معلومة

الضرر الذي يلحق بالخلايا باستخدام الماصات

الضرر الذي يلحق بالخلايا باستخدام الماصات


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لدي فضول لمعرفة مقدار الضرر المحتمل أن يحدث بسبب إجهاد القص بواسطة المص. أعلم أن الحقن المستخدمة في حقن الخلايا الجذعية يمكن أن تسبب الكثير من الضرر. ومع ذلك ، إلى أي مدى يحدث هذا مع أطراف الماصة P20 و P200؟ من المفهوم أن معامل القص للخلايا البكتيرية يختلف اختلافًا كبيرًا عن الخلايا السرطانية ، والتي ستكون مختلفة عن تلك الموجودة في الخلايا الجذعية.


هذا سؤال ممتاز ، لقد قمت بتدريب الأشخاص على الخلايا المستنبتة منذ حوالي 12 عامًا ويواجه الطلاب صعوبة في استيعاب هذا الأمر وتقدير الأهمية وما إلى ذلك.

ما تعانيه الخلايا عادةً أثناء سحب العينة يشبه حشدًا من الأشخاص الذين يحاولون الدخول في مدخل المبنى. يعتبر القص أثناء سحب العينة مصدر قلق مشروع في زراعة الخلايا. ستلاحظ تأثيره السلبي على الصلاحية بشكل أكثر وضوحًا عند سحب الخلايا في وسط التجميد (الذي يحتوي على DMSO) بعد ذوبان الجليد. حتى ينخفض ​​تركيز DMSO ، تصبح أغشيتها أضعف وأكثر سيولة. هذا هو السبب في أنك تقوم بمص الخلايا المجمدة من القطرة إلى الوسط الطازج ، لتكون لطيفًا بشكل خاص في هذه المرحلة.

يتم معالجة الخلايا بدائية النواة مثل الخلايا TOP10 المذكورة أعلاه بكلوريد الكالسيوم والجلسرين الذي له نفس التأثير على جدرانها وأغشيتها. ومن ثم يجب إجراء الماصات بدقة بعد إذابة هذه الخلايا أيضًا.

مع ما يقال ، إذا قارنت حساسية الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة بالقص ، فإن الخلايا حقيقية النواة تكون أكثر حساسية بعمق.

بالنسبة للأفراد الذين يستخدمون بكتيريا مختصة للاستنساخ الفرعي والاستخدامات الروتينية الأخرى ، فإن قتل نسبة صغيرة من خلاياك ليس بهذه الأهمية. ومع ذلك ، إذا كنت تستخدم التحويل لإنشاء مكتبات cDNA ، فمن المهم جدًا أن يكون لديك عيار يمثل بشكل كافٍ النسخة التي تتكون منها المكتبة.

في هذه الحالات ، باستخدام خلية ذات كفاءة أعلى ، يعد الالتزام بدرجات الحرارة الصحيحة وتقليل سحب العينات أمرًا ضروريًا. هذا هو السبب في أن الكثيرين يتم تعليمهم تحريك الحمض النووي بالخلايا المختصة ، بدلاً من البديل الأكثر قسوة: الماصات لأعلى ولأسفل.

العوامل الأربعة الأكثر أهمية التي تساهم في القص الخلوي هي ، وبالترتيب من الأكثر إلى الأقل مساهمة:

  1. قطر التجويف في طرف الماصة ، كلما كان القص أصغر.
  2. السرعة التي يمر بها التعليق عبر فتحة الطرف. كلما كان ذلك أسرع كلما كان الضرر أكثر.
  3. حجم وصلابة الخلية. الخلايا الأكبر هي أكثر عرضة للتلف. الخلايا ذات الجدار المورين أقل عرضة للتلف.
  4. تركيز الخلايا. الثقافات الأكثر تركيزًا هي أكثر عرضة للتلف.

لأن التركيب إذا كانت الخلية نفسها لها تأثير كبير على مقدار الضرر ، وبسبب التنوع الهائل للخلايا ؛ سيكون تصميم تجربة تمثيلية لتقييم الضرر صعبًا وشاقًا للغاية.

أخيرًا ، تنوع النصائح والسيرولوجيات هائلة أيضًا. ومع ذلك ، إذا حاول المرء تقييم ذلك ، فيمكن القيام به:

اختر مجموعة متنوعة تمثيلية من خطوط الخلايا ، اختر مجموعة متنوعة تمثيلية من الماصات. قد يرغب المرء على الأرجح في استخدام ماصة آلية ليتمكن من تقييم السرعات والضغوط المعينة بشكل متزايد. انظر إلى تركيزات الثقافة المختلفة ، ومراحل منحنى النمو ، والوقت بين الماصات والتحليل ، والمسافة بين السائل الخارج والثقافة ، إلخ ، إلخ.

أعتقد أن طريقة تحليل ناجحة للغاية ستستخدم يوديد البروبيديوم ونظام مراقبة الأصول الميدانية.

بعد تجربتك التي ستكلف الكثير من الوقت والدولار ، أعتقد أنك ستجد قواعد الفطرة السليمة: حافظ على المصاصة إلى الحد الأدنى واستخدم نصائح أوسع كلما أمكن ذلك.


إنها تجربة سهلة. خذ خلاياك قسما منها إلى 10 أنابيب ميكروفوج ، وامص كل تعليق كمية متزايدة من المرات ، وصمة عار باللون الأزرق التريبان وعد.

ستكون أهم العوامل هي نوع الماصة الذي تستخدمه ؛ أتوقع أن يتسبب p1000 في مزيد من الضرر ثم p200 ثم p20 بسبب سرعة السائل. سيكون العامل الأكثر أهمية أيضًا هو مهارة العالم ، إذا قمت بالماصة ببطء ، فيجب أن تقلل الإجهاد بدلاً من المص بسرعة.

من واقع خبرتي ، يعتمد الأمر على نوع الماصة ومهارة المشغل. الطريقة الوحيدة للإجابة عن هذا السؤال هي أن تجربه بشكل تجريبي.


من خلال القصص المتناقلة ، لم ألاحظ أي موت للخلايا عند سحب العينة بكتريا قولونية DH5alpha أو TOP10 ، ولكن كخلايا مختصة ، يتم تثبيط الاختلاط عن طريق الماصات لأعلى ولأسفل بسبب جدار الخلية المخترق.


من الأفضل تقديم هذا السؤال في الفيزياء أو الكيمياء. لا أعتقد أن لدينا هندسة عامة حيث يمكن وصف ديناميكيات الموائع بطريقة مختلفة عن الفيزياء ، ولكن إذا فعلنا ذلك ، فيجب أيضًا الإجابة عليها هناك.

في الواقع ، فإن الضغط الاسموزي أو السائل في حد ذاته قد يتسبب في حدوث تغييرات قد تلحق الضرر بالخلية. ثم التفاعلات الأخرى الماصة للحرارة والممتدة للحرارة للمواد الكيميائية بسبب قوة التأثير مثل الكيماويات أو الاحتكاك.

أنا متأكد من المتطلبات الأخرى للحفاظ على الطاقة والتي تجاهلتها بشكل شبه خطير.

لقد وجدت هذه الورقة الشيقة التي تركز على إجهاد القص بشكل عام.

يتسبب سحب العينات في إجهاد القص وارتفاع مستوى البروتين كيناز / جون كيناز المُنشط بالإجهاد المُفَسَفَر في أجنة ما قبل الزرع.

شي Y1 ، وانغ ف ، بوشيك إي إي ، رابولي دا.

إجهاد القص عند 1.2 داين / سم (2) يؤدي إلى فسفرة بروتين كيناز / جون كيناز الذي يسبق وتسبب موت الخلايا المبرمج في الأجنة (Xie et al. ، 2006b ، Biol Reprod). تعد أجنة الماصات ضرورية للعديد من البروتوكولات ، من الإخصاب في المختبر إلى جمع الأجنة قبل تحليل التعبير الجيني بواسطة المصفوفات الدقيقة. سعينا إلى تحديد ما إذا كانت الأنابيب تنظم MAPK8 / 9 الفسفوري (المعروف سابقًا باسم بروتين كيناز المنشط بالإجهاد / جون كيناز / SAPK / JNK1 ، 2). وجدنا أن MAPK8 / 9 الفسفوري ، علامة تنشيط MAPK8 / 9 ، يتم تنظيمه بطريقة تعتمد على الجرعة عن طريق الماصات. في حين أن الأجنة التي تمت إزالتها من المنطقة الشفافة كانت أكثر حساسية للفتك الناجم عن الإجهاد بوساطة قوة قص 1.2 داين / سم (2) ، تم تحفيز MAPK8 / 9 الفسفوري عند عدد أقل من تراتيرات الماصات في الأجنة الفقس عند E4.5. كانت الأجنة E4.5 أكثر حساسية لتحريض MAPK8 / 9 من الأجنة غير المقشورة عند E2.5 أو E3.5. أظهرت الأجنة E3.5 أيضًا تحفيزًا يعتمد على الجرعة في سحب بروتين FOS (المعروف سابقًا باسم c-fos) ، وهو علامة لإجهاد القص في العديد من أنواع الخلايا. تم التعبير عن MAPK8 / 9 المفسفر الذي تم قياسه في أجنة خارج الجسم الحي من E1.5 إلى E4.5 عند مستويات منخفضة. كان لدى الأجنة التي تم تنقيطها بشكل كافٍ لتحفيز MAPK8 / 9 الفسفرة و FOS نفس عدد الخلايا مثل الأجنة غير المعالجة بعد 24 ساعة. يشير هذا إلى أن الفسفرة السريعة لـ MAPK8 / 9 بسبب إجهاد القص العابر لا تتوسط نتائج بيولوجية سلبية طويلة المدى. ولكن ، من الممكن أن التقنيات التي تتطلب أحداث معالجة متعددة من شأنها أن تحفز MAPK8 / 9 وتسبب نتائج بيولوجية أو أن النتائج البيولوجية الأخرى تتأثر بكميات منخفضة من إجهاد القص العابر. تقترح هذه الدراسة أن التعامل مع الأجنة قبل القياس التجريبي لبروتينات الفوسفوبروتينات والبروتينات و mRNA يجب أن يتم بحذر. في الواقع ، من المحتمل أن يسبب إجهاد القص تغيرات عابرة سريعة في مئات البروتينات و mRNA.


عادةً ما يتم قياس إجهاد القص $ tau $ بهذه الأحجام الصغيرة بوحدة dyn / cm2 أو N / m2 = Pa. المعادلات بينهما: $ 1dyn / cm ^ 2 = 10 ^ {- 5} N / cm ^ 2 = 0.1N / م ^ 2 = 0.1 باسكال دولار.

ما نوع الأضرار التي يمكن أن تعانيها البيضة الملقحة؟

باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني ، وجدنا ثقوبًا مفتوحة على سطح البيض المفسد ، مما يشير إلى فشل غشاء البلازما في الانغلاق بعد الحقن المجهري. لم يُلاحظ وجود ثقوب في البيض غير المحصن ، ولكن العديد منهم تعرضوا لتغييرات غشائية توحي بوجود ثقوب ملتئمة.

  • 1987 - جدوى اللاقحة في تجارب نقل الجينات

حتى إجهاد القص الصغير 1.2 داين / سم 2 يحث على موت الخلايا المبرمج عن طريق الماصات الملقحة. لذا فإن الزيجوت لها مستوى إجهاد القص الحرج بمقدار 1.2 دين / سم 2 ، بينما تتضمن الماصات قوى أكبر من 1.2 داين / سم 2.

إجهاد القص عند 1.2 داين / سم 2 يؤدي إلى فسفرة بروتين كيناز / جون كيناز الذي يسبق وتسبب موت الخلايا المبرمج في الأجنة (Xie et al. ، 2006b ، Biol Reprod). تعد أجنة الماصات ضرورية للعديد من البروتوكولات ، من الإخصاب في المختبر إلى جمع الأجنة قبل تحليل التعبير الجيني بواسطة المصفوفات الدقيقة. سعينا إلى تحديد ما إذا كانت الأنابيب تنظم MAPK8 / 9 الفسفوري (المعروف سابقًا باسم بروتين كيناز المنشط بالإجهاد / جون كيناز / SAPK / JNK1 ، 2). وجدنا أن MAPK8 / 9 الفسفوري ، علامة تنشيط MAPK8 / 9 ، يتم تنظيمه بطريقة تعتمد على الجرعة عن طريق الماصات.

  • 2007 - تسبب سحب العينات في إجهاد القص وارتفاع مستوى بروتين كيناز / جون كيناز المُنشط بالإجهاد المُنشط بالفوسفور في أجنة ما قبل الغرس

يتراوح مستوى إجهاد القص الحرج بين 0.01 و 1000 داين / سم 2 بواسطة الخلايا الحيوانية اعتمادًا على نوع الخلية والأنواع. (أعتقد أن المتوسط ​​يبلغ في مكان ما حوالي 50 دين / سم 2 ، ولكن من الصعب جدًا التمييز بين المقالات التي تذكر مستويات القص الحرجة ومعظم مستويات القص المميتة ، وبالتالي قد يكون النطاق والمتوسط ​​أقل.) ثابت الموت (1 / ساعة) ) يزيد أضعافا مضاعفة عن طريق زيادة إجهاد القص.

تم تطوير جهاز للتحقيق التفصيلي لتأثير إجهاد القص على خلايا BHK الملتصقة. تمت دراسة قوى القص بين 0.0 و 2.5 نيوتن متر مربع. تم تحديد التأثير على حيوية الخلية ، ومورفولوجيا الخلية ، وتحلل الخلية ، وحجم الخلية. أدت زيادة قوى القص وكذلك زيادة مدة التعرض إلى تغيرات متزايدة في شكل الخلية وموت الخلايا. تم تحديد "مستوى إجهاد القص الحرج".

  • 1992 - تحديد "مستوى إجهاد القص الحرج" المطبق على خلايا الثدييات الملتصقة

تم فحص الضرر الناتج عن إجهاد القص للورم الهجين في الفئران بواسطة أبو ريش وكارجي في ظل الظروف الصفائحية والمضطربة في مقياس اللزوجة Searle الأسطواني المحوري. تعرضت الخلايا لمستويات إجهاد قص من 5 إلى 100 نيوتن / م 2 لمدة 0.5 إلى 3.0 ساعة. في وقت معين من إجهاد القص ووقت التعرض ، كان القص المضطرب أكثر ضررًا من القص الرقائقي كما تم الإبلاغ عنه في الماضي بالنسبة للأوليات والخلايا النباتية. في ظل الظروف المضطربة ، حدث الضرر عندما تجاوز إجهاد القص 5 نيوتن / م 2. تضرر النشاط التنفسي للخلايا في وقت أبكر من غشاء الخلية ، مما يعني ضمناً انتقال إشارة الإجهاد إلى داخل الخلية. يتبع تلف الخلايا حركية من الدرجة الأولى في كل من البيئات الرقائقية والاضطرابات. بالنسبة لمستويات إجهاد القص المضطرب من 5 إلى 30 نيوتن / م 2 ، زاد ثابت معدل الوفيات (kd) أضعافًا مضاعفة مع زيادة مستوى الإجهاد ؛ اختلفت قيم kd بين 0.1 و 1.0 1 / h.

  • 2001 - الأضرار الهيدروديناميكية التي تلحق بالخلايا الحيوانية

تتكاثر الثقافات البطانية شبه المتقاربة التي تتعرض باستمرار لقص 1-5 داين / سم 2 بمعدل مماثل لمعدل الثقافات الثابتة وتصل إلى نفس كثافة التشبع (≃ 1.0-1.5 × 105 خلية / سم 2). عندما تتعرض لضغط القص الصفحي من 5-10 داين / سم 2 ، تخضع الطبقات الأحادية المتكدسة لتغيير يعتمد على الوقت في شكل الخلية من متعدد الأضلاع إلى بيضاوي الشكل وتصبح موجهة بشكل موحد مع التدفق. يبدو أن تجديد "الجروح" الخطية في الطبقة الأحادية المتكدسة يتأثر باتجاه القوة المطبقة. تشير الدراسات الأولية إلى أن بعض وظائف الخلايا البطانية ، بما في ذلك الالتقام الخلوي السائل ، والتجمع الهيكلي الخلوي وخصائص السطح غير التجلطي ، حساسة أيضًا لإجهاد القص. تشير هذه الملاحظات إلى أن القوى الميكانيكية للسوائل يمكن أن تؤثر بشكل مباشر على بنية الخلية البطانية ووظيفتها.

  • 1981 - الاستجابة الديناميكية للخلايا البطانية الوعائية لإجهاد القص السائل

أدى إجهاد القص فوق 0.25 داين / سم (2) إلى فقدان كبير للخلايا البودوسية ولكن ليس الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة (خلايا LLC-PK (1)) بعد 20 ساعة.

  • 2006 - خلايا بودوسيت حساسة لإجهاد قص السوائل في المختبر

تم إجراء سلسلة من الدراسات الدقيقة حول تلف الدم في مقياس اللزوجة الدوراني. تم التركيز بشكل خاص على تأثيرات تفاعل السطح الصلب ، وقوة الطرد المركزي ، وتفاعل واجهة الهواء ، وخلط الطبقات المنفصمة وغير المنفصمة ، والتفاعل الخلوي الخلوي ، والتسخين اللزج. تظهر النتائج أن هناك إجهاد قص عتبة ، 1500 داين / سم 2 ، فوقها يكون تلف الخلية الواسع بسبب إجهاد القص مباشرة ، والتأثيرات الثانوية المختلفة المذكورة أعلاه لا تذكر.

  • 1972 - تلف خلايا الدم الحمراء بسبب إجهاد القص

عتبة إجهاد القص لبعض دينوفلاجيلات (الطحالب الدقيقة) أقل من عتبة كريات الدم الحمراء (0.029 نيوتن / م 2). على سبيل المثال ، أثبت مستوى إجهاد القص الصفحي المستمر البالغ 0.0044 نيوتن / م 2 (أي ما يعادل معدل القص 2.2 1 / ثانية) أنه قاتل لسوطيات دينوفلاجيل Gonyaulax polyedra.

أنواع الخلايا الأخرى ليست ضرورية مثل الخلايا الحيوانية ولا تتفاعل بالضرورة مع موت الخلايا المبرمج (حوالي 10 داين / سم 2) لقص الإجهاد ، لذلك عليك استخدام قوى نخرية (حوالي 5000 داين / سم 2) لتدميرها:

حجم نوع الخلية حساسية القص الخلايا الميكروبية 1-10 ميكرومتر حبيبات / كتل ميكروبية منخفضة تصل إلى 1 سم من الخلايا النباتية المعتدلة 100 ميكرومتر تجمعات الخلايا النباتية المتوسطة / العالية حتى 1-2 سم خلايا حيوانية عالية 20 ميكرومتر خلايا حيوانية عالية على ناقلات دقيقة 80-200 ميكرومتر خلايا فطرية عالية جدًا 2 -10μm معتدلة / عالية
  • الجدول 1 - حساسية القص حسب أنواع الخلايا
  • مبادئ هندسة العمليات الحيوية: الجدول 8.6 - بولين م دوران
  • 1996 - دور القص الهيدروديناميكي في زراعة الخلايا الحيوانية والنباتية والميكروبية
  • 1988 - تأثير القص على حيوية المعلقات الخلوية النباتية
  • 2004 - تحليل كمي لتأثيرات القص على تعليق الخلية وثقافة الخلية من perilla frutescens (النبات) في المفاعلات الحيوية
  • 2009 - حساسية القص - ربما يحتوي النص الكامل على جميع الأرقام

تظهر النتائج أن مبيض الهامستر الصيني وخلايا الكلى الجنينية البشرية ستدخل مسار موت الخلايا المبرمج عندما تتعرض لمستويات منخفضة من الإجهاد الهيدروديناميكي (حوالي 2.0 باسكال) في تدفق متذبذب وامتداد. في المقابل ، يسود الموت النخر عندما تتعرض الخلايا لضغوط هيدروديناميكية حول 1.0 باسكال في تدفق القص البسيط أو حوالي 500 باسكال في التدفق الممتد.

  • 2009 - تحريض موت خلايا الثدييات عن طريق القص البسيط والتدفقات البعيدة

لا يتم تحديد حساسية القص فقط من خلال نوع الخلية والأنواع ، فهناك العديد من العوامل الأخرى المعنية:

  • نوع الخلية والأنواع
  • تكوين وسمك جدار الخلية عند وجوده
  • حجم وتشكل الخلية
  • شدة وطبيعة إجهاد القص ، سواء كان مضطربًا أو رقائقيًا ، أو مرتبطًا بالواجهات (على سبيل المثال أثناء صعود الفقاعة وتمزقها)
  • تاريخ النمو ، سواء على المدى القصير (مثل الجوع) أو التكيف على المدى الطويل
  • وسط النمو (العناصر النزرة والفيتامينات ومصادر الكربون والنيتروجين)
  • معدل النمو
  • مرحلة النمو
  • نوع وتركيز عوامل الحماية من القص إن وجدت

يمكن أن تكون الخلايا حساسة للغاية لضغط القص الناجم عن التدفق المضطرب ، في حين أنها ليست حساسة للغاية لإجهاد القص الناجم عن التدفق الصفحي.

على أساس قياسات لزوجة التدفق الصفحي ، تم اقتراح مستوى إجهاد قص حرج يتراوح بين 80-200 نيوتن / متر مربع لخلايا Morindata citrifolia.

... بينما بالنسبة إلى Daucus carota ، ارتبط مستوى إجهاد القص البالغ 50 نيوتن / متر مربع بتلف الخلايا. في دراسة أخرى ، فقدت خلايا الجزر في التدفق الصفحي مقياس اللزوجة Couette القدرة على النمو والانقسام في نطاق إجهاد القص من 0.5-100 N / m2. تم إعاقة نشاط الإنزيم داخل الخلايا عند مستويات إجهاد القص أعلى من 3000 نيوتن / م 2 ، ولكن لم يحدث تحلل كبير حتى مستوى إجهاد القص 10.000 نيوتن / م 2 المطبق على محيط طويل (> 1 ساعة).

على النقيض من السلوك في التدفق الصفحي ، كانت الخلايا حساسة تمامًا لتحريك الدافع المضطرب. سرعات طرف المكره التي تبلغ 1.1 م / ث تقريبًا يتم فصل نسبة كبيرة من الخلايا في غضون 40 دقيقة.

يكون تلف الفقاعة شديدًا (1000 خلية بفقاعة واحدة بحجم 3.5 مم) بسبب التصاق الخلية بواجهة الفقاعة والقوى القوية المعنية (> 1000 دين / سم 2 بواسطة مفاعلات حيوية مقلبة). التصاق وبالتالي يمكن تقليل الضرر مع السطحي.

  • 2004 - دراسات كمية لتفاعلات الفقاعات الخلوية وتلف الخلايا عند تركيزات مختلفة من خلايا pluronic F-68 والخلية.
  • 2004 - تقليل الفاعل بالسطح في التصاق الفقاعات الانسداد والضرر البطاني

يُقترح أنه عندما تكون الخلايا مرتبطة أو قريبة جدًا من فقاعة تمزق ، فإن القوى الهيدروديناميكية المرتبطة بالتمزق تكون كافية لقتل الخلايا.

أجريت جميع التجارب باستخدام خلايا الحشرات Spodoptera frugiperda (SF-9) ، في وسط TNM-FH و SFML ، مع وبدون Pluronic F-68. تشير التجارب إلى أن ما يقرب من 1050 خلية تُقتل لكل تمزق فقاعي منفرد يبلغ 3.5 ملم في وسط TNM-FH وأن العدد نفسه تقريبًا من الخلايا الميتة موجود في النفاثة الصاعدة. وقد لوحظ أيضًا أن تركيز الخلايا في هذه الطائرة الصاعدة أعلى من تعليق الخلية في وسط TNM-FH بدون Pluronic F-68 بمعامل اثنين. ويعتقد أن هذا التركيز العالي هو نتيجة التصاق الخلايا بواجهة الفقاعة. تنجرف هذه الخلايا إلى الأعلى خلال عملية تمزق الفقاعة. أخيرًا ، يُقترح أن طبقة رقيقة حول الفقاعة تحتوي على هذه الخلايا الممتصة هي "حجم القتل الافتراضي" الذي قدمه باحثون آخرون.

  • 1994 - التحديد الكمي للضرر الذي لحق بالخلايا الحشرية المعلقة نتيجة تمزق الفقاعات

بالنسبة لخط الورم الهجين ، تم الإبلاغ عن أن التعرض لضغط القص الصفحي (208 نيوتن / م 2) في التدفق غير المهوى في مخروط ومقياس اللزوجة الصفيحية أدى إلى خسارة كبيرة في عدد الخلايا والصلاحية في غضون 20 دقيقة. عند تعرض ثابت لمدة 180 ثانية ، يزيد إجهاد القص على مدى 100-350 نيوتن / متر مربع من اضطراب الخلية المعزز خطيًا ، مع تدمير أكثر من 90 ٪ من الخلايا عند مستوى إجهاد 350 نيوتن / متر مربع. قد تتراوح مستويات شرائط القص المرتبطة بتمزق الفقاعات على سطح مفاعل حيوي بين 100-300 نيوتن / متر مربع. تتوافق هذه القيم بشكل ملحوظ مع معدلات القص التي أضرت بالأورام الهجينة في تجارب التدفق الصفحي غير المهواة.

تسبب الماصات ذات الفتحات الصغيرة مزيدًا من الضرر.

قمنا أيضًا بفحص جوانب إجراء نقل الجينات التي قد تؤثر على البقاء مثل حجم ماصات الحقن وتفتقها بالنسبة إلى قطر الزيجوت ، والسمية المحتملة لوسط الحقن ، وتوقيت الحقن ، والسحب الفوري مقابل المتأخر للماصة. كانت العوامل الوحيدة التي أثرت بشكل كبير على بقاء الخلية هي حجم الماصة والاستدقاق ، وتوقيت الحقن فيما يتعلق بالانقسام الأول. يشير هذا إلى أن قابلية بقاء البيضة الملقحة ترتبط عكسياً بحجم الفتحة التي تنتجها ماصة الحقن وأن الضرر الذي يلحق بالغشاء لا يتم إصلاحه بنجاح لأن البويضة المخصبة تستعد للانقسام.

  • 1987 - جدوى اللاقحة في تجارب نقل الجينات

من الصعب العثور على أي شيء عن مستوى إجهاد القص بالمص. يمكن أن يكون بالتأكيد أكثر من 1 داين / سم 2. لها مدة قصيرة (بضع ثوان على الأكثر). أعتقد أن العوامل التالية يمكن أن تؤثر على مستويات إجهاد القص عن طريق الماصات:

  • نوع الماصة
  • سرعة التدفق (يمكن أن يكون التدفق الأسرع مضطربًا على الأرجح)
    • الضغط السلبي عن طريق الشفط
    • حجم الثقب (الحفرة الأكبر يمكن أن تقلل من سرعة التدفق)
    • لزوجة سائلة
  • تشكيل الفقاعة

ربما يتم تضمين المزيد من العوامل ولكني لست خبيرًا في سحب العينات. ؛-) أنا أتفق مع الآخرين ، فهذا بالتأكيد يعتمد على المهارات الشخصية ، على سبيل المثال يمكن للهواة إنشاء فقاعات ضخمة عن طريق الماصات ، والتي يمكن أن تقتل الكثير من الخلايا عن طريق التكوين والتعطيل ...

أتفق مع Artem في أن هذه تجربة يجب القيام بها خاصة إذا كانت النتيجة مهمة بالنسبة لك. ما تحتاجه لإنشاء نموذج حول تلف الماصة ، هو مستويات إجهاد القص بواسطة الماصة ومستويات إجهاد القص الحرجة للخلايا. أعتقد أنه من الصعب التصميم والتجربة حيث يمكنك قياس مستويات إجهاد القص في الماصات ولا يوجد نموذج تدفق للمصاصات بقدر ما أعرف ، لذلك يمكن أن يكون موضوعًا جيدًا لأطروحة أو عمل دبلوم.


أعلم أن هذا الموضوع عمره عامين ، لكنني على الرغم من أنني سأقوم بنشر هذا على أي حال في حالة بحث شخص آخر عن هذه الإجابة كما لو كنت الليلة. لا تناقش هذه المقالة المذكورة أدناه نصائح الماصة مقابل الإبر على وجه التحديد ، ولكنها تناقش الفرق في تأثيرات التناقص مقابل الإبر الأسطوانية على تلف الخلايا. لسوء الحظ ، فإن الرياضيات الموجودة في الورقة أبعد قليلاً عني (أنا طبيب ، ولست مهندسًا ، ولم يغطوا هذه الأشياء في كلية الطب) ، لكنهم وجدوا أن استخدام الإبر الأسطوانية ينتج عنه ما يقرب من 5 أضعاف كمية موت الخلايا مقارنة بإبرة مدببة بأي معدل تدفق معين ، وحوالي 6-8 أضعاف كمية الخلايا التالفة. كان هذا على الأرجح بسبب الحاجة إلى ضغوط أعلى لزيادة معدلات التدفق في الإبر الأسطوانية مقارنة بالإبر المدببة والاختلافات في القص بسبب الأشكال الهندسية. في حين أن الإبرة المدببة ليست مطابقة لطرف الماصة البلاستيكية ، فإن الأشكال الهندسية قابلة للمقارنة.

برنامج Biotechnol. 2011 نوفمبر - ديسمبر ؛ 27 (6): 1777-84. تأثير هندسة الإبرة على معدل التدفق وتلف الخلايا في عملية التصنيع الحيوي القائمة على الاستغناء. لي إم 1 ، تيان إكس ، شراير دي جي ، تشين إكس.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/btpr.679/full


لدي مثال بيولوجي حقيقي. إعداد التجربة المبسط: تخضع الخلايا البائية المنقاة خارج الجسم الحي لثلاث عمليات غسل في برنامج تلفزيوني (الدوران وإعادة التعليق) ، ثم يتم تحضينها في المختبر لمدة 24 ساعة وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام Acqua Zombie و PI لاستبعاد الخلايا الميتة. التجربة 1: سحب الماصات بعد الغسل باستخدام طرف 1 مل. التجربة 2: سحب الماصات بعد الغسل باستخدام ماصة 10 مل

بقاء الخلية كما تم تحليله بواسطة قياس التدفق الخلوي: التجربة 1: 9.96٪ التجربة الثانية: 43.9٪


ثقافة الخلية الأولية: 3 تقنيات (مع رسم بياني)

تتضمن الزراعة الأولية على نطاق واسع تقنيات الاستزراع التي يتم إجراؤها بعد عزل الخلايا ، ولكن قبل الثقافة الفرعية الأولى. عادة ما يتم تحضير الثقافات الأولية من كتل الأنسجة الكبيرة. وبالتالي ، قد تحتوي هذه الثقافات على مجموعة متنوعة من الخلايا المتمايزة على سبيل المثال الخلايا الليفية ، الخلايا الليمفاوية ، الضامة ، الخلايا الظهارية.

من خلال تجارب الموظفين العاملين في مختبرات زراعة الأنسجة ، تؤخذ المعايير / الخصائص التالية في الاعتبار من أجل التطوير الفعال للثقافات الأولية:

أ. تُفضل الأنسجة الجنينية بدلاً من أنسجة البالغين في الثقافات الأولية. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن الخلايا الجنينية يمكن أن تتفكك بسهولة وتنتج خلايا أكثر قابلية للحياة ، إلى جانب تكاثرها بسرعة في المختبر.

ب. يجب أن تكون كمية الخلايا المستخدمة في الثقافة الأولية أعلى لأن معدل بقائها أقل بكثير (بالمقارنة مع الثقافات الفرعية).

ج. يجب معالجة الأنسجة بأقل ضرر للخلايا لاستخدامها في الثقافة الأولية. علاوة على ذلك ، يجب إزالة الخلايا الميتة.

د. يُنصح باختيار وسيط مناسب (ويفضل أن يكون غنيًا بالمغذيات). لإضافة المصل ، يفضل مصدر بقري جنيني بدلاً من مصل العجل أو الحصان.

ه. من الضروري إزالة الإنزيمات المستخدمة في تفكيك الخلايا بالطرد المركزي.

تقنيات الثقافة الأولية:

من بين التقنيات المختلفة التي تم ابتكارها للزراعة الأولية للأنسجة المعزولة ، هناك ثلاث تقنيات هي الأكثر شيوعًا:

1. التفصيل الميكانيكي.

2. التفصيل الأنزيمي.

3. تقنية النبات الأساسي.

يوضح الشكل 36.1 مخططًا لهذه التقنيات ، ويتم وصف الإجراءات بإيجاز:

تقنية # 1. التفصيل الميكانيكي:

من أجل تفصيل الأنسجة الرخوة (مثل الطحال والدماغ والكبد الجنيني والأورام الرخوة) ، عادةً ما يتم استخدام التقنية الميكانيكية. تتضمن هذه التقنية بشكل أساسي تقطيع أو تقطيع الأنسجة بعناية إلى قطع وجمع الخلايا المنسكبة.

يمكن جمع الخلايا بطريقتين:

أنا. الضغط على قطع الأنسجة من خلال سلسلة من المناخل مع تقليل تدريجي لحجم الشبكة.

ثانيا. دفع شظايا الأنسجة من خلال حقنة وإبرة.

على الرغم من أن التصنيف الميكانيكي ينطوي على مخاطر تلف الخلايا ، إلا أن الإجراء أقل تكلفة وسريعًا وبسيطًا. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص عندما يكون توافر الأنسجة بكثرة ، وكفاءة المحصول ليست بالغة الأهمية. ومع ذلك ، يجب ملاحظة أن قابلية الخلايا التي تم الحصول عليها من التقنيات الميكانيكية على قيد الحياة أقل بكثير من التقنية الأنزيمية.

تقنية # 2. التفصيل الأنزيمي:

يستخدم التفصيل الأنزيمي في الغالب عند الحاجة إلى استعادة عالية للخلايا من الأنسجة. يعتبر تفكيك الأنسجة الجنينية أكثر كفاءة مع زيادة إنتاجية الخلايا باستخدام الإنزيمات. هذا يرجع إلى وجود نسيج ضام ليفي أقل ومصفوفة خارج الخلية. يمكن إجراء التفصيل الأنزيمي باستخدام التربسين أو الكولاجيناز أو بعض الإنزيمات الأخرى.

التفصيل عن طريق التربسين:

يستخدم مصطلح التربسين بشكل شائع لتفكيك الأنسجة بواسطة إنزيم التربسين.

يفضل العديد من العمال استخدام التربسين الخام بدلاً من التربسين النقي للأسباب التالية:

أنا. التربسين الخام أكثر فعالية بسبب وجود بروتياز أخرى

ثانيا. يمكن للخلايا أن تتحمل التربسين الخام بشكل أفضل.

ثالثا. يمكن تحييد النشاط المتبقي للتربسين الخام بسهولة بواسطة مصل وسائط الاستنبات (عند استخدام وسائط خالية من المصل ، يمكن استخدام مثبط التربسين للتحييد).

يمكن أيضًا تفكيك الخلايا باستخدام التربسين النقي الذي يكون أقل سمية وأكثر تحديدًا في عمله. يتم تقطيع الأنسجة المرغوبة إلى قطع 2-3 مم ثم يتم تفكيكها بواسطة التربسين. هناك نوعان من تقنيات التربسين - التربسين الدافئ والتريبسين البارد (الشكل 36.2).

التربسين الدافئ (الشكل 36.2 أ):

تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع لتفصيل الخلايا. يتم غسل الأنسجة المقطعة بمحلول الملح القاعدي (DBSS) ، ثم يتم نقلها إلى قارورة تحتوي على التربسين الدافئ (37 درجة مئوية). يتم تقليب المحتويات ، وفي فاصل زمني كل ثلاثين دقيقة ، يمكن جمع المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا المنفصلة. بعد إزالة التربسين ، يتم تشتيت الخلايا في وسط مناسب وحفظها (عن طريق الحفاظ على القارورة على الجليد).

تتم عملية إضافة التربسين الطازج (إلى قطع الأنسجة) ، وحضانة وتجميع الخلايا المنفصلة (بفواصل زمنية 30 دقيقة) لمدة 4 ساعات تقريبًا. يتم تجميع الخلايا المصنفة وإحصائها وتخفيفها بشكل مناسب ثم احتضانها.

التربسين البارد (الشكل 36.2 ب):

يُشار إلى هذه التقنية بشكل أكثر ملاءمة باسم التربسين مع التعرض المسبق البارد. يمكن التقليل من خطر تلف الخلايا عن طريق التعرض المطول للتربسين عند 37 درجة مئوية (في التربسين الدافئ) في هذه التقنية.

بعد التقطيع والغسيل ، تُحفظ قطع المناديل في قنينة (على الجليد) وتُنقع في التربسين البارد لمدة 6-24 ساعة تقريبًا. تتم إزالة التربسين والتخلص منه. ومع ذلك ، تحتوي قطع الأنسجة على التربسين المتبقية. يتم تحضين قطع الأنسجة هذه في وسط عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. تتشتت الخلايا عن طريق المداعبات المتكررة. يمكن عد الخلايا المنفصلة وتخفيفها بشكل مناسب ثم استخدامها.

عادة ما ينتج عن طريقة التربسين الباردة إنتاجية أعلى للخلايا القابلة للحياة مع بقاء أفضل للخلايا بعد 24 ساعة من الحضانة. لا تتضمن هذه الطريقة التحريك أو الطرد المركزي ، ويمكن اعتمادها بسهولة في المختبر. القيد الرئيسي للتريبسين البارد هو أنه غير مناسب لتفكيك الخلايا من كميات كبيرة من الأنسجة.

حدود تفصيل التربسين:

قد يؤدي التفكك بواسطة التربسين إلى إتلاف بعض الخلايا (مثل الخلايا الظهارية) أو قد يكون غير فعال تقريبًا لبعض الأنسجة (مثل النسيج الضام الليفي). ومن ثم فإن الإنزيمات الأخرى تستخدم أيضًا لتفكك الخلايا.

التفصيل حسب الكولاجيناز:

الكولاجين هو البروتين الهيكلي الأكثر وفرة في الحيوانات العليا. يوجد بشكل رئيسي في المصفوفة خارج الخلية للنسيج الضام والعضلات. يمكن استخدام إنزيم كولاجيناز (عادة ما يكون خامًا ملوثًا بالبروتياز غير المحدد) بشكل فعال لتفكيك العديد من الأنسجة (الطبيعية أو الخبيثة) التي قد تكون حساسة للتربسين.

تمت تجربة درجات عالية النقاء من الكولاجيناز ، لكنها أقل فعالية عند مقارنتها بالكولاجيناز الخام. فيما يلي وصف موجز للمراحل المهمة في تفصيل إنزيم الكولاجين ، المبين في الشكل 36.3.

يتم تقطيع الأنسجة المرغوبة المعلقة في محلول الملح القاعدي المحتوي على المضادات الحيوية إلى قطع. يتم غسل هذه القطع عن طريق الترسيب ، ثم تعليقها في وسط كامل يحتوي على كولاجيناز. بعد الحضانة لمدة 1-5 أيام ، يتم تشتيت قطع المناديل بواسطة الماصات. يتم فصل مجموعات الخلايا عن طريق الاستقرار. يمكن فصل الخلايا الظهارية والخلايا الليفية.

تم استخدام تصنيف الكولاجيناز بنجاح في الدماغ البشري والرئة والعديد من الأنسجة الظهارية الأخرى ، إلى جانب الأورام البشرية المختلفة ، والأنسجة الحيوانية الأخرى. إضافة إنزيم آخر هيالورونيداز (يعمل على بقايا الكربوهيدرات على أسطح الخلايا) يعزز التفكك.

تم العثور على كولاجيناز بالاشتراك مع الهيالورونيداز ليكون فعالًا جدًا في فصل كبد الفئران أو الأرانب. يمكن القيام بذلك عن طريق دمج العضو بأكمله في الموقع. يستخدم بعض العمال الكولاجيناز بالتزامن مع التربسين ، وهي تركيبة تم تطويرها في مصل الدجاج ، لتفكيك أنسجة معينة.

استخدام إنزيمات أخرى في التفصيل:

التربسين والكولاجيناز هما الإنزيمات الأكثر استخدامًا للتجزئة. تم استخدام بعض البروتياز البكتيري (على سبيل المثال ، البرانس ، الديباز) بنجاح محدود. إلى جانب الهيالورونيداز ، يستخدم النيورامينيداز أيضًا جنبًا إلى جنب مع كولاجيناز من أجل التحلل الفعال للكربوهيدرات الموجودة على سطح الخلية.

تقنية # 3. تقنية Explant الأولية:

كانت التقنية الأولية للزراعة هي ، في الواقع ، الطريقة الأصلية ، التي طورها هاريسون في عام 1907. خضعت هذه التقنية لعدة تعديلات ، ولا تزال قيد الاستخدام. يوضح الشكل 36.4 الإجراء المبسط المعتمد للثقافة النباتية الأولية في الشكل 36.4 ، ويتم وصفه بإيجاز أدناه.

يتم تقطيع الأنسجة الموجودة في محلول الملح القاعدي جيدًا وغسلها بواسطة الترسبات. ثم يتم إزالة محلول الملح القاعدي. تنتشر قطع الأنسجة بالتساوي على سطح النمو. بعد إضافة الوسط المناسب ، تتم الحضانة لمدة 3-5 أيام. ثم يتم تغيير الوسيط على فترات أسبوعية حتى يتم ملاحظة نمو كبير للخلايا. الآن ، يتم إزالة النباتات المستأصلة ونقلها إلى وعاء استزراع جديد.

تعتبر التقنية الأساسية للزراعة مفيدة بشكل خاص في تصنيف الكميات الصغيرة من الأنسجة (مثل خزعات الجلد). ومع ذلك ، فإن الطريقتين الأخريين التقسيم الميكانيكي أو الأنزيمي غير مناسبين للكميات الصغيرة من الأنسجة ، حيث يوجد خطر فقدان الخلايا.

يتمثل الحد من تقنية النبات المستأصل في ضعف التصاق أنسجة معينة بسطح النمو واختيار الخلايا في النتوء. ومع ذلك ، لوحظ أنه يمكن استخدام تقنية النبات المستأصل الأولية لغالبية الخلايا الجنينية ، على سبيل المثال. الخلايا الليفية ، الخلايا العضلية ، الخلايا الظهارية ، الخلايا الدبقية.

فصل الخلايا القابلة للحياة وغير القابلة للحياة:

إنها ممارسة شائعة لإزالة الخلايا غير القابلة للحياة بينما يتم تحضير الثقافة الأولية من الخلايا المصنفة. يتم ذلك عادةً عند إجراء التغيير الأول للوسيط. يتم تخفيف القلة القليلة المتبقية من الخلايا غير القابلة للحياة وتختفي تدريجياً مع بدء تكاثر الخلايا القابلة للحياة.

Sometimes, the non-viable cells from the primary cultures may be removed by centrifugation. The cells are mixed with ficoll and sodium metrizoate, and centrifuged. The dead cells form a pellet at the bottom of the tube.

Medical Ethics and Safety Measures in Culture Techniques:

Since the culture techniques involve the use of animal or human tissues, it is absolutely necessary to follow several safety measures and medical ethics. In fact, in some countries there are established legislation/norms for selection and use of tissues in cultures. For example, in United Kingdom, Animal Experiments (Scientific Procedures) Act of 1986 is followed.

The handling of human tissues poses several problems that are not usually encountered with animal tissues. While dealing with fetal materials and human biopsies, the consent of the patient and/his or her relatives, besides the consent of local ethical committee is required. Further, taking any tissue (even in minute quantities) from human donors requires the full consent of the donor in a prescribed format.

The following issues need to be fully considered while dealing with human tissues:

1. The consent of the patient and/or relatives for using tissues for research purposes.

2. Ownership of the cell lines developed and their derivatives.

3. Consent for genetic modification of the cell lines.

6. Patent rights for any commercial use of cell lines.

In the general practice of culture techniques using human tissues, the donor and/or relatives are asked to sign a disclaimer statement (in a prescribed pro-forma) before the tissue is taken. By this approach, the legal complications are minimized.

Handling of human tissues is associated with a heavy risk of exposure for various infections. Therefore, it is absolutely necessary that the human materials are handled in a biohazard cabinet. The tissues should be screened for various infections such as hepatitis, tuberculosis, HIV, before their use. Further, the media and apparatus, after their use must be autoclaved or disinfected, so that the spread of infections is drastically reduced.


Assessment of Future Scientific Needs for Live Variola Virus.

As noted earlier, smallpox was eradicated prior to the modem age of cell and molecular biology, virology, and immunology. Therefore, the basics of viral replication, determinants of viral virulence, and pathogenesis of the disease are not as well understood as they are for other pathogens.

Since variola virus is a pathogen that is uniquely adapted to cause severe, widespread human illness, it is highly likely that it has evolved to specifically thwart an effective immune response to infection. Poxviruses are the largest of the viruses and produce many proteins that are not necessary for virus replication, but presumably enhance the ability of the virus to cause disease. The multiple mechanisms used by poxviruses to evade host immune responses, the unique proteins these viruses produce, and their interactions with the host are just beginning to be identified. As the database expands, questions about the interactions of variola virus with human cells and immune responses and about the functions of these disease-producing variola proteins will become more obvious and pressing. The ability to identify the interactions between variola virus and host proteins would likely provide new insights into important aspects of the human immune system that would not be apparent from studies of other viruses.


Finding ways to recycle

Even when plastics have outlived their usefulness in the lab, researchers and institutions are finding ways to keep them out of the trash heap. Currently, after being thrown away, most lab plastics go to a landfill, or, if they’re contaminated with anything potentially dangerous, into biohazardous waste streams, where they are typically incinerated, explains Allison Paradise, executive director of My Green Lab, a California-based nonprofit that promotes lab sustainability.

Paradise recalls being shocked by how much laboratory plastic ware is wasted while completing a summer internship at a pharmaceutical lab during high school. She remembers diligently collecting her pipette tips after an experiment, and asking her PI where the recycling bin was. “She was just looking at me like I [was] crazy,” Paradise says.

Yet many lab plastics can, in principle, be recycled—an option that some institutions are now exploring. Anne Krieghoff, manager of the sustainability program at the University of California, Irvine, was able to work out a recycling program in 2013 by coordinating with the university’s waste transfer station. Before then, plastics were going from UC Irvine labs straight into landfills. Now, many of the institution’s lab plastics, including polypropylene pipette tip boxes and even pipette tips, are recycled, provided they were only used for harmless reagents and water. Recycling represents a major economic bonus for the university, Krieghoff explains, as in the Irvine region, landfill waste costs more to take away, whereas the institution receives money from their waste hauler for recycling.

Even when traditional recycling services for certain plastics aren’t available, lab managers and university administrators often find bespoke solutions. For example, many biology labs go through copious amounts of Styrofoam, which researchers use to transport reagents and biological materials that need to be maintained at controlled temperatures. To find a sustainable avenue for this material at Irvine, Krieghoff initially cut a deal with surfboard manufacturing company Marko, which compressed it to form the buoyant cores of surfboards. However, the university’s labs collected so much Styrofoam through the program that Krieghoff later had to switch to a larger, Styrofoam-manufacturing company to accept the material, she says.

Establishing such deals is easier in some states than in others. “If you go to places in Texas and Alabama and Oklahoma, or even Missouri, they [often] don’t even have basic recycling for their homes, let alone the lab,” Paradise says.

Nevertheless, Nick Ciancio, a neuroscience undergraduate at the University of Alabama at Birmingham (UAB), was able to find one recycling company in Albertville last year that was willing to accept polypropylene and Styrofoam. About 70 of the university’s 2,000 science labs now recycle their waste through this scheme.

However, UAB made the decision to exempt pipette tips from the program over concerns that researchers might accidentally throw tips contaminated with hazardous waste into the recycling bin, posing a health risk to workers at the recycling facility. This was a precautionary decision, Ciancio explains. “If anything is improperly disposed of, it would be a pipette tip. The first time someone outside of the institution is contaminated with biohazardous material will be the last time we recycle lab material.”

Although the Environmental Protection Agency provides rudimentary guidelines on hazardous waste disposal, it’s up to institutions to take the initiative to go further. And because they are responsible for any eventual contamination of their waste, Paradise explains, many prefer to err on the side of caution.


شكر وتقدير

This work was funded by the ERC, BBSRC and Wellcome Trust (ERC_STG 337066, BB/L023776/1 and IA 212304/Z/18/Z to C.L.C. PhD studentship 105398/Z/14/Z to M.L.R.H.). A.M.B. was funded by the MRC (NIRG MR/N00227X/1). S.W. was funded by an MRC studentship. T.C.L. was funded by a Sir Henry Dale Fellowship (210424/Z/18/Z). Work by the Göttgens group is funded by the Wellcome Trust, Bloodwise and Cancer Research UK, with core funding from the Wellcome–MRC Cambridge Stem Cell Institute. C.L.C. and K.R.D. were supported in part by the Royal Irish Academy–Royal Society International Exchange Program (IECR1180061). We thank M. Tunnicliff for passaging parasites and preparing mosquitos, F. Angrisano and K. Sala for technical assistance and advice with infections, I. Kucinski for support creating the interactive website, Imperial College DoLS Flow Cytometry and Central Biomedical Services and Crick Biological Research Facilities for support, and H. Fletcher, A. Cunnington and all of the Lo Celso group members for constructive discussions.


Trypsin-Free Detachment of cells using EDTA - (Jun/20/2006 )

I am trying to detach T84 cells without trypsin, however these cells are especially hard to lift. Can anyone tell me how long cells can incubate in EDTA before it harmful effects set in (ie apoptosis, membrane damage, etc)? So far 10 minutes is not enough to lift all the cells. شكرا لك مقدما.

Why don't you want to use trypsin?

if u need to detach cells, i have a protocol with citric saline.

I am interested in studying cell surface proteins via flow cytometry, which trypsin would eat up. I am very interested in your citric saline protocol. You can email to me if that's easier. Thanks so much!

thanks so much scolix - i will try it.

can u send citric saline method for detaching. i am also intrested.

If possible, I too would be interested in a copy of the non-trypsin based protocol. Thank you in advance if you may offer any assistance

Me too, pleasssseee. شكرا.

Here are two different approaches I have been recommended:

Make a solution of 1mM EDTA (can be increased all the way up to 10-15mM EDTA if your cells are extremely adherent). The EDTA solution acts to chelate calcium. Flood flask with the solution and incubate for 1 minute. Remove most of solution (not as dangerous for cells to sit in EDTA as it is to sit in trypsin) and allow to incubate at 37degrees for 5-10 minutes. Time may be increased if necessary.

I found that the EDTA solution at 10mM worked well for 10 minutes with Hep2 epithelial cells, but I had difficulty with clumping for my T84 cell line. Normally this would not be terrible, but for flow cytometry it is very problematic.

For 500mL 10x solution: 50.3 g KCl, 22.06 g Sodium Citrate.

Flood flask with prewarmed citric saline (1x) and incubate at 37 degrees for 4 minutes. Remove cells be gently tapping or pipetting up and down several times.

I have not had the chance to try this yet, so please let me know how this works for you!


Biology of taste buds and the clinical problem of taste loss

Taste buds are the anatomical structures that mediate the sense of taste. They comprise taste cells and nerve fibers within specialized epithelial structures. Taste cells are traditionally described by histologic methods as basal, dark, intermediate, and light cells, with the nerve fibers surrounding and infiltrating the taste buds. By means of immunohistochemical methods, taste cells and gustatory nerve fibers can be classified in functional groups based on the expression of various cell adhesion molecules and other proteins. When taste buds become damaged, the loss of the ability to taste results. This loss is not uncommon and can impact health and quality of life. Patients who receive radiation therapy for head and neck cancer often experience taste loss, which leads to compromised nutritional intake and a worse outcome than patients who do not experience taste loss. The mode of radiation damage to taste cells and nerve fibers has been investigated using cell adhesion molecules, synaptic vesicle proteins, and other cell markers. The light and intermediate cells are preferentially affected by ionizing radiation, whereas the nerve fibers remain structurally intact. Experimental studies of radiation-induced taste loss are performed via a unique animal/human model.


الملخص

Recent discoveries are redefining our view of cellular senescence as a trigger of tissue remodelling that acts during normal embryonic development and upon tissue damage. To achieve this, senescent cells arrest their own proliferation, recruit phagocytic immune cells and promote tissue renewal. This sequence of events — senescence, followed by clearance and then regeneration — may not be efficiently completed in aged tissues or in pathological contexts, thereby resulting in the accumulation of senescent cells. Increasing evidence indicates that both pro-senescent therapies and antisenescent therapies can be beneficial. In cancer and during active tissue repair, pro-senescent therapies contribute to minimize the damage by limiting proliferation and fibrosis, respectively. Conversely, antisenescent therapies may help to eliminate accumulated senescent cells and to recover tissue function.


2.2: Using the spectrophotometer to evaluate your pipetting skills

  • بمساهمة من Clare M. O & rsquoConnor
  • أستاذ مشارك فخري (علم الأحياء) في كلية بوسطن

Since you will be using micropipettes for all of your experiments, the quality of your results will depend on proper operation of the micropipette. Today&rsquos laboratory will lead you through some exercises that will show you how to use micropipettes correctly and point out some common pitfalls associated with their use. Your results will also provide information about whether the pipettes are functioning properly.

In these exercises, you will be using the spectrophotometer to determine if your pipetting is accurate and precise. سوف تفعلها
be using micropipettes to combine various volumes of water and solutions of a blue dye, bromophenol blue (BPB). You will measure the absorbance of the resulting solutions at 590 nm (A590), which is close to the absorbance maximum of bromophenol blue at neutral pH. Measuring errors will be reflected in the spectrophotometer readings.

The spectrophotometer readings provide an indirect measurement of pipette performance. The proper way to calibrate the micropipettes would be to weigh out volumes of water, which
has a specific gravity of 1.0 g/mL. Unfortunately, we do not have enough balances with sufficient accuracy for the class to perform the measurements. If you suspect inaccuracies in the micropipettes that you are using, refer them to the teaching staff, who will test them properly.


Calcium in Living Cells

David L. Armstrong , . Jody A. White , in Methods in Cell Biology , 2010

B Making Pipettes

Commercial programmable pipette pullers are now available, but some experimentation is required inevitably to find the settings that produce pipettes with the desired overall shape: long and narrow tapers for cell-attached patch recordings to minimize capacitance with the bath and short stubby tapers for perforated patch whole-cell recordings to speed antibiotic diffusion to the tip and minimize access resistance. Handling the capillaries with wet or greasy hands on the portion that is heated contributes to variability, but before pulling the pipettes, both ends of the capillaries should be fire polished gently to increase the longevity of the silver chloride coating on the wire in the pipette holder. Otherwise, the sharp glass edge at the back of the pipette scrapes off a little silver chloride every time you insert a new pipette. Also make sure the pipette holders and their internal rubber gaskets are designed to hold capillaries of the same outer diameter as your pipettes, or they will not fit snugly.

For most low-noise applications, the pipette must be coated with “Sylgard” (Corning 184), an elastomer that is cured with heat, which insulates the pipette walls from the bath solution. The reported curing time for Sylgard is 10 min at 150 °C however, a brief exposure (< 1 min) to a heating element followed by 10–20 min at room temperature should be adequate for curing before moving on to shaping of the tip. The Sylgard is most effective when it is applied thickly, but prevents giga-ohm seal formation if it gets on the tip. Our method of applying Sylgard is illustrated in Fig. 1 . We use gravity by mounting the pipette vertically inside a loop of tungsten wire across the prongs of an outlet plug. We control the heat transiently with a rheostat and observe the pipette through an inexpensive, low power, dissecting scope mounted horizontally on a boom arm. The Sylgard is precured to a viscous consistency at room temperature when it is first made and then stored in small 1 ml aliquots in the freezer. We apply it with a bent hypodermic needle by taking up a dollop onto the needle, touching the dollop to the pipette, and slowly winding it on to the glass by turning the pipette from below. Care must be taken to avoid touching Sylgard to the heating/curing wire, or the Sylgard vapors will quickly coat the tip. You will know when you get Sylgard too close to the tip because when you try to polish it, the Sylgard contracting around the thin glass walls at the tip literally wrinkles the glass.

رسم بياني 1 . Application of Sylgard. Sylgard (Corning 184), a heat-cured polymer, is applied to patch pipettes after pulling but before polishing to reduce the capacitance between the glass walls and the bath. (A) Sylgard is stored in small 1-ml plastic tubes in the freezer until it is ready for use. Room temperature Sylgard is applied using a 25-gauge hypodermic needle that is bent for ease of application. The needle hub is affixed to a plastic tube for ease of handling. (B) The pipettes are placed into a hand-made holder that holds the pipette upright and allows it to be positioned easily so that the heating element made of tungsten wire surrounds the tip. (C) The pipette is positioned so that the area from the first narrowing of the glass to the tip is placed above the heating element. (D) Sylgard is applied in consecutive rings or “donuts” starting at the area where the glass first narrows. This lower ring helps protect against noise if your bath height changes between perfusions. (E) Between applications of consecutive rings, apply heat to cure each ring. Remember that heat goes up, so the hottest area near the heating wire is above it. (F) The final ring should also coat the taper of the pipette and can be placed as close as 50–100 nm from the tip. Be careful not to get Sylgard on the tip or on the heating element!

Everybody has their own favorite glass that they believe forms the tightest seals, but their relative intrinsic noise can be tested empirically using the Sylgard hemispheres. The lowest noise is produced by quartz glass capillaries ( Levis and Rae, 1993 ), but they require a special laser puller to create the pipettes. On real cells, the size and shape of the tip also influence success. It is extremely difficult to make pipettes that will routinely make > 10 GΩ seals when you cannot clearly see the tip while you polish it. An extra long working distance (ELWD) objective with at least 40× magnification is essential but they are expensive, so they must be mounted below the polishing element that is heated to prevent cracking the lens from repeated heating. Our polishing strategy is illustrated in Fig. 2 . We find that it is also critical to melt a small bead of the pipette glass onto the apex of the heating element, usually a small loop of platinum wire, presumably because it prevents the tip from being coated with metal. We find that pipettes with bullet-shaped tips and initial resistances between 3 and 5 MΩ make the best seals.

الصورة 2 . Fire-polishing pipettes. Fire polishing the tip allows the user to narrow the tip opening to gain the desired shape and resistance. (A) The pulled pipettes are placed horizontally in a 2D holder mounted on the stage of an inverted microscope with a long working distance objective ≥ 40×. On the opposite side of the stage, a 3D manipulator is placed with a small platinum wire loop on which a bead of pipette glass has been melted. (B) The unpolished pipette tip is brought into the same plane of view as the glass bead, but at opposite sides of the periphery. (C) When current is passed through the wire, the bead gets hot and expands into the center of the field. The tip of the pipette is transiently manipulated closer to the bead until the opening at the tip starts to close. (D) When the tip narrows and attains rounded edges, the pipette is withdrawn and the heat is turned off. (E) A finished, polished pipette tip.

Filling the pipettes also requires some attention to detail. All pipette solutions should be filtered through 0.2 or 0.45-ميكرومترm filter disks but do not use filter disks prepared with wetting agents. To avoid bubbles and washing the dirt inside the capillaries down into the tip, both of which reduce seal success, one must first fill the tip separately by immersing it in a small vial of pipette solution and allowing the first 20–50 ميكرومترm to fill by capillary action. Then the rest can be backfilled. Usually bubbles are visible to the naked eye, and they can be removed by gently flicking the pipette while it is held between the thumb and the forefinger.


شاهد الفيديو: لماذا نتبع الأوهام مدخل إلى الطبيعة السيكولوجية للفيروسات العقلية! رحله في الذاكره (ديسمبر 2022).