغيل ، كانت ضرورية لطفح الحركة. تضمنت SFCs الطواحين الصغيرة (PilEأنا، بيلكسأنا، بيلفأناو FimTأنا) ، البروتين المضاد للانكماش PilY1أنا، وبروتين النظام الأساسي PilC ، و ATPases التمديد / الاستخراج (PilB ، و PilT ، و PilU) ، ومركب PilMNOPQ. من بين هؤلاء ، طفرة بيلت أو بيلو تسبب في حدوث تضخم مفرط ، في حين أن الـ 12 SFCs المتبقية لا غنى عنها لتكوين الشعر. عشرة (فيمتأنا، PilY1أنا، PilB ، PilT ، PilU ، ومركب PilMNOPQ) من 14 بروتينًا من بروتينات SFC ، بالإضافة إلى PilA ، لعبت دورًا رئيسيًا في إنزيمات L. تشكيل بيوفيلم. بشكل عام ، تقدم نتائجنا التقرير الأول لتشريح الأساس الجيني للتكوين الحيوي لـ T4P ودوره في تكوين الأغشية الحيوية في إنزيمات L. بالتفصيل ، والتي يمكن أن تكون بمثابة منصة بديلة لدراسة التولد الحيوي T4P ووظيفته المضادة للفطريات.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


2. C. البيض تطوير الأغشية الحيوية

معظم معرفتنا C. البيض ينشأ تكوين الأغشية الحيوية من دراسة الأغشية الحيوية أحادية النوع ، والتي تم تمييزها في كليهما في المختبر و في الجسم الحي أنظمة وتتكون من أربع مراحل متميزة من التنمية [9،11] (الشكل 2). C. البيض يبدأ تكوين البيوفيلم بالتصاق خلايا الخميرة الدائرية بسطح صلب (في المختبر ، غالبًا ما يتم استخدام قرص سيليكون صغير ، أو مادة القسطرة الشائعة داخل الأوعية ، أو صفيحة البوليسترين الدقيقة). عادة ، ثقافة C. البيض يضاف إلى السطح الصلب لبدء مرحلة الالتزام (60 & # x0201390 دقيقة) ثم يتم غسل الخلايا غير الملتصقة أو الملتصقة بشكل فضفاض ، مما يؤدي إلى تكوين طبقة قاعدية من خلايا الخميرة الراسخة (الشكل 2 أ). غالبًا ما يشار إلى هذه المرحلة بالخطوة & # x0201cseeding & # x0201d وهي ضرورية لتطوير الأغشية الحيوية الطبيعية. تتكون المرحلة التالية في تطوير الأغشية الحيوية من تكاثر الخلايا وخيوط المرحلة المبكرة للخلايا الملتصقة (الشكل 2 ب). يتبع ذلك نضج الأغشية الحيوية ، مما يؤدي إلى شبكة معقدة من عدة طبقات من الخلايا متعددة الأشكال ، بما في ذلك الخلايا الخيطية (سلاسل من الخلايا الأسطوانية) ، والخلايا الزيفية الكاذبة (الخلايا البيضاوية المرتبطة من طرف إلى طرف) ، وخلايا الخميرة المستديرة ، المغلفة في مصفوفة خارج الخلية ، مما يعطي البيوفيلم مظهرًا سميكًا ومنظمًا بالإضافة إلى توفير الحماية من الإصابات الكيميائية والفيزيائية (الشكل 2C). يتشكل البيوفيلم الناضج عادةً خلال 24 ساعة ، ويمكن تصويره بالعين على أنه هيكل سطح غائم أعلى السطح الصلب ، وتحت المجهر ، كمجموعة منظمة من أنواع مختلفة من الخلايا. خلال هذه المراحل من تطور الأغشية الحيوية ، يتم الحفاظ على وسط النمو يهتز باستمرار ، لمنع الخلايا العائمة الحرة من الاستقرار على السطح ، أو تتدفق باستمرار فوق البيوفيلم ، لتقليد ظروف التدفق الموجودة عادة في القسطرة. تسمى الخطوة الأخيرة لتطوير الأغشية الحيوية بمرحلة التشتت ، حيث تنتشر بعض خلايا الخميرة الدائرية من الأغشية الحيوية إلى مواقع جديدة (الشكل 2 د) ، وهذه هي أقل مرحلة تمت دراستها من C. البيض تطوير الأغشية الحيوية. عدة نماذج من في المختبر C. البيض تم الإبلاغ عن تكوين الأغشية الحيوية ، وركزت الدراسات على تحليل تأثير الأنواع المختلفة من الركائز ، والوسائط الغذائية ، ووجود تدفق أو ظروف ثابتة ، على تطور الأغشية الحيوية [14]. في المختبر، C. البيض يمكن أن تتطور الأغشية الحيوية على عدة ركائز مختلفة وفي العديد من أنواع الوسائط المختلفة ، مما يشير إلى القوة الكامنة في تطوير الأغشية الحيوية لمجموعة واسعة من الظروف البيئية.

C. البيض دورة حياة الأغشية الحيوية الرقيقة. أ. التصاق خلايا الخميرة الدائرية بالسطح. ب. بدء تكوين الأغشية الحيوية ، حيث تتكاثر الخلايا لتشكل طبقة قاعدية من الخلايا الملتصقة. ج. نضوج الغشاء الحيوي ، حيث تتطور طبقات معقدة من الخلايا متعددة الأشكال وتصبح مغطاة في مصفوفة خارج الخلية. د. التشتت ، حيث تترك خلايا الخميرة المستديرة الأغشية الحيوية الناضجة لبذر مواقع جديدة.

بشكل عام، المبيضة البيضاء في المختبر يرتبط تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة بشكل جيد مع في الجسم الحي و خارج الجسم الحي نماذج الأغشية الحيوية التي تتبع مسارًا زمنيًا مماثلًا في مراحل التطوير وتظهر أيضًا مشابهة معماريًا للأغشية الحيوية المسترجعة من المرضى المصابين بالعدوى. على سبيل المثال، الكانديدا تؤكد الأغشية الحيوية المأخوذة من مرضى التهاب الفم ومن المرضى المصابين بالقسطرة داخل الأوعية الدموية وجود الخميرة والخيوط والمصفوفة خارج الخلية [1]. واحدة من مزايا في الجسم الحي النماذج هي فرصة للدراسة C. البيض تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة في وجود الجهاز المناعي للمضيف ، والذي يمكن أن يوفر رؤى آلية إضافية في تفاعلات المضيف الممرض. الهندسة المعمارية للأغشية الحيوية في نماذج القسطرة الوريدية المركزية للجرذان والأرانب ، ونماذج القسطرة البولية الساكنة ونماذج التهاب الفم بأسنان الجرذ ، تشبه أيضًا نماذج القسطرة الوريدية المركزية للفئران والأرانب. في vitro بنية بيوفيلم ، بما في ذلك العديد من خلايا الخميرة في المنطقة القاعدية ، وخيوط خيوط وطبقة خارج الخلية ممتدة في جميع أنحاء الأغشية الحيوية [15 & # x0201317]. الغشاء المخاطي المهبلي في الجسم الحي نماذج الفئران (الغشاء المخاطي المهبلي الملقح بـ C. البيض في الفئران الحية) و خارج الجسم الحي نماذج (المهبل الذي يتم استئصاله من الفئران التي تم تطعيمها بالقتل الرحيم C. البيض في لوحات زراعة الأنسجة) تظهر أيضًا هياكل بيوفيلم مماثلة مع خلايا الخميرة ، والخيوط ، والمصفوفة خارج الخلية الواضحة في جميع أنحاء الأغشية الحيوية ، المتكونة فوق الطبقات المخاطية [18]. نماذج حيوانية أخرى لمراقبة تكوين الأغشية الحيوية تشمل الغشاء المخاطي للفم القوارض ، الفم والبلعوم ، وتحت الجلد ، ونماذج الحروق [19 ، 20]. يجري تطوير أنظمة نموذجية أحدث ، وستساعدنا في تصور التقدم الزماني والمكاني لعدوى الأغشية الحيوية في الحيوانات الحية باستخدام التصوير بالتلألؤ البيولوجي. على سبيل المثال ، في الآونة الأخيرة ، تم تحسين كودون C. البيض تم استخدام luciferase bioreporter في نموذج داء المبيضات الفرجي المهبلي لمراقبة تكوين البيوفيلم في الوقت الحقيقي في تجويف المهبل [21]. آخر C. البيض تشتمل نماذج الأغشية الحيوية ذات الإضاءة الحيوية على نماذج القسطرة البلعومية ، والجلدية ، وتحت الجلد ، والقسطرة المزروعة [22 ، 23].


دور Mss11 في المبيضات البيض تشكيل بيوفيلم

المبيضات البيض هو أحد مسببات الأمراض البشرية الانتهازية التي يمكن أن تشكل غشاء حيوي على الأسطح الحيوية أو الخاملة مثل الظهارة والأجهزة السريرية. في هذه الدراسة ، ندرس تشكيل ج. البيض بيوفيلم عن طريق إنشاء شبكة رئيسية تركز على الجينات تعتمد على تفاعل البروتين والبروتين (PPI) ومجموعات بيانات التعبير الجيني. بدءا من ج. البيض Cph1 و Efg1 ، عوامل النسخ المرتبطة بتشكيل تكوين الأغشية الحيوية ، توضح الشبكة العملية الخلوية المعقدة وتتوقع مكونات غير معروفة محتملة تتعلق بتكوين الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، قمنا بتحليل وظائف Mss11 بين هذه البروتينات المحددة لاختبار كفاءة النهج الحسابي المقترح. MSS11- تمت مقارنة المسوخات المحذوفة بسلالة من النوع البري ، مما يشير إلى أن المتحولة معيبة في تكوين غشاء حيوي ناضج ويخفف جزئيًا من ضراوة ج. البيض في نموذج فأر مصاب. أخيرًا ، تم إجراء تحليل ميكروأري للحمض النووي لتحديد الجينات المستهدفة المحتملة لـ ج. البيض Mss11. توضح نتائج هذه الدراسة تفاعل الجين المعقد أو البروتين أثناء عملية تكوين الأغشية الحيوية ج. البيض، ودعم تطبيق نهج بيولوجيا النظم لدراسة التسبب الفطري.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


أساليب

السلالات البكتيرية وظروف النمو

تم سرد السلالات البكتيرية المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول S1. تم تخزين مخزون الفريزر في 25 ٪ من الجلسرين عند -80 درجة مئوية.

تمت زراعة البكتيريا في مرق تسريب الدماغ والقلب (BHI) ، وسط M9 المعدل مع مستخلص الخميرة والجلوكوز (MM9-YEG) ، 74 مرق الصويا التريبتي بدون وسط نمو الدكستروز (TSB-D) ، أو مرق اللايسوجيني (LB ، لزيادة إفراز البروتين) ). تمت إضافة أجار (1٪ وزن / حجم) للوسائط الصلبة ، وأضيف الجيلاتين (3٪ وزن / حجم) حيث تمت الإشارة إليه. تم استخدام المضادات الحيوية للاختيار بالتركيزات التالية: الكلورامفينيكول (10 ميكروغرام / مل) ، الإريثروميسين (20 ميكروغرام / مل) ، حمض الفوسيديك (25 ميكروغرام / مل) ، الجنتاميسين (100 ميكروغرام / مل) ، كاناميسين (50 ميكروغرام / مل) ، سبكتينوميسين (250 ميكروغرام / مل) ، والتتراسيكلين (5 ميكروغرام / مل). عند الحاجة للتحريض ، تمت إضافة الببتيد الفرمون cCF10 إلى تركيز نهائي من 10-50 نانوغرام / مل. تم شراء المضادات الحيوية والجيلاتين من سيجما. تم شراء مكونات وسائط النمو من ديفكو.

البلازميدات وأليغنوكليوتيدات

يتم سرد البلازميدات وأوليغنوكليوتيدات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول S1. تم شراء Oligonucleotides من Invitrogen. تم إجراء PCR باستخدام PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase (Agilent Genomics). تم شراء إنزيمات التقييد من New England Biolabs. تم تأكيد جميع التركيبات باستخدام تسلسل Sanger (Eurofins). تم تحويل البلازميدات إلى مختصة كيميائيا بكتريا قولونية للتكاثر والإفراط في التعبير عن البروتين ، وتم استخدام التثقيب الكهربائي لإدخال البلازميدات فيها E. faecalis.

تم إنشاء بنيات الإفراط في التعبير لتنقية البروتين عن طريق الدمج bph المتغيرات لعلامة hexahistidine (H6) C- الطرفية المشفرة على ناقل pET28b +. bph تم تضخيم افتقار كودون التوقف الأصلي باستخدام الاشعال JW109 / JW110. تم إنشاء Amplicons الذي يشفر طفرات Y85A و N87A و D105A باستخدام المبارزات الضخمة. تم إجراء أول PCR باستخدام JW110 وأوليغنوكليوتيد يحتوي على الطفرة المرغوبة (Y85A ، JW115 N87A ، JW116 D105A ، JW117) باستخدام الجينوم OG1RF DNA كقالب. تم استخدام هذه المنتجات في تفاعل ثان لتضخيم الأليل كامل الطول باستخدام JW109. تم إنشاء طفرة W70A باستخدام PCR الممتد المتداخل. تم تضخيم منتجين من الحمض النووي OG1RF الجيني باستخدام أزواج oligo JW109 / JW130 و JW114 / JW110 وخلطهما في تفاعل آخر مع البادئات JW109 / JW110. تم هضم جميع الأليلات كاملة الطول باستخدام NcoI-HF / XhoI وربطها بـ pET28b +.

سلالة الحذف بدون علامات Δbph تم إنشاؤه باستخدام التبادل الأليلي والاختيار المضاد كما هو موضح سابقًا ، 75 مع الحفاظ على سلامة الكودونات الثلاثة الأولى والأخيرة من bph افتح إطار القراءة. تم إنشاء بنية التبادل الأليلي (pJW270) عن طريق تضخيم المناطق الجينومية المرافقة bph مع oligos JW133 / 134 و JW135 / 136 على التوالي. تم هضم منتجات PCR باستخدام EcoRI-HF ، وتم ربطها ، ثم هضمها باستخدام BamHI-HF / SphI-HF وربطها بـ pCJK218 75 تمت معالجتها بنفس إنزيمات التقييد. تم تأكيد الحذف بواسطة PCR والتسلسل.

تم إنشاء مشتق مقاوم للتيتراسيكلين لمتجه pCIE 76 الذي يحفزه الفرمون عن طريق استبدال كاسيت مقاومة الكلورامفينيكول بتشفير شظية محاطة بـ SpeI / EcoRI tetM لتوليد pCIE-tet (pJW8). تم استبدال موقع الاستنساخ المتعدد لـ pCIE-tet بكاسيت قليل النوكليوتيد (JW29 / 30) يشفر فريد BamHI / HincII-SalI / EcoRV / PvuI / NheI مواقع إنزيم التقييد ، مما أدى إلى pCIEtm (pJW76). الطول الكامل bph تم تضخيم الأليل وموقع ربط الريبوسوم الأصلي من الحمض النووي الجيني باستخدام JW163 / 93. ال bph تم إنشاء المسوخ النقطي (W70A ، Y85A ، N87A ، D105A) في العمود الفقري pCIEtm باستخدام ميجابيمر كما هو موضح أعلاه لتركيبات pET28b + ، باستثناء التمهيدي العكسي في PCR الأول كان JW93 ، وكان التمهيدي الأمامي في PCR الثاني هو JW163 ، و تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني مع النوع البري bph بناء التعبير كقالب. تمت معالجة Megaprimer PCRs باستخدام DpnI لإزالة قالب DNA. تم هضم جميع منتجات PCR باستخدام BamHI-HF / PvuI-HF وربطها بـ pJW76.

مكتبة جيل صفيف تن

تم اشتقاق مكتبة Tn المصفوفة من مكتبة مصفوفة تم إنشاؤها سابقًا ، 30 والتي تم الاحتفاظ بها كمخزونات مجمدة في أنابيب مشفرة ثنائية الأبعاد (Micronic) في مركز الجينوم بجامعة مينيسوتا. المسوخ مع إدراج Tn في الجينات المشروحة على أنها افتراضية / غير معروفة (ن = 1052) أو في المناطق الجينية (ن = 894) لإدراجها في هذه المكتبة مع 11 متحولة تحكم. تم الحصول على الحيوانات المستنسخة الفردية باستخدام معالج أنبوب XL20 آلي (BioMicroLab) وتم تلقيحها في 96 طبقًا جيدًا تحتوي على BHI / 10 ٪ من الجلسرين. نمت ثقافات مخزون المكتبة بين عشية وضحاها وتم تجميدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. يتم توفير القائمة الكاملة للطفرات الموجودة في المكتبة في البيانات التكميلية 1.

فحوصات الغشاء الحيوي الرقيق والمرفقات

تم إجراء شاشة الأغشية الحيوية لمكتبة Tn المصفوفة كما هو موضح سابقًا مع تعديلات طفيفة. 23،25،77 تم إجراء جميع الحضانات عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة ثابتة. تم استخدام دبوس مكرر (Boekel Scientific) لتلقيح 96 طبقًا جيدًا تحتوي على 100 ميكرولتر من TSB-D الطازج مع سلالات مكتبة Tn المجمدة ، وقد نمت هذه اللوحات بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، تم استخدام دبوس النسخ المتماثل لنقل اللقاح من الثقافات بين عشية وضحاها إلى 96 طبقًا جيدًا تحتوي على 100 ميكرولتر من TSB-D الطازج ، والتي تم تحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. أجريت تجارب تحكم متزامنة في لوحة منفصلة. تم استخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (Turner Biosystems) لقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD600) ، ثم تمت إزالة مستنبتات العوالق. تم غسل الأطباق ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج باستخدام غسالة الألواح (Biotek) ، وتجفيفها ، وتلطيخها بـ 100 ميكرولتر من سافرانين (0.01٪ وزن / حجم). تمت إزالة الفائض من الزعفران بغسل الصحن ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج. التطوير التنظيمي450 تم قياس مادة البيوفيلم الملطخة بالسافرانين ، وتم حساب قيم مؤشر البيوفيلم كنسبة من المواد الملطخة بالسافران إلى كثافة الخلية (OD450/ التطوير التنظيمي600) تطبيع إلى بيوفيلم أنتج بواسطة OG1RF. تم إجراء جميع فحوصات الأغشية الحيوية الأخرى على النحو الموصوف أعلاه باستخدام الثقافات الليلية المزروعة في TSB-D بالإضافة إلى المضادات الحيوية و cCF10 ، وتم تلقيح الألواح بتخفيف 1: 100.

تم استبعاد المسوخ مع قيم مؤشر بيوفيلم سلبية من مزيد من التحليل. لم تنقص المسوخات الأخرى OG1RF_10987 و OG1RF_11802 الأغشية الحيوية في هذه الشاشة ، ولوحظ وجود عيب عام في النمو لطافرة OG1RF_11756 Tn في الموضع 183636. تم الحصول على المسوخ المختار لمزيد من التحليل من لوحات مخزون المكتبة وفحص حساسية الإريثروميسين لضمان الخسارة من البلازميد المحتوي على ترانسبوزيز المستخدم في إنشاء المكتبات. يحتوي متحور OG1RF_10435-Tn ثالث في المكتبة المصفوفة على إدخال بنسبة 82.9 ٪ في الجين وخفض إنتاج الأغشية الحيوية في شاشة بيوفيلم 6 ساعات (البيانات التكميلية 2). ومع ذلك ، لم نتمكن من عزل استنساخ حساس للإريثروميسين من هذا المسوخ ، لذلك تم استبعاده من التحليل الإضافي.

لقياس الارتباط بألواح ميكروتيتر ، قسامات 1 مل من الثقافات بين عشية وضحاها (لطفرات Tn) أو ثقافات طور السجل المزروعة من سلالات نمت بين عشية وضحاها (من أجل bph مكمل) في جهاز طرد مركزي منضدية (9615 × ز لمدة دقيقة واحدة) ، وغسلها بمحلول ملحي مخزّن من فوسفات البوتاسيوم بحجم واحد (KPBS) ، وأعيد تعليقه في 100 ميكرولتر من KPBS ، وإضافته إلى صفيحة 96 بئر ، والتي تم تحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. كثافة الخلية (OD600) ، الكتلة الحيوية المرفقة (OD450) وقيم فهرس المرفقات (OD600/ التطوير التنظيمي450) كما هو موصوف لمقايسات الأغشية الحيوية.

تم إجراء التعلق بصمامات قلب الخنازير كما هو موضح سابقًا مع تعديلات طفيفة. تم التضحية بـ 36،37 خنزيرًا لأغراض أخرى في مختبر الجراحة التجريبية في جامعة مينيسوتا (رقم البروتوكول 1803A35699 المعتمد من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة مينيسوتا). تم رفع القلوب على الفور ووضعها في محلول ملحي مبرد ، وتمت إزالة الصمامات في غضون 24 ساعة من التضحية بالحيوان. تم الحصول على قطع الصمام باستخدام أداة خزعة ثقب 6 مم (Acuderm Inc.) وتم نقلها إلى لوحة 24 بئر (Corning) تحتوي على 2 مل DMEM / 5 ٪ FBS / gent100. تم تجميد الصمامات التي لم يتم استخدامها على الفور عند -80 درجة مئوية في DMEM / 5٪ FBS / gent100 مع 10٪ DMSO. قبل الاستخدام ، تم تحضين الصمامات طوال الليل في DMEM / 5٪ FBS / gent100 عند 37 درجة مئوية / 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2، تغسل 3 × في KPBS ، وتوضع في لوحة 48 بئر مع 1 مل DMEM (قطعة صمام واحدة لكل بئر). تم تلقيح الآبار ببكتيريا 5 × 10 7 وحضنت عند 37 درجة مئوية / 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 3 ساعات ، وبعد ذلك تم غسل الصمامات 3 × في KPBS ونقلها إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل تحتوي على 5 مل KPBS. تم صوت العينات باستخدام سونيكاتور QSonica Q500 (طرف 1.6 مم ، سعة 20 ٪ ، 10 ثوانٍ / 20 ثانية لمدة دقيقتين من وقت النبض) لإزالة البكتيريا المرتبطة بالأنسجة ، وتم تخفيف قسامات في KPBS وطليها للعدد CFU / مل. للتحكم في حجم الصمام ، تم تطبيع قيم CFU / mL لوزن كل قطعة صمام. نؤكد أننا امتثلنا لجميع اللوائح الأخلاقية لهذه التجارب.

فحص CPRG

نمت السلالات بين عشية وضحاها في TSB-D المكملة بالإريثروميسين وتم تخفيفها إلى OD600 = 0.05 في وسط جديد مع الاريثروميسين و 25 ميكروغرام / مل CPRG. حضنت الثقافات بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية تم قياس كثافة الخلية عند OD630، وتم تحديد كمية التحلل المائي CPRG على أنها OD570 من المستنبت طاف بعد إزالة الخلايا بالطرد المركزي (17000 × ز لمدة دقيقتين). نسبة OD570/630 تم التخطيط لتقييم التحلل المائي بالنسبة لنمو الخلايا.

فحوصات الجيلاتيناز

نمت الثقافات بين عشية وضحاها في TSB-D ورُصدت على أطباق أجار TSB-D المكملة بـ 3 ٪ من الجيلاتين (وزن / حجم). تم تحضين الصفائح عند 37 درجة مئوية خلال الليل لنمو الطائفة ثم عند 4 درجات مئوية لتطوير المنطقة. تم تصوير الألواح على جهاز تصوير البروتينات الحيوية للخلايا البسيطة FluorChem FC3. اعتبرت السلالات إيجابية للجيلاتيناز إذا تطورت منطقة معتمة حول المستعمرة.

تنقية eDNA وعديد السكاريد

تم حصاد eDNA من الثقافات كما هو موضح سابقًا 16 مع التعديلات. تم تخفيف الثقافات الليلية بنسبة 1:50 في وسط طازج بالإضافة إلى المضادات الحيوية و cCF10 ونمت لمدة 4 ساعات. تم تكوير خلايا 1 مل بالطرد المركزي (17000 × ز لمدة دقيقتين) ، وتم تمرير المواد الطافية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. تم ترسيب الحمض النووي باستخدام الأيزوبروبانول والإيثانول وتعليقه في 10 ملي مولار من Tris-HCl pH 8.0. تم قياس كمية الحمض النووي المزدوج الشريطة باستخدام مجموعة مقايسة Quant-iT PicoGreen dsDNA (Thermo Fisher Scientific) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تخفيف الثقافات ومطليها لتحديد CFU / mL ، وتم التعبير عن القيم على أنها مضان لكل CFU / mL.

تم عزل عديد السكاريد كما هو موصوف سابقًا ، 25 تم فصله باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد الأصلي ، وتم تلوينه باستخدام Stains-All (Sigma). الصور المعروضة هي صور تمثيلية من ثلاث تجارب مستقلة. تم تصوير المواد الهلامية بتدرج الرمادي على BioRad Gel Doc EZ Imager.

تعبير البروتين وتنقيته

تم تحويل مشتقات pET28b + التي تشفر متغيرات Bph-H6 إلى بكتريا قولونية خلايا BL21 (DE3) ونمت في LB / كاناميسين. نمت الثقافات عند 37 درجة مئوية على شاكر أرضية منصة Innova 2300 (New Brunswick Scientific) بسرعة 150 دورة في الدقيقة إلى OD600 0.4-0.6 ، وعند هذه النقطة تمت إضافة 1.5 ملي مولار من الأيزوبروبيل β- d -1-ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) للحث على التعبير البروتيني لمدة 3 ساعات. تم حصاد الخلايا بالطرد المركزي (6371 × ز لمدة 10 دقائق) ومعلق في محلول تحلل (20 ملي تريس - حمض الهيدروكلوريك 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.01 ٪ تريتون X-100 ، 20 ملي إيميدازول ، 100 ميكروغرام / مل ليزوزيم ، 1 ملي PMSF ، 10 U / مل DNase). تم كسر الخلايا عن طريق الصوتنة في حمام جليدي باستخدام سونيكاتور QSonica Q500 (طرف 1.6 مم ، سعة 40 ٪ ، 10 ثوانٍ / 20 ثانية لإجمالي 2 دقيقة من وقت النبض) ، وتم تكوير حطام الخلية بالطرد المركزي (30000 × ز لمدة 15 دقيقة). تم نقل المواد الطافية إلى أنابيب تحتوي على راتنج NTA النيكل المغسول مسبقًا (Qiagen) وتم تحضينها بالتناوب عند 4 درجات مئوية. تم غسل الراتينج 3 × مع محلول غسيل (20 ملي مولار Tris – HCl pH 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.01٪ تريتون X -100 ، 20 ملي مولار إيميدازول) ، تمت التصفية من البروتينات (20 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك pH 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 250 ملي مولار إيميدازول). تم تحليل الكسور من أجل النقاء باستخدام Tris-glycine SDS-PAGE ودالتها مقابل محلول سعة 2 لتر يحتوي على Tris-HCl pH 7.5 ، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. تم تخزين البروتينات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في محلول غسيل الكلى بالإضافة إلى 50٪ من الجلسرين (حجم / حجم).

تنبؤات الهيكل وفحوصات الفوسفاتيز

تم استخدام تسلسل الأحماض الأمينية Bph كمدخل لـ Phyre2 55 و PaperBLAST. تم استيراد 57 محاذاة عالية الثقة إلى Pymol. 78 تم إنشاء جميع صور الهيكل باستخدام Pymol. بالنسبة لمقايسات الفوسفاتيز في المختبر ، تم خلط متغيرات Bph-H6 المنقى (1 ميكرومتر) مع الركائز المشار إليها (100 ميكرومتر) في لوحة 96 بئر تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول التفاعل المؤقت (20 ملي مولار من Tris - HCl pH 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، و 10 مم من الكاتيونات المعدنية ثنائية التكافؤ المشار إليها) لكل بئر. تم تحضين التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تمت إضافة 4.2٪ موليبدات الأمونيوم في 4 مولار حمض الهيدروكلوريك و 0.045٪ أخضر المالاكيت (20 ميكرولتر لكل منهما) إلى كل بئر متبوعًا بـ 1.4 ميكرولتر 1٪ تريتون. الامتصاصية عند 640 نانومتر (أ640) باستخدام قارئ لوحة BioTek Synergy H1. أ640 تم تطبيع القيم لعناصر تحكم الركيزة فقط ، وتم تحديد كمية الفوسفات الحر بالنسبة لمنحنى قياسي. تم إجراء التجارب على المسوخات النقطية Bph-H6 والكاتيونات ثنائية التكافؤ بالتوازي ، وبالتالي فإن تفاعلات التحكم هي نفسها.

تجزئة الخلايا ورحلان البروتين الكهربائي والبقع الغربية

لتوليد ليسات البروتين E. faecalis، تم تخفيف الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD600 0.05 في وسط طازج وحضنت عند 37 درجة مئوية (46 درجة مئوية لتعبير بروتين Ace). في النقاط الزمنية المشار إليها في الشكل 4 أ ، ما يعادل 1 مل من الخلايا عند OD600 = 1.0 تم تكويرها في جهاز طرد مركزي منضدية (9615 × ز لمدة دقيقتين). تم إجراء البقع الغربية مع العينات التي تم حصادها في 2 و 4 ساعات ، وتم إجراء تلطيخ Pro-Q Diamond على العينات التي تم حصادها في 4 ساعات. تم إعادة تعليق الكريات في محلول مؤقت سعة 100 ميكرولتر (10 ملي مولار (درجة الحموضة 8.0) ، 1 ملي مولار EDTA ، 25 ٪ سكروز ، 15 مجم / مل من الليزوزيم) وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم خلط هذا المعلق مباشرة مع 2 × عينة عازلة Laemmli (BioRad) لمحلول الخلية الكاملة أو بالطرد المركزي (17000 ×) ز لمدة 1 دقيقة) لفصل بيليه (بروتوبلاست) من المادة طافية (مستخلص جدار الخلية). تم ترسيب البروتينات المفرزة في المادة الطافية المزروعة بخلط حجم واحد من المادة الطافية مع 0.25 حجم من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك مبرد بنسبة 100٪ على الجليد. تم تكوير البروتينات المترسبة في جهاز طرد مركزي منضدية 4 درجات مئوية (17000 × ز لمدة 10 دقائق) وغسلها مرتين بالأسيتون. تم تجفيف الحبيبات وإعادة تعليقها في محلول تحلل اليوريا (8 م يوريا ، 20 ملي مولار من تريس- حمض الهيدروكلوريك 7.5 ، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم). تم تحليل البروتينات بواسطة SDS – PAGE باستخدام 10٪ من المواد الهلامية Tris – glycine. تم خلط العينات مع محلول لاملي 2 × وتم تسخينها عند 95 درجة مئوية قبل التحميل. تم تشغيل المواد الهلامية عند 110 فولت ، ملطخة بـ Coomassie ، وتم تصويرها على BioRad Gel Doc EZ Imager.

تم إجراء الكشف عن البروتين الفوسفوري باستخدام Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain (ThermoFisher Scientific). تم تقسيم محلولات الخلية الكاملة إلى كسور غير معالجة ومعالجة ، والتي عولجت بالكلوروفورم والميثانول وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم فصل العينات بواسطة SDS – PAGE وملطخة وموجهة باستخدام بروتوكول معدل تم وصفه مسبقًا. تم التقاط 79 صورة باستخدام قناة 600 نانومتر على نظام التصوير Licor Odyssey FC (LI-COR Biosciences). ثم تم تلطيخ الجل مع Coomassie وتصويره.

بالنسبة للبقع الغربية ، تم نقل البروتينات إلى أغشية النيتروسليلوز (بروتران ، سيجما الدريتش) باستخدام محلول تاوبين (0.05٪ SDS ، 5-20٪ ميثانول). تم حظر الأغشية باستخدام حليب 1 ٪ مذاب في KPBS مكملًا بنسبة 0.01 ٪ Tween-20 (KPBST ، درجة الحموضة 7.4). كانت الأجسام المضادة الأولية (1: 20000 مضاد لـ Ace و anti-SA80 ، و 1: 10000 anti-EbpC و Anti-PrgB) والأجسام المضادة الثانوية (1: 20000 بيروكسيديز الفجل (HRP) - المعزة المضادة للأرانب ، Invitrogen # 65-6120) مخفف في KPBST. تم تطوير الإشارة باستخدام ركيزة SuperSignal West Pico chemiluminescent (Thermo Scientific) ، وتم الحصول على الصور باستخدام مرشح الإضاءة الكيميائية على نظام Licor Odyssey FC للتصوير. تظهر البقع الغربية غير المقصوصة في الأشكال التكميلية. 6-9. تم اشتقاق جميع العينات لطخة غربية معينة من نفس التجربة ومعالجتها بالتوازي.

قياس الطيف الكتلي

تم تخفيف الثقافات بين عشية وضحاها في وسط طازج واستزراعها لمدة 4 ساعات ، وعند هذه النقطة تم تحضير محللات الخلايا للهلام الكهربائي كما هو موضح أعلاه. تم استخراج شرائح الجل من المواد الهلامية Tris-glycine SDS-PAGE الملطخة كوماسي بشفرة حلاقة وتم إرسالها إلى مركز كلية العلوم البيولوجية بجامعة مينيسوتا لقياس الطيف الكتلي والبروتيوميات من أجل هضم التربسين داخل الهلام والتحليل البروتيني بواسطة LC / MS –MS على مطياف الكتلة LTQ Orbitrap Velos. تم تحليل جميع عينات MS / MS باستخدام Sequest (XCorr Only) (Thermo Scientific ، الإصدار IseNode في Proteome Discoverer 2.2.0.388) للبحث E. faecalis بروتينات OG1RF التي تفترض إنزيم التريبسين الهضمي مع تحمل كتلة أيونية للجزء 0.100 دا وتسامح أيون أصلي قدره 50 جزء في المليون. تم استخدام Scaffold (الإصدار Scaffold_4.8.9 ، Proteome Software Inc.) للتحقق من صحة الببتيد المستند إلى MS / MS (& gt77.0 الاحتمال ، FDR & lt 1.0٪ بواسطة سقالة FDR المحلي) والبروتين (& gt 97.0٪ الاحتمال ، FDR & lt 1.0 ٪ ، على الأقل اثنين من الببتيدات المحددة) التعريفات. تم تعيين احتمالات البروتين بواسطة خوارزمية Protein Prophet. تمت مقارنة 80 بالمائة من الأطياف الإجمالية بين OG1RF و Δbph عينات لتحديد البروتينات المعبر عنها تفاضليًا الأكثر وفرة.

منحنيات النمو ومقايسات حساسية المضادات الحيوية

تم إجراء النمو في الوسائط المكملة بالجلوكوز أو الأرجينين باستخدام وسط شبه اصطناعي موصوف سابقًا. نمت 52 سلالة في TSB-D ، حبيبات في جهاز طرد مركزي منضدية (9615 × ز لمدة دقيقتين) ، وغسلها في وسط شبه صناعي. تم تخفيف الخلايا إلى OD البداية600 0.05 في 200 ميكرولتر من الوسط الأساسي أو الوسيط المضاف إليه 1٪ جلوكوز أو 1٪ أرجينين في صفيحة 96 بئر ، والتي تم غلقها بغشاء مانع للتسرب Microseal B PCR (Bio-Rad). التطوير التنظيمي600 تم أخذ القياسات على فترات 15 دقيقة لمدة 15 ساعة في قارئ لوحة BioTek Synergy H1. لفحوصات حساسية المضادات الحيوية ، نمت السلالات في TSB-D وتعديلها إلى OD600 = 0.05 في 200 ميكرولتر من التخفيفات ذات الشقين من المضادات الحيوية (أعلى تركيزات: سيفوكسيتين ، 512 ميكروغرام / مل أوكساسيللين ، 64 ميكروغرام / مل) في لوحة 96 بئر. تم تنفيذ منحنيات النمو 15 ساعة كما هو موضح أعلاه ، والانتهاء من OD600 تم تقسيم القيمة لكل شرط بواسطة OD600 للثقافة غير المعالجة.

اقتران

تمت زراعة الثقافات الليلية للمتبرعين والمتلقين في TSB-D أو TSB-D / tet ، وتم تخفيفها بنسبة 1:10 في TSB-D الطازج بدون مضادات حيوية ، وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. Cells were mixed at a 1:9 donor:recipient ratio in a microfuge tube. At indicated time points, aliquots were removed, diluted in KPBS supplemented with 2 mM EDTA, and plated on selective antibiotic agar plates.

Microscopy

E. faecalis biofilms were grown on Aclar fluoropolymer substrates essentially as described previously. 15,24 Overnight cultures were diluted 1:50 in TSB-D medium supplemented with 50 ng/mL cCF10 and cultured for 6 h in a 24-well polystyrene plate (Corning) at 100 rpm on a MaxQ 2000 tabletop shaker (Thermo Scientific). Cells were stained with 10 μg/mL Hoechst 33342 (Molecular Probes/Thermo Fisher Scientific), and images were captured with a Zeiss AX10 wide-field microscope using Zen2 (blue edition) software with a ×20 0.8-numerical-aperture objective. Images were imported as grayscale and false-colored (LookUp Table: cyan) using Fiji 81 and cropped to 500 × 500 pixels using GIMP (https://www.gimp.org/).

تحليل احصائي

For experiments where numerical values are presented, individual data points from three independent biological replicates are shown. Error bars indicate standard error of the mean. Statistical significance was assessed using analysis of variance (ANOVA) with corrections for multiple comparisons by controlling the false discovery rate. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism. For assays where qualitative images are shown, experiments were performed in triplicate, and representative images are shown.


Advances in scientific research: في المختبر و في الجسم الحي biofilm detection methods

Many in vitro and in vivo methods have been used for a better understanding of the biology of biofilms and their detection. Colorimetric assays are the most widely used ones and commonly applied in studies related to the development and susceptibility of biofilms to drugs and the quantification of specific biofilm structures (Shukla and Rao 2017 ). These methods, although requiring significant amounts of time and a high number of trained staff, are important allies in identifying biofilm formation and for a better understanding, mainly of the susceptibility of biofilms to anti-biofilms and antimicrobial compounds, which can assist in the development of new methods of diagnosis and treatment that can be useful in clinical practice (Qu وآخرون. 2017). The main in vitro and in vivo tests used by the academic community are listed in Table 1 and described below.


Future perspective

We are only beginning to understand the biology of commensal bacteria such as S. البشرة and their function in the maintenance of human health. Current microbiome studies will allow us to first understand and identify the ‘players’ that utilize the human skin as their ecological niche. It is unclear whether each species has a particular role in maintenance of and integrity of the skin structure or, possibly, immune development [2]. Second, the utilization of newer technologies will enable investigators to further probe each stage of biofilm formation to identify new strategies to inhibit biofilm formation on biomaterials. Many strategies, some very successful, have addressed inhibiting the initial adherence step of biofilm formation. Although vaccines against staphylococcal targets have proven to be problematic, multivalent vaccines against S. البشرة should certainly target factors that are important for adherence to biomaterials. A virtually untapped area of staphylococcal biofilm research has been the identification of factors that are responsible for biofilm maturation. These maturation processes may include tower formation or the shift from a primarily aerobic metabolism to a microaerobic/anaerobic condition. It is hypothesized that inhibition of maturation may facilitate increased phagocytosis by the innate immune system or susceptibility to antibiotics. Newer technologies, such as laser capture microdissection microscopy, are needed to address the heterotypic nature of biofilms and study the single cell/regional response(s) to the nutrient and oxygen gradients that are generated by biofilms [123]. It is hypothesized that phenotypic variation is a byproduct of maturation and metabolic status of the biofilm. Importantly, future studies need to address the function/role of PIA-, Aap-, Bhp- or Embp-dependent S. البشرة biofilms. Are all of these biofilms clinically relevant and recalcitrant to the innate immune system and the bactericidal action of antibiotics? Finally, further studies are required to address the interaction of PGA and other biofilm accumulation factors (PIA, Aap, Embp and Bhp) as the loss of PGA appears to dampen the anti-innate immune system properties of a PIA-dependent biofilm [7].

Executive summary

المكورات العنقودية البشروية

المكورات العنقودية البشروية is a commensal bacterium living on the skin of humans. It is a significant cause of biomaterial-related infections.

Biofilm synthesis is a primary virulence factor. Staphylococcal biofilm is recalcitrant to host innate immune response and antibiotic treatment therefore, treatment of S. البشرة infections frequently requires removal of offending device.

Genome structure of S. البشرة

The genomes of two S. البشرة isolates have been sequenced, ATCC12228 and RP62A.

The genome sequence reflects the ecological niche (skin) of S. البشرة by encoding genes related to osmoprotection.

أضع ثقتي في Staphylococcus aureus, S. epidermidis produces few virulence factors. Most are related to biofilm synthesis or resistance to host innate immune system.

Most clinical S. البشرة isolates are part of a large clonal complex defined as CC2.

S. البشرةbiofilm formation

Lack of virulence of S. البشرة أضع ثقتي في بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية may be related to ease of transmission from host to host.

Many virulence factors produced by S. epidermidis, including phenol-soluble modulins and the three-component antimicrobial peptide-sensing system, help to mediate resistance to the innate immune system.

Biofilm formation in staphylococci is typically viewed as a four-step mechanism: adherence, accumulation, maturation and detachment.

A factor complicating experimental analysis of S. البشرة biofilm formation is that not all isolates encode factors demonstrated to augment biofilm formation, including icaADBC, aap, embp و bhp.

Adherence to biomaterials is mediated by both nonspecific and specific interactions. Specific adhesins include the bifunctional adhesins/autolysins AtlE/Aae and the MSCRAMM proteins SdrG, SdrF and Embp.

The best studied accumulation factor is polysaccharide intercellular adhesin (PIA) synthesized by gene products of the icaADBC أوبرون. icaADBC is transcriptionally regulated by multiple factors, demonstrating that PIA synthesis is tied to metabolic status of the bacterium.

S. البشرة strains have also been isolated from clinically relevant infections that do not synthesize PIA, suggesting that other factors can replace PIA in the biofilm accumulation phase. Aap and Bhp are two identified proteins that can function in this role.

Little is known regarding the maturation phase of staphylococcal biofilm synthesis, but some data suggest that arginine catabolism is important. Phenotypic variation may be a by-product of biofilm maturation and tower formation.

Dispersal of both بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية و S. البشرة biofilms is agr متكل. ومع ذلك، في S. epidermidis, dispersal is related to synthesis of phenol-soluble modulins and δ-toxin, whereas بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية dispersal is related to protease production.

Poly-γ-DL-glutamic acid

Poly-γ-DL-glutamic acid is a virulence factor not found in بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية that protects S. البشرة against high salt concentrations in addition to mediating resistance to antimicrobial peptides and phagocytosis.


تثبيط الزائفة الزنجارية Biofilm Formation by Traditional Chinese Medicinal Herb Herba patriniae

New antimicrobial agents are urgently needed to treat infections caused by drug-resistant pathogens and by pathogens capable of persisting in biofilms. The aim of this study was to identify traditional Chinese herbs that could inhibit biofilm formation of الزائفة الزنجارية, an important human pathogen that causes serious and difficult-to-treat infections in humans. أ luxCDABE-based reporter system was constructed to monitor the expression of six key biofilm-associated genes in P. الزنجارية. The reporters were used to screen a library of 36 herb extracts for inhibitory properties against these genes. The results obtained indicated that the extract of Herba patriniae displayed significant inhibitory effect on almost all of these biofilm-associated genes. Quantitative analysis showed that H. patriniae extract was able to significantly reduce the biofilm formation and dramatically altered the structure of the mature biofilms of P. الزنجارية. Further studies showed H. patriniae extract decreased exopolysaccharide production by P. الزنجارية and promoted its swarming motility, two features disparately associated with biofilm formation. These results provided a potential mechanism for the use of H. patriniae to treat bacterial infections by traditional Chinese medicines and revealed a promising candidate for exploration of new drugs against P. الزنجارية biofilm-associated infections.

بيان تضارب المصالح

The authors declare that they have no competing interests regarding the publication of this paper.

الأرقام

تعبيرات عن algU , algA…

تعبيرات عن algU , algA , pslM, و bdlA in medium with water…

(a) Inhibition of biofilm production…

(a) Inhibition of biofilm production of PAO1 by H. patriniae extract. The control…

Photograph of exopolysaccharide production on…

Photograph of exopolysaccharide production on Congo red plates. (a) Without H. patriniae .…

Swarming motility of PAO1. (a)…

Swarming motility of PAO1. (a) PAO1 grown with H. patriniae was at right…


دعم المعلومات

S1 Fig. Comparative analysis of becA-R biofilm gene cluster from ب. mallei ATCC23344, ب. pseudomallei 1026b, and ب. thailandensis E264.

ال becA-R gene cluster from the sequenced genomes of ب. mallei ATCC23344 (top), ب. pseudomallei 1026b (middle), and ب. thailandensis E264 (bottom). Genes for becA-R من ب. pseudomallei 1026b, Bp1026b_I2907-Bp1026b_I2927 (becA-ر) are aligned with BMA0027-BMA0048 from ب. mallei ATCC and ب. thailandensis E264 BTH_I0520-BTH_I0537. Coding sequences are depicted by arrows per positive or negative strand orientation and sizes of genes and intergenic regions are to scale. The results of BLASTN annotations with minimum identity of 60% and threshold E-value of 1E-3 are aligned to regions of similarity. Red bars depict sequence inversions and blue bars depict direct homology in a color density gradient.

S2 Fig. Comparative analysis of bce-I و bce-II gene clusters from ب. pseudomallei و ب. vietnamiensis ش 4.

The cepacian biosynthesis (bce-I و bce-II) gene clusters from the sequenced genomes of ب. pseudomallei 1026b (top) and ب. vietnamiensis G4 (bottom). (A) Genes for bce-I من ب. pseudomallei 1026b, Bp1026b_II1966-Bp1026b_II1956 are aligned with Bcep1808_4200-Bcep1808_4210 from ب. vietnamiensis ش 4. (B) Genes for bce-II من ب. pseudomallei 1026b, Bp1026b_II1796-Bp1026b_II1807 are aligned with Bcep1808_4471-Bcep1808_4480 from ب. vietnamiensis ش 4. Coding sequences are depicted by arrows per positive or negative strand orientation and sizes of genes and intergenic regions are to scale. The results of BLASTN annotations with minimum identity of 60% and threshold E-value of 1E-3 are aligned to regions of similarity. Red bars depict sequence inversions and blue bars depict direct homology in a color density gradient.

S3 Fig. Growth curves of ب. pseudomallei 1026b biofilm mutants.

Overnight cultures were grown in LB and cultures were adjusted to a final OD600 0.1. Bacteria were grown at 37°C with shaking. Readings were taken every hour (A-D).

جدول S1. Biofilm-defective transposon mutants identified in primary screen.

Columns presented are the old NCBI gene locus, new NCBI gene locus, K96243 gene locus, gene description as found in burkholderia.com [38], gene locus, and if the gene was noted to have increased gene expression in a recent transcriptomic study [66]. Gene loci in bold represent transposon mutants that are predicted to be the first gene in an operon and were studied in detail.

الجدول S2. Strains and plasmids used in the study.

S3 Table. Percent nucleotide and amino acid identities of the becA-R biofilm exopolysaccharide gene clusters from ب. pseudomallei 1026b as compared to ب. mallei ATCC2334, ب. thailandensis E264, and ب. cenocepacia J2315 exopolysaccharide gene clusters.

S4 Table. Percent nucleotide identity of the bce-I و bce-II gene clusters from ب. pseudomallei 1026b compared to ب. vietnamiensis G4, ب. cenocepacia J2315, ب. thailandensis E264, and ب. mallei ATCC23344.

S5 Table. نشرت ب. pseudomallei genes that contribute to biofilm formation.

The asterisk indicates that a transposon insertional mutant was identified in the screen described in the current study.


شاهد الفيديو: العلاج الجيني في أوروبا وفرصه المستقبلية. المستقبل الآن (شهر فبراير 2023).