معلومة

تنقية قليل النوكليوتيد مع التحلية

تنقية قليل النوكليوتيد مع التحلية


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد طلبت 36bp قليل النوكليوتيدات التي تلدن مع بعضها البعض وتخلق نهايات لزجة ليتم استنساخها في ناقل بعد ذلك. لقد حاولت الاستنساخ عدة مرات بطرق مختلفة وفشلت. بدأت الآن في التفكير في أن القلة أقصر من 36 nt لأن تحلية المياه ليست طريقة فعالة وأن معظم نباتات oligos الخاصة بي لا تخلق نهايات لزجة كاملة عندما تلتصق ببعضها البعض. أعتقد أنني وجدت أيضًا دعمًا لذلك. لذا ، ما هو المقدار الذي يمكن أن يكون معظم قلة القلة لدي أقصر من 36 nt؟ هل هذا حل جيد لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها أم أن 36 nt oligos التي لا يتم تنقيتها بطريقة أكثر كفاءة لا ينبغي أن تخلق مشكلة بالفعل؟


Oligos من الشركات المعروفة جيدة جدًا على حد علمي. تبدأ المشاكل بعد شظايا oligos / dsDNA 100-300bp.

ما أقترحه هو PCRing المتجه الخاص بك مثل هذا:

التمهيدي F: ---------------------__________ المتجه: ====== | v site لـ 36 bp insert v | ======== == ... Upstream Downstream ______-----------------: التمهيدي R Legend: __ جزء من التمهيدي الصلب إلى المتجه - الجزء الذي هو موضع اهتمامك

ثم يمكنك في الواقع تحويل هذا PCR إلى e. coli ، والتي ستغلق نقطتين معًا وتنشر المتجه. سيضمن علاج تفاعل PCR الخاص بك باستخدام إنزيم Dpn إزالة كل قالب الحمض النووي.


تنقية قليل النوكليوتيد مع التحلية - علم الأحياء

بعد الانتهاء من تفاعلات تخليق oligo ، يتم شق القلة المكتملة من الدعامة الصلبة ويتم فصلها عن طريق إضافة الأمونيا المركزة إلى العمود عند 55 درجة مئوية طوال الليل. المنتج النهائي لعملية التوليف هو خليط من القلة المرغوبة ، والتتابعات المقطوعة ، ومجموعات الحماية المشقوقة. تنقية القلة مطلوب لإزالة المنتجات الثانوية لتفاعل التوليف وزيادة تركيز القلة الكاملة الطول. يوجد خياران للتنقية ، ويعتمد الخيار الأفضل على التطبيق النهائي لأوليغنوكليوتيد.

يتم إجراء التحلية لإزالة المنتجات الثانوية غير المرغوب فيها من إجراءات التخليق والتشقق ونزع الحماية. بمجرد تحلية القلة ، يمكن استخدامها في معظم تطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل. بشكل عام ، يُقبل تحلية القلة التي يقل طولها عن 35 قاعدة ، حيث سيكون أوليجو كامل الطول هو المنتج الأكثر وفرة. ملاحظة: التحلية لا تزيل قليلات النوكليوتيدات المقطوعة.

تنقية خرطوشة الطور العكسي (RP):

بالنسبة لبعض التطبيقات ، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد ، والاستنساخ ، والطفرات ، فإن المزيد من التنقية سيحسن نقاء قليل النوكليوتيد ، وبالتالي أداءه. تتضمن تنقية خرطوشة RP فصل oligos كاملة الطول (التي تحتوي على مجموعة 5’-DMT) من oligos المقطوعة (بدون مجموعة 5'-DMT) بناءً على الاختلاف في مقاومة الماء. يتم الاحتفاظ بأوليجوس كاملة الطول مع مجموعة 5'-DMT في العمود بينما يتم غسل التسلسلات التي لا تحتوي على 5'-DMT بعيدًا. بعد شق مجموعة 5'-DMT من العمود ، يتم استرداد القلة الكاملة المرغوبة. يوصى أيضًا بتنقية خرطوشة RP للأحجام الطويلة (> 35 قاعدة في الطول) نظرًا لأن عدد oligos المقطوع يميل إلى الزيادة مع زيادة دورات الاقتران.

تحليل ما بعد التنقية للوزن الجزيئي باستخدام مطياف الكتلة (MS):

يسمح مطياف الكتلة (MS) بقياس الوزن الجزيئي للقلة. في مطياف الكتلة ، يتأين القلة ويتم دفع الأيونات إلى كاشف الكتلة والمحلل. يسمح تحليل MS بمقارنة الوزن الجزيئي المحسوب (MW) للقلة مع M المقاس ، ويمكنه اكتشاف عمليات الحذف أو الإضافات أو البدائل ضمن تسلسل oligo. يمكن لمرض التصلب العصبي المتعدد أيضًا أن يكتشف بسهولة الإزالة غير الكاملة لمجموعات الحماية أثناء الخطوات النهائية للتوليف.

تقدم ACGT تحليل MS من خلال موفر خارجي وقد يتم تطبيق رسوم إضافية.

يمكن أيضًا تعديل أو تصنيع قليل النوكليوتيدات باستخدام شقوق غير نيوكليوتيدية لمجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجية.

البادئات المتدهورة عبارة عن خليط من قليل النوكليوتيدات لها قواعد مختلفة في موضع واحد أو أكثر. غالبًا ما تُستخدم عندما يكون تسلسل البروتين فقط معروفًا (بدلاً من التسلسل الأساسي الفعلي) أو لتضخيم التسلسلات المماثلة مثل SNPs والجينات المتماثلة. اعتمادًا على التطبيق المصب للقليل ، يمكن استخدام بقايا الديوكسيينوزين في المواقع التي يوجد بها انحلال كامل.

ديوكسيينوساين هو ديوكسينوكليوسيد مع قاعدة 6-هيدروكسي بورين. يمكن أن تتزاوج بقايا ديوكسيينوساين في قليل النوكليوتيد مع أي بقايا نيوكليوتيد على الحمض النووي الهدف. يمكن استخدام Deoxyinosine بدلاً من القواعد المختلطة (القواعد المتدهورة) ، وبالتالي تقليل عدد oligos الفريد المركب. لا تستخدم deoxyinosine لبادئات PCR لأن بوليميرات الحمض النووي قد لا تتعرف على هذه القاعدة وقد تسقط.

بسبب تقارب البيوتين للستربتافيدين ، يمكن استخدام قلة البيوتين المسمى بالبيوتين لربط الأوليغو بأعمدة تقارب الستربتافيدين أو اقترانات بروتين الستربتافيدين. يمكن إضافة البيوتين إلى نهاية 5 أو 3 من الأوليغو عن طريق إضافته إلى جزيء رابط.

تحتوي أليغنوكليوتيدات غير المعدلة على مجموعة 5-هيدروكسيل ، ومع ذلك يمكن تصنيع مجموعة فوسفات 5 بوصات. عن طريق إضافة مجموعة 5’-phosphate ، إما إنزيمياً أو كيميائياً أثناء تخليق oligo ، يمكن ربط oligo بواسطة ligase.

يتم تصنيع oligos المعدلة بالثيول من خلال دمج مجموعة ثيول (مع رابط C3 أو C6) أثناء توليف oligo إما في نهاية 5'- أو 3’-. يمكن ربط oligos المعدلة بالثيول بالببتيدات أو الإنزيمات ، على سبيل المثال ، يمكن استخدام مجسات oligo المسمى بإنزيم الفوسفاتيز القلوي للتهجين في الموقع. يمكن أيضًا استخدام oligos المعدل بالثيول للتثبيت على الأسطح ولإقران أصباغ مالييميد (سلفهيدريل المتفاعل).

يمكن أيضًا تمييز Oligos بجزيئات الفلورسنت ، مثل الفلوريسين ، لاستخدامها في تقدير كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل وفي مجسات التهجين في الموقع. تتوفر تعديلات أخرى قليلة النوكليوتيد ، يرجى الاتصال بنا للحصول على مزيد من المعلومات والتسعير.


إعداد وتنقية فعالين على نطاق واسع لأوليغنوكليوتيدات الحمض النووي الريبي قصير المدى وحيدة الجديلة

يلعب التعرف على الحمض النووي الريبي الخاص بالتسلسل بواسطة بروتينات ربط الحمض النووي الريبي دورًا مهمًا في التنظيم اللاحق للترجمة للتعبير الجيني. تساعد الدراسات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية على كشف مبادئ التعرف على الحمض النووي الريبي الخاص بالتسلسل ، لكن الأساليب المستخدمة تتطلب كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي أحادي الجديلة (ssRNA). نقدم هنا طريقة سريعة وقوية لإعداد وتنقية على نطاق واسع لأوليغنوكليوتيدات ssRNA القصيرة للدراسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية والهيكلية. لقد صممنا ريبوزيم رأس المطرقة (HH) القابل للطي بكفاءة ، لتحضير أليغنوكليوتيدات ssRNA. تشق جزيئات RNAs ذات رأس المطرقة بكفاءة تزيد عن 95 ٪ أثناء النسخ في المختبر كدالة لتركيز المغنيسيوم لإنتاج عوائد عالية من منتجات ssRNA المطلوبة. يمكن تنقية ssRNAs الناتجة من تفاعلات النسخ الخام عن طريق تغيير طبيعة كروماتوغرافيا تبادل الأنيون ثم تحليتها عن طريق كروماتوجرافيا تبادل الأنيون الضعيف باستخدام محلول عازلة لبيكربونات الأمونيوم المتطايرة. إن oligonucleotides ssRNA المنتجة بهذه الطريقة متجانسة ، كما يُحكم عليها من خلال قياس الطيف الكتلي (MS) ، وهي مناسبة للدراسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية. علاوة على ذلك ، من أجل تحديد هيكل الرنين المغناطيسي النووي عالي الدقة لمجمعات بروتين الحمض النووي الريبي ، يتيح بروتوكولنا التحضير الفعال لأوليغنوكليوتيدات ssRNA مع مخططات وسم نظائر مختلفة غير متوفرة تجاريًا.

الكلمات الدالة: RNA تحلية المطرقة ribozyme علم الأحياء الهيكلي RNA أحادي الجديلة RNA المسمى بنظير RNA.


تنقية قليل النوكليوتيد مع التحلية - علم الأحياء

الأتى خيارات التنقية متاحة لمستخدمي خدمات تركيب الحمض النووي لدينا:

وصف مقياس التوليف طول قليل النوكليوتيد
تحلية 50 نانومول ، 200 نانومول 3-75 قواعد
صفحة 100 نانومول ، 250 نانومول ، 1 أومول 76-90 قاعدة
صفحة 250 نانومول ، 1 أومول 91-100 قاعدة

نحن نقدم لجميع منتجات قليل النوكليوتيد الداخلية لدينا تحلية كخدمة إضافية. تعمل طريقة تنقية الخرطوشة لدينا على إزالة الأملاح ومجموعات حماية القاعدة وتسلسلات الفشل القصيرة التي تصل إلى 6 قواعد بكفاءة. يمكن استخدام قليل النوكليوتيدات المحلاة في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية القياسية بما في ذلك PCR و qPCR وتسلسل الحمض النووي ، إلخ.

نوصي باستخدام قليل النوكليوتيدات الطويلة غير المعدلة تنقية PAGE. بالنسبة لخيار الخدمة هذا ، سيتم توفير كل من التركيب والتنقية من خلال شراكتنا مع IDT.

اتصل بنا! يرجى إخبارنا باحتياجات بحثك الفردي. يمكننا تلبية الطلبات الخاصة التي قد لا تكون مدرجة هنا بشكل صريح. نحن نقدم أيضًا مساعدة فنية مجانية لمساعدتك على الاختيار الأفضل لتطبيقك المحدد.

للحصول على مقدمة موجزة عن وحدة تخليق قليل النوكليوتيد DNA الخاصة بنا ولمحة عامة عن منتجاتنا وخدماتنا ، يرجى الاطلاع على هنا.


يتضمن تخليق قليل النوكليوتيدات عددًا كبيرًا من التفاعلات الفردية ، والتي تؤدي حتماً إلى تراكم الشوائب مثل قليل النوكليوتيدات المقطوعة والمتواليات التي تحتوي على قواعد معدلة كيميائيًا. يجب إزالة هذه الشوائب بعد التوليف.

الكروماتوغرافيا هي تقنية لفصل المكونات في خليط عن طريق الامتزاز التفاضلي على سطح ممتز (المرحلة الثابتة). ثم يتم التصفية من المكونات بواسطة مذيب أو خليط من المذيبات (الطور المتحرك).

هجوم العمالقه

الترشيح الهلامي هو فصل مكونات الخليط على أساس الحجم الجزيئي ، وهو أبسط شكل من أشكال اللوني لتنقية قليل النوكليوتيد. يتم الاحتفاظ بمجموعات الحماية المشقوقة والتسلسلات القصيرة المقطوعة في مصفوفة الهلام بينما يتم فصل جزيئات قليل النوكليوتيد الأكبر بسرعة من خلال عمود الترشيح الهلامي (الشكل 1). يزيل الترشيح الهلامي أيضًا الأملاح من قليل النوكليوتيدات التي تمت تنقيتها بواسطة HPLC.

الشكل 1 | الترشيح الهلامي تمثيل تخطيطي لترشيح الهلام لتنقية قليل النيوكليوتيدات. تتم إزالة الجزيئات الكبيرة بسرعة عبر العمود ، بينما يتم الاحتفاظ بالجزيئات الأصغر في مصفوفة الهلام ويتم التخلص منها ببطء أكبر.

في حين أن ترشيح الهلام هو أسلوب بسيط ومفيد للغاية ، إلا أنه لا يزيل الشوائب ذات الحجم المماثل للمنتج المطلوب. يوصى باستخدامه كطريقة تنقية وحيدة للصغيرة جدًا فقط (الشكل 2 | تمثيل تخطيطي HPLC للطور المعكوس للطور المعكوس HPLC كما هو مستخدم في تنقية قليل النيوكليوتيدات. أزل الشوائب المحبة للماء (البرتقالية) من العمود أولاً ، متبوعًا بالمنتج (أزرق) ، وأخيراً الشوائب الكارهة للماء (أزرق).

يحتوي HPLC ذو الطور العكسي على قيود معينة: فكلما طالت فترة قليل النوكليوتيد ، زادت صعوبة فصل متواليات الفشل ذات الطول المماثل ، ويمكن أن يتسبب الهيكل الثانوي المستقر (مثل حلقات دبوس الشعر) في فصل قليل النوكليوتيد كقمة واسعة أو حتى سلسلة من القمم. يمكن أن يؤدي وضع عمود HPLC في فرن عمودي عند 60 درجة مئوية إلى التغلب على هذه المشكلة عن طريق (مؤقتًا) تدمير الهيكل الثانوي.

تبادل الأنيون HPLC

يقوم HPLC بتبادل الأنيون بفصل قليل النوكليوتيدات على أساس فروق الشحنة. كل قليل النوكليوتيد في الخليط الخام عبارة عن بوليانيون وله شحنة سالبة صافية معينة بناءً على عدد مجموعات الفوسفوديستر في الجزيء. الطور الثابت على عمود تبادل الأنيون هو أمين ثلاثي. يتم فصل الخليط الخام عن طريق زيادة القوة الأيونية للطور المتحرك ببطء لإضعاف التفاعلات بين قليل النيوكليوتيد (بوليانيون) والمرحلة الثابتة الموجبة. تتأخر قليلات النوكليوتيدات الأطول والأكثر شحنة عن الأقصر. هذه الطريقة فعالة في فصل أليغنوكليوتيدات في المنطقة من 5 إلى 50 قاعدة في الطول عن متواليات الفشل.

ما هو نوع HPLC الذي يجب استخدامه لتنقية القلة؟

يتم استخدام HPLC معكوس الطور بشكل روتيني في تنقية oligos.

القلة ذات الدرجة العالية من البنية الثانوية (مثل حلقات دبوس الشعر) تؤدي إلى ظهور قمم متعددة. يمكن التخلص من هذا الهيكل الثانوي في وجود درجة حموضة قلوية عالية ، مما يلغي تفاعلات ارتباط الهيدروجين. نظرًا لأن HPLC لتبادل الأنيون يمكن أن يتحمل درجة حموضة عالية ، فإن HPLC لتبادل الأنيون هو تقنية مفيدة في تنقية oligos ذات البنية الثانوية.

يمكن توقع أن تؤدي بعض متواليات قليل النوكليوتيد إلى ظهور بنية ثانوية بعبارات بسيطة ، ومن المحتمل أن تكون oligos التي تحتوي على نسبة عالية من قواعد G و C (محتوى GC عالي) مرشحة لتنقية HPLC لتبادل الأنيون. HPLC التبادلي الأنيون مفيد أيضًا لتنقية القلة الأطول (40-100 قاعدة).

يمكن تنقية قليل النوكليوتيدات الكارهة للماء عن طريق التبادل الأيوني HPLC عن طريق تضمين مذيب عضوي في الطور المتحرك.

تنقية Trityl-on (DMT-on)

يمكن تصنيع قليل النوكليوتيدات مع المحطة الطرفية 5 ومجموعة DMT الأساسية (DMT على trityl-on). يؤدي هذا إلى زيادة الكراهية للماء لأوليغنوكليوتيد كامل الطول بالنسبة لجميع متواليات الفشل (والتي سيتم تغطيتها باستخدام أنهيدريد الخل أثناء التخليق ولن تحتوي على مجموعة 5 & Prime-DMT). تنقية HPLC ذات المرحلة العكسية فعالة جدًا في فصل المنتج المحمي DMT من الشوائب. أخيرًا ، بعد التنقية ، تتم إزالة مجموعة 5 & Prime-DMT. تنقية Trityl-on فعالة لتنقية قليل النوكليوتيدات الطويلة (40 إلى 150 نيوكليوتيد). ومع ذلك ، فإن إزالة مجموعة DMT (التي تتطلب ظروفًا حمضية) يمكن أن تؤدي إلى بعض التنقية من قليل النيوكليوتيد.

كروماتوغرافيا التقارب الفلوري

يستغل كروماتوغرافيا التقارب الفلوري مفهوم الفلوروفيليتي: التقارب العالي للمركبات العضوية عالية الفلورة للمركبات المفلورة الأخرى. تتطلب كروماتوغرافيا التقارب الفلوري أن يتم تمييز النكليوتيدات بعلامة فلورية (باستخدام فوسفوراميديت مع مجموعة 5 & رئيس-DMT مشتق من سلسلة ألكيل مشبعة بالفلور الشكل 3) أثناء تخليق قليل النوكليوتيد في المرحلة الصلبة. نظرًا لأنه يتم إضافة الملصق الفلوري في نهاية تخليق قليل النوكليوتيد ، فلن يكون لتسلسل الفشل تسمية فلورية. يرتبط كروماتوغرافيا التقارب الفلوري بتنقية trityl-on.

الشكل 3 | تراكيب أحادي نيوكليوسيد الفوسفوراميديت الفلوري (يسار) وأوليغنوكليوتيد مع علامة 5 & برايم فلور (يمين) الذيل الفلوري ملون باللون الأزرق.

بعد تخليق المرحلة الصلبة ، يتم إذابة القلة في المخزن المؤقت وتمريرها عبر عمود فلور (يحتوي على راتينج بوليمر ترتبط به المجموعات العضوية المفلورة). سوف يرتبط قليل النوكليوتيد المسمى بالعمود بقوة ، في حين أن الشوائب غير الموسومة لن تتفاعل مع العمود وسوف تمر من خلاله. الغسل اللاحق لن يطلق القلة المفلورة من العمود ، مثل قوة التفاعل الفلوري. بعد إزالة جميع الشوائب ، يتم إزالة النوكليوتيد المطلوب على العمود (باستخدام حمض ثلاثي فلورو أسيتيك) ، مما يكسر التفاعل القوي بين القلة والعمود. يمكن الآن شطب القلة المحرومة من العمود (الشكل 4).

الشكل 4 | كروماتوغرافيا التقارب الفلوري تمثيل تخطيطي للكروماتوغرافيا الانجذابية الفلورية كما هو مستخدم في تنقية قليل النيوكليوتيدات. تزيل الشوائب غير المصنفة (السوداء) بسرعة ، في حين أن قليل النوكليوتيد المطلوب المسمى الفلور (أزرق فاتح) يظل مرتبطًا بقوة بالعمود. يحرر الإزالة على العمود الأوليغنوكليوتيد المطلوب (الأزرق الداكن) من العمود ، ويسمح بتصفية القلة المرغوبة.

يعتبر كروماتوغرافيا التقارب الفلوري مناسبًا لأوليغنوكليوتيدات طويلة ، نظرًا لقوة التفاعل الفلوري. وهذا يجعلها طريقة مفيدة لتنقية القلة التي يصعب تنقيتها باستخدام طرق أخرى. ومع ذلك ، فإن دمج العلامة 5 & برايم فلوروس أثناء تخليق المرحلة الصلبة ، والذي يتطلب مونومرات فوسفوراميديت خاصة 5 & الأولية الفلورية (الشكل 3 ، يسار) ، يضيف تعقيدًا ويمنع استخدام 5 & تعديلات رئيسية أخرى.

بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (PAGE)

يفصل الرحلان الكهربائي الجزيئات بناءً على شحنتها الكهربائية وخصائصها الهيدروديناميكية ، والتي هي دالة على طول السلسلة. يمكن استخدام تنقية PAGE مع oligos من أي طول ، ولكنها موصى بها بشكل خاص للقليل الطويل ، الذي يبلغ حوالي 100 قاعدة وأطول ، حيث تواجه طرق التنقية الأخرى صعوبات. ينتج عن تنقية PAGE عادةً قلة قليلة النقاء عالية جدًا ، ولكن على حساب العائد ويمكن أن تستغرق وقتًا طويلاً.

الهيكل الثانوي في قليل النوكليوتيدات

إن تنقية قليل النوكليوتيدات معقد بسبب وجود هياكل ثانوية مثل الدوبلكس وحلقات دبوس الشعر (الشكل 5 ، الشكل 6) ورباعية الجوانين (الرباعية). ستؤثر البنية الثانوية في قليل النوكليوتيد على اختيار طريقة التنقية الكروماتوغرافية.

الشكل 5 | تشكيل حلقة دبوس الشعر تمثيل تخطيطي لتشكيل حلقة دبوس الشعر من أوليغنوكليوتيد الحمض النووي الخطي.

الشكل 6 | تمثيل ثلاثي الأبعاد لعروة دبوس الشعر في أليغنوكليوتيد الحمض النووي الغني بـ AT.

تعتبر أعمدة HPLC القائمة على التبادل الأنيوني البوليمر مفيدة لتنقية قليل النوكليوتيدات التي تتبنى بنية ثانوية واسعة النطاق. هذا لأن المرحلة الثابتة مستقرة عند درجة حموضة عالية ، لذلك يمكن إجراء تنقية HPLC عند الرقم الهيدروجيني 12. في هذا الرقم الهيدروجيني ، يتم تدمير الهياكل الثانوية في قليل النوكليوتيد لأن N (3) من الثايمين و N (1) من الجوانين يتم إزالتها ، وتتزعزع روابط الهيدروجين بين القواعد. التنقية عند درجة حموضة عالية غير مجدية بالنسبة للحمض النووي الريبي نظرًا لوجود خطر انتقال 3 & رئيس إلى 2 & رئيس الفوسفات وانقسام العمود الفقري للفوسفوديستر (انظر تخليق المرحلة الصلبة من الحمض النووي الريبي).

طرق التنقية الموصى بها لتطبيقات مختلفة

تعتمد طريقة التنقية التي تختارها على تسلسل وحجم القلة ، ولكن أيضًا على الاستخدام المقصود (الجدول 1).

الجدول 1 ، الطرق الموصى بها لتنقية أليغنوكليوتيدات الحمض النووي الاصطناعية


ما هي عملية تنقية القلة؟

يؤدي تخليق قليل النوكليوتيد إلى التراكم الحتمي للشوائب. هذه الشوائب هي تسلسلات فشل: تسلسلات أقصر ، تسلسلات أطول ، تسلسلات معدلة أو شوائب خلفتها عملية التخليق. قد تعرض هذه الشوائب تجربتك للخطر ، لأنها تتنافس مع المنتج الكامل في بعض التطبيقات ، أو تمنع التفاعلات. لذلك ، فإن عملية التنقية توفر لك المال على المدى الطويل وكذلك القليل من عقلك!


يمكن استخدام خراطيش تنقية تحلية المياه C18 لتحلية قليل النوكليوتيدات بعد التوليف. أثناء عملية التنقية ، يتم التخلص من تسلسل الفشل وإزالة DMT لاحقًا ، مما يسمح بشطف المنتجات النقية. يمكن أيضًا استخدام خراطيش تنقية التحلية لتحلية قليل النوكليوتيدات بعد التنقية بواسطة PAGE أو HPLC.

توفر Biocomma خراطيش تنقية تحلية C18 بأحجام مختلفة. يمكن اختيار حجم خرطوشة مناسب وفقًا لتركيز oligos. في حالة تنقية عينات متعددة ، ستكون اللوحة ذات 96 بئرًا خيارًا أفضل.


أعمدة تحلية المياه لإزالة الجزيئات الصغيرة

تستخدم أعمدة التحلية مبدأ كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، وتسمى أيضًا كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي. بالإضافة إلى تحلية المياه ، فإن الاستخدام الرئيسي الآخر لكروماتوغرافيا استبعاد الحجم هو تجزئة الحجم.

تحتوي حبات المصفوفة في عمود استثناء الحجم على مسام. إذا تمكن جزيء أو مركب من دخول المسام ، فسوف يتحرك خلال العمود بمسار أطول من أي جزيء أو معقد كبير جدًا لدرجة لا تسمح له بدخول المسام. الجزيئات التي لا تدخل المسام ستتحرك خلال العمود بالطور المتحرك ، في حين أن الجزيئات التي يمكن أن تدخل المسام سوف تتأخر وتتخلص بعد هذه الجزيئات الأكبر. حد استبعاد الحجم هو النطاق الأعلى للحجم الجزيئي الذي يمكن أن يدخل المسام.

في التحلية ، يوجد فرق كبير في الحجم بين الجزيئات المستهدفة في العينة والملح غير المرغوب فيه أو الجزيئات الصغيرة. يتم اختيار حد استبعاد للحجم يكون أقل من حجم الجزيئات المستهدفة (أي أن الجزيئات المستهدفة أكبر من أن تدخل مسام الحبيبات). لذلك ، يتم استبعادها من المسام ، وتبقى في الطور المتحرك ، ويتم التخلص منها بعد حجم الفراغ. يتم إعاقة الأملاح والجزيئات الصغيرة الأخرى بواسطة عمود التحلية وبالتالي يتم فصلها عن الجزيئات المستهدفة. تسمى إزالة الملوحة أحيانًا بوضع الفصل الجماعي.

في التجزئة حسب الحجم ، تكون جميع الجزيئات التي سيتم فصلها أقل من حد استبعاد الحجم للعمود ، ويتم الاحتفاظ بها بواسطة العمود. يرتبط مقدار التخلف لكل جزيء بحجمه (وشكله). ينتج عن هذا شطف متسلسل للجزيئات حسب الحجم.

يتطلب نوعا كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أعمدة مختلفة. تحتوي أعمدة التحلية على عبوات وأبعاد تسمح بشطف الجزيئات المستبعدة قبل أن يمر حجم عمود واحد من الطور المتحرك عبر العمود. لذلك ، عادةً ما يكون عمود إزالة الملوحة قصيرًا وواسعًا ، بينما بالنسبة لتجزئة الحجم ، كلما زاد طول العمود ، زادت الدقة.

لدى Bio-Rad مجموعة واسعة من أعمدة التجزئة والتحلية. تصف الأقسام التالية استخدامات أعمدة تحلية المياه واختيارها.


طهارة

كما هو مذكور هنا ، يتم بذل كل جهد لتحقيق أقصى قدر من الجودة والعائد في oligos غير المنقى لدينا ، وهي مناسبة لمعظم تطبيقات PCR والتسلسل دون مزيد من التنقية. عند الحاجة إلى نقاء أعلى ، نقدم ثلاثة أنواع من التنقية:

  • تنقية خرطوشة الطور العكسي
    تُترك مجموعة trityl في نهاية 5 'من الجزيء عند الانتهاء من التوليف وتُستخدم "كمقبض" كاره للماء لصيد السلاسل كاملة الطول المطلوبة. سيتم بعد ذلك إزالة تسلسلات الفشل ، التي تفتقر إلى مجموعة trityl ، ويتم تحلية القلة في نفس الوقت.
    إذا كنت تفضل إجراء هذا النوع من التطهير بنفسك ، فيمكننا توفير بروتوكول لهذا الإجراء. في هذه الحالة ، يجب عليك تحديد أن OLIGOS سيتم تشغيلها "TRITYL ON".
  • تنقية HPLC ذات المرحلة العكسية
    متاح لقواعد DNA oligos & lt100. عادةً ما تضيف تنقية HPLC 3-5 أيام عمل للوقت المستغرق. قد يتطلب HPLC من oligos DNA المعدل خطوة تحلية أولية / تنقية خرطوشة قبل HPLC لذلك قد يتم تطبيق رسوم إضافية.

    تنقية الجل
    عادةً ما يضيف التنقية بالجيل من أسبوع إلى أسبوعين للوقت المستغرق.


خراطيش تنقية تحلية RPC

خرطوشة تنقية تحلية المياه RPC معبأة بجزيئات راتينج PS / DVB أحادية الانتشار صغيرة المسام. يتميز الراتينج المتشابك بدرجة عالية بالاستقرار الكيميائي والفيزيائي ويمكن استخدامه في نطاق أس هيدروجيني أوسع من العبوات القائمة على السيليكا.

يربط سطح تعبئة RPC جزيئات الحمض النووي عبر التفاعل المسعور. ثم يتم استخدام محلول مائي لغسل الأملاح المتبقية. أخيرًا ، يتم استخدام مذيب عضوي لاستخراج جزيئات الحمض النووي ويتم جمع مادة eluent في خزان.

أثبتت خرطوشة تنقية تحلية المياه RPC أنها طريقة فعالة واقتصادية للحصول على قليل النوكليوتيدات عالية النقاء.