معلومة

خصائص تفاعل البلمرة المتسلسل

خصائص تفاعل البلمرة المتسلسل


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أثناء استعراض PCR في محاضرة علم الأحياء هذا الأسبوع ، صادفت بعض الأسئلة التي لدي حول هذه العملية.

أولاً ، نظرًا لأن PCR يركز على محاولة تكرار تسلسل DNA محدد مستهدف عدة مرات في فترة زمنية قصيرة ، فهل تستخدم البادئات في كل دورة نفس التسلسل؟ أفهم أن البادئات الأمامية والعكسية لن تكون هي نفسها ولكن التمهيدي الأمامي لخيط واحد في دورة واحدة ، هل سيكون هو نفسه التمهيدي الأمامي لشريط ابنة لنفترض الدورة الثامنة؟

ثانيًا ، لماذا لا يمكن إعادة استخدام البرايمر في دورات مختلفة؟ أعتقد أن هذا سيستند إلى إجابة سؤالي الأول. إذا كان التمهيدي نكون في الأساس نفس التسلسل ، لماذا يجب استخدام بادئات جديدة لكل دورة؟

شكرا لكم مقدما!


هل البادئات المستخدمة في كل دورة بنفس التسلسل؟

نعم فعلا. تضع التفاعل بالكامل على جهاز التدوير الحراري ، ثم تبتعد حتى تكتمل جميع الدورات.

ولكن يمكن للمرء أن يقوم بجولة ثانية من PCR باستخدام مواد أولية داخلية مختلفة على منتج PCR الأول ، إذا أردت.

ثانيًا ، لماذا لا يمكن إعادة استخدام البرايمر لدورات مختلفة؟

هل تسأل لماذا لا يمكنك وضع 10 جزيئات من البرايمر الأمامي والحصول على مليون جزيء منتج من ذلك؟

يتم دمج كل جزيء من مادة التمهيدي التي يتم استخدامها كقالب تمديد في حامل كامل لمنتج PCR. إنه ليس برايمر بعد الآن.


تم دمج البرايمر في بداية الخصلة الجديدة. عدد خيوط الحمض النووي المنتجة محدود بعدد البادئات.


طريقة PCR حساسة للغاية ، ولا تتطلب سوى عدد قليل من جزيئات الحمض النووي في تفاعل واحد للتضخيم عبر عدة أوامر من حيث الحجم. لذلك ، يلزم اتخاذ تدابير كافية لتجنب التلوث من أي DNA موجود في بيئة المختبر (البكتيريا أو الفيروسات أو المصادر البشرية). نظرًا لأن المنتجات من تضخمات PCR السابقة هي مصدر شائع للتلوث ، فقد نفذت العديد من مختبرات البيولوجيا الجزيئية إجراءات تتضمن تقسيم المختبر إلى مناطق منفصلة. [1] منطقة معمل واحدة مخصصة لتحضير ومعالجة الكواشف السابقة لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ومنطقة أخرى لمعالجة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل الرحلان الكهربي للهلام أو تنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل. لإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تتضمن العديد من إجراءات التشغيل القياسية استخدام ماصات مع أطراف مرشح وارتداء قفازات معملية جديدة ، وفي بعض الحالات خزانة تدفق صفائحية مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية كمحطة عمل (لتدمير أي تكوين خارجي متعدد المضاعفات). يتم تقييم تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل روتيني مقابل تفاعل تحكم سلبي يتم إعداده بشكل مماثل لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل التجريبي ، ولكن بدون قالب DNA ، ويتم إجراؤه جنبًا إلى جنب مع تفاعل البوليميراز المتسلسل التجريبي.

يمكن أن تؤدي الهياكل الثانوية في الحمض النووي إلى طي أو عقد قالب أو بادئات الحمض النووي ، مما يؤدي إلى انخفاض إنتاجية المنتج أو فشل التفاعل. دبابيس الشعر ، التي تتكون من طيات داخلية ناتجة عن الاقتران الأساسي بين النيوكليوتيدات ، وهي تكرارات مقلوبة داخل الحمض النووي أحادي الجديلة ، وهي هياكل ثانوية شائعة وقد تؤدي إلى فشل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

عادةً ما يتم استخدام التصميم التمهيدي الذي يتضمن فحصًا للهياكل الثانوية المحتملة في البادئات ، أو إضافة DMSO أو الجلسرين إلى PCR لتقليل الهياكل الثانوية في قالب الحمض النووي ، [2] في تحسين PCRs التي لها تاريخ من الفشل بسبب دبابيس الشعر المشتبه بها الحمض النووي.

يفتقر Taq polymerase إلى نشاط نوكلياز خارجي من 3 إلى 5. وبالتالي ، ليس لدى Taq نشاط قراءة مقاوم للخطأ ، والذي يتكون من استئصال أي قاعدة نيوكليوتيدات مدمجة حديثًا من خيط DNA الناشئ (أي الممتد) الذي لا يتطابق مع قاعدته المعاكسة في خيط الحمض النووي التكميلي. ينتج عن النقص في 3 إلى 5 من التدقيق اللغوي لإنزيم Taq معدل خطأ مرتفع (طفرات لكل نيوكليوتيد في كل دورة) تقريبًا 1 من 10000 قاعدة ، مما يؤثر على دقة PCR ، خاصةً إذا حدثت أخطاء في وقت مبكر من PCR مع كميات منخفضة من مادة البدء ، مما يتسبب في تراكم نسبة كبيرة من الحمض النووي المتضخم مع تسلسل غير صحيح في المنتج النهائي. [3]

العديد من بوليمرات الدنا "عالية الدقة" ، التي صممت نشاط نوكلياز خارجي يتراوح من 3 إلى 5 ، أصبحت متاحة مما يسمح بتضخيم أكثر دقة لاستخدامه في تفاعلات البوليميراز المتسلسل لتسلسل المنتجات أو استنساخها. تتضمن أمثلة البوليميرات ذات نشاط نوكلياز خارجي يتراوح من 3 إلى 5 درجات: بوليميراز DNA KOD ، وهو شكل مؤتلف من ثيرموكوكوس كوداكاراينسيس KOD1 Vent ، والتي يتم استخلاصها من المكورات الحرارية litoralis بوليميريز الحمض النووي Pfu ، والذي يتم استخراجه من Pyrococcus furiosus و Pwo ، المستخرج من Pyrococcus woesii. [4]

المغنيسيوم مطلوب كعامل مساعد لبوليميراز DNA القابل للحرارة. إن بوليميريز Taq هو إنزيم يعتمد على المغنيسيوم ، ويعد تحديد التركيز الأمثل لاستخدامه أمرًا بالغ الأهمية لنجاح تفاعل PCR. [5] يمكن لبعض مكونات خليط التفاعل مثل تركيز القالب و dNTPs ووجود عوامل مخلبية (EDTA) أو البروتينات أن تقلل من كمية المغنيسيوم الحر الموجود وبالتالي تقليل نشاط الإنزيم. [6] يتم تثبيت المواد الأولية التي ترتبط بمواقع القوالب غير الصحيحة في وجود تركيزات مفرطة من المغنيسيوم وبالتالي ينتج عنها انخفاض نوعية التفاعل. تعمل تركيزات المغنيسيوم الزائدة أيضًا على استقرار الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل وتمنع التشوه الكامل للحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل مما يقلل من إنتاجية المنتج. [5] [6] إذابة غير كافية من MgCl2 قد يؤدي إلى تكوين تدرجات تركيز داخل محلول كلوريد المغنيسيوم المزود ببوليميراز الحمض النووي ويساهم أيضًا في العديد من التجارب الفاشلة. [6]

يعمل PCR بسهولة مع قالب DNA يصل طوله إلى 2000 زوج قاعدي. ومع ذلك ، فوق هذا الحجم ، غالبًا ما تنخفض غلة المنتج ، كما هو الحال مع زيادة طول التأثيرات العشوائية مثل الإنهاء المبكر بواسطة البوليميراز التي تبدأ في التأثير على كفاءة PCR. من الممكن تضخيم قطع أكبر تصل إلى 50000 زوج قاعدي مع دورة تسخين أبطأ وبوليمرات خاصة. هذه عبارة عن بوليميرات مدمجة في بروتين مرتبط بالحمض النووي المعزز للمعالجة ، مما يعزز التزام البوليميراز بالحمض النووي. [7] [8]

تشمل الخصائص القيمة الأخرى للبوليميرات الخيمرية TopoTaq و PfuC2 تعزيز الثبات الحراري والخصوصية والمقاومة للملوثات والمثبطات. [9] [10] تم تصميمها باستخدام نطاقات ربط الحمض النووي الحلزوني - اللولبي - الحلزون الفريد (HhH) من توبويزوميراز V [11] من محبي الحرارة Methanopyrus kandleri. تتغلب البوليمرات الكيميرية على العديد من قيود الإنزيمات الأصلية وتستخدم في تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر من مزارع الخلايا وحتى عينات الطعام ، وبالتالي تجاوز خطوات عزل الحمض النووي الشاقة. يساعد نشاط إزاحة حبلا قويًا لبوليميراز TopoTaq الهجين في حل مشاكل تفاعل البوليميراز المتسلسل التي يمكن أن تسببها دبابيس الشعر واللوالب المزدوجة المحملة بـ G. تتميز الحلزونات ذات المحتوى العالي من G-C بدرجة حرارة انصهار أعلى ، مما يؤدي غالبًا إلى إعاقة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اعتمادًا على الظروف. [12]

يحدث الربط غير النوعي للبادئات بشكل متكرر وقد يحدث لعدة أسباب. يتضمن ذلك تسلسلات متكررة في قالب الحمض النووي ، أو ربط غير محدد بين التمهيدي والقالب ، أو محتوى G-C مرتفع أو منخفض في القالب ، أو ربط تمهيدي غير مكتمل ، تاركًا الطرف 5 'من التمهيدي غير متصل بالقالب. الربط غير النوعي للبادئات المتدهورة شائع أيضًا. يمكن استخدام معالجة درجة حرارة التلدين وتركيز أيون المغنيسيوم لزيادة النوعية. على سبيل المثال ، قد تمنع التركيزات المنخفضة من المغنيسيوم أو الكاتيونات الأخرى تفاعلات التمهيدي غير المحددة ، وبالتالي تمكين تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الناجح. إن إنزيم بوليميراز "البدء الساخن" الذي يتم إعاقة نشاطه ما لم يتم تسخينه إلى درجة حرارة عالية (على سبيل المثال ، 90-98 درجة مئوية) أثناء خطوة تغيير طبيعة الدورة الأولى ، يستخدم بشكل شائع لمنع التحضير غير النوعي أثناء تحضير التفاعل عند درجات حرارة منخفضة. تتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الذي يتم تشغيله على الساخن بوساطة كيميائية درجات حرارة أعلى وأوقات حضانة أطول لتنشيط البوليميراز ، مقارنةً بالأجسام المضادة أو تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات البدء الساخن القائمة على الأبتامر. [ بحاجة لمصدر ]

تشمل الطرق الأخرى لزيادة الخصوصية Nested PCR و Touchdown PCR.

يمكن إجراء محاكاة الكمبيوتر لنتائج PCR النظرية (Electronic PCR) للمساعدة في تصميم التمهيدي. [13]

تفاعل البلمرة المتسلسل أو تفاعل البلمرة المتسلسل هو طريقة تفاعل البلمرة المتسلسل التي من خلالها سوف تتجنب البادئات تضخيم التسلسلات غير المحددة. تحدد درجة حرارة التلدين أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل خصوصية التلدين التمهيدي. تحدد درجة انصهار البرايمر الحد الأعلى لدرجة حرارة التلدين. في درجات حرارة أقل بقليل من هذه النقطة ، سيحدث فقط اقتران أساسي محدد جدًا بين التمهيدي والقالب. في درجات الحرارة المنخفضة ، ترتبط المواد الأولية بشكل أقل تحديدًا. يحجب الارتباط التمهيدي غير المحدد نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، حيث أن التسلسلات غير المحددة التي تصلب فيها البادئات في الخطوات المبكرة للتضخيم سوف "تطغى" أي متواليات محددة بسبب الطبيعة الأسية لتضخيم البوليميراز.

الخطوات الأولى لدورة تفاعل البوليميراز المتسلسل لها درجات حرارة تلدين عالية. يتم تقليل درجة حرارة التلدين بزيادات لكل مجموعة لاحقة من الدورات (يتم اختيار عدد الدورات الفردية والزيادات في انخفاض درجة الحرارة من قبل المجرب). سوف يتحلل التمهيدي عند أعلى درجة حرارة والتي تكون أقل سماحًا للربط غير المحدد الذي يمكنه تحمله. وبالتالي ، فإن التسلسل الأول الذي تم تضخيمه هو التسلسل بين المناطق ذات خصوصية التمهيدي الأكبر ، ومن المرجح أن يكون هذا هو تسلسل الاهتمام. سيتم تضخيم هذه الأجزاء بشكل أكبر خلال الجولات اللاحقة عند درجات حرارة منخفضة ، وستتنافس مع التسلسلات غير المحددة التي قد ترتبط بها البادئات عند درجات الحرارة المنخفضة. إذا كان التمهيدي في البداية (خلال مراحل درجة الحرارة المرتفعة) يرتبط بتسلسل الاهتمام ، يمكن إجراء جولات لاحقة من تفاعل سلسلة البوليميراز على المنتج لزيادة تضخيم هذه الأجزاء.

قد يؤدي تلدين الطرف 3 'من أحد التمهيدي إلى نفسه أو التمهيدي الثاني إلى تمديد التمهيدي ، مما يؤدي إلى تكوين ما يسمى ثنائيات التمهيدي ، والتي يمكن رؤيتها كأشرطة منخفضة الوزن الجزيئي على المواد الهلامية PCR. [14] غالبًا ما يتنافس تكوين ثنائي التمهيدي مع تكوين جزء الحمض النووي محل الاهتمام ، ويمكن تجنبه باستخدام البادئات المصممة بحيث تفتقر إلى التكامل - خاصة عند الأطراف الثلاثة - لنفسها أو للبادئة الأخرى المستخدمة في التفاعل. إذا كان تصميم التمهيدي مقيدًا بعوامل أخرى وإذا حدثت ثنائيات التمهيدي ، فقد تتضمن طرق الحد من تكوينها تحسين MgCl2 تركيز أو زيادة درجة حرارة التلدين في PCR. [14]

قد يربط Deoxynucleotides (dNTPs) أيونات Mg 2+ وبالتالي يؤثر على تركيز أيونات المغنيسيوم الحرة في التفاعل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي الكميات الزائدة من dNTPs إلى زيادة معدل الخطأ في بوليميراز الحمض النووي وحتى تثبيط التفاعل. [5] [6] يمكن أن يؤدي عدم التوازن في نسبة dNTPs الأربعة إلى سوء الدمج في خيط DNA المكون حديثًا ويساهم في تقليل دقة بوليميريز الحمض النووي. [15]


A. PCR - العملية الأساسية

يعتمد PCR النموذجي على معرفة بتتين من تسلسل الحمض النووي التي سيتم استخدامها لتصميم وتوليف متواليات قليلة النوكليوتيد القصيرة (القلة) في المختبر. يتم اختيار القوليغومرين ليكونا مكملين للتسلسلات المتقابلة من الحمض النووي مزدوج الشريطة الذي يحتوي على الجين المراد دراسته. نقول أن وجه القلة ، أو يعارض بعضهم البعض. هذا يعني فقط أن النهاية 3 و rsquo لقليل واحد تواجه النهاية 3 و rsquo من أوليغومر المتعارض. وبهذه الطريقة يمكن أن يعمل القليونان الاشعال لتكرار استطالة كل من خيوط تسلسل الحمض النووي المستهدف المزدوج الذين تقطعت بهم السبل. تحقق من الرابط أدناه لمزيد من التوضيح.

تتمثل الخطوة الأولى في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في إضافة بادئات قليلة القسيمات إلى الحمض النووي المستهدف الذي من خلاله يتم تضخيم الجين (أو تسلسل جينومي آخر). ثم يسخن الخليط لإفساد الحمض النووي المستهدف. يتم تبريد الخليط للسماح للبادئات برابطة H لتكملة خيوط الحمض النووي المستهدفة. بعد ذلك ، تتم إضافة سلائف ديوكسينوكليوتيد الأربعة للحمض النووي (dATP و dCTP و dTTP و dGTP) جنبًا إلى جنب مع كمية صغيرة من بوليميريز الحمض النووي. سيتم الآن إطالة خيوط الحمض النووي الجديدة من البادئات قليلة النوكليوتيد الموجودة في قوالب الحمض النووي. لصنع الكثير من منتج PCR ، يجب تكرار دورة التفاعل هذه عدة مرات. لذلك ، بعد السماح بالاستطالة ، يتم تسخين الخليط لإفساد (فصل) جميع خيوط الحمض النووي. عندما يتم تبريد الخليط مرة أخرى ، تجد الأوليغومرات مرة أخرى متواليات تكميلية للرابطة H. اعتمدت الإصدارات المبكرة من PCR في الأصل على ملف بكتريا قولونية بوليميريز الحمض النووي ، الذي يتم تعطيله عن طريق التسخين ، وبالتالي يجب إعادة إضافته إلى خليط PCR لكل دورة استطالة. تمامًا كما هو الحال مع تسلسل الحمض النووي ، تحول الباحثون بسرعة كبيرة إلى استقرار الحرارة طاق بوليميراز، من Thermus aquaticus. إنزيمات T. aquaticus تظل نشطة في درجات الحرارة العالية جدًا التي تعيش فيها هذه الكائنات الحية. لأن التسخين لا يدمر Taq polymerase في المختبر، يمكن أتمتة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل تفاعلات تسلسل الحمض النووي ، مع برمجة المبردات الحرارية التي ترفع وخفض درجة الحرارة التي تتطلبها تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل. لم تعد هناك حاجة لتجديد بوليميريز الحمض النووي بمجرد بدء دورات التفاعل. يتم توضيح المعالجة الحرارية في تضخيم PCR النموذجي أدناه لأول دورتين من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والثانية تنتج أول خيوط من الحمض النووي التي سيتم تضخيمها بالفعل بشكل كبير.

يمكنك أن ترى من الرسم التوضيحي أن الدورة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل قد ولّدت شريطين من الحمض النووي اللذين سيكونان قوالب لمضاعفة وإعادة مضاعفة المنتج المطلوب بعد كل دورة لاحقة. قد يتضمن تفاعل PCR النموذجي 30 دورة PCR ، مما يؤدي إلى تضخيم أسي تقريبًا للتسلسل المطلوب.

بدءًا من زوج من جزيئات الحمض النووي المستهدفة التكميلية (بعد دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الثالثة) ، كم عدد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المزدوجة التي تقطعت بها السبل يجب أن تمتلكها نظريًا في نهاية كل دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل الثلاثين؟

المنتجات المكبرة لمنتجات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بكثرة بحيث يمكن رؤيتها بسهولة تحت إضاءة الفلورسنت على هلام الاغاروز الملون ببروميد الإيثيديوم (أدناه).

في هذا الهلام ، يحتوي الممر الأول (على اليسار) على a سلم الحمض النووي، خليط من الحمض النووي بأطوال معروفة يمكن استخدامه لتقدير حجم شظايا PCR في الممرات الثالثة والرابعة (الممر الهلامي بجوار السلم فارغ). النطاقان اللامعان في الممرات 3 و 4 عبارة عن نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تم إنشاؤها باستخدام زوجي أوليجومير مختلفين. يمكن إجراء تسلسل الحمض النووي المضخم للـ PCR واستخدامه في العديد من الدراسات اللاحقة.


تضخيم الجينوم الكامل (WGA)

تحتوي معظم الخلايا على نسخة واحدة أو بضع نسخ من الجينوم الخاص بها ، مما يشكل picograms من الحمض النووي ، وهو ما لا يكفي للتحليل المباشر باستخدام تقنيات التسلسل الحالية. يتطلب فحص الحمض النووي للخلية الواحدة من أجل التشخيص ، والذي قد يتطلب تجارب متعددة مع عينة محدودة ، تضخيمًا سريعًا غير متحيز للحمض النووي. يشكل البحث عن الحمض النووي القديم ، والذي غالبًا ما يكون مجزأًا ، نوعًا آخر من التحدي. هذه هي المجالات التي تستخدم فيها تقنية التضخيم متساوي الحرارة لزيادة مادة الحمض النووي اللازمة لتحليل المصب.

لزيادة كمية أهداف الحمض النووي المحدودة ، فإن تضخيم الجينوم الكامل متساوي الحرارة (WGA) هو الأسلوب الأكثر فعالية. [3] هذا مفيد بشكل خاص في أبحاث الأمراض الوراثية ، حيث يتطلب الأمر العديد من التكرارات. يتم استخدام الحمض النووي المضخم بواسطة WGA في تسلسل الجيل التالي ، وتسلسل Sanger ، والتنميط الجيني باستخدام المصفوفات الدقيقة ، والتنميط الجيني متعدد الأشكال للنيوكليوتيدات الفردية (SNP). تم تطوير تقنيات WGA المختلفة التي تختلف في بروتوكولاتها وسهولة استخدامها.

Phi29 DNA polymerase هو الإنزيم الرئيسي المفضل لـ WGA. تقدم Thermo Scientific أيضًا ملف تحسين EquiPhi29 DNA polymerase، وهو متحور Phi29 DNA بوليميريز تم تطويره من خلال في المختبر تطور البروتين. [5] يتفوق هذا الإنزيم بشكل كبير على Phi29 في ثبات البروتين بالحرارة وسرعة التفاعل وإنتاجية المنتج وتحيز التضخيم. علاوة على ذلك ، فإنه يحتفظ بجميع فوائد الإنزيم من النوع البري ، بما في ذلك المعالجة العالية (حتى 70 كيلو بايت) ، ونشاط إزاحة الخيوط القوية ، ونشاط نوكلياز خارجي (تصحيح التجارب المطبعية) 3'-5 '. لهذا السبب ، يوصى باستخدام مواد أولية عشوائية مقاومة للأكسو. الجدول 3 يقارن Phi29 الكلاسيكي و EquiPhi29 polymerases DNA.

الجدول 3. مقارنة Phi29 و EquiPhi29 DNA polymerases مع البيانات الداعمة.

Phi29- نوع DNA PolymerasesEquiPhi29 DNA Polymerase
العملية / إزاحة حبلاعالية (حتى 70 كيلوبايت)عالية (حتى 70 كيلوبايت)
درجة حرارة التضخيم الأمثل30-37 درجة مئوية42-45 درجة مئوية
وقت رد الفعلبطيء - حتى 12 ساعةبطيء - حتى 3 ساعات
التدقيق اللغوي3'-5 '(معدلات خطأ منخفضة)3'-5 '(معدلات خطأ منخفضة)
صحةعالية (معدلات خطأ منخفضة)عالية (معدلات خطأ منخفضة)
أثمرعاليعالي جدا
انحياز التسلسل (تفضيل)تضخيم منخفض متحيز وموحد للشظايا الطويلة (الجينوم الكامل)انحياز منخفض جدًا ، بما في ذلك GC و AT rich (البيانات صالحة لمواد البدء 0.5 نانوغرام)

كيف يعمل PCR؟

يحاكي تفاعل البوليميراز المتسلسل ما يحدث في الخلايا عندما يتم نسخ (نسخ) الحمض النووي قبل انقسام الخلية ، ولكن يتم تنفيذه في ظروف خاضعة للرقابة في المختبر. الآلة المستخدمة تسمى ببساطة آلة PCR أو جهاز التدوير الحراري. يتم وضع أنابيب الاختبار التي تحتوي على خليط الحمض النووي محل الاهتمام في الجهاز ، ويقوم الجهاز بتغيير درجة الحرارة لتناسب كل خطوة من خطوات العملية.

المكونات القياسية في الخليط هي:

  • الجزء المتعلق بالحمض النووي موضع الاهتمام
  • بادئات محددة
  • إنزيم بوليميراز DNA المقاوم للحرارة
  • الأنواع الأربعة المختلفة من نيوكليوتيدات الحمض النووي
  • الأملاح اللازمة لخلق بيئة مناسبة للإنزيم للعمل.

تفاعل البلمرة المتسلسل

تسمح التقنية المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية ، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للعلماء بعزل وتوصيف وإنتاج كميات كبيرة من قطع معينة من الحمض النووي من كميات صغيرة جدًا من مادة البداية. يتم نسخ قطعة معينة من الحمض النووي بشكل متكرر ، مما يؤدي إلى تضخيم هائل لمواد البداية التي لا يمكن اكتشافها لولا ذلك. تم تطوير هذه التقنية في عام 1983 من قبل عالم الكيمياء الحيوية الأمريكي كاري بي موليس ، الحائز على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993 لاختراعه. أحدثت التطبيقات العملية لـ PCR ثورة في علم الأحياء. بحلول عام 1990 ، تم استخدام هذه التقنية لتشخيص الأمراض الوراثية قبل الولادة وبعدها ، والأمراض المعدية (مثل الإيدز) ، والسرطان وللمساعدة في التوفيق بين متلقي الزرع والمتبرعين. تم استخدام PCR في مشروع الجينوم البشري. كما أنها تستخدم لدراسة التاريخ الوراثي البشري وتطور الأنواع وتساعد علماء الطب الشرعي ببصمة الحمض النووي.


تفاعل البلمرة المتسلسل

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو أداة رئيسية في البيولوجيا الجزيئية التي تسمح بالتكرار السريع للحمض النووي. إنه يسمح بتكرار سريع ودقيق للحمض النووي من جودة منخفضة ، ومع ذلك ، فإنه يتطلب معرفة المنطقة المستهدفة وتسلسلها ويمكنه تكرار الجينومات الأخرى إذا كانت ملوثات.

تم تأسيس هذه التقنية من قبل كاري موليس في الثمانينيات ، ويقال أنه تصور الفكرة أثناء رحلة تخييم.

onlinebiologynotes.com

تمسخ & # 8211 عادة 1 دقيقة

لبدء التفاعل ، يجب أولاً تغيير طبيعة الحمض النووي & # 8211 يتم ذلك حول 94-96 درجةج & # 8211 يقوم هذا بفك ضغط الحمض النووي ، مما يعني أن الحمض النووي الغني لـ G-C سوف & # 8220 يلتصق & # 8221 معًا لفترة أطول من الحمض النووي الغني بـ A-T. عند هذه الدرجة ، يلزم وجود بوليميراز جرثومي من الينابيع الساخنة. يبلغ عمر نصف عمر البلمرة البكتيرية الحرارية (Taq) 1.6 ساعة عند 95 درجةج. هذا يعني أنه يمكنه تحمل درجة الحرارة المرتفعة هذه ويظل نشطًا في الكلمة الختامية # 8217s إذا حدث لفترة قصيرة من الزمن.

تعني خطوة البداية هذه أنه يمكننا استخدام حمض نووي منخفض الجودة.

التلدين & # 8211 عادة 1 دقيقة

عادة ما تكون المواد الأولية أطول ثم أو تساوي 18 نيوكليوتيد ، ويجب أن تكون درجة حرارة انصهار خيط الحمض النووي والبادئة قريبة وقريبة من منطقة الاهتمام التي نرغب في تطبيقها.

أثناء مرحلة التلدين ، يرتبط التمهيدي بالحمض النووي ، ولهذا السبب تنخفض درجة الحرارة إلى 60 درجةج.

استطالة & # 8211 عادة 1 دقيقة

الاستطالة هي التي تسمح لنا بمضاعفة الحمض النووي في كل جولة لاحقة. تمت إضافة dNTP & # 8217s بترتيب 5 & # 8242 إلى 3 & # 8242 بواسطة Taq Polymerase. درجة الحرارة المثلى لـ Taq polymerase هي 72 درجةج، مما يسمح لها بإضافة ما يقرب من 1000 قاعدة في الدقيقة إلى حبلا DNA. لذلك ، يتم إجراء التفاعل عند 72 درجةج.

غالبًا ما يتكرر هذا التسلسل من 30 إلى 40 مرة اعتمادًا على مقدار تضخيم الحمض النووي المطلوب.

اشرح اختيار درجة الحرارة المحددة لكل مرحلة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

حدد المواد المتفاعلة المطلوبة لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وما هي وظائفها.


إجراء PCR

التهيئة

هذه الخطوة ضرورية فقط لبوليميرات الحمض النووي التي تتطلب بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يسخن التفاعل إلى ما بين 94 و 96 درجة مئوية ويبقى لمدة 1-9 دقائق.

تمسخ

إذا كان الإجراء لا يتطلب التهيئة ، فإن الخطوة الأولى هي تمسخ الصفات. يسخن التفاعل إلى 94-98 درجة مئوية لمدة 20-30 ثانية. تتعطل الروابط الهيدروجينية لقالب الحمض النووي ويتم إنشاء جزيئات DNA أحادية السلسلة.

التلدين

تنخفض درجة حرارة التفاعل إلى ما بين 50 و 65 درجة مئوية وتبقى لمدة 20-40 ثانية. تصلب البادئات إلى قالب الحمض النووي أحادي الخيط. درجة الحرارة مهمة للغاية خلال هذه الخطوة. إذا كان الجو حارًا جدًا ، فقد لا يلتصق البرايمر. إذا كان الجو باردًا جدًا ، فقد يتماسك البرايمر بشكل غير كامل. يتم تكوين رابطة جيدة عندما يتطابق تسلسل التمهيدي مع تسلسل القالب.

التمديد / الاستطالة

تختلف درجة الحرارة خلال هذه الخطوة حسب نوع البوليميراز. يقوم بوليميراز الحمض النووي بتخليق خيط DNA جديد تمامًا.

استطالة نهائية

يتم تنفيذ هذه الخطوة عند 70-74 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة بعد دورة PCR النهائية.

عقد نهائي

هذه الخطوة اختيارية. يتم الاحتفاظ بدرجة الحرارة عند 4-15 درجة مئوية ويقضي على التفاعل.


تفاعل البلمرة المتسلسل

في المختبر وسائل تضخيم كبير لنسخ معينة الحمض النووي شرائح ، ما يصل إلى عدد قليل كيلوباس في الطول.

أسطورة شخصية: تفاعل البلمرة المتسلسل مثل التي تحدث في جهاز التدوير الحراري. درجات حرارة أعلى تفسد ال الحمض النووي (كما هو موضح بواسطة الأسهم) بينما تسمح درجات الحرارة المنخفضة البلمرة. بالانتقال من اليسار إلى اليمين ، تكون النتيجة حرفياً ملف زيادة أسية فى كمية من الحمض النووي الحاضر ، وإن كان على حساب واحد التمهيدي مع عدد لا يحصى dNTPs في كل جولة البلمرة. وبالتالي ، هناك حدود لمقدارها الحمض النووي يمكن إنتاجه دفعة واحدة داخل أنبوب واحد (وتميل الأنابيب إلى أن تكون صغيرة نظرًا لأنه من الأسهل تسخين وتبريد الأحجام الصغيرة مقابل الأحجام الكبيرة). لاحظ أنه كما هو موضح ، لا يمثل هذا تمثيلًا لـ هلام. بدلاً من ذلك ، يتدفق الوقت من اليسار إلى اليمين أثناء الحمض النووي يتراكم من أعلى إلى أسفل.

يمكن النظر إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل كبديل لاستنساخ الجينات كوسيلة لتضخيم الحمض النووي ، كوسيلة لزيادة كميات الحمض النووي النادرة جدًا (مثل التي يمكن العثور عليها في مسرح الجريمة أو في العظام القديمة) ، أو وسيلة لتوليد كميات كبيرة نسبيًا من الحمض النووي كمقدمة لاستنساخ الجينات.


بوليميرات الحمض النووي

تعد بوليميرات الحمض النووي من المكونات الهامة في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، حيث تقوم بتركيب الخيوط التكميلية الجديدة من قوالب الحمض النووي أحادية السلسلة. تمتلك جميع بوليمرات الحمض النووي نشاط 5 → 3 بوليميريز ، وهو دمج النيوكليوتيدات لتمديد البادئات في نهاياتها 3 في اتجاه 5 إلى 3 (الشكل 2).

في الأيام الأولى من PCR ، كان جزء Klenow من بوليميريز الحمض النووي I من بكتريا قولونية تم استخدامه لتوليد خيوط ابنة جديدة [3]. ومع ذلك، هذا بكتريا قولونية الإنزيم حساس للحرارة ويمكن تدميره بسهولة في درجات حرارة تغيير الطبيعة العالية التي تسبق خطوات التلدين والتمديد. وبالتالي ، يحتاج الإنزيم إلى التجديد في خطوة التلدين لكل دورة خلال العملية.

أثبت اكتشاف بوليميرات الحمض النووي القابل للحرارة أنه تقدم مهم ، حيث فتح فرصًا هائلة لتحسين طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال تمكين استقرار التفاعلات على المدى الطويل. واحدة من أكثر بوليمرات الحمض النووي المعروفة بالحرارة هي طق بوليميراز الدنا المعزول من الأنواع البكتيرية المحبة للحرارة Thermus aquaticus في عام 1976 [5،6]. في التقرير الأول في عام 1988 [7] ، أظهر الباحثون طق احتفاظ بوليميريز الحمض النووي بالنشاط فوق 75 درجة مئوية ، مما يجعل التدوير المستمر دون إضافة إنزيم طازج يدويًا أمرًا ممكنًا ، وبالتالي تمكين أتمتة سير العمل. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع بكتريا قولونية بوليميراز الحمض النووي ، طق أنتج بوليميراز الدنا أمبليكونات PCR أطول بحساسية وخصوصية وإنتاجية أعلى. لجميع الأسباب المذكورة أعلاه ، طق تم تسمية بوليميريز DNA "جزيء العام" من قبل المجلة علم في عام 1989 [8].

الشكل 2. بوليميراز الحمض النووي يمتد 3 نهاية التمهيدي PCR في اتجاه 5 ′ إلى 3.

بالرغم ان طق قام بوليميريز الحمض النووي بتحسين بروتوكولات PCR بشكل كبير ، ولا يزال الإنزيم يقدم بعض العيوب. طق إن بوليميراز الحمض النووي غير مستقر نسبيًا فوق 90 ​​درجة مئوية أثناء تمسخ خيوط الحمض النووي. هذا يمثل مشكلة خاصة بالنسبة لقوالب الحمض النووي ذات المحتوى العالي من GC و / أو الهياكل الثانوية القوية التي تتطلب درجات حرارة أعلى للفصل. يفتقر الإنزيم أيضًا إلى نشاط التدقيق اللغوي ، طق يمكن أن يخطئ بوليميراز الدنا في دمج النيوكليوتيدات أثناء التضخيم. عندما تكون دقة التسلسل أمرًا بالغ الأهمية ، فإن أمبليكونات PCR التي بها أخطاء ليست مرغوبة للاستنساخ والتسلسل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطبيعة المعرضة للخطأ لـ طق يساهم بوليميراز الحمض النووي في عدم قدرته على تضخيم الأجزاء التي تزيد عن 5 كيلو بايت بشكل عام. للتغلب على أوجه القصور هذه ، يتم باستمرار تطوير بوليمرات الحمض النووي ذات الأداء الأفضل لتسخير قوة تفاعل البوليميراز المتسلسل عبر مجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجية (تعرف على المزيد حول خصائص بوليميريز الحمض النووي).

فيديو: إنزيم PCR سريع

تحقيق تخليق أسرع للحمض النووي بمعدل 4 مرات ، وصلب البادئات عند 60 درجة مئوية ، وتحميل العينات مباشرة على المواد الهلامية بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باستخدام Invitrogen Platinum II طق البدء الساخن لبوليميراز الحمض النووي.


شاهد الفيديو: تفاعل البلمرة المتسلسل PCR (ديسمبر 2022).