معلومة

المحاضرة 23: المسوخ والطفرات 2018 - علم الأحياء

المحاضرة 23: المسوخ والطفرات 2018 - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

المحاضرة 23: المسوخ والطفرات 2018

تطوير والتحقق من ناقل CRISPR / Cas9 الفعال لعزل المحولات الإيجابية والطفرات الخالية من الجينات بشكل فعال في مجموعة واسعة من الأنواع النباتية

تعد تقنية كريسبر / كاس 9 أداة ذات قيمة عالية في إنشاء مواد جديدة لكل من الأبحاث الأساسية والتطبيقية. في السابق ، نجحنا في التوليد الفعال لطفرات في napus براسيكا باستخدام ناقل CRISPR / Cas9 متاح pKSE401، في حين أن عزل المسوخات الخالية من Cas9 عملية شاقة وغير فعالة. هنا ، قمنا بإدراج علامة مضان (sGFP) يقودها التأسيسي 35 ثانية المروج إلى pKSE401 لتسهيل الشاشة المرئية للطفرات. تم تسمية هذا المتجه المعدل pKSE401G واختبارها في العديد من أنواع نباتات الديكوت ، بما في ذلك أرابيدوبسيس, قيلولة, فراغاريا فيسكا (الفراولة) و جلايسين ماكس (فول الصويا). وبالتالي ، تم تحديد النباتات الإيجابية GFP بسهولة من خلال فحص الفلورة في جميع هذه الأنواع. من بين هذه النباتات إيجابية GFP ، تراوح متوسط ​​تواتر الطفرة من 20.4 إلى 52.5 ٪ في أرابيدوبسيس و قيلولة ذات التحول المستقر ، وكانت 90.0٪ في الفراولة و 75.0٪ في فول الصويا مع التحول العابر ، مما يشير إلى أن كفاءة التحرير تشبه كفاءة المتجه الأصلي. علاوة على ذلك ، تم تحديد المسوخات الخالية من الجينات بشكل كافٍ في أرابيدوبسيس في الجيل T2 و قيلولة في الجيل T1 استنادًا إلى عدم وجود مضان GFP ، وكانت هذه المسوخ قابلة للانتقال بثبات إلى الجيل التالي دون حدوث طفرات مستحثة حديثًا. جماعي، pKSE401G يوفر لنا أداة فعالة للتعرف بسهولة على المحولات الأولية الإيجابية والطفرات الخالية من الجينات في الأجيال اللاحقة في مجموعة واسعة من أنواع نباتات الديكوت.

الكلمات الدالة: Arabidopsis B. napus CRISPR / Cas9 تحرير جينوم فول الصويا والفراولة الفحص البصري.

الأرقام

تصميم المتجه pKSE401G ...

تصميم المتجه pKSE401G . (أ) تمثيل تخطيطي لـ pKSE401G المتجه…

جيل ال CR-rpk1 المسوخ في ...

جيل ال CR-rpk1 المسوخ في أرابيدوبسيس . (أ) المواقع المستهدفة من sgRNA1 ...

شاشة مرئية وتوصيف ...

شاشة مرئية وتوصيف خالية من Cas9 CR-rpk1 نباتات الجيل T2. (أ)…

جيل ال CR-بنعرف 2 المسوخ في ...

جيل ال CR-بنعرف 2 المسوخ في قيلولة . (أ) محاذاة تسلسل الترميز الجزئي ...

شاشة مرئية وتوصيف ...

شاشة مرئية وتوصيف خالية من Cas9 CR-بنعرف 2 المسوخ في الجيل T1. (أ)…

النمط الظاهري والنمط الجيني للفراولة ...

تحول النمط الظاهري والنمط الجيني لفاكهة الفراولة بشكل عابر CR-FveMYB10. (أ) الهدف…

النمط الظاهري والنمط الجيني لفول الصويا ...

النمط الظاهري والنمط الجيني لجذور فول الصويا تتحول بشكل عابر مع CR-GmNFR1a . (أ) ال…


تنشيط غير نمطي لبروتين G Gα ف بواسطة طفرة الأورام Q209P

كان الدور المسبب لطفرات مسار مستقبلات البروتين المقترن GPCR في الورم الميلانيني العنبي (UM) راسخًا. تحمل جميع UMs تقريبًا طفرة نشطة في مسار GPCR بوساطة بروتينات G من Gف / 11 الأسرة ، بدء الورم الدافع وربما تطور النقيلي. وبالتالي ، فإن استهداف هذا المسار يحمل وعدًا علاجيًا لإدارة UM. ومع ذلك ، فإن الاستهداف المباشر لـ Gα المسرطنةف / 11 المسوخات ، الموجودة في 90٪ من UMs ، معقدة بسبب الاعتقاد بأن هذه الطفرات تشبه هيكليًا Gα النشطف / 11 WT. تأسست هذه الفكرة بقوة على الدراسات السابقة التي تميز طفرات Gα والتي فيها الجلوتامين التحفيزي المحفوظ (Gln-209 في Gαف) بالليوسين ، مما يؤدي إلى نقص وظيفة GTPase والتنشيط التأسيسي. في حين أن Q209L يمثل ما يقرب من نصف طفرات GNAQ في UM ، فإن Q209P متكرر مثل Q209L ويعزز أيضًا تكوين الورم ، ولكن لم يتم تمييزه على المستوى الجزيئي. هنا ، قمنا بتمييز الخصائص الكيميائية الحيوية والإشارات لـ Gαف Q209P ووجد أنه أيضًا يعاني من نقص في GTPase وينشط إشارات المصب بكفاءة مثل Gαف Q209L. ومع ذلك ، فإن Gαف يحتوي Q209P على ميزات جزيئية ووظيفية مميزة ، بما في ذلك منطقة التبديل II من Gαف Q209P ، الذي اعتمد شكلاً مختلفًا عن شكل Gαف Q209L أو WT Gα النشطف، مما أدى إلى تغيير الارتباط بالمؤثرات ، Gβγ ، والمنظمين لبروتينات تأشير البروتين G (RGS). تكشف النتائج التي توصلنا إليها أن الخصائص الجزيئية لـ Gαف Q209P تختلف اختلافًا جوهريًا عن تلك الموجودة في Gα النشطة الأخرىف البروتينات ويمكن الاستفادة منها كنقطة ضعف محددة لـ 20٪ من UMs تحمل هذه الطفرة.

الكلمات الدالة: مستقبلات مقترنة بالبروتين G (GPCR) GNAQ GTPase خلية بيولوجية للسرطان تشير إلى الورم الميلانيني البروتيني المتغاير G بروتين الورم الميلانيني.

بيان تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة


تفسد طفرات اللوكيميا البشرية ولكنها لا تلغي وظيفة GATA-2

من خلال تحفيز توليد ووظيفة الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية ، يتحكم المنظم الرئيسي لتكوين الدم GATA-2 في إنتاج جميع أنواع خلايا الدم. متغاير الزيجوت جاتا 2 الطفرات تسبب نقص المناعة ، متلازمة خلل التنسج النقوي ، وسرطان الدم النخاعي الحاد. جاتا 2 عادة ما تؤدي الطفرات المرضية إلى تعطيل بقايا الأحماض الأمينية التي تتوسط في ربط الحمض النووي أو رابطة الدول المستقلة-عناصر حيوية داخل جاتا 2 محسن intronic ، مما يشير إلى آلية عدم كفاية الفرد من التسبب في المرض. تحدث الطفرات أيضًا في جاتا 2 تختلف مناطق الترميز عن إصبع الزنك الكربوكسيل المرتبط بالحمض النووي (إصبع C) ، بما في ذلك إصبع الزنك الأميني (N-finger) ، ولم يتم إنشاء وظيفة N-finger. ما إذا كانت الطفرات المتميزة تؤثر بشكل تفاضلي على آليات GATA-2 غير معروفة. هنا ، نوضح أن طفرات N-finger قللت من شغل الكروماتين GATA-2 وتخفيف تنظيم الجين المستهدف. قمنا بتطوير مقايسة تكميلية وراثية لتحديد وظيفة GATA-2 في الخلايا السلفية النخاعية من جاتا 2 -77 الفئران متحولة محسن. أدى تكميل GATA-2 إلى زيادة التمايز النخاعي والكريات الحمر. في حين أن طفرات مرض GATA-2 لم تكن مؤهلة للحث على تمايز الكريات الحمر بين أسلاف Lin-Kit + النخاعي ، بشكل غير متوقع ، عززوا تمايز النخاع الشوكي وانتشاره. نظرًا لأن نشاط تعزيز تكوين النخاع لطفرات GATA-2 تجاوز نشاط GATA-2 ، جاتا 2 الطفرات المرضية ليست مثبطة بشكل صارم. وبالتالي ، فإننا نقترح أن نموذج نقص الفردانية لا يفسر بشكل كامل التسبب المرضي المرتبط بـ GATA-2 ، ودمج العيوب النوعية والكمية التي يسببها جاتا 2 الطفرات تكمن وراء الأنماط الظاهرية المعقدة للأمراض المعتمدة على GATA-2.

الكلمات الدالة: ابيضاض الدم AML GATA-2 MDS هو سرطان الدم.

بيان تضارب المصالح

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

الأرقام

تخفف طفرات سرطان الدم GATA-2 N-finger ...

تعمل طفرات سرطان الدم GATA-2 N-finger على إضعاف شغل الكروماتين وتنشيط الجين المستهدف. ( أ…

المحددات الهيكلية لوظيفة GATA-2 ...

المحددات الهيكلية لوظيفة GATA-2. ( أ , العلوي ) تمثيل تخطيطي لـ ...

طفرات سرطان الدم GATA-2 تزيد من الخلايا النخاعية ...

تزيد طفرات ابيضاض الدم GATA-2 من نشاط الخلايا السلفية النخاعية في الخلية الجينية الأولية ...

تحفز طفرات اللوكيميا GATA-2 تكوين النخاع ...

تحفز طفرات اللوكيميا GATA-2 تكوين النخاع خارج الجسم الحي. ( أ ) تمثيل تخطيطي لـ ...

طفرة اللوكيميا GATA-2 تزيد من الخلايا ...

يزيد طفرة اللوكيميا GATA-2 من تقدم دورة الخلية في مقايسة التكميل الجيني. (...

طفرات سرطان الدم GATA-2: اكتساب الوظيفة و ...

طفرات سرطان الدم GATA-2: عواقب اكتساب الوظيفة وفقدان الوظيفة. ( أ ) الأنشطة الجزيئية لـ ...


مناقشة

يُعتقد أن وظيفة كبح النمو في ABA هي مقايضة لتحسين التكيف مع الإجهاد (3 ، 33 ، 34). نظرًا لأن عمليات نمو النبات والتكيف مع الإجهاد تتعارض مع بعضها البعض من نواح كثيرة ، فمن المهم إقامة توازن بينهما يكون مناسبًا للبيئة. لذلك ، يجب أن يكون لمستويات ABA والإشارات تأثيرات كبيرة على كل من النمو والتكيف. قد يؤدي التعديل الجيني للتوازن عن طريق التلاعب بمستويات ABA و / أو إرسال الإشارات إلى إنتاج أصناف محاصيل مفيدة لتحسين الإنتاجية في بيئات معينة.

تعد PYLs حاليًا أكبر عائلة مستقبلات هرمون نباتي معروفة (35). في أرابيدوبسيس, 14 PYL تم تحديد الأعضاء ، وتم توثيق الوظائف الزائدة عن الحاجة وكذلك الوظائف التفاضلية للجينات (11 ، 26 –28 ، 35 ، 36). في الأرز ، 13 PYL تم توقع أعضاء (29 ، 30). تشير نتائجنا إلى وظائف تفاضلية وزائدة عن الحاجة لأعضاء مختلفين أيضًا. يوفر التمايز الوظيفي والتكرار إمكانية ضبط التوازن بين النمو ومقاومة الإجهاد لتحسين إنتاجية المحاصيل من خلال تحرير معين PYLس. في الأرز ، وجدنا أنه من بين بيل المسوخ pyl1 / 4/6 أظهر أفضل نمو ، مع الحفاظ على سبات البذور الطبيعي تقريبًا. خلال موجة الحر في صيف 2016 في حقل الأرز في شنغهاي ، على الرغم من نمو خمسة أضعاف إلى سبعة أضعاف بيل المسوخ كان متخلفًا بشكل متزايد ، pyl1 / 4/6 لا تزال المسوخات تنمو بشكل أفضل من النوع البري. هذا يشير إلى أن ملف pyl1 / 4/6 قد تكون الخطوط أكثر تسامحًا مع الطقس الحار من طفرات المجموعة الخماسية والسداسية والسبعة. تشير هذه النتائج إلى أن التوازن بين النمو والتكيف مع الإجهاد يتغير في المجموعة الأولى عالية الترتيب بيل المسوخ ، وأن التوازن الجديد في pyl1 / 4/6 تفضل النباتات مزيدًا من النمو ، بينما يكون التكيف مع الإجهاد أقل تعرضًا للخطر من المجموعة الأولى ذات الترتيب الأعلى بيل المسوخ.

أظهرت الدراسات السابقة ذلك أرابيدوبسيس ترتيب عالي بيل أظهرت الطفرات نموًا متخلفًا ، وأن عيب النمو هذا يمكن تحسينه عن طريق زيادة رطوبة بيئة النمو (25 ، 37). ومع ذلك ، لم يلاحظ تحسن النمو (مقارنة بالنوع البري) في أرابيدوبسيس بيل المسوخ (25). على الرغم من الأرز بشكل عام PYLs لها وظائف مماثلة ل أرابيدوبسيس PYLs في تعزيز سبات البذور وإغلاق الفم ، يبدو أنهما يختلفان في تأثيرهما على نمو النبات. من المحتمل أنه في ظل ظروف نمو حقل الأرز ، بعض الأرز PYLs تم اختياره ليكون له دور مهم بشكل خاص في تقييد نمو النبات. في المستقبل ، سيكون من المهم تحديد كيفية ارتباط PYL1 و PYL4 و PYL6 (خاصة PYL6) بتنظيم النمو في الأرز. في حقل الأرز ، حيث المياه غير محدودة ، يكون النتح أعلى pyl1 / 4/6 قد يساهم في نمو أسرع وعائد أعلى من خلال تسهيل ثاني أكسيد الكربون السريع2 الامتصاص ، مع تجنب الآثار السلبية لفقد الماء المفرط. لطالما اقترح مربو النباتات أن تحسين أداء المحاصيل في مناخات معينة يمكن تحقيقه عن طريق تقليل الاستجابات لـ ABA أو مستوى ABA الداخلي (34). ال pyl1 / 4/6 قد تمثل طفرات الأرز طريقة فعالة لتحقيق هذه النتيجة المرغوبة تاريخيًا.


تزعزع معظم الطفرات التي تسبب رنح مخيخي صبغي جسدي متنحي من النوع 16 (SCAR16) استقرار بروتين E3 ligase CHIP الذي يتحكم في جودة البروتين

يعزز تراكم البروتينات المشوهة تراكم البروتين وموت الخلايا العصبية في العديد من الأمراض التنكسية العصبية. لمواجهة تراكم البروتين الخاطئ ، تمتلك الخلايا العصبية مسارات تتعرف على البروتينات المعرضة للتجمع وتعيد طيها أو تحللها. يلعب E3 ligase الذي يحتوي على U-box ، وهو الطرف C للبروتين المتفاعل Hsc70 (CHIP) ، دورًا رئيسيًا في هذه العملية ، حيث يستهدف البروتينات الخاطئة للتحلل البروتوزومي. تلعب CHIP دورًا وقائيًا في نماذج الفئران للأمراض التنكسية العصبية ، وفي البشر ، تسبب الطفرات في CHIP ترنحًا صبغيًا صبغيًا متنحيًا من النوع 16 (SCAR16) ، وهو مرض تنكسي عصبي قاتل يتميز بترنح جذعي وأطراف يؤدي إلى عدم استقرار المشية. هنا ، قمنا بتحليل منهجي لطفرات CHIP التي تسبب SCAR16 ووجدنا أن معظم طفرات SCAR16 تزعزع استقرار CHIP. تسبب عدم الاستقرار هذا في حدوث عيوب خاصة بالطفرة في نشاط CHIP ، بما في ذلك زيادة تكوين الأوليغومرات القابلة للذوبان ، وتقليل التفاعلات مع المرافقين ، وتناقص انتشار الركيزة ، وانخفاض مستويات الحالة المستقرة في الخلايا. تمشيا مع انخفاض استقرار CHIP الذي يعزز اختلالها الوظيفي في SCAR ، استعادت معظم البروتينات الطافرة النشاط عندما تم إجراء الاختبارات تحت درجة حرارة انصهار المسوخ. كشفت نتائجنا معًا عن الأساس الجزيئي للعيوب الجينية في وظيفة CHIP التي تسبب SCAR. تشير رؤيتنا إلى أن المركبات التي تعمل على تحسين الثبات الحراري للمتغيرات الجينية CHIP قد تكون مفيدة في علاج المرضى الذين يعانون من SCAR.

الكلمات الدالة: الجزيئي تشبيرون مرض التنكس العصبي البروتين خلل بروتين ubiquitin ligase.

© 2018 من قبل الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية ، وشركة.

بيان تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة


مراجع

Hodgkinson A ، Eyre-Walker A. التباين في معدل الطفرة عبر جينومات الثدييات. نات ريف جينيت. 201112: 756–66.

Schuster-Bockler B، Lehner B. تنظيم الكروماتين له تأثير كبير على معدلات الطفرات الإقليمية في الخلايا السرطانية البشرية. طبيعة سجية. 2012488: 504-7.

Frigola J، Sabarinathan R، Mularoni L، Muinos F، Gonzalez-Perez A، Lopez-Bigas N. انخفاض معدل الطفرات في exons بسبب إصلاح عدم التطابق التفاضلي. نات جينيه. 201749: 1684–92.

برندرغاست جي جي ، كامبل إتش ، جيلبرت إن ، دنلوب إم جي ، بيكمور وا ، سيمبل كاليفورنيا. بنية الكروماتين وتطوره في الجينوم البشري. بي إم سي إيفول بيول. 20077: 72.

لانج جي ، موراي أ. ترتبط معدلات الطفرة عبر كروموسوم الخميرة في مهدها مع توقيت النسخ المتماثل. جينوم بيول إيفول. 20113: 799-811.

Stamatoyannopoulos JA، Adzhubei I، Thurman RE، Kryukov GV، Mirkin SM، Sunyaev SR. معدل الطفرة البشرية المرتبط بتوقيت تكرار الحمض النووي. نات جينيه. 200941: 393-5.

Chen CL و Rappailles A و Duquenne L و Huvet M و Guilbaud G و Farinelli L و Audit B و d'Aubenton-Carafa Y و Arneodo A و Hyrien O و Thermes C. تأثير توقيت النسخ على معدلات الاستبدال غير CpG و CpG في جينومات الثدييات. الدقة الجينوم. 201020: 447-57.

ويبر سي سي ، بينك سي جيه ، هيرست لد. تتميز نطاقات التكرار المتأخر باختلاف وتنوع أعلى في ذبابة الفاكهة السوداء. مول بيول إيفول. 201229: 873-82.

Supek F ، Lehner B. إصلاح عدم تطابق الحمض النووي التفاضلي هو الأساس لتغير معدل الطفرات عبر الجينوم البشري. طبيعة سجية. 2015521: 81-4.

هيرمان آر كيه ، دوركين ملحوظة. تأثير تحريض الجين على معدل الطفرات بواسطة ICR-191 في الإشريكية القولونية. J باكتيريول. 1971106: 543-50.

Park C ، Qian W ، Zhang J. دليل الجينوم لمعدلات الطفرات المرتفعة في الجينات المعبر عنها بشكل كبير. ممثل EMBO .201213: 1123–9.

Savic DJ ، Kanazir DT. تأثير الطفرة التأسيسية للحامض الهيستيدين على قابلية الطفرة التي تسببها الأشعة فوق البنفسجية داخل مشغل الهيستيدين في السالمونيلا تيفيموريوم. مول جينيه. 1972118: 45-50.

Chen X ، Yang JR ، Zhang J.Nascent RNA قابلة للطي يخفف من الطفرات المرتبطة بالنسخ. الدقة الجينوم. 201626: 50-9.

Hanawalt PC، Spivak G. إصلاح الحمض النووي المقترن بالنسخ: عقدين من التقدم والمفاجآت. بيول ريف مول خلية نات. 20089: 958-70.

Coulondre C، Miller JH، Farabaugh PJ، Gilbert W. الأساس الجزيئي للنقاط الساخنة لاستبدال القاعدة في الإشريكية القولونية. طبيعة سجية. 1978274: 775–80.

Aggarwala V ، Voight BF. يوضح نموذج سياق التسلسل الموسع على نطاق واسع التباين في مستويات تعدد الأشكال عبر الجينوم البشري. نات جينيه. 201648: 349-55.

Zhu YO ، Siegal ML ، Hall DW ، Petrov DA. تقديرات دقيقة لمعدل الطفرات والطيف في الخميرة. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014111: E2310–8.

Blake RD، Hess ST، Nicholson-Tuell J. تأثير الجيران الأقرب على معدل ونمط الطفرات النقطية العفوية. J مول إيفول. 199234: 189-200.

أولسون وك ، غورين AA ، لو XJ ، هوك LM ، زوركين ف. التشوه المعتمد على تسلسل الحمض النووي المستخلص من المجمعات البلورية للبروتين والحمض النووي. Proc Natl Acad Sci U S A. 199895: 11163–8.

Harteis S ، Schneider S. صنع الانحناء: بنية DNA الثلاثية وتفاعلات البروتين والحمض النووي. علوم Int J Mol. 201415: 12335-63.

Rohs R ، West SM ، Sosinsky A ، Liu P ، Mann RS ، Honig B. دور شكل الحمض النووي في التعرف على البروتين والحمض النووي. طبيعة سجية. 2009461: 1248–53.

Wang X ، Zhou T ، Wunderlich Z ، Maurano MT ، DePace AH ، Nuzhdin SV ، Rohs R. يشير تحليل التباين الجيني إلى تورط شكل الحمض النووي في تنقية الانتقاء. مول بيول إيفول. 201835: 1958–67.

لانج جي ، موراي أ. تقدير معدل الطفرة لكل زوج أساس في الخميرة Saccharomyces cerevisiae. علم الوراثة. 2008178: 67-82 https://doi.org/10.1534/genetics.107.071506.

Lee W ، Tillo D ، Bray N ، Morse RH ، Davis RW ، Hughes TR ، Nislow C. أطلس عالي الدقة لشغل النواة في الخميرة. نات جينيه. 200739: 1235-1244.

بولشوي أ ، مكنمارا ف ، هارينجتون ري ، تريفونوف إن. DNA منحني بدون A-A: تقدير تجريبي لجميع زوايا إسفين الحمض النووي الـ 16. Proc Natl Acad Sci U S A. 199188: 2312–6.

Wolfe KH ، Sharp PM ، Li WH. تختلف معدلات الطفرات بين مناطق جينوم الثدييات. طبيعة سجية. 1989337: 283-5.

Chen X، Chen Z، Chen H، Su Z، Yang J، Lin F، Shi S، He X. تقوم النيوكليوسومات بقمع الطفرات العفوية الأساسية - تحديدًا في حقيقيات النوى. علم. 2012335: 1235–8.

Smith T ، Ho G ، Christodoulou J ، Price EA ، Onadim Z ، Gauthier-Villars M ، Dehainault C ، Houdayer C ، Parfait B ، van Minkelen R ، et al. تباين واسع في معدل الطفرات بين الجينات البشرية وداخلها المرتبطة بمرض مندليان. همهمة موتات. 201637: 488-94.

Bouaoun L و Sonkin D و Ardin M و Hollstein M و Byrnes G و Zavadil J و Olivier M. TP53 الاختلافات في السرطانات البشرية: دروس جديدة من قاعدة بيانات IARC TP53 وبيانات الجينوميات. همهمة موتات. 201637: 865–76.

فارس إم إيه ، كين أوم ، توفت سي ، كاريتيرو-بوليت إل ، جونز جي دبليو. أدوار الجينوم الكامل والازدواج على نطاق صغير في التخصص الوظيفي لجينات Saccharomyces cerevisiae. بلوس جينيت. 20139: e1003176 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003176.

Pleasance ED و Cheetham RK و Stephens PJ و McBride DJ و Humphray SJ و Greenman CD و Varela I و Lin ML و Ordonez GR و Bignell GR et al. كتالوج شامل للطفرات الجسدية من جينوم السرطان البشري. طبيعة سجية. 2010463: 191-6.

شبكة أبحاث أطلس جينوم السرطان ، Weinstein JN ، Collisson EA ، Mills GB ، Shaw KR ، Ozenberger BA ، Ellrott K ، Shmulevich I ، Sander C ، Stuart JM. مشروع تحليل عموم السرطان لأطلس جينوم السرطان. نات جينيه. 201345: 1113–20.

Capuano F و Mulleder M و Kok R و Blom HJ و Ralser M. تم العثور على مثيلة DNA Cytosine في ذبابة الفاكهة السوداء ولكنها غائبة في Saccharomyces cerevisiae و Schizosaccharomyces pombe وأنواع الخميرة الأخرى. الشرج تشيم. 201486: 3697-702.

Jonsson H و Sulem P و Kehr B و Kristmundsdottir S و Zink F و Hjartarson E و Hardarson MT و Hjorleifsson KE و Eggertsson HP و Gudjonsson SA وآخرون. تأثير الوالدين على طفرات السلالة الجرثومية البشرية في 1548 ثلاثية من أيسلندا. طبيعة سجية. 2017549: 519–22 https://doi.org/10.1038/nature24018.

هاجرمان بي جيه. الانحناء الموجه بالتسلسل للحمض النووي. طبيعة سجية. 1986321: 449-50.

Koo HS، Wu HM، Crothers DM. انحناء الحمض النووي في الأدينين. مسالك الثايمين. طبيعة سجية. 1986320: 501-6.

Ulanovsky LE ، Trifonov EN. تقدير مكونات الإسفين في الحمض النووي المنحني. طبيعة سجية. 1987326: 720-2.

Luria SE ، Delbruck M. طفرات البكتيريا من حساسية الفيروس إلى مقاومة الفيروسات. علم الوراثة. 194328: 491-511.

ماكي هـ.أصول الطفرات العفوية: خصوصية واتجاهية الاستبدال الأساسي ، وتغير الإطار ، والطفرات البديلة المتسلسلة. Annu Rev Genet. 200236: 279-303.

الكسندروف إل بي ، نيك زينال إس ، ويدج دي سي ، كامبل بيجاي ، ستراتون إم آر. فك رموز تواقيع العمليات الطفرية الناشطة في سرطان الإنسان. مندوب الخلية. 20133: 246–59.

Lawrence MS و Stojanov P و Polak P و Kryukov GV و Cibulskis K و Sivachenko A و Carter SL و Stewart C و Mermel CH و Roberts SA وآخرون. التغايرية الطفرية في السرطان والبحث عن جينات جديدة مرتبطة بالسرطان. طبيعة سجية. 2013499: 214-8.

Polak P، Karlic R، Koren A، Thurman R، Sandstrom R، Lawrence M، Reynolds A، Rynes E، Vlahovicek K، Stamatoyannopoulos JA، Sunyaev SR. يشكل تنظيم الكروماتين الخلوي المنشأ المشهد الطفري للسرطان. طبيعة سجية. 2015518: 360-4.

هيرست لد ، سميث إن جي. هل الجينات الأساسية تتطور ببطء؟ كور بيول. 19999: 747-50.

هيرش إيه إي ، فريزر إتش بي. الاستغناء عن البروتين ومعدل التطور. طبيعة سجية. 2001411: 1046-9.

Wang Z، Zhang J. لماذا العلاقة بين أهمية الجينات ومعدل تطور الجينات ضعيفة للغاية؟ بلوس جينيت. 20095: e1000329.

Liao BY، Scott NM، Zhang J. تأثيرات جوهرية الجين ونمط التعبير وانضغاط الجينات على المعدل التطوري لبروتينات الثدييات. مول بيول إيفول. 200623: 2072–80.

تشانغ جي ، يانغ جونيور. محددات معدل تطور تسلسل البروتين. نات ريف جينيت. 201516: 409–20.

Li C، Qian W، Maclean CJ، Zhang J. مشهد اللياقة لجين الحمض الريبي النووي النقال. علم. 2016352: 837-40.

Puchta O ، Cseke B ، Czaja H ، Tollervey D ، Sanguinetti G ، Kudla G. شبكة التفاعلات المعرفية داخل الخميرة snoRNA. علم. 2016352: 840-4.

هو العاشر ، ليو ل. التطور. نحو التطور الجزيئي المرتقب. علم. 2016352: 769–70.

Wal M ، Pugh BF. رسم خرائط على مستوى الجينوم لمواقع الجينوم في الخميرة باستخدام MNase ChIP-Seq عالي الدقة. طرق الانزيم. 2012513: 233-50.

لانجميد ب ، سالزبيرج سي. محاذاة سريعة للقراءة مع Bowtie 2. طرق Nat. 20129: 357-9.

Wang Y و Song F و Zhu J و Zhang S و Yang Y و Chen T و Tang B و Dong L و Ding N و Zhang Q وآخرون. GSA: أرشيف تسلسل الجينوم. علم الجينوم علم البروتينات المعلوماتية الحيوية. 201715: 14-8.

لورنز آر ، برنهارت ش ، هونر زو سيدرديسين سي ، تافر إتش ، فلام سي ، ستادلر بي إف ، هوفاكير إيل. حزمة ViennaRNA 2.0. خوارزميات مول بيول. 20116: 26.

Chen S، Li K، Cao W، Wang J، Zhao T، Huan Q، Yang YF، Wu S، Qian W. Codon-Resolution analysis يكشف عن تأثير مباشر يعتمد على السياق للطفرات المترادفة الفردية على مستوى mRNA. مول بيول إيفول. 201734: 2944-58.

كريستي كر ، ونغ إس ، بالاكريشنان آر ، كوستانزو إم سي ، دولينسكي ك ، دوايت إس إس ، إنجل إس آر ، فييرباخ ب ، فيسك دي جي ، هيرشمان جي إي وآخرون. توفر قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces (SGD) أدوات لتحديد وتحليل التسلسلات من Saccharomyces cerevisiae والتسلسلات ذات الصلة من الكائنات الحية الأخرى. الدقة الأحماض النووية. 200432: D311–4.

Deutschbauer AM، Jaramillo DF، Proctor M، Kumm J، Hillenmeyer ME، Davis RW، Nislow C، Giaever G. آليات الاكتفاء الفرداني التي كشفت عنها التنميط الجينومي في الخميرة. علم الوراثة. 2005169: 1915-25 https://doi.org/10.1534/genetics.104.036871.

Qian W ، Ma D ، Xiao C ، Wang Z ، Zhang J. المشهد الجينومي والقرار التطوري لتعدد التعدد العدائي في الخميرة. مندوب الخلية. 20122: 1399–410 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2012.09.017.

Qian W ، Zhang J. دليل الجينوم للتكيف عن طريق الازدواجية الجينية. الدقة الجينوم. 201424: 1356–62 https://doi.org/10.1101/gr.172098.114.

Chatr-Aryamontri A و Oughtred R و Boucher L و Rust J و Chang C و Kolas NK و O'Donnell L و Oster S و Theesfeld C و Sellam A وآخرون. قاعدة بيانات تفاعل BioGRID: تحديث 2017. الدقة الأحماض النووية. 201745: D369–79.

Hart T ، Chandrashekhar M ، Aregger M ، Steinhart Z ، Brown KR ، MacLeod G ، Mis M ، Zimmermann M ، Fradet-Turcotte A ، Sun S ، et al. تكشف شاشات CRISPR عالية الدقة عن جينات اللياقة البدنية والتزامات السرطان الخاصة بالنمط الجيني. زنزانة. 2015163: 1515–26 https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.11.015.

Wang T، Birsoy K، Hughes NW، Krupczak KM، Post Y، Wei JJ، Lander ES، Sabatini DM. تحديد وتوصيف الجينات الأساسية في الجينوم البشري. علم. 2015350: 1096-101 https://doi.org/10.1126/science.aac7041.

هوانغ إن ، لي الأول ، ماركوت إم ، هيرلز مي. توصيف وتوقع قصور الفرد في الجينوم البشري. بلوس جينيت. 20106: e1001154 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1001154.

Friedel M و Nikolajewa S و Suhnel J و Wilhelm T. DiProDB: قاعدة بيانات لخصائص ثنائي النوكليوتيد. الدقة الأحماض النووية. 200937: D37-40.

Rehm HL و Berg JS و Brooks LD و Bustamante CD و Evans JP و Landrum MJ و Ledbetter DH و Maglott DR و Martin CL و Nussbaum RL et al. ClinGen - مورد الجينوم السريري. إن إنجل جي ميد. 2015372: 2235–42.

Duan C ، Huan Q ، Chen X ، Wu S ، Carey LB ، He X ، Qian W. يؤدي انخفاض انحناء الحمض النووي الداخلي إلى زيادة معدل الطفرات. أرشيف تسلسل الجينوم. 2018. http://bigd.big.ac.cn/gsa/browse/CRA000570. تاريخ الإصدار: 19 أبريل 2018.


يتحور البروتين LZTR1 في السرطانات البشرية وأمراض النمو. يتقارب العمل من مجموعتين الآن لإشراك البروتين في تنظيم الإشارات بواسطة guanosine triphosphatase RAS. ستيكلوف وآخرون. أظهر أن الفئران غير كافية ل LZTR1 تلخص جوانب المرض البشري متلازمة نونان. أظهرت دراساتهم البيوكيميائية أن LZTR1 مرتبط بـ RAS. يبدو أن LZTR1 يعمل كمحول يعزز انتشار RAS في كل مكان ، وبالتالي يثبط وظائف الإشارة الخاصة به. بيجينزان وآخرون. وجدت LZTR1 في شاشة للبروتينات التي أدى غيابها إلى مقاومة مثبطات التيروزين كينيز المستخدمة في علاج السرطانات التي يسببها منتج الجين الورمي BCR-ABL. كما أظهرت دراساتهم البيوكيميائية والدراسات الجينية على ذبابة الفاكهة أن فقدان LZTR1 أدى إلى زيادة نشاط RAS والإشارة من خلال مسار بروتين كيناز المنشط بالميتوجين.

إن بروتين منظم النسخ 1 (LZTR1) الشبيه بسحاب ليسين ، وهو محول لمركب كولين 3 (CUL3) يوبيكويتين ليجاس ، متورط في أمراض الإنسان ، ومع ذلك تظل آلية عمله غير معروفة. وجدنا أن نقص Lztr1 الفرداني في الفئران يلخص الأنماط الظاهرية لمتلازمة نونان ، في حين أن فقدان LZTR1 في خلايا شوان يؤدي إلى عدم التمايز والتكاثر. من خلال محاصرة مجمعات LZTR1 من خلايا الثدييات السليمة ، حددنا guanosine triphosphatase RAS كركيزة لمجمع LZTR1-CUL3. أظهر تحليل Ubiquitome أن فقدان Lztr1 أبطل تواجد راس في ليسين -170. أدى التواجد في كل مكان بوساطة LZTR1 إلى تثبيط إشارات RAS عن طريق تخفيف ارتباطها بالغشاء. المرض المصاحب LZTR1 الطفرات عطلت تكوين معقد LZTR1-CUL3 أو تفاعلها مع بروتينات RAS. يوفر تنظيم RAS عن طريق التواجد بوساطة LZTR1 تفسيرًا لدور LZTR1 في المرض الذي يصيب الإنسان.

الطفرات المتزامنة مع فقدان تغاير الزيجوت في منظم النسخ الشبيه بسحاب ليسين 1 (LZTR1) مع ورم أرومي دبقي و ورم شفاني (13). تؤهب طفرات LZTR1 لأورام الأطفال وتزداد على الخلفية في سرطانات الكبد والخصية (4, 5). الطفرة الأكثر تكرارًا في LZTR1 في السرطان هي طفرة معطلة في موقع لصق في الكودون 217 (الشكل S1) (4, 6). يشكل LZTR1 متلازمة نونان الناتجة عن خلل تنظيم غوانوزين ثلاثي فوسفاتاز RAS (79). ومع ذلك ، فإن كيفية مساهمة LZTR1 في الإصابة بأمراض الإنسان غير معروفة.

للكشف عن آليات مرض Lztr1 ، استخدمنا نموذج ماوس حذف Lztr1. وجدنا أن فقدان Lztr1 مميت بين اليوم الجنيني 17.5 (E17.5) والولادة (الشكل S2A). Lztr1 أظهرت الفئران الذكور +/ انخفاضًا في الوزن (الشكل S2 ، B إلى D) وخلل في شكل الوجه (الشكل 1 أ). Lztr1 +/ الفئران ، ذكورا وإناثا ، أظهرت تشوهات في القلب ، بما في ذلك انخفاض وظيفة انقباض البطين الأيسر ، وزيادة الأبعاد الانبساطية ، وتضخم غريب الأطوار ، وزيادة مساحة عضلة القلب ، وتقليل طول العمر (الشكل 1 ، B و C ، والشكل S2 ، E و F). بشكل جماعي ، تظهر نتائجنا ذلك Lztr1 +/ الفئران تلخص بعض الأنماط الظاهرية لمرضى متلازمة نونان البشرية ، مما يشير إلى أن وظيفة LZTR1 محفوظة من الناحية التطورية.

(أ) الخصائص المورفومترية لجماجم الطفل البالغ من العمر 12 شهرًا Lztr1 + / + و Lztr1 +/ ذكور الفئران. (بالمقاطع البطينية للقلب المصبوغة بالهيماتوكسيلين والأيوزين. شريط مقياس 0.5 مم. تم تحديد إجمالي مساحة القلب من قبل فيجي. في الرسم البياني ، تمثل الخطوط الأفقية يعني ± SD. (ج) متوسط ​​مساحة 200 خلية عضلية تم قياسها في أقسام القلب الملطخة باللامينين Lztr1 + / + و Lztr1 +/ الفئران. تمثل الخطوط الأفقية يعني ± SD. (د) معدل نمو MEFs الممر المبكر المعزول من ثلاثة Lztr1 + / + وثلاثة Lztr1 - / - الأجنة. (ه) معدل نمو Lztr1 - / - MEFs التي تعبر عن ناقل فارغ (EV) أو wt-LZTR1 أو طفرات LZTR1. ن = 3. (F) نمو الذكاء الاصطناعي لخلايا شوان التي تعبر عن Cas9 أو Cas9 / gLZTR1 (gLZTR1 ، دليل RNA الذي يستهدف LZTR1). ن = 3. (جي) نمو الذكاء الاصطناعي لخلايا شوان LZTR1-indel معربًا عن التركيبات المشار إليها. ن = 3. M202R ، Met 202 → Arg. (ح) تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) لتعبير الرنا المرسال في خلايا شوان البشرية الأولية التي تعبر عن shGFP أو shLZTR1 المجمعة. ن = 3. بالنسبة لـ (D) إلى (H) ، فإن القيم تعني ± SEM. من أجل (أ) إلى (ج) و (ف) إلى (ح) ، ص القيم من الطالب على الوجهين ر اختبار. بالنسبة إلى (D) و (E) ، ص تم الكشف عن القيم من خلال تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA).

قمنا بتصميم عدة نماذج خلوية لفقدان LZTR1: الخلايا الليفية لجنين الفأر (MEFs) المشتقة من Lztr1 + / + و Lztr1 - / - أجنة الفئران ، وخلايا شوان البشرية الأولية التي تعبر عن بروتين فلوري أخضر قصير الشعر (shGFP) أو shLZTR1 ، وخلايا شوان البشرية وخلايا هيلا المخلدة مع CRISPR-Cas9 بوساطة LZTR1-indels (الشكل S3). في جميع النماذج المختبرة ، أدت خسارة LZTR1 إلى زيادة معدل النمو (الشكل 1D والشكل S4 ، A إلى C). أدى الإفراط في التعبير عن LZTR1 من النوع البري (wt-LZTR1) ، ولكن ليس من طفرات LZTR1 ، إلى خفض معدل النمو المحسن (الشكل 1E والشكل S4 و D و E). عزز فقدان LZTR1 في خلايا شوان المستعمرة ثنائية الأبعاد والنمو المستقل (AI) (الشكل 1F والشكل S4 ، F إلى H) ، والإفراط في التعبير عن wt-LZTR1 ، ولكن ليس من طفرات LZTR1 المرتبطة بالمرض ، قمع نمو الذكاء الاصطناعي في خلايا LZTR1-indel (الشكل 1G). علاوة على ذلك ، أظهر استنفاد LZTR1 في خلايا شوان توقيع تعبير جيني (الشكل 1 ح) يشبه تلك الخاصة بتكاثر خلايا شوان أثناء تجديد الأعصاب (10). تشير هذه البيانات إلى أن فقدان LZTR1 يدفع خلايا شوان من الخلايا الميالينية الهادئة إلى خلايا متكاثرة.

يعمل LZTR1 كمحول ركيزة لمجمعات كولين 3 (CUL3) يوبيكويتين ليغاز (11). لتحديد ركائز LZTR1 المرشحة ، استخدمنا طريقة مطياف الكتلة (MS) Virotrap ، والتي سمحت باحتجاز مجمعات البروتين من خلايا الثدييات السليمة (الشكل S5A) (12). كشفت الشاشة التي تحتوي على LZTR1 كطعم عن CUL3 ، وساركوما هارفي الجرذ الفيروسي المتجانس (HRAS) ، والورم الأرومي العصبي RAS المتماثل الورمي الفيروسي (NRAS) بين أعلى النتائج (الشكل 2 أ). أكدت شاشة Virotrap المتبادلة مع متحولة HRAS-deltaCAAX ، والتي تفتقر إلى آخر أربعة أحماض أمينية ، التكوين المعقد باستخدام LZTR1 وتم تحديد CUL3 (الشكل 2 ب). علاوة على ذلك ، فإن الجسم المضاد panRAS الذي يتعرف على جميع الأشكال الإسوية RAS coimmunoprecipitated مع hemagglutinin (HA) - الموسومة LZTR1. وبالمثل ، فإن LZTR1 الموسومة بعلامة العلم ترسب مع بروتينات RAS الذاتية ، ولكن ليس RAC1 (الشكل S5B). علاوة على ذلك ، قدمنا ​​علامة Halo-tag HiBiT (13) إلى LZTR1 موضع في خلايا هيلا و MEFs (الشكل 2C والتين. S5 و C و D). الجسم المضاد panRAS متفاعل مع RAS الداخلي و HiBiT-LZTR1 الداخلي (الشكل 2C والشكل S5E). أظهر التهابات مناعية متبادلة (co-IPs) أن LZTR1 تفاعل مع كل من الأشكال الإسوية Flag-RAS الثلاثة (الشكل S5F). تشير هذه النتائج معًا إلى أن LZTR1 و CUL3 و RAS تشكل معقدًا.

(أ و ب) يتم إجراء شاشات Virotrap في خلايا HEK293T باستخدام مستضد خاص بالمجموعة (GAG) –LZTR1 (A) أو GAG-HRAS – deltaCAAX (deltaC) (B) كطُعم. الإشريكية القولونية تم استخدام اختزال ثنائي هيدروفولات (eDHFR) المدمج في GAG كعنصر تحكم سلبي. (ج) مخطط لتوليد الخلايا التي تعبر عن بروتين HiBiT-LZTR1 داخل الإطار. تم تحصين RAS من محللات خلية HeLa المعدلة HiBiT-LZTR1 مع الجسم المضاد panRAS. تم إنشاء إشارة الإنارة بواسطة HiBiT المحتضنة بـ LgBiT. NT ، النوكليوتيدات. (د) تمت تنقية RAS Ubiquitinated من خلايا HEK293T التي تعبر عن التركيبات المشار إليها بواسطة كروماتوغرافيا تقارب المعادن Co 2 + واكتشافها عن طريق التكتل المناعي. الأرقام الموجودة على اليسار عبارة عن كتل جزيئية بوحدة kDa. 2xUb ، اثنان Ub 1xUb ، واحد Ub EV ، ناقل فارغ ، WCL ، محلول كامل الخلية ns ، غير محدد. (ه) سير عمل للتحليل الشامل. LC-MS / MS ، الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي. (F) خريطة حرارية تظهر الببتيدات المنتشرة بشكل مختلف في Lztr1 + / + و Lztr1 - / - MEFs. يظهر المقياس ض- قيم شدة الموقع المسجلة. (جي) القياس الكمي لتحليل PLA لخلايا شوان التي تعبر عن Cas9 أو Cas9 / gLZTR1 باستخدام الأجسام المضادة ضد panRAS و Ub. القيم تعني ± SEM ن = 3. ص القيم من الطالب على الوجهين ر اختبار. الاختصارات أحادية الحرف لبقايا الأحماض الأمينية هي كما يلي: A، Ala C، Cys D، Asp E، Glu F، Phe G، Gly H، His I، Ile K، Lys L، Leu M، Met N، Asn P ، Pro Q، Gln R، Arg S، Ser T، Thr V، Val W، Trp and Y، Tyr.

لاختبار ما إذا كان مجمع LZTR1-CUL3 قد يتحكم في انتشار RAS ، أجرينا تفاعلًا في المختبر. لاحظنا انتشار wt-HRAS في كل مكان على وجه التحديد في وجود مجمع LZTR1-CUL3 (الشكل S6A). أدى تعايش LZTR1 و CUL3 في خلايا 293T في الكلية الجنينية البشرية (HEK) إلى زيادة كميات RAS المنتشرة في كل مكان (الشكل 2D والشكل S6B). على النقيض من ذلك ، أدى العلاج بمثبط neddylation كولين MLN4924 أو فقدان LZTR1 إلى انخفاض انتشار جميع الأشكال الإسوية لبروتين RAS الموسومة بالعلم (الشكل S6 ، C إلى F). وبالتالي ، يمكن لمجمع LZTR1-CUL3 أن يعزز انتشار RAS في كل مكان.

للتحقيق في دور LZTR1 في انتشار RAS الداخلي ، قمنا بتمييز ملفات تعريف انتشار Lztr1 + / + و Lztr1 - / - MEFs بواسطة MS (الشكل 2E). Ubiquitome analysis revealed that ubiquitination of Hras at Lys 170 (K170) was abrogated in MEFs lacking Lztr1 (Fig. 2F and fig. S6G), indicating that endogenous Ras may serve as a substrate for the LZTR1-CUL3 complex. We also optimized a proximity ligation assay (PLA) with paired antibodies to ubiquitin (Ub) and panRAS. Consistent with the MS results, Hras-K170R (Lys 170 →Arg) knock-in or depletion of LZTR1 led to a decrease in panRAS-Ub proximity signals (Fig. 2G and fig. S7). MS analyses failed to detect any C-terminal peptides of Nras or Kras, perhaps because these isoforms are not highly expressed in MEFs and their C termini are lysine-rich (fig. S8A). However, LZTR1 interacted with (fig. S5F) and ubiquitinated all three RAS isoforms (fig. S6F), consistent with evolutionary conservation of K170 (fig. S8D). Thus, the LZTR1-CUL3 complex appears to mediate ubiquitination of all RAS isoforms.

Although multiple truncating and missense mutations of LZTR1 have been reported in Noonan syndrome and schwannomatosis (13, 14), no recurrent germline LZTR1 mutations have been identified to date. Additional sequencing analysis of blood samples from schwannomatosis patients revealed several recurrent germline mutations of LZTR1 within the BTB (broad-complex, tramtrack, and bric-a-brac)–BACK domains predicted to mediate dimerization and CUL3 binding (11, 15) (Fig. 3A). Concordantly, the BTB-BACK LZTR1 mutants, except L812P (Leu 812 →Pro), exhibited reduced binding to CUL3 (Fig. 3B and fig. S9A). Although LZTR1-L812P retained interaction with CUL3, it failed to form dimers (Fig. 3C). Oligomerization of BTB domains determines the subcellular distribution of CUL3 adaptors (15, 16). Indeed, both endogenous and ectopically expressed HA-tagged LZTR1 showed punctate endomembrane immunostaining (fig. S9B), whereas the BTB-BACK domain LZTR1 mutants, including LTZR1-L812P, showed diffuse cytoplasmic staining (Fig. 3D and fig. S9C).

(أ) LZTR1 mutations in schwannomatosis and Noonan syndrome individuals. Missense LZTR1 mutations identified in our cohort of schwannomatosis patients are shown in blue. In the schematic, K indicates Kelch domain. See Fig. 2 legend for amino acid abbreviations. (ب) Flag-tagged CUL3 purified from HEK293T cells was incubated with HA-tagged LZTR1-overexpressing cell lysates and then immunoprecipitated using anti-Flag resin. LZTR1 was detected by immunoblotting with anti-HA antibody. (ج) Cross-linking reactions were performed using HA-tagged LZTR1 purified from HEK293T cells. LZTR1 was detected by immunoblotting using anti-HA antibody. (D) Immunostaining of HeLa cells expressing HA-tagged wt-LZTR1 or LZTR1 mutants with anti-HA antibody. شريط مقياس ، 10 ميكرومتر. (ه) RAS proteins were immunoprecipitated with antibody against panRAS. LZTR1 was detected by immunoblotting with anti-HA antibody. (F) Colocalization of mCherry-NRAS and HA-tagged LZTR1 expressed in HeLa-Cas9/gLZTR1 cells. Values are means ± SEM. ص values were detected by two-sided Student’s ر اختبار. (جي) Ubiquitinated NRAS was purified from HEK293T cells expressing the indicated constructs by Co 2+ metal affinity chromatography and detected by anti-Flag antibody.

Missense mutations within the LZTR1 Kelch domain predicted to mediate substrate binding are also found in human disease. In co-IP assays, Kelch domain LZTR1 mutants showed decreased binding to RAS (Fig. 3E). The Kelch domain mutants, like wt-LZTR1, displayed punctate immunostaining, but only wt-LZTR1 led to relocalization of RAS to the LZTR1-CUL3–containing puncta, which represent loci of LZTR1-CUL3–mediated ubiquitination (Fig. 3F and fig. S9, D and E). Consistently, the LZTR1-L812P mutant, which does not form puncta, only weakly ubiquitinated RAS, as did the LZTR1-Y726* (Tyr 726 →Stop) mutant (Fig. 3G). Thus, disease-associated LZTR1 mutations appear to abrogate RAS ubiquitination by disrupting the formation of the RAS-LZTR1-CUL3 complex.

RAS ubiquitination affects RAS–mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling (17). Loss of LZTR1 led to increased RAS activity and phosphorylation of MEK1/MEK2 and ERK1/ERK2 in all tested model systems, whereas enhanced phosphorylation of V-Akt murine thymoma viral oncogene homolog (AKT) was cell dependent (Fig. 4A and fig. S10). After serum stimulation, Lztr1 −/− MEFs showed higher MEK1/MEK2 activity at all time points, whereas Lztr1 +/− MEFs had higher MEK1/MEK2 phosphorylation only at later time points (fig. S11A). Thus, Lztr1 abundance may fine-tune the activation of Ras signaling. Restoration of wt-LZTR1 expression in LZTR1-indel cells decreased MEK1/MEK2 activity (fig. S11B). Finally, LZTR1-mutated schwannomas showed strong staining of phosphorylated ERK1/ERK2 compared to wt-LZTR1 nerve trunk (fig. S11, C and D). The MEK1 inhibitor pimasertib abolished the colony growth difference between wt-LZTR1 and LZTR1-mutant cells (fig. S11E). Pimasertib treatment also rescued the embryonic lethality of Lztr1 −/− mice (Fig. 4B). Thus, LZTR1-mediated phenotypes arise, at least in part, from increased RAS signaling.

(أ) MEFs isolated from three Lztr1 +/+ and three Lztr1 −/− embryos were serum-starved, stimulated with 10% serum, and analyzed by immunoblotting. Values are means of phosphorylated (p) relative to nonphosphorylated protein levels ± SEM. ص values are from a two-way ANOVA. (ب) Progeny from the indicated Lztr1 +/− matings. Pregnant mice were treated with pimasertib starting from E7.5. (ج) Quantitative ubiquitome analysis of Lztr1 + / + و Lztr1 −/− MEFs. FDR, false discovery rate. (D) Ubiquitinated RAS was purified from HEK293T cells expressing the indicated constructs by Co 2+ metal affinity chromatography and detected by immunoblotting. (ه) The PLA analysis of wt-Hras and Hras-K170R MEFs expressing shGFP or shLztr1 using antibodies against panRAS and Ub. Red, PLA signal blue, 4′,6-diamidino-2-phenylindole scale bar, 10 μm. (F) HEK293T cells expressing the indicated constructs were serum-starved overnight, stimulated with 10% serum, and analyzed by immunoblotting. Values are means of phosphorylated relative to nonphosphorylated protein levels ± SEM ن = 3. ص values are from a two-way ANOVA. (جي) Snapshots of Ub-conjugated RAS at the lipid bilayer composed of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) lipids (3:1 molar ratio). (ح و أنا) Immunoblotting of the membrane and cytoplasmic fractions isolated from HeLa cells expressing shGFP and shLZTR1 (H) or wt-Hras and Hras-K170R MEFs (I). HSP70, heat shock protein 70.

Although our MS analysis detected Ras ubiquitination at several lysines, loss of Lztr1 abrogated ubiquitination of Ras only at K170 (Fig. 4C). Thus, ubiquitination of Hras at K170 may specifically require Lzrt1. Indeed, though LZTR1 depletion hindered ubiquitination of wt-HRAS, it did not affect ubiquitination of the HRAS-K170R mutant (Fig. 4D). Loss of LZTR1 also abolished the difference in Ras ubiquitination between wt-Hras and Hras-K170R MEFs (Fig. 4E and fig. S12A). Nonetheless, the LZTR1-CUL3 complex did ubiquitinate mutant HRAS-K170R in vitro (fig. S6A). The site specificity in vivo could be directed by anchoring of RAS to the membrane. Moreover, overexpression of the HRAS-K170R mutant led to higher activation of ERK1/ERK2 than did overexpression of wt-HRAS, and LZTR1 depletion did not affect ERK1/ERK2 activity in cells overexpressing HRAS-K170R (Fig. 4F and fig. S12B). K170R knock-in MEFs also showed increased MAPK signaling and growth rates (fig. S12, C and D). Collectively, these data indicate that LZTR1-mediated ubiquitination of RAS at K170 suppresses RAS-MAPK signaling.

Ubiquitination of RAS can inhibit its activity by triggering its degradation (18). However, quantitative MS analysis did not reveal an increase in RAS protein abundance in Lztr1 −/− MEFs (fig. S6G). wt-LZTR1 and LZTR1-indel Schwann cells treated with the protein synthesis inhibitor cycloheximide also showed similar RAS stability (fig. S12E), Thus, LZTR1 regulates RAS by a nondegradative mechanism. Ubiquitination of RAS also induces its relocalization to endomembranes (19, 20). However, LZTR1 overexpression increased the endomembrane fraction of both wt-RAS and the HRAS-K170R mutant (fig. S12F). LZTR1 alone also only slightly increased RAS ubiquitination (Fig. 2D) and did not affect the MAPK pathway (fig. S12G), suggesting that LZTR1 overexpression promotes endomembrane localization of RAS independently of its ability to mediate ubiquitination at K170.

To assess how ubiquitination of RAS at K170 controls its activity, we elucidated modes of the interaction between RAS and conjugated Ub. LZTR1 colocalized with NRAS at RAB11–Transferrin receptor–positive recycling endosomes (fig. S13), suggesting that LZTR1 regulates ubiquitination of farnesylated and palmitoylated RAS. Therefore, we performed molecular simulations on lipidated RAS. In the initial structures of Ub conjugated to K170 of RAS, the hypervariable regions (HVRs) of RAS exposed their anchor portions to the solution. The long-lasting simulations showed that Ub secured the anchor portion of the HVR by sequestering the farnesyl and palmitoyl groups (fig. S14). Concordantly to a rapid kinetics of spontaneous insertion of lipidated RAS into the membrane (2124), the HVRs of nonubiquitinated RAS straightforwardly associated with membranes. However, Ub conjugation to K170 of RAS prevented the HVRs from binding to and inserting into membranes (Fig. 4G). Thus, ubiquitination at K170 may disrupt the association of RAS to the membrane. Indeed, loss of LZTR1 or Hras-K170R knock-in increased the fraction of membrane-bound RAS (Fig. 4, H and I, and fig. S15). These results are all consistent with RAS ubiquitination at K170 inhibiting RAS activity by impairing its association with the membrane.

Our results indicate that LZTR1-mediated ubiquitination of RAS on K170 modulates RAS activity, dysregulation of which leads to human disease. An accompanying study shows that LZTR1 dysregulation also confers drug resistance (25). Understanding this unconventional mechanism of RAS activation may help to identify patients who might benefit from RAS pathway inhibitors and inform new therapeutic approaches for these patients.


Genetic Insights into Mammalian Cytoplasmic Dynein Function Provided by Novel Mutations in the Mouse

Anna Kuta , . Elizabeth M.C. Fisher , in Dyneins , 2012

18.10 Using Mouse Genetics to Further Unravel the Role of the Cytoplasmic Dynein Heavy Chain

Mouse mutants have given and will continue to give novel insight into the role of cytoplasmic dynein, insights that would have been impossible to gain from في المختبر studies. In addition, one aspect of working with genetic mouse models that can give information about the interactions of proteins of interest is to cross different mouse strains and analyze the phenotype of the resulting progeny. In 2005, heterozygous Dync1h1 Loa/+ mice were crossed with the SOD1 G93A transgenic mice [16] . The latter strain (TgSOD1 G93A ) carries a human transgene array of a mutant superoxide dismutase 1 gene, which is causative for ALS in both humans and mice. TgSOD1 G93A mice typically die at about 125 days of age (depending on genetic background) from motor neuron loss and with pathophysiological symptoms resembling ALS in humans.

Somewhat surprisingly, the double mutant progeny that carried the human transgene array and the Loa mutation in Dync1h1 lived for 28% longer than their TgSOD1 G93A littermates or parents. The double mutants had a delay in disease onset and death, although a similar time course of disease. Axonal transport was analysed in embryonic motor neurons derived from progeny of the cross, using a fluorescently labeled fragment of the tetanus toxin. This showed two surprising results: axonal retrograde transport in TgSOD1 G93A was delayed compared to wild-type and Dync1h1 Loa/+ littermates, whereas it was faster in the TgSOD1 G93A –Dync1h1 Loa/+ double mutants [16] . This result may indicate an unexpected interaction, either direct or indirect, between Dync1h1 and mutant (and possibly wild-type) SOD1 [10,34] .

The extension of lifespan in TgSOD1 G93A –Dync1h1 Loa/+ double mutants was also shown by two other groups: Chen, Popko, and colleagues, who found a 21% increase in the lifespan of these mice compared to TgSOD1 G93A littermates [3] and Ilieva, Cleveland, and colleagues, who reported a 9% increase [14] . The latter group crossed their Dync1h1 Loa/+ mice with two other transgenic animals with different mutations in SOD1 that also give models of ALS they found no ameliorating effect of the dynein subunit mutation, which they suggest may reflect a difference in SOD1 protein levels in the transgenics.

Interestingly, Teuchert and colleagues reported that TgSOD1 G93A –Dync1h1 Cra1/+ double mutants also have a delayed disease onset compared to TgSOD1 G93A littermates [26] , but this effect is not seen in TgSOD1 G93A –Dync1h1 Swl/+ double mutants [3] , indicating that different members of this dynein subunit allelic series may well have different interactions. This also highlights the use of having an allelic series of mutants for helping to tease out protein–protein interactions that take place in different domains.

New research indicates that the role of the dynein HC mutation in ameliorating the effect of the TgSOD1 G93A transgene may lie in a surprising alteration in mitochondrial function that is found in the Dync1h1 Loa/+ and TgSOD1 G93A –Dync1h1 Loa/+ double mutant mice [10] . Morsi El-Kadi, Hafezparast, and colleagues have shown that in the double mutants the Dync1h1 Loa mutation leads to a significant reduction in the amount of toxic SOD1 G93A protein in the mitochondrial matrix, resulting in amelioration of the defects in mitochondrial membrane potential and respiration. The precise mechanism by which mutant dynein affects the differential deposition of SOD1 G93A in the double mutants and its role in ameliorating mitochondrial function is not understood yet. But, taking into account the role of dynein in mitochondrial transport and possibly mitochondrial fission [30] , it is likely that the Dync1h1 Loa mutation improves the transport of mitochondria and that the improved transport could make them less prone to mutant SOD1 association, leading to ameliorated membrane potential and respiration and/or reducing the association of mutant SOD1 protein with the mitochondrial membranes via an as-yet-unknown mechanism thus, the Dync1h1 Loa mutation could restore the docking of dynein (and kinesin) to the mitochondria to improve its transport ( Fig. 18.6 ) [10,29] .

Figure 18.6 . آثار Dync1h1 Loa mutation on the TgSOD1 G93A mouse phenotype. mSOD1, mutant SOD1 ●, mSOD1 aggregates ?, not tested yet.

The unexpected outcome of crossing the Dync1h1 Loa/+ and TgSOD1 G93A mice has prompted other crosses with the dynein HC subunit mutants. Ravikumar, Acevedo-Arozena, Rubinsztein, and colleagues crossed the Dync1h1 Loa/+ mouse with a mouse model of the neurodegenerative disorder Huntington’s disease (Hdh HD/+ ) [23] . They found that the Huntington’s phenotype, including tremor onset, motor coordination, and muscle function, was enhanced in compound heterozygote animals. This effect likely resulted from effects of the dynein mutation on the autosome–lysosome fusion process – showing a potential novel role for the dynein HC subunit in this pathway.

In other mouse models of neurological disorders, the Dync11h Loa/+ has had no effect on phenotype [2] .


ملفات إضافية

ملف إضافي 1:

Sequences of each gene and CRISPR/Cas9-induced mutants or synthesized templates used in all experiments.

ملف إضافي 2: الجدول S1.

List of primers used in this study.

Additional file 3: Fig. 1.

The yield of temperature gradient PCR with different single point mutation templates of NtCRTISO (synthesized) and different combination of primers was detected by agarose gel electrophoresis.

Additional file 4: Fig. 2.

The yield of temperature gradient PCR with different multiple point mutation templates of NtCRTISO (synthesized) and different combination of primers was detected by agarose gel electrophoresis.

Additional file 5: Fig. 3.

Identification of CRISPR/Cas9-induced crtiso mutants in tobacco by MSBSP-PCR.

Additional file 6: Fig. 4.

The sequencing and sequences analysis of different clones of NtCRTISO خطوط معدلة وراثيا.

Additional file 7: Fig. 5.

Identification of CRISPR/Cas9-induced myb86 mutants in tobacco by MSBSP-PCR.

Additional file 8: Fig. 6.

The sequencing and sequences analysis of different transgenic lines of NtMYB86.

Additional file 9: Fig. 7.

Identification of CRISPR/Cas9-induced ggpps1 mutants in tobacco by MSBSP-PCR.

Additional file 10: Fig. 8.

The sequencing and sequences analysis of different transgenic lines of NtGGPPS1.

Additional file 11: Fig. 9.

Identification of CRISPR/Cas9-induced rin4 mutants in tobacco by MSBSP-PCR.

Additional file 12: Fig. 10.

The sequencing and sequences analysis of different transgenic lines of NtRIN4.

Additional file 13: Fig. 11.

Identification of CRISPR/Cas9-induced pvy mutants in tobacco by MSBSP-PCR.

Additional file 14: Fig. 12.

The sequencing and sequences analysis of different transgenic lines of NtPVY.


شاهد الفيديو: الطفرات (شهر نوفمبر 2022).