معلومة

هل يجب أن أستخدم RNAseZAP على مقاعد البدلاء والماصات قبل استخلاص الحمض النووي الريبي؟

هل يجب أن أستخدم RNAseZAP على مقاعد البدلاء والماصات قبل استخلاص الحمض النووي الريبي؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل يجب علي رش RNAseZAP على مقعدتي والماصات قبل العمل مع RNA؟ أنا أستخدم RNase بانتظام في مقعدتي وأرغب في العمل مع RNA أيضًا. هل يمكن أن تؤدي آثار RNase على أجهزتي إلى تدهور الحمض النووي الريبي الخاص بي؟


الممارسة الشائعة في مختبري هي العمل في خزانة التدفق الصفحي وتنظيفها بالكحول ، ثم رشها باستخدام RNAseZAP. لطالما سمعت من أساتذتي أنه في حين أن الحمض النووي غير شائع ، فإن "الحمض النووي الريبي موجود في كل مكان". لذا ، انطلق مبكرًا ، انطلق بكل شيء.


هل يجب أن أستخدم RNAseZAP على مقاعد البدلاء والماصات قبل استخلاص الحمض النووي الريبي؟ - مادة الاحياء

لا يمكننا استخدام DEPC لعلاج عازلة TE ، فكيف يمكنك تحضير عازلة TE لتحلل الحمض النووي الريبي؟ على الرغم من أنني أستخدم المياه المعالجة بـ DEPC لصنع محلول TE مؤقت ، إلا أنني ما زلت أخشى أن RNase يمكن أن يتلوث من خلال مسحوق EDTA أو أثناء تحديد الرقم الهيدروجيني.

سيكون موضع تقدير أي نصيحة.

أهلا
عادة لا أستخدم المخزن المؤقت لتذويب الحمض النووي الريبي.
اعتني بكل المواد المستخدمة (أطراف الماصة ، الصقر) وعادةً يجب أن يكون كل شيء على ما يرام. لا تنس تخزين rna عند درجة حرارة -80 درجة واحتفظ بها على الجليد في كل مرة. للإذابة ، يمكنك جعله في درجة حرارة الغرفة ولكن مع الحرص على تركيز الحمض النووي الريبي. إذا كانت شديدة التركيز ، فمن المحتمل أنها تشكل مادة هلامية.
أعيد تعليق rna في المياه المعالجة FRESH DEPC.

بالنسبة لـ EDTA ، نظرًا لحقيقة أنك تستخدم الماء المعالج DEPC في إذابته ، والمواد المعقمة للإذابة والحفظ ، وتعقيم محلول EDTA (الترشيح على مرشح 0.22 ميكرون) ، فمن المحتمل ألا تكون هناك فرصة لتلوث rnase. علاوة على ذلك ، إذا تم استخدام مسحوق EDTA بشكل جيد ، فأنا أعني عدم وضع فائض من المسحوق في المخزون ، فربما لا يكون هناك تلوث.

على سبيل المثال ، باهتمام جيد ، لدي حل كامل من الحمض النووي الريبي بجودة جيدة جدًا ، وجعلته أكثر سمرة منذ عام & # 33

أنا أستخدم أيضًا ماء DEPC فقط لإذابة الحمض النووي الريبي.
أثناء العمل مع RNA ، أستخدم رؤوس المرشح وقم بتنظيف المقعد الخاص بي من قبل باستخدام EtOH. دائما يعمل بشكل جيد ولم يكن لديه مشاكل

أهلا
فقط لإكمال إجابتي و marc_U7snurp & # 39s واحد ، أغسل المقعد أيضًا باستخدام المنظفات وبعد ذلك باستخدام الإيثانول (لتقليل البكتيريا التي يسببها الإيثانول وتثبيت # 39 على مقاعد البدلاء) ، وبعد أن أضع لوح ألومنيوم نظيف.

للحصول على استخلاص جيد ، يجب أن تكون سريعًا في الخطوات لتقليل وقت الاستخراج ومخاطر التدهور. وحاول أن تكون الأكثر في الجليد.

أهلا
أنا أستخدم الماء الخالي من rnase / dnase من الإنزيم للذوبان ..
كما أنني أتأكد من تنظيف المقعد الخاص بي وأدوات المختبر باستخدام rnaseZap من ambion قبل العمل ..


استخراج الحمض النووي الريبي بواسطة بروتوكول Trizol - لم أحصل على نوعية جيدة من الحمض النووي الريبي (أكتوبر / 26/2005)

أهلا
لقد أجريت استخلاص الحمض النووي الريبي من ورم في المخ البشري بواسطة بروتوكول Trizol ولم أحصل على نوعية جيدة من الحمض النووي الريبي. اعتدت على إزالة الأنسجة الطبيعية والنخرية من شظايا الورم قبل الإجراء.
عندما قمت بتشغيل agarose gel بنسبة 1،2٪ ، لم أحصل على عصابات 28S و 18S. علاوة على ذلك ، رأيت شريطين غير محددين في نهاية كل شوط وفرقة DNA في البداية.
ماذا يمكن أن يكون هذان النطاقان غير المحددان؟
ما الذي يمكن أن أفعله خطأ؟
ما رأيك يجب أن أقوم به؟
شكرا
t_2005
ملاحظة: لقد أرفقت صورة هلام بلدي.

أهلا
استخدم ضعف الحجم على النحو الموصى به لتحسين الانتعاش
العمل بسرعة وعلى الجليد
استخدام تلميحات مخصصة لـ RNA للفلتر ، وحلول RNA مخصصة 100٪ etoh و IPrOH و 80٪ etOH (80٪ etOH محضر بمياه miliQ المعالجة بـ DEPC)
نظف مقعدك باستخدام 0،1N NaOH
تنظيف الماصات أيضًا
قم بالتسخين المسبق للتريزول إلى 50 درجة وفتق بعناية لأعلى ولأسفل حتى الحصول على حل واضح يعزز الجودة بشكل كبير
ربما تستخدم RNA لاحقًا؟


شرح نصائح عزل الحمض النووي الريبي وأرقام تكامل الحمض النووي الريبي (RINs)

الخطوة 1: استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة أو البلازما أو الخلايا.

  • بكتيريا "التجميد المفاجئ" وأنسجة النبات عن طريق غمر الأنابيب في النيتروجين السائل ، ثم تخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  • اغمر الأنسجة البشرية في RNA لاحقًا (منتج تجاري) ، ثم يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية. التجميد المفاجئ لا يكفي للحفاظ على الحمض النووي الريبي في بعض الأنسجة (بيسارسكا وآخرون ، 2016).

  • مركابتو إيثانول بيتا ("BME" ، "2-مركابتوإيثانول") السلامة: BME متقلب ويمكن امتصاصه من خلال الجلد. الحد من التعرض لـ BME باستخدام الغطاء الكيميائي ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة ، على الأقل للخطوات الأولية في البروتوكول قبل خطوات الغسيل. اقرأ معلومات السلامة و SDS قبل استخدام BME. لا بأس بالعمل خارج الغطاء الكيميائي لفترات قصيرة من الوقت (صوتنة ، طرد مركزي) بمحلول 1٪ أو بعد بعض خطوات الغسيل لشطف أعمدة الدوران ، ولكن ليس بمحلول المخزون.
  • الأعراض التحذيرية الأولى للتعرض المفرط لـ BME هي أعراض خفيفة غثيان، وهو أمر شائع عند العمل بمحلول 1٪ من الغطاء الكيميائي لفترة طويلة جدًا ولكنه سيختفي من تلقاء نفسه إذا توقفت عن التعرض وحصلت على هواء نقي. الغثيان الخفيف من BME ليس خطيرًا ، لكن من المهم عدم تجاهله.
  • إذا انسكبت محلول BME على بشرتك ، فقم بإيقاف كل شيء على الفور ، واغسل المنطقة بالماء الجاري لمدة 15 دقيقة ، وانتقل إلى صحة الموظف أو الرعاية العاجلة. ستكون الأعراض أكثر حدة وتتطلب عناية طبية. يمكن أن تتراوح من الغثيان الشديد حتى الموت ، اعتمادًا على مدى التعرض.

  • احتفظ بها على الجليد أثناء الطريق إلى nanodrop.
  • بحاجة إلى استراحة؟ بعد الشطف ، يمكنك ترك أنابيب RNA على الجليد لمدة 30 دقيقة أو نحو ذلك. قم بتغطية دلو الثلج بدلو ثلج آخر لعزل وإبطاء الذوبان.

الخطوة 2: تحقق من الحمض النووي الريبي للمحصول والملوثات

  • نانودروب RNA لإلقاء نظرة سريعة باستخدام إعداد RNA-40
    • يمتص الحمض النووي الريبي والحمض النووي في 260 نانومتر
    • قد تظهر الملوثات قمم في 230 نانومتر (أملاح) و 270 نانومتر (الفينول)
    • تعتبر الأملاح العازلة ومخازن الغسيل التي تحتوي على الأيزوبروبانول من الأسباب الشائعة لتركيز 230 نانومتر. يستخدم الأيزوبروبانول لتحسين إنتاجية الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، ولكن على حساب تحسين الاحتفاظ بالملوثات الملوثة. تميل مجموعات استخراج الحمض النووي من هلام Agarose ومجموعات استخراج miRNA إلى إنتاج شطف بقراءات عالية تبلغ 230 نانومتر.

    الخطوة 3: تحقق من سلامة الحمض النووي الريبي

    • عائد الحمض النووي الريبي وسلامة الحمض النووي الريبي ليسا نفس الشيء. يمكن أن توحي تقنية nanodrop بإنتاجية عالية من الحمض النووي الريبي (قراءات عالية عند 260 نانومتر) وملوثات منخفضة (قراءات منخفضة عند 230 نانومتر و 270 نانومتر) ، لكن قراءات 260 نانومتر لا تخبرك ما إذا كانت جزيئات الحمض النووي الريبي المعزولة من عينتك تحافظ على سلامتها ، أي إذا كان معظمها من جزيئات RNA الخاصة بك طويلة (غير منقطعة) أو إذا كانت متدهورة.

    • رين=رقم سلامة الحمض النووي الريبي ، يتراوح من 0-10 (الأعلى هو الأفضل).
    • عادة ما تحتاج رين و GT8 للتسلسل ، على الرغم من أن RIN و gt6 قد يعملان في بعض الحالات.
    • بالنسبة إلى Cedars-Sinai ، أرسل طلبات خدمة التحليل البيولوجي إلى Genomics Core من خلال موقع iLab الإلكتروني: https://csmc.corefacilities.org/account/login
      • يتطلب حسابا
      • يتطلب مصدر تمويل مرتبط
      • "RNA Nano" - شريحة التحليل البيولوجي المعتادة المستخدمة للتركيزات العادية
      • "RNA Pico" - شريحة التحليل البيولوجي المستخدمة لعينات منخفضة التركيز

      • ما هما النطاقان المستخدمان لتحديد تكامل الحمض النووي الريبي؟ النطاقان هما الرنا الريباسي الأطول (الرنا الريباسي).
        • في حقيقيات النوى: 28S و 18S rRNA (البشر والنباتات)
        • في الفطريات / الخميرة: 26S و 18S rRNA
        • في البكتيريا: 23S و 16S rRNA


        اختر بلدك

        أمريكا الشمالية

        أوروبا

        آسيا والمحيط الهادئ

        إذا كنت لا ترى بلدك أعلاه ، يرجى زيارة موقعنا الدولي

        لقد كنت خاملاً لأكثر من 20 دقيقة ، تم تسجيل خروجك من أجل أمانك. الرجاء تسجيل الدخول مرة أخرى لمواصلة الجلسة الخاصة بك.

        تم تعيين ملف التعريف الخاص بك إلى مؤسسة ، يرجى تسجيل الدخول مرة أخرى لاستكمال تحديثات ملف التعريف الخاص بك.

        لحفظ عربة التسوق الخاصة بك وعرض الطلبات السابقة ، قم بتسجيل الدخول إلى حساب NEB الخاص بك. ستؤدي إضافة منتجات إلى عربة التسوق الخاصة بك دون تسجيل الدخول إلى فقد سلة التسوق الخاصة بك عند تسجيل الدخول أو مغادرة الموقع.


        عزل الحمض النووي الريبي هو مهارة وفن في نفس الوقت

        نظرًا لأن الحمض النووي الريبي عرضة للهضم من خلال مجموعة متنوعة من RNases الداخلية والخارجية ، ولأن هذه RNases موجودة تقريبًا في جميع الكائنات التي تتلامس مع البشر ، يجب توخي الحذر الشديد لمنع تلوث العينات وتدهورها. يمكن أن يؤدي الاجتهاد والالتزام ببعض القواعد البسيطة إلى إحداث فرق بين إعداد الحمض النووي الريبي السليم والنظيف والحمض النووي الريبي المتدهور. الهدف العام هو الحفاظ على ملف تعريف mRNA لعينتك سليمة للتطبيقات النهائية من أجل إنشاء بيانات ذات مغزى.

        يفعل قم بارتداء القفازات وقم بتغييرها بشكل متكرر. يتم إفراز RNases من خلال الجلد وسيؤدي ملامسة الجلد إلى تلوث مستحضراتك التحضيرية.

        يفعل تطهير الماصات وصناديق الهلام وأمشاط الجل. يعتبر العلاج باستخدام RNaseZap ™ ، RNase Decontamination Solution طريقة سريعة وشاملة لضمان خلو أجهزتك من جميع أنواع RNases.

        يفعل استخدم الكواشف والأنابيب والنصائح الخالية من RNase.

        يفعل معالجة الأنسجة بسرعة ، إما عن طريق تعطيل المخزن المؤقت للتحلل أو التجميد أو التخزين في محلول تخزين الأنسجة RNAlater ™ / RNA Stabilization Solution.

        يفعل الحفاظ على الأنسجة مجمدة أو في RNAlater قبل عزل RNA. هذا يمنع انهيار الحمض النووي الريبي بواسطة RNases الذاتية ويحافظ على نمط التعبير لأنواع الحمض النووي الريبي داخل العينة.

        يفعل طحن الأنسجة التي تم تجميدها على الجليد الجاف أو في النيتروجين السائل مع الهاون والمدقة. بعد ذلك ، قم بالتجانس باستخدام الخالط الآلي في المخزن المؤقت للتحلل. عن طريق الحفاظ على الأنسجة مجمدة ، تظل RNases الذاتية معطلة أثناء التحلل. (لمزيد من المعلومات ، انظر "نصائح من مقاعد البدلاء: تأثير تجميد ذوبان الأنسجة على سلامة الحمض النووي الريبي"

        يفعل شطف الخالط الخاص بك في محلول تحلل بين العينات لمنع التقاطع
        تلوث اشعاعى.

        يفعل كن دقيقًا في التعطيل والاستخراج. تمثل شظايا الأنسجة التي تُركت دون انقطاع الحمض النووي الريبي المفقود.

        يفعل الدوامة لمدة تزيد عن 2 دقيقة عند استخلاص الفينول. سيؤدي ذلك إلى تسهيل إزالة البروتينات المرتبطة بإحكام والتي ترتبط عادةً بالحمض النووي الريبي (يمكن أن تمنع تفاعلات المصب).


        هل قام أحد هنا باستخراج الحمض النووي الريبي؟

        في المختبر أعمل & # x27m ، وما زلت في خضم التدريب. لقد قمت للتو باستخراج الحمض النووي الريبي للمرة الثالثة وكانت النتائج مروعة. أعلم أنه يأتي مع الممارسة ، ولكن هل لدى أي شخص أي نصائح مفيدة؟ أقوم باستخراج الحمض النووي الريبي على جذور Brachypodium / Oryza sativa باستخدام مجموعة نباتات RNeasy المصغرة ، بدءًا من طحن الجذور في الهاون والمدقة ثم سلسلة من الغسل. أحاول طحن الأنسجة بأقصى ما أستطيع والحصول على أكبر قدر ممكن في أنابيب التجميع ، يمكنني فقط & # x27t معرفة ما إذا كان خطئي في الطحن / التجميع أو في الغسلات ، إذا لم أكون كذلك دقيق بما فيه الكفاية مع مصاصاتي الدقيقة. شكرًا مقدمًا على أي نصائح مفيدة ، أود & # x27d الحصول على بعض عينات الحمض النووي الريبي الجيدة حتى أتمكن من الانتقال إلى RT-PCRs والتسلسل.
        هتافات!

        [تحرير]: فقط للإضافة إلى هذا ، أنا & # x27m طالب جامعي يجري بحثًا - لذلك ليس لدي حقًا رأي كبير في ما أستخدمه / أفعله - لا بد لي من استخدام مجموعة النباتات واتباع البروتوكول - أبحث فقط عن نصائح لتحقيق أقصى استفادة مما لدي. :)

        من تجربتي (قمت بآلاف عمليات الاستخراج في العامين الماضيين) ، تخلص من مجموعات العمود لاستخراج TRIzol (استخدم أيضًا الجليكوجين ، واحتضان العينة في a -80 لمدة 1-24 ساعة أثناء خطوة الترسيب ، وأضف غسل الإيثانول الثاني إلى البروتوكول القياسي ، يمكنني أن أرسل لك البروتوكول المعدل إذا أردت & # x27d). منذ الانتقال إلى هذه الطريقة الجديدة ، حققت نسبة نجاح 100٪ مع آخر 300 عينة ، ومواصفات رائعة ، وعوائد عالية ، وعدم تدهور. لقد واجهت الكثير من المشكلات مع مجموعات الأعمدة (معدل نجاح 60-80٪ بمواصفات أقل من مثالية) لدرجة أنني تخليت عنها.

        إذا كنت ترغب في الاستمرار في استخدام الأعمدة ، فجرّب هذه الأشياء: تأكد من استخدام النصائح المفلترة لأية خطوات تتضمن RNA ، وتأكد من أن غسالاتك دقيقة (اقلب الأنابيب ولف الأنابيب للحصول على الغسل في جميع أنحاء الداخل والغطاء قبل تدور) ، واستخدم فراغًا أو ماصة لإزالة الغسلات (لا تقم فقط بإخراجها من أنبوب التجميع).

        * تحرير: هنا هو البروتوكول المعدل الخاص بي ، أنا أعمل على الخلايا البشرية ولكن قد تكون هناك بعض الخطوات الإضافية للأنسجة النباتية ، لذا انظر إلى بروتوكول Thermo الأصلي لمعرفة ذلك. تأكد أيضًا من نظافتك حول الحمض النووي الريبي واستخدم مبيضًا بنسبة 10٪ أو RNase Zap على القفازات / مساحة العمل / الأدوات لمنع أي RNases قبل العمل.

        الذهاب إلى الثانية هذا البروتوكول. Trizol هو القرف. سمعت أيضًا أن بولي أكريلاميد الخطي يعمل بشكل أفضل من الجليكوجين كناقل للحمض النووي الريبي.

        توصية إضافية إذا أراد OP الاستمرار في استخدام الأعمدة (يجمع هذا البروتوكول بين العائد المرتفع لـ Trizol مع سهولة / تنظيف المجموعات):

        اتبع بروتوكول / u / what_are_you_saying & # x27s خلال الخطوة 5 ، ثم انقل المرحلة المائية إلى أنبوب إبندورف خالٍ من الحمض النووي الريبي.

        تحتوي المجموعات في كثير من الأحيان على & quotclean up RNA باستخدام بروتوكول العمود & quot. استخدم هذا البروتوكول على البت المائي من النقطة النقطية أعلاه.

        إذا لم يكن لدى المجموعة الخاصة بك بروتوكول تنظيف & quotRNA & quot ، أضف المخزن المؤقت للتحلل / الإيثانول إلى الكميات التي تحتاجها عادةً لعينة سائلة تبلغ 200 ميكرولتر. لا تضيف بيتا مركابتوإيثانول أو بروتيناز ك. أضف هذا الخليط إلى العمود وتنقية الحمض النووي الريبي بشكل طبيعي وفقًا لتعليمات العينة العادية في المجموعة.

        يمكن لهذا البروتوكول عادةً الحصول على بضعة ميكروغرام من الحمض النووي الريبي فائقة النقاء حتى لو كان لديك كمية صغيرة جدًا من مادة البداية (مثل 10 رؤوس ذبابة الفاكهة).

        هل سبق لك أن أجريت عمليات قلع بدون الجليكوجين؟ إذا كان الأمر كذلك ، فهل تجد أن الجليكوجين يزيد العائد؟ يزيد النقاء؟

        أنا أستخدم مجموعة أعمدة ، ولدي معدل نجاح بنسبة 100٪ ، حيث سجلت معظم عيناتي RIN من 10. خلايا الماوس هنا.

        أنا & # x27m عالم وراثة جزيئية يعمل على النباتات. قمت & # x27ve بالكثير من عمليات استخراج الحمض النووي الريبي. هنا & # x27s زوجين من الأفكار.

        يتحلل الحمض النووي الريبي بسهولة شديدة وهو أقل استقرارًا من الحمض النووي. رش طاولة العمل والماصات والقفازات الخاصة بك بالإيثانول قبل أن تبدأ في الاستخراج. هل تلمس شيئًا آخر أثناء دوران جهاز الطرد المركزي؟ رش القفازات مرة أخرى. أود أيضًا استخدام نصائح خاصة & quot ؛ لتصفية الحصص & quot ؛ لتجنب تلويث عيناتي بـ RNases.

        -يبدو وكأنك تستخدم مجموعة. تأكد من اتباع التعليمات بعناية - الكثير من المخازن المؤقتة لها أسماء رنين متشابهة. إذا كانت هناك خطوات اختيارية ، فقم بتنفيذها. في الخطوة الأخيرة ، عندما تقوم بإخراج الحمض النووي الريبي الخاص بك من العمود ، أود أن آخذ ما يخرج وأعد ماصه إلى أعلى العمود. سيعطيك هذا الغسل الثاني عائدًا أعلى قليلاً.

        - يبدو أنك & # x27re جديدًا في المختبر - مرحبًا بك! أنا متأكد من أن هناك بعض كبار الموظفين الذين يعملون معك قاموا بهذا البروتوكول (ليس بالضرورة الباحث الرئيسي ، ولكن ربما حتى بعد الدكتوراه أو طالب الدراسات العليا). اطلب منهم المساعدة! اطلب منهم الجلوس معك أثناء قيامك بالبروتوكول ويمكنهم مراقبة أسلوبك وقد يكونوا قادرين على الإشارة إلى شيء تقوم به بشكل غير صحيح.


        هل تستخدم غرفة نظيفة PCR / RNA؟ إذا كان الأمر كذلك لماذا؟ إذا لم يكن كذلك ، فلماذا؟

        يبدو الأمر مفرطًا بالنسبة لي ، لكنني بدأت أدرك أن الغرف النظيفة لعمل PCR و RNA هي ممارسة شائعة إلى حد ما. فضولي لما يعتقده الناس!

        نقوم بعمل pcr في غرفة نظيفة في وظيفتي الحالية ، وعلى الرغم من أنها مبالغة ، إلا أنها تبدو رائعة للزيارات!

        أقوم بكل ما لدي من عمل PCR و RNA مباشرة في مقعدتي الرئيسية دون أي احتياطات خاصة (مجرد تقنية نظيفة عادية) ولم أواجه أي مشكلة على الإطلاق. كل شخص في مختبري يفعل نفس الشيء. أعتقد أنه من الغريب حقًا أن يكون لدى المختبر مناطق مخصصة فقط لـ PCR ، على الرغم من أنني أستطيع رؤية فائدة عمل RNA. أعتقد أنها مشكلة تتعلق بالفضاء بالنسبة لنا أكثر من أي شيء آخر ، لكنها تعمل من أجلنا ولن أغيرها.

        كذلك هنا. لا أحد في قسمي يستخدم غرفة نظيفة. لدينا فقط 5 زجاجات من RNaseZap على كل مقعد.

        كما سبق. طالما أنك لا تعطس في / على عيناتك ، فإن زوجًا من القفازات والأسلوب الجيد هو كل الاحتياطات التي تحتاجها. يوجد معمل أعمل فيه حيث يرتدي الجميع ملابس جراحية كاملة (عباءة ، وجوارب ، وشبكة شعر ، وقفازات ، وقناع وجه ، وما إلى ذلك) عندما يقومون بعمل RNA. يجعلني ضحكة مكتومة. انه هدر للمال.

        لا ، لأن بنايتنا من السبعينيات. نحاول الاحتفاظ بغطاء دخان مخصص لعمل الحمض النووي الريبي لأننا عادة ما نقوم باستخراج الفينول الساخن.

        يبدو أن البروتوكول الخاص بك من السبعينيات أيضًا.

        مختبري هو الحمض النووي الريبي فقط عمل ، ونحن نقوم بعلم الأحياء البنيوي على RN! لذلك يجب أن تكون العينات مستقرة على مدى سنوات بدون أي مثبطات RNAse. لذلك ، نعم ، المختبر مثل غرفة نظيفة! لقد قمنا بالاستعانة بمصادر خارجية لجميع الأعمال الخلوية / البكتيرية وكل شيء يدخل المختبر ملوث. ليس لدينا شبكات شعر ، ولكن من المفترض أن يتم سحب الشعر للخلف ، واعتمادًا على المكان الذي نعمل فيه على صنع العينات ، كنا أقنعة للوجه. ولكن بالنسبة لـ rt-PCR البسيط ، لن أفعل أيًا من ذلك.

        من المهم حقًا أن يكون هناك غرف منفصلة في عمليات التشخيص والكشف. تقوم بإعداد رد الفعل في غرفة وتشغيله في غرفة أخرى. معاطف مختبرية مختلفة لكل منها أيضًا. ينتج PCR الكثير من المنتجات التي يمكن الحصول عليها في كل مكان وتعبث ببياناتك حقًا. ما عليك سوى البحث عن كارثة XMRV بأكملها إذا كنت تعتقد أن مثل هذه الأساليب مبالغ فيها.

        نعم ، لأننا نمتلك عددًا كافيًا من المقاعد وأجهزة التدوير الحرارية التي يمكننا القيام بذلك ، ولكن في الأساس هو مجرد عذر لمنع أعضاء المختبر الآخرين من لمس الماصات الخاصة بي. (أعني ، لدينا أشخاص يتعاملون مع الدم واللعاب على المقاعد الأخرى ، وأحيانًا ينسون البلاستيك المتسخ على المقعد.) ليس لدينا أي RNase-zap (على الرغم من أنني أخزن RNA في سترات الصوديوم وأستخدم RNaseOUT في RTs) ، وقد قامت تقنية المختبر الجديدة لدينا بمئات من مكتبة التسلسل qPCRs في مختبره القديم على مقعد غير نظيف لـ PCR ولم ترَ قط NTC إيجابيًا.

        لدينا مقعد نظيف منفصل مقسم لـ RNA على اليسار والإشعاع على اليمين. نظرًا لأن 2/4 من المشاريع في المختبر تركز على تنظيم RNA من نوع ما ، فقد كان ذلك منطقيًا بالنسبة لنا. ومع ذلك ، فهو موجود في مساحة المختبر الرئيسية ويظل نظيفًا فقط لأن آلهة / تقنية المختبر لدينا ستسلخك بملعقة إذا قمت بتلويثها.

        عملت سابقًا في مختبر بغرف منفصلة لـ PCR و RNA وزراعة الخلايا. كان المكان متاهة ، وكان أكثر صعوبة من أي شيء آخر.

        نحن للأسف ليس لدينا غرفة نظيفة منفصلة ، ولكن لدينا أغطية PCR بعيدًا عن مقاعدنا للعمل الجزيئي القياسي.

        بالتأكيد ، لا يحدث فرق كبير في معظم الأوقات ، وإذا كان يعمل كما ينبغي ، فلن ترى الفرق أبدًا. ولكن عندما تقوم بإجراء فحوصات حساسة للغاية (مثل التسلسل العميق ، أو PCR الجينوم الفردي ، أو حتى مجرد qPCR) ، يصبح وجود منطقة نظيفة على الأقل أمرًا مهمًا للغاية. ومع ذلك ، إذا كان & # x27s مجرد وجود / غياب سريع ، تحقق من PCR ، فأنا أفعل ذلك على مقعدتي الرئيسية.

        النقطة المهمة هي أنه في بعض التجارب تحتاج إلى ضمان إضافي ، وفي بعض المباني يكون من الصعب للغاية حساب الممارسة المعملية لأشخاص آخرين.

        استخدم الغرفة النظيفة لعمل جزيء واحد ، لمنع التلوث. ولكن بالنسبة لجميع أعمال qPCR أو الاستنساخ أو التنميط الجيني ، فأنا أقوم بذلك على مقاعد البدلاء.

        لا ، لدي منطقة جلوس أخصصها خالية من RNAase ولا يمكن لأي شخص أن يسعل عليها أو يفرك يديه القذرة في كل مكان ، لكني أقوم بعمل DNA PCR مباشرة على مقعدتي العادية. لدي ماصات من الحمض النووي الريبي ودرج لأشياء الحمض النووي الريبي المسمى بذلك ويقول & quotWEAR GLOVES & quot. لكن هذا & # x27s بقدر ما ينطبق على منطقة RNA.

        لدي ماصات من الحمض النووي الريبي ودرج لأشياء الحمض النووي الريبي المسمى بذلك ويقول & quotWEAR GLOVES & quot. لكن هذا & # x27s بقدر ما ينطبق على منطقة RNA.

        الناس .. لا يرتدون قفازات بانتظام كافية لتبرير هذا التحذير؟

        أقوم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في مقعد عملي العادي مع اتخاذ الاحتياطات العامة. لدينا غطاء منفصل ومنطقة عمل لعمل الحمض النووي الريبي.

        لم أفعل ذلك أبدًا ، لكنني أرتدي قناعًا للوجه ، وقناعًا يمكن التخلص منه ، وشبكة شعر ، وقفازات ، وطنًا متريًا من rnase بعيدًا. وأضع علامة على المكان الذي أقوم فيه بالإعداد خوفًا من وضع الآخرين للأشياء هناك. لكنها & # x27s فقط على مقاعد البدلاء العادية.

        نحن نستخدم غرفة نظيفة في الغالب لأن مساحة المختبر لدينا صغيرة جدًا بحيث لا يوجد بها غطاء مخصص لإعداد PCR على مقعدنا. نظرًا لأننا نميل إلى تضخيم نفس الأشياء مرارًا وتكرارًا ، يمكن أن يصبح التلوث مشكلة كبيرة. كنت أعمل في مختبر التشخيص الجزيئي السريري وكان لدينا غرف منفصلة (ومعاطف معملية منفصلة ، ومستلزمات منفصلة) لإعداد ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، و PCR ، وما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. الآن أنا & # x27m في منشأة بحثية مخصصة ولدينا غرفة نظيفة ومن ثم باقي القسم هو مساحة فعالة بعد PCR.

        كان لدينا عدد قليل من مشاريع المستودعات الكبيرة حيث كنا بحاجة إلى استخراج الحمض النووي من مئات عينات الدم للتسلسل (هذا العام عالجت ما يقرب من 2000 عينة دم لتلك المشاريع). نظرًا لأن المنطقة التي يتم تسلسلها هي أيضًا منطقة قمنا باستنساخها في مساحة المختبر الرئيسية ، فقد كان من المفيد للغاية وجود غرفة مخصصة لما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل لاستخراج الحمض النووي. إذا كانت أي من عينات المستودعات هذه ملوثة بموادنا المؤتلفة في المختبر الرئيسي ، لكانت هذه المشاريع قد تعرضت لخطر كبير.


        نصائح لتنقية الحمض النووي الريبي بنجاح باستخدام مجموعة Monarch & reg Total RNA Miniprep Kit

        يمكن بسهولة تنقية الحمض النووي الريبي الناجح باستخدام مجموعة Monarch Total RNA Mini Prep Kit باتباع هذه النصائح المفيدة.

        الجزء 1 قبل التحضير

        1.1 القضاء على Rnases من بيئة العمل

        من المهم العمل في بيئة خالية من RNases. احرص دائمًا على ارتداء القفازات ، واستخدام الزجاج والبلاستيك الخالي من RNase وتنظيف مناطق عملك. نوصي بمسح سطح المنضدة بعامل تنظيف مثل RNaseZAP.

        1.2 تخزين عينات الحمض النووي الريبي بشكل صحيح للحفاظ على سلامة العينة

        للحفاظ على سلامة RNA لعينتك ، قبل الإعداد ، يجب تجميد العينات في وقت الحصاد ، أو حمايتها بواسطة كاشف مخصص مثل Monarch DNA و RNA Protection Reagent ، والتي يتم تضمينها في مجموعة أدواتنا. كريات الخلايا المزروعة عبارة عن قسامات من الدم المحفوظة باستخدام كاشف الحماية هذا ، ويجب خلطها جيدًا عن طريق الدوامة أو الماصات قبل التخزين.

        يمكن تخزين قطع صغيرة من الأنسجة أقل من 20 مجم مباشرة في كاشف الحماية. ومع ذلك ، يجب تجانس عينات الأنسجة الأكبر حجمًا في كاشف الحماية قبل التخزين. إذا تم حفظ العينات في كاشف الحماية ، فلا تقم بإزالة السائل قبل المعالجة ، حيث يبدأ كاشف الحماية أيضًا في تحلل العينة.

        1.3 تجنب إذابة العينات للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي

        من المهم تجنب إذابة عينتك من أجل الحفاظ على سلامتها قبل استخراج الحمض النووي الريبي. يمكن إذابة الخلايا المستنبتة المجمدة لفترة وجيزة قبل إضافة المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي ، ولكن لا ينبغي إذابة معظم أنواع العينات الأخرى في حالة عدم وجود كاشف الحماية أو المخزن المؤقت للتحلل. وتشمل هذه العينات الأنسجة والدم والبكتيريا والخميرة والنباتات.

        1.4 تعظيم العائد من خلال ضمان تجانس كامل للعينة

        تأكد من أن العينات الخاصة بك معطلة ومتجانسة تمامًا من أجل إطلاق كل الحمض النووي الريبي وتعظيم العائد الخاص بك. يمكن للتجانس الميكانيكي ، على سبيل المثال ، باستخدام أداة تجانس الخرزة ، أن يزيد عوائدك إلى ما يتجاوز تلك التي ينتجها هضم بروتيناز K وحده عندما تعمل مع الأنسجة. يوصى أيضًا بالتجانس الميكانيكي للعينات الصعبة مثل النباتات والبكتيريا والخميرة.

        1.5 قد يوصى بإجراء جولات متعددة من التجانس

        عند استخدام التحلل الميكانيكي والتجانس ، يمكن التوصية بجولات متعددة من التجانس. إذا كنت تستخدم جولات متعددة ، فضع عينتك على الجليد لمدة دقيقة واحدة تقريبًا بين الجولات لمنع العينة من التسخين الزائد.

        1.6 للأنسجة أو الكريات البيض ، قم بتسخين كتلة التسخين إلى 55 درجة مئوية

        إذا كنت تعمل مع الأنسجة أو الكريات البيض ، فيمكن أن يساعدك في تسخين كتلة التسخين مسبقًا إلى 55 درجة مئوية قبل بدء الإعدادية الخاصة بك ، بحيث تكون الكتلة الحرارية في درجة الحرارة الصحيحة عندما تصل إلى حضانة بروتيناز K.

        يرجى العلم أنه عند العمل مع الدم الكامل للثدييات ، يتم إجراء حضانة البروتيناز K في درجة حرارة الغرفة.

        1.7 تحضير مزيج رئيسي من Dnase I و Dnase I Reaction Buffer

        نوصي أيضًا بإعداد مزيج رئيسي من المخزن المؤقت لتفاعل DNase I و DNase I قبل البدء إذا كنت تقوم بإجراء عدة عمليات إعداد في وقت واحد.

        الجزء 2 أثناء التحضير

        2.1 اتبع إرشادات NEB: www.neb.com/MonarchRNAInputs

        تأكد من اتباع إرشاداتنا بشأن مقادير إدخال العينة الموصى بها للتأكد من أن وحدات التخزين المؤقت مناسبة وأن الأعمدة ليست محملة بشكل زائد. هذا خطأ شائع يمكن أن يقلل بسرعة من إنتاج ونقاء وسلامة الحمض النووي الريبي الخاص بك.

        2.2 بعد التحلل ، نفذ الإجراء في درجة حرارة الغرفة

        بعد تحلل العينة ، نفذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة. سيمنع هذا المنظف من الترسب في المخازن المؤقتة. لا تضع عيناتك على الثلج بعد التحلل.

        2.3 أنبوب جمع الملصقات قبل تحميل عمود إزالة جدنا

        قبل تطبيق عينتك على عمود إزالة الحمض النووي الجيني ، تأكد من تسمية أنبوب التجميع ، حيث ستتخلص من العمود بعد جهاز الطرد المركزي. بعد وضع عينتك في عمود إزالة الحمض النووي الجيني ، تأكد من حفظ التدفق من خلاله. يحتوي هذا التدفق من خلال RNA الخاص بك.

        2.4 أضف حجمًا واحدًا من الإيثانول إلى التدفق الخاص بك

        إذا كنت ترغب في التقاط إجمالي الحمض النووي الريبي بما في ذلك الحمض النووي الريبي الصغير ، أضف حجمًا واحدًا من الإيثانول إلى التدفق الخاص بك من خلال عمود إزالة جدنا ، استعدادًا لربطه بعمود تنقية الحمض النووي الريبي. إذا كنت ترغب في استبعاد الحمض النووي الريبي الأصغر من مائتي نيوكليوتيد ، فأضف فقط نصف حجم الإيثانول إلى التدفق الخاص بك من خلال عمود إزالة gDNA.

        2.5 قم بتنفيذ جميع خطوات الغسيل ، وقم بالتدوير لمدة دقيقتين بعد آخر غسلة

        من المهم جدًا تنفيذ جميع خطوات الغسيل في البروتوكول من أجل إنتاج RNA نقي للغاية. تأكد من تدوير العمود لمدة دقيقتين بعد آخر غسل.

        بالنسبة للعينات ذات الإنتاجية المنخفضة ، بما في ذلك العضلات أو الدماغ ، أو لمدخلات البداية المنخفضة ، ضع في اعتبارك إزالة الحمض النووي الريبي بـ 50 ميكرولتر من الماء الخالي من نوكلياز من أجل الحصول على الحمض النووي الريبي المركّز.

        2.6 يجب أن يكون التركيز & gt20 نانوغرام / ul في حالة استخدام مقياس الطيف الضوئي ذي الحجم الصغير

        من المهم أن يكون تركيزك أعلى من 20 نانوجرامًا لكل ميكروليتر. إذا تم استخدام مقياس الطيف الضوئي ذي الحجم الصغير ، مثل قطرة النانو ، لقياس التركيز والنقاء.

        الجزء 3 بعد الإعدادية

        3.1 عينة تدور لإزالة تأثير جزيئات السيليكا على OD 260/230

        في بعض الحالات ، يمكن العثور على جزيئات السيليكا من مصفوفة العمود في النذرة. للتأكد من أن هذا لا يؤثر على نسبة OD260-230 الخاصة بك ، يمكنك الطرد المركزي للشذبة لمدة دقيقة إلى دقيقتين عند 1600 x G واستخراج القسمة من وقت السائل للقياس على مقياس الطيف الضوئي.

        3.2 أضف EDTA إلى تركيز نهائي من 0.1 إلى 1 مم لحماية الحمض النووي الريبي

        بينما يتم توفير الماء الخالي من النواة في هذه المجموعة لشطف الحمض النووي الريبي ، فإن إضافة EDTA إلى تركيز نهائي من 0.1 إلى 1 ملي مولار يمكن أن يحمي عينات الحمض النووي الريبي التي سيتم تخزينها لفترة طويلة من الزمن.

        بالإضافة إلى ذلك ، من الممارسات الجيدة تخزين الحمض النووي الريبي المزال في قسامات لتجنب دورات التجميد-الذوبان المفرطة.


        عوائد منخفضة مع استخراج الحمض النووي الريبي (QIAGEN RNeasy)

        أحاول أن أقوم باستخراج الحمض النووي الريبي من خلايا المثقبية البروسية لأداء qRT PCR لكنني & # x27m عالق في الخطوة الأولى.

        أستخدم خلايا 5e10 7 (موصى بها من قبل الأشخاص في إدارتي) والتي يجب أن تعطيني عائدًا يصل إلى 50 ميكروغرامًا ، يتم التخلص منها في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. ومع ذلك ، كنت أحصل على 3.5-5-9.7-15ug من RNA (تم إجراء عمليات الاستخراج في محاولة لتحسين العائد في أيام مختلفة بعينات مختلفة) العينة الأولى (3.5ug) قمت بتشغيلها على هلام agarose ويمكنني رؤية بعض اللطاخة كلها على طول الممر.

        البروتوكول الخاص بي هو كما يلي:

        I. حصاد الخلايا وغسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني بارد

        ثانيًا. التقط بيليه التجميد في الثلج الجاف لمدة 5 دقائق

        ثالثا. أعد تعليق الحبيبات في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت RLT مع 6uL من 2-beta-mercaptoethanol (حاولت & # x27ve خلط RLT مع 2BM قبل إضافتها إلى عينتي وإضافتها في نفس الوقت).

        رابعا. أضف 600 ميكرولتر 70٪ إيثانول (ماء معالج DEPC + إيثانول مطلق). تحميل في عمود RNeasy.

        V. حوض تدفق الدوران والتجاهل (مرتين لأن إجمالي حجم الخلية المحللة أكبر من سعة حجم العمود)

        السادس. يغسل مع 350uL RW1 عازلة

        سابعا. احتضان مع RNase خالية من DNAse معلق في RDD العازلة (10uL + 70uL) لمدة 15 دقيقة.

        ثامنا. يغسل مع 350uL RW1 عازلة.

        التاسع. يغسل مع 500uL RPE العازلة. مرتين ، مع التأكد من جفاف العمود بعد الغسيل الثاني.

        X. أزل الحمض النووي الريبي باستخدام 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase المتوفرة في مجموعة QIAGEN.

        النسب 260 جيدة (في 195ng / uL أي 9.7ug مع النسب 2.11 و 2.25 260 نانوغرام / uL أي 15ug مع نسبة 1.55 و 2.24).

        حاولت & # x27ve استخدام مجموعة شخص آخر & # x27s مع الخلايا المتحللة (على سبيل المثال. تم بالفعل هضم الخلايا في المخزن المؤقت RLT الخاص بي)

        هل رأى أي شخص هذا يحدث من قبل؟ أي نصائح / أشياء أنا & # x27m نظرة عامة؟

        الاهتمامات الحالية: & # x27m الغزل لمدة 15 ثانية عند 5400 جم عندما يستدعي البروتوكول & gt8000g. أتأكد دائمًا من تجفيف العمود بشكل صحيح قبل الشطف.

        يحاول TLDR I & # x27m استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا حقيقية النواة وعائدتي ضعيفة للغاية ولكن النقاء يبدو جيدًا. لست متأكدًا مما إذا كانت & # x27s قد تدهورت لأنني لم أقم بتشغيل المواد الهلامية مع أحدث عيناتي. لست متأكدًا مما يجب فعله بعد الآن.

        تحديث: تمكنت من حل مشاكلي وحصلت على عائد جيد. تحقق من التعليقات أدناه لمعرفة كيف فعلت ذلك!

        لم & # x27t قراءة جميع الردود. تأكد من أنك تدور بالسرعة الصحيحة. تأكد من عدم وجود الإيثانول في العمود الخاص بك. أزل في 25 UL.

        ما أفعله هو إزالة 25uL ، ثم أعد نفس 25uL مرة أخرى في العمود وقم بتشغيله مرة أخرى.

        عندما & # x27re تضيف الماء ، تأكد من أنك & # x27re تسقطه مباشرة على الغشاء ، ولا تدع أي شيء يلمس جوانب العمود (قم بتغيير النصائح بعد كل عمود).

        نعم ، جرب المزلق بمياه أقل ، فلن تحتاج إلى 50 ميكرولتر.

        مرحبًا ، ما هو الغرض من تجميد خلاياك قبل أن تقضيها؟ بخلاف ذلك ، قد ترغب في تجانس عيناتك قبل إضافة الإيثانول. امص العينة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام p1000 ، أو يمكنك حتى استخدام إبرة وحقنة ذات مقياس دقيق ، فقط لتفتيت الخلايا أكثر. أتمنى أن يساعد!

        أعتقد أنه & # x27s لتسهيل تحلل الخلايا وتحسين استقرار الحمض النووي الريبي.

        عادةً ما أقوم بتجانس العينة عن طريق الماصات وهذه المرة الأخيرة (أفضل عائد ، 15ug) قمت أيضًا بعمل دوامة.

        لماذا يتم تجميد الخلايا المفاجئة قبل التحلل؟

        توصيات الزوجين بناءً على مئات عمليات استخراج RNeasy:

        قم بزيادة مدة و RCF للدوران الخاص بك بعد غسل RPE الثاني و قم بالتبديل إلى أنبوب تجميع جديد لدوران قصير وثالث للتأكد من أنك & # x27re تتخلص من كل الإيثانول. يبدو أنك & # x27re لا تحصل على ترحيل ولكن & # x27ll تساعد في استبعاد مشكلات التصفية. في هذه الملاحظة ، هل هناك سبب يجعلك تستطيع & # x27t الدوران على & gt8000g؟

        دع عمودك يحتضن لمدة 2-3 & # x27 عند RT بعد إضافة حجم الشطف وقبل أن تقوم بتدويره للمساعدة في تحسين الإنتاجية

        حدد كمية الحمض النووي الريبي (RNA) الخاص بك باستخدام مقايسة تعتمد على التألق (مثل Qubit أو Picogreen) للحصول على قراءة أكثر دقة لعائدك

        كما ذكر آخرون ، فكر في استخدام طريقة تحلل إضافية ، من الناحية المثالية طريقة ميكانيكية بالإضافة إلى. QIAshredder جيد جدًا إذا كنت لا تريد استخدام معدات إضافية بخلاف جهاز الطرد المركزي.

        هل ترى تلطيخًا على الجل فوق نطاقات الرنا الريباسي الخاص بك؟ قد يكون هذا مؤشرا على تلوث جدنا أو قد يكون مجرد قطعة أثرية تلطيخ. يمكنك محاولة إجراء علاج DNase داخل المحلول متبوعًا بتنظيف RNA لمعرفة ماهية التعافي النسبي.

        أخيرًا ، كيف يمكنك استخلاص عائد 50ug المتوقع؟ اطلب من الأشخاص في قسمك إجراء عمليات الاستخراج باستخدام خلايا 5e10 7 T. بروسي أو كائن حي آخر؟ ينتج الحمض النووي الريبي لأعداد مكافئة من الخلايا يفوز بالضرورة بالتنقل بين الأنواع.

        هل تقوم بتدوير المحللة؟ بمجرد إضافة RLT والتجانس ، تحتاج إلى تدوير جميع الخردة الخلوية (أعتقد أن Qiagen يوصي بـ 3-5 دقائق في & gt8000g؟) واستخدام المادة الطافية الناتجة فقط. إذا لم تفعل ذلك ، فأنت تقوم بملاحظة عمودك بالحطام.

        ستتفاجأ & # x27d بكمية الخردة التي ستتكوّر عند القيام بذلك. :)

        I think this step is only recommended if you're using tissue not cells. Might still help for cells.

        While I've ran the similar RNAeasy plus kit a few times, I've never troubleshooted this so consider this brainstorming rather than expert advice.

        The first thought that comes to my head (aside from RNAse contamination, but I assume that's ruled out) is overloading of the spin columns with nucleotides and just general goop. In the RNAeasy Plus kit I run a gDNA elimination column before even using the pink ones you've got, and I still would be wary to load 50 million cells worth of RNA into just one of them. The fact that vortexing gives you a better yield seems to support this - a less viscous mixture leading to significant better yield indicates that may be where the problem is.

        So, unless our labrat friends have better suggestions, I would try pooling your sample over multiple columns and see if your yield improves.

        Maybe you're not getting sufficient lysis? We bead beat and do a phenol extraction before adding the RLT, but that's because my organism has a tough cell wall to break through.

        The smear implies degradation. The RNeasy kit doesn't extract small (eg. Fragmented) RNA. Do you have access to a bioanalyzer to check the RINs for your samples?

        Snapfreezing shouldn't be the issue as long as you're not allowing the pellet to that without it being in lysis buffer. Your sample is degrading somewhere along the way. Do you do your work on the benchtop? Fume hood? Biosafety hood? Maybe the cold PBS washes are too harsh and the RNA degrades there? Could be a lot of factors.

        Why snap freeze the cells?

        I use this kit a lot and it works amazingly for me. In my experience the limiting step is the homogenization. Pipetting up and down is usually not enough, you have to use a syringe and needle. Alternatively, and this works the best, get some QIAShredders from Qiagen. It's an additional spinning step.

        Also, why are you spinning at such low speed?

        I'm not sure if anyone else has suggested this but I usually run my final elution through the column twice. For example, I spin 25 uL of RNase free water through (which I placed directly in the center of the column) and then pass that same 25 uL through a 2nd time. I find I get a bit better yield.

        Also, for sure, as others have suggested, lyse your cells. As that kit suggests, try passing the lysate through a needle a few times, this should work better then the pipette up and down.

        Finally, although you might be concerned with that lower yield, you mentioned that this is for qRT-PCR . in that case you need as little as 10pg to make enough cDNA for future PCRs. The amount you are getting is more then enough. حظا طيبا وفقك الله!

        Hello and thanks everyone for your replies! Today I've done another extraction following most people's advice (to increase the speed in my centrifugation steps).

        Changes from last time are the following: I. 5e10 7 cells were pelleted and left in the -80ºC for 48h. I did this because people in my department usually take RNA samples in several time points and therefore always leave their samples at -80ºC.

        ثانيًا. I've increased my centrifugation speed to 13000rpm (15000g approx.) 30 seconds.

        ثالثا. Eluted in 50uL DEPC treated water which I left into the column for 5 minutes before elution.

        I don't really know what's going on. I'm currently running a gel to see how this and the previous samples look.

        /u/iamnomoney /u/Blurr /u/scotleeds I elute in 50 uL but I don't care much on concentration as in ultimate RNA amount in ug.

        /u/iski4free /u/naughtydismutase I snap freeze because it's meant to help with the lysis process and to prevent RNA degradation. Most people in my lab collect their cell pellet, freeze at -80ºC and a few days later perform their extractions (this is useful when they are taking samples at time points)

        /u/adam_von_indypants Thanks for the advice! I'm now doing 13000rpm (can't calculate g right now but I'm 100% confident is >8000g). I've also incubated for 5 minutes at RT with the DEPC water I use for elution. I don't hace access to QIAshredder-like protocols at the moment but I'll consider it. My expected yield is derived from the people in my department using the same amount of cells of the same organism. They all agree that the yield is always between 30-40ug and 50ug is the maximum they've ever gotten.

        /u/CittiKatt I did't spin my lysate before but I did this last time (13000rpm 3min) but I couldn't see any pellet. I loaded the lysate into the column after pipetting it slowly and avoiding to disturb the "invisible pellet".

        /u/jakeandamirlove Thanks! I know it should be enough for qRT but I'm concerned about not getting enough RNA. I just want to know what's going on with my protocol as other fellow labrats suggested before I may be getting bad yields because it gets degraded along the way.

        /u/TubeZ I work with my cells in a biosafety fumehood, once the cells are snap frozen (the pellet alone, not in buffer. ) I carry on in my bench which I clean using 70% ethanol.


        شاهد الفيديو: RT-PCR made EASY - Reverese Transcriptase PCR for detection and test of Viral DNA (ديسمبر 2022).