معلومة

قياس الحمض النووي في رباط على الرحلان الكهربائي للهلام

قياس الحمض النووي في رباط على الرحلان الكهربائي للهلام


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا طالب جامعي في السنة الأولى في العلوم وأنا أطرح هذا السؤال على أنه سؤال نظري أكثر من كونه تنفيذ بروتوكول ، لذلك سأكون ممتنًا إذا لم تتضمن الإجابات الكثير من الأسماء الكيميائية المعقدة.

كنت أتساءل كيف يمكن للمرء أن يشرع في تحديد كمية الحمض النووي في نطاق معين على الرحلان الكهربائي للهلام. بعض الأفكار التي خطرت لي حتى الآن هي:

  • قطع شريط الحمض النووي واستخراج الحمض النووي. حدد الكمية باستخدام بعض الطرق المعروفة مثل قياس الامتصاصية عند 260 نانومتر من الحمض النووي في المحلول لإيجاد التركيز.
  • عندما يكون الحمض النووي ملطخًا ببروميد إيثيديوم ، فمن الواضح أنه سيكون هناك عمومًا المزيد من البقع التي يتم امتصاصها في منطقة الشريط إذا كانت تحتوي على المزيد من الحمض النووي ، لذلك سوف يتألق بكثافة أكبر عند إضاءته بضوء الأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك ، لدي تحفظات على استخدام هذه الطريقة لأنني أعتقد أن مقدار البقعة التي يتم امتصاصها سيعتمد أيضًا على حالة الحمض النووي (أي إذا كان ملفوفًا بشكل فائق أم لا) ، ولكن مرة أخرى لا أعرف مقدار التأثير يمكن أن يكون لهذا على مقدار البقع التي يتم امتصاصها. بالطبع ، إذا كنت تعلم أن كل الحمض النووي الخاص بك في نفس الحالة ، فلا ينبغي أن تكون هناك مشكلة في هذه الطريقة على ما أعتقد. على الرغم من أنك هنا يجب أن تدرك أن تركيز بروميد الإيثيديوم في نطاق معين يعتمد على تركيز النيوكليوتيدات هناك ، والذي يعتمد على عدد شظايا الحمض النووي وحجمها (وهو ما يُعرف من موقع النطاق) . قارن هذا بالطريقة النهائية ...
  • أخيرًا ، إذا كان المرء يصنع الحمض النووي على سبيل المثال باستخدام إنهاء سلسلة ديديوكسي / تسلسل سانجر في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فيمكنك استخدام مادة أولية ذات علامات إشعاعية. ستخبرك شدة الصورة على جهاز التصوير الإشعاعي بشكل مباشر بعدد جزيئات جزء الحمض النووي الموجود في النطاق.

كنت أتساءل أي من هذه الخيارات قابلة للتطبيق لاستخدامها في المختبر ، ولماذا / لم لا.


يمكن استخدام جميع الطرق الثلاثة لقياس كمية الحمض النووي. ومع ذلك ، من الناحية العملية ، فإن الطريقة الثانية (التقدير حسب سطوع الصبغة) تعمل بشكل أفضل في سير العمل العادي. يعتمد الأمر حقًا على ما تخطط للقيام به كتطبيق في المصب.

مشاكل الطريقة 1:

  • أحيانًا يكون العائد من طرق تنقية الهلام صعبًا وعرضة للفقد.
  • يمكن أن يؤثر امتصاص الاغاروز المتبقي على النتائج. تنظيف الحمض النووي أمر لا بد منه.

مشاكل الطريقة 2:

  • القياس الكمي صعب حيث يجب عليك تقدير سطوع النطاق مقابل معيار معروف (أضف كمية معروفة من سلمك واستخدمها للتقدير).
  • يؤدي الالتواء الفائق للبلازميدات إلى ظهور نطاقات متعددة ، لذلك يجب إجراء التقدير عدة مرات ثم إضافته (الآن أصبح أقل تقديرًا وأكثر تخمينًا)

مشاكل الطريقة الثالثة:

  • يضيف العمل مع النشاط الإشعاعي قدرًا كبيرًا من بروتوكولات الأمان إلى إجراء بسيط
  • يجب أيضًا التعامل مع جميع المنتجات من العلامات الإشعاعية كمواد مشعة
  • استخدام صورة له نفس المشكلة مثل الطريقة الثانية حيث تقوم بالتقدير بدلاً من القياس الكمي فعليًا.
  • يمكنك الحصول على المزيد من النتائج الكمية من عداد التلألؤ ، ولكن بعد ذلك تصبح المنتجات أكثر صعوبة في الاستخدام بسبب التنقية من سائل التلألؤ (ربما يكون هذا ممكنًا ولكني لم أجربه أبدًا).
  • أنت مقيد بالإجراءات التي قد تتضمن النيوكليوتيدات ذات العلامات الإشعاعية
  • إذا كنت تفعل شيئًا مثل dA-tailing ، فأنت لا تحدد كمية الحمض النووي ، ولكن كمية نسخ النص.

القياس الكمي لكثافة نطاقات الحمض النووي - (27 أكتوبر 2003)

[COLOR = blue] هل يمكن أن تخبرني عن قياس نطاقات الحمض النووي التي حصلت عليها من الفصل الكهربائي للهلام. لدي نظام توثيق هلامي يمكنني التقاط صور للشريط تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. الآن ، أحاول تحديد كثافة العصابات. لدي برنامج لذلك على جهاز الكمبيوتر ، لكن الدليل محير للغاية. إذا كان أي شخص يعرف ذلك ويخبره بطريقة بسيطة أو إذا كان هناك بعض مواقع المعلومات ، فسأكون سعيدًا جدًا للتعلم.

على وجه الخصوص ، لا أستطيع أن أفهم جزء استبدال الضوضاء.

Secil CERTEL
التكنولوجيا الحيوية والهندسة الحيوية

أعلم أن هناك العديد من هذه البرامج حتى برنامج فوتوشوب يمكنه القيام بهذه المهمة. يختلف كل برنامج من حيث كيفية استخدامه. لقد كنت أستخدم واحدًا يسمى Gelquant وهو سهل الاستخدام جدًا. لذلك لا توجد إرشادات عامة حول كيفية تحديد نطاقاتك ، ما عليك سوى قراءة ملف المساعدة الذي يوفره برنامجك بدقة.

شكرا لك pcrman ، لدي برنامج ودليل منه ولكن الأمر محير للغاية؟ ما هو أبسط ما تستخدمه؟


تشغيل هلام الاغاروز وبولي أكريلاميد

يعد الرحلان الكهربائي أحد أكثر الأدوات استخدامًا في علم الأحياء الجزيئي ، ويوفر طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لفصل الأحماض النووية بناءً على الحجم للتقدير الكمي والتنقية. احصل على بعض النصائح حول كيفية تشغيل المواد الهلامية. من هنا يمكنك أيضًا الوصول إلى دليل تفصيلي لاستكشاف أخطاء PAGE وإصلاحها.

يعتبر الرحلان الكهربائي باستخدام المواد الهلامية من مادة الاغاروز والبولي أكريلاميد أحد أكثر الأدوات استخدامًا في البيولوجيا الجزيئية. توفر المواد الهلامية طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لفصل الأحماض النووية بناءً على الحجم للتقدير الكمي والتنقية.

أساسيات

يمكن استخدام المواد الهلامية Agarose لحل أجزاء كبيرة من الحمض النووي. تُستخدم المواد الهلامية بولي أكريلاميد لفصل الأحماض النووية الأقصر ، بشكل عام في نطاق من 1 و 1000 زوج قاعدي ، بناءً على التركيز المستخدم (الشكل 1). يمكن تشغيل هذه المواد الهلامية مع أو بدون مذيب. يشار إلى المواد الهلامية التي يتم تشغيلها بدون مذيب على أنها مواد هلامية أصلية. سوف يهاجر الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي بمعدلات مختلفة ، اعتمادًا على بنيته الثانوية. تسمح المواد الهلامية الأصلية للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي بالبقاء مزدوجًا. ستؤدي إضافة مادة مُحولة إلى الهلام ، مثل اليوريا ، إلى جعل جميع الأحماض النووية بشكل عام منفردة. لن تتشكل البنية الثانوية في تغيير طبيعة المواد الهلامية ، وبالتالي ، فإن طول الحمض النووي فقط سيؤثر على الحركة.

تركيزات مختلفة من الاغاروز والاكريلاميد ضرورية لتحسين دقة الأحماض النووية بأطوال مختلفة. التركيزات المقترحة موضحة أدناه في الجدول 1.

الجدول 1. تركيزات الهلام لفصل الحجم.

Agarose Gels بولي أكريلاميد الهلام
٪ الاغاروز نطاق الحجم للحصول على أفضل نتيجة (BP) ٪ أكريلاميد نطاق الحجم للحصول على أفضل نتيجة (BP)
0.5 1,000-30,000 3.5 1,000-2,000
0.7 800-12,000 5 80-500
1.0 500-10,000 8 60-400
1.2 400-700 12 25-150
1.5 200-500 15 25-150
20 6-100

اعتبارات السلامة

أكريلاميد هو سم عصبي قوي ويمكن بسهولة رشه في شكل مسحوق. تأكد من ارتداء الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات والقناع ، عند وزن الخامة. تبيع العديد من الشركات مادة الأكريلاميد المذابة في الماء أو المواد الهلامية مسبقة الصب. هذه المنتجات أكثر تكلفة قليلاً ولكنها تقلل من خطر استنشاق مادة الأكريلاميد.

بروميد الايثيديوم هي أكثر بقع الحمض النووي المتوفرة شيوعًا ، كما أنها سامة إذا تم استنشاقها ، وتتحلل عند تسخينها لإنتاج غازات سامة ، ويُشتبه في أنها تسبب عيوبًا وراثية [1]. احرص دائمًا على ارتداء القفازات وتجنب سوائل الميكروويف التي تحتوي على بروميد إيثيديوم. الأصباغ الفلورية غير المطفرة المتاحة كبديل تشمل Bio-Safe & trade (Bio-Rad) و SYBR-safe & trade (ThermoFisher) و GelRed Nucleic Acid Stain (Phenix Research Products). في حين أن هذه البقع أكثر تكلفة من بروميد الإيثيديوم ، إلا أن هذه البقع تقلل من الحاجة إلى عزل محطات الفصل الكهربائي للهلام وتطهيرها. لاحظ أن بروميد الإيثيديوم يتحول فقط إلى دنا مزدوج الشريطة ، وبالتالي ، ليس وصمة عار جيدة لتحليل الحمض النووي أحادي الجديلة.

نصائح للهلام الكهربي من مادة الأكريلاميد

  • استخدم بيرسلفات الأمونيوم الطازج (APS). يحفز APS بلمرة الأكريلاميد. سيؤدي استخدام APS أو APS القديم المخزن فوق -20 درجة مئوية إلى بلمرة بطيئة أو غير كاملة. احتفظ بكميات صغيرة وطازجة في الفريزر.
  • اعرف كيف ستهاجر صبغة (أصباغ) التتبع.في المواد الهلامية agarose ، سوف يهاجر Bromophenol Blue و Xylene Cyanol بحوالي 3000 و 300 زوج قاعدي على التوالي. ستهاجر هذه الأصباغ بمعدلات مختلفة في المواد الهلامية من مادة الأكريلاميد اعتمادًا على كثافة الهلام. يوفر الجدول 2 معدل الهجرة التقريبي من حيث الحجم النسبي للحمض النووي أحادي الجديلة / المشوه.
  • TAE أو TBE؟ تستخدم المواد الهلامية Agarose عادةً مخازن Tris-Acetic Acid-EDTA (TAE) أو Tris-Boric Acid-EDTA (TBE). يتميز TAE buffer بأنه يمكن تصنيعه في حلول مخزون 50X. ومع ذلك ، فإنه يحمي بشكل أقل كفاءة ، وفي بعض الحالات ، يؤدي استخدامه إلى نطاقات ملطخة. تنتج المواد الهلامية المخزنة TBE نطاقات أكثر حدة ، خاصة عند استخدام أجزاء صغيرة من الحمض النووي ، ويمكن تشغيلها بجهد أعلى. ومع ذلك ، فإن البورات في TBE يمكن أن تثبط بعض الإنزيمات و mdash بما في ذلك T4 DNA ligase و mdashin DNA المنقى من هذه المواد الهلامية.
  • ما الجهد لاستخدام؟ يمكن تشغيل المواد الهلامية Agarose في نطاق كبير من الفولتية و mdash من 0.25 و ndash7 V / cm. توفر الفولتية العالية الوقت ولكن يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع درجة حرارة الجل ، مما يؤدي إلى ذوبان المواد الهلامية بنسبة منخفضة من الاغاروز. يمكن أن تتسبب الفولتية العالية أيضًا في تلطيخ الشريط ، خاصةً الشظايا و GT10 كيلو بايت. يمكن الحصول على النطاقات الأكثر حدة عن طريق تشغيل المواد الهلامية في TBE طوال الليل عند 0.25 & ndash0.5 V / cm.

الجدول 2. معدلات هجرة الصبغ في المواد الهلامية الأكريلاميد.

المواد الهلامية غير المشبعة تغيير طبيعة المواد الهلامية
٪ أكريلاميد بروموفينول بلو (نيوكليوتيدات) زيلين سيانول (نيوكليوتيدات) بروموفينول بلو (نيوكليوتيدات) زيلين سيانول (نيوكليوتيدات)
3.5 100 460 55 210
5.0 65 260 35 140
8.0 45 160 19 75
12.0 20 70 10 70
15.0 15 60 8 28

* مقتبس من Sambrook J، Fritsch EF، Maniatis T. (1989) in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual، Cold Spring harbour Laboratory.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها الكهربائي للهلام

  • العصابات الباهتة؟ يؤدي الإفراط في استخدام الحمض النووي أو الملح الزائد إلى تكوين شرائط ملطخة و / أو خطوط في الهلام. تحميل الكمية الصحيحة من الحمض النووي (عادة بحد أقصى 100 & ناقص 250 نانوغرام / مم عرض البئر) وعينات تحلية بعمود الدوران قبل التحميل سوف يمنع ذلك.
  • العصابات في المكان الخطأ؟لا تقم بتسخين الأحماض النووية قبل الجري على هلام أصلي ، ولا تتجاوز 20 فولت / سم (تقاس من الأنود إلى الكاثود ، بدلاً من طول الهلام بالكامل) أو السماح للجيل بتجاوز 30 درجة مئوية. لأشد الحزم ، مرري الجل ببطء عند 5 فولت / سم.
  • تحميل العازلة يطفو بعيدا؟ إن شطف الآبار باستخدام المخزن المؤقت قبل التحميل مباشرة هو فشل أساسي في القيام بذلك قد يمنع خليط التحميل من الغرق في قاع البئر ، مما يؤدي إلى نطاق غير متساوٍ وتأخير الهجرة.

مراجع

المؤلفون)

آدم كلور ، دكتوراه ، مدير الدعم الفني للبيولوجيا التركيبية وتطوير أمبير ، IDT.

تم النشر في 17 حزيران (يونيو) 2011
تمت مراجعته / تحديثه في 20 سبتمبر 2017

فك النشرة الإخبارية على الإنترنت

مصادر إضافية

التركيز على المنتج

DNA و RNA Oligos المخصص

تسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، منزوع الأملاح ، غير محمي ، حتى 1 ميكرولتر في أنابيب أو أطباق. تم التحقق منه بواسطة مطياف الكتلة.

قم بتضمين قواعد وتعديلات مختلطة. طلب أحواض منقى ومزدوجة وممزوجة مسبقًا (RxnReady ® Pools).


المواد والأساليب

العينات البيولوجية البشرية وتحضير الحمض النووي

تم التعامل مع العينات البيولوجية البشرية وفقًا للإطار القانوني الوطني (قانون أبحاث الطب الحيوي [يوليو 2007]). تم جمع العينات المستخدمة بعد موافقة مستنيرة من المتبرعين وإخفاء هويتها على الفور. أقرت اللجان العلمية والأخلاقية المحلية الإجراءات التي تمت في هذا العمل (32120017 كود المشروع). كانت العينات المستخدمة (A) 118 من الأنسجة المجمدة في درجة حرارة القطع المثلى (OCT) التفاعلية (Tissue-Tek. ، Cat. No 4583) ، (B) 68 من الأنسجة FFPE ، (C) 119 عينة دم EDTA مجمدة و (D) 26 عينات اللعاب التي تم جمعها في نظام Oragene ® (DNA Genotek، Inc. Cat. No. OG-250). تم جمع العينات وفقًا للتوصيات الدولية وتعليمات الشركة الصانعة.

لعزل الحمض النووي من أحجام العينات العالية ، تم استخدام الأداة Chemagic MSMI (PerkinElmer ، Inc.) القائمة على الخرز البارامغناطيسي (PerkinElmer ، Inc.) لكل عينة حيوية. باختصار ، تم استخدام Chemagic DNA Blood Kit (PerkinElmer، Inc. Cat. No. CMG-703-1) لأقسام الأنسجة ولكن مع بروتين K للأنسجة (PerkinElmer، Inc. Cat. No. 834) و Lysis Buffer 1 لـ الأنسجة (PerkinElmer، Inc. Cat. No. 805). تم أيضًا تنظيف عينات الحمض النووي التي تم الحصول عليها من أنسجة FFPE باستخدام QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen Cat. رقم 51304). تم استخدام ما بين 10 و 18 عشرين قسمًا ميكرومترًا للأنسجة المجمدة OCT وما بين 7 و 10 أقسام ميكرومتر لأنسجة FFPE (يختلف العدد الدقيق للأقسام مع المنطقة التي تشغلها الأنسجة بعد تلطيخ الهيماتوكسيلين). تم استخدام Chemagic DNA Blood Kit (PerkinElmer، Inc. Cat. No. CMG-703-1) لـ 5 مل من الدم الذي تم استبدال جزء البلازما الخاص به بمحلول PBS. أخيرًا ، تم استخدام مجموعة Chemagic DNA Saliva Kit الخاصة (PerkinElmer، Inc. Cat. No. CMG-1035) لـ 2 مل من اللعاب الذي تم جمعه في نظام Oragene (DNA Genotek، Inc. Cat. No. OG-250). تم استخدام مخازن شطف Tris-HCl المقابلة المتوفرة في المجموعات.

التحديد الكمي ونقاوة الحمض النووي عن طريق القياس الطيفي

تم قياس الامتصاصية عند 260 و 280 و 230 نانومتر لـ 2 ميكرولتر من كل عينة DNA في نسختين باستخدام لوحة Nanoquant على أداة Infinite F200 (Tecan Trading AG). تم استخدام المخزن المؤقت المقابل للشطف على أنه فارغ. تم إجراء قياس إضافي عند 340 نانومتر لكل عينة تلقائيًا بواسطة الأداة لتجاوز قيم الامتصاص بسبب ملوثات لوحة Nanoquant. تمت معايرة الماكينة وتنظيفها وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة الموصى بها.

تم حساب تركيز DNA من 260 نانومتر بواسطة الأداة وفقًا لقانون Lambert-Beer. تم استخدام نسبة 260/280 كمؤشر نقاء لعينات الحمض النووي. نظرًا لأن القيمة المثلى لنسبة 260/280 للحمض النووي النقي هي 1.8 ، فقد تم تحديد النسبة المئوية للعينات لكل مجموعة بنسبة نقاء بين 1.6 و 2.0 (1.8 ± 0.2) بشكل إضافي. كما تم تقدير النقاء من نسبة 260/230 لكل عينة DNA وتم تمثيلها مقابل تركيز الحمض النووي.

تحليل سلامة الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي

لمراقبة سلامة الحمض النووي ، تم تحليل 50 نانوغرام من كل عينة من عينات الحمض النووي على أساس القياس الطيفي بواسطة الرحلان الكهربي على هلام الاغاروز 0.8٪ الملون بـ GelRed (Biotium Cat. No. 41003). تم أيضًا فصل Lambda-pUC Mix Marker 4 (Fermentas Life Sciences Cat. No. SM0291) كمرجع للحجم. تم إجراء تحليل قياس الكثافة عن طريق تحديد مساحة مربعة لنطاق HMW أعلى من 20 كيلو بايت ولطاخة. تم حساب النسبة بين كثافات نطاق HMW ومناطق اللطاخة لكل مسار DNA. تم تحديد النسبة المئوية للعينات لكل مجموعة مع وجود نطاق HMW بالإضافة إلى ذلك.

تقدير الكمي والسلامة لعينات الحمض النووي بواسطة PicoGreen

تم استخدام مجموعة مقايسة Quant-iT ™ PicoGreen dsDNA (Life Technologies Cat. No. P7589) لتقدير الحمض النووي عن طريق التألق. تم استخدام Lambda DNA الموجود في المجموعة لإنشاء منحنى قياسي من ست نقاط من 3.125 إلى 100 نانوغرام / مل. تم تخفيف عينات الحمض النووي ذات التركيز المحدد بواسطة 260 نانومتر امتصاص أعلى من 100 نانوغرام / مل وتم تصحيحها لاحقًا من خلال عامل التخفيف. تم تقسيم اثنين ميكرولتر من كل DNA وتخفيف منحنى قياسي في لوحة CORNING 96 Flat Black (Corning، Inc. Cat. No. 3650). 1 × تم استخدام المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) كعنصر تحكم سلبي. تم تخفيف كاشف PicoGreen بنسبة 1: 200 في محلول عازلة 1 × TE وتمت إضافة 198 ميكرولتر إلى كل بئر. تم خلط العينات واحتضانها لمدة 15 دقيقة في الظلام قبل قياس مضانها باستخدام أداة Infinite F200 (Tecan Trading AG).

لتقدير سلامة الحمض النووي ، تم تحديد النسبة بين غلات الاستخراج بالميكروجرام المحسوبة باستخدام PicoGreen والقياس الطيفي. بالنسبة لأقسام الأنسجة ، تم تطبيع المحصول لعينات مختلفة باستخدام المنطقة النووية بالمليمتر المربع الذي تم فحصه من خلال تلطيخ الهيماتوكسيلين. باختصار ، تم عد النوى في المجهر وتم تقدير المساحة المشغولة بالمليمتر المربع باستخدام graticule. تم تقسيم ميكروجرام إجمالي الحمض النووي التي تم الحصول عليها لكل عينة على المنطقة المقدرة.

فحص PCR في الوقت الحقيقي

لمقايسة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي ، تم تضخيم 50 نانوغرام من الحمض النووي من كل عينة من أجل جابده و RPLP0 الجينات (منتجات PCR من 87 و 69 زوجًا أساسيًا [bp] ، على التوالي) في LightCycler ® 96 System (Hoffmann-La Roche Ltd.) باستخدام مجموعة FastStart Essential DNA Green Master (Hoffmann-La Roche Ltd. Cat. No. 064027121001) ). تم تضمين تحكم سلبي في كل مقايسة. لكل عينة ، تم إجراء قرارات مكررة و Cتي تم تحليل القيمة. يتم عرض تسلسل التمهيدي لـ PCR في الوقت الفعلي في الجدول التكميلي S1 (البيانات التكميلية متاحة عبر الإنترنت على www.liebertpub.com/bio).

تضخيم PCR

لتحليل PCR ، تم تضخيم 50 نانوغرام من الحمض النووي من كل عينة من أجل ACVR2B, ZFX, AF4، و جابده الجينات. احتوت خمسة وعشرون ميكرولتر من تفاعلات التضخيم على وحدة واحدة طق بوليميريز DNA (Qiagen Cat. No.201205) dNTPs 0.15 ميكرومتر (Thermo Scientific Cat. No. R0151 ، R0161 ، R0141 ، و R0171) لـ جابده و AF4، و 0.2 ميكرومتر من أجل ZFX و ACVR2B 0.4 ميكرومتر من البادئات المحددة لـ جابده و AF4، و 0.8 ميكرومتر من أجل ZFX و ACVR2B Cl2ملغ 1.5 مم (Qiagen Cat. رقم 201205) لـ جابده، و 2.5 ملم لـ AF4, ZFX، و ACVR2B و 0.5 نانوغرام / ميكرولتر BSA (Sigma-Aldrich Co. Cat. No. B2518-10 MG) ، فقط لـ ACVR2B تفاعل. تم تحليل منتجات PCR البالغة 5049 و 1137 و 400 و 87 نقطة أساس ، على التوالي ، بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام. تم أيضًا فصل سلم DNA GeneRuler ™ 100 bp Plus وسلم DNA GeneRuler 1 kb Plus (Thermo Scientific Cat. No. SM0321 و SM1331 ، على التوالي) كمراجع للحجم. يتم عرض تسلسل التمهيدي لـ PCR في الجدول التكميلي S1.


سلالم الحمض النووي لقياس الكميات وتحديد الحجم

يسر شركة BioCat أن تقدم مجموعة واسعة من واسمات الحمض النووي بكميات محددة نانوغرام لكل نطاق. شركاؤنا الذين يقدمون هذه العلامات هم Norgen و BioVision.

سلالم الحمض النووي الكمي
• تحديد دقيق للحجم
• سهولة تقدير كميات النانوجرام
• نطاقات متباعدة جيدًا مع مراجع عالية الكثافة
• جاهز للاستخدام بدون تحضير
• مستقرة في درجة حرارة الغرفة لأكثر من عامين
• 17 منتجًا من 25 نقطة أساس - 24000 نقطة أساس
• 100 حمولة لكل أنبوب
الجديد حجم عبوة 500 حمولة متاح أيضًا


سلالم نورجين الكمية للحمض النووي تم هندستها وراثيًا بحيث تكون العصابات ذات أحجام دقيقة ومنفصلة. تسهل النطاقات ذات المسافات الجيدة والنطاقات المرجعية عالية الكثافة التحليل المرئي للهلام. هذه السلالم مثالية للقياس الكمي بسبب الكميات الدقيقة المعروفة نانوغرام لكل نطاق.

انظر كتيب المنتج (الرابط أدناه) للحصول على نظرة عامة على علامات نورجين وللتحقق من الكميات لكل نطاق.
للحصول على تحديد دقيق لكتلة نطاقات الحمض النووي الخاصة بك ، انظر الإرشادات المرفقة (الرابط أدناه).

ميزات سلالم Norgen DNA المختلفة هي كما يلي:
MiniSizer 50bp DNA Ladder 25 نقطة أساس - 650 نقطة أساس لحجم منتج PCR وتأكيد الكمية
PCRRanger 100bp DNA Ladder 50 نقطة أساس - 1000 نقطة أساس لتقييم مجموعة من أحجام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل
PCRSizer 100bp DNA Ladder 100 نقطة أساس - 1000 نقطة أساس لتقييم مجموعة من أحجام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (عينة مجانية متاحة ، استخدم الرابط أدناه لطلب عينة مجانية)
سلم الحمض النووي FastRunner 50 نقطة أساس - 2000 نقطة أساس تحجيم سريع لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وهضم التقييد
سلم الحمض النووي LowRanger 100bp 100 نقطة في البوصة - 2000 نقطة في البوصة تحديد استنساخ ملائم
CloneSizer 100bp DNA Ladder 100bp - 2686bp لأوقات تشغيل سريعة وتقييم بصري دقيق
MidRanger 1kb DNA Ladder 300bp - 5000bp تحجيم منتجات PCR الأكبر ومعظم تطبيقات الاستنساخ.
FullRanger 100bp DNA Ladder 100bp - 5000bp نطاق جيد لتطبيقات الاستنساخ الصغيرة والكبيرة.
HighRanger 1kb DNA Ladder 300bp - 10000bp تحديد حجم الحمض النووي المهضوم. (عينة مجانية متاحة ، استخدم الرابط أدناه لطلب عينة مجانية)
HighRanger Plus 100bp DNA Ladder 100bp - 10000bp تحليل الحمض النووي على نطاق واسع من الأحجام.
UltraRanger 1kb DNA Ladder 300 نقطة أساس - 24000 نقطة أساس لتحديد حجم الحمض النووي المهضوم ذو الوزن الجزيئي العالي


يتم تقديم سلالم أكثر من 100 نقطة أساس و 1 كيلوبايت من شريكنا BioVision. يتوفر أيضًا نسخة جاهزة للاستخدام مع Image Green منها. علاوة على ذلك ، تقدم BioVision صبغة الحمض النووي للصورة الآمنة وهي بقعة حمض نووي جديدة وآمنة لتصور الحمض النووي مزدوج السلسلة (dsDNA) والحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل (ssDNA) والحمض النووي الريبي في المواد الهلامية agarose و polyacrylamide (انظر الرابط أدناه). روابط ذات علاقة


البروتوكول: تنقية الهلام

اتبع بروتوكول Agarose Gel Electrophoresis مع التعديلات التالية:

ملحوظة: يعتبر تنقية الجل أكثر فاعلية باستخدام مواد هلامية أقل في المائة ، لذلك سترغب في البقاء في نطاق 0.7-0.8٪ إن أمكن.

ملحوظة: سوف تحتاج إلى عصابات لطيفة ومقرمشة. يمكن تحقيق ذلك باستخدام مشط جل أوسع وتشغيل الجل بجهد أقل.

ملحوظة: ستحتاج إلى مساحة كافية حول كل شريط لقطعه دون وجود حمض نووي في الممرات الأخرى يلوث عينتك. لتحقيق ذلك ، من الأفضل تخطي الممرات بين العينات وبين السلم وأقرب عينة.

ملحوظة: لتقليل مخاطر تلف الحمض النووي ، من الأفضل الحد من التعرض للأشعة فوق البنفسجية للحمض النووي. لذلك ، من الجيد استخدام جهاز تصوير هلامي لالتقاط صورة للهلام قبل قطع النطاقات وستحتاج إلى استخدام الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة لأقصر وقت ممكن لقطع العصابات.

بمجرد تشغيل الجل ، انقله إلى صندوق مفتوح للأشعة فوق البنفسجية (تأكد من ارتداء حماية مناسبة من الأشعة فوق البنفسجية - خاصة لعينيك!) ، قم بإزالته من أي علبة هلامية لأن البلاستيك سيمنع الكثير من الأشعة فوق البنفسجية وبطريقة نظيفة ومعقمة شفرة حلاقة ، قطع جزء الحمض النووي المطلوب من الجل.

ملحوظة: لحماية صندوق الأشعة فوق البنفسجية ، من الجيد وضع الجل على لوح زجاجي إذا كان ذلك متاحًا. على عكس الدرج البلاستيكي ، لن يقلل هذا من الأشعة فوق البنفسجية بشكل كبير ، ولكنه سيحمي صندوق الأشعة فوق البنفسجية من القطع بواسطة شفرة الحلاقة.

ملحوظة: حاول الحصول على أقل قدر ممكن من الجل الزائد حول الشريط. للقيام بذلك ، غالبًا ما يكون من المهم أخذ الشريط المستخرج ووضعه على صندوق الأشعة فوق البنفسجية وتقليم الجزء العلوي والسفلي والجوانب بشفرة الحلاقة. هذا مهم بشكل خاص أثناء خطوة تنقية الحمض النووي ، حيث أن العديد من المجموعات لا يمكنها التعامل مع أكثر من حجم إجمالي معين من الهلام لكل تفاعل.

ضع الجل في أنبوب microfuge المسمى.

باستخدام مقياس ، قم بوزن الأنبوب بجزء الهلام بعد صفير المقياس بأنبوب فارغ. بدلاً من ذلك ، يمكنك فقط طرح وزن الأنبوب الفارغ من وزن الأنبوب بجزء الهلام. يتناسب وزن الجل بشكل مباشر مع حجم السائل الخاص به ويستخدم هذا لتحديد مقدار كل مخزن مؤقت لإضافته أثناء خطوة عزل الحمض النووي.

أخيرًا ، سترغب في عزل الحمض النووي من الجل. يتم إجراء ذلك بشكل شائع باستخدام مجموعة تنقية الهلام التجارية ، مثل QIAquick Gel Extraction Kit. دائما اتبع تعليمات الشركة المصنعة.

ملحوظة: عادة ما يكون من المهم تحديد تركيز الحمض النووي الذي قمت بعزله قبل الانتقال إلى الخطوة التالية المقصودة باستخدام الحمض النووي المنقى الآن بالهلام. يمكنك العثور على مزيد من المعلومات حول تقدير الحمض النووي هنا.


الخطوات العريضة التي ينطوي عليها بروتوكول الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي:

1. تجهيز العينات للتشغيل

2. يتم تحضير محلول هلام agarose TAE

يوفر TAE buffer مصدرًا للأيونات لإعداد المجال الكهربائي أثناء الرحلان الكهربائي. يتم استخدام تركيز الوزن إلى الحجم من الاغاروز في TAE العازلة لتحضير المحلول. على سبيل المثال ، إذا كان جل الاغاروز 1٪ مطلوباً ، 1 جرام من الاغاروز يضاف إلى 100 مل من TAE. يتم تحديد نسبة الاغاروز المستخدمة من خلال حجم أو صغر حجم الحمض النووي المتوقع. إذا كان المرء يبحث في فصل مجموعة من نطاقات الحمض النووي الأصغر حجمًا (& lt500bp) ، يتم تحضير نسبة أعلى من هلام الاغاروز (& gt1٪). تخلق النسبة الأعلى من الاغاروز غربالًا أكثر كثافة لزيادة فصل الاختلافات الصغيرة في طول الحمض النووي. يتم تسخين محلول agarose-TAE لإذابة agarose.

3. صب الجل

حل الاغاروز TAE هو سكب في علبة الصب أنه بمجرد أن يبرد محلول الهلام ويصلب ، يتم تكوين لوح جل به صف من الآبار في الأعلى.

4. إنشاء غرفة التفريد

يتم وضع الهلام الصلب في غرفة مملوءة TAE العازلة. يتم وضع الجل بحيث تكون آبار الغرفة الأقرب إلى القطب السالب للغرفة.

5. تحميل الجل

ال آبار غرفة الهلام محملة بعينات الحمض النووي وعادة ما يتم تحميل سلم الحمض النووي أيضًا كمرجع للأحجام.

6. الرحلان الكهربائي

يتم توصيل الخيوط السالبة والموجبة بالغرفة ومزود الطاقة حيث يتم ضبط الجهد. يؤدي تشغيل مصدر الطاقة إلى إعداد المجال الكهربائي وستبدأ عينات الحمض النووي ذات الشحنة السالبة بالانتقال عبر الهلام وبعيدًا عن القطب السالب باتجاه الموجب.

7. وقف الكهربائي وتصور الحمض النووي

بمجرد أن تنتقل الصبغة الزرقاء في عينات الحمض النووي عبر الهلام بدرجة كافية ، يتم إيقاف تشغيل مصدر الطاقة وإزالة الجل ووضعه في محلول بروميد إيثيديوم. بروميد الإيثيديوم يقحم بين الحمض النووي ويكون مرئيًا في ضوء الأشعة فوق البنفسجية. في بعض الأحيان يضاف بروميد الإيثيديوم مباشرة إلى محلول هلام الاغاروز في الخطوة 2. يتم بعد ذلك تعريض الجل المصبوغ ببروميد الإيثيديوم لضوء الأشعة فوق البنفسجية والتقاط صورة. يتم تصور عصابات الحمض النووي في كل حارة المقابلة لبئر الغرفة. يتم أيضًا تصور سلم الحمض النووي الذي تم تحميله ويمكن تقدير طول نطاقات الحمض النووي. ويرد مثال في الشكل أدناه.


عزل الحمض النووي الجيني

تعتبر الإنتاجية والنقاء والنزاهة ضرورية للأداء في تطبيقات المصب مثل PCR والتسلسل. تحسين منهجيات الاستخراج هو مفتاح النجاح مع أنواع العينات الصعبة وتطبيقات المصب. يجب أن يكون الحمض النووي المستهدف المنقى خاليًا من الملوثات ، بما في ذلك البروتينات والمكونات الخلوية الأخرى والأحماض النووية غير المرغوب فيها.

قد تكون هناك حاجة إلى مجموعات تنقية خاصة من نوع العينة للعينات الأكثر تعقيدًا والتحدي التي تحتوي على الحمض النووي المتحلل أو التي تحتوي على تركيزات منخفضة من الحمض النووي. تشمل أنواع العينات الصعبة أنسجة FFPE أو البلازما أو المصل المحتوي على حمض نووي خالٍ من الخلايا أو عينات الطب الشرعي أو أي مصدر تكون فيه كمية العينة محدودة.

كانت Promega واحدة من أوائل الشركات التي قدمت مجموعات لتنقية الحمض النووي ، وكذلك البلازميدات ، مع أكثر من 30 عامًا من الخبرة في استخراج الحمض النووي. نحن نقدم مجموعة واسعة من مجموعات استخراج الحمض النووي الجينومي المناسبة لمجموعة متنوعة من أنواع العينات واحتياجات الإنتاجية ، مما ينتج عنه عوائد عالية وحمض نووي عالي الجودة لاستخدامه في تطبيقاتك النهائية. تغطي منتجاتنا مجموعة متنوعة من خيارات الإنتاجية وطرق المعالجة المناسبة لاحتياجاتك الخاصة و [مدش] من الإعدادات الفردية اليدوية إلى الأنظمة الآلية الصغيرة أو الكبيرة الحجم.

باستخدام الطرق القائمة على الدوران أو الفراغ أو المغناطيسية ، فإن حلول الإعداد الفردي اليدوية لدينا هي الأفضل لمعالجة أقل من 24 عينة في المرة الواحدة. إذا كنت تبحث عن حل تلقائي ، فإن أطقمنا التي تعتمد على الخرطوشة للاستخدام مع Maxwell & reg Instruments يمكنها معالجة ما يصل إلى 48 عينة في نفس التشغيل. نقدم أيضًا خيارات استخراج عالية الإنتاجية مؤتمتة بالكامل باستخدام طرق معالجة قائمة على الألواح ، متوافقة تمامًا مع منصات معالجة السوائل.

على الرغم من أن تقنيات مثل النشاف الجنوبي ، والتي تتطلب كميات ميكروغرام من الحمض النووي ، لا تزال تُجرى في مختبرات البيولوجيا الجزيئية ، إلا أن معظم تقييمات الحمض النووي الصبغي تتم بواسطة تقنيات تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). وهي تشمل PCR أحادي أو متعدد الإرسال ، مصفوفات SNP ، التحليل و PCR في الوقت الحقيقي ، ddPCR وتسلسل الجيل التالي (NGS). تستخدم هذه التقنيات الأخيرة كميات نانوجرام من الحمض النووي لكل تفاعل. بغض النظر عن النظام المختار ، توفر مجموعات تنقية الحمض النووي الجينومي من Promega العوائد المطلوبة من الحمض النووي عالي الجودة مع الحد الأدنى من الملوثات.

أنظمة التنقية اليدوية

الأنظمة القائمة على الحلول

تقدم Promega أنظمة عزل الجينوم DNA على أساس تحلل العينة بواسطة المنظفات والتنقية بطرق مختلفة. وتشمل هذه الأنظمة القائمة على الغشاء (على سبيل المثال ، نظام تنقية الحمض النووي الجيني (Cat. # A2360 ، A2361) أو نظام تنقية الحمض النووي الجيني عالي الإنتاجية ، 96-well Wizard & reg SV 96 Genomic DNA Purification System (Cat. # A2370 ، A2371) وأنظمة السيليكا المغناطيسية المؤتمتة بسهولة. كل هذه الأنظمة تنقي الحمض النووي الجيني القابل للاستخدام في العديد من التطبيقات النهائية.

إن مجموعة أدوات تنقية DNA الجينومية Wizard & reg (Cat. # A1120 ، A1125 ، A1620) هي نظام متعدد الاستخدامات وقابل للتطوير لعزل الحمض النووي الجيني باستخدام طريقة تعتمد على الترسيب. مع هذا النظام وحده ، يمكن عزل الحمض النووي الكروموسومي من الدم الكامل (5) ، أوراق النبات (6) ، البكتيريا موجبة الجرام (7) والبكتيريا سالبة الجرام (8) ، ذيل الفأر (9) والخميرة (10). كما تم استخدام أنواع عينات إضافية مثل الفطريات (11) وأنسجة الضفادع المصابة المضمنة في البارافين (12) واللعاب (13) وخنافس الدقيق (14) بنجاح.

لا ينجح نظام تنقية الجينوم هذا مع العديد من أنواع العينات فحسب ، بل يمكن أيضًا تحجيمه بسهولة من أجل كمية مواد البدء عن طريق ضبط أحجام الكاشف لتلائم احتياجاتك.

الأنظمة المستندة إلى العمود

الأنظمة التقليدية القائمة على الأعمدة

للعزل أحادي العمود ، يوفر نظام Wizard® SV Genomic DNA Purification System تقنية سريعة وبسيطة لتحضير الحمض النووي المنقى والسليم من ذيول الفئران والأنسجة والخلايا المستنبتة في أقل من 20 دقيقة ، اعتمادًا على عدد العينات المعالجة (حتى 24 عن طريق الطرد المركزي ، اعتمادًا على حجم الدوار ، أو حتى 20 عن طريق الفراغ). يتم استخدام مشعب فراغ أو جهاز طرد مركزي صغير لمعالجة العينات. مع بعض التعديلات ، يمكن أيضًا استخدام الدم الكامل مع نظام العزل هذا (15). هذا نظام قائم على غشاء السيليكا ، مما يعني أن هناك قيودًا على كمية المواد التي يمكن تحميلها على عمود SV واحد يصل إلى 20 مجم من الأنسجة (ذيل فأر أو نسيج حيواني) أو بين 1 × 10 4 و 5 × 10 6 يمكن معالجة خلايا زراعة الأنسجة لكل عملية تنقية. مع المزيد من العينة ، قد تحتاج المحللة المعدة إلى تقسيمها بين عمودين أو أكثر لتجنب الانسداد.

الشكل 2. تضخيم الحمض النووي المعزول من مصادر الأنسجة المختلفة باستخدام Wizard & reg SV Genomic DNA DNA Purification System. تم تضخيم ميكروليتر واحد من الحمض النووي الجيني المنقى باستخدام PCR Master Mix (Cat. # M7502) وأشعال IL-1 و beta الخاصة بالماوس (منتج 1.2 كيلوبايت). تم إجراء التفاعلات مع DNA الجينوم الماوس (Cat. # G3091 + C) وبدون DNA (& ndashC) كعناصر تحكم إيجابية وسلبية ، على التوالي. كانت ظروف التدوير الحراري: دورة واحدة مدتها 3 دقائق عند 95 درجة مئوية تليها 30 دورة: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 70 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة و 30 ثانية تمديد نهائي عند 70 درجة مئوية لمدة 7 دقائق 4 درجة مئوية ونقعها. احتوت جميع الممرات على 10 ميكرول من منتج التفاعل مفصولة على هلام الاغاروز 1٪. تم تصور منتجات PCR بواسطة تلطيخ بروميد الإيثيديوم. تشير التعيينات & ldquoSpin & rdquo و & ldquoVacuum & rdquo إلى البروتوكول المستخدم لعزل الحمض النووي الجيني.

الحمض النووي الجينومي المعزول باستخدام نظام Wizard® SV الجينومي لتنقية الحمض النووي ذو جودة عالية ويعمل بشكل جيد في تحليل هلام الاغاروز ، وهضم إنزيمات التقييد وتحليل PCR كما هو موضح في الشكل 2. يقدم الجدول 1 عوائد نموذجية للحمض النووي الجيني المنقى من مجموعة متنوعة من مصادر.

الجدول 1. إنتاجية الحمض النووي الجينومي النموذجي من أنسجة مختلفة باستخدام نظام Wizard® SV Genomic DNA Purification System.

عينة كمية متوسط ​​العائد
قص الذيل 20 ملغ 20 ميكروغرام
كبد 20 ملغ 15 ميكروغرام
قلب 20 ملغ 10 ميكروغرام
مخ 20 ملغ 6 ميكروغرام
خلايا CHO 1 × 10 6 5 ميكروغرام
خلايا NIH / 3T3 1 × 10 6 9 ميكروغرام
293 خلية 1 × 10 6 8 ميكروغرام

استخدم الباحثون هذا النظام البسيط والسريع للعديد من أنواع العينات الإضافية والتطبيقات بما في ذلك البعوض (16) ، والخلايا الجذعية للثدي (17) ، العصوية الرقيقة (18), الإشريكية القولونية (19) ، شكل اليرقات من البلهارسيا المنسونية طفيلي (20) والحمض النووي الفيروسي من خلايا BC3 المصابة بفيروس Kaposi & rsquos sarcoma (21).

للحصول على عزل عالي الإنتاجية ، 96 بئرًا ، يتوفر نظام Wizard & reg SV 96 Genomic DNA Purification System. يمكن عزل الحمض النووي الجيني القابل للتضخيم من 5 مرات أو 10 6 خلايا ، أو 20 مجم من الأنسجة أو ما يصل إلى 1.2 سم من طرف ذيل الفأر دون الطرد المركزي للمحلول قبل التنقية.

This multiwell system requires a vacuum manifold (Vac-Man® 96 Vacuum Manifold, Cat.# A2291) and a vacuum pump capable of generating 15&ndash20 inches of mercury or the equivalent. Genomic DNA was isolated from three different source types then used in a monoplex PCR and run on an agarose gel as shown in Figure 3. Figure 4 compares the yield from the three Wizard® SV Genomic DNA purification methods (96-well plate, vacuum and centrifugation).

Figure 3. Agarose gel electrophoresis of PCR products amplified from 1µl of mouse tail, CHO cells and tomato leaf sample genomic DNA isolated using the Wizard® SV 96 Genomic DNA Purification System. A total of 10µl of PCR product is visualized on a 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide. اللوحة أ. IL-1&beta (1.2kb) amplified from mouse tail. اللوحة B. &beta-actin (250bp) amplified from CHO cells. Panel C. Chloroplast DNA (600bp) amplified from tomato leaf. Lane M, 1kb DNA Ladder (Cat.# G5711).

Figure 4. Comparison of DNA yields using the Wizard® SV and SV 96 Genomic DNA Purification Systems. Average yield of genomic DNA in micrograms purified from 20mg mouse tail clippings. The average A260/A280 ratios are: SV 96, 1.7 ± 0.08 SV vacuum method, 1.7 ± 0.14 SV spin method, 1.7 ± 0.14.

High-Performance Column-Based Systems

We offer two different ReliaPrep&trade gDNA Miniprep Systems that purify genomic DNA using a cellulose column-based method: ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep System (Cat.# A5081, A5082) and ReliaPrep&trade gDNA Tissue Miniprep System (Cat.# A2051, A2052). Both are ready-to-use systems that obtain intact genomic DNA without using ethanol washes or precipitations. The ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep System processes 200&mul of blood or body fluid, either fresh or frozen, in less than 40 minutes. Yields from blood are typically 4&ndash10&mug, depending on the white blood cell count. Up to 25mg of tissue, a buccal (cheek) swab or a 1cm mouse tail can be processed with the ReliaPrep&trade gDNA Tissue Miniprep System and the eluted DNA recovered in 30 minutes or less. The purified DNA can be eluted in as little as 50µl and is suitable for use in downstream applications such as RT-qPCR.

Figure 5. The yield of genomic DNA from the ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep System varies with white blood cell count. Whole blood was obtained from several individuals, and white cell counts were determined using a hemocytometer. Two hundred microliters of blood was used for genomic DNA purification (n = 3 or 4), and the amount of isolated gDNA was quantitated by absorbance spectroscopy.

Figure 6. Comparison of elution volume with concentration, yield and purity. Aliquots of blood (200&mul) were processed using the ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep System (n = 4) and eluted with 30&ndash200&mul of Nuclease-Free Water. Concentration (Panel A), total yield (Panel B) and purity (Panel C) were assessed using absorbance spectroscopy. Yield decreased slightly with decreases in elution volume, while concentration increased. Purity as measured by optical density ratios remained constant.

Automated Systems for DNA Purification

As laboratories try to improve productivity for research, diagnostics and applied testing, the need has increased for easy-to-use, low- to moderate-throughput automation of purification processes. Automation eliminates the hands-on time and labor of manual purification, giving you more time and energy to focus on your research.

Cartridge-Based Systems

Traditionally, automation refers to the use of large, specialized and costly equipment that requires extensive training to operate and maintain. Promega has developed the Maxwell® Systems, which provide flexible, reliable, compact and easy-to-use alternatives to traditional automated systems.

The Maxwell® Systems are designed for efficient, automated purification from a wide range of sample types (see Table 2). Maxwell® Instruments are supplied with preprogrammed automated purification methods, and can process up to 48 samples in as little as 30–40 minutes (depending on instrument, sample type and method). The purified concentrated DNA or RNA are high quality and high yield, making them compatible with many common downstream applications, including qPCR, ddPCR, genotyping, sequencing and NGS.

الشكل 7. The Maxwell® RSC (left) and Maxwell® RSC 48 (right).

Table 2. DNA yield from various sample types after purification using the Maxwell® RSC Instrument and DNA Purification Kits.

Up to 50mg of liver tissue
Up to 50mg of lung tissue

Maxwell® Kits offer predispensed reagent cartridges for purification of genomic DNA, RNA and Total Nucleic Acid. Application and sample type-focused kits make the Maxwell® Instruments a versatile extraction instrument for laboratories that may work with one or all of these different applications.

الشكل 8. The Maxwell® RSC DNA or RNA extraction methods start with cartridges prefilled with purification reagents and paramagnetic particles, ready for your samples. After sample addition, the Maxwell® RSC moves the paramagnetic particles and associated nucleic acids through multiple steps ultimately yielding highly pure RNA or DNA in 30–100µl.

The Maxwell® Systems purify samples using paramagnetic particles (PMPs), which provide a mobile solid phase that optimizes sample capture, washing and elution of the nucleic acid. The Maxwell® Instruments are magnetic-particle-handling instruments that efficiently bind nucleic acids to the paramagnetic particle in the first well of a prefilled cartridge. The samples are processed through a series of washes before the nucleic acid is eluted. The systematic magnetic particle-based methodology used by the Maxwell® Instruments avoid common problems associated with automated liquid handler-based purification systems, such as clogged tips or partial reagent transfers, which can result in suboptimal purification processing.

The benchtop-compact Maxwell® Instruments are easy to set up and require no special training for use. Optimized automated methods are preloaded, the prefilled reagent cartridges are snapped into place, your sample is added and you select "Start" to begin the appropriate method. A full list of nucleic acid extraction kits is available here.

Several Maxwell® Instrument reagent kits are available and allow optimal extraction from a variety of sample types, including blood, serum and plasma, formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue, bacteria, plant, food and animal tissue.

Maxwell® HT Systems allow purification of DNA or RNA at scale on any laboratory liquid handler in 24- or 96-well SLAS format. Maxwell® purification chemistries use novel magnetic particle-based solutions that naturally decrease contamination carryover.

In addition to trusted chemistry, you&rsquoll gain expert support to get started with automation or optimize your current HT workflow. Our team of automation experts can offer assistance with most of the leading laboratory automation providers in the world and help you develop and implement an automated nucleic acid purification solution customized to the needs of your laboratory.

Genomic DNA Extraction Kits

Looking for extraction options by sample scale or type? Explore our DNA extraction portfolio to discover the right solution for your purification needs.

Scalable Automation Solutions

The Maxwell® RSC Instruments provide a compact, automated nucleic acid purification platform that processes up to 16 (Maxwell ® RSC) or up to 48 (Maxwell ® RSC 48) samples simultaneously.

High-throughput Purification Chemistries and Automation Support

Maxwell® HT chemistries allow automation of nucleic acid purification on liquid handlers. Our team of automation experts offer assistance to help develop and implement an automated nucleic acid purification solution customized to the needs of your laboratory.

High-Throughput Systems for Genomic DNA Isolation

Promega offers several automated high-throughput options to isolate genomic DNA isolation from blood samples. Some laboratories, such as biobanks, have a desire to isolate DNA from large amounts of starting material (e.g., 10ml of blood). The ReliaPrep &trade Large Volume HT gDNA Isolation System (Cat.# A2751) provides an effective means for isolation of genomic DNA derived from blood fractions derived from 2.5&ndash10ml samples of whole blood. This chemistry can be automated onto liquid handlers by using a Promega HSM device, which enable processing of purification reactions in 50ml conical tubes.

Liquid level sensing and instrument operating software scale the chemistry to sample input volume for each individual sample, reducing reagent waste and expense. The automated system can also process sample in 14ml tubes using the Low Volume Adapter XAT1020 (LVA and Methods) which enables processing samples from 0.25&ndash3ml.

There are no tedious centrifugation steps or hazardous chemicals, which are inherently handling workstation, offering walkaway purification of genomic DNA from whole blood, regardless of sample storage or shipping conditions.

الشكل 9. DNA was isolated from whole blood via three methods, separated by CHEF gel electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining. DNA isolated using the ReliaPrep&trade Large Volume HT gDNA Isolation System provided DNA with a size range of 20–125kb precipitation-based purification isolated DNA with a size range of 20–200kb while column-based methods demonstrated gDNA with a size of 20–75kb.

There is an option for low-throughput isolation of gDNA from up to 32 samples at one time when the Heater Shaker Magnet Instrument (HSM 2.0 Cat.# A2715) is used on a bench versus integrated on a liquid handler where the user dispenses and aspirates reagents from the samples as directed by the software on a computer screen. The preprogrammed methods control the heating, shaking, magnetization and timing of the steps required for the semi-automated purification.

In addition to whole blood, a variety of other sample types can also be processed, including stabilized saliva, buccal wash samples, blood fractions, buffy coats, red cell pellets and all cell pellets. For fully automated purification, the HSM 2.0 Instrument can be integrated with a robotic liquid-handling workstation.

Automating reagents onto instrumentation requires a carefully planned and executed approach. Collaborating with Promega gives you access to scientists who have designed automated purification for hundreds of labs, across a wide range of sample types.

Automating reagents onto instrumentation requires a carefully planned and executed approach. Collaborating with Promega gives you access to scientists who have designed automated purification for hundreds of labs, across a wide range of sample types.

Figure 10. Automated DNA yields for blood fractions. DNA yield is linear with respect to original volumes of blood. Panel A. DNA yields as determined by NanoDrop spectrophotometer. Panel B. DNA yields as determined using the QuantiFluor&trade dsDNA System. All samples were prepared from a single donor. Manual samples were processed using the Wizard® Genomic DNA Purification Kit. Each point is the mean of n=4 values with error bars of 1 standard deviation.

Custom HT Nucleic Acid Purification

Implementing automated nucleic acid purification technologies onto your high-throughput workflow can be challenging and time-consuming. Our Field Support Scientists can provide the support you need to get started.

Selected DNA Purification Kits by Sample Type

Learn more about some of our specialized kits below, and explore the breadth of our portfolio and compare our DNA extraction kits with the help of our product comparison page to discover the right solution for your DNA purification needs.

Fixed-Tissue Genomic DNA Isolation

The MagneSil® Genomic, Fixed-Tissue System (Cat.# MD1490), provides a fast, simple technique for the preparation of genomic DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. After an overnight Proteinase K digestion, genomic DNA can be manually purified from FFPE thin tissue sections in less than an hour. Amplifiable genomic DNA can be isolated from 10μm sections without centrifugation of the lysate prior to purification. Up to 12 samples can be processed in the manual format using a MagneSphere® Technology Magnetic Separation Stand (Cat.# Z5332, Z5342).

Figure 11. Analysis of DNA purified from paraffin-embedded, formalin-fixed 10µm thin sections using the MagneSil® Genomic, Fixed Tissue System. Purified DNA was amplified, and the amplification products were analyzed on an ABI PRISM® 310 or 3100 genetic analyzer. Panel A. Amplification with a set of 16 fluorescently labeled primers. Amplification products range in size from 104 to 420 bases. Panel B. A 972-base fragment amplified using an amelogenin primer set. Panel C. A 1.8kb fragment amplified from the Adenomatosis polyposis coli (APC) الجين. Increasing the extension time during amplification may help to balance yields between small and large amplification products and increase yields for large amplification products. Results will vary depending on the degree of cross-linking due to formalin fixation.

One advantage this system has over other purification methods, such as phenol:chloroform extraction, is its ability to remove most inhibitors of amplification, including very small fragments of DNA. Tissue that has been stored in formalin for extended periods of time may be too cross-linked or too degraded to perform well as a template for amplification. Figure 11 shows an amplification of 16 short tandem repeat (STR) loci and demonstrates how well the isolated DNA can work in multiplex PCR using the PowerPlex® 16 HS System (Cat.# DC2101, DC2100).

The Maxwell® RSC FFPE Plus DNA Kit (Cat.# AS1720) is an automated method for purifying up to 48 samples of one to ten 5μm sections of FFPE tissue samples on the Maxwell® RSC Instrument (Cat.# AS4500 1–16 cartridges per run) or Maxwell® RSC 48 Instrument (Cat.# AS8500 1–48 samples per run). The FFPE Plus chemistry is designed to provide high yield of DNA from FFPE when measured by spectroscopy that is suitable for amplification applications including qPCR, multiplex PCR and NGS. The protocol provides flexibility with either a 1-hour quick deparaffinization or 24-hour overnight protocol to fit your work flow needs.

The Maxwell® RSC DNA FFPE chemistry is Promega’s latest FFPE technology and has been designed to provide highly amplifiable DNA. Save time and labor by utilizing either FFPE chemistry with the Maxwell® Instruments, and avoid exposure to hazardous xylene utilized in other FFPE purification products. Our quality testing has also demonstrated virtually no PCR inhibitors in purified DNA samples, making your PCR and other downstream applications a breeze.

Utilizing the same chemistry as the Maxwell® RSC FFPE DNA, the Maxwell® HT DNA FFPE Isolation System (Cat.# A6372) provides a simple and reliable method for high-throughput, rapid isolation of genomic DNA from FFPE tissue samples. The system does not require an organic solvent, making it safe and convenient to use, and the purified DNA can be used directly in a variety of downstream applications, including PCR and NGS.

The Maxwell® HT DNA FFPE Isolation System purifies nucleic acid using paramagnetic particles, which provide a mobile solid phase to optimize binding, washing and purification of gDNA. The use of paramagnetic particles for DNA isolation eliminates the need for centrifugation or vacuum manifolds, making the system suitable for full automation.

As FFPE samples can have widely varying quality due to the nature of the sample fixation and embedding process, QC of samples can be an important part of the FFPE workflow.

Figure 12. Comparative data of the Maxwell® RSC DNA FFPE chemistry versus the Maxwell® RSC FFPE Plus DNA chemistry. The Maxwell® RSC FFPE Plus DNA method has been observed to produce more yield by absorbance and fluorescence, while the Maxwell® RSC DNA FFPE method produces more yield by PCR.

قياس الطيف الضوئي is a common way to evaluate the quality of extracted DNA and RNA. Most laboratories have a NanoDrop Microvolume Spectrophotometer (or similar device) and they are incredibly easy to use. Pipette 1-2µl of sample, select “Analyze” and the instrument provides a read out of concentration and purity via A260/A280 و أ260/A230 ratios in just a few seconds. These devices have revolutionized routine sample quantitation in the lab, but is it the best method for assessing FFPE samples? There are two main considerations when using a NanoDrop: sensitivity and integrity. FFPE samples can have a wide-ranging yield of DNA or RNA often as little as 10ng or less in a volume ranging from 10µl to 100µl from an extraction. This can result in sample concentrations below the NanoDrop’s linear range. In addition, as a spectrophotometer, it does not differentiate between RNA, DNA or free nucleotides, which can result in dramatic inaccuracies in DNA/RNA concentration measurements. Finally, there is no way to determine if a sample is accessible to downstream enzymatic assays since it cannot detect the presence or absence of crosslinks (or other damage) within a sample.

Dye-Based Quantitation like the Promega QuantiFluor® dsDNA System (Cat.# E2670, E2671), provides a rapid and significantly more sensitive method to quantitate dsDNA or RNA compared to absorbance spectroscopy. This method provides a broadly useful estimate of concentration. When considering FFPE samples, it is important to note that dye-based quantitation does not estimate the integrity of the DNA/RNA or the extent of cross-linking in the sample, which could affect success in downstream assays.

Sizing Assays (e.g., agarose gel, Tape station, fragment analyzer, DV200) can provide an estimate of concentration and—more importantly—information on the size distribution of the fragments in the sample. FFPE-derived DNA, due to the fixation process, can be significantly fragmented compared to DNA from freshly frozen tissue. Below is a fragment analyzer trace (Figure 13) and associated DV200 scores (Table 3) of DNA isolated from FFPE sections using five different purification methods. While the sizing traces do assess the distribution of DNA size purified, it does not measure the degree of cross-linking within the sample or the presence of inhibitors.

الشكل 13. Fragment analyzer trace of DNA isolated from FFPE sections using five different purification methods.

Table 3. DV200 scores of DNA isolated from FFPE sections using five different purification methods in fragment analyzer trace (Figure 13).

طريقة 1 (Light Green) 2 (Blue) 3 (Red) 4 (Orange) 5 (Green)
DV200 71.8 69.9 70.1 58.7 80.5

For example, when the same samples were quantitated by qPCR assays of various targets and fragment sizes, the yield by qPCR does not correlate well with the DV200 scores. In fact, in this example, the samples with the lowest DV200 scores had the greatest yield by qPCR (Figure 14).

الشكل 14. qPCR yields of DNA isolated from FFPE sections. The same samples of DNA isolated by five different purification methods in the fragment analyzer trace and DV200 table above were quantitated by qPCR assays of various targets and fragment sizes.

While there are general trends, the DV200 score does not necessarily correlate with success in downstream assays such as qPCR.

qPCR has several advantages for the quantitation of FFPE samples. First, qPCR can be very sensitive, requiring only a small amount of sample and detecting pg/µl amounts of DNA. In terms of sensitivity in nucleic acid detection, it is surpassed only by ddPCR. qPCR can also provide a measure of how degraded or crosslinked a DNA sample may be since nucleic acid must be a suitable substrate for a DNA polymerase for a signal to be generated. Absorbance may not represent the sample suitable for the downstream assay because it will detect DNA, fragmented DNA and nucleotides. Finally, most qPCR QC assays, such as the ProNex® DNA QC Assay (Cat.# NG1004, NG1005) provide internal controls which are used to detect the presence of inhibitors in the sample prior to attempting a more expensive assay. This can help you assess not only the integrity of the nucleic acids, but also the likelihood of an amplification-based assay to be successful.

NGS is another assay used by some labs to QC their samples. There are several reasons for this. Some labs are trying to get as much data as possible from very precious samples, in which case any sequence information may be worth the expense and risk of failed sequencing runs. As a QC test, NGS may provide a lot of information, but it is expensive and can require large amounts of sample and time. Some labs run low pass NGS, which uses highly-multiplexed samples to lower the cost per sample to determine if it is worth the time and resources to sequence deeper. Most sequencing and purification providers recommend qPCR assays to quantitate FFPE DNA, as all NGS workflows depend primarily on the success of enzymatic amplification steps to obtain sequencing-ready DNA as part of library preparation steps.

Table 4. Comparative Pros and Cons of Various QC Assays.

طريقة سرعة حساسية Quantitative? Measure Purity? Assess size of NA? Detect Cross- linking? كلفة
Spectrophotometry (NanoDrop) +++ + Semi - quantitative + - - $
Dye-Based Quantitation +++ ++ ص - - - $
DV200 ++ + Semi - quantitative - +* - $$
هلام الكهربائي ++ +/- Semi - quantitative - +* - $
qPCR ++ +++ ص +* + + $
NGS + ص + ++ + $$$

Plant Genomic DNA Isolation

The Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System (Cat.# FF3760, FF3761) is designed for manual or automated 96-well purification of DNA from plant leaf and seed tissue. The Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System has been validated with corn and tomato leaf as well as with canola and sunflower seeds. The DNA purified from these samples can be used in PCR and other more demanding applications, such as RAPD analysis. Since plant materials can be particularly challenging to lyse, especially when working with tough or woody tissues, additional required equipment includes not only a magnet (MagnaBot® FLEX 96 Magnetic Separation Device, Cat.# VA1920) but also a device capable of breaking up seed or leaf material (e.g., Geno/Grinder® 2000 from SPEX CertiPrep, Inc.).

The yield depends on the source material and how well the seeds or leaf disks are pulverized prior to the genomic DNA isolation. Yield may range from 10–100ng from a single 8mm leaf punch. To increase the yield from the Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System, a scale up in volume with up to 5 leaf punches can be used [as demonstrated in Promega Notes 79]. The potential scale-up is limited by the volume in a deep-well, 96-well plate.

Another automated option we have to meet your plant DNA extraction needs, is the Maxwell® RSC Plant DNA Kit (Cat.# AS1490). The Maxwell® RSC Plant DNA Kit is used with the Maxwell® RSC and RSC 48 Instruments to provide an easy method for efficient, automated purification of genomic DNA (gDNA) from a range of plant tissue samples, including corn, soybean and أرابيدوبسيس. The Instruments are supplied with preprogrammed purification methods and uses predispensed reagent cartridges, maximizing simplicity and convenience.

Using this system, DNA can be purified from plant samples in under 60 minutes with minimal preprocessing and no organic extractions. Automated purification results in consistent purification, with less variability than traditional DNA extraction methods such as CTAB and spin-columns. The resulting purified DNA is ready to use in downstream applications, including amplification assays.

Serum-Plasma Genomic DNA Isolation

For high quality, purified cell-free DNA from plasma samples, we offer the Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit (Cat.# AS1480). Utilizing the simple three-step protocol, the Maxwell® RSC Instrument can process 1 to 16 samples, and the Maxwell® RSC 48 Instrument can process 1 to 48 samples. Simply add 0.2–1.0ml of plasma to the prepared cartridges and select Start, no preprocessing of samples required. In approximately 70 minutes, you will have high yields of amplifiable DNA that is ready to be used in downstream assays including qPCR, NGS and digital PCR.

As a magnetic particle mover, not a liquid handler, the Maxwell® RSC additionally offers several advantages over other automated systems. Since no liquid handling or splashing occurs during sample processing, there is minimal risk of sample cross-contamination. It also eliminates the worry of potential clogs and inevitable system breakdowns that follow, ensuring a smooth workflow with fewer disruptions.

Bacterial Genomic DNA Isolation

If you need to make quick decisions about potential food contamination and spoilage, the Maxwell® RSC PureFood Pathogen Kit (Cat.# AS1660) offers a simple automated protocol with minimal hands-on steps. The kit effectively eliminates laborious sample preprocessing steps such as enzymatic pretreatment, as it works with inhibiting sample types and also has the ability to lyse both Gram+ or Gram– bacteria.

By coupling the high-performance Maxwell® chemistries with the trusted benchtop Maxwell® RSC instruments, you will be able to effectively purify bacterial DNA from up to 48 food samples in as little as 40 minutes. Once extracted, the resulting DNA is ready for advanced downstream molecular analyses, including serotyping, NGS and identification of spoilage organisms.

This method can be utilized for both raw and processed food and has successfully been used to isolate pathogen DNA from a wide variety of food samples, including بكتريا قولونية 0157:H7 from uncooked beef, السالمونيلا المعوية from uncooked chicken and الليسترية المستوحدة from whole milk. Figure 15 below highlights a comparison of total DNA versus بكتريا قولونية 0157:H7 DNA extracted from cilantro samples that were spiked with the بكتريا قولونية 0157:H7 bacteria.

Figure 15. Comparison of total DNA and بكتريا قولونية 0157:H7 DNA extracted from cilantro samples spiked with the indicated amounts of بكتريا قولونية 0157:H7 bacteria. The total DNA concentration was assessed using the QuantiFluor® ONE dsDNA System.

Buffy Coat Genomic DNA Isolation

The Maxwell® RSC Buffy Coat DNA Kit (Cat.# AS1540) provides a simple, automated method of genomic DNA extraction using the convenient, prefilled cartridge format of the Maxwell® RSC Instrument. The kit contains all the reagents you need for optimal DNA extraction, and is compatible with blood stored in EDTA, heparin and citrate anticoagulants. Avoid the tedious and time-consuming hassle of preprocessing samples, simply add 50–250μl of your sample directly into well #1 of the cartridges. Your purified DNA is ready for analysis in about 50 minutes, and can be used directly in various downstream applications, such as agarose gel electrophoresis.

Food Genomic DNA Isolation

Food and plant materials often provide the greatest challenge for cell lysis and intact DNA extraction, due to the lysis conditions required to liberate the nucleic acid and the processing of plant materials into comestibles.

Another specialized genomic DNA isolation system is the Wizard® Magnetic DNA Purification System for Food (Cat.# FF3750, FF3751). This convenient protocol is designed for the manual purification of DNA from a variety of food samples including corn seeds, cornmeal, soybeans, soy flour and soy milk, generating results in one-third of the time of traditional methods. In addition, DNA can be purified from processed food such as corn chips, chocolate and chocolate-containing foods, lecithin and vegetable oils if used with the appropriate optimized protocols.

The DNA purified from many of these samples can be used in PCR-based testing for Genetically Modified Organism (GMO) DNA sequences, such as by quantitative analysis using TaqMan® assays. As with all isolation systems using the MagneSil® PMPs, a magnetic separation stand is needed and enables processing of up to 12 samples per batch. With samples containing highly processed food, the genomic DNA isolated will be fragmented and better suited for analysis using amplification rather than a Southern blot. The yield of DNA from this system will vary depending on source type and extent of food processing.

The Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication Kit (Cat.# AS1600) provides an easy and automated method for efficient purification of DNA for PCR-based food and ingredient authentication. The Kit is used with the Maxwell® RSC and RSC 48 Instruments and can purify DNA from raw and processed food samples, including corn, soybeans, canola, ground beef and ground pork.

100 minute protocol requires only 30 minutes of hands-on time, effectively achieving not only faster results with walk-away automation, but also freeing up laboratory resources for higher value activities. The purified DNA extracted using the PureFood Kit is ready to be used for several applications, including real-time PCR, gel electrophoresis, next-generation and Sanger sequencing and microarrays.

Nucleic Acid Purification Protocols for Plant & Food Sample Types

Explore our collection of protocols for manual and automated DNA or RNA extraction from a variety of food and plant samples.


Quantifying DNA in a band on gel electrophoresis - Biology

In this experiment we are given the scenario of a crime scene in a classroom where we will be analyzing DNA samples of evidence found in the classroom. After analyzing this data and comparing the data to the blood that was found on the ground in the classroom, we’ll be able to determine whose blood is it. The suspects are Mr. Gladson, Bobby, and Ms. Mason. The evidence found were a wad of bubble gum, a shard of glass with a reddish stain, a discarded tissue and a paper cup with lipstick stains. From the data we collected we’ll be able to analyze it via electrophoresis and find out if the blood on the ground belongs to either one of our suspects. Our hypothesis is that after we analyze the evidence one will match the blood on the floor and point to one of the suspects. As for our null hypothesis if none of them were to match the blood on the ground, they would be cleared and no longer remain suspects and that there was someone else in the room besides the three suspects.

We started by creating an agarose solution to create a gel for electrophoresis. After creating our solution we tape the edges of a tray so we can cast the solution in the tray and create our gel. The comb is to be put in the side that is closest to the negative cathode in the gel box. When the gel is casted the comb makes 8 wells that can be filled with our DNA samples.

We prepared our DNA samples by placing the sample DNA into 3 separate tubes and placed different restriction enzymes and marked each tube with the initial of each enzyme. We also had a control DNA as well as the DNA from the crime scene and added dye to each one and mixed it in a centrifuge for a couple of seconds. We then placed each sample of DNA, with the wells on the left side, in the first 5 wells. We used a micropipette to carefully fill each well with 15 microliters of each sample. The control sample from the crime scene went in well 1 and the next four are put in any order but make sure to keep track of which one is in which well. We then plugged in the gel box and set the box at 50 volts for 2 hours and what it does is it makes the dye move to the opposite side since opposite forces attract and DNA is negative it will move towards the positive anode. After two hours we took out our gel and moved it into a plastic tray and dyed it so the dye would attach to the DNA and left it overnight and let osmosis take place. The next day we drained out our containers and placed regular tap water into our trays and placed it back on the rocker for 15 minutes and we let reverse osmosis take place and then we took our gel and placed it on a light source tray to reveal the bands of DNA in the gel. We then took a ruler to measure how far each band traveled from each well and how many times it split during the process. Once were finished we matched up which sample matched the sample from the crime scene.


شاهد الفيديو: ما هي البروتينات الناقلة في الدم وماذا تنقل Plasma Transport Proteins (شهر نوفمبر 2022).