معلومة

فحص لوحة الفيروس ، حساب pfu / ml على لوحات ذات لويحات قليلة جدًا

فحص لوحة الفيروس ، حساب pfu / ml على لوحات ذات لويحات قليلة جدًا


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا طالب ، لذا آمل أن أطرح هذا السؤال هنا. لقد أجريت فحص لوحة الفيروس بشكل عملي مؤخرًا ولدي بعض الأسئلة المتعلقة بعدد البلاك لحساب pfu.

في اللوحات المقابلة للضربات 0 و 10 دقائق ، تشكلت بضع لوحات (أقل من 5 لوحات في كل لوحة حيث يمكن رؤية اللوحات) هل ما زلت أحسب pfu بهذه النتائج ، أم يجب أن أتركها على أنها 0 pfu ، وأستخدمها فقط أعداد البلاك التي لا تقل عن 10؟


حل عيار الفيروس المضخم للخلايا في الفئران عن طريق فحص البلاك باستخدام خط الخلايا M2-10B4 وتراكب منخفض اللزوجة

يستخدم الفيروس المضخم للخلايا (MCMV) بشكل متزايد كنموذج معدي للتحقيق في تفاعلات المضيف الممرض في الفئران. تم نشر طرق مفصلة لاستخدام الخلايا الليفية الجنينية الفئران الأولية (MEFs) لإعداد المخزونات وتحديد التتر الفيروسي من MCMV. لتحديد عيار MCMV عن طريق فحص البلاك ، تعتمد هذه الطرق على وسائط عالية اللزوجة تقيد الانتشار الفيروسي من خلال المادة الطافية للثقافة ، ولكنها عادة ما تكون لزجة للغاية بالنسبة للماصة. علاوة على ذلك ، يجب إنشاء MEFs بشكل متكرر ويمكن أن تختلف بشكل كبير من دفعة إلى دفعة في النقاء ، ومعدلات الانتشار ، وتطور الشيخوخة. على النقيض من ذلك ، تم الإبلاغ عن أن خط الخلايا اللحمية لنخاع العظم M2-10B4 (ATCC # CRL-1972) ، الذي يسمح أيضًا لـ MCMV ، ينتج مخزونات عالية العيار من MCMV ولديه مزايا كبيرة للنمو السريع والمتسق. ومع ذلك ، لم يتم نشر طرق مفصلة باستخدام هذه الخلايا.

أساليب

قمنا بتعديل البروتوكولات الحالية لاستخدام خلايا M2-10B4 لقياس التتر MCMV عن طريق فحص البلاك.

نتائج

وجدنا أنه يمكن حل لويحات MCMV بسهولة على طبقات أحادية من خلايا M2-10B4. علاوة على ذلك ، تشكلت اللويحات بشكل طبيعي حتى عندما كانت مزارع الخلايا M2-10B4 أقل من 50٪ متكدسة في يوم الإصابة ، طالما أننا استخدمنا أيضًا تراكبًا منخفض اللزوجة.

الاستنتاجات

بشكل عام ، مكّننا بروتوكولنا من استخدام خط خلية ثابت لتقييم التتر الفيروسي ، بدلاً من إنتاج MEFs الأولية بشكل متكرر. كما سمح لنا ببدء الاختبار بخلايا أقل بأربعة أضعاف مما هو مطلوب لتوليد طبقة أحادية متكدسة ، مما يقلل المهلة الزمنية قبل بدء الفحص. أخيرًا ، يمكن معالجة اللزوجة المنخفضة CMC بواسطة الماصة ولا تحتاج إلى خلطها مسبقًا مع الوسائط ، وبالتالي زيادة عمرها الافتراضي وسهولة استخدامها. نصف نتائجنا هنا ، جنبًا إلى جنب مع البروتوكولات التفصيلية لاستخدام خطوط الخلايا M2-10B4 لتحديد العيار وتنمية مخزون MCMV.


كيف تحسب عيار العاثية؟

انظر المزيد من التفاصيل المتعلقة بها هنا. فقط هكذا ، كيف يتم حساب التتر؟

إلى احسب جسم مضاد عيار، يتم تخفيف عينة مصل الدم المحتوية على جسم مضاد بنسب متسلسلة (1: 2 ، 1: 4 ، 1: 8 ، 1: 16 وما إلى ذلك). باستخدام طريقة الكشف المناسبة (على سبيل المثال ، القياس اللوني ، الكروماتوجرافي ، إلخ) ، يتم اختبار كل تخفيف لوجود مستويات يمكن اكتشافها من الجسم المضاد.

علاوة على ذلك ، كيف تحسب PFUS ML؟ وزارة الداخلية مرتبطة بـ pfu بواسطة المتابعة معادلة: تعدد العدوى (moi) = وحدات تشكيل البلاك (pfu) للفيروس المستخدم للعدوى / عدد الخلايا. على سبيل المثال ، إذا أصيب 2 × 10 6 خلية بنسبة 50 مل للفيروس مع عيار 10 8 pfu/مل. سيكون moi 0.05 * 10 8/2 * 10 6 = 2.5.

بالإضافة إلى ذلك ، ما هو عيار العاثية؟

الفيروس عيار هو قياس كمي للنشاط البيولوجي للفيروس الخاص بك ويتم التعبير عنه بوحدات تشكيل البلاك (pfu) لكل مل. لحساب الفيروس عيار، هذه اللويحات عبارة عن بقع من البكتيريا الميتة ، وكل لوحة تمثل فيروسًا واحدًا.

كيف أرفع عيار العاثية؟

احتضان مع التحريض لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. أضف 100 & # 956 لتر من الارتفاع عيار فج lysate (& GT 10 8 PFU & middotml & # 8722 1). احتضان عند 37 درجة مئوية مع التحريض لمدة & # 87645 ساعة أو حتى يزيل المحللة.


كيف تحسب عيار البكتيريا؟

انقر هنا لمعرفة المزيد عنها. بجانب ذلك ، كيف يتم حساب العيار؟

العمل بها عيار حجم الحمض المضاف هو الحجم النهائي مطروحًا منه حجم البداية. للعثور على المتوسط عيار (حجم المعايرة) تضاف القيم معًا وتقسيمها على عدد القراءات التي تم أخذها. لاحظ أن الحجم التقريبي غير معتاد على احسب المتوسط.

بالإضافة إلى ذلك ، ما هو الغرض من مقايسة عيار الملتهمة؟ هدف. لتحديد عدد فج في عينة معبر عنها كـ PFU (وحدة تشكيل اللويحة) / مل. معرفتي. هناك طريقتان لعمل ملف عيار. اللوحة الكاملة عيار يسمح بحساب أسهل وأكثر دقة للوحة ، ولكنه يتطلب أيضًا المزيد من اللوحات والوقت أكثر من طريقة & ldquoquick و dirty & rdquo.

وبالمثل ، ما هو عيار العاثية؟

الفيروس عيار هو قياس كمي للنشاط البيولوجي للفيروس الخاص بك ويتم التعبير عنه بوحدات تشكيل البلاك (pfu) لكل مل. لحساب الفيروس عيار، هذه اللويحات عبارة عن بقع من البكتيريا الميتة ، وكل لوحة تمثل فيروسًا واحدًا.

كيف تحسب tcid50؟

باستخدام معادلة 1: سجل10 50٪ تخفيف نقطة النهاية = - (57/10 + 0.5) مرات 1 = -6.2 50٪ تخفيف نقطة النهاية = 10 - 6.2 عيار الفيروس = 10 6.2 LD50/ مل. باستخدام معادلة 2: تسجيل الدخول10 تمييع نقطة النهاية بنسبة 50٪ = - (5.7 + 0.5) & مرات 1 = -6.2 تمييع نقطة النهاية بنسبة 50٪ = 10 - 6.2.


プ ラ ー ク ア ッ セ イ: プ ラ ー ク 形成 単 位 (PFU) と し て ウ イ ル ス 定 数 を 決定 す る 方法

バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ ま た は 単 に フ ァ ー ジ と 呼 ば れ る 原核生物 に 感染 す る ウ イ ル ス は، 20 世紀 初 頭 に تورت (1) と デ レ ル (2) に よ っ て 独立 し て 同 定 さ れ た. フ ァ ー ジ は، そ の 治療 価 値 (3) と ヒ ト (4) 、 な ら び に グ ロ ー バ ル な 生態 系 (5) へ の 影響 に つ い て さ て い は おلا شيء :

バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ は، 宿主 細胞 に 遺 伝 物質 を 注入 し، 新 し い フ ァ ー ジ 粒子 の 製造 の た め の 機械 を 乗 っ 取 り، 最終 的 に 細胞 リ シ ス を 通 じ て 多数 の 子孫 を 放出 さ せ る こ と に よ っ て، 生 き 残 る. そ の 微小 な 大 き さ の た め に、、 ク テ リ オ フ ァ ジ は 、 単 に 光 顕 微鏡 を し て 観 す る こ と は で ま せ ん。 そ の め 、 走 査 型 電子 顕 検 査 がで す (図 1)。さ ら に 、 フ ァ ー ジ は 、 餌 食 に 宿主 を 必要 と す る の で 細菌 の よ う な 栄 寒 天 プ レ ー ト で 栽培 す る こ と は で き ま せ


図 1: バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ の 形態 は 、 こ こ で大腸菌フ ァ ー ジ に よ っ て 例 示 さ れ 、 走 査 型 電子 顕 微鏡 を 用 い て 研究 す る こ と が で き る。ほ と ん ど の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ は، カ ウ ド ビ レ ア (尾 の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ) に 属 し て い ま す. こ の 特定 の フ ァ ー ジ は، 非常 に 短 い 尾 構造 と イ コ サ ヘ ド ラ ル ヘ ッ ド を 有 し، ポ ド ウ イ ル ス の フ ァ ミ リ ー に 置 き ま す.

プ ラ ー ク ア ッセ イ (2)لا شيءた フ ァ ー ジ は 、 の 後 感染 し 、 内 で 複製 し 、 1 つ の 細胞プ ラ ー ク) は 、 そ う で な け れ ば 濁板 (図 2B / 図 3A)で 観 察 す る こ と が で き، 最初 に 単 一 の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ 粒子 で あ っ た も の ​​の 存在 を 示 す. 試 料 の 体積 当 た り の プ ラ ー ク 形成 単 位数 (す な わ ち PFU / مل) は، 生成 さ れ る プ ラ ー ク の 数 か ら 決定 す る こ とが で き る。


図 2: プ ラ ー ク 形成 単 位 (PFU) の 試 験 は 、 サ ン プ ル 中 の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ の 数 を 決定 す た め の 一般 的 な 方法 で あ る。(أ)滅菌 ペ ト リ 皿 の ベ ー ス は، 適 切 な 固体 栄 養 培 地 で 覆 わ れ، 続 い て، ソ フ ト 培 地، 感受性 宿主 細胞 お よ び 元 の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ サ ン プ ル の 希 釈 が 混合 さ れ る. フ ァ ー ジ 懸濁液 は، 場合 に よ っ て は، 既 に 固化し た 柔 ら か い 寒 天 の 表面 全体 に 均等 に 広 が る 可能性 が あ る と に 注意 し て く だ さ い。(ب)لا شيء


図 3: PFU 試 験 の 結果 は 、 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ よ よ っ 生成 れ れ 複数 の プ ー ク を 示 す。感受性 宿主 細胞 の リ シ ス に よ り 、 プ ラ ー クは (أ)完全 ク リ ア ラ ン ス 、ま た は (ب).

特定 の 温 帯 フ ァ ー ジ は، 以前 に 記載 さ れ た 溶解性 成長 に 加 え て، リ ソ ゲ ン 性 の ラ イ フ サ イ ク ル と 呼 ば れ る も の を 採用 す る こ と が で き ま す. リ ソ ジ ェ ニ ー で は، ウ イ ル ス は، 宿主 細胞 (9) の ゲ ノ ム に そ の 遺 伝لا شيءさ れ る (図 3 ب)。لا شيء

ウ イ ル ス は، 限 ら れ た 範 囲 の 宿主 細菌 に の み 付 着 ま た は 吸着 す る こ と が で き る (10). 宿主 範 囲 は، كريسبر-كاس シ ス テ ム (11) の よ う な 細胞 内 抗 ウ イ ル ス 戦 略 に よ っ て さ ら に 制 限 さ れ る. 細菌 サ ブ.さ れ て き た (図 4)。こ の 方法 の 有効性 は، 新 し い シ ー ケ ン シ ン グ 技術 に よ っ て 上 回 っ て い ま す が، フ ァ ー ジ タ イ ピ ン グ は، 例 え ば، 臨床 使用 の た め の フ ァ ー ジ カ ク テ ル の 設計 を 容易 に す る، 細菌 と フ ァ ー ジ の 相互作用 に 関 す る 貴重 な 情報 を 提供 す るこ と が で き ま す.


図 4: 異 な る 細菌 株 の フ ァ ー ジ 感受性。キ ュ ー チ バ ク テ リ ウ ム ・ ニ キ ビ株 (أ) م 27お よ び (ب) AD35を 有 す る 柔 ら か い 寒 天 板 を 、 21 種類の C. に き び細菌 食 症 で 発 見 し た. 唯一 の フ ァ ー ジ 11 は، 株 AD35 が す べ て の フ ァ ー ジ に 対 す る 感受性 を 示 し な が ら، AD27 に 感染 し، 殺 す こ と が で き ま し た. フ ァ ー ジ タ イ ピ ン グ と 呼 な こ の 技術 は، フ ァ ー ジ 感受性 に 基 づ いて 細菌 種 と 株 を 異 な る サ ブ グ ル ー プ に 分割 す る た め 使用 す る こ と が で き る。

إجراء

  1. 微生物 を 含 む 作業 を 開始 す る 前 に 、 作業 ス ペ ー ス が 殺菌 さ れ て い る こ と を 確認 し て く だ さ い (え ば 、 70٪ エ タ ノ ー ル で 拭 き 取 り ま す)。 常 に ラ の コ ー ト と 手袋 用 し 、 長 い 髪 縛 り け け 、 傷 、 傷 傷 が 傷 が 傷
  2. 完成 し た ら 、 す べ て の 表面 を 殺菌 し 、 手 や 手 首 を 十分 に / 殺菌 し ま す。

  1. LB メ デ ィ ア の 準備
    注:宿主 細菌 株 お よ び バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ に 応 じ て، 異 な る 液体 培 地 は، 宿主 細菌 株 ま た は 異 な る 固体 培 地 の 初期 培養 に 対 し て よ り 適 し て も よ い し، そ の 後 の 増 殖 に 対 し て よ り 適 し て も よ い. リ ソ ジ ェ ニ ー ス ー プ(LB) は 、 ス ー プ と 寒 天 の た め に こ の プ ロ ト コ ル で 使用 さ れ ま す。
    1. 200 مل 蒸 留 水 に 4G LB を 混 ぜ، 三 量 三 回 に، LB ス ー プ، 固体 底 寒 天، 柔 ら か い ト ッ プ 寒 天 を 混 ぜ ま す. オ ー ト ク レ ー ブ 中 の オ ー バ ー フ ロ ー を 防 ぐ た め に، す べ て の ソ リ ュ ー シ ョ ン は، 最終 ボ リ ュ ー ム の 2 倍 を 保持で き る 容器 に 用意 す る 必要 が あ り ま す。
      注:三重 に ア ッ セ イ を 行 う 場合 は 、 LB 底 寒 天 の 量 を 2 倍 に 調 べ な さ い。
    2. هيدروكسيد الصوديوم ま た は HCl を 必要 に 応 じ て 、 3 つ の ソ リ ュ ー シ ョ ン す べ の の pH を 7.4 に 調整 し ま す。
    3. 底 寒 天 ボ ト ル に 寒 天 の 電力 を 3g 加 え 、 固体 寒 天 の 1.5٪ 寒 天 溶液 を 作 る
    4. 上部 の 寒 天 ボ ト ル に 1.2 جرام の 寒 天 力 を 加 え 、 柔 か い 寒 天 の 0.6٪ の 寒 天 溶液 を 作 り ま す。
    5. لا شيء
    6. LB 培 地 が 約 45


    مقدمة

    فيروس زيكا (عائلة ZIKV Flaviviridae ، جنس فلافيفيروس) هو فيروس RNA مغلف ، ذو إحساس إيجابي ، وحيد الشريطة. يشفر جينومه (∼11 كيلو بايت) ثلاثة بروتينات هيكلية (قفيصة واحدة [C] وبروتينين مغلفين [M ، E]) ، بالإضافة إلى سبعة بروتينات غير بنائية (NS1 ، NS2A ، NS2B ، NS3 ، NS4A ، NS4B ، NS5 Kuno و تشانغ ، 2007). تم عزل ZIKV لأول مرة في عام 1947 من قرد حارس ريسوس من غابة زيكا في أوغندا (سميثبورن ، 1952). تم اكتشافه لاحقًا في الزاعجة الأفريقية برك البعوض في عام 1947 ثم في البشر في عام 1952 (ديك ، 1952 ديك وآخرون ، 1952). في حين أن مضيف الخزان لم يتم تحديده بعد (منظمة الصحة العالمية ، 2016) ، فمن المفترض أنه يتكاثر في الطبيعة من خلال دورة تكاثرية تشمل مضيفات الثدييات ، مثل الرئيسيات ، وناقلات الحشرات ، وبشكل أساسي بعوض البعوض. الزاعجة جنس (Marchette وآخرون ، 1969 Fagbami ، 1979 McCrae and Kirya ، 1982 Akoua-Koffi et al. ، 2001). كان فيروس ZIKV مستوطنًا في الأصل في إفريقيا ، وانتشر في جميع أنحاء أجزاء من آسيا في نهاية المطاف في التجمعات البشرية في جنوب شرق آسيا وبرك البعوض. دفعت الفاشيات الأخيرة في جزيرة ياب وميكرونيزيا وجزر بولينيزيا الفرنسية إلى إجراء تحقيقات نظرًا للتشابه في الأعراض مع فيروسات فلافيفيروسات الأخرى التي ينقلها البعوض مثل حمى الضنك وغرب النيل وفيروسات الحمى الصفراء (دافي وآخرون ، 2009). ظهر الاهتمام المتجدد بـ ZIKV مرة أخرى جنبًا إلى جنب مع تفشي المرض البرازيلي لعام 2015 بسبب الارتباط المحتمل بين الفيروس وتأثيراته المحتملة المسخية والتنكسية العصبية.

    تصف هذه الوحدة الطرق المطلوبة للقياس الكمي (

    2) من حلول الأسهم ZIKV. يتم أيضًا وصف إجراءات صيانة خطوط الخلايا المطلوبة (بروتوكولات الدعم 1 و 2).

    حذر: ZIKV هو أحد مسببات الأمراض من المستوى 2 (BL-2) للسلامة الحيوية ، باستثناء المملكة المتحدة التي صنفت ZIKV كممرض من مستوى السلامة الحيوية 3 (BL-3). اتبع جميع الإرشادات واللوائح المناسبة لاستخدام الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض والتعامل معها. يجب دائمًا تنفيذ إجراءات توليد الهباء الجوي المحتملة في خزانة أمان بيولوجية معتمدة (BSC). ارى وحدة غير متوفر و زائدة غير متوفر لمزيد من المعلومات.

    حذر: تم الإبلاغ عن الانتقال الجنسي لـ ZIKV (Foy et al.، 2011 Musso et al.، 2015) ، وتم اكتشاف فيريونات ZIKV في عينات السائل المنوي للرجال المصابين (Atkinson et al.، 2016 Mansuy et al.، 2016). يجب توعية جميع العاملين وشركائهم الجنسيين بالمخاطر قبل العمل مع ZIKV. بالنظر إلى أن التأثيرات المسخية المحتملة لـ ZIKV لا يزال يتعين توضيحها ، يجب مراعاة احتياطات أمان إضافية للعاملين الحوامل ، والعاملين الذين يكون شركاؤهم حوامل ، أو العمال الذين يحاولون تكوين أسرة. يجب على جميع العمال الرجوع إلى الإرشادات المحدثة التي وضعتها مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (Oster et al. ، 2016).

    ملاحظة: نوصي العمال بارتداء طبقة ثانية من القفازات عند العمل مع ZIKV. يجب إزالة الزوج الثاني قبل الخروج من BSC. يجب أن يتخذ العمال احتياطات إضافية مع رؤوس الماصات أو الأشياء الحادة الأخرى التي يمكن أن تثقب الجلد. يمكن استخدام محلول فيركون 1٪ كمطهر بالإضافة إلى 70٪ إيثانول. يمكن تجهيز حاويات النفايات السائلة بقمع صغير و 1 إلى 2 بوصة من 1٪ Virkon لتقليل تناثر وإنتاج الهباء الجوي.

    1: القياس الكمي لفيروس زيكا عن طريق فحص البلاك

    فحص البلاك هو المعيار الذهبي لتقدير حلول المخزون الفيروسي والعينات المحتوية على فيروسات. المقايسة الموصوفة هنا قابلة للتطبيق لتحديد عيار مخزونات ZIKV أو طاف الخلايا المصابة ومتجانسات الأنسجة الحيوانية. يستخدم هذا البروتوكول ملح الصوديوم carboxymethylcellulose (CMC) لتراكب الطبقات الأحادية الخلية المصابة. يجب تحضير CMC قبل يوم إلى يومين من التجربة.

    المواد

    • 6 لوحات زراعة الأنسجة جيدا
    • تم ضبط حاضنة زراعة الخلايا على 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2
    • حمام مائي 37 درجة مئوية
    • الكاميرا ، لتصوير 6 لوحات جيدة

    لوحات آبار البذر وإعداد العينات

    1. خلايا بذور Vero E6 في 6 أطباق أنسجة جيدة مع 1.5 مل / بئر (1.5 × 10 5 خلايا / بئر). احتضان اللوحات في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 2 إلى 3 أيام أو حتى يتم الوصول إلى التقاء المطلوب.

    للحصول على أفضل النتائج ، استخدم ألواح الآبار المتكدسة بنسبة 90٪ إلى 95٪ (انظر المعلمات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها).

    2. اضبط الحمام المائي على 37 درجة مئوية ودافئ DMEM / 2٪ FBS و DPBS و CMC / DMEM. عينات تذويب ليتم معايرتها في BSC.

    3. قم بإعداد 5 تخفيفات متسلسلة لكل عينة عن طريق الجمع بين عينة 200 ميكرولتر و 1.8 مل DMEM / 2٪ FBS. اخلط كل تخفيف جيدًا عن طريق الماصات لأعلى ولأسفل لبضع ثوان. استخدم طرف ماصة جديدًا بين كل تخفيف.

    هذا سيجعل 10 1 إلى 10 5 تخفيف. قد تحتاج إلى مزيد من تخفيف العينة اعتمادًا على تركيز الفيروس (انظر المعلمات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها). يوجد تخفيف نهائي كافٍ لاختبار العينة في ثلاث نسخ.

    4. قم بإزالة اللوحات ذات 6 آبار من الحاضنة وضعها داخل BSC.

    5. إزالة وسائط ثقافة Vero E6 من كل بئر ، وإضافة 1 إلى 2 مل DPBS لغسل الخلايا.

    لا تقم بتطبيق DPBS مع الضغط العالي مباشرة على الخلايا لأن هذا قد يتسبب في انفصال الطبقة الأحادية عن اللوحة. أضف DPBS برفق أسفل جانب كل بئر وقم بتحريك الألواح للخلف وللأمام ومن اليسار إلى اليمين لمدة 1 إلى 3 دقائق للمساعدة في إزالة الحطام الخلوي والوسائط الزائدة.

    6. قم بإزالة والتخلص من DPBS. استخدم طرف ماصة جديدًا لكل طبق.

    إصابة أحادية الطبقة

    7. أضف 500 ميكرولتر من DMEM / 2٪ FBS إلى البئر العلوي الأيسر من كل لوحة كعنصر تحكم. أضف 500 ميكرولتر من كل تخفيف إلى جانب البئر من اليسار إلى اليمين من أعلى تخفيف إلى أقل تخفيف.

    انظر الشكل 1 لأفضل الممارسات. يوفر إعداد اللوحة هذا الوقت ونصائح الماصة المصلية عند العمل من أعلى عامل تخفيف إلى أدنى. اعمل بسرعة لتجنب جفاف الخلايا.

    8. احتضان لوحات البئر المصابة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة مع هزاز لطيف كل 15 دقيقة لنشر اللقاح الفيروسي بالتساوي عبر الطبقة الأحادية.

    9. بعد فترة الامتصاص التي تبلغ 1 ساعة ، تخلص من تعليق الفيروس الذي يعمل من أقل تركيز إلى أعلى. استخدم طرف ماصة جديدًا لكل بئر.

    إضافة التراكب

    10. اغسل الآبار مع 1 إلى 2 مل DPBS كما هو موضح في الخطوة 5.

    11. أضف 2 مل تراكب CMC / DMEM لكل بئر.

    ضع التراكب بضغط منخفض أسفل جانب لوحة البئر.

    12. احتضان اللوحات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 5 أيام (120 ساعة).

    لا تزعج الأطباق خلال فترة الحضانة هذه. ضع الألواح في الزاوية الخلفية للحاضنة لتجنب تقلبات درجات الحرارة من فتح وإغلاق الحاضنة بشكل متكرر أثناء العمل الروتيني.

    13. بعد فترة الحضانة لمدة 5 أيام ، قم بإزالة وتجاهل التراكب في BSC. استخدم طرف ماصة جديدًا لكل طبق.

    14. إزالة التراكب الزائد عن طريق غسل الخلايا مع 2 إلى 3 مل دبس.

    احتضان لوحات البئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 إلى 10 دقائق مع هزاز لطيف كل دقيقتين ، أو حتى يذوب التراكب بالكامل. يمكن أيضًا وضع أطباق البئر في الحاضنة للمساعدة في هذه العملية.

    15. أزل محلول الغسيل وتخلص منه.

    تلطيخ

    16. أضف 2 مل من محلول البنفسج الكريستالي لكل بئر من أقل تخفيف إلى أعلى. استخدم طرف ماصة جديدًا لكل بئر.

    ضع محلول البنفسج الكريستالي مع ضغط منخفض أسفل جانب لوحة البئر.

    17. احتضان اللوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع هزاز لطيف كل 10 دقائق.

    قم بإطفاء الأنوار في BSC أو قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم لأن محلول البنفسج الكريستالي حساس للضوء.

    18. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول التلوين وغسل الآبار برفق بماء الصنبور من الحوض.

    19. اقلب الألواح واتركها تجف على وسادات ماصة قبل تصور البلاك.

    اتركها تجف لمدة 1 إلى 2 ساعة أو بين عشية وضحاها قبل عد لويحات.

    تقدير العيار الفيروسي

    20. حدد التخفيف الذي أنتج من 30 إلى 100 لويحة ، واحسب عدد الصفائح لكل تكرار.

    راجع المعامِلات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها إذا كانت الأعداد & gt100 أو كانت الطبقة الأحادية غير متكدسة.

    21. لكل عينة حساب متوسط ​​عدد لويحات لهذا التخفيف.

    22. احسب وحدات تشكيل البلاك لكل مل (PFU / مل) لكل عينة:

    23. التقاط صور للنتائج (اختياري ولكن موصى به) ، وتخزين اللوحات في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

    2: توليد وتنقية مخزون فيروس زيكا

    يمكن نشر ZIKV بسهولة في خطوط خلايا الثدييات والبعوض (على سبيل المثال ، Vero E6 و C6 / 36 ، على التوالي). نحن هنا نصف الانتشار باستخدام خط الخلية Vero E6 ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول ليناسب خط الخلية C6 / 36. يمكن شراء سلالات مختلفة من ZIKV من ATCC (http://www.atcc.org/en.aspx). يوصي المؤلفون بتحديد أي حلول أولية لمخزون ZIKV قبل التجريب أو التلاعب (

    1). بمجرد معرفة العيار ، انتقل إلى التكاثر. تصاب الطبقة الأحادية المتكدسة من الخلايا بتعددية منخفضة للعدوى (MOI) لتقليل عدد جزيئات الفيروس المعيبة. يتم إحضار حلول مخزون ZIKV إلى تركيز نهائي FBS بنسبة 20 ٪ قبل التخزين طويل الأجل.

    المواد

    • تم ضبط حاضنة زراعة الخلايا على 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2
    • حمام مائي 37 درجة مئوية
    • قوارير زراعة الأنسجة 75 سم 2 (تختلف الأحجام حسب الاحتياجات الشخصية)
    • أنابيب مخروطية سعة 10 مل و 50 مل
    • جهاز الطرد المركزي
    • 2.0 مل كريوتوبيس مع حلقة O
    • جهاز طرد مركزي فائق Optima XL-100 K مزود بدوار دلو متأرجح SW 28
    • الماصات المصلية 5 مل و 25 مل

    تحضير العينة والطبقة الواحدة

    1. اضبط الحمام المائي على 37 درجة مئوية ودافئ DMEM / 2٪ FBS و DPBS و Vero E6. يتم استخدام محلول ذوبان الجليد ZIKV للعدوى في BSC.

    يجب تسخين جميع المحاليل التي تتلامس مع الخلايا مسبقًا إلى 37 درجة مئوية.

    2. ابدأ بأحد عشر قارورة لزراعة الأنسجة بحجم 75 سم 2 والتي تتراوح من 90٪ إلى 95٪ متكدسة (انظر

    يوصي المؤلفون بتكاثر عشر قوارير في المرة الواحدة. يتم استخدام الدورق الحادي عشر لتحديد عدد الخلايا.

    3. استخدم إحدى القوارير مقاس 75 سم 2 للحصول على عدد الخلايا.

    4. باستخدام وزارة الداخلية 0.01 وعدد الخلايا المحسوب ، احسب حجم اللقاح الفيروسي المطلوب:

    حدد حل مخزون ZIKV معاير مسبقًا. أدخل PFU / ml من محلول المخزون هذا في المعادلة أعلاه ، ثم قم بحل حجم اللقاح.

    5. نقل الحجم المحسوب لمحلول المخزون ZIKV من الخطوة 4 إلى أنبوب مخروطي سعة 10 مل. إحضار الحجم النهائي من اللقاح حتى 5 مل مع DMEM / 2٪ FBS. كرر للحصول على عشرة مجلدات من اللقاح.

    6. قم بإزالة وسائط النمو وتجاهلها من القوارير العشر المتبقية ، واشطف القوارير بـ 5 إلى 10 مل من DPBS.

    لا تقم بتطبيق DPBS مع الضغط العالي مباشرة على الخلايا لأن هذا قد يتسبب في انفصال الطبقة الأحادية عن دورق الثقافة. أضف DPBS برفق أسفل عنق القارورة والصخر للخلف وللأمام ومن اليسار إلى اليمين لمدة 1 إلى 3 دقائق للمساعدة في إزالة الحطام الخلوي والوسائط الزائدة.

    7. أزل محلول الغسيل وتخلص منه.

    إصابة أحادية الطبقة

    8. أضف 5 مل من اللقاح الفيروسي المُعد مسبقًا (الخطوة 5) لكل من القوارير العشر.

    9. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة مع هزاز لطيف كل 15 دقيقة لنشر اللقاح الفيروسي بالتساوي عبر الطبقة الأحادية.

    10. بعد فترة الامتزاز التي تبلغ 1 ساعة ، أضف 4 مل وسط استزراع Vero E6.

    11. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو2 لمدة 40 إلى 48 ساعة.

    لا تزعج القارورة خلال فترة الحضانة هذه. ضع القارورة في الزاوية الخلفية للحاضنة لتجنب تقلبات درجات الحرارة من فتح وإغلاق الحاضنة بشكل متكرر أثناء العمل الروتيني. لا ينبغي أن تستمر الحضانة بمجرد ملاحظة تأثير الاعتلال الخلوي (انظر المعلمات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها).

    حصاد فيروس زيكا

    12. بعد فترة الحضانة ، انقل الوسائط إلى أنبوب مخروطي سعة 10 مل ، وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 1300 × ز، 4 درجات مئوية.

    13. قم بإزالة وتجميع خليط المادة الطافية جيدًا. نضع جانباً 200 ميكرولتر لتحديد العيار الفيروسي بمقايسة معايرة البلاك (

    14. قسامة مجمعة طاف بزيادات 1 مل إلى 2.0 مل كريوتوبيس مع حلقة O.

    15. تخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام أو الشروع في تنقية الفيروسات إذا لزم الأمر.

    للتخزين طويل الأجل ، قم بإحضار الحجم المتبقي إلى التركيز النهائي بنسبة 20 ٪ (حجم / حجم) FBS.

    تنقية الفيروسات

    تم اقتباس هذا البروتوكول من وحدة غير متاح (برين وآخرون ، 2013). تأكد من أنك على دراية بإرشادات الشركة المصنعة لجهاز الطرد المركزي الفائق قبل محاولة هذا البروتوكول.

    16. اضبط درجة حرارة الدوار فائقة السرعة على 4 درجات مئوية.

    17. انقل 25 مل من المادة الطافية للفيروس المجمعة المحضرة خلال الخطوة 14 إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

    18. أضف 5 مل من TNE / 25٪ جلسرين إلى قاع كل أنبوب طرد مركزي.

    أضف TNE / 25٪ الجلسرين بالقرب من أسفل الأنبوب قدر الإمكان لزيادة حجم تعليق الفيروس فوقه.

    19. ملء أنابيب الطرد المركزي أقرب ما يمكن من أعلى الأنبوب مع DMEM / 2٪ FBS ، وموازنة أنابيب أجهزة الطرد المركزي في حدود 0.1 غرام.

    20. ضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي الفائق.

    تطهير أنابيب أجهزة الطرد المركزي من الخارج قبل نقلها إلى جهاز الطرد المركزي. تأكد من أن شركات السلامة الأحيائية متوازنة.

    21. بيليه فيريونات من خلال وسادة الجلسرين عن طريق الطرد المركزي للعينات 3 ساعات عند 110500 × ز، 4 درجات مئوية.

    22. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة وتجاهل الطبقة العلوية من المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة 25 مل.

    اترك ∼5 مل TNE / 25٪ جلسرين في الأنبوب المخروطي.

    23. إزالة 4 مل TNE / 25٪ الجلسرين باستخدام ماصة 5 مل المصلية.

    24. إعادة تعليق بيليه الفيروس في 1 مل TNE.

    لن تكون بيليه الفيروس مرئية في أنبوب الطرد المركزي. للمساعدة في إعادة التعليق ، استخدم طرف ماصة سعة 1 مل لكشط جوانب الأنبوب المخروطي ، متحركًا بحركات دائرية صغيرة.

    25. اجمع بين المحاليل الفيروسية والقسمة بزيادات مقدارها 1 مل في أنابيب كريوت سعة 2.0 مل مع حلقة O.

    1 ، أو تخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين استخدامها مرة أخرى.

    3: الكشف عن فيروس زيكا عن طريق النسخ العكسي في الوقت الحقيقي PCR

    يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) طريقة سريعة وفعالة للكشف عن وجود شرائح الجينات الفيروسية. يصف هذا البروتوكول اكتشاف مستويات ZIKV RNA بواسطة qRT-PCR باستخدام مزيج رئيسي من خطوة واحدة للتحقيق العالمي من iTaq. يمكن شراء أزواج التمهيدي / المسبار من Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos.html) وإعادة تعليقها عند تركيز نهائي قدره 100 ميكرومتر. يجب تخزين قسامات من 10 ميكرومتر من مخزون التمهيدي / المسبار عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. يمكن تحضير الضوابط الإيجابية من محاليل مخزون ZIKV التي تم قياسها مسبقًا والتي تبلغ 10 5 PFU / ml أو أعلى. إجراء عزل RNA روتيني والتخفيفات التسلسلية للحصول على حل مخزون تحكم إيجابي. قم بإجراء تخفيفات متسلسلة للحصول على مخزون عامل يتراوح من 10 إلى 1 إلى 10 3 تخفيفات. قم بتخزين عناصر التحكم الإيجابية في درجة حرارة -80 درجة مئوية. يمكن تعديل هذا البروتوكول لمزيج رئيسي من خطوتين واستيعاب الفلوروفورات المختلفة.

    المواد

    • الاشعال والتحقيقات:
      • استنادًا إلى سلالة فيروس زيكا MR 766 (GenBank # AY632535 ​​Lanciotti et al. ، 2008)
      • Zika 835 fwd: 5′-TTGGTCATGATACTGCTGATTGC-3
      • Zika 911c rev: 5′-CCTTCCACAAAGTCCCTATTGC-3 ′
      • مسبار Zika 860 FAM: 5′-CGGCATACAGCATCAGGTGCATAGGAG-3 ′
      • زيكا 1086 قدم: 5′-CCGCTGCCCAACACAAG-3 ′
      • Zika 1162c rev: 5′-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT-3 ′
      • Zika 1107 FAM التحقيق 5′-AGCCTACCTTGACAAGCAGTCAGACACTCAA-3 ′
      • لوحة التفاعل البصري السريع MicroAmp 96-Well (على سبيل المثال ، ThermoFisher ، القط. رقم 4346907)
      • دوامة
      • ماصة متعددة القنوات
      • فيلم مانع للتسرب شفاف بصريًا (على سبيل المثال ، ThermalSeal RT ، Excel Scientific ، cat. no. TSRT2100)
      • نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

      1. خطط لتخطيط اللوحات المكونة من 96 بئرًا ، واحسب الحجم المناسب للمزيج الرئيسي المطلوب لعدد العينات ، بما في ذلك ثلاثة عناصر تحكم إيجابية على الأقل وعناصر تحكم سلبية واحدة ، باستخدام الجدول 1.

      يوصي المؤلفون بتشغيل 84 عينة لكل لوحة 96 بئراً. هذا يترك مساحة لثلاثة عناصر تحكم إيجابية والتحكم السلبي في ثلاث نسخ.

      اضرب عدد العينات في كل تشغيل بمقدار 1.1 لإضافة زيادة حجم 10٪ لحساب الماصة والخطأ البشري (أي 96 × 1.1 = 106).

      اضرب عدد العينات في كل شوط بمقدار 1.1 لإضافة زيادة حجم 10٪ لحساب الماصة والخطأ البشري (أي 96 × 1.1 = 106).

      2. ذوبان الجليد التمهيدي ، والمجسات ، والحمض النووي الريبي على الجليد.

      3. تحضير المزيج الرئيسي على الجليد.

      4. قم بتدوير المزيج الرئيسي برفق لمدة 30 إلى 60 ثانية ، وأضف 20 ميكرولتر لكل بئر.

      5. أضف 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي لكل عينة واترك 12 بئراً مجانية للمراقبة.

      يوصي المؤلفون باستخدام ماصة متعددة القنوات لهذه الخطوة.

      6. أضف 5 ميكرولتر من 10 1 و 10 2 و 10 3 تخفيفات من الحمض النووي الريبي المضاد والمعاير والمستخرج مسبقًا والمياه الخالية من نوكلياز إلى الآبار المناسبة.

      7. ختم لوحة البئر البصرية باستخدام الختم البصري.

      استخدم الأداة المتوفرة للضغط على حواف الختم بإحكام على اللوحة. إذا لم يكن الختم محكمًا بدرجة كافية ، فيمكنه الفتح أثناء التفاعل. قد يتسبب هذا في تبخر العينات ، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.

      8. قم بتشغيل qRT-PCR بخطوة واحدة باستخدام نظام اكتشاف PCR أحادي اللون MyiQ كما هو موضح في الجدول 2.

      يعتبر أي منحنى بشكل مناسب يتجاوز العتبة موجبًا لـ ZIKV.

      دورة درجة حرارة الوقت (دقيقة: ثانية) يتكرر
      1 50 درجة مئوية 30:00 1
      2 95 درجة مئوية 15:00 1
      3 94 درجة مئوية 00:15 40
      60 درجة مئوية 01:00
      4 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى معلق

      1: انتشار خلايا Vero E6

      تم اشتقاق خلايا Vero E6 في الأصل من خلايا الكلى السليمة للقرد الأخضر الأفريقي (Cercopithecus aethiops). هذا الخط الخلوي المحدد هو استنساخ لخط خلية Vero 76. عندما تصل خلايا Vero E6 إلى نقطة التقاء ، ستتوقف عن النمو وتبدأ في التدهور (Ammerman et al. ، 2008). هذا هو السبب في أنه من المهم مراقبة تطور الخلايا والثقافة الفرعية قبل أن تصل الخلايا إلى 100 ٪. تتم مراقبة الخلايا يوميًا وتثبيتها الفرعية كل 3 إلى 4 أيام. بعد التفكك ، يتم نقل معلقات الخلية إما إلى دورق جديد أو بذرها في 6 أطباق جيدة. احتفظ بسجل رقم المرور. نوصي بمراقبة التلوث الجرثومي شهريًا عن طريق تلقيح ألواح الآجار بمسحات من وسط الاستزراع واستخدام مجموعات الكشف عن الميكوبلازما (على سبيل المثال ، سيجما ، القط رقم MP0035-1KT). If bacterial contamination is detected, immediately dispose of the culture flask and begin sterilization of the BSC and cell culture incubator. Frozen stocks of low-passaged (passage number <50) Vero E6 cells are kept in liquid nitrogen at −191°C with a final concentration of 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 20% FBS. DMSO is a cryoprotectant added to cell culture media to decrease the formation of ice which reduces cell death during the freezing process. All procedures should be performed in a BSC with proper aseptic technique.

      المواد

      • Vero E6 cell line (ATCC #CRL-1586)
      • DPBS (see recipe)
      • Vero E6 culture medium (see recipe)
      • 0.25% trypsin/EDTA (e.g., Invitrogen, cat. no. 25200-072)
      • 75-cm 2 tissue culture-treated flasks (sizes vary with personal needs)
      • Cell culture incubator set to 37°C and 5% CO2
      • 37°C water bath
      • Centrifuge

      Media and reagent preparation

      1. Begin with a 75-cm 2 flask that is ∼80% to 90% confluent.

      2. Warm DPBS, Vero E6 culture medium, and 0.25% trypsin/EDTA to 37°C in a water bath.

      All solutions that come into contact with the cells should be previously warmed to 37°C.

      3. Remove media and rinse the flask with 5 to 10 ml of DPBS.

      Do not apply the DPBS with high pressure directly to the cells as this may cause the monolayer to disassociate from the culture flask. Gently add the DPBS down the neck of the flask and rock backward and forward and left to right for 1 to 3 min to aid in the removal of cellular debris and excess media.

      Cell dissociation

      4. Add 2 to 3 ml of 0.25% Trypsin/EDTA directly to the monolayer.

      Gently rock the flask backward and forward and left to right so that the trypsin covers the entire monolayer.

      5. Incubate the flask at 37°C and 5% CO2 for 2 to 4 min.

      Do not incubate for longer than 5 min.

      6. After incubation, vigorously rock the flask from side to side.

      Check to see if the monolayer has been removed from the surface of the flask the bottom of the flask should no longer be opaque.

      7. Once the cells have disassociated from the flask immediately add 10 ml Vero E6 culture media to the flask.

      8. Pipet up and down to vigorously dispense the cell-media solution where the monolayer used to be in order to dislodge any remaining cells.

      Repeat this step for 3 to 5 min to ensure all of the cells are suspended in solution. Be careful not to create excessive air bubbles.

      9. Centrifuge the cell suspension 5 min at 200 × ز, room temperature, to pellet the cells.

      10. Remove and discard supernatant.

      Be careful not to disturb the pellet.

      Cell resuspension and subculturing

      11. Resuspend cells in 10 ml Vero E6 culture media.

      12. For a 1:10 dilution add 1 ml of the cell suspension to a new 75-cm 2 flask.

      A 1:10 dilution should take 3 to 4 days to reach 80% to 90% confluence in a 75-cm 2 flask.

      13. Add 10 to 15 ml of warmed Vero E6 culture media to the culture flask.

      14. Incubate the culture flask at 37°C and 5% CO2.

      15. Monitor cell growth daily.

      16. When cells reach an 80% to 90% confluent monolayer proceed to step 2.

      2: Propagation of C6/36 Cells

      C6/36 cells were originally derived from larval tissue of الزاعجة البيضاء. Cells are monitored daily and subcultured every 3 to 4 days. After dissociation, cell suspensions are either transferred to a new flask or seeded into well plates. Keep record of the passage number. We recommend monitoring for bacterial contamination monthly as described in

      1. Frozen stocks of low passaged C6/36 cells are kept in liquid nitrogen at −191°C with a final concentration of 5% DMSO and 20% FBS. All procedures should be performed in a BSC with proper aseptic technique.

      المواد

      • C6/36 cell line (ATCC #CRL-1660)
      • C6/36 culture medium (see recipe)
      • DPBS (see recipe)
      • 75-cm 2 tissue culture-treated flasks (sizes vary with personal needs)
      • Cell culture incubator set to 28°C and 5% CO2
      • 28°C water bath
      • Cell scraper (sizes vary with personal needs)

      1. Begin with a 75-cm 2 flask that is ∼80% to 90% confluent.

      2. Warm DPBS and C6/36 culture medium to 28°C in a water bath.

      All solutions that come into contact with the cells should be previously warmed to 28°C.

      3. Remove media and rinse the flask with 5 to 10 ml DPBS.

      Do not apply the DPBS with high pressure directly to the cells as this may cause the monolayer to disassociate from the culture flask. Gently add the DPBS down the neck of the flask and rock backward and forward and left to right for 1 to 3 min to aid in the removal of cellular debris and excess media.

      4. Scrape the cells with a cell scraper.

      Gently press the cell scraper to the monolayer and move along the entire surface area of the monolayer to remove the cells.

      5. Resuspend the cells in 10 ml C6/36 culture medium.

      Mix thoroughly to avoid large clumps of cells.

      6. Split the cells into a new 75-cm 2 culture flask at a 1:3 or 1:5 dilution.

      A 1:5 dilution should take 3 to 4 days to reach 80% to 90% confluency in a 75-cm 2 flask.

      7. Add 10 to 15 ml of warmed C6/36 culture media to the culture flask.

      8. Incubate the culture flasks at 28°C and 5% CO2.

      9. Monitor cell growth daily.

      10. When cells reach an 80% to 90% confluent monolayer proceed to step 2.


      ACKNOWLEDGMENTS

      The authors thank Prof. Qihan Li (Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences, Kunming, China) for the gift of mumps virus strain. The authors also thank LetPub (Shanghai, China) for its linguistic assistance during the preparation of this manuscript. This work was supported by grants from the Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Initiative for Innovative Medicine (Grants 2017-IZM-B&R-06 and 2017-IZM-3-007), the Major State Basic Research Project of China (Grants 2016YFA0101001 and 2018YFC1003902), the National Natural Science Foundation of China (Grant 1701430), and the China Postdoctoral Science Foundation (Grant 2017M611931). أعلن المؤلفون أنه لا يوجد اختلاف في الاهتمامات.


      المواد والأساليب

      Bacteriophage MS2 suspension and enumeration

      The bacteriophage MS2 (NCIMB 10108 ATCC 15597-B1) was used as a surrogate for nonenveloped mammalian viruses and notably poliovirus ( Jones 1995 Brion and Silverstein 1999 Koivunen and Heinonen-Tanski 2005 Sickbert-Bennett وآخرون. 2005). MS2 was propagated in الإشريكية القولونية (NCIMB 9481) following the protocol described by Woolwine and Gerberding (1995) .

      MS2 stock suspension was obtained by pipetting 5 ml of SM buffer (5% v/v 1 mol l −1 Tris/HCl pH 7·4, 0·2% w/v MgSO4, and 0·5% w/v gelatine) onto a plaque assay plate showing at least 50 plaques. The top agar layer was scraped and poured into a centrifuge tube and centrifuged for 15 min at 11 000 ز at 4°C. The supernatant containing phages was filtered through a 0·22-μm membrane filter and stored at 4–5°C until used. To enumerate the phage stock, a plaque assay was performed as described by Adams (1959) .

      Biocides and suspension test

      PHMB-based biocides were VANTOCIL™ TG (MW 2678 Arch Chemicals, Manchester, UK) and COSMOCIL™ CQ (MW 3016 Arch Chemicals). Both PHMB were used at two concentrations, 200 and 800 ppm, which reflect the range of concentrations used in commercial products. They were prepared monthly in a sterile bottle using sterile deionized water.

      The suspension test used here was based on the European Standard prEN13610 ( Anon 2001 ). The efficacy of the PHMB was tested at four different contact times (1, 5, 10 and 30 min) at room temperature. Briefly, 1 ml of phage suspension adjusted to ج. 10 10 PFU ml −1 was added to 9 ml of PHMB. After the appropriate exposure time, 1 ml of the test mixture was added to 9 ml of neutralizer (6% w/v Tween 80 0·45% w/v lecithin and 0·1% w/v l -histidine). After 2-min contact in the neutralizer, a sample was taken, serially diluted (tenfold) and surviving bacteriophages enumerated with the plaque assay ( Adams 1959 ). In the control, PHMB was replaced with sterile distilled deionized water. The toxicity of the neutralizer towards MS2, and its host was validated together with the efficacy of the neutralizer to quench the activity of the biocide as follows: one ml of the overnight host cell suspension (ج. 10 9 CFU ml −1 ) was mixed with 9 ml of neutraliser. After 10-min exposure time, 1 ml of sample was serially diluted and plated using the Miles–Misra method ( Miles and Misra 1938 ). After 24-h incubation at 37°C, colonies were counted, and the reduction factor (RF) was calculated as log10 (CFU ml −1 initial inoculum) − log10 (CFU ml −1 after exposure). The neutraliser toxicity test was similar with MS2. One millilitre of phage suspension (ج. 10 9 PFU ml −1 ) and 9 ml of neutraliser were mixed together for 10 min. Then, 1 ml of sample was withdrawn and serially diluted, and surviving bacteriophages enumerated with the plaque assay ( Adams 1959 ). The RF was calculated as log10 (PFU ml −1 initial inoculum) − log10 (PFU ml −1 after exposure).

      The efficacy of the neutraliser to quench effectively PHMB was performed with both the host bacteria and MS2. Two different ratios (1/1 and 2/1) between the biocide and the neutraliser were tested, as different amounts of disinfectant and neutraliser were used in this investigation. One millilitre of the overnight host cell (ج. 10 9 CFU ml −1 ) or phage suspension (ج. 10 9 PFU ml −1 ) was added to a disinfectant/neutraliser mixture and left for 10 min and serially diluted. Bacterial survival and phage survival following exposure were measured as described previously.

      Precipitation and purification of MS2

      The protocol to precipitate and purify the bacteriophage was based on Sambrook and Russell (2001) with the following modifications: PEG 8000 and NaCl were added to the MS2 suspension (ج. 10 10 PFU ml −1 ) simultaneously. The CsCl equilibrium gradient was prepared with the three densities ρ = 1·35 g cm −3 , ρ = 1·45 g cm −3 , ρ = 1·70 g cm −3 in a 13·5-ml centrifuge tube, layering 2·6 ml of the three steps gradient. The three densities were chosen because of MS2 density of 1·38 g cm −3 ( Kuzmanovic وآخرون. 2003 ) The virus (5·2 ml) was layered on top of the gradient and then centrifuged at 363 000 ز (Beckman Coulter Fullerton, CA, USA) for 8 h at 20°C. Purified bacteriophages were harvested, dialysed overnight against SM buffer and then filtered through 0·22-μm filter.

      Hydrophobicity tests

      Two different tests were performed: the adsorption to lipid and the MATH tests. The biocide concentrations tested were 2, 20, 200 and 800 ppm.

      Adsorption to cholesterol was based on a modified protocol for bacteriophages described by Klein and Deforest (1983) . A 5% w/v cholesterol suspension was prepared adding 0·01% w/v of Tween 80 to increase the lipid solubility. The suspension was kept at 4°C and used at room temperature during the experiments. One millilitre of MS2 suspension (10 10 PFU ml −1 ) was mixed with 9 ml of PHMB biocide at different concentrations (2, 20, 200 and 800 ppm). Deionized water was used instead of PHMB as a control. After 5-min exposure time, 1 ml of the text mixture was mixed with 4 ml of the cholesterol solution. The mixture was constantly agitated at 150 rev min −1 for 30 min at room temperature and then centrifuged twice for 30 min at 5000 ز at 20°C. The number of phage present in the aqueous supernatant was enumerated according to Adams (1959) .

      Adsorption to hexadecane (MATH method) was described by Denyer وآخرون. (1993) . One ml of MS2 suspension (10 10 PFU ml −1 ) was mixed with 9 ml of PHMB biocide at different concentrations (2, 20, 200 and 800 ppm). Deionized water was used instead of PHMB as a control. After 5-min exposure time, 1 ml of the text mixture was mixed with 0·2 ml of hexadecane at room temperature for 10 min. After 60-s vortexing, the two phases were allowed to separate at room temperature for 7 min. The number of phages in the aqueous phase was measured as described earlier.

      The percentage of MS2 partitioned to the lipidic-hydrocarbon phase was calculated as: (PFU ml −1 inoculated − PFU ml −1 in the aqueous phase)/PFU ml −1 inoculated × 100.

      Dynamic light scattering

      Dynamic light scattering measured with N4plus (Beckman Coulter) was used to measure the size of the aggregates of MS2 before and after the treatment with PHMB. Purified virus suspension (10 11 PFU ml −1 ) was dialysed overnight against KCl (0·250 mol l −1 ) and then filtered through 0·22-μm filter. The sample concentration was adjusted to ensure that the count per second fell in the range 5 × 10 4 –1 × 10 6 . MS2 suspension (10 11 PFU ml −1 ) was then exposed to PHMB (2, 20, 200 and 800 ppm) for 2 min. Light scattering measurements ran for 240 s using a laser angle of 90° and were made in triplicate. To analyse the results effectively, the percentage of particles of a different size were pulled together into arbitrary size categories.

      Protein analysis

      MS2 exposure to biocide prior to protein analysis was performed at two different PHMB concentrations, 200 and 800 ppm. Controls were tested against deionized water.

      A volume of the purified MS2 (0·375 ml 10 11 PFU ml −1 ) was mixed with 0·125 ml of biocide. After 10-min contact time, a cold acetone precipitation of proteins was performed mixing 0·3 ml of the sample with 1·2 ml of cold acetone. After incubation at −20°C for 3 h, the sample was centrifuged at 15 000 ز for 15 min at 4°C. The supernatant was discharged, and the pellet was air-dried for 5–10 min to drive off the acetone.

      The pellet was then resuspended with 20 μl of 2× SDS sample buffer (15·14% w/v Tris–HCl pH 6·8, 20% v/v glycerol, 4% w/v SDS, 0·2% w/v 2-mercaptoethanol (2-ME) and 0·001% w/v bromophenol blue) and boiled for 3 min. The sample was allowed to cool at room temperature and a quick centrifugation (8000 ز for 10 s at 15°C) was carried to remove any insoluble materials. Ten microlitres of sample (ج. 0·5 mg ml −1 of proteins) was loaded onto a polyacrylamide 20% homogeneous gel (Amersham Pharmacia Biotech AB, Buckinghamshire, UK). Gels were developed by silver staining (PhastSystem separation technique file no. 110 Pharmacia AB) using the automated developing chamber of the PhastSystem (Amersham Pharmacia Biotech AB). The concentration of the proteins was measured according to Gerhart وآخرون. (1994) .

      Attachment of PHMB to phage proteins was measured qualitatively with a colorimetric assay based on the property of PHMB to change the pK of certain indicator, such as Eosin Y ( Gilbert وآخرون. 1990 ). The proteins separation was run in duplicate gels. One gel was silver stained, whereas the other was dyed with Eosin Y. The gel was first fixed in 7% v/v acetic acid for 10 min and then for another 20 min in 50% v/v methanol. A washing step was performed for 20 min. The gel was finally soaked in 10% w/v sodium acetate (100 ml), 0·024% w/v Eosin y (250 ml) and water (150 ml), until pink bands were visible (1 h). A last step of washing was performed to wash away all the dye not attached to the biocide. Controls, which consisted of PHMB mixed with deionized water (final concentration 200 and 800 ppm) and processed through the cold acetone precipitation were used to assess the presence of the biocide in solution after the SDS-PAGE protocol.

      Electron microscopy

      One millilitre of concentrated phage stock (10 11 PFU ml −1 ) was treated with 1 ml of biocide. After 10-min exposure, 20 μl of sample was mixed with 30 μl of 2% methylamine tungstate for 10 min. A drop of the negatively stained phage was placed on a nickel- or copper-coated grid and left drying for 20 min. The excess of liquid was removed with filter paper. The grid was examined in a Philips EM 400T electron microscope operating at 80 kV accelerating voltage at magnification of ×28 000–44 000. Control consisted of MS2 treated in with distilled deionized water instead of PHMB.

      تحليل احصائي

      Suspension tests were performed five times in duplicates. All data were transformed in log10 to assure normal distribution. RF was calculated as log10 (PFU ml −1 initial inoculum) − log10 (PFU ml −1 after exposure). The other tests described earlier (protein analysis and hydrophobicity) were performed on three separate occasions in duplicate. Any differences among results were analysed by parametric test, one-way anova test. If the test resulted significant, آخر مخصص Tukey test was used to underline which couple of variables resulted different. The dynamic light scattering results were analysed using the χ 2 test.


      مناقشة

      Although the Huh7.5.1–8 cell line is more permissive to HCV infection than the Huh7.5.1 cell line [20], we found that this was not the case with JEV infection: The Huh7.5.1–8 and the parental Huh7.5.1 cell lines were comparable in terms of JEV productivity, susceptibility to JEV-induced cell death, and JEV plaque formation (Fig 1). Even the ancestral HuH-7 cell line was comparable except for plaque formation. These findings indicate that genetic factors contributing to the high permissiveness of the Huh7.5.1–8 cell line to HCV infection are specific rather than broadly proviral. One such genetic factor might be involved in stable HCV receptor expression [20]. Unlike the Huh7.5.1–8 and Huh7.5.1 cell lines, the HuH-7 cell line was not maintained under our culture conditions for the plaque assay (Fig 1C), likely because our HuH-7 cells had a lower fitness to cell culture than Huh7.5.1–8 and Huh7.5.1 cells.

      Here, we found three differences in outputs of flavivirus infection between Huh7.5.1–8 and Vero cell lines. First, Huh7.5.1–8 cells produced higher amounts of infectious JEV and YFV than Vero cells early in infection (Figs 2 and 8A–8D). In the case of JEV, the high virus productivity of Huh7.5.1–8 cells may be attributed not to the increase in infectivity of a virus particle (Fig 4), but to viral rapid replication kinetics and efficient virus release early in infection (Figs 5 and 6). Therefore, Huh7.5.1–8 cells are more suitable than Vero cells for obtaining large amounts of flavivirus in a short period of time. Recently, HuH-7 cells were shown to produce higher amounts of Zika virus than other cells including Vero E6 cells (ATCC CRL-1586) early in infection [29]. Considering that JEV production in Huh7.5.1–8 cells and the ancestral HuH-7 cells were comparable (Fig 1A), high virus productivity early in flavivirus infection may be a common feature among the HuH-7 lineage. In addition, a similar trend was observed when HuH-7 cells were infected with Middle East respiratory syndrome coronavirus [30]. Thus, the feature may not be limited to flavivirus infection.

      Second, we found that Huh7.5.1–8 cells were more susceptible to JEV/YFV-induced cell death than Vero cells (Figs 3, 8E and 8F). These characteristics of the Huh7.5.1–8 cell line may facilitate cell viability-based screenings of antiviral host factors and agents for flaviviruses. Meanwhile, the potent cell death observed in Huh7.5.1–8 cells appears to be a part of the reason for plateaued or reduced virus production late in infection. Therefore, genetic engineering of the Huh7.5.1–8 cell line to make it less susceptible to virus-induced cell death might yield a cell line with more flavivirus production.

      Third, we found that Huh7.5.1–8 cells developed JEV plaques rapidly (Fig 7) and formed a larger number of YFV plaques (Fig 9) compared with Vero cells, though the difference in plaque numbers between the two cell lines varied by each virus. The JEV plaque phenotype of Huh7.5.1–8 cells appears to reflect their high virus productivity and susceptibility to virus-induced cell death. Because a plaque assay is somewhat time-consuming, the plaque phenotype observed with JEV infection in Huh7.5.1–8 cells can be utilized to shorten the period of plaque assay. In addition, the high-number plaque phenotype observed with YFV infection in Huh7.5.1–8 cells can be utilized to improve the sensitivity of detection and titration of YFV by plaque assay. Vero cells may be more suitable to viruses requiring long-term cultivation to grow plaques, because they were more tolerant to our plaque assay conditions than Huh7.5.1–8 cells. In addition, the higher tolerance of Vero cells to flavivirus-induced cell death, compared with Huh7.5.1–8 cells, may be a feature that makes the Vero cell line advantageous for vaccine production.

      On top of these findings, we provided evidence that Huh7.5.1–8 is a RIG-I null mutant cell line. Our results suggested that, in a Huh7.5.1–8 cell, one allele of the RIG-I gene generates full-length mRNA with a T55I mutation that abolishes RIG-I-mediated antiviral signaling, whereas the other allele generates defective splice variants without the mutation. One of the splice variants is also expressed in the parental HuH-7 cell line. Codon 55 of RIG-I gene of Huh7.5.1 cells was heterozygous as was that of Huh7.5.1–8 cells, showing that the heterozygosity of the codon was stable at least during the time span for isolation of the Huh7.5.1–8 clone from Huh7.5.1 cells. At present, the underlying mechanisms that generate splice variants and their impacts on RIG-I signaling remain to be studied. Although JEV has been restricted by RIG-I in a mouse model [31] and mouse cell lines [32, 33], JEV production and susceptibility to JEV-induced cell death were not dramatically altered in the Huh7.5.1–8 and Huh7.5.1 cell lines compared with the HuH-7 cell line (Fig 1A and 1B), implying that the RIG-I pathway may not work or may be counteracted by viral mechanisms [34] under our experimental conditions.

      In conclusion, our study highlighted the characteristics of the Huh7.5.1–8 cell line that are helpful for improvement of flavivirus propagation, detection, and titration. Further study is needed to investigate the potential versatility of the Huh7.5.1–8 cell line in virus research.


      5. الخلاصة

      Our results highlight the importance of choosing the right membrane for intensified virus production and continuous product harvesting. We show that a selection based solely on nominal membrane pore size values reported by manufacuturers may not be sufficient. Instead, membrane material and associated structural and physiochemical properties are decisive factors that determine filter fouling and eventually the “true” membrane pore size causing product retention. The widely used PES (0.18 µm measured cutoff) membrane fouled quickly, so that YFV titers but also protein concentrations decreased rapidly in the permeate flow. In contrast, the 0.34 µm PS membrane was highly permeable for YFV particles and enabled continuous product harvesting in small-scale hollow fiber modules and TFF mode. In this context, different process conditions (e.g., flow velocity and permeate flux) and filtration operations (e.g., hydrodynamic backflushing, inverting flow directions, and pulsed flow) can be investigated to improve performance of the PS-based perfusion processes even further.


      شاهد الفيديو: لوحات ضبط الصفات لوحة النسبة المئوية للمعيب p-chart, لوحة عدد العيوب c-chart (ديسمبر 2022).