معلومة

الحد الأدنى لعدد دورات القياس الكمي الفعال QPCR؟

الحد الأدنى لعدد دورات القياس الكمي الفعال QPCR؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد كنت أواجه مشكلة واضحة مع تلوث gDNA في عناصر التحكم في النسخ غير العكسي (NRT) من خلال ظهور قمم التألق في بيانات qPCR الخاصة بي.

لقد حاولت / أحاول عدة علاجات DNase (Turbo DNase ، تقنيات الحياة) وتنظيف الحمض النووي الريبي (Qiagen ، RNeasy). العامل المحدد الذي أشعر بالقلق بشأنه هو أنني سأقوم بتدمير كل الحمض النووي الريبوزي المتوفر لدي من خلال علاجات / عمليات تنظيف متعددة.

سؤالي هو - هل يمكنني تقليل عدد الدورات التي أستخدمها لقياس التألق؟ هل هناك جانب سينحرف عن مساره (من حيث التجربة نفسها لتحليل البيانات) إذا قللت من عدد الدورات إلى 25-30؟ تبدأ جميع تلوثاتي بالظهور في نطاق ما يقرب من 30 دورة وما فوق (على النحو الذي تحدده قيم Ct).

يرجى إعلامي إذا كنت بحاجة إلى أي معلومات أخرى يمكن أن تساعد في الحصول على إجابة!

أفضل


دليل لتفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل (qPCR)

يعد qPCR & # 8211 المعروف أيضًا باسم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي & # 8211 حاليًا المعيار الذهبي لاكتشاف وقياس الحمض النووي الريبي في عدد صغير من الأنسجة. ومع ذلك ، فإن التقنية نفسها تعتمد على مجموعة من العوامل ، دعنا نلقي نظرة على بعض النصائح والحيل لزيادة فرصك في النجاح.

تمت كتابة هذه المقالة الأصلية بالتعاون مع The Addictive Brain ، وهي مبادرة للتواصل العلمي. يسعدنا أن نقدم نصائح وحيل Chinmaya & # 8217s الشخصية بناءً على تجربة مباشرة في تشغيل عدد لا يحصى من ردود فعل PCR و qPCR!


الملخص

هدفت هذه الدراسة إلى اختيار والتحقق من صحة استراتيجيات منهجية مختلفة لتحديد التعبير عن جينات الفوعة تصاعدي و أسكف بواسطة qPCR في Aeromonas salmonicida subsp. سالمونيكيدا (اير. سالمونيكيدا).

الطرق والنتائج

باستخدام خوارزميات geNorm و Normfinder و BestKeeper ، تم اختيار الجينات المرجعية لـ qPCR بناءً على في المختبر ثبات التعبير في ثلاثة اير. سالمونيكيدا سلالات. تم حساب كفاءة التضخيم الجيني بواسطة برامج PCR Miner و LinReg PCR في الوقت الحقيقي ، والتي لم يتم استخدامها سابقًا في تحليل التعبير الجيني البكتيري. التعبير عن تصاعدي و تصاعدي الجينات الفوعة في خبيثة اير. سالمونيكيدا تم تقييم السلالة من خلال ثلاثة نماذج قياس كمي ، بما في ذلك واحد (الأقل أو الأكثر استقرارًا) أو ثلاثة جينات مرجعية أكثر استقرارًا ، جنبًا إلى جنب مع كفاءة تضخيم الجينات الثابتة أو المحددة. كانت الجينات المرجعية الأكثر استقرارًا هي gسنة, proC و rpoC، في حين rpoD و فابد كانت الأقل استقرارًا. أظهرت نماذج القياس الكمي أنماط تعبير مختلفة.

الاستنتاجات

كانت الإستراتيجية المثلى لتحديد تعبير mRNA هي استخدام مزيج من الخوارزميات الثلاثة ونموذج القياس الكمي بما في ذلك الجينات المرجعية الثلاثة الأكثر استقرارًا. كانت أداة PCR Miner أو LinReg PCR في الوقت الحقيقي أدوات قيمة لتقدير كفاءة التضخيم.

أهمية وتأثير الدراسة

أعطت الطرق المستخدمة في هذه الدراسة بيانات تعبيرية أكثر موثوقية باستخدام qPCR من الطرق المنشورة سابقًا. ستساهم ديناميكيات القياس الكمي والتعبير عن جينات الفوعة في فهم أفضل للكيفية اير. سالمونيكيدا يتفاعل مع مضيفه والبيئة ، وبالتالي منع الأوبئة الحيوانية بسبب هذا العامل الممرض.


نتائج

TaqMan ® ، UPLs ® ، الإستراتيجية القائمة على الذيل تعطي نتائج مماثلة في ddPCR

حددنا أولاً ما إذا كانت Universal Probe Technologies (UPL ® ، Roche) تعمل بشكل مشابه لتحقيقات التحلل المائي التقليدية 5 ′ (Taqman®) في إعداد ddPCR. باستخدام اثنين من الجينات ، قارنا ، مع تخفيف مدخلات (كدنا) ، مستوى الكشف في ddPCR (الشكل SI ، SII). تم إجراء المقارنة الأولى بين مجسات TaqMan ® و UPL ® (الشكل SI) مع البادئات التي تكشف عن exons 7 و 8 من HTERT (إنزيم النسخ العكسي للتيلوميراز البشري ، معرف الجين NCBI: 7015) من cDNA. في تجاربنا ، كانت المجسات العامة فعالة مثل مجسات التحلل المائي التقليدي 5′ كما يتضح من الارتباط القوي المرتبط (ملاءمة الملاءمة) الموجود بين الانحدارات الخطية (R 2 = 0.9999 p & lt 0.0001).

لتأكيد أن مجسات Roche (Universal Probes Library® LNA المعدلة من 8 إلى 9 أوليغومرات DNA) تعمل في قطيرات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي ، أجرينا اختبارًا إضافيًا على جين مرجعي شائع ، HPRT (هيبوكسانثين - جوانين فوسفوريبوسيل ترانسفيراز ، معرف الجين NCBI: 3251). كدليل على المبدأ ، اختبرنا استراتيجية 5-tail أو "تحقيق شامل" (يشار إليها باسم droplet digital PCR-Tail أو ddPCR-Tail) 19. في هذه الإستراتيجية ، يتم إضافة التسلسل التكميلي لتسلسل مسبار عالمي (Roche Universal Probes®) إلى الطرف 5 من التمهيدي الأمامي (المبين في الشكل 1 و SII). في هذه الحالة ، يمكن للمرء أن يحدد بدقة كمية المواد المدخلة (أي القياس الكمي للمكتبة لمستوى NGS أو mRNA) دون معرفة التسلسل بين الاشعال الأمامي والخلفي. للتحقق من صحة هذا المفهوم ، جربنا أولاً استراتيجية "ddPCR-Tail" في نظام قياس كمي بسيط (أي التعبير الجيني: منتج تضخيم واحد). استخدمنا اشعال الجينات المرجعية ل HPRT مع مكتبة مسبار عالمية داخلية رقم 22 (UPL # 22) إلى البادئات ومسبار ذيل 5 من التسلسل الفريد (UPL # 52). استخدمنا التخفيفات التسلسلية لـ (كدنا) المصنوعة من الحمض النووي الريبي الكلي لتحديد ما إذا كانت استراتيجية الذيل والمسبار الداخلي تعطي قيم تركيز مماثلة. لاحظنا وجود علاقة قوية بين الطريقتين ، كما يتضح من منحني الانحدار الخطي (جودة الملاءمة R 2 = 0.9923 ، p & lt 0.0001) ، مما يشير إلى اكتشاف مماثل بين الاستراتيجيات المختلفة (TaqMan ® ، UPLs الداخلية والذيل ®) ( الشكل SII).

تعطي معايرة مكتبات NGS باستخدام ddPCR-Tail عددًا مطلقًا من جزيئات الإدخال

طبقنا استراتيجية ddPCR-Tail لتقدير NGS الكمي عن طريق إضافة تسلسل 5 إلى التمهيدي العالمي 1.0 (Illumina) وقارننا طريقة ddPCR-Tail بالتقنيات الأخرى المستخدمة لتقدير مكتبة NGS DNA. تم تحديد كمية العينة نفسها (مع 6 فهارس مختلفة) باستخدام مجموعات تجارية باستخدام QuBit و qPCR و ddPCR و ddPCR-Tail (الشكل 2). تم حساب المولاري وفقًا للتقنية المعنية وتم تصحيحها بمنحنى قياسي عند الحاجة (على سبيل المثال ، KapaBiosystem لـ qPCR). نجحت جميع طرق القياس الكمي في تقدير المكتبات في نفس نطاق التركيز (50-250 نانومتر). بالنسبة لمؤشر واحد (ATTCCT) ، كانت المولارية مختلفة مع مجموعة ddPCR (465 نانومتر) ، وهو عنصر خارجي يحتمل أن يكشف عن عدم توافق بين المجسات المستخدمة في تلك المجموعة وتسلسل الفهرس المحدد. ومع ذلك ، إذا تم أخذها بشكل منفصل ، فإن جميع قياسات المكتبات المفهرسة تختلف اختلافًا كبيرًا عند مقارنة كل طريقة (الشكل 2 ج). في الواقع ، كشفت قيم p المعدلة المحسوبة باستخدام اختبار المقارنة المتعدد لـ Sidak (alpha = 0.05) عن قيم p أقل من 0.0001 مع استثناء واحد (GATCAG: ddPCR-Tail مقابل qPCR المعدلة قيمة p = 0.0956). لذلك ، فإن نتيجة نتيجة التسلسل فقط هي التي ستحدد بوضوح طريقة القياس الكمي الأكثر موثوقية. لا يتطلب استخدام ddPCR أو ddPCR-Tail الحساب الخلفي للمكتبة مقابل متوسط ​​الحجم الذي يحدده اختبار Bioanalyzer (الشكل 2 ب) ، مما يجعل الكميات المستندة إلى ddPCR أقل استهلاكًا للوقت والكاشف. يتطلب القياس الكمي باستخدام QuBit أو qPCR معدات إضافية من أجل تحديد مولارية المكتبات مع مزيد من الحسابات. يعطي qPCR و QuBit مقاييس نسبية بينما ddPCR منها مطلقة.

(أ) رسم تخطيطي للتصميم التجريبي لتسلسل الجيل التالي (NGS). باستخدام أربع طرق للتقدير الكمي ، قمنا بمعايرة مكتبات الحمض النووي المحضرة من خلايا هيلا ، باتباع تعليمات الشركات المصنعة. تمت إضافة ستة فهارس مختلفة في خطوة التضخيم. من بين الممرات الثمانية الموجودة على خلية تدفق NGS ، تم استخدام أربعة ممرات لمقارنة كل طريقة (ممر مؤشر فريد) وأربعة ممرات لدقة التجميع (مجموعة من ستة فهارس لكل حارة). (ب) صورة محلل بيولوجي للمكتبات ، تُظهر مسحة متجانسة من الحمض النووي من 280 إلى 450 زوجًا قاعديًا. تظهر جميع الفهارس الستة متوسط ​​الحجم بالمثل. (ج) نتيجة القياس الكمي لجميع الفهارس باستخدام نهج QuBit و qPCR و ddPCR و ddPCR-Tail ، على التوالي. تم إجراء جميع الكميات (باستثناء ddPCR-Tail) باتباع تعليمات الشركة المصنعة (Invitrogen و BioRad و KapaBiosystem). استخدمت إستراتيجية ddPCR-Tail نفس الجهاز مثل ddPCR مع تعديلات طفيفة (50 نانومتر من ثلاث خطوات PCR-التلدين عند 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، ووقت تمديد 30 ثانية عند 72 درجة مئوية). التجارب التي أجريت في ثلاث نسخ ، يعني محسوبًا باستخدام منحنى التخفيف (متوسط ​​12 قيمة لكل تقدير كمي ، 6 لـ QuBit). يعني ± SD المعروضة.

يعطي ddPCR-Tail معايرة حساسة وموثوقة لـ NGS

باستخدام أربعة ممرات لتجربة تسلسل النهاية المزدوجة (PE-Seq) ، قمنا بتجميع الفهارس الستة بناءً على طريقة المعايرة المستخدمة وتسلسلها (PE-100nt ، HiSeq2500 Illumina). كان هدفنا هو مقارنة طرق المعايرة المختلفة ، وبالتالي تم توجيه التركيز نحو جودة وإعادة تقسيم القراءات بدلاً من التسلسلات الفعلية الواردة في القراءات (الشكل 3 ، SIII). قمنا أولاً بفحص بيانات FastQ باستخدام نقاط Q. درجة Q هي قيمة تشير إلى احتمال استدعاء قاعدة (نوكليوتيد) بشكل غير صحيح ، يتم إعطاء درجات Q لكل نوكليوتيد للقراءة (يتم الحساب بواسطة خوارزمية تشبه phred ، مماثلة لتلك التي تم تطويرها في الأصل لتجارب Sanger للتسلسل) 20 . على الصعيد العالمي ، تمثل الدرجة Q البالغة 20 معدل خطأ قدره 1 في 100 ، مع دقة مكالمة مقابلة تبلغ 99٪. في تسلسل PE ، تكون درجة Q "جيدة" عندما تكون أعلى من 34 (معدل الخطأ حوالي 1 في دقة 2500 99.96٪). في هذه التجارب ، لاحظنا أن QuBit و ddPCR-Tail أعطيا درجات Q أفضل قليلاً (أحادي الاتجاه ANOVA p & lt 0.0001 مع عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين QuBit و ddPCR-Tail باستخدام التصحيح لمقارنات متعددة) بمتوسط ​​34 وما شابه. الانحراف المعياري (SD) ± 0.15 و ± 0.13. بالمقارنة ، ddPCR و qPCR متوسط ​​درجة Q 33 (دقة 99.95٪) ، بقيم SD ± 0.17 و ± 0.15 ، على التوالي (الشكل 3 أ). ومع ذلك ، فإن قيمة درجة Q غير مكتملة دون مراعاة العدد الإجمالي للقراءات (الشكل 3 ب). أنتجت طرق DdPCR و qPCR المزيد من القراءات (تعني ± SD ddPCR = 414 ± 2.42 و qPCR = 402 ± 27 مليون قراءة PF ، أي يقرأ تمرير مرشح illumina) ، مما يشير إلى زيادة التحميل المحتمل للممر مما يؤدي إلى صعوبة فصل المجموعات ، وبالتالي Q أقل نتيجة. يمكن تفسير ذلك من خلال التقليل من تركيز المكتبات ، نتيجة لفشل تضخيم PCR ، أو القضايا المتعلقة بالتحقيق / الإنزيم التي تفضل تسلسلات محددة في كل من فحوصات المعايرة.

(أ) جدول درجات متوسط ​​الجودة (Q) من الممرات الأربعة المنفصلة (تم الإبلاغ عنها كحمل فردي) والفهارس الستة المجمعة عبر طرق المعايرة الأربعة (جميعها من قراءة إجمالي 1 من 7 متوسط ​​نقاط Q لكل معايرة). درجات الجودة جيدة إلى حد ما (مع كون 34 المعيار الذهبي لنتائج التيسير الكمي) ، مع نتائج أفضل من أفضل من استراتيجيات QuBit و ddPCR-Tail (يعني ± SD ، QuBit = 34.23 ± 0.15 ddPCR-Tail = 34.18 ± 0.13). (ب) العدد الإجمالي للقراءات (قراءات PF) المتاحة من نتائج التسلسل (من تجربة غير مجمعة ومجمعة) ، أي يمثل عدد القراءات التي تمر بالتحكم الأساسي والتي تم تحديدها على أنها مجموعات فريدة. لكل اختبار ، تمثل القراءات غير المفهرسة أقل من 2٪ (qPCR = 1.55٪ ، QuBIT = 1.54٪ ، ddPCR = 1.32٪ ، ddPCR-Tail = 1.49٪ على التوالي). أعطت جميع الطرق أكثر من 350 مليون قراءة: qPCR و ddPCR (402 ، 414) QuBit و ddPCR-Tail (357 ، 372). يعني ± SD الموضح محسوبًا من تجارب مكررة. (ج) متوسط ​​تمثيل المؤشر يعني ± SD الموضح. (د) إعادة التقسيم المحدد للفهارس الستة داخل الممرات الأربعة المختلفة ، من طرق المعايرة الأربعة المختلفة.

بعد ذلك ، باستخدام نهجنا المفهرس ، قمنا بتقييم إمكانية استنساخ طرق المعايرة بالتحليل الحجمي بغض النظر عن تسلسل الفهرسة ، نظرًا لأن جميع المكتبات متطابقة (من نفس الإعداد بالضبط) وتمثل نسخًا مكررة تقنية. من الناحية المثالية ، ستسمح التقنية الموثوقة والحساسة بفهرسة عينات متعددة بطريقة متجانسة (نسب متساوية). قد ينتج عن التوازن الأمثل للمكتبات المفهرسة ملف

16٪ لكل مكتبة مفهرسة (حوالي سدس 100٪). قدم QuBit و ddPCR-Tail النتائج الأكثر استقرارًا (الشكل 3 ج) ، مع أقل قدر من التباين بين المقاييس بالنسبة إلى اختلاف أقل بين مكتبات الحمض النووي المفهرسة (تم الإبلاغ عنها عن طريق الانحراف المعياري المنخفض على التوالي ddPCR-Tail SD ± 3.1 QuBit SD ± 1.9 qPCR SD ± 7.2 و ddPCR SD ± 8.9). ومع ذلك ، عند تمثيل البيانات لتقدير إعادة التقسيم الحقيقي بين متواليات الفهرس (الشكل ثلاثي الأبعاد) ، لاحظنا أن بعض الفهارس يتم تمثيلها بشكل مفرط إلى حد كبير. على سبيل المثال ، يتم تمثيل مؤشر ATTCCT بشكل مفرط بمعايرة qPCR ، في حين أنه غائب تمامًا تقريبًا مع معايرة ddPCR. يمكن ربط هذه التباينات إما بمشكلة في تسلسل الفهرس نفسه أو بفشل جزئي في المعايرة بالتحليل الحجمي. حققت فحوصات ddPCR-Tail و QuBit أفضل النتائج فيما يتعلق بتوازن الفهرس الذي يسمح بتجارب تسلسل تعدد الإرسال بطريقة دقيقة ومتوازنة. لذلك ، يمكن أن يقلل ذلك من التحيز ويحتمل أن يقلل تكلفة التسلسل لكل عينة عن طريق تحميل المزيد من المكتبات المفهرسة في نفس الممر مع الثقة في أن كل مكتبة سيتم تسلسلها بالتساوي.

لتقييم حساسية طريقة ddPCR-Tail ، قمنا بتحديد بعض مكتبات NGS الصعبة بكميات منخفضة من الحمض النووي ، وعدم تجانس واسع في أحجام الحمض النووي وآثار ثنائيات التمهيدي. قارنا النتائج بأكثر طرق القياس الكمي شيوعًا ، qPCR. قمنا بتحليل المكتبات المعقدة المعدة لتسلسل Hi-C (الشكل 4 أ ، ب) ، وهي تقنية قائمة على NGS للتحقيق في بنية الكروماتين على مستوى الجينوم 21 ، 22. نظرًا للخطوات الأنزيمية العديدة المطلوبة للمقايسة ، فإن كمية الحمض النووي المحضر محدودة. يجب أن يكون لدى المرء وسيلة حساسة للغاية لقياس المكتبة قبل NGS لتقليل تحيز تفاعل البوليميراز المتسلسل 18. في هذه الحالة ، ستؤدي المكتبة الضعيفة ليس فقط إلى عدد أقل من القراءات ، ولكن أيضًا إلى نقص في التسلسلات التمثيلية. قد يتم التغاضي عن عمليات الربط النادرة وقد يتم تشويه المستويات النسبية للتفاعلات بسبب التحيز الذي تم إدخاله أثناء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل 18. قدمت طريقة ddPCR-Tail نتائج القياس الكمي المكافئة مثل تلك المحسوبة من طريقة qPCR في 4 من أصل 6 مكتبات (الشكل 4 أ NGS-2 ، p = 0.99 NGS-3 ، p = 0.99 NGS-4 ، p = 0.94 NGS- 6 ، p = 0.99 على التوالي ، قيم p المعدلة المحسوبة باستخدام مقارنات Sidak المتعددة اختبار ألفا = 0.05). هذا يكمل ملاحظتنا السابقة بأن ddPCR-Tail موثوقة بنفس القدر مثل qPCR لتقدير الحمض النووي.

(أ) مقارنة بين طريقتين لمكتبات NGS منخفضة الوفرة ، ونتائج المعايرة باستخدام qPCR ونظام ddPCR-Tail. تم إجراء الاختبار في ثلاث نسخ ومتوسط ​​محسوب باستخدام عوامل تصحيح التخفيف (متوسط ​​18 قيمة لكل عينة). يعني ± SD المعروضة. (ب) نتائج صور Bioanalyzer المستخدمة لحساب المولارية النهائية لقياس qPCR ، خوارزمية مقدمة من KapaBiosystem باستخدام متوسط ​​حجم مكتبة NGS جنبًا إلى جنب مع منحنى معيار qPCR. (ج) تم تحديد كمية جميع المكتبات بنجاح بثقة عالية (الانحدار الخطي الكل في 0.9) ، أظهرت استراتيجية ddPCR Tail خطيًا عامًا أفضل بغض النظر عن عدم تجانس المكتبات.

أخيرًا ، تناولنا استقرار التقنية في مكتبات Hi-C غير المتجانسة (الشكل 4 ج). يعطي DdPCR-Tail ارتباطات انحدار خطي أفضل (اختبار الطالب T p = 0.04 الشكل 4 ج) وانحرافات معيارية أصغر مقارنةً بـ qPCR (الشكل 4 أ NGS-1 و NGS-5). هناك مصدران محتملان للخطأ يمكن أن يفسرا الانحرافات المعيارية الكبيرة التي لوحظت في NGS-1 و NGS-5 وتشمل الاختلافات داخل التجربة (أي نشاط الإنزيم) والتباين التقني (الماصات).

ومع ذلك ، من أجل تقليل التباين الناجم عن التقنية ، وزيادة قوة التحليل الإحصائي ، أجرينا الفحص في ثلاث نسخ من ثلاث نسخ (ثلاث نسخ من كل نقاط تخفيف ، في 3 فحوصات مختلفة بإجمالي 18 قيمة لكل عينة كحد أدنى) ، يختلف التقدير الكمي للمكتبتين إحصائياً وأكثر تباينًا عند مقارنته بالنتيجة المقدمة بواسطة ddPCR-Tail (الشكل 4 أ NGS-1 قيمة p المعدلة & lt 0.0001 NGS-5 قيمة p معدلة p & lt 0.0001 ، اختبار مقارنات Sidak المتعددة). يوفر DdPCR-Tail قياسات كمية أكثر استنساخًا مقارنةً بـ qPCR كما هو موضح في المعايرة الست المختلفة لمكتبات HiC. نظرًا لأن ddPCR-Tail حساس للغاية ، كما يتضح من التخفيف الكبير المستخدم من أجل تحديد المكتبات ، يمكن للمرء تطبيق هذه الطريقة لمعايرة المكتبات مع الحد الأدنى من تضخيم PCR: تحريك حدود مادة الحمض النووي اللازمة لتجارب NGS نحو سعة جهاز التسلسل .


2. الاعتبارات المفاهيمية

2.1 الحساسية التحليلية يشير إلى الحد الأدنى لعدد النسخ في العينة التي يمكن قياسها بدقة باستخدام الفحص ، بينما الحساسية السريرية هي النسبة المئوية للأفراد المصابين باضطراب معين والذين يعتبرهم الفحص إيجابيين لتلك الحالة. عادة ، يتم التعبير عن الحساسية باسم الحد من الكشف (LOD) ، وهو التركيز الذي يمكن اكتشافه بدرجة معقولة من اليقين (يشيع استخدامه بنسبة 95٪) باستخدام إجراء تحليلي معين. أكثر LOD حساسية ممكنة من الناحية النظرية هو 3 نسخ لكل PCR (28) ، بافتراض توزيع Poisson ، وفرصة 95٪ لتضمين نسخة واحدة على الأقل في PCR ، واكتشاف نسخة واحدة. تتضمن الإجراءات التجريبية عادةً خطوات معالجة العينة (أي الاستخراج) ، وعند الحاجة ، النسخ العكسي. إذا تم تغيير الحجم وكفاءة هذه الخطوات في الاعتبار ، فيمكن التعبير عن أكثر درجة حساسية ممكنة نظريًا بالوحدات ذات الصلة بالتجربة ، مثل النسخ لكل نانوجرام من الأنسجة. لا ينبغي أبدًا الإبلاغ عن النتائج التجريبية الأقل من الحد الممكن نظريًا. ويترتب على ذلك أيضًا أن نتائج "0" لا معنى لها ومضللة. تقديرات LOD في تحليلات qPCR معقدة بسبب الطبيعة اللوغاريتمية لـ Cف، لأن جف غير معرّف عندما يكون تركيز القالب صفرًا. إن التحديد والنمذجة المناسبة لـ LOD في qPCR هو محور البحث المستمر (26).

2.2 الخصوصية التحليلية يشير إلى فحص qPCR الذي يكتشف التسلسل المستهدف المناسب بدلاً من الأهداف الأخرى غير المحددة الموجودة أيضًا في العينة. خصوصية التشخيص هي النسبة المئوية للأفراد الذين ليس لديهم شرط معين والذين يحددهم الاختبار على أنهم سلبيون لهذا الشرط.

2.3 صحة يشير إلى الاختلاف بين التركيزات المقاسة تجريبياً والتركيزات الفعلية ، المقدمة كتغييرات أضعاف أو تقديرات عدد النسخ.

2.4 التكرار (الدقة قصيرة المدى أو التباين داخل المقايسة) تشير إلى دقة ومتانة الاختبار مع نفس العينات التي تم تحليلها مرارًا وتكرارًا في نفس الاختبار. يمكن التعبير عنها على أنها SD لـ Cف فرق. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام SD أو السيرة الذاتية لرقم النسخ أو تباين التركيز. لا ينبغي استخدام السير الذاتية مع C.فق ، ومع ذلك (29).

2.5 قابلية اعادة الأنتاج (الدقة طويلة المدى أو التباين البيني) يشير إلى التباين في النتائج بين الأشواط أو بين المختبرات المختلفة ويتم التعبير عنه عادةً باسم SD أو السيرة الذاتية لأرقام النسخ أو التركيزات. جف تخضع القيم التي تم إنشاؤها من عمليات التشغيل المختلفة للتغير المتأصل بين الدورات (30) وبالتالي ، يتم الإبلاغ عن interrun Cف الاختلاف غير مناسب.

يجب أن توضح المنشورات التي تصف تركيزات الرنا المرسال للجينات المستهدفة بدقة ما هي الأهداف. يتم تقطيع نسخ معظم الجينات البشرية والعديد من الجينات في الكائنات متعددة الخلايا الأخرى بدلاً من ذلك (31) (32) ، وتحدد متغيرات التضفير هذه الأشكال الإسوية البروتينية البديلة ، مع تباين في أنماط التضفير المبلغ عنها في الأنسجة المختلفة أو في مراحل نمو مختلفة. وبالتالي ، قد تكتشف فحوصات RT-qPCR المستندة إلى exon عددًا من متغيرات لصق ، في حين قد تكون البادئات التي تمتد عبر intron أكثر انتقائية ولكنها قد تفقد بعض متغيرات لصق تمامًا. في الآونة الأخيرة ، تم وصف الجينات الجسمية غير المطبوعة التي تظهر عدم التوازن الأليلي في تعبيرها (33). مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن استخدام اختبار RT-qPCR الذي يستهدف ببساطة واحدًا أو 2 على الأكثر من exons من mRNA لم يعد كافياً لوصف مستوى التعبير لجين معين. وبالتالي ، يجب توفير معلومات التسلسل الخاصة بالبادئات جنبًا إلى جنب مع تقييم خصوصيتها فيما يتعلق بمتغيرات لصق معروفة ومواضع تعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات الموثقة في قواعد بيانات النسخ وقواعد بيانات تعدد الأشكال أحادية النوكليوتيدات. بالنسبة لمجموعات البرايمر المختارة من قاعدة بيانات RTprimerDB (34) (35) ، يمكن القيام بذلك بسهولة عن طريق الرجوع إلى موقع الويب RTprimerDB (http://www.rtprimerdb.org) ، والذي يحتوي على جميع المعلومات ذات الصلة. بالنسبة للمقايسات التجارية ، يلزم توفر معلومات الدُفعة ومعايير المصادقة التجريبية لمقدمي الخدمة. لا يُنصح بشدة بالإبلاغ عن نتائج المقايسات والمقايسات التجارية التي تم التحقق من صحتها في السيليكو فقط.

يجب أن نتذكر أن اكتشاف وجود الرنا المرسال لا يوفر أي معلومات حول ما إذا كان هذا الرنا المرسال سيتم ترجمته إلى بروتين أو ، في الواقع ، ما إذا كان البروتين الوظيفي قد تمت ترجمته على الإطلاق.

لا تستطيع الكيمياء المناعية أو النشاف الغربي أو طرق قياس البروتين الأخرى دائمًا تأكيد بيانات الرنا المرسال الخلوية الكمية. لقد ثبت الآن أنه يوجد في كثير من الأحيان نقص في التوافق بين بيانات تركيز الرنا المرسال والبروتين (36) ، وهو أمر ينطبق بشكل خاص على mRNAs التي تحدد البروتينات التي تشكل جزءًا من مجمعات البروتين متعددة الوظائف (37). أخيرًا ، أصبح من الواضح أن معرفة وجود ووظيفة الرنا الميكروي المحدد مهم لفهم التعبير الجيني بقدر أهمية القدرة على تحديد أنواع الرنا المرسال (38).

من الضروري أيضًا إدراك أن معظم بيانات الحمض النووي الريبي الكمية ليست مطلقة ، ولكنها نسبية. وبالتالي ، فإن الجينات أو المواد المرجعية المستخدمة في التوحيد تعتبر حاسمة ، وأي تقييم لصلاحية تجربة RT-qPCR يجب أيضًا أن يأخذ في الاعتبار مدى ملاءمة مرجع القياس الكمي النسبي. لذلك ، فإن تطوير مواد معايرة DNA و RNA المرجعية العالمية ، على الرغم من أنها مفيدة للغاية (39) (40) ، لن تكون الدواء الشافي الشامل (41) (42).

لا يرجع الكثير من التباين في قيم التعبير المبلغ عنها التي تم إنتاجها في تجارب RT-qPCR ببساطة إلى التباين في البروتوكولات التجريبية ، ولكنه ناتج عن التصحيحات المطبقة بواسطة خوارزميات معالجة البيانات المختلفة ، وكل منها يضع افتراضاته الخاصة حول البيانات. وبالتالي ، على الرغم من إعلان qPCR في كثير من الأحيان على أنه محك أو معيار ذهبي ، إلا أن هذا "المعيار" عمليًا هو معيار متغير ، ويتطلب الإبلاغ عن النتائج قدرًا كبيرًا من التعقيد في التحليل والتفسير (43).


طريقة PMA-qPCR المعدلة للتقدير السريع للكميات القابلة للتطبيق اكتوباكيللوس النيابة. في منتجات الألبان المخمرة

يعتبر التحديد الكمي لبكتيريا حمض اللاكتيك القابلة للحياة مؤشرًا مهمًا لجودة منتجات الألبان المخمرة ، لكن طريقة الكشف الحالية ، وهي عد الصفائح ، تستغرق وقتًا طويلاً. تصف هذه الدراسة مقايسة PMA-qPCR المعدلة التي تسمح باكتشاف وتعداد إجمالي قابل للتطبيق اكتوباكيللوس النيابة. في منتجات الألبان التجارية. هنا ، تم تصميم زوج جديد من البادئات الخاصة بالجنس وتحقيقات الموثق الصغيرة على أساس تسلسل الجينات 16S rRNA من 24 سلالة مرجعية ، 13 منها كانت من مختلف اكتوباكيللوس الأنواع التي يشيع استخدامها في منتجات الألبان المخمرة التجارية. بعد ذلك ، بالمقارنة مع طريقة قتل الحرارة ، تم اختيار طريقة التجانس ذات 20 دورة لتحسين PMA-qPCR الأولي. تم تحضير منحنيات قياسية ، وبلغت الكفاءة التي تم الحصول عليها 97٪ (ص 2 = 0.992) ، مما يدل على أن طريقة PMA-qPCR هذه كانت مجدية وفعالة. بالإضافة إلى ذلك ، قابلة للحياة اكتوباكيللوس النيابة. كان نطاق الكشف 10 3 –10 9 CFU / مل ، والذي يفي بمتطلبات الكشف في منتجات الألبان المخمرة. علاوة على ذلك ، العدد الإجمالي للبقاء اكتوباكيللوس النيابة. في ستة منتجات ألبان مخمرة تجارية مختلفة تم تقديرها بثلاث طرق فردية (عدد الصفائح في MRS agar و qPCR و PMA-qPCR). كانت مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها بواسطة PMA-qPCR وعدد الألواح متشابهة ، وكلاهما انخفض وفقًا لذلك ، مما يدل على وجود علاقة جيدة مع انخفاض حيوية الإجهاد ، بعد 30 يومًا من تاريخ انتهاء الصلاحية. يسمح إجراء PMA-qPCR الذي تم وضعه في هذه الورقة بالتقدير الكمي للقابلية للتطبيق اكتوباكيللوس النيابة. في حوالي 3 ساعات ، مما أدى إلى تحسين كفاءة الكشف بشكل كبير ، وله آفاق تطبيق واسعة في اختبار منتجات الألبان المخمرة.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


التمهيدي التلدين الأمثل

في هذه الخطوة ، يتم خفض درجة حرارة التفاعل للسماح بربط المواد الأولية بالحمض النووي المستهدف. غالبًا ما يكون وقت الحضانة من 0.5 إلى 2 دقيقة كافياً للتلدين التمهيدي. يتم تحديد درجة حرارة التلدين عن طريق حساب درجة حرارة الانصهار (Tم) من البادئات المختارة لتضخيم PCR. القاعدة العامة هي أن تبدأ بدرجة حرارة التلدين أقل من 3 إلى 5 درجات مئوية أقل من أدنى درجة حرارةم من الاشعال.

تيم تُعرَّف بأنها درجة الحرارة التي يكون عندها 50٪ من المادة الأولية والتسلسل التكميلي لها شكل مزدوج ، ويمكن حسابها بعدة طرق. أبسط طريقة في تقدير التمهيدي T.م هو بعدد النيوكليوتيدات الموجودة في قلة الحمض النووي ، باستخدام الصيغة:

نظرًا لأن تركيز الملح (Na +) للتفاعل يؤثر على التلدين التمهيدي ، فإن Tم يمكن حسابها بشكل أكثر دقة باستخدام الصيغة:

تيم = 81.5 + 16.6 (سجل [Na +]) + 0.41 (٪ GC) - 675 / طول التمهيدي

باستخدام الثبات الديناميكي الحراري لكل زوج ثنائي النوكليوتيد متجاور من الأوليجو ، إلى جانب تركيزات الأملاح والبادئات ، Tم يمكن أيضًا حسابها بطريقة تسمى طريقة الجار الأقرب [1،2]. هذه الطريقة هي أيضًا أساس أداتنا عبر الإنترنت لتحديد درجات حرارة التلدين الأولية الموصى بها لبوليميرات الحمض النووي المحددة.

أحد الاعتبارات الهامة في T.م الحساب هو استخدام إضافات PCR والمذيبات المشتركة والنيوكليوتيدات المعدلة. وجود هذه الكواشف يقلل من Tم من مجمع القالب التمهيدي. على سبيل المثال ، يمكن لـ 10٪ DMSO خفض درجة حرارة التلدين بمقدار 5.5-6.0 درجة مئوية [3]. وبالمثل ، فإن استبدال dGTP بـ 7-deaza-dGTP في PCR سيؤدي أيضًا إلى تقليل Tم. في هذه الحالات ، يجب تعديل درجة حرارة التلدين وفقًا لذلك.

لاحظ أن قيمة T المحسوبةم القيمة هي درجة حرارة مرجعية ابتدائية للتلدين التمهيدي. قد تحتاج درجة حرارة التلدين إلى مزيد من التحسين ، اعتمادًا على نتائج التضخيم. على سبيل المثال ، إذا كانت النتائج بلا أو كانت تضخيمًا منخفضًا ، فقد تنخفض درجة حرارة التلدين بزيادات تبلغ 2-3 درجة مئوية أثناء التحسين. ومع ذلك ، إذا ظهرت منتجات PCR غير محددة ، يمكن رفع درجة حرارة التلدين بزيادات تتراوح من 2 إلى 3 درجات مئوية (حتى درجة حرارة الامتداد) لتحسين النوعية (الشكل 4).

الشكل 4. نتائج تضخيم PCR المرتبطة بدرجات حرارة مختلفة للصلب. درجة حرارة التلدين المحسوبة لمجموعة التمهيدي في هذه التجربة هي 54 درجة مئوية.

للمساعدة في تقليل خطوة التحسين هذه وتوفير الوقت ، تم تصميم المخزن المؤقت للتفاعل لبعض بوليميرات الحمض النووي بمكونات متساوية الاستقرار. تزيد هذه الصيغة الخاصة من ثبات الدوبلكس ذي القالب التمهيدي أثناء خطوة التلدين ، وبالتالي تحسين الإنتاجية وتعزيز خصوصية PCR. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح المخزن المؤقت بتليين قالب PCR التمهيدي عند درجة حرارة عالمية (على سبيل المثال ، 60 درجة مئوية) ، حتى مع الاشعال بدرجات حرارة انصهار مختلفة.

فيديو: تعرف على فوائد درجة حرارة التلدين العالمية لـ PCR

تعرف على أهمية خطوة التلدين في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وكيفية التحايل على خطوات التحسين باستخدام المخزن المؤقت PCR المصمم خصيصًا ، وفوائد درجة حرارة التلدين العالمية التي يتم تمكينها بواسطة المخزن المؤقت.

لتحسين درجات حرارة التلدين ، تعد كتل التدرج الحراري المتدرجة خيارات شائعة ، حيث يتم تعيين درجات الحرارة الأعلى والأدنى عبر الكتلة بحيث يمكن تقييم الاختلافات في درجة الحرارة عبر سلسلة من الآبار أو التفاعلات في نفس الوقت. من الناحية العملية ، من الصعب تحقيق تدرج حقيقي مع تحكم دقيق في درجة حرارة الآبار ويوصى باستخدام كتل "أفضل من التدرجات" بوحدات تسخين / تبريد منفصلة للتحكم الدقيق في درجة الحرارة على تحسين PCR (الشكل 5). (تعرف على المزيد: اعتبارات جهاز التدوير الحراري).

الشكل 5. مقارنة بين درجات حرارة الكتلة للدوارات الحرارية التي تستخدم "أفضل من التدرج اللوني" مقابل تقنيات التدرج القياسي.


5. الخلاصة

من المرجح أن يتم اتخاذ قرارات الإدارة بشكل متزايد باستخدام نتائج استطلاعات eDNA ، وبالتالي ، يجب أن تكون البيانات الناتجة عن دراسات eDNA موثوقة ويمكن الدفاع عنها وتنفيذها وفقًا لمعايير ضمان الجودة العالية. يعد تطوير اختبار الحمض النووي البيئي واختباره والتحقق من صحته خطوات حاسمة في العملية ، وهناك حاجة إلى تعريفات واضحة لأداء الفحص في مجتمع eDNA. يعد الإبلاغ عن مقاييس جودة الفحص للأداء في ظروف مثالية بتركيزات معروفة خطوة أولى في أي دراسة لـ eDNA ويجب أن يتبعها عرض توضيحي إضافي للمقايسة باستخدام عينات ميدانية. يوفر فهم حدود الفحص قاعدة صلبة لبناء بقية بروتوكولات مسح eDNA. نصف مجموعة متماسكة من التعريفات وطرق التحديد التي يمكن تطبيقها على دراسات eDNA ، والتعاريف والنهج بدورها توجه تفسير هذه المقاييس واستخدامها. يسهل الإبلاغ الواضح عن هذه المقاييس وغيرها من مقاييس الأداء qPCR تقييم ومقارنة بيانات qPCR عبر الدراسات ويوفر لمديري الموارد أساسًا سليمًا لاتخاذ القرار.


نهج محاكاة لتقييم الحد الأدنى من تكرار PCR في الوقت الحقيقي لتقدير الكمي المعدّل وراثيًا

عادةً ما يستخدم القياس الكمي للمكونات المعدلة وراثيًا (GM) في الغذاء والأعلاف PCR الكمي في الوقت الحقيقي (RT-QPCR). في السنوات الأخيرة ، سهلت العديد من فحوصات RT-QPCR الجديدة زيادة أداء الطريقة. مستوى تكرار العينة ضمن هذه المقايسات هو جانب أساسي يجب مراعاته للحصول على نتائج بثقة عالية. في هذه الورقة ، نصف استخدام نهج النمذجة كما هو مطبق على مجموعات بيانات GM و RT-QPCR ، لتقييم تأثير المستويات المختلفة لتكرار PCR بشكل موضوعي من حيث التباين المرتبط بالنتيجة ، وإثبات أنه من الممكن استخدام مستوى منخفض من النسخ المتماثل دون تقليل لاحق في ثقة النتيجة. باستخدام مجموعة بيانات نموذجية ، نظهر أنه من الممكن تقليل مستوى عينة النسخ المتماثل من ستة إلى ثلاثة مكررات PCR ، دون تغيير كبير في القيمة المتوسطة للنتيجة. يمكن أن يؤدي استخدام مثل هذا النهج إلى تسهيل استخدام الحد الأدنى من التكرارات من أجل الحصول على نتيجة دقيقة ، وبالتالي توفير الموارد الهامة التي تنطوي عليها فحوصات القياس الكمي.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


ملفات بيانات إضافية

تتوفر البيانات الإضافية التالية مع الإصدار عبر الإنترنت من هذه الورقة: شكل يوضح مخططات ثبات تعبير geNorm (ملف بيانات إضافي 1) شكل يوضح متوسط ​​قيمة miRNA CV في مجموعة عينة الورم الأرومي العصبي (ملف بيانات إضافي 2) شكل يوضح cumulative distribution of miRNA CV values (Additional data file 3) a figure showing ChIP-chip results for the miR-17-92 cluster (Additional data file 4) a figure showing ChIP-qPCR results for the miR-17-92 cluster (Additional data file 5) a figure showing ChIP-chip results for the miR-181a-1/miR-181b-1 cluster (Additional data file 6) a figure showing miR-17-92 expression in neuroblastoma cell lines (Additional data file 7) a figure showing overall differential miRNA expression in the neuroblastoma sample set (Additional data file 8) a figure showing fold change expression difference correlation for MYCN downregulated miRNAs (Additional data file 9) a figure showing hierarchical clustering of neuroblastoma cell lines based on miRNA expression (Additional data file 10) a table listing the MIQE checklist (Additional data file 11) a collection of RDML files containing miRNA expression for all data sets (Additional data file 12).


شاهد الفيديو: وحدة 8 حساب المئيين والرتبة المئينية في جدول التوزيع ج2 - القياس والتقويم في التعلم والتعليم (شهر فبراير 2023).