معلومة

عمل التردد المحتمل للخلايا العصبية قبل المشبكية يصاحبها في الخلايا العصبية / العضلية بعد المشبكي

عمل التردد المحتمل للخلايا العصبية قبل المشبكية يصاحبها في الخلايا العصبية / العضلية بعد المشبكي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا فيزيائي مهتم بمعرفة كيف يقارن التردد المحتمل للعمل في الخلايا العصبية قبل المشبكية مع ذلك في

أ) خلية عصبية ما بعد المشبكي و

ب) إزالة الاستقطاب الغشائي للخلايا العضلية ، و

ج) كيف أن إزالة الاستقطاب الغشائي للخلايا العضلية يرتبط بشكل كمي بانقباض العضلات.

من القراءة التي قمت بها حتى الآن ، يبدو أن نظرية ج) قياسية ، ويطلق عليها الاسم "اقتران الانقباض والإثارة". أعتقد أن العلاقة الفعلية بين تواتر إزالة الاستقطاب من غشاء الخلية العضلية ودرجة تقلص العضلات - مهما كانت كمية - ستختلف من حيث نوع العضلات ، ونضوب مخازن الكالسيوم Ca2 + من الشبكة الساركوبلازمية ، وما إلى ذلك. تمت تغطيته هنا على سبيل المثال ، على الرغم من أنني لم أر الكثير من النمذجة الرياضية والمقارنة الكمية هنا.

على أي حال ، ما زلت أتساءل بعد ذلك بشأن أ) و ب). أعتقد أنه لا توجد إجابة مباشرة ؛ تسلسل الأحداث هو جهد فعل -> إطلاق ناقل عصبي في شق متشابك -> ارتباط ناقل عصبي -> إزالة استقطاب الغشاء -> نأمل أن يكون جهد فعل.

أرى بالفعل بعض المصادر المحتملة للسلوك غير الخطي في الخطوة الأخيرة ، وستعتمد أيضًا خطوة ارتباط الناقل العصبي -> إزالة الاستقطاب على حركية المستقبِل. نظرًا لأننا نتحدث عن السلوك على نطاق زمني ، فسيتعين علينا النظر في معدل انحلال الناقل العصبي داخل الشق المشبكي ، ولا شك في أن العديد من الأمراض تنشأ بسبب بعض الخلل في التغييرات في معدل تدهور / إعادة امتصاص الناقل العصبي ... تعال للتفكير في الأمر الآن في الواقع ، أعتقد أن الاختلافات في مدى الارتباط (على سبيل المثال بسبب الاختلافات في عدد المستقبلات على غشاء الخلايا العصبية بعد المشبكي) هي الأساس - أو على الأقل عامل واحد - في المرونة العصبية. لذلك بالطبع سوف يختلفون. لكن يبقى السؤال إلى أي مدى. لست متأكدًا مما إذا كانت بعض الدوائر ، مثل تلك الموجودة في النظام الحركي ، هناك القليل من الانحراف بين الاستجابات لدى الناس.

لإعطاء بعض السياق لسؤالي ، أنا مهتم بالتقنيات التي تحفز بنشاط أو تعطل تحفيز الخلايا العصبية بطريقة مضبوطة ، وذلك لتحقيق تأثير الإخراج المطلوب. هناك العديد من التقنيات والتقنيات المعملية التي يتم تطويرها مع مراعاة علم البصريات الوراثي على مستوى الخلايا العصبية المفردة ، والتحفيز فوق الجافية والتحفيز فوق الجافية لتحفيز مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية لفترة زمنية غير محددة. أعتقد أن هذه التقنيات يمكن أن تكون أكثر قوة وفعالية ، إذا عرفنا العلاقة الزمنية بين معدلات إطلاق الأعصاب المتتالية على التحفيز.


يحدد علماء الأعصاب آلية جديدة تساهم في تقوية نقاط الاشتباك العصبي

الخلايا العصبية الحركية (الخضراء) تشكل نقاط الاشتباك العصبي (مظللة باللون الأرجواني) على ألياف العضلات في ذبابة الفاكهة. اكتشف علماء الأعصاب في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا مسارًا يساهم في تقوية هذه المشابك. الصورة: تروي ليتلتون

حدد علماء الأعصاب من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا آلية جديدة تسمح للدماغ بتقوية الروابط بين الخلايا العصبية.

عندما يشكل الدماغ ذكريات أو يتعلم مهمة جديدة ، فإنه يشفر المعلومات الجديدة عن طريق ضبط الاتصالات بين الخلايا العصبية. اكتشف علماء الأعصاب في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا آلية جديدة تساهم في تقوية هذه الروابط ، وتسمى أيضًا نقاط الاشتباك العصبي.

في كل مشبك ، يرسل الخلايا العصبية قبل المشبكي إشارات كيميائية إلى خلية أو أكثر من الخلايا المستقبلة بعد المشبكي. في معظم الدراسات السابقة حول كيفية تطور هذه الروابط ، ركز العلماء على دور الخلايا العصبية بعد المشبكية. ومع ذلك ، وجد فريق معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا أن الخلايا العصبية قبل المشبكية تؤثر أيضًا على قوة الاتصال.

يقول تروي ليتلتون ، الأستاذ في أقسام علم الأحياء والدماغ والعلوم المعرفية في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، "هذه الآلية التي اكتشفناها في جانب ما قبل المشبكي تضيف إلى مجموعة الأدوات التي لدينا لفهم كيف يمكن أن تتغير نقاط الاشتباك العصبي". معهد Picower للتعلم والذاكرة ، وكبير مؤلفي الدراسة ، التي ظهرت في عدد 18 نوفمبر من Neuron.

يمكن أن يساعد تعلم المزيد حول كيفية تغيير المشابك العصبية في روابطها العلماء على فهم اضطرابات النمو العصبي مثل التوحد بشكل أفضل ، نظرًا لأن العديد من التعديلات الجينية المرتبطة بالتوحد توجد في الجينات التي ترمز للبروتينات المتشابكة.

ريتشارد تشو ، عالم أبحاث في معهد بيكوير ، هو المؤلف الرئيسي للورقة.

إعادة توصيل الدماغ

أحد أكبر الأسئلة في مجال علم الأعصاب هو كيف يعيد الدماغ تشكيل نفسه استجابة للظروف السلوكية المتغيرة - وهي قدرة تُعرف باللدونة. هذا مهم بشكل خاص أثناء التطور المبكر ولكنه يستمر طوال الحياة حيث يتعلم الدماغ ويشكل ذكريات جديدة.

على مدار الثلاثين عامًا الماضية ، وجد العلماء أن المدخلات القوية لخلية ما بعد المشبك تجعلها تنقل المزيد من مستقبلات الناقلات العصبية إلى سطحها ، مما يضخم الإشارة التي تتلقاها من الخلية قبل المشبكية. تحدث هذه الظاهرة ، المعروفة باسم التقوية طويلة المدى (LTP) ، بعد التحفيز المستمر عالي التردد للمشبك. يمكن أن يحدث الاكتئاب طويل الأمد (LTD) ، وهو ضعف في استجابة ما بعد المشبك بسبب التحفيز منخفض التردد للغاية ، عند إزالة هذه المستقبلات.

يقول ليتلتون إن العلماء ركزوا بشكل أقل على دور الخلايا العصبية قبل المشبكية في اللدونة ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى صعوبة دراستها.

قضى مختبره عدة سنوات في العمل على آلية كيفية إطلاق الخلايا قبل المشبكية لناقل عصبي استجابة لارتفاع النشاط الكهربائي المعروف باسم إمكانات الفعل. عندما تسجل الخلايا العصبية قبل المشبكية تدفق أيونات الكالسيوم ، تحمل الاندفاع الكهربائي لإمكانات الفعل ، تندمج الحويصلات التي تخزن الناقلات العصبية في غشاء الخلية وتنسكب محتوياتها خارج الخلية ، حيث ترتبط بالمستقبلات الموجودة على العصبون ما بعد المشبكي.

يطلق العصبون قبل المشبكي أيضًا ناقلًا عصبيًا في غياب إمكانات الفعل ، في عملية تسمى الإطلاق التلقائي. كان يُعتقد سابقًا أن هذه "الثياب الصغيرة" تمثل ضوضاء تحدث في الدماغ. ومع ذلك ، وجد ليتلتون وتشو أنه يمكن تنظيم السيارات الصغيرة لقيادة اللدونة الهيكلية المتشابكة.

لاستكشاف كيفية تقوية نقاط الاشتباك العصبي ، درس ليتلتون وتشو نوعًا من المشابك يُعرف باسم الوصلات العصبية العضلية في ذباب الفاكهة. قام الباحثون بتحفيز الخلايا العصبية قبل المشبكية بسلسلة سريعة من إمكانات العمل خلال فترة زمنية قصيرة. كما هو متوقع ، أطلقت هذه الخلايا ناقلًا عصبيًا بشكل متزامن مع إمكانات العمل. ومع ذلك ، ولدهشتهم ، وجد الباحثون أن الأحداث المصغرة قد تحسنت بشكل كبير بعد انتهاء التحفيز الكهربائي.

يقول ليتلتون: "كل مشابك في الدماغ تطلق هذه الأحداث الصغيرة ، لكن الناس تجاهلوها إلى حد كبير لأنها تحفز قدرًا صغيرًا جدًا من النشاط في خلية ما بعد المشبكية". "عندما أعطينا نبضًا قويًا من النشاط لهذه الخلايا العصبية ، فإن هذه الأحداث الصغيرة ، والتي عادة ما تكون منخفضة التردد للغاية ، زادت فجأة وبقيت مرتفعة لعدة دقائق قبل أن تنخفض."

نمو متشابك

يبدو أن تعزيز الثغرات الصغيرة يستفز الخلايا العصبية بعد المشبكية لإطلاق عامل إشارة ، لا يزال غير معروف ، يعود إلى الخلية قبل المشبكية وينشط إنزيمًا يسمى PKA. يتفاعل هذا الإنزيم مع بروتين حويصلي يسمى كومبلينسين ، والذي يعمل عادةً كمكبح ، ويثبِّط الحويصلات لمنع إطلاق ناقل عصبي إلى حين الحاجة إليه. التحفيز بواسطة PKA يعدل المركب بحيث يطلق قبضته على حويصلات الناقل العصبي ، مما ينتج عنه أحداث صغيرة.

عندما يتم إطلاق هذه الحزم الصغيرة من الناقلات العصبية بمعدلات مرتفعة ، فإنها تساعد في تحفيز نمو اتصالات جديدة ، تُعرف باسم boutons ، بين الخلايا العصبية قبل المشبكي وما بعد المشبكي. هذا يجعل الخلايا العصبية بعد المشبكية أكثر استجابة لأي اتصال مستقبلي من الخلايا العصبية قبل المشبكية.

"عادةً ما يكون لديك 70 أو نحو ذلك من هذه الحزم لكل خلية ، ولكن إذا قمت بتحفيز الخلية قبل المشبكية ، يمكنك زراعة نبتات جديدة بشكل حاد جدًا. سيضاعف عدد نقاط الاشتباك العصبي التي تتشكل ، "يقول ليتلتون.

لاحظ الباحثون هذه العملية خلال تطور يرقات الذباب ، والتي تستمر من ثلاثة إلى خمسة أيام. ومع ذلك ، أوضح ليتلتون وتشو أن التغيرات الحادة في الوظيفة المشبكية يمكن أن تؤدي أيضًا إلى مرونة هيكلية متشابكة أثناء التطور.

"يمكن تعديل الآلات في الطرف قبل المشبكي بطريقة حادة جدًا لدفع أشكال معينة من اللدونة ، والتي قد تكون مهمة حقًا ليس فقط في التطور ، ولكن أيضًا في الحالات الأكثر نضجًا حيث يمكن أن تحدث تغيرات متشابكة أثناء العمليات السلوكية مثل التعلم والذاكرة ، "تشو يقول.

الدراسة مهمة لأنها من بين أولى الدراسات التي كشفت عن كيفية مساهمة الخلايا العصبية قبل المشبكية في اللدونة ، كما تقول ماريا بيخوفسكايا ، أستاذة علم الأعصاب في كلية الطب بجامعة واين ستيت والتي لم تشارك في البحث.

يقول بيخوفسكايا: "كان معروفًا أن نمو الروابط العصبية يتحدد بالنشاط ، لكن ما كان يحدث تحديدًا لم يكن واضحًا للغاية". لقد استخدموا ذبابة الفاكهة بشكل جميل لتحديد المسار الجزيئي.

يحاول مختبر Littleton الآن اكتشاف المزيد من التفاصيل الآلية لكيفية تحكم مركب مركب في إطلاق الحويصلة.


توصيل النبضات العصبية

تمتلك الخلايا العصبية استثارة كهربائية ، وهي القدرة على الاستجابة لمحفز عن طريق توليد نبضة عصبية. في معظم الحالات ، تكون التشعبات في الخلايا العصبية هي المكان الذي تحدث فيه التغيرات المحلية في الخواص الكهربائية للغشاء من خلال المشابك. تستقبل التشعبات المحفزات من البيئة الخارجية (مثل الخلايا العصبية الحسية الجسدية) أو البيئة الداخلية (مثل الخلايا العصبية الحسية الحشوية أو الخلايا العصبية الحركية أو الخلايا العصبية الداخلية). يتم تحديد مقدار التغيير في الشحنة الكهربائية للغشاء من خلال قوة المنبه الذي يسببها. على سبيل المثال ، ستؤدي إبرة وخز طرف الإصبع إلى محفز أكبر مقارنة بجسم غير حاد يلامس نفس الإصبع. بمجرد أن ينتج المنبه (أو المنبهات المتعددة) تغيرًا كبيرًا في الخواص الكهربائية للغشاء للتغصنات ويصل إلى درجة محددة مسبقًا عتبة، ثم يحدث نبضة عصبية (تسمى أيضًا إمكانات الفعل). ان إمكانات العمل يتم إنشاؤه في تلة عصبية عصبية ويتقدم بسرعة على طول غشاء البلازما لمحور عصبي للوصول إلى الأهداف (خلية عصبية ثانية أو عضلة أو غدة). تسمى هذه الحركة لإمكانات العمل على طول المحور العصبي التكاثر. في حين أن المنبهات يمكن أن تكون ضعيفة أو قوية ، فإن جهد الفعل يتبع أ قانون الكل أو لا شيء التي يكون لها دائمًا نفس القوة (يشار إليها بالسعة) بشكل مستقل عن التحفيز. هذا يقلل من احتمال فقدان المعلومات على طول الطريق. الطريقة الوحيدة لتعديل الاستجابة هي من خلال تكرار إمكانات العمل - كم عدد إمكانات الفعل التي تصل إلى الهدف في فترة زمنية محددة. سينتج الحافز الأكبر سلسلة (أو مجموعة) من إمكانات الفعل التي تكون قريبة من بعضها البعض ، في حين أن الحافز الضعيف سينتج إمكانات عمل متفرقة.

تتأثر سرعة جهد الفعل بقطر المحور العصبي وتكوّن النخاع فيه. كلما زاد قطر المحور العصبي ، زادت سرعة إجراء إمكانات العمل. المحاور النخاعية قادرة على حمل إمكانات العمل بشكل أسرع من المحاور غير الملقحة. كما نوقش في القسم السابق ، تلتف الخلايا النخاعية (الخلايا قليلة التغصن في الجهاز العصبي المركزي وخلايا شوان في الجهاز العصبي المحيطي) حول المحاور التي تشكل المايلين. عقد رانفييه عبارة عن فجوات بين أجزاء المايلين. يمكن أن تقفز الشحنات الكهربائية لجهد الفعل من فجوة إلى فجوة أخرى ، مما يتيح سرعة أكبر لإمكانات الفعل. يسمى هذا التطور في النبض العصبي التوصيل المملحي. ومع ذلك ، في المحاور غير الملقحة ، لا يتم تغطية جانب واحد من المحوار بواسطة المايلين وتتحرك الشحنات الكهربائية على طول الغشاء المحوري بأكمله ، وبالتالي تستغرق وقتًا أطول للوصول إلى هدفها. يسمى هذا التطور في النبضات العصبية التوصيل المستمر. بمجرد وصول جهد الفعل إلى طرف المحور العصبي ، يتم نقله إما كشحنة كهربائية إلى الخلية التالية أو تحويله إلى إشارة كيميائية ، اعتمادًا على نوع المشبك الذي تشكله اللمبة الطرفية المشبكية مع هدفها.

الخلايا العصبية وأهدافها تشكل نقاط الاشتباك العصبي. تسمى الخلية العصبية التي تولد وتنفذ جهد الفعل للهدف أ خلية قبل المشبكي. تسمى الخلية المستهدفة التي تتلقى جهد الفعل أ خلية بعد المشبكي. في حين أن الخلية قبل المشبكية هي دائمًا خلية عصبية (لأن الخلايا العصبية فقط لها محاور ويمكن أن تشكل مشابكًا) ، يمكن أن تكون الخلية بعد المشبكية خلية عصبية أو نوعًا آخر من الخلايا مثل الخلايا العضلية الهيكلية أو القلبية أو الملساء أو الغدد. في الشكل ( PageIndex <1> ) ، تشكل الخلايا العصبية قبل المشبكية تشابكات عصبية مع خليتين عصبيتين ما بعد المشبكي. ينتقل الدافع العصبي (أو الإشارة) من عصبون ما قبل المشبكي إلى خلية ما بعد المشبكي. إذا كانت الخلية ما بعد المشبكية عبارة عن خلية عصبية ، فقد يتم إنشاء إمكانية عمل جديدة في الخلايا العصبية بعد المشبكية وتصل إلى أهدافها بعد المشبكية.

الشكل ( PageIndex <1> ): الخلايا العصبية قبل المشبكية وما بعد المشبكية. الخلايا العصبية قبل المشبكية في الأعلى تتشابك مع اثنين من الخلايا العصبية بعد المشبكية في الأسفل. يتم تصنيف أجزاء الخلايا العصبية قبل المشبكية على أنها جسم الخلية ، والنواة ، والتشعبات ، والمحاور المغطاة بغمد المايلين. يوضح اتجاه الإشارة أن الإشارة الكهربائية (إمكانات الفعل) تنتقل من المحور العصبي للخلايا العصبية قبل المشبكي إلى المحاور المحورية للخلايا العصبية قبل المشبكية التي تكون على اتصال مع التشعبات والجسم الخلوي للخلايا العصبية بعد المشبكي. (رصيد الصورة: & quotNeuron Part 1 & quot بواسطة BruceBlaus مرخص بموجب CC BY-SA 4.0)


الفروق بين الجمع الزماني والمكاني

قدر الإمكان ، لا نريد التورط في الأمور المعقدة. خلال أيام دراستنا ، ربما كرهنا الرياضيات وحتى العلوم. في الرياضيات ، تحتاج إلى الحساب. نحن عادة نكره التعامل مع الأرقام. في العلم ، هناك الكثير من المصطلحات التقنية ، ونبدأ في لعن كل المخترعين والعلماء الذين جعلونا نعاني في دراساتنا. حتى العلم له رياضيات! هل سمعت عن الجمع الزماني والمكاني؟ إنه ليس الجمع النموذجي لـ "س" و "ص". له علاقة بالعلم ، وخاصة الخلايا العصبية. الخلايا العصبية هي جزء من الجهاز العصبي. بدونهم ، لن يكون هناك حافز ورد فعل. لمعرفة المزيد عن الفرق بين التجميع الزماني والمكاني ، نحتاج إلى دراسة هذه المصطلحات المعقدة. لكن لا تقلق! تشرح هذه المقالة الجمع الزمني والمكاني بأبسط مصطلحاته. أعتقد أنك ستتعلم شيئًا من هذه التفسيرات.

قبل أن نتعمق في الاختلاف بين الجمع الزماني والمكاني ، دعونا نحدد "الجمع" أولاً. المصطلح الآخر لـ "التجميع" هو "تجميع التردد". إنها عملية تتواصل فيها الخلايا العصبية مع بعضها البعض من أجل تحديد إمكانية الفعل التي يتم تشغيلها بواسطة إمكانات ما بعد المشبكي. تصدر الخلايا العصبية قبل المشبكي نواقل عصبية تندرج في إحدى فئتين: الناقلات العصبية الاستثارية والمثبطة. تصبح الخلية بعد المشبكية أكثر استقطابًا بسبب الناقلات العصبية المثيرة. عندما يزداد عمل النواقل العصبية الاستثارة ، تقلل النواقل المثبطة من تأثيرها. يمكن أن يدور عمل الخلايا العصبية في عمليتين فقط: إثارة أو تثبيط وبالتالي إنتاج استجابة محدودة فقط. يوجد جمع زمني إذا كان العصبون المستهدف لا يتلقى إلا مدخلات فاصلة قصيرة بشكل متكرر من محطة محوار وحيدة. يوجد تجميع مكاني عندما تتلقى الخلايا العصبية المستهدفة عدة مدخلات من عدة مصادر.

"التجميع الزمني" هو التأثير الناتج عن خلية عصبية معينة لتكون قادرة على تحقيق جهد فعل. يحدث "الجمع" بشكل عام اعتمادًا على طول الوقت الثابت والتكرار المتكرر لإمكانيات الفعل. هناك دائمًا ارتفاع آخر في إمكانات الفعل قبل النهايات المحتملة السابقة. سوف تلخص النقاط المحتملة السابقة والثانية وبالتالي توليد إمكانات أكبر. عندما يحدث هذا ، يمكن أن تصل الإمكانات إلى عتبة بدء عمل آخر محتمل. فيما يتعلق بالرؤية ، يتم تضمين التجميع الزمني. قانون بنسن - روسكو هو النسبة العكسية للشدة والوقت. تردد الرؤية مرتبط بتكرار الومضات. وفقًا للقانون ، كلما طالت مدة الحافز ، زادت فرصة بلوغه عدد الكميات اللازمة للرؤية.

وفي الوقت نفسه ، "التجميع المكاني" هو طريقة لتحقيق جهد فعل في خلية عصبية تتلقى مدخلات من عدة خلايا. عندما تضيف أو تلخص الإمكانات من التشعبات ، سيكون لديك جمع مكاني. كما ذكرنا سابقًا ، عندما تصل الإمكانات إلى الحد الأدنى ، فإنها ستولد إمكانية عمل أخرى. وهذا ما يسمى بالمرحلة الاستثارية بينما تمنع المرحلة المثبطة الخلية من تحقيق مثل هذا الفعل المحتمل. وفقًا لقانون ريكو ، داخل العين ، تتغيّر الكثافة والمساحة بشكل عكسي بسبب مجموعة الإشارات من القضبان إلى ثنائية الأضلاع والتي تتحول إلى خلايا عقدية.

يُعرف "التجميع" أيضًا باسم "تجميع التردد". إنها عملية تتواصل فيها الخلايا العصبية مع بعضها البعض من أجل تحديد إمكانية الفعل التي يتم تشغيلها بواسطة إمكانات ما بعد المشبكي.

يحدث الجمع عمومًا اعتمادًا على طول الوقت الثابت وعلى التكرار المتكرر لإمكانيات الفعل.

"التجميع الزمني" هو التأثير الناتج عن خلية عصبية معينة لتكون قادرة على تحقيق جهد فعل.

وفي الوقت نفسه ، فإن "الجمع المكاني" هو طريقة لتحقيق جهد فعل في خلية عصبية تتلقى مدخلات من عدة خلايا.


الجهاز العصبي: الرسم التخطيطي والوظيفة والأمراض رقم 038

هل تساءلت يومًا كيف سيكون الأمر إذا لم يكن لدى البشر جهاز عصبي؟ من الصعب للغاية حتى تخيل مثل هذا الموقف. ستفقد البشرية جوهرها وسلامتها. قد نفشل أيضًا في تصميم أنشطتنا اليومية ولن نكون قادرين على تحقيق مساعينا.فقط بسبب الجهاز العصبي ، الذي يعمل بمثابة & # 8216 الأسلاك الكهربائية ، & # 8217 يمكننا المشي والتحدث والأكل والقراءة والكتابة والجلوس والحفظ والتفكير والقيام بعملنا اليومي. الجهاز العصبي البشري هو شبكة معقدة من الأعصاب. تشكل الخلايا العصبية الوحدة الأساسية للجهاز العصبي. يتكون الجهاز العصبي من بلايين الخلايا العصبية. إنها نوع خاص من الخلايا التي تساعد في نقل المعلومات.

يشكل الجهاز العصبي مركز الاتصال والتنظيم الرئيسي بالإضافة إلى وحدة التحكم. ينظم الجهاز العصبي ، إلى جانب جهاز الغدد الصماء ، التوازن. دعونا نتحدث أكثر عن الدماغ والأعضاء المرتبطة به.

الجهاز العصبي البشري

ينقسم الجهاز العصبي البشري إلى ما يلي:

1. الوسط شمال شرق RVOUS نظام (CNS)

  • وهي تتألف من الدماغ والنخاع الشوكي.
  • CNS هو موقع معالجة المعلومات.

2. الجهاز العصبي المحيطي (PNS)

  • يتكون من جميع الخلايا العصبية المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي.
  • هناك نوعان من الألياف العصبية المرتبطة بالخلايا العصبية الحسية للجهاز العصبي المحيطي (الألياف الواردة) والخلايا العصبية الحركية (الألياف الصادرة).
  • يتم تصنيف الجهاز العصبي المحيطي كذلك إلى الجهاز العصبي الجسدي والمستقلي.
  • ينقسم الجهاز العصبي اللاإرادي بدوره إلى الجهاز العصبي السمبثاوي والباراسمبثاوي.
  • يُطلق على مجموعة الخلايا العصبية المحيطية جنبًا إلى جنب مع المحاور العصبية والواردة والخلايا الداعمة اسم العقد.

العصبون: الوحدة الأساسية الهيكلية والوظيفية

تشكل الخلايا العصبية الوحدة الهيكلية والوظيفية الأساسية للجهاز العصبي. هذه الخلايا العصبية ضرورية لتوصيل النبضات العصبية. الخلايا العصبية amitotic.

يتكون العصبون من ثلاثة أجزاء رئيسية هي ، جسم الخلية ، والتشعبات ، والمحاور.

1. جسم الخلية

  • يحتوي جسم الخلية على السيتوبلازم مع نواة وعضيات خلوية وأجسام حبيبية.
  • تسمى هذه الأجسام الحبيبية حبيبات Nissl & # 8217s.
  • لا توجد مريكزات في جسم الخلية.

2. التقسيمات

  • هم امتدادات لجسم الخلية.
  • تُعرف أيضًا باسم الألياف.
  • تستقبل التشعبات النبضات العصبية وتنقلها نحو جسم الخلية.

3 . محور عصبي

  • وهو أيضًا الامتدادات السيتوبلازمية لجسم الخلية.
  • إنها ألياف طويلة ولها نهاية بعيدة متفرعة.
  • يوجد هيكل يشبه المصباح في نهاية كل فرع ، وهو ما يسمى مقبض متشابك.
  • مقبض متشابك له الحويصلات المشبكية.
  • تحتوي هذه الحويصلات المشبكية الناقلات العصبية.
  • يعد المحور العصبي مسؤولاً عن نقل النبضات العصبية بعيدًا عن جسم الخلية إلى أ تشابك عصبى.

التصنيف على أساس الهيكل:

  1. الخلايا العصبية أحادية القطب
  2. الخلايا العصبية ثنائية القطب
  3. الخلايا العصبية متعددة الأقطاب

التصنيف على أساس وجود أو عدم وجود غمد المايلين:

  1. الخلايا العصبية المتخلفة: الخلايا العصبية محاطة خلايا شوان. قد تطور خلايا شوان هذه غمدًا المايلين حول الخلايا العصبية التي تسمى هذه الخلايا العصبية الخلايا العصبية النخاعية. تُعرف الفجوات التي تمتد بين غمد الميالين باسم العقد رانفييه. تم العثور على هذه الخلايا العصبية في العمود الفقري والأعصاب القحفية.
  2. الخلايا العصبية غير المبطنة: تسمى خلايا شوان التي لا تطور غمد المايلين حول العصبون الخلايا العصبية غير الملقحة. تم العثور على هذه الخلايا العصبية في النظام العصبي الذاتي والجسدي.

التصنيف على أساس الوظيفة:

  1. الخلايا العصبية الحسية: هذه تنقل النبضات العصبية من الأنسجة والأعضاء إلى النخاع الشوكي والدماغ.
  2. الخلايا العصبية الحركية: هذه الخلايا العصبية مسؤولة عن نقل النبضات العصبية من الدماغ والحبل الشوكي إلى العضلات والغدد.
  3. أعصاب بينية: تربط الخلايا العصبية الداخلية خلية عصبية بأخرى. ينقلون إشارات من الخلايا العصبية الحسية والأعصاب الداخلية الأخرى إلى الخلايا العصبية الحركية.

الدافع العصبي: التوليد والتوصيل

غشاء الخلايا العصبية مستقطب. يمكن أن يكون هذا بسبب القنوات الأيونية الموجودة على غشاء الخلايا العصبية. هذه القنوات الأيونية قابلة للاختراق بشكل انتقائي للأيونات المختلفة. لذلك ، فإن الخلايا العصبية قابلة للإثارة.

1.عندما تكون الخلية العصبية في حالة راحة (لا تجري أي نبضة):

بسبب اختلاف تركيز الأيونات داخل الخلية وفي السائل خارج الخلية ، أ تدرج التركيز لقد تكون. عندما يكون الغشاء في حالة راحة ، فإن مضخة الصوديوم والبوتاسيوم مسؤول عن الحفاظ على تدرج التركيز هذا. تعمل مضخة الصوديوم والبوتاسيوم هذه على نقل الأيونات بنشاط.

نتيجة للنقل النشط للأيونات ، يتم استقطاب غشاء العصبون.

إمكانات غشاء الراحة: فرق الجهد عبر غشاء الخلية عندما تكون في حالة راحة (لا تجري نبضة).

ثانيًا. عندما يكون الغشاء في حالة نشاط كهربائي (إجراء نبضة)

يصبح غشاء الخلية منفذاً بحرية لـ Na في الموقع حيث يتم تطبيق المنبه و

  • هناك تدفق من أيونات الصوديوم ،
  • عكس القطبية ، أمبير
  • الغشاء منزوع الاستقطاب (نزع الاستقطاب).

إمكانية العمل واندفاع الأعصاب: يسمى التغيير قصير المدى في فرق الجهد الكهربائي في الموقع الذي يتم فيه تطبيق المنبه بـ إمكانات العمل. هذا ما يسمى بـ & # 8220نبض العصب.”

الآن ، الموقع الذي أمامك مباشرة لا يزال في حالة راحة. هذا يعني أنه يحتوي على شحنة موجبة أكثر على غشاءه الخارجي وشحنة سالبة أكثر في العصارة الخلوية. من الآن فصاعدًا ، يتدفق التيار من:

  • السطح الداخلي& # 8211 من موقع التحفيز إلى الموقع الذي يسبقه مباشرة.
  • السطح الخارجي& # 8211 من الموقع مباشرة ، والعودة إلى موقع التحفيز.

مضخة الصوديوم والبوتاسيوم : مضخة الصوديوم والبوتاسيوم نوع من النقل النشط (يتطلب طاقة / ATP) التي تنقل الأيونات / الجزيئات مقابل تدرج تركيزها. تستخدم هذه المضخة ATP لإعطاء ثلاثة أيونات الصوديوم واثنين من أيونات البوتاسيوم.

  • أ البروتين الناقل مطلوب. نظرًا لأن البروتينات الحاملة تستخدم لنقل الأيونات مقابل تدرج تركيزها ، فإن هذه البروتينات الحاملة تُعرف باسم مضخات.
  • ترتبط ثلاثة أيونات الصوديوم بمضخة البروتين (الموجودة داخل الخلية). يتغير شكل مضخة البروتين الآن بعد أن تستمد الطاقة من ATP. بمجرد أن يغير شكله ، فإنه ينقل ثلاثة أيونات الصوديوم خارج الخلية.
  • تتجه مضخة البروتين للخارج لأنها تطلق أيونات الصوديوم. الآن ، يرتبط اثنان من أيونات البوتاسيوم بالمضخة ويتم نقلهما داخل الخلية.

الدافع العصبي: انتقال

أ تشابك عصبى هي نقطة اتصال وتواصل بين خليتين عصبيتين. يمكن أن يكون أيضًا نقطة الاتصال بين العصبون والعضلة أو الغدة. الكلمة & # 8216synapse & # 8217 مشتقة من الكلمة & # 8216syn & # 8217 & # 8216syn & # 8217 تعني معًا. المشبك لديه تشعبات من محور عصبي وجسم خلية لمحور آخر. يتم نقل النبضات العصبية (أو المعلومات) من أول خلية عصبية تسمى الخلايا العصبية قبل المشبكي، وتلقى من قبل خلية عصبية أخرى ، تسمى الخلايا العصبية بعد المشبكي. قد يتم أو لا يتم فصل الخلايا العصبية قبل المشبكية والخلايا العصبية بعد المشبك بفجوة تُعرف باسم شق متشابك.

هناك نوعان من نقاط الاشتباك العصبي

  • المشبك الكهربائي هو مفرق جاب.
  • هذه تقاطعات الفجوة لها قنوات connexon التي توضع في غشاء البلازما.
  • قنوات connexon لها مسام connexin التي تسمح للأيونات وجزيئات الإشارة بالمرور مباشرة من خلية إلى أخرى.
  • أغشية الخلايا العصبية قبل المشبكية وما بعد المشبكية قريبة جدًا من بعضها البعض.
  • يكون توصيل النبضات أسرع في المشابك الكهربائية مقارنة بالمشابك الكيميائية.
  • يتحرك التيار الكهربائي مباشرة عبر هذه المشابك.
  • نادرا ما تكون موجودة في البشر.

  • تنقل المشابك الكيميائية المعلومات من خلال مساعدة الإشارات الكيميائية (الناقلات العصبية).
  • يتم فصل أغشية الخلايا العصبية قبل المشبكي وما بعد المشبكي بفجوة تعرف باسم شق متشابك.
  • جميع المشابك الكيميائية لها عضيات مرتبطة بغشاء تسمى الحويصلات المشبكية في المحطات قبل المشبكي.
  • تمتلئ الحويصلات المشبكية الناقلات العصبية.
  • معظم مشابك الجهاز العصبي المركزي ذات طبيعة كيميائية.

نقل العصب المتزامن

  • يؤدي وصول النبضات العصبية إلى المحطة المحورية إلى تحريك الحويصلات المشبكية نحو غشاء البلازما. تندمج الحويصلات مع غشاء البلازما.
  • بعد اندماجها ، يتم إطلاق النواقل العصبية من الخلايا العصبية قبل المشبكي إلى الشق المشبكي.
  • ترتبط الناقلات العصبية التي يتم إطلاقها بمستقبلاتها المحددة الموجودة على غشاء الخلايا العصبية بعد المشبكي.
  • يؤدي ارتباط الناقلات العصبية إلى فتح القنوات الأيونية.
  • يسمح فتح القنوات الأيونية بدخول أيونات معينة. لذلك ، يتم إنشاء إمكانية عمل جديدة في الخلايا العصبية بعد المشبكي.
  • قد يكون العمل المحتمل المتولد مثير أو مثبط.

القوس الانعكاسي

تُعرف الاستجابة المفاجئة للمحفز باسم السلوك الانعكاسي. يحدث لا إرادية ويتطلب إشراك جزء فقط من الجهاز العصبي المركزي. هناك أنواع مختلفة من الخلايا العصبية التي تعمل معًا في عمل انعكاسي

خطوات المشاركة في القوس الانعكاسي:

  1. يكتشف المستقبل الإشارة وينقلها إلى الخلايا العصبية للترحيل. توجد خلايا الترحيل في الحبل الشوكي (جزء من الجهاز العصبي المركزي).
  2. تنقل الخلايا العصبية الصادرة إشارات إلى العضو المستجيب. ينتج العضو المستجيب استجابة.

تسمى العملية الكاملة التي ينطوي عليها الإجراء المنعكس أ القوس الانعكاسي.

بعض الأمثلة على الفعل المنعكس هي:

  • سحب اليدين من دبوس.
  • إبعاد يديك عن جسم ساخن أو نار.
  • الهزات الركبة.

الأمراض

بعض الأمراض التي تحدث بسبب التشوهات في الجهاز العصبي هي:


ينظم النشاط المشبكي استثارة ما قبل المشبكي

ينظم النشاط المشبكي فعالية التشابك وهو مهم في التعلم والتطوير. نوضح هنا أن تطور الإثارة في الخلايا العصبية الحركية قبل المشبكي يتطلب تنشيطًا متشابكًا لخلايا العضلات بعد المشبكي. يوسع الحصار المشبكي من إمكانات العمل ويقلل من إطلاق النار المتكرر للخلايا العصبية قبل المشبكي. تمشيا مع هذه النتائج ، أدى الحصار المشبكي أيضًا إلى تقليل كثافة تيار البوتاسيوم في الخلية قبل المشبكية. منع استخدام نيوروتروفين -3 ، ولكن ليس مغذيات عصبية ذات صلة ، هذه التغييرات. أشارت التسجيلات من بقع الغشاء الجسدي إلى حدوث تعديلات في تيارات البوتاسيوم والصوديوم قبل المشبكي في حجرة نائية غير متشابكة. وهكذا ، فإن الإشارات بعد المشبكية المعتمدة على النشاط تعدل استثارة ما قبل المشبكي ، مما يحتمل أن ينظم الإرسال في جميع نقاط الاشتباك العصبي للخلية قبل المشبكية.


يكشف تقليل SMN الخاص بالعضلات عن مرض مستقل عن الخلايا العصبية الحركية في نماذج ضمور العضلات الشوكي

2 مركز بيولوجيا وأمراض الخلايا العصبية الحركية ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

3 قسم العلوم البيولوجية ، جامعة جنوب كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

4 قسم طب الأعصاب و

5 قسم طب الأطفال ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

6 قسم علم الأدوية وعلم وظائف الأعضاء ، المركز الطبي بجامعة روتشستر ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

مراسلات العنوان مع: Umrao R. Monani، P & ampS، Room 5-422، 630 W. 168th Street، New York، New York 10032، USA. الهاتف: 212.342.5132 البريد الإلكتروني: [email protected]

اعثر على مقالات بواسطة Kim، J. في: JCI | PubMed | الباحث العلمي من Google | />

1 قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية و

2 مركز بيولوجيا وأمراض الخلايا العصبية الحركية ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

3 قسم العلوم البيولوجية ، جامعة جنوب كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

4 قسم طب الأعصاب و

5 قسم طب الأطفال ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

6 قسم علم الأدوية وعلم وظائف الأعضاء ، المركز الطبي بجامعة روتشستر ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

مراسلات العنوان مع: Umrao R. Monani، P & ampS، Room 5-422، 630 W. 168th Street، New York، New York 10032، USA. الهاتف: 212.342.5132 البريد الإلكتروني: [email protected]

1 قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية و

2 مركز بيولوجيا وأمراض الخلايا العصبية الحركية ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

3 قسم العلوم البيولوجية ، جامعة جنوب كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

4 قسم طب الأعصاب و

5 قسم طب الأطفال ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

6 قسم علم الأدوية وعلم وظائف الأعضاء ، المركز الطبي بجامعة روتشستر ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

مراسلات العنوان مع: Umrao R. Monani، P & ampS، Room 5-422، 630 W. 168th Street، New York، New York 10032، USA. الهاتف: 212.342.5132 البريد الإلكتروني: [email protected]

1 قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية و

2 مركز بيولوجيا وأمراض الخلايا العصبية الحركية ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

3 قسم العلوم البيولوجية ، جامعة جنوب كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

4 قسم طب الأعصاب و

5 قسم طب الأطفال ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

6 قسم علم الأدوية وعلم وظائف الأعضاء ، المركز الطبي بجامعة روتشستر ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

مراسلات العنوان مع: Umrao R. Monani، P & ampS، Room 5-422، 630 W. 168th Street، New York، New York 10032، USA. الهاتف: 212.342.5132 البريد الإلكتروني: [email protected]

ابحث عن مقالات بواسطة م. فاليرو في: JCI | PubMed | منحة جوجل

1 قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية و

2 مركز بيولوجيا وأمراض الخلايا العصبية الحركية ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

3 قسم العلوم البيولوجية ، جامعة جنوب كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

4 قسم طب الأعصاب و

5 قسم طب الأطفال ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

6 قسم علم الأدوية وعلم وظائف الأعضاء ، المركز الطبي بجامعة روتشستر ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

مراسلات العنوان مع: Umrao R. Monani، P & ampS، Room 5-422، 630 W. 168th Street، New York، New York 10032، USA. الهاتف: 212.342.5132 البريد الإلكتروني: [email protected]

اعثر على مقالات بواسطة Chiriboga، C. في: JCI | PubMed | منحة جوجل

1 قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية و

2 مركز بيولوجيا وأمراض الخلايا العصبية الحركية ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

3 قسم العلوم البيولوجية ، جامعة جنوب كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

4 قسم طب الأعصاب و

5 قسم طب الأطفال ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

6 قسم علم الأدوية وعلم وظائف الأعضاء ، المركز الطبي بجامعة روتشستر ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

مراسلات العنوان مع: Umrao R. Monani، P & ampS، Room 5-422، 630 W. 168th Street، New York، New York 10032، USA. الهاتف: 212.342.5132 البريد الإلكتروني: [email protected]

اعثر على مقالات بواسطة Wei-Lapierre، L. في: JCI | PubMed | منحة جوجل

1 قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية و

2 مركز بيولوجيا وأمراض الخلايا العصبية الحركية ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

3 قسم العلوم البيولوجية ، جامعة جنوب كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

4 قسم طب الأعصاب و

5 قسم طب الأطفال ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

6 قسم علم الأدوية وعلم وظائف الأعضاء ، المركز الطبي بجامعة روتشستر ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

مراسلات العنوان مع: Umrao R. Monani، P & ampS، Room 5-422، 630 W. 168th Street، New York، New York 10032، USA. الهاتف: 212.342.5132 البريد الإلكتروني: [email protected]

اعثر على مقالات بواسطة Dirksen، R. في: JCI | PubMed | منحة جوجل

1 قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية و

2 مركز بيولوجيا وأمراض الخلايا العصبية الحركية ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

3 قسم العلوم البيولوجية ، جامعة جنوب كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

4 قسم طب الأعصاب و

5 قسم طب الأطفال ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

6 قسم علم الأدوية وعلم وظائف الأعضاء ، المركز الطبي بجامعة روتشستر ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

مراسلات العنوان مع: Umrao R. Monani، P & ampS، Room 5-422، 630 W. 168th Street، New York، New York 10032، USA. الهاتف: 212.342.5132 البريد الإلكتروني: [email protected]

1 قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية و

2 مركز بيولوجيا وأمراض الخلايا العصبية الحركية ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

3 قسم العلوم البيولوجية ، جامعة جنوب كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

4 قسم طب الأعصاب و

5 قسم طب الأطفال ، المركز الطبي بجامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

6 قسم علم الأدوية وعلم وظائف الأعضاء ، المركز الطبي بجامعة روتشستر ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

مراسلات العنوان مع: Umrao R. Monani، P & ampS، Room 5-422، 630 W. 168th Street، New York، New York 10032، USA. الهاتف: 212.342.5132 البريد الإلكتروني: [email protected]

تم النشر في 10 فبراير 2020 - مزيد من المعلومات

تؤدي ندرة بروتين الخلايا العصبية الحركية للبقاء على قيد الحياة إلى اضطراب العصبون الحركي الطفولي المميت ، وضمور العضلات الشوكي (SMA). تعد زيادة البروتين إحدى وسائل علاج ضمور العضلات الشوكي ، وقد أدت مؤخرًا إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على قليل النوكليوتيد المعزز للـ SMN المستخدم حاليًا. على الرغم من ظهور هذا العلاج وغيره من علاجات ضمور العضلات الشوكي ، فمن غير الواضح ما إذا كان الشلل المرتبط بالمرض ناتجًا فقط عن خلل وظيفي في الخلايا العصبية الحركية التي يمكن استهدافها بكفاءة عن طريق التوصيل المقيد للعوامل المعززة لـ SMN إلى الجهاز العصبي ، أو ينبع من عيوب أوسع. من وحدة المحرك ، بحجة امتلاء نظام SMN. لقد بحثنا في التأثيرات التي تسهم في الإصابة بالمرض لانخفاض SMN في عضو طرفي واحد ذي صلة - العضلات الهيكلية - عن طريق استنفاد البروتين بشكل انتقائي في هذا النسيج فقط. وجدنا أن العضلات المحرومة من SMN تضررت بشدة. على الرغم من أن النمط الظاهري للمرض لم يكن واضحًا على الفور ، إلا أن المستويات المنخفضة المستمرة من البروتين أدت في النهاية إلى عيوب في الألياف العضلية ، وتشوهات في الوصلات العصبية العضلية ، وأداء حركي ضعيف ، وموت مبكر. الأهم من ذلك ، استعادة SMN بعد ظهور أمراض العضلات عكس المرض. تقدم نتائجنا الدليل الأكثر إقناعًا حتى الآن على الدور المساهم المباشر للعضلات في ضمور العضلات الشوكي ونجادل بأن العلاج الأمثل للمرض يجب أن يصمم لمعالجة هذا الجانب من الوحدة الحركية المختلة.

طفرات متماثلة اللواقح في بقاء الخلايا العصبية الحركية 1 (SMN1) يؤدي الجين إلى انخفاض مستويات بروتين SMN ويؤدي إلى ظهور المرض العصبي العضلي الطفولي ، ضمور العضلات الشوكي (SMA) (1-3). الخسارة الكاملة لـ SMN مميتة للجنين (4). في الواقع ، المرضى الذين يعانون من SMA يعبرون دائمًا عن البروتين المتبقي من SMN1 دعا Paralogue SMN2. عدم قدرة SMN2 للتعويض عن SMN1 ينبع من انتقال C → T صامت في exon 7 من Paralogue. يغير التغيير الأساسي الفردي الكفاءة التي يتم بها تقسيم exon 7 إلى نصوص SMN مثل ذلك SMN2 يعبر في الغالب عن شكل إسوي SMNΔ7 (5 ، 6). يتم التعبير عن SMNΔ7 مرنا بكثرة. ومع ذلك ، فإن البروتين المقطوع المقابل غير مستقر ومتحلل (2 ، 3 ، 7). لا يزال التعبير عن مستويات منخفضة من البروتين FL-SMN من SMN2 يكفي لضمان التطور الجنيني والولادات الحية. على النقيض من ذلك ، فإن التطور المبكر بعد الولادة ، وخاصة تطور الجهاز العصبي العضلي ، يتأثر بشدة في غياب SMN1. وفقًا لذلك ، فإن معظم المرضى الذين يعانون من ضمور العضلات الشوكي يطورون بسرعة نمطًا ظاهريًا مشلولًا تشمل سماته المميزة فقدان الخلايا العصبية الحركية الشوكية وضمور العضلات القريب (8). بالنظر إلى وظيفة التدبير المنزلي لبروتين SMN في تنظيم سلسلة التضفير (9) ، يظل الفقد الانتقائي للخلايا العصبية الحركية في SMA غير مبرر إلى حد كبير.

على الرغم من أن معظم مرضى SMA يتأثرون بشدة ، إلا أن هناك طيفًا من الأنماط الظاهرية التي تمتد إلى مرض خفيف حقًا. عادة ما يرتبط SMA الخفيف بعدد أكبر من SMN2 نسخ (10 ، 11). في الواقع ، في حالة واحدة ، مريض لديه 8 SMN2 ورد أن النسخ كانت بدون أعراض (12). ارتفاع تأثير تعديل المرض SMN2 نسخ ، وبالتالي بروتين SMN ، تم إثباته لاحقًا مباشرة في الفئران النموذجية خالية من الفئران Smn لكن تأوي 8 نسخ من SMN2 الجين (13). قدم النمط الظاهري WT لهذه الفئران الأساس المنطقي الحقيقي الأول للاستهداف SMN2 لزيادة بروتين SMN كوسيلة للعلاج. تم تعزيز الجهود المبذولة لتنفيذ هذه الاستراتيجية بشكل أكبر عندما تبين أن العنصر التنظيمي ، ISS-N1 ، في اتجاه مجرى النهر SMN2 يمكن استهداف exon 7 بشكل فعال لتعزيز مستويات FL-SMN (14 ، 15). كانت نتيجة علاج الفئران النموذجية SMA المصابة بشدة باستخدام قليل النوكليوتيدات (SSOs) التي استهدفت العنصر التنظيمي رائعة. أعادت الإدارة في الوقت المناسب لمستويات SMN المعززة بالقلة العلاجية الوظيفة العصبية العضلية وتمديد البقاء على قيد الحياة بشكل كبير (16 ، 17). يستخدم SSO لاستهداف ISS-N1 والتعديل SMN2 تم تطوير التعبير الجيني في النهاية إلى عقار SMA العلاجي ، Spinraza (18).

على الرغم من الوعود السريرية لـ Spinraza ، تكثر الأسئلة حول فعاليتها على المدى الطويل (19 ، 20). ينبع القلق الرئيسي من المتطلبات المكانية لبروتين SMN والطريقة التي يتم بها إدارة الدواء حاليًا - داخل القراب. من المتوقع أن تؤدي طريقة العلاج هذه إلى استعادة قوية لبروتين SMN إلى أنسجة الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن الأعضاء المحيطية ، بما في ذلك العضلات ، ستظل محرومة من الآثار المفيدة المحتملة لتركيزات البروتين الطبيعية. يتضح بشكل متزايد أن مستويات SMN المنخفضة لها تأثيرات تخريبية تتجاوز الخلايا العصبية الحركية (21 ، 22). من الأمور ذات الأهمية الخاصة ، بسبب النمط الظاهري لـ SMA العصبي العضلي ، احتمال حدوث مثل هذه التأثيرات في العضلات ومساهمتها في المرض العام. توصلت الدراسات التي أجريت لقياس الدور المساهم للعضلات في ضمور العضلات الشوكي إلى استنتاجات متباينة (23 - 30). هنا ، تعهدنا بحل عدم اليقين بالطريقة الأكثر مباشرة حتى الآن من خلال توصيف عواقب المرض المتمثلة في الحرمان الانتقائي للعضلات من SMN. باستخدام الفئران النموذجية التي تم استنفاد البروتين بشكل انتقائي في العضلات الهيكلية ، ولكن مع ذلك تم تصميمها للتعبير عن نسخة أو نسختين من SMN2 الجين - وهو النمط الجيني SMA النموذجي الحاد - أظهرنا أن انخفاض SMN في هذا النسيج كان ضارًا للغاية. في الحيوانات مع واحد SMN2 نسخة ، كان ظهور المرض سريعًا ، بمتوسط ​​بقاء يقارب P21. في المقابل ، فإن المرض في الحيوانات التي تحمل نسختين من SMN2 ظهر الجين متأخرًا ، ولكنه أدى مع ذلك إلى مجموعة واسعة من الأنماط الظاهرية للعضلات ، بما في ذلك الضرر المورفولوجي للألياف العضلية والوصلات العصبية العضلية (NMJs) ، وضعف الأداء الحركي ، وعدم القدرة على توليد القوة العضلية على النحو الأمثل. أقرب إلى المرض في طفرات مع نسخة واحدة من SMN2، أدت هذه العيوب في النهاية إلى تقصير العمر الافتراضي إلى ما يقرب من 13 شهرًا. على الرغم من هذه العيوب ، أثبتت استعادة SMN للعضلات الهيكلية للفئران التي تظهر عليها الأعراض أنها مفيدة. نستنتج أن العضلات هي موقع خلوي مهم لبروتين SMN وأن التعبير عن البروتين من نسخة أو نسختين من SMN2 الجين غير كافٍ لمنع ظهور نمط ظاهري شديد للخلية الذاتية للعضلات. تشير نتائجنا إلى أن أفضل أنظمة العلاج المعززة لـ SMN لـ SMA ستكون تلك التي تعيد البروتين إلى العضلات الهيكلية.

يؤثر MyoD-iCre على تثبيط قوي خاص بالعضلات لأليل Smn F7. للتحقيق في التأثيرات المستقلة للخلايا لاستنفاد SMN في العضلات الهيكلية ، بدأنا باختبار أي من اثنين من محركات Cre العضلية ، MyoD-iCre و Myf5-Cre (31 ، 32) ، كان أكثر ملاءمة لدراستنا. كل منها يدفع التعبير في الخلايا السلفية للعضلات في وقت مبكر مثل E8 (33-35) ، وقد تم استخدامه لاستنفاد أو استعادة البروتينات المرتبطة بالأمراض في العضلات الهيكلية (27 ، 36). لتحديد خصوصية الأنسجة لخطي Cre ، قمنا بتربية الفئران المعدلة وراثيًا بشكل منفصل للحيوانات التي تأوي محفزًا Smn أليل الحذف (SMN F7 ) تحمل مواقع loxP على جانبي إكسون 7 (37 ، 38). استخدمنا بعد ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل لفحص أي من أنسجة الجينات المزدوجة التي أظهرت دليلًا على إعادة التركيب بوساطة كري. كما هو متوقع ، اكتشفنا وجود الأليل المحذوف (7) في العضلات القريبة والبعيدة لكل من الجينات المزدوجة المعدلة وراثيًا. MyoD-iCre Smn F7 و Myf5-Cre Smn F7.0 الحيوانات (الشكل 1 أ). ومع ذلك ، وبما يتفق مع التقارير الأخرى (27 ، 39) ، في حين أن إعادة تركيب SMN F7 يقتصر الأليل على العضلات الهيكلية لل MyoD-iCre Smn F7 الفئران ، تم اكتشافه أيضًا في أنسجة الجهاز العصبي المركزي Myf5-Cre Smn F7.0 الحيوانات التي وجدتها الأخيرة حالت دون استخدام خط Myf5-Cre لهذه الدراسة. ومع ذلك ، فقد شرعنا في تحديد الكفاءة النسبية التي يتأثر بها كل من محركات Cre SMN F7 تعطيل في العضلات والهيكل العظمي. لقياس مدى قوة كل من السائقين في تحويل ملف SMN F7 أليل إلى المحذوفة SMN Δ7 في الشكل ، استخدمنا Q-PCR على الحمض النووي الجيني من العضلات الهيكلية لـ P7 MyoD-iCre Smn F7 / + و Myf5-Cre Smn F7 / + الحيوانات ، والمستويات النسبية المقدرة للمخلفات SMN F7 أليل في كل مجموعة من المسوخ. الحمض النووي من الأنسجة العضلية لل MyoD-iCre Smn F7 / + تحتوي الفئران على مستويات أقل من SMN F7 أليل من الحمض النووي من عضلة Myf5-Cre Smn F7 / + الفئران (الشكل 1 ب) ، مما يشير إلى أن MyoD-iCre أكثر قوة في تعطيل الأليل floxed.

التعطيل القوي الخاص بالعضلات لـ SMN F7 أليل مع MyoD-iCre. (أ) تحليل PCR للحمض النووي الجيني المأخوذ من أنسجة الفئران التي تأوي SMN F7 أليل وإما MyoD-iCre أو Myf5-Cre. المعطل SMN Δ7 يتم اكتشاف الأليل فقط في عضلات الفئران MyoD-iCre ، بينما يُرى في مواقع خارج الرحم من Myf5-Cre المعدلة وراثيًا. (ب) بيانات Q-PCR التي تقارن كفاءة SMN F7 تعطيل عضلات الفئران مع سائق MyoD-iCre أو Myf5-Cre. **ص & lt 0.01 ، ر اختبار، ن ≥ 4 فئران من كل مجموعة. (ج) منحنيات بقاء كابلان ماير Myf5-Cre Smn F7 / - و MyoD-iCre Smn F7 / - الفئران. ص & lt 0.01 بين المجموعات ، اختبار تسجيل الترتيب.

كوسيلة ثانية غير مباشرة لتحديد كفاءة إعادة التركيب ، أنشأنا تقاطعات لتوليدها MyoD-iCre Smn F7 / - و Myf5-Cre Smn F7 / - المسوخ. في مثل هذه الطفرات ، من المتوقع أن يتم استئصال بروتين SMN تمامًا في خلايا العضلات إذا SMN F7 تم تحويله إلى SMN Δ7 . نظرًا لأن هذا الاجتثاث غير متوافق مع بقاء الخلية وبالتالي الكائن الحي (4) ، فإن الحدوث النسبي للخلية المعنية كري Smn F7 / - الطفرات وشدة المرض في أي حيوانات ناتجة - وفقًا لتقدير العمر - هي مقياس غير مباشر ولكن حساس لكفاءة إعادة التركيب في SMN F7 أليل. بالنظر إلى أقل من التحويل الكامل SMN F7 إلى SMN Δ7 ، كما تم اكتشافه في تجارب PCR الخاصة بنا ، لم نفاجأ بالحصول على أحياء و / أو مولود ميت Smn Δ7 / - المسوخات التي تحمل كل من سائقي Cre. ومع ذلك ، بما يتوافق مع نتائج Q-PCR الخاصة بنا التي تشير إلى أن تأثيرات MyoD-iCre على إعادة التركيب الفائق ، أشار تحليل χ 2 إلى عدد أقل بكثير من المتوقع MyoD-iCre Smn F7 / - المسوخ عند الولادة. فى المقابل، Myf5-Cre Smn F7 / - وُلد المسوخون وزملائهم في القمامة بترددات متوقعة (المواد التكميلية للجدول 1 التكميلية المتاحة عبر الإنترنت مع هذه المقالة https://doi.org/10.1172/JCI131989DS1). علاوة على ذلك ، في حين أن الغلبة (

90٪) من MyoD-iCre Smn F7 / - المسوخ إما ميت أو هلك في P0 ، ما يقرب من 75 ٪ من Myf5-Cre Smn F7 / - لم تعيش الفئران حتى سن الرشد فحسب ، بل تمت تربيتها بقوة فقط 2 MyoD-iCre Smn F7 / - عاشت المسوخات بعد P1 ولم ينج أي منهما بعد P30 (الشكل 1C). بشكل جماعي ، اقترحت البيانات أن الخط المعدّل وراثيًا MyoD-iCre يشكل محركًا أكثر قوة من نظيره Myf5-Cre ، وبالتالي فهو اختيار أكثر حكمة للكاشف لتقييم التأثيرات المستقلة للخلية لتعبير SMN المنخفض في العضلات. في تأكيد نهائي لاختيارنا لبرنامج MyoD-iCre الذي يمكن من خلاله استنفاد SMN في العضلات ، قمنا بتوليد الفئران ROSA-YFP (40) مع أو بدون التحوير Cre. كما هو متوقع ، اكتشفنا إشارة YFP قوية في غالبية ألياف العضلات MyoD-iCre ROSA-YFP، لكن لا ROSA-YFP الحيوانات (الشكل التكميلي 1 أ). لم يتم الكشف عن مضان YFP في أنسجة الحبل الشوكي أو الدماغ أو الكبد لفئران MyoD-iCre ROSA-YFP (الشكل التكميلي 1B). وفقًا لذلك ، أجريت الدراسات المتبقية باستخدام MyoD-iCre خط.

لوحظ مرض شديد وسريع الظهور في طفرات SMN2 أحادية النسخة المستنفدة من SMN في العضلات. الاستئصال الكامل للأنسجة من SMN يعطل التكاثر الحيوي لـ snRNP وبالتالي فهو قاتل (4). بالإضافة إلى ذلك ، يفشل الاستئصال الكامل لـ SMN في نموذج SMA البشري بأمانة ، حيث يتم اشتقاق المستويات المتبقية من البروتين من 1 أو أكثر SMN2 نسخ. وفقًا لذلك ، لتوليد طفرات تعبر عن SMN المتبقي فقط في العضلات الهيكلية ، قمنا بتربية الفئران الحاملة SMA متماثلة اللواقح من أجل SMN2 التحوير (13) ومتغاير الزيجوت لبرنامج MyoD-iCre (MyoD-iCre SMN2 + / + Smn +/– ) مع Smn F7 / F7 الحيوانات. MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - تم الحصول على المسوخ بالتردد المتوقع بنسبة 12.5 ٪ ، لكنهم أظهروا نمطًا ظاهريًا صريحًا ، وفقًا لتقييم وزن الجسم ، في غضون 24 ساعة من الولادة (الشكل 2 ، A و B). أظهرت المسوخ أيضًا حركة منخفضة ، وفشلت في اختبار أداء المحرك (الشكل 2C والفيديو التكميلي 1) ، وكانت تحتضر بنحو P14. تم العثور عليهم في كثير من الأحيان هزالا ، وأشعث ، وتظهر عليها علامات التنفس بضيق (فيديو تكميلي 2). تم تقصير متوسط ​​البقاء على قيد الحياة إلى حوالي P21 (الشكل 2D). كما هو متوقع ، كانت مستويات بروتين SMN في أنسجة العضلات الهيكلية للطفرات P7 أقل بكثير وأقل من نصف مستويات البروتين في الفئران الحاملة SMA من خط شائع الاستخدام (41) من المسوخات الشديدة (النوع 1) (الشكل 2 ، E و F). نستنتج أن المسوخات عبرت عن حوالي 25 ٪ من بروتين WT SMN وأن النمط الظاهري للمرض الصريح الذي لوحظ كان بالفعل نتيجة لتقليل البروتين بشكل انتقائي في الأنسجة العضلية للحيوانات.

مرض شديد ، مبكر الظهور في MyoD-iCre Smn F7 / - المسوخ تحمل 1 SMN2 ينسخ. (أ) رسم بياني يصور انخفاض وزن المسوخ ر اختبار، ن ≥ 10 فئران من كل مجموعة. (ب) زميل نموذجي متحولة ومسيطر عليه يعكس الحجم الأصغر للأول. (ج) أداء المسوخ ضعيف في اختبار رد الفعل التقويمي ر اختبار، ن ≥ 10 فئران من كل مجموعة. (دمنحنيات بقاء كابلان ماير تصور انخفاض عمر المسوخ. ص & lt 0.0001 بين المجموعات ، اختبار ترتيب السجل ، ن = 25 فأراً من كل مجموعة. (ه) أظهرت البقعة الغربية انخفاضًا في بروتين SMN في العضلات الهيكلية لـ a MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - متحولة. (F) مستويات SMN النسبية في العضلات الهيكلية للطفرات والضوابط ذات الصلة أحادية الاتجاه ANOVA ، ن ≥ 3 فئران من كل مجموعة. (جييقل حجم الأطراف وألياف عضلات الجهاز التنفسي بشكل ملحوظ في طفرات P15 ر اختبار، ن ≥ 600 ألياف من ن = 3 فئران من كل مجموعة. (ح) أقسام عرضية ملطخة بـ H & ampE للعضلات الوربية من متحولة P15 والتحكم تظهر فقدان الأنسجة ، والألياف ذات النوى المركزية (الأسهم) في السابق. شريط النطاق: 20 ميكرومتر. القياس الكمي لـ (أنا) النوى المركزية و (ي) أعداد الألياف في العضلات الوربية للطفرات والضوابط P15. ر اختبار، ن = 3-5 فئران من كل مجموعة. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 لجميع التحليلات.

بالنظر إلى النمط الظاهري الحاد وسريع الظهور والتأثيرات المعروفة للاستنفاد الجهازي لبروتين SMN على الوحدة الحركية ، قمنا بعد ذلك بفحص MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - المسوخ لإثبات علم الأمراض العصبية والعضلية. قمنا أولاً بتقييم مورفولوجيا الألياف العضلية في العضلات التمثيلية البعيدة (عضلات الساق) والدانية (ثلاثية الرؤوس) والجهاز التنفسي (الوربي). تم تقليل مناطق الليف العضلي في المسوخ في جميع العضلات الثلاثة في عمر 2 إلى 3 أسابيع (الشكل 2G والشكل التكميلي 2 ، A-C). أظهر تحليل أكثر تفصيلاً للعضلات الوربية في P15 أن هذا الشذوذ كان مصحوبًا بعلم أمراض تنكسية مميزة تتميز بمناطق خالية من ألياف العضلات وغالبًا ما تؤوي تسلل من الخلايا الأحادية أو الضامة ، وأعداد كبيرة من الألياف العضلية التي تحتوي على نوى مركزية غير طبيعية (الشكل 2 ، ح وأنا). أشار القياس الكمي للألياف العضلية إلى أن ما يقرب من ثلث الخلايا في هذه العضلة التنفسية قد فقدت (الشكل 2J) ، وهو أصل محتمل لخلل وظيفي شديد في العضلات ، وصعوبة في التنفس (انظر أيضًا الفيديو التكميلي 2) ، والموت النهائي للطفرة الحيوانات. ومن المثير للاهتمام ، أن هذه العيوب كانت أقل أهمية في P7 ، ولكنها مع ذلك توحي بوجود تنكس عضلي بعد الولادة في MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - المسوخ (الشكل التكميلي 2 ، D-F). علاوة على ذلك ، اقتصرت التشوهات على عضلات الهيكل العظمي لأن فحص عضلة القلب ، الذي لم يتم التعبير فيه عن MyoD-iCre ، لم يظهر مختلفًا في المسوخ والضوابط على النحو الذي تحدده منطقة الألياف العضلية وسماكة جدار البطين الأيسر (الشكل التكميلي) 2 ، G-I).

يتم تعريف SMA بفقدان الخلايا العصبية الحركية. إن استنفاد SMN بشكل انتقائي في هذه الخلايا كافٍ لتحفيز خسارتها (42) ، ولكن لم يتم فحص دور العضلات المريضة في عملية التنكس العصبي. لذلك قمنا بتحديد وتوصيف سوما الخلايا العصبية الحركية في منطقتنا MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - المسوخ. أشارت أعداد خلايا الجسم إلى أنه على الرغم من انخفاض SMN في العضلات ، لم يكن هناك فقدان للخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري (الشكل 3 ، A و B). علاوة على ذلك ، لم نجد أي دليل على انخفاض تلطيخ SMN في سوما من الخلايا العصبية الحركية ولا انخفاض في عدد الأحجار الكريمة ، البؤر النووية الفرعية التي يتم فيها توطين البروتين (الشكل 3 ، C-E ، والمرجع 43).

عيوب NMJ في MyoD-iCre Smn F7 / - المسوخ مع نسخة واحدة من SMN2 الجين. (أ) المقاطع المستعرضة للحبل الشوكي القطني (L1 – L3) من متحولة P21 والسيطرة عليها. شريط النطاق: 25 ميكرومتر. النتائج الكمية لـ (ب) تعداد الخلايا العصبية الحركية الشوكية (L1 – L3، T7 – T10، C5 – C6) (ج) شدة إشارة SMN في الخلايا العصبية الحركية (د) جوهرة نووية في الخلايا العصبية الحركية للفئران. NS: ص & GT 0.05 ، ر اختبار، ن & gt 150 خلية و ن = 4 فئران من كل مجموعة. (ه) خلية عصبية حركية قطنية من متحولة تظهر إشارة SMN قوية ووجود جواهر نووية (أسهم). شريط النطاق: 8 ميكرومتر. (F) NMJs في العضلات الوربية للفئران المتحولة والسيطرة. يشتمل على صور عالية التكبير للوحات نهائية نموذجية من كل حيوان توضح انخفاض التعقيد ووجود دوالي نهائية محتقنة بـ NF (الأسهم) في المسوخ. أشرطة النطاق: 50 ميكرومتر و 15 ميكرومتر ، على التوالي. الرسوم البيانية لـ (جي) تعقيد NMJ ، (ح) حجم اللوحة النهائية ، و (أنا) مورفولوجيا NMJ في طفرات وضوابط P21. **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، ر اختبار، ن ≥ 100 NMJs من ن ≥ 3 فئران من كل مجموعة. (يأظهر تعبير بروتين الأتروجين في المسوخ والضوابط تغيرًا طفيفًا في علامات إزالة التعصيب هذه. NS: ص & GT 0.05 ، ر اختبار، ن = 3 فئران.

على الرغم من أن المرض الذي ينشأ في العضلات قد لا يؤثر على الخلايا العصبية الحركية القريبة ، فإن الاعتلال العضلي المزمن يعطل الحيز بعد المشبكي ويؤدي في النهاية إلى الإضرار بمورفولوجيا ووظيفة المشبك العصبي العضلي (44). علاوة على ذلك ، من غير الواضح ما إذا كان انخفاض SMN في العضلات يساهم في أو يؤدي إلى تفاقم عيوب NMJ التي لوحظت في SMA. وفقًا لذلك ، أجرينا تحليلًا مورفولوجيًا دقيقًا للـ NMJs في طفراتنا. وجدنا أن مجموعات مستقبلات الأسيتيل كولين (AChR) في جميع العضلات الثلاثة للطفرات P17 – P21 قد اكتسبت البنية النموذجية الشبيهة بالبريتزل للـ NMJs الناضجة (الشكل 3F). ومع ذلك ، فإن التقييم الدقيق لتعقيداتها النسبية استنادًا إلى عدد الثقوب في المجموعات أشار إلى أنه على الرغم من أن الصفائح الطرفية في عضلة المعدة والعضلة ثلاثية الرؤوس لم تكن مختلفة بين المسوخ والضوابط ، إلا أن تلك الخاصة بالضلاع كانت أقل تفصيلاً في المسوخ (الشكل 3G). علاوة على ذلك ، تمشيا مع الحجم الأصغر للعضلات الطافرة ، تم العثور على المجموعات في جميع العضلات الثلاثة لتكون ضآلة نسبيًا (الشكل 3 و F و H). كشف فحص النهايات العصبية العضلية في الفئران الطافرة عن زيادة في الدوالي المنتفخة ببروتين الخيوط العصبية (NF) ، وهي ميزة تذكرنا بالعيوب التي لوحظت في الفئران النموذجية التي تعبر عن بروتين SMN منخفض بشكل منهجي (المراجع 45-48 والشكل 3I). ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن دليل على إزالة التعصيب في أي من الدراسات الكيميائية الهيستولوجية المناعية لـ NMJ أو عن طريق تحديد كمية atrogenes ، atrogin-1 و MuRF1 ، والتي يتم تنظيمها بشكل روتيني في العضلات منزوعة العصب (الشكل 3J). ومع ذلك ، فإن العيوب الملحوظة في تركيبة مع أمراض العضلات والنمط الظاهري الصريح لـ MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - المسوخ يقودنا إلى استنتاجين.أولاً ، تشير النتائج إلى أن انخفاض SMN في العضلات الهيكلية كافٍ لإحداث المرض. ثانيًا ، أثبتوا أن علم الأمراض الذي ينشأ في العضلات قادر على إحداث تشوهات في الأعصاب ، على الأرجح بطريقة رجعية. وفقًا لذلك ، تعمل ندرة SMN في العضلات بأسلوب مستقل عن الخلية وغير مستقل للخلايا للمساهمة في العيوب الخلوية والنمط الظاهري لـ SMA الكلي.

يتم الكشف عن اعتلال عضلي بعد إصابة العضلات في طفرات شابة طبيعية المظهر تحمل نسختين من SMN2. SMA في المرضى وفئران نموذجية تؤوي واحدًا SMN2 تشكل النسخة أشد أشكال المرض (النوع 0) الممكنة وغالباً ما تؤدي إلى الوفاة في الرحم (49 - 51). وبالتالي ، فإن انتشار هذا الشكل من المرض منخفض (52) ، وشدة النمط الظاهري في MyoD-iCre Smn F7 / - المسوخ hemizygous ل SMN2 ربما لا يكون التحوير غير متوقع. لتحديد تأثيرات التعبير عن SMN في عضلة الطفرات من نسختين من الجين ، وهو وضع أكثر شيوعًا بين مرضى SMA البشريين ، قمنا بتوليد فئران متماثلة اللواقح من أجل SMN2 (MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - ).

على النقيض من النمط الظاهري الذي لا لبس فيه وسريع الظهور الذي تم تمييزه في طفرات MyoD-iCre التي تؤوي واحدًا SMN2 نسخة ، اكتشفنا فقط تشوهات طفيفة في الفئران الصغيرة البالغة التي تعبر عن نسختين من الجين. وهكذا ، على سبيل المثال ، على الرغم من أن المسوخات الأخيرة أظهرت انخفاضًا طفيفًا في وزن الجسم في الأسبوع الثاني بعد الولادة مقارنة بعناصر التحكم التي تفتقر إلى برنامج تشغيل Cre (الشكل 4 أ) ، فإن منحنيات النمو الإجمالية بين P0 و P21 أظهرت مسارًا تصاعديًا واضحًا (الشكل التكميلي) 3 أ). علاوة على ذلك ، لم تظهر المسوخ أي ضعف في القدرة على تقويم الأطفال حديثي الولادة (الشكل التكميلي 3 ب) أو على الروتارود في عمر 6 أسابيع (الشكل التكميلي 3 ج) ، ولم تظهر أي انخفاض في العمر بين الولادة و P60 (16 من 16 طفرات على قيد الحياة 18 من 18 ضوابط على قيد الحياة). ظلت تركيزات SMN في العضلات الهيكلية للطفرات البالغة من العمر شهرًا منخفضة ، عند حوالي 21 ٪ من مستويات WT (الشكل 4 و B و C) لم يتم تقليل مستويات البروتين في الأنسجة الأخرى.

القليل من الأمراض الخلوية عند الشباب MyoD-iCre Smn F7 / - المسوخ تحمل 2 SMN2 نسخ. (أ) مقارنات بين أوزان الجسم للضوابط والطفرات التي تؤوي 1 أو 2 SMN2 نسخ أحادية الاتجاه ANOVA ، ن ≥ 10 فئران من كل مجموعة. (ب) تظهر نتائج اللطخة الغربية استنفادًا انتقائيًا لبروتين SMN في العضلات الهيكلية لـ P30 MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - متحولة. (ج) المستويات الكمية من بروتين SMN في الفئران المتحولة والسيطرة P30 ر اختبار، ن ≥ 3 فئران من كل مجموعة. (د) لم تكشف المقاطع المستعرضة من عضلات الساق الملطخة H & ampE من متحولة P30 والتحكم عن الاختلافات المورفولوجية الرئيسية بين الاثنين. شريط النطاق: 25 ميكرومتر. الرسوم البيانية لـ (ه) مناطق الألياف العضلية ، (F) ألياف تحتوي على نوى مركزية ، و (جي) مستويات الكرياتين كيناز (CK) في المصل في طفرات وضوابط الشباب. NS: ص & GT 0.05 ، ر اختبار، ن & gt 150 ألياف من ن = 3 فئران من كل مجموعة للحصول على نتائج في ه و F NS: ص & GT 0.05 ، ر اختبار، ن = 10 فئران لقيم CK. (ح) NMJs من العضلة ثلاثية الرؤوس من متحولة P30 وعناصر تحكم تُظهر مورفولوجيا مماثلة لمقصورات ما قبل وما بعد المشبكي في الفئران 2. شريط النطاق: 30 ميكرومتر. (أنا) رسم بياني لمدى تعصيب NMJ في طفرات وضوابط P30. (ي) رسم بياني يصور تعقيد اللوحة النهائية في طفرات P30 والتحكم في القمامة. NS: ص & gt 0.05 ، اختبار فيشر الدقيق ، ن ≥ 300 NMJs من ن = 3 فئران من كل مجموعة من الفئران لتحليلها في أنا و ي. **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001.

إعطاء أدلة على علم الأمراض العصبية والعضلية في نسخة واحدة SMN2 طافرات MyoD-iCre ، شرعنا في فحص الوحدة الحركية العضلية والبعيدة للطفرات الصغيرة البالغة التي تؤوي نسختين من الجين البشري المتحور. لم يلاحظ أي شذوذ عضلي جسيم. على الرغم من الوزن الأصغر إلى حد ما للطفرات ، فإن الألياف العضلية في العضلات التي تم فحصها كانت مكافئة إلى حد كبير في الحجم لتلك الموجودة في عناصر التحكم (الشكل 4 ، D و E) ، بدت طبيعية شكليًا ، ولم تعرض علم الأمراض في شكل نوى عضلية موضعية بشكل غير طبيعي في عضلات الساق والعضلات الوربية. كانت العضلة ثلاثية الرؤوس الأكثر ضعفًا في المسوخ تحتوي على عدد أكبر من النوى المركزية مقارنةً بالضوابط ، ولكن هذا يمثل أقل من 1 ٪ من إجمالي الألياف العضلية التي تم فحصها (الشكل 4F والشكل التكميلي 4 ، A –E). تمشيا مع عدم وجود أمراض عضلية رئيسية ، لم نجد ارتفاعًا في الكرياتين كيناز العضلي (CK) في مصل الحيوانات الطافرة (الشكل 4G) أو تلف غمد الليف العضلي الذي تم تقييمه من خلال فحص ما إذا كان المصل IgG قد تغلغل في الألياف العضلية (الشكل التكميلي) 4F). كشفت تحليلات مستويات التعبير عن جينات السلسلة الثقيلة للميوسين والعوامل العضلية Pax7 و MyoD و Myf6 و myogenin ، وهي علامات معروفة لحالة نضج الألياف العضلية في طفرات P7 ، عن عدم وجود تغيير كبير في الحيوانات التي تأوي 1 أو 2 SMN2 نسخ (الشكل التكميلي 5 ، A-L) ، على الرغم من أن تعبير MyoD اتجه إلى أعلى ، لا سيما في أشد طفرات SMA Δ7 ، والتي كانت بمثابة مجموعة واحدة من عناصر التحكم. كانت تغييرات التعبير أيضًا غير قابلة للكشف في طفرات P14 (الشكل التكميلي 5 ، M-Q) ، مما يشير إلى أن استنفاد SMN الانتقائي في العضلات الهيكلية للكائن السليم كما هو مؤثر هنا لا يعطل تكوين العضل أو تمايز العضلات.

قمنا بعد ذلك بالتحقيق في مورفولوجيا NMJ. على عكس العيوب اللافتة للنظر التي لوحظت في المسوخ hemizygous ل SMN2 التحوير ، NMJs في عضلات ثلاثية الرؤوس من طفرات عمرها شهر واحد متماثلة اللواقح من أجل SMN2 بدت طبيعية نسبيًا (الشكل 4 ح). على وجه التحديد ، لا توجد فروق في حجم اللوحة النهائية (المساحة بالميكرومتر 2 - عناصر التحكم: 218.1 ± 3.9 ، المسوخ: 225.3 ± 3.7 ، ن ≥ 150 NMJs من ن = 3 فئران من كل مجموعة ، ص = 0.183, ر اختبار) ، التعصيب (الشكل 4I) ، تعقيد اللوح النهائي (الشكل 4J) ، أو حدوث دوالي NF (عدد الصفائح النهائية ذات التورمات المحورية - الضوابط: 7.87 ± 0.69 ، المسوخ: 5.25 ± 1.56 ، ن ≥ 150 NMJs من ن = 3 فئران من كل مجموعة ، ص = 0.2, ر اختبار). كوسيلة أكثر حساسية لاكتشاف العيوب المشبكية المحتملة ، قمنا أيضًا بفحص الحالة الوظيفية لـ NMJs. كان تردد إمكانات اللوحة النهائية المصغرة (MEPP) ، وسعة MEPP ، وإمكانات اللوحة النهائية المستحثة (EPPs) ، والمحتوى الكمي كلها طبيعية في عمر 4 إلى 5 أسابيع MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - المسوخ (الشكل التكميلي 6 ، أ-د). تمشيا مع هذه النتائج ، كانت مساحة المقطع العرضي والعدد المتوسط ​​للألياف المحددة كميا في عضلات الأصابع الطويلة الطافرة (EDL) مكافئة لتلك الخاصة بعناصر التحكم (الشكل التكميلي 6 و E و F). بشكل جماعي ، أظهرت هذه النتائج أن الشاب البالغ MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - كانت المسوخات طبيعية ظاهريًا ولم تظهر أدلة رئيسية على أمراض العضلات أو NMJ.

النظر في عدم وجود عيوب كبيرة في الشباب MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - المسوخ ، استفسرنا عما إذا كانت الإصابة الحادة للعضلة قد تكشف عن علم الأمراض الأساسي. وفقًا لذلك ، قمنا بحقن عضلة الساق للطفرات P21 والتحكم بعامل نخر عضلي ، وهو سم القلب (CTX) ، وفحصنا قدرة العضلات على التجدد. بعد ستة أيام من التعرض لـ CTX ، أظهرت الألياف العضلية من المسوخ والضوابط انحطاطًا موحدًا يتميز بالعضلات النخرية ودقيقة عديدة لتجديد الألياف العضلية ذات النوى المركزية (الشكل 5 أ). بعد أسبوعين من الإصابة ، كان تجديد العضلات أكثر وضوحًا. ومع ذلك ، كشف القياس الكمي للنواة المركزية مقابل النوى الموجودة في المحيط في الألياف العضلية الجديدة أن العضلات الطافرة لم تتميز فقط بأعداد أكبر من الألياف التي لا تزال تؤوي نوى مركزية ، ولكن أيضًا الخلايا التي تحتوي على العديد من هذه النوى (الشكل 5 ، أ و ب). أظهر فحص الحيوانات بعد 26 يومًا من الحقن أن العضلات التي تعبر عن المستويات الطبيعية من SMN قد تعافت تمامًا ، مع أقل من 2 ٪ من الألياف لا تزال تؤوي نوى مركزية. على النقيض من ذلك ، استمرت العضلات المستنفدة في البروتين في إظهار دليل على التجدد ما يقرب من نصف الألياف في هذه العضلات كانت لا تزال غير ناضجة ، وتحتوي على نواة واحدة أو أكثر في موقع مركزي ، وتظهر تباينًا كبيرًا في الحجم ، وفي حالات قليلة لا تزال تتدهور (الشكل 5 ، أ و ج). تشير هذه النتائج إلى أنه على الرغم من عدم وجود اعتلال عضلي واضح عند الشباب MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - المسوخ ، وهو مرض أساسي ظهر في ظل ظروف إصابة العضلات ، مما أضر بشدة بقدرة الحيوانات على إصلاح العضلات التالفة.

تكشف الإصابة الحادة عن أمراض العضلات لدى الشباب MyoD-iCre Smn F7 / - طفرات تحمل نسختين من SMN2 الجين. (أتم فحص المقاطع المستعرضة الملطخة بـ H & ampE من الفئران المتحولة والسيطرة بعد 6 و 14 و 26 يومًا من الإصابة بـ CTX. لاحظ استمرار علم أمراض العضلات المتمثل في الألياف الضخامية (رؤوس الأسهم الصلبة) والعديد من النوى المركزية (الأسهم) والألياف المتدهورة (رؤوس الأسهم المفتوحة) في اليوم 26 في المسوخ. أشرطة النطاق: 25 ميكرومتر (الألواح العلوية) و 15 ميكرومتر (الألواح الوسطى) و 30 ميكرومتر (الألواح السفلية). تصور الرسوم البيانية نسبة الألياف ذات النوى المركزية أو المحيطية الموجودة في المسوخ والضوابط (ب) 14 يومًا و (ج) 26 يوم بعد الاصابة. ***ص & lt 0.001 ، ر اختبار، ن ≥ 400 ألياف من ن ≥ 4 فئران من كل تركيب وراثي.

لوحظ الخلل الوظيفي الحركي المتأخر والوفيات المبكرة في طفرات SMN2 المكونة من نسختين والتي تم استنفاذها بشكل انتقائي من SMN في أنسجة العضلات والهيكل العظمي. على الرغم من أننا فشلنا في الكشف عن تشوهات العضلات الرئيسية أو المرض العلني عند الشباب MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - المسوخ ، نتيجة تجاربنا التي تنطوي على CTX والكشف عن أن الضرر الحاد يكشف عن علم أمراض أساسي تنبأ بأن هذا الخلل الوظيفي سيظهر في النهاية في شكل مرض متأخر الظهور. وفقًا لذلك ، واصلنا مراقبة النسخة 2 SMN2 المسوخ ، إجراء مجموعة واسعة من التحليلات الثانية بين 6 و 7 أشهر من العمر. في فحوصات الروتارود ، فشلنا في اكتشاف التغييرات الملحوظة في المسوخ في عمر 8 و 10 و 16 أسبوعًا ، على الرغم من وجود ميل للطفرات إلى أداء أقل من الضوابط. ومع ذلك ، بحلول 18 أسبوعًا من العمر ، أصبح التناقض كبيرًا وظل كذلك عندما تم اختبار الحيوانات في 20 و 28 أسبوعًا ، على التوالي (الشكل 6 أ). كانت هذه الاختلافات أكثر وضوحًا عندما تم تصنيف النتائج وفقًا للجنس واقترحت أنه على الرغم من أن أداء المسوخ بشكل عام أقل جودة من الضوابط ، فإن إناث الحيوانات تتأثر بدرجة أكبر من الذكور على الروتارود (الشكل التكميلي 7 ، A و B).

تأخر ظهور المرض في MyoD-iCre Smn F7 / - المسوخ تحمل 2 SMN2 نسخ. نتائج (أ) روتارود و (بأظهرت اختبارات قوة القبضة التأثيرات المتأخرة المسببة للأمراض لاستنفاد SMN بشكل انتقائي في العضلات الهيكلية ر اختبار، ن ≥ 25 فأرًا من كل تركيب وراثي. (جمنحنيات بقاء كابلان ماير تصور انخفاض عمر المسوخ. ص & lt 0.0001 بين المسوخ ومجموعتين من عناصر التحكم ص & gt 0.05 بين مجموعتي عناصر التحكم واختبار ترتيب السجل. (د) توضح المقاطع المستعرضة من 6 إلى 7 أشهر من عضلات الساق المتحولة والسيطرة وجود علم الأمراض في المسوخ. يتم عرض الألياف الضخامية (الأسهم الصلبة) ، والألياف المتجددة مع القاعدة السيتوبلازمية (رأس السهم المفتوح) ، والألياف المنقسمة (رؤوس الأسهم الصلبة) ، أو الألياف المتدهورة (الأسهم المفتوحة). شريط النطاق: 25 ميكرومتر. تمثل الرسوم البيانية (ه) أحجام الألياف و (F) أعداد الألياف في العضلات من طفرات وضوابط عمرها 7 أشهر ر اختبار، ن ≥ 500 ألياف من ن ≥ 3 فئران من كل تركيب وراثي. (جي) تقديرات النوى المركزية في العضلات للطفرات أو الضوابط البالغة من العمر 7 أشهر ر اختبار، ن ≥ 1000 ألياف من ن ≥ 3 فئران من كل تركيب وراثي. (ح) مقاطع عرضية من عضلات الساق من الفئران المتحولة والسيطرة البالغة من العمر 7 أشهر والتي تصور الألياف العضلية التالفة إيجابية IgG (الأسهم). شريط النطاق: 50 ميكرومتر. (أنا) القياس الكمي للألياف التالفة من التجربة السابقة ر اختبار، ن ≥ 300 ألياف من ن ≥ 3 فئران من كل تركيب وراثي. (ي) النتائج الكمية لقيم CK في المصل من الفئران المتحولة والسيطرة البالغة من العمر 7 أشهر ر اختبار، ن ≥ 8 فئران من كل مجموعة. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001.

في اختبار قوة القبضة ، أصبح الخلل الوظيفي واضحًا حتى قبل ذلك. كان أداء المسوخ دون المستوى في جميع النقاط الزمنية التي تم فحصها (الشكل 6 ب). علاوة على ذلك ، ظهر كلا الجنسين متأثرين بالتساوي (الشكل التكميلي 7 و C و D). أخيرًا ، أظهر تقييم العمر الافتراضي أن انخفاض SMN في العضلات الهيكلية تسبب أيضًا في وفيات مبكرة في نسختين SMN2 المسوخ. في حين أن ما يقرب من 95٪ من السيطرة (SMN2 + / + Smn F7 / - ) ظلت الحيوانات على قيد الحياة في عمر 18 شهرًا تقريبًا ، وكان 14 ٪ فقط من الطفرات لا تزال قابلة للحياة في هذا العمر (الشكل 6 ج). كما هو متوقع ، لم نجد فرقًا بين SMN2 + / + Smn F7 / - ضوابط ومجموعة ثانية من عناصر التحكم التي كانت تؤوي برنامج تشغيل MyoD-iCre ، ولكنها حملت أيضًا 1 WT SMN allele (MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / + ) ، وبالتالي ضمان مستويات متغايرة من البروتين في العضلات (الشكل 6C). بالاقتران مع التحليل السلوكي لطفرات الشباب البالغين ، تشير هذه النتائج إلى استمرار انخفاض التعبير SMN في العضلات الهيكلية من 2 SMN2 كانت النسخ كافية لإثارة النمط الظاهري للمرض ، وإن كان ذلك في شكل اختلال وظيفي متأخر الظهور.

اعتلال عضلي هو نتيجة متأخرة الظهور ومستقلة خلويًا لانخفاض SMN في العضلات الهيكلية. النظر في دليل المرض العلني لدى كبار السن MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - المسوخ ، رأينا إعادة تقييم علم الأمراض العصبية العضلية المحتملة في الحيوانات على أنها مهمة بشكل خاص. وفقًا لذلك ، بدأنا تحليلنا مرة أخرى من خلال فحص مورفولوجيا العضلات. على عكس الملاحظات في طفرات الشباب ، كانت نتائج تحليلات الفئران الأكبر سنًا (من 6 إلى 7 أشهر) مذهلة. في جميع العضلات الثلاثة التي تم فحصها ، وجدنا دليلًا واضحًا على علم الأمراض الذي يتميز بالألياف النخرية التي اخترقتها الخلايا الالتهابية ، وتجديد الألياف التي تظهر الأسيمة السيتوبلازمية ، والألياف الزاويّة التي يبدو أنها نشأت من انقسام ألياف أكبر ، والوجود العرضي لمجموعات من الضخامي. ألياف داخل ما يبدو أنه كان ذات مرة اندوميسيوم فردي (الشكل 6 د والشكل التكميلي 7 و E و F). تم أيضًا إثبات أدلة على علم الأمراض في العضلات الطافرة في شكل زيادة النقاط التي تلطخ بشكل إيجابي للعلامة الدبقية الصغيرة / الضامة ، Iba-1 (الشكل التكميلي 7G). ثانيًا ، وجدنا أن الألياف العضلية الطافرة لم تكن أصغر بشكل عام فقط (الشكل 6E والشكل التكميلي 8 ، A-C) ، ولكن أيضًا بحجم غير متسق. ثالثًا ، وجدنا أن العضلات الطافرة تحتوي على ألياف أقل بشكل ملحوظ (الشكل 6F) ، والعديد منها يحتوي على نواة واحدة أو أكثر في موقع مركزي (الشكل 6G). من الواضح أن فقدان الألياف العضلية حدث متأخر ، حيث وجدنا أعدادًا مكافئة من الألياف في العضلات المتحولة والسيطرة في عمر شهر واحد (الشكل 6F). أخيرًا ، أظهر تقييم الحجم الإجمالي للعضلة المعدية أن وزن العضلة الطافرة أقل بكثير من عضلة التحكم (الوزن بالمجم: الضوابط - 126 ± 7.3 ، المسوخ - 93.08 ± 4.5 ، ص & lt 0.01 ، ن ≥ 7 فئران ، ر اختبار). كان علم الأمراض في العضلة المثنية الضعيفة (FDB) أكثر شدة. في المسوخ ، تم العثور على بقايا العضلات فقط ، مما يشير إلى فقدان أو انحطاط شبه كامل (الشكل التكميلي 8 د).

نظرا للعملية التنكسية العضلية المستمرة لدى كبار السن MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - وكوسيلة ثانية لتأكيد علم الأمراض ، قمنا بتقييم سلامة الليف العضلي الفردي عن طريق قياس الاختراق بواسطة مستويات IgG في الدم ومستويات CK في الدم. تمشيا مع علم الأمراض المرصود ، وعلى عكس ما لوحظ في الحيوانات الصغيرة ، احتوى عدد أكبر بكثير من الألياف الطافرة على IgG (الشكل 6 ، H و I) ، على غرار ما لوحظ في الحثل العضلي ، وإن كان بدرجة أقل (تكميلي) الشكل 4 و). كما تم رفع مستويات متحولة CK (الشكل 6J). ليس من المستغرب ، أن أمراض العضلات التي تتميز بارتفاع CK في المصل والألياف العضلية الأصغر مع زيادة النوى المركزية لوحظت أيضًا في المسوخ الأقدم الذي استنفد بشكل انتقائي SMN في الأنابيب العضلية المنصهرة - عن طريق محرك HSA-Cre (24) - بدلاً من أسلاف العضلات (الشكل التكميلي) 9 ، أ-د). للتأكد من أهمية هذه النتائج في الفئران النموذجية لدينا لأمراض العضلات المحتملة في SMA البشري ، قمنا بفحص قيم CK في مصل الدم في عينة من 6 مرضى ، تم علاجهم جميعًا لمدة عام على الأقل باستخدام Spinraza. في كل حالة ، تم رفع قيم CK وتجاوز الحد الأقصى للقيم العادية بنسبة 15٪ إلى 500٪ (الجدول 1). بشكل جماعي ، تعزز هذه النتائج ملاحظات المرض العلني لدى كبار السن MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - المسوخات ، توفر أساسًا خلويًا للخلل الوظيفي الحركي والوفيات المبكرة ، وتعزز فكرة أن العضلات الهيكلية هي موقع خلوي مهم لبروتين SMN. نقص البروتين حتى في وجود 2 SMN2 نسخ ، ضار للعضلات مع تقدم الكائن الحي.

زيادة قيم كرياتين كيناز عضلات المصل (CK-MM) في مرضى SMA المعالجين

العيوب الوظيفية والهيكلية للـ NMJs هي عواقب ذاتية الخلية لانخفاض SMN في العضلات الهيكلية. قمنا بعد ذلك بفحص NMJs في عمر 7 أشهر MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - الفئران. كانت النتيجة الأكثر لفتًا للانتباه لتحليلاتنا المورفولوجية هي مدى تفكيك مجموعات AChR المتحولة وتجزئتها (الشكل 7 و A و B). ولوحظت عيوب مماثلة في الأطفال بعمر 6 أشهر HSA-Cre SMN2 + / + Smn F7 / - المسوخ (الشكل التكميلي 9 و E و F). علاوة على ذلك ، على عكس الشباب MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - المسوخات التي لم تكن فيها اللوحات النهائية مختلفة في الحجم والهيكل عن تلك الموجودة في الضوابط ، لم تكن اللوحات الطرفية في الفئران القديمة أصغر بشكل ملحوظ (الشكل 7 ج) فحسب ، بل كانت أيضًا أقل تفصيلاً - كما تم تقييمها من خلال قياس نسبة مجموعات AChR في gastrocnemius التي تمتلك هيكل نموذجي يشبه البريتزل مع 4 ثقوب أو أكثر (الضوابط - 86.33٪ ± 3.1٪ ، المسوخ - 3.33٪ ± 1.85٪ ، ص & lt 0.001 ، ن ≥ 100 NMJs في ن = 3 فئران من كل مجموعة ، ر اختبار).

علم الأمراض NMJ والخلل العصبي العضلي في MyoD-iCre Smn F7 / - المسوخ تحمل 2 SMN2 نسخ. (أ) تظهر NMJs من عضلات EDL لفئران عمرها 7 أشهر تجزئة عميقة للوحات النهاية في المسوخ. شريط النطاق: 10 ميكرومتر. (ب) التمثيل الكمي لـ NMJs المجزأة في الفئران المتحولة والسيطرة البالغة من العمر 7 أشهر ر اختبار، ن ≥ 500 لوحة نهائية من ن ≥ 3 فئران من كل تركيب وراثي. (ج) رسم بياني يصور حجم NMJ في عضلات الساق للطفرات والضوابط البالغة من العمر 7 أشهر ر اختبار، ن ≥ 420 لوحة نهائية من ن = 3 فئران من كل تركيب وراثي. التصوير الكمي لـ (د) سعة MEPP ، (ه) تردد MEPP ، (F) سعة EPP ، و (جي) المحتوى الكمي في عضلات شركة كهرباء لبنان للفئران المتحولة والسيطرة البالغة من العمر 7 أشهر. NS: ص & GT 0.05 ، ر اختبار، ن ≥ 10 أطباق نهائية لكل حيوان من ن ≥ 4 فئران من كل تركيب وراثي. تمثل الرسوم البيانية (ح) أرقام الليف العضلي و (أنا) نسبة الألياف ذات النوى المركزية في عضلات EDL للفئران التي تم تحليلها ر اختبار، ن ≥ 4 فئران من كل تركيب وراثي. التصوير الكمي لـ (ي) قوة محددة الذروة ، (ك) انخفاض القوة النسبية ، و (إل) معدل إنتاج القوة القصوى في عضلات النعل من 5 إلى 7 أشهر من عمر الفئران ذات الاتجاهين ANOVA للحصول على نتائج في ي و ر اختبارات للنتائج في ك و إل, ن ≥ 5 فئران من كل مجموعة. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001.

لتحديد ما إذا كانت التشوهات المورفولوجية مرتبطة بضعف النقل العصبي ، قمنا أيضًا بتقييم وظيفة NMJ بالوسائل الكهربية. على الرغم من عدم وجود فروق في سعة EPP وترددات MEPP في عضلات EDL للطفرات والضوابط ، كانت سعة MEPP أقل بشكل ملحوظ في MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - الفئران ، بما يتفق مع ندرة AChRs بعد المشبكي (الشكل 7 ، D-F). أدى ذلك إلى زيادة ملحوظة في متوسط ​​المحتوى الكمي في الصفائح الطرفية الطافرة (الشكل 7G) ، مما يشير إلى زيادة تعويضية في إطلاق الناقل العصبي قبل المشبكي استجابةً لتركيزات AChR بعد المشبكية المنخفضة. علاوة على ذلك ، تم تقليل حجم عضلة EDL المتحولة (منطقة المقطع العرضي للعضلات في ميكرومتر 2: عناصر التحكم - 584.300 ± 33.470 ، المسوخ - 406.900 ± 36.780 ، ص & lt 0.05 ، ر اختبار ن ≥ 4 حيوانات من كل مجموعة) وتتكون من عدد أقل من الألياف ، والعديد منها لها نوى مركزية وليست محيطية (الشكل 7 ، H و I). لم تؤثر عيوب العضلات المذكورة أعلاه على أعداد الخلايا العصبية الحركية الشوكية في الطفرات (متوسط ​​العدد لكل قسم: المسوخ - 14.5 ± 0.25 ، عناصر التحكم - 12.8 ± 1.08 ، ص & GT 0.05 ، ن = 3 فئران ، ر اختبار). تعزز هذه النتائج الملاحظة التي تشير إلى أن الخلل الوظيفي المورفولوجي والحركي ناتج عن انخفاض SMN في العضلات الهيكلية ، وتشير كذلك إلى أن العيوب التي تنشأ في حجرة ما بعد المشبكي يمكن أن يكون لها تأثير رجعي على وظيفة الخلايا العصبية الحركية.

في مجموعة ختامية من التجارب الوظيفية ، أجرينا قياسات انقباض خارج الجسم الحي في عضلات النعل من عمر 5 إلى 7 أشهر MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - المسوخ. وجدنا أن القوة النوعية القصوى المتولدة أثناء التحفيز الفردي والتردد المنخفض (10-20 هرتز) لم تختلف بين العينات المتحولة وعينات التحكم. ومع ذلك ، تم الكشف عن انخفاض كبير في ذروة القوة النوعية عندما تم تحفيز العضلات الطافرة بترددات أدت إلى تقلص تلخيصي (40-200 هرتز) (الشكل 7J). لم يلاحظ أي تحول في علاقة التردد بين القوة والعضلات الطافرة. كما أخضعنا العضلات لتحفيز متكرر متوسط ​​التردد لتقييم مدى قابليتها للإرهاق. ومن المثير للاهتمام ، أن العضلات الطافرة أظهرت انخفاضًا متواضعًا ، ولكن مهمًا ، في التعب خلال 25 قطارًا تحفيزيًا تقريبًا (الشكل 7 ك). للتحقيق في الأساس الخلوي لهذه الملاحظة ، تم تحليل اللييفات العضلية المستخرجة من عضلة النعل بأكملها من أجل المستويات النسبية للأشكال الإسوية ذات السلسلة الثقيلة من الميوسين. تمشيا مع زيادة مقاومة التعب ، وجدنا أن عضلات النعل من MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - أعربت الفئران عن المزيد من الميوسين من النوع الأول (MyHc7) الموجود بشكل مميز في الألياف العضلية البطيئة المقاومة للتعب (الشكل التكميلي 10 و A و B). أخيرًا ، بالنظر إلى هذه التغييرات الملحوظة في ذروة قوة الكزاز النوعية ومحتوى الميوسين البطيء من النوع الأول ، قمنا بتحليل حركية تطوير القوة (dF / dt) في عضلات النعل من الفئران المتحولة والسيطرة. يتوافق مع الزيادة الملحوظة في محتوى MyHc7 ، وعلى الرغم من الحجم الطبيعي (الوزن بالملجم: عناصر التحكم - 6.15 ± 0.22 ، المسوخ - 6.15 ± 0.38 ص = 1, ن ≥ 4 فئران ، ر اختبار) ، تم تقليل dF / dt الأقصى في عضلة النعل معربًا عن انخفاض SMN (الشكل 7L). بشكل جماعي ، توفر هذه النتائج دليلًا قويًا على وجود عجز مورفولوجي ووظيفي كبير للعضلات ناتج عن تأثير مستقل للخلايا لندرة SMN في هذا النسيج.

لوحظ التخفيف من الأمراض العصبية العضلية بعد امتلاء بروتين SMN بعد الأعراض. إن امتلاء SMN المبكر بعد الولادة يمنع بشكل فعال ظهور SMA (53 ، 54). لتحديد ما إذا كانت استعادة SMN تفيد أيضًا الفئران بعد الأعراض المستنفدة بشكل انتقائي للبروتين في العضلات ، قمنا بإعطاء إما SMN2 مورفولينو تبديل لصق (MO) أو واحد مع تسلسل مخلوط لعمر 7 أشهر MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - المسوخ. بعد تسعة أسابيع ، تم تقييم مستويات SMN في العضلات. تمشيا مع التقارير السابقة ، وجدنا أن نصوص FL-SMN والمستويات الإجمالية لبروتين SMN كانت أعلى بشكل ملحوظ في المسوخات المعالجة بـ SMN MO مقارنة بالمجموعة التي عولجت بالجزيء المخفوق (الشكل 8 ، A-C). لتحديد ما إذا كانت الزيادة في SMN العضلية قد خففت من أمراض العضلات التي لوحظت عادةً في المسوخ ، قمنا بتشريح gastrocnemii من المجموعات المختلفة ، في نفس الوقت الذي تم فيه فحص مستويات SMN ، لتقييم العضلات. أظهرت قياسات الوزن الرطب للعضلات أنه في حين أن العضلات من المسوخات المشوشة المعالجة بـ MO ظلت أصغر بكثير من تلك الموجودة في الضوابط ، كانت العضلات من المسوخات التي تم ترميمها من أجل SMN أكبر ولا تختلف في الوزن عن العضلات الضابطة (الشكل 8 د). كان هذا مصحوبًا بعدد أقل من العيوب الخلوية في طفرات الألياف العضلية المعالجة بـ SMN في هذه الحيوانات أظهرت مناطق ألياف أكبر مقارنةً بتلك الموجودة في المسوخات التي خضعت للخلط المخلوط. بالإضافة إلى ذلك ، احتوى عدد أقل من الألياف العضلية المعالجة بـ SMN MO على نوى مركزية مقارنة بتلك الموجودة في المسوخات المخلوطية المعالجة بـ MO (الشكل 8 ، E-G). أخيرًا ، أظهرت قياسات حجم اللوحة النهائية وتعقيدها في مجموعات الفئران الثلاثة أن كلتا المعلمتين تم تطبيعهما جزئيًا في المسوخات المعالجة بـ SMN MO (الشكل 8 ، H-J). على وجه التحديد ، لم تكن NMJs في المسوخات المستعادة لـ SMN أكبر فقط (الشكل 8I) ، ولكن أيضًا أقل تجزئة (الشكل 8 و H و J). علاوة على ذلك ، كانت اللوحات النهائية السليمة في المسوخ المستعاد لـ SMN أكثر تفصيلاً ، كما تم تقييمها من خلال التقدير الكمي للهياكل الشبيهة بالبريتزل مع 3 ثقوب مميزة أو أكثر (الشكل 8J). نستنتج أن استعادة SMN حتى بعد علم أمراض العضلات يصبح اعتقالات واضحة و / أو يعكس الاعتلال العضلي المنسوب إلى انخفاض البروتين في الأنسجة. وفقًا لذلك ، من المتوقع أن يكون لتكاثر SMN لعضلات موضوعات SMA تأثير مخفف مهم على النمط الظاهري للمرض بشكل عام.

يخفف ملء SMN من عيوب العضلات في المسوخ المصحوب بأعراض. مستويات (أ) SMN2- مستمدة من نصوص FL-SMN و (ب) بروتين SMN في عضلات الساق من الضوابط والطفرات إما تدار SMN2 MOQ أو MO غير محدد في 7 أشهر من العمر 1-way ANOVA ، ن = 3 فئران من كل تركيب وراثي. (ج) فحص لطخة غربية لبروتين SMN في العضلات الهيكلية بعد العلاج باستخدام SMN-MO أو MO المخلوط. (د) أوزان العضلات في الفئران المعالجة كما هو موضح في اللوحات السابقة أحادية الاتجاه ANOVA ، ن ≥ 3 فئران في كل مجموعة. (ه) المقاطع المستعرضة لعضلات الساق من المسوخ والضوابط المعالجة. لوحظ انخفاض علم الأمراض في شكل نوى مركزية (رؤوس سهام) ، وألياف ضامرة (أسهم مفتوحة) ، وألياف متدهورة (أسهم صلبة) في العضلات المعالجة بـ SMN-MO. شريط النطاق: 100 ميكرومتر. النتائج الكمية لـ (F) النوى المركزية و (جي) مناطق الألياف العضلية في العضلات من الفئران أحادية الاتجاه ANOVA ، ن ≥ 300 ألياف من ن ≥ 3 فئران من كل مجموعة. (ح) لوحيات نهائية من 3 مجموعات من الفئران يتم رؤية عدد أقل من NMJs المجزأة في متحولة معالجة SMN-MO مقارنة بنظيرتها MO المخففة المدارة. شريط النطاق: 25 ميكرومتر. (أنا) قياسات منطقة NMJ و (ي) تحليل تعقيد NMJ في عضلات الساق للطفرات المعالجة أو الضوابط أحادية الاتجاه ANOVA ، ن ≥ 400 لوحة نهائية من ن ≥ 3 فئران من كل تركيب وراثي للحصول على نتائج أنا و ي. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001.

SMA هو اضطراب يصيب الأطفال بالشلل بسبب انخفاض بروتين SMN. إذا لم يتم علاجها ، فإن معظم مرضى ضمور العضلات الشوكي يموتون قبل عمر سنتين. استعادة SMN في الفئران النموذجية يمنع و / أو يعكس بداية SMA (54 ، 55) وبالتالي تم اعتماده بسرعة كوسيلة لعلاج قابل للتطبيق. ومع ذلك ، أوضحت دراسات التزاحم أيضًا أن نجاح الاستراتيجية يعتمد بشكل حاسم على متى وفي أي الأنسجة يتم استعادة SMN. من المقبول على نطاق واسع أن خلايا الجهاز العصبي المركزي ، وعلى وجه الخصوص ، الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري معرضة بشكل خاص لانخفاض SMN ، وبالتالي يجب أن تعبر عن مستويات SMN كافية لإحباط ظهور المرض. يتم استهداف هذه الخلايا بكفاءة عن طريق الإدارة داخل القراب لعوامل استعادة SMN مثل Spinraza. في الواقع ، لم تترك النتيجة الأولية لعلاج المرضى بهذه الطريقة أي شك حول الفعالية السريرية لاستهداف الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، لا تزال الأسئلة العالقة حول التوصيل المقيد للدواء داخل القراب والتأثيرات طويلة المدى لحرمان محيط SMN المناسب قائمة. استخدمنا هنا ما نعتقد أنه مجموعة جديدة من الفئران النموذجية لإثبات نتيجة حرمان عضو هام من العضلات والهيكل العظمي من SMN المناسب. هذا النسيج مهم بشكل خاص نظرًا لضعف الوحدة الحركية في SMA. ظهرت أربع نتائج رئيسية من دراساتنا. الأكثر أهمية هو الكشف عن مدى ضرر نقص SMN للعضلات الهيكلية. وجدنا عيوبًا في الألياف العضلية الفردية و NMJs ، وتشوهات واختلالًا وظيفيًا في العضلات بأكملها ، وفي النهاية نمطًا ظاهريًا صريحًا يضر بالبقاء على قيد الحياة. ظهر هذا المرض على الرغم من المستويات الطبيعية لـ SMN في الأنسجة الأخرى. ثانيًا ، أظهرنا أن مدى المرض يرتبط بعدد SMN2 نسخ وبالتالي المستويات المطلقة من بروتين SMN الوظيفي في الأنسجة. في حين أن المسوخ يعبر عن نسخة واحدة فقط من SMN2 تطور الجين المرض بسرعة ، أظهر أولئك الذين لديهم نسختان نمطًا ظاهريًا متأخرًا جدًا. ومع ذلك ، يمكن الكشف عن علم الأمراض الخلوي الكامن وراء المرض المتأخر الظهور في المراحل المبكرة في ظل ظروف إصابة العضلات الحادة. ثالثًا ، أظهرت نتائجنا بشكل لا لبس فيه أن بعض جوانب النمط الظاهري الشامل للـ SMA تنبع على الأقل من تأثير عضلي مستقل. استنزاف SMN في هذا النسيج كافٍ لتحريك علم الأمراض. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن التشوهات الناتجة كانت أكثر وضوحًا في العضلات نفسها ، فقد تم أيضًا اكتشاف العيوب في نهاية المطاف في ما قبل النفق في شكل دوالي محورية تحتوي على NF ومحاولة نقل عصبي تعويضي. أخيرًا ، أظهرنا أن استعادة SMN للعضلات حتى بعد ظهور علم الأمراض يمكن أن يكون له تأثير مخفف. هذا مطمئن بشكل خاص من وجهة نظر سريرية. نستنتج أن بروتين SMN مهم جوهريًا لوظيفة العضلات. العلاجات التصالحية SMN التي تحرم هذا النسيج من البروتين الكافي من غير المرجح أن تحقق أقصى فائدة. بدلاً من ذلك ، أثارت نتائجنا احتمالية إصابة الأشخاص الذين عولجوا داخل القراب باحتمالية الإصابة باعتلال عضلي حاد ومهدد للحياة بمرور الوقت. Zolgensma ، عامل تعزيز SMN بوساطة AAV9 ، والذي تمت الموافقة عليه مؤخرًا لعلاج SMA ، يعالج هذا القلق لأنه يتم توصيله بشكل منهجي وبالتالي يستهدف العضلات على الأرجح. ومع ذلك ، تتم الموافقة على هذا العلاج حاليًا فقط للمرضى الذين تقل أعمارهم عن عامين ، ويقتصر المرضى الأكبر سنًا على العلاج داخل القراب.

يجب أن يأخذ ملء SMN لعلاج SMA في الاعتبار المتطلبات المكانية والزمانية للبروتين. في هذا السياق ، نوقش كثيرًا التأثير المحتمل المستقل للخلايا والمسبب للمرض لانخفاض SMN في العضلات الهيكلية. نشأت الازدواجية إلى حد كبير من طبيعة SMA ، والتي تنطوي على مستويات منخفضة في كل مكان من بروتين SMN ، والضعف الأساسي للخلايا العصبية الحركية الشوكية لندرة SMN ، والطريقة التي يؤثر بها إزالة التعصيب على العضلات. لذلك يمكن تفسير أي تأثيرات للضمور العضلي الشوكي على العضلات على أنها ناشئة ثانوية لفقدان الخلايا العصبية الحركية. ومع ذلك ، فقد استنتجت العديد من الدراسات دورًا مستقلاً للعضلات في ضمور العضلات الشوكي. تراوحت هذه الدراسات من تحليلات الخلايا في المزرعة التي تُظهِر التأثير الضار لعضلة SMA على زراعة الأعصاب والعضلات (23 ، 56) إلى تقييمات العضلات السليمة وعلامات تكوُّن العضل في أنسجة تشريح الجثة ونماذج الفئران (26 ، 57 ، 58). ومع ذلك ، نظرًا لأن التجارب اعتمدت على خلايا المرضى أو الفئران المستنفدة في كل مكان من أجل SMN ، كان من المستحيل حقًا فصل التأثيرات في الخلايا العصبية الحركية عن تلك الموجودة في العضلات. استنتجت أكثر المحاولات المباشرة لتحديد التأثيرات الذاتية الخلوية المحتملة للعضلات المنخفضة SMN على النمط الظاهري لـ SMA أن البروتين المنخفض في هذا النسيج يساهم بشكل ضئيل في المرض (25 ، 28).

تتناقض نتائجنا بشكل حاد مع نتائج Iyer et al. (28). ينبع أحد التفسيرات للاختلاف في النتائج من اختيارنا لمحركات Cre. تعتبر متانة وخصوصية هذه الدوافع أساسية لتمكين المرء من التنبؤ بدقة بالنتائج في سياق المرض. في هذا الصدد ، لم نجد فقط خط MyoD-iCre لاستنفاد SMN بشكل أكثر كفاءة من برنامج تشغيل Myf5-Cre ، ولكن أيضًا للقيام بذلك مع خصوصية أكبر للأنسجة. كانت نتائجنا تشير بشكل خاص إلى أن نصف النتائج تقريبًا Myf5-Cre Smn F7 / - لم تعيش المسوخات حتى مرحلة البلوغ فحسب ، بل كانت أيضًا قوية بما يكفي للتكاثر. يشير هذا بقوة إلى أن خط Myf5-Cre فشل في دفع عملية إعادة التركيب بكفاءة في SMN F7 أليل ، ولذلك فلا عجب من إضافة SMN2 إلى Myf5-Cre Smn F7 / - ستخفي الفئران أيضًا أي أعراض للمرض - على غرار ما لاحظه Iyer et al. التفسير ذو الصلة للنتائج المتناقضة هو الخلفية الأليلية المعتمدة في الدراستين. في حين أن الفئران النموذجية التي استخدمها Iyer et al. مأوى وعبر عن جين متحور SMNΔ7 اصطناعي ، لم يكن لدينا. على الرغم من البيانات الموثوقة التي توضح أن بروتين SMNΔ7 لا يعمل في حد ذاته ، إلا أنه قادر ، بالتنسيق مع FL-SMN ، على منح وظيفة جزئية لمركب SMN وبالتالي التخفيف بشكل كبير من المرض (41 ، 59). التفسير النهائي لعدم القدرة على اكتشاف الخلل الوظيفي في الفئران الناتجة عن Iyer et al. يكمن على الأرجح في حقيقة أن كثرة التحليلات أجريت في نسختين صغيرتين نسبيًا (8 أسابيع) SMN2 المسوخ. في الواقع ، فشلنا أيضًا في الكشف عن أدلة على وجود أمراض خلوية أو مرض واضح في طفرات MyoD-iCre التي تؤوي 2 SMN2 نسخ. ظهر النمط الظاهري للمرض فقط في عمر 6 إلى 7 أشهر. نشك في أن هذا كان سيحدث أيضًا لو قام Iyer وزملاؤه بتحليل المسوخات الأكبر سنًا. لا ينفي الاختلاف في النتائج التي توصلنا إليها تأكيد Iyer et al. أن علاج الأنسجة العضلية في ضمور العضلات الشوكي بشكل حصري سيفشل في تحقيق فائدة سريرية. من المحتمل أن يظل هذا هو الحال ، مع الفوائد السريرية المثلى التي تتراكم فقط عند استعادة المحيط والجهاز العصبي المركزي لـ SMN.

نتائجنا ليست غير متوقعة تمامًا بالنظر إلى النمط الظاهري السائد للعضلات العصبية العضلية SMA واستنتاجات الدور المستقل للعضلات في المساهمة في المرض. ومع ذلك ، على حد علمنا ، فإن نتائجنا هي النتائج الأولى لاستخدام نموذج للثدييات SMN2 لتوضيح أن انخفاض SMN في العضلات الهيكلية ينتج المرض بطريقة ذاتية الخلية. هذا وثيق الصلة بشكل خاص من وجهة النظر السريرية ، بالنظر إلى الوعد العلاجي لعوامل استعادة SMN. اثنان من هؤلاء ، Spinraza و Zolgensma ، حصلوا الآن على الموافقة التنظيمية لعلاج SMA. ومع ذلك ، فإن استخدامها يخضع لتحذيرات سبق الإشارة إليها. في ضوء النتائج التي توصلنا إليها ، فإن هذا المزيج من العوامل يستدعي القلق للمئات العديدة من المرضى الذين يخضعون للعلاج حاليًا ، خاصةً إذا اقتصروا على الجهاز العصبي المركزي. إذا كان علم أمراض العضلات ، كما تنبأت نتائجنا قبل السريرية ، هو نتيجة متأخرة الظهور لانخفاض SMN في الأنسجة ، فهناك كل الاحتمالات بأن الفوائد الأولية للعلاج داخل القراب ستؤدي في النهاية إلى اضطراب عضلي مزمن وماكر متأخر الظهور. دعمت قيم CK في المصل المرتفعة بشكل عام في مرضى SMA المعالجين بـ Spinraza والمستويات العالية بشكل خاص من هذا المرقم الحيوي في المرضى المتنقلين مقابل المرضى غير المتنقلين الذين تم أخذ عيناتهم من هذا الاستخدام المعتمد على النشاط للعضلات المحرومة من SMN في المرضى المتنقلين من المحتمل أن يؤدي إلى تسريع تلف الأنسجة . قد يتم إيقاف و / أو عكس الخلل الوظيفي ، كما هو موضح في نموذجنا ، من خلال زيادة SMN في العضلات ، ولكن من المحتمل مرة أخرى أن يعتمد على توقيت التدخل. بمجرد فقدان العضلات بالكامل سيكون من الصعب استبدالها.

على الرغم من أن عيوب العضلات في الفئران النموذجية لدينا والآثار العلاجية لمثل هذا الضرر واضحة ، إلا أنه لا يزال يتعين استكشاف كيفية انخفاض معدل SMN في علم الأمراض. اقترح البعض اضطرابات في عملية تكوين العضل (29 ، 57 ، 60 ، 61). على الرغم من أن هذا قد يكون صحيحًا في أشد أشكال SMA ، إلا أنه يبدو أنه ليس كذلك في طفراتنا ، خاصة تلك التي تعبر عن 2 SMN2 نسخ. في مثل هذه الطفرات التي تم فحصها في P7 ، وجدنا القليل من عيوب العضلات. بدلاً من ذلك ، أشارت بياناتنا إلى وجود عيوب في صيانة العضلات. لم يتم حتى الآن الإبلاغ عن عيوب الحفاظ على العضلات في SMA أو التأكيد عليها - وهي نتيجة محتملة لشدة النمط الظاهري والعمر القصير للفئران النموذجية التي تم فحصها حتى الآن. ومع ذلك ، تظل عيوب الصيانة احتمالًا واضحًا وقد تنشأ في الألياف العضلية التالفة و / أو الخلايا الساتلية. تنشط الخلايا الساتلية بشكل خاص أثناء التطور المبكر للعضلات بعد الولادة عندما تعمل كمصادر لنواة عضلية جديدة (62). بعد حياة ما قبل البلوغ في الفئران (4-6 أسابيع من العمر) ، وهي الفترة التي تنخفض فيها مستويات SMN أيضًا بشكل كبير (63) ، تنخفض أعداد هذه الخلايا بشكل كبير حيث تصل الألياف العضلية إلى أبعادها البالغة. نتوقع أنه خلال الأسابيع اللاحقة ، تتدهور الألياف العضلية التي تعبر عن انخفاض SMN بأعداد كبيرة. قد تلبي الخلايا الساتلية في البداية الطلب على تجديد الألياف المتدهورة. ومع ذلك ، فإن عملية التنكس المتسارعة المصحوبة بخلل جوهري في الخلايا الساتلة المستنفدة للـ SMN تطغى في النهاية على قدرة هذه الخلايا الجذعية على إعادة ملء العضلات. يمكن الاستدلال على الخلل الوظيفي للخلايا الساتلية من التناقض بين الأعداد الأكبر بكثير من الألياف التي تظهر نوى مركزية بالنسبة لتلك المتدهورة بشكل نشط - وفقًا لتقييم امتصاص المصل IgG (الشكل 6I). قد يكمن أحد التفسيرات المثيرة للاهتمام لمثل هذا التباين في القدرة الطبيعية للخلايا الساتلية المستنفدة من SMN على الاستجابة لتلف الألياف ، ولكن فشل الخلايا لاحقًا في العودة إلى السكون. يمكن أن تؤدي الحالة النشطة التأسيسية الناتجة لهذه الخلايا إلى تسريع استنفادها وبالتالي فقدان ألياف العضلات بشكل عام.اقترحت تجارب CTX أيضًا أن مستويات SMN أثرت بشدة على تجديد العضلات بعد الإصابة. إذا كان هذا صحيحًا عند البشر ، فسيتعين على المرضى الذين عولجوا بأدوية تعيد SMN حصريًا إلى الجهاز العصبي المركزي أن يمارسوا الحذر. أحد المعضلات الواضحة الناشئة من ملاحظاتنا هو سبب عدم الإبلاغ عن علم أمراض العضلات الشبيه بما لاحظناه على نطاق واسع في SMA الكلاسيكي. نعتقد أن الإجابة تكمن في المقام الأول في تأثيرات إخفاء فقدان الخلايا العصبية الحركية المبكرة. تركز الفرضية الثانية المثيرة للاهتمام على الحديث المتبادل بين العضلات والأعصاب. في SMA الكلاسيكي ، من المحتمل أن تتعرض صحة كل من مقصورات ما قبل المشبك وما بعد المشبك للخطر. قد يؤدي الإنقاذ الانتقائي للخلايا العصبية الحركية ، كما هو متوقع في المرضى الذين عولجوا داخل القراب ، إلى فرض حجرة ما قبل المشبكية التي تم إنقاذها عبئًا لا داعي له على العضلات. لا تزال المحددات الجزيئية الكامنة وراء مثل هذه الاضطرابات في إرسال الإشارات في NMJ بحاجة إلى استكشاف في سياق SMA. ستعمل الفئران النموذجية لدينا كأداة مفيدة في التحقيق في هذا الأمر والأسئلة الأوسع التي تركز على الإشارات المطلوبة بين الخلايا العصبية الحركية والعضلات لضمان صحة كلا النوعين من الخلايا وقابليتهما للحياة.

الفئران. تم التنميط الجيني الفئران ROSA26-flox-STOP-flox-YFP (مختبر جاكسون ، المخزون رقم 006148) وفقًا للبروتوكولات الموجودة على https://www.jax.org/ MyoD-iCre أو Myf5-Cre SMA الفئران بدون SMN2 (MyoD-Cre Smn F7 / - أو Myf5-Cre Smn F7 / - ) والضوابط (Smn F7 / - ) عن طريق تكاثر MyoD-iCre (مختبر جاكسون ، مخزون رقم 014140) أو Myf5-Cre (مختبر جاكسون ، مخزون رقم 007893) فئران متغايرة الزيجوت للفئران Smn (Smn +/– مختبر جاكسون ، مخزون لا. 006214) مع Smn F7 / F7 الحيوانات (SMN F7 ، مختبر جاكسون ، مخزون لا. 006138). طفرات MyoD-Cre SMA مع نسخة واحدة أو نسختين من SMN2 والضوابط (SMN2 +/– Smn F7 / -، SMN2 + / + Smn F7 / - ، أو MyoD-Cre SMN2 + / + Smn F7 / + ) عن طريق إدخال SMN2 التحوير (مختبر جاكسون ، المخزون رقم 005024) على الحيوانات مع سائق Cre وأليل floxed. جميع التحليلات على نسختين SMN2 أجريت الفئران مع المحقق الذي أعمى عن النمط الظاهري. تم اتباع بروتوكول مماثل للنسخة 1 SMN2 الفئران ، باستثناء الدراسات السلوكية حيث منع النمط الظاهري الصريح في الطفرات التعمية. انظر الطرق التكميلية للحصول على تفاصيل الاشعال التنميط الجيني.

فحوصات السلوك الحركي. تم إجراء اختبارات قوة الدوران والقبضة باستخدام LE8200 rotarod (Harvard Apparatus / Panlab Inc.) و BIOSEB Grip Strength Tester BIO-GS3 (Bioseb Inc.) ، على التوالي ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم وصف تفاصيل هذه الطرق في الطرق التكميلية.

فحص مصل CK. تم قتل الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون2 الغاز و 500 ميكرولتر من الدم التي تم جمعها من البطين الأيمن باستخدام إبرة قياس 21. تم قياس مستوى CK في المصل بواسطة معهد الطب المقارن بجامعة كولومبيا باستخدام محلل الكيمياء البيطرية Element DC (Heska).

الخلايا العصبية الحركية ، NMJ ، وأنسجة العضلات. تم إجراء الأنسجة العصبية الحركية و NMJ والعضلات بشكل أساسي كما هو موضح سابقًا (42 ، 45). يتم تقديم تفاصيل إضافية في الطرق التكميلية.

تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والبقع الغربية ، والهلام الملون بالفضة. تم تفكيك الأنسجة باستخدام TRIzol (Invitrogen) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد توليف (كدنا) ، تم إجراء PCR الكمي في ثلاث نسخ على MasterCycler Real Plex4 (Eppendorf). يشار إلى متواليات التمهيدي المستخدمة في qRT-PCR في الطرق التكميلية. تم إجراء النشاف الغربي كما هو موصوف (13) تم إجراء تحليل الشكل الإسوي لسلسلة الميوسين الثقيلة وفقًا لتقرير سابق (64) انظر أيضًا الطرق التكميلية.

تجارب CTX و MO. تم تخدير الفئران بنسبة 1٪ -2٪ إيزوفلورين ، والنخر العضلي الناجم عن CTX. تم استخدام إبرة قياس 30 لحقن 20 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من CTX ، في برنامج تلفزيوني ، في بطن الساق. تم إدخال سم القلب بشكل موحد في عضلات الطرف الخلفي الأيمن. تم حقن الطرف الخلفي الأيسر بأحجام متطابقة من PBS. تم تقييم الفئران عند نقطة الأساس (بدون حقن) وفي نقاط زمنية مختلفة بعد حقن CTX و PBS ، وإزالة عضلات الطرف الخلفي ووزنها واستخدامها على الفور لإعداد تحلل الأنسجة أو التجميد. كانت SMN و MOs المشوشة المستخدمة مماثلة لتلك الموجودة في تقرير سابق (16). تم تعليق كل MO في ماء معقم وقُسمت إلى تركيز نهائي قدره 0.5 ملي مولار. تم إدارة الفئران MOs بواسطة i.p. الحقن (12.5 مجم / كجم) عند P210.

الفيزيولوجيا الكهربية. الفيزيولوجيا الكهربية NMJ: تم إجراء الفيزيولوجيا الكهربية NMJ بشكل أساسي كما هو موضح سابقًا (46). تم إجراء تجارب انقباض العضلات خارج الجسم الحي بناءً على الأساليب المُحسَّنة والمستخدمة مسبقًا (64). تم تفصيل التعديلات على الطرق الخاصة بهذه الدراسة في الطرق التكميلية.

إحصائيات. تم تقييم منحنيات بقاء Kaplan-Meier للاختلافات باستخدام اختبار تسجيل الترتيب المكافئ لاختبار Mantel-Haenszel. الطالب غير المزاوج 2 الذيل ر اختبار أو ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا بمقارنة Tukey اللاحقة ، حيث تمت الإشارة إليها ، لمقارنة وسائل الفروق الإحصائية. في الحالات التي يجب فيها تحليل المتغيرات ذات الحدين الفئوية ، تم استخدام اختبار فيشر الدقيق. يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ​​± SEM ما لم يُذكر خلاف ذلك. ص اعتبرت القيم الأقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام الإصدار 6.0 من Prism (برنامج GraphPad).

الموافقة على الدراسة. تلتزم جميع الإجراءات الخاصة بالحيوانات بالبروتوكولات الموضحة في دليل لرعاية واستخدام حيوانات المختبر (مطبعة الأكاديميات الوطنية ، 2011) وتمت الموافقة عليها من قبل IACUC بجامعة كولومبيا. تم اختيار موضوعات هذه الدراسة عشوائياً ، وخلفية مختلطة ، من فئران ذكور وإناث تم وضعها في بيئة خاضعة للرقابة في دورة مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة مع الطعام والماء.

أجرى JKK و NNJ و MRF معظم التجارب الموضحة هنا. قام ZF بتقييم الوضع الوظيفي لـ NMJs بينما أشرف CPK على هذه التجارب وقدم مدخلات فكرية. ساهمت CAC في بيانات المريض الموصوفة في هذه الدراسة. أجرى LWL دراسات انقباض العضلات خارج الجسم الحي ووجه RTD هذا الجانب من المشروع. قامت URM بوضع تصور للتجارب ، وتوجيه المشروع ككل ، وتحليل البيانات وتفسيرها. كتب JKK و URM المخطوطة مع مدخلات من جميع المؤلفين.

نشكر P. Faust وأعضاء Columbia MNC للحصول على المشورة والاقتراحات. كما نشعر بالامتنان لـ DC De Vivo لدعمه خلال هذه الدراسة. تم تمويل هذا المشروع من خلال منح من AFM-France و Cure SMA و NIH (R21 NS099921 و R01 NS057482 و R56 NS104218) إلى URM و NIH R01 AR059646-08 إلى RTD ومؤسسة SMA إلى CPK.

تضارب المصالح: أعلن الكتاب أنه لا يوجد تضارب في المصالح.


الخصائص

في هذا القسم ، سنتحدث عن خصائص الخلايا العصبية التي تجعل من الممكن تجميع الخلايا العصبية.

مجال كبير للإثارة

تحتوي معظم الخلايا العصبية ، وخاصة الخلايا العصبية الحركية ، على تشعبات تمتد من 500 إلى 1000 ميكرومتر على كل جانب حول جسم الخلية في الخلايا العصبية. يسمح هذا للخلايا العصبية باستقبال نبضات أو إشارات عصبية من مجال مكاني واسع جدًا ، أي أن لديهم مجالًا كبيرًا من الإثارة.

بالإضافة إلى ذلك ، تستقبل الخلايا العصبية ما يقرب من 80٪ إلى 95٪ من جميع الإشارات عبر نقاط الاشتباك العصبي في التشعبات. غالبية المحطات قبل المشبكي تتصل بهذه التشعبات. وبالتالي ، فإن الإثارة الكبيرة للتشعبات تلعب دورًا مهمًا في التجميع العصبي.

التوزيع الموحد لإمكانات العمل

إنها خاصية مهمة لجميع الخلايا العصبية. السائل داخل الخلايا في العصبون هو سائل عالي التوصيل لأنه يحتوي على تركيز كبير من الأيونات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قطر جسم الخلية العصبية كبير ، ولا يسبب أي مقاومة لتدفق الأيونات وتوصيل الجهد من جزء إلى الجزء الآخر داخل سوما.

بسبب هذه الخصائص ، ينتشر الجهد المتولد في أي نقطة على طول جسم الخلية على الفور إلى الخلية العصبية بأكملها. هذا المبدأ ضروري للتجميع العصبي.


المواد والأساليب

الأجسام المضادة والكواشف.

تم شراء مضادات الخيوط العصبية (NF) ، ومضادة لـ MAP2 ، ومضادة لـ CHT ، ومضادة للنعناع 1 ، ومضادة للكالسيوم / بروتين سيرين كيناز (Cask) ، وأجسام مضادة 22C11 من Millipore Bioscience Research الكواشف المضادة لـ synaptophysin و SV2 كانت الأجسام المضادة من Dako والدراسات التنموية Hybridoma Bank ، على التوالي ، وكان الجسم المضاد للعلم من Sigma-Aldrich. يتعرف الجسم المضاد APP أحادي النسيلة المضاد للأرنب المستخدم في التلقيح المناعي على تسلسل C-terminal الخاص بـ APP الذي يحتوي على نموذج YENPTY وكان متاحًا من Epitomics (استنساخ Y188). تم وصف الجسم المضاد APPc متعدد الأضداد المضاد لـ APP C سابقًا (Wang et al. ، 2007). α-Bungarotoxin (α-BTX) كان من Invitrogen.

يبني الحمض النووي.

وصف وانج وآخرون التطبيق البشري كامل الطول (شكل 695) و APPΔC و APPc99 في ناقلات pcDNA3. (2007). تم إنشاء بنيات حذف APP خارج الخلية من (كدنا) كامل الطول بواسطة PCR والطفرات الموجهة للموقع. تم استئصال الأحماض الأمينية 22-189 و 289-500 من APP لإنشاء بنية APPΔE1 و APPΔE2 ، على التوالي. لتوليد شكل جليكوزيل فوسفاتيديلينوسيتول (GPI) من APP ، تم دمج تسلسل APP خارج الخلية بالكامل مع exon 5 من الماوس AchE (أستيل إستريز أستيل) ، والذي يشفر 43 بقايا الأحماض الأمينية الطرفية C بما في ذلك إشارة لتعديل GPI. لإنشاء جزيء الالتصاق الخلوي APP / المشبكي (SynCAM) الوهم ، تم استبدال الذيل السيتوبلازمي الكامل لـ APP (الأحماض الأمينية 649-695) بالتسلسلات داخل الخلايا لـ SynCAM1 (الأحماض الأمينية 428-474) ، والتي تم تضخيمها عن طريق النسخ العكسي ( RT) -PCR من الحمض النووي الريبي لدماغ الفأر.

لإنشاء ناقلات التعبير الفيروسي البطيء ، تم استخدام الاشعال التالية لتضخيم cDNAs من نواقلها المستندة إلى pcDNA3 بواسطة PCR. تم استنساخ الأجزاء المضخمة لاحقًا في ناقل المكوك البطيء FUGW (cmv) -RBN في نهيانا و باكمواقع I (Xu et al. ، 2008): APP FL و APPc99 ، 5′-AT GCTAGC GCCACCATGCTGCCCGGTTGGCA-3 نهيأنا 5′-GA TTAATTAA CTAGTTCTGCATCTGCTCAAAGAA-3 ′ باكI APPΔC ، 5′-AT GCTAGC GCCACCATGCTGCCCGGTTGGCA-3 ′ 5′-GA TTAATTAA CTACTTCAGCATCACCAAGGTGAT-3 APP / SynCAM ، 5′-AT GCTAGC GCCACCATGCTGCCCGGTTGCTGCAT-3 ′ 5-GA تم توفير بنيات Mint1 و Cask من قبل الدكتور Tom Südhof (كلية الطب بجامعة ستانفورد ، ستانفورد ، كاليفورنيا). لإنشاء ناقلات تعبير لتحليل تكملة التألق ثنائي الجزيء (BiFC) ، فإن المحطة N-172 aa من YFP (nYFP) أو C-terminal 173-238 aa من YFP (cYFP) من نواقل Venus-nYFP أو Venus-cYFP (Chen وآخرون ، 2007) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) واستنساخهم في الطرف C للطرف APP ، وكل من الطرف N والنهاية C في Mint1 و Cask كبروتينات اندماج داخل الإطار. تم إنشاء بنيات APP مع حذف عزر YENPTY باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة للموقع (Stratagene). تم التحقق من التركيبات النهائية عن طريق تسلسل الحمض النووي.

إنتاج الفئران وتربيتها وتنميطها الجيني.

خلق ال تطبيق يتم وصف الأليل الشرطي في الطرق التكميلية (متوفرة على www.jneurosci.org كمادة تكميلية). تم تهجين هذه الفئران ، بالإضافة إلى جميع الحيوانات الأخرى المستخدمة في هذه الدراسة ، على خلفية C57BL / 6J لمدة ستة أجيال. تم إنشاء الضربة القاضية الشرطية المزدوجة العصبية (N-dCKO) وفئران الضربة القاضية الشرطية المزدوجة (M-dCKO) بالعبور إلى APLP2- خلفية كاملة ومن التربية التالية: APP fl / + APLP2 - / - × Cre APP fl / + APLP2 - / - → APP + / + APLP2 - / - (تحكم) ، Cre APP fl / fl APLP2 - / - ( N-dCKO أو M-dCKO).

تم وصف التنميط الجيني APLP2 مسبقًا (von Koch et al. ، 1997). النوع البري (WT) و تطبيق تم تحديد الأليل المفلوكسي بواسطة PCR باستخدام الاشعال التالية: p1 ، 5′-GAC CAT CCA GAA CTG GTG CAAG-3 ، و p2 ، 5′-TCC CCC AGG CTT GGG ATA CAC ATT A-3.

يقوم البادران بتضخيم ما يلي: WT allele، 443 bp floxed allele، 503 bp بسبب إدخال loxP ومواقع التقييد.

تم التعرف على الفئران المعدلة وراثيا Nestin-Cre و Mck-Cre بواسطة PCR باستخدام الاشعال التالية ، والتي تضخم جزء 791 نقطة أساس: CRE-F ، 5′-GGC GTT TTC TGA GCA TAC CTG GAA-3 و CRE-R ، 5 ′ -CAC CAT TGC CCC TGT TTC ACT ATC-3 ′.

بالنسبة للتحليل الجنيني ، تم إعداد التزاوج الموقوت ، واليوم الذي لوحظ فيه السدادة المهبلية كان يعتبر يوم جنيني 0.5 (E0.5).

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقًا للجنة رعاية الحيوان المؤسسية التابعة لكلية بايلور الطبية واستخدامها ومع اللوائح والسياسات الوطنية.

تلطيخ المناعي.

تم إجراء التلقيح المناعي الكامل لعضلة الحجاب الحاجز والتقدير الكمي للأنماط الظاهرية العصبية والعضلية كما هو موصوف (Wang et al. ، 2005). بالنسبة للتلوين المناعي APP للعضلات ، تم عزل عضلات الترقوة الخشائية المثبتة طوال الليل في بارافورمالدهيد بنسبة 4 ٪ ، وتم تجميدها في OCT (العلوم الطبية الحيوية المثلثية) ، وتم تقطيعها بالتبريد عند 20 ميكرون طوليًا. تم نفاذ المقاطع باستخدام 0.1 ٪ Triton X-100 في PBS (PBST) لمدة 30 دقيقة ، وتم حظرها بنسبة 3 ٪ BSA و 4 ٪ من مصل الماعز في PBST لمدة ساعة واحدة ، وحضنت باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة APP للأرنب Y188 (1: 250) في PBST مع 4٪ من مصل الماعز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ثم استمر عند 4 درجات مئوية طوال الليل. تم بعد ذلك غسل المقاطع ست مرات لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني وحضنت مع الماعز المترافق مع أليكسا 555 (1: 1000) وأليكسا 488 مترافق α-BTX (1: 1000) في PBST مع 2٪ مصل الماعز من أجل 3 ساعات تم غسل الأقسام مرة أخرى ست مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في PBS ثم تم تركيبها باستخدام وسط تركيب Fluoromount-G. تم الحصول على صور متحد البؤر باستخدام مجهر المسح بالليزر Zeiss 510 ، وتم إجراء القياس الكمي باستخدام برنامج ImageJ من المعاهد الوطنية للصحة.

الفيزيولوجيا الكهربية.

تم فحص الانتقال المشبكي للموصل العصبي العضلي (NMJ) عند 28 ± 0.5 درجة مئوية باستخدام التسجيلات داخل الخلايا على تحضيرات العصب الحجابي الحاجز المعزول بشكل حاد في اليوم التالي للولادة 0 (P0) إلى P2. تم تشريح العضلات في محلول رينجر العادي المؤكسج المثلج الذي يحتوي على ما يلي (بالمتر): 116 NaCl ، 4.5 KCl ، 1 MgSO4، 23 ناهكو3، 1 NaH2ص4، 11 سكر العنب ، 2 CaCl2، مثبتة في غرفة تسجيل مطلية بـ Sylgard ، ومدمجة باستمرار بمحلول Ringer المؤكسج بمعدل 2 مل / دقيقة. تم ملء أقطاب كهربائية دقيقة من الزجاج الحاد بمقاومة تتراوح من 15 إلى 25 م 3 بـ 3 م بوكل. تم تسجيل إمكانات الصفيحة النهائية المصغرة (mEPPs) في محلول Ringer العادي الذي يحتوي على 2.3 ميكرومتر من Conotoxin GIIIB (Bachem) لمنع قنوات الصوديوم ذات الجهد العضلي بشكل انتقائي ، وبالتالي تقلص العضلات. تم جمع البيانات باستخدام مضخم صوت MultiClamp 700B ، ورقمته عند 10 كيلو هرتز ، وتسجيله على جهاز كمبيوتر باستخدام برنامج pClamp 9 (الأجهزة الجزيئية). تم إجراء تحليل البيانات خارج الخط باستخدام Clampfit 9 (الأجهزة الجزيئية) و MiniAnalysis (Synaptosoft) و OriginPro 7.5 (OriginLab).

مزرعة الحصين الأولية / HEK293 المختلطة.

تم إجراء تحضير ثقافة الحصين الأولية وزراعة المحاصيل لتقدير النقاط المشبكية بشكل أساسي كما هو موضح سابقًا (Biederer and Scheiffele ، 2007). باختصار ، تم تحضير ثقافات الحصين الأولية من الفئران P0 C57BL / 6J. تم تعليق الحصين المشقوق في التربسين- EDTA لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وغسلها ثلاث مرات باستخدام Ca 2 + –Mg 2+-free HBSS ، وسحنها باستخدام ماصة زجاجية مصقولة بالنار لفصل الخلايا. تم تعليق الخلايا في وسط عصبي عصبي خالٍ من المصل مع مكمل B27 (Invitrogen) وطليها على أغطية 12 مم مُعالجة مسبقًا ببولي د-ليسين (5 ميكروغرام / مل سيغما ألدريتش) بكثافة 30000 خلية / سم 2.

تم نقل خلايا HEK293 بشكل عابر باستخدام neuroligin 1 (NL1) أو APP مع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) بنسبة 10: 1 مولار. بعد 24 ساعة ، تم زرع الخلايا المصابة بالعدوى المنقولة عند 30000 خلية / سم 2 إلى الخلايا العصبية الحُصينية المذكورة أعلاه المزروعة لمدة 6-7 أيام. في المختبر. بعد ثمانية وأربعين ساعة ، تم إصلاح الثقافات وتلطيخها بجسم مضاد لمضاد synaptophysin (1: 500 Dako) متبوعًا بحضانة الجسم المضاد الثانوي المترافق Alexa Fluor 594. تمت مواجهة الخلايا أيضًا بجسم مضاد لـ MAP2 (كواشف أبحاث العلوم البيولوجية 1: 1000 ميليبور) ، وتم اختيار النقاط المشبكية السلبية لـ MAP2 لتقدير تكوين المشبك غير المتجانسة. تم تحديد نقاط الاشتباك العصبي بواسطة التراكيب الترقيمية فوق خلايا HEK293 المزروعة وقياسها كميًا بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر متبوعًا بتحليل ImageJ.

عدوى لينتيفيرال.

تم إنتاج الفيروس البطيء المؤتلف عن طريق النقل المشترك لمتجه التعبير FUGW (cmv) -APP ، وناقل التغليف CMVΔ8.9 و pVSVG في خلايا HEK293T بواسطة Lipofectamine 2000 (Invitrogen). تم تقسيم خلايا HEK293 قبل يوم تعداء وكانت 70-80 ٪ متكدسة في يوم تعداء. تم استبدال وسط الثقافة DMEM بوسط الثقافة العصبية (Neurobasal يحتوي على 1 × B27 و 0.5 مل مل - الجلوتامين) قبل تعداء العدوى. لكل قارورة T75 ، تم استخدام 10 ميكروغرام من FUGW (cmv) -APP و 7.5 ميكروغرام من CMVΔ8.9 و 5 ميكروغرام من بلازميد pVSVG للترنس. بعد ستين ساعة من تعداء العدوى ، تم جمع المادة الطافية وتصفيتها باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر ، وتم تقطيعها وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية. أُصيبت الخلايا العصبية الحُصَينية بعد يوم واحد من الطلاء باستخدام طاف فيروسي غير مركز (∼50-100 ميكرولتر / مل). بعد خمسة إلى ستة أيام ، تمت زراعة نصف الخلايا العصبية المصابة مع خلايا HEK293 التي تعبر عن APP و GFP كما هو موضح أعلاه. تم تحديد الخلايا العصبية والمحاور العصبية التي تعبر عن APP بواسطة مضان GFP. تم استخدام النصف الآخر لتحليل اللطخة الغربية لتعبير APP باستخدام الجسم المضاد لـ APPc.

النشاف الغربي و biotinylation.

تم تجانس عينات دماغ الفأر أو الحبل الشوكي أو العضلات أو الخلايا العصبية المستزرعة أو خلايا HEK293 باستخدام محلول تحلل RIPA (1 ٪ NP-40 ، 50 مم تريس ، درجة الحموضة 8.0 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، 0.5 ٪ ديوكسيكولات الصوديوم ، 0.1 ٪ SDS ، 2 مم EDTA) يحتوي على خليط مثبطات الأنزيم البروتيني الكامل (روش). بعد ثلاث مجموعات من 10 نبضات صوتنة ، تم غزل المتجانسات عند 14000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام Bio-Rad DC Protein Assay. تم تحميل عشرة ميكروغرامات من البروتين على هلام SDS-PAGE بنسبة 10 ٪ عند 100 فولت لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز (Bio-Rad) عند 100 فولت لمدة ساعة واحدة. تم حظر الأغشية لمدة ساعة واحدة باستخدام 5٪ حليب جاف خالي الدسم في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ توين 20 (PBS-Tween) (Sigma-Aldrich). تم إجراء حضانة الأجسام المضادة الأولية في 5 ٪ حليب في PBS-Tween. بعد ثلاث غسلات باستخدام PBS-Tween ، تم تطبيق الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة باستخدام 5 ٪ من الحليب في PBS-Tween متبوعًا بثلاث غسالات إضافية باستخدام PBST. تم تصور العصابات باستخدام نظام Immobilon Western ECL (Millipore).

من أجل biotinylation للبروتينات السطحية ، تم نقل خلايا HEK293 بشكل عابر باستخدام بنيات APP. تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني بارد مثلج يحتوي على 1.0 مل MgCl2 و 0.1 م كاكل2 (PBS / Ca-Mg) وتعامل مع sulfo-NHS-SS-biotin (1.5 مجم / مل بيرس) لمدة ساعة على الجليد في PBS / Ca-Mg. تمت إزالة الكواشف Biotinylating عن طريق الحضانة مع بارد 100 م جليكاين في PBS / Ca-Mg لمدة 30 دقيقة ، تليها ثلاث غسلات باستخدام PBS / Ca-Mg بارد. تم بعد ذلك تحلل الخلايا في محلول تحلل 1٪ CHAPS (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- بروبان سلفونات) يحتوي على 50 متر مكعب من Tris و pH 7.4 و 150 mm NaCl ومثبطات الأنزيم البروتيني (Roche). تم فصل البروتينات المعالجة بالبيوتينيلات والبروتينات غير المشبعة بالبيوتين عن طريق الحضانة باستخدام حبة Ultralink-Neutravidin (بيرس) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. خضعت العينات لتحليل اللطخة الغربية كما هو موضح أعلاه.


أساسيات انتقال متشابك الجلوتامات في الجهاز العصبي المركزي

AMPAR: النوع الرئيسي من مستقبلات الغلوتامات الذي يتوسط انتقالًا متشابكًا مثيرًا سريعًا. كما يشير الاسم ، يتم تنشيطه بشكل انتقائي بواسطة ناهض α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate. يصف بعض المؤلفين هذا المستقبل على أنه مستقبل AMPA / kainate ، حيث يتم تنشيطه أيضًا بواسطة kainate. على عكس الردود على AMPA والغلوتامات ، فإن أولئك الذين يجب أن يكونوا kainate لا يزيلون الحساسية. منذ عدة سنوات تمت الإشارة إلى هذا المستقبل باسم "مستقبل quisqualate" ولكن تمت إعادة تسميته لأن quisqualate تبين أنه ناهض غير انتقائي ، كما أنه ينشط الفئة 1 mGluRs.

نقاش متقاطع: عندما يتم تحرير جهاز الإرسال في وقت واحد في مواقع متقاربة ، ينبض جهاز الإرسال في تلخيص الشق المشبكي. قد يؤدي هذا إلى تباطؤ في تخليص جهاز الإرسال ، مما قد يؤدي إلى إطالة أمد تيار ما بعد المشبكي.

التعطيل: إغلاق قنوات AMPAR بعد إزالة الناهض.

إزالة التحسس: إغلاق قنوات AMPAR في ظل استمرار وجود الناهض ، والذي يكون أبطأ بثلاثة أضعاف تقريبًا من التعطيل. على الرغم من أن إزالة التحسس هي خاصية عامة للقنوات الأيونية المترابطة ، إلا أنها سريعة بشكل خاص بالنسبة لـ AMPARs.

تم استحضار EPSC: استحثاث EPSC عن طريق تحفيز الخلايا العصبية قبل المشبكية. إذا تم تحفيز خلية عصبية واحدة (على سبيل المثال ، في تكوين تسجيل مزدوج) ، فسيتم الإشارة إلى EPSC على أنها "أحادية". إذا تم تحفيز العديد من الخلايا العصبية قبل المشبكية (عن طريق التحفيز خارج الخلية للمسالك المحورية) ، فسيتم الإشارة إلى EPSC باسم "مركب".

EPSC ، الكمي: EPSC الناتج عن إطلاق محتويات حويصلة متشابكة واحدة. تم تقديم مصطلح "الكم" من قبل برنارد كاتز للأحداث عند التقاطع العصبي العضلي ، ويستخدم أيضًا في المشابك الجلوتاماتيكية. تتمثل إحدى طرق عزل الأحداث الكمية في تسجيل EPSCs المستحث في ظروف احتمالية إطلاق منخفضة. يتمثل النهج البديل في تسجيل EPSCs المصغر ، أي EPSCs التي تحدث تلقائيًا بعد قمع النشاط المحتمل للعمل قبل المشبكي (مع tetrodotoxin و / أو حاصرات قنوات Ca 2+ ذات الجهد الكهربائي).

فشل: تُظهر EPSCs المستحثة تقلبًا إحصائيًا في سعة الذروة من تجربة إلى أخرى. من حين لآخر ، لا تثير إمكانات العمل قبل المشبكي EPSC في الخلايا العصبية بعد المشبكية على الإطلاق. يُشار إلى هذا على أنه فشل في الإرسال المتشابك.

GluR-A to -D: الوحدات الفرعية AMPAR المحددة بواسطة الاستنساخ الجزيئي. في التسمية البديلة ، يشار إلى هذه الوحدات الفرعية باسم GluR1 إلى 4. تتكون كل وحدة فرعية من

900 من الأحماض الأمينية (تحديد التسلسل بين الوحدات الفرعية

70٪). يُعتقد أن كل وحدة فرعية لها أربعة أجزاء غشائية (ثلاثة أجزاء غشائية وحلقة تشكل المسام المائي). يبدو أن القناة الوظيفية عبارة عن قلة قليلة مجمعة من أربع أو خمس وحدات فرعية.

Flip ، Flop: متغيرات الوحدة الفرعية AMPAR الناتجة عن الربط البديل لوحدة الوجه / التقليب. تتكون هذه الوحدة من 115 زوجًا أساسيًا (المقابلة لـ 38 من الأحماض الأمينية ، 9-11 منها مختلفة بين متغيرات الوجه والتخبط).

تحرير RNA: شكل من أشكال التعديل اللاحق للنسخ لـ AMPAR RNA ، اكتشفه Peter Seeburg وزملاؤه. يُعتقد أن تحلية الأدينوزين إلى إينوزين هي الآلية الجزيئية الأساسية. تم تحديد موقعين للتحرير لوحدة AMPAR الفرعية mRNA: موقع Q / R في منطقة تشكيل المسام للوحدة الفرعية GluR-B وموقع R / G الذي يسبق وحدة التقليب / التقليب في GluR-B و -C و- الوحدات الفرعية د. يغير تحرير موقع Q / R نفاذية Ca 2+ لـ AMPARs بأكثر من ترتيب من حيث الحجم ، بينما يشارك تحرير موقع R / G في الضبط الدقيق لبوابة AMPAR.

تسهيل النبضة المزدوجة أو الاكتئاب: عندما يتم استنباط إمكانات عمل في خلية عصبية ما قبل المشبكية ، مفصولة بفاصل زمني قصير ، قد يتم تعزيز أو تقليل سعة EPSC الثاني مقارنةً بالأول ، اعتمادًا على نوع المشبك واحتمال الإطلاق. يبدو أن تعديل النبضة المزدوجة يتم إنشاؤه بشكل أساسي عن طريق آليات ما قبل المشبكي ، ولكن عوامل ما بعد المشبك (مثل إزالة التحسس) قد تساهم أيضًا في بعض نقاط الاشتباك العصبي.

كثافة ما بعد المشبكي: موقع متخصص بعد المشبكي كثيف الإلكترون والذي يفترض أنه يحتوي على مستقبلات جهاز الإرسال.

موقع الإطلاق: موقع متخصص قبل المشبكي حيث يُعتقد أن اندماج الحويصلة يحدث.

العمود الفقري: نتوء صغير يشبه الشوكة للغشاء التغصني ، والذي قد يخدم الغرض من زيادة مساحة السطح وإنتاج التجزئة. في الحصين والقشرة المخية الحديثة ، تتشكل نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاماتي بين الخلايا العصبية الرئيسية بشكل أساسي على العمود الفقري ، بينما يتم إنشاء المشابك العصبية الرئيسية للخلايا العصبية الداخلية على أعمدة شجرية (تفتقر الخلايا العصبية الداخلية المثبطة بشكل مميز إلى العمود الفقري). قد تؤخر أعناق العمود الفقري الضيقة هروب الغلوتامات من الشق المشبكي.

التأخير المشبكي: الفاصل الزمني من النقطة الأكثر انحدارًا في المرحلة الصاعدة لإمكانات الفعل قبل المشبكي (المسجلة بالقرب من موقع الإطلاق) إلى بداية EPSC المستحث.

أشكر الدكاترة. J.R P. Geiger، K. Haverkampf، and B. Taskin لإجراء مناقشات مفيدة.

يستند هذا الاستعراض إلى محاضرة ألقيت في لشبونة في مارس 1998 بمناسبة أول جائزة من جائزة Medinfar الأوروبية في علم وظائف الأعضاء.

يتم دعم دراستي من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft ، والمؤسسة الألمانية الإسرائيلية ، ومنظمة برنامج Human Frontiers Science Program.

يؤسفني أنه لا يمكن الاستشهاد بالعديد من الأوراق ذات الصلة بسبب القيود التحريرية المفروضة على الحد الأقصى لعدد المراجع.


شاهد الفيديو: Introduction to the Nervous System. لمحة عن الجهاز العصبي (ديسمبر 2022).