معلومة

Electroporation مقابل البنادق الجينية

Electroporation مقابل البنادق الجينية


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما هي إيجابيات وسلبيات استخدام المحركات الكهربائية (يسار) والمدافع الجينية (يمين) للتحول من حيث:

  • سعر
  • الكائن المستهدف
  • فعالية
  • سهولة الاستعمال
  • اعمال صيانة

أنا لست خبيرا في البنادق الجينية ولكن سأحاول إعطاء إجابتي على هذا السؤال على أي حال.

كلاهما رخيص نسبيًا من حيث السعر. المواد الاستهلاكية للأجهزة الكهربائية هي فقط الكوفيتات ، تكلف 5-10 دولار / لكل منها. تستخدم المدافع الجينية الميكروبيدات كرصاصة ، واعتمادًا على المادة ، تكلف ما بين 200 و 300 دولار لكل ميكروجرام ، 10-50 دولارًا لكل لقطة ، وهي أغلى قليلاً من التثقيب الكهربائي.

بالنسبة للكائنات الحية ، تُستخدم البنادق في الغالب للخلايا النباتية وعدد قليل من الكائنات الحية الأخرى "التي يصعب تقطيعها بالكهرباء". ليس لدي قائمة مناسبة بها ولكن تقريبًا ، إذا كنت تعمل مع البكتيريا والخمائر وخلايا الثدييات ، فانتقل إلى جهاز كهربائي. إذا كنت بحاجة إلى العمل مع الأنسجة أو الكائنات الحية بأكملها مثل الديدان / الحشرات / النباتات ، فابحث عن مسدس ، فلا يمكنك بالتأكيد تقطيع الورقة بالكهرباء. لكن بشكل عام ، تحقق من الأدبيات حول أفضل طريقة حاليًا لتغيير النظام الذي تختاره.

الفعالية ، أيضًا في هذه الحالة تعتمد على شكل الخلايا التي تعمل معها. يصل Electroporation إلى 10 ^ 9/10 ^ 10 تحويل النمل لكل ميكروجرام من الحمض النووي في حالة بكتريا قولونية وهذا هو أفضل كفاءة يمكنك الحصول عليها في الوقت الحاضر. سيتم نقل جميع الخلايا الأخرى بكفاءة أقل ، فكم أقل؟ هذا يعتمد على الخلايا!

سهل الاستخدام. كلاهما سهل الاستخدام للغاية ، فالأمر يتعلق بالضغط على زر. بالنسبة للتثقيب الكهربائي ، تحتاج إلى تحضير خلايا كهربائية ، لكن الإجراء سهل للغاية. بالنسبة للبنادق الجينية ، تحتاج إلى طلاء الخرز بالحمض النووي ، وهو أمر سهل للغاية أيضًا.

اعمال صيانة. لا يحتاج جهاز Electroporator إلى أي صيانة على الإطلاق بينما قد يحتاج المسدس إلى بعض العناية على المدى الطويل نظرًا لأنه يحتوي على مضخات وغرف مضغوطة ، وعادة ما تحتاج هذه الأشياء إلى بعض الاهتمام ولكن لا يوجد شيء خاص.

بعض المراجع:

bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_9541.pdf

bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006174B.pdf

bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006217A.pdf


سعر

بالنظر إلى التسوق عبر Google وزيارة مواقع الويب القليلة ، يبدو أن Electroporation هو 3000-8000 دولار اعتمادًا على الميزات التي تريدها ، ومن ناحية أخرى ، فإن البنادق الجينية أغلى بكثير. مدفع الجينات الأكثر شيوعًا ، طراز Helios من Bio-Rad ، يبلغ حوالي 17000 دولار ، بما في ذلك جميع الأجزاء الضرورية. كما ترى ، يمكن أن يكون سلاح الجينات أكثر تكلفة.

أيضًا ، يحتاج مسدس الجينات إلى الرصاص ، وهي ميكروبيدات (أو ناقلات صغيرة ، كما يسميها Bio-Rad) ، وتكلف حوالي 600 دولار. الكوفيتات الكهربائية هي 90 دولارًا. ومع ذلك ، يمكن تنظيفها وإعادة استخدامها.

الكائن المستهدف

وفقًا لـ Wikipedia ، تُستخدم مسدسات الجينات بشكل أساسي لتحويل الأنسجة النباتية ، ولكنها تستخدم أيضًا في الأنسجة الحيوانية. وفقًا لـ Bio-Rad ، فهو جيد لأنظمة النباتات وأنظمة الحيوانات بشكل أساسي ، ولكن يمكن استخدامه للطحالب والبكتيريا وغير ذلك.

يبدو أن Electroporation يستخدم أكثر للبكتيريا. لقد استخدموها للخميرة أيضًا. تم استخدامه أيضًا للأنسجة الحيوانية ، لكنه ليس الكائن المستهدف الأكثر ملاءمة. يبدو أفضل بالنسبة للأنظمة المختبرية لأن معظم أنظمة التثقيب الكهربائي تحتاج إلى نقل الأنسجة أو الخلايا في كفيت.

فعالية

بالنسبة للمدافع الجينية ، تعتمد الكفاءة على البيئة ونوع الخلايا المستخدمة. تختلف كفاءة تعداء أنواع الخلايا المختلفة. لا يمكنني العثور على تقديرات كثيرة لكفاءة البنادق الجينية. لكن بعضها يشكل 10-20٪ من الحمض النووي. من المتفق عليه أن Electroporation لها كفاءة عالية جدًا. بحسب ويكيبيديا:

يمكن أن يؤدي التحضير الطبيعي للخلايا المكونة إلى كفاءة تحويل تتراوح من 106 إلى 108 cfu / ميكروغرام DNA. ومع ذلك ، توجد بروتوكولات للطريقة الكيميائية لصنع خلايا فائقة الكفاءة قد تسفر عن كفاءة تحويل تزيد عن 1 × 109. [6] تتميز طريقة Electroporation بشكل عام بكفاءة تحويل أفضل من الطرق الكيميائية التي تحتوي على أكثر من 1 × 1010 cfu / ميكروغرام DNA ممكن ، وتسمح بتحويل البلازميدات الكبيرة بحجم 200 كيلو بايت.

سهولة الاستعمال

كلاهما سهل الاستخدام للغاية. إنها لا تتطلب سوى الضغط على بضعة أزرار. ومع ذلك ، إذا كنت تريد معرفة كيفية الاستخدام ، فيجب عليك قراءة الكتيبات والبروتوكولات. دليل نظام مدفع الجينات الخاص بشركة Helios متاح هنا. يحتوي نظام MicroPulser electroporation أيضًا من Bio-Radd على الدليل هنا.

اعمال صيانة

صيانة بندقية الجينات بسيطة للغاية. على سبيل المثال ، مسدس الجينات المحمول Bio-Rad لديه صيانة بسيطة (من هنا):

البرميل المعدل المحسن منخفض الصيانة. يمكن تنظيفه بسهولة باستخدام 70٪ من الإيثانول. يحتوي طرف البرميل على شبكة دائرية من النايلون ، والتي يجب استبدالها بانتظام للحفاظ على الأداء الأمثل. لتغيير الشبكة ، ما عليك سوى فك الطرف وإزالة الشبكة المستهلكة وإدخال شبكة جديدة فوق الحلقة O. بمجرد إعادة تثبيت الطرف في مكانه ، يتم تشغيل مسدس الجينات المحمول باليد.

لا يحتاج Electroporation إلى صيانة تقريبًا أيضًا.


النواقل الفيروسية والخلايا المهندسة وثورة كريسبر

على مدى العقود القليلة الماضية ، أحدثت القدرة على تعديل الخلايا البشرية ثورة في علم الأحياء والطب الحديث. مع التقدم في منهجيات تحرير الجينوم ، أصبح توصيل الجينات والعلاجات القائمة على الخلايا التي تستهدف علاج الأمراض الوراثية حقيقة واقعة ستصبح أكثر وأكثر أهمية في الممارسة السريرية. إن تعديل طفرات معينة في الخلايا حقيقية النواة باستخدام أنظمة CRISPR-Cas المشتقة من أنظمة المناعة بدائية النواة قد سمح بدقة في تصحيح الطفرات المرضية المختلفة. علاوة على ذلك ، أصبح توصيل الحمولات الجينية عن طريق استخدام الانتفاخ الفيروسي آلية حاسمة وفعالة لتوصيل الجينات وأنظمة تحرير الجينات إلى الخلايا. أخيرًا ، تمتلك الخلايا المعدلة خارج الجسم الحي إمكانات هائلة وأظهرت فعاليتها في دراسة وعلاج عدد لا يحصى من الأمراض. يسعى هذا الفصل إلى تسليط الضوء على التقدم المهم في مجال تحرير الخلايا البشرية باستخدام أنظمة CRISPR-Cas ومراجعته ، واستخدام الفيروسات كنواقل للعلاج الجيني ، وتطبيق الخلايا المهندسة لدراسة الأمراض وعلاجها.

الكلمات الدالة: CRISPR / Cas Gene Therapy جراحة الجينوم طب العيون.


ما هو ترنسفكأيشن

إن تعداء العدوى هي طريقة لنقل الجينات يتم فيها إدخال المادة الوراثية عن عمد إلى خلية أخرى باستخدام طرق كيميائية أو غير كيميائية أو تعتمد على الجسيمات. تتضمن آلية تعداء العدوى إنشاء مسام على غشاء الخلية ، مما يسمح للحمض النووي الغريب بالمرور إلى الخلية المضيفة. أنواع النواقل المستخدمة في تعداء هي البلازميدات ، الكوسميدات ، BACs ، YACs أو HACs. بناءً على آلية إنشاء المسام ، يمكن تحديد أنواع مختلفة من طرق تعداء الجسم. الأنواع الثلاثة من تعداء هي تعداءً كيميائيًا ، وترنسفكأيشن غير كيميائي بوساطة ، وترنسفكأيشن على أساس الجسيمات. يظهر تعداء غير كيميائي من خلال BAC في شكل 1.

الشكل 1: التثقيب الكهربائي

ترنسفكأيشن بوساطة كيميائية يستخدم فوسفات الكالسيوم أو البوليمرات الموجبة أو الجسيمات الشحمية. ال تعداء غير كيميائية يستخدم electroporation ، impalefection ، sonoporation ، transfection ، البصرية أو التوصيل الهيدروديناميكي. ال تعداء الجسيمات يستخدم تقنية بندقية الجينات حيث يتم نقل الحمض النووي الغريب باستخدام جسيم نانوي. العدسة المغناطيسية و nucleofection هما الطريقتان الأخريان لترنسفكأيشن الجسيمي. في حالة المغناطيسية ، تتركز الجسيمات التي تحمل الحمض النووي الغريب في الخلية المضيفة بمساعدة مجال مغناطيسي. في nucleofection ، يتم استخدام صدمة حرارية لنقل الحمض النووي الغريب إلى الخلية المضيفة.


تقدم

يتميز نقل الجينات القائم على البلازميد بمزايا مقارنة باستخدام النواقل الفيروسية

تم تطوير النواقل الفيروسية المؤتلفة كطرق عالية الكفاءة لتوصيل الجينات إلى مجموعة متنوعة من الأنسجة. تعود كفاءة هذه النواقل إلى وجود بروتينات فيروسية تتفاعل مع مستقبلات سطح الخلية. لسوء الحظ ، تثير هذه البروتينات الفيروسية استجابات مناعية محددة يمكن أن تحد من القدرة على إعادة إدارة الناقل. قد تكون هذه مشكلة خاصة في ترجمة الدراسات قبل السريرية إلى علاجات بشرية ، حيث أن نسبة كبيرة من السكان قد تكون قد واجهت الفيروس سابقًا وبالتالي لديها أجسام مضادة معادلة.

في المقابل ، تتكون نواقل البلازميد بالكامل من دوائر مغلقة تساهميًا من DNA مزدوج الشريطة بدون بروتينات مرتبطة. ومع ذلك ، فإن توصيل الجينات مع نواقل البلازميد غير فعال للغاية ما لم يكن الحمض النووي إما مرتبطًا بجزيئات أخرى و / أو يتم استخدام الطاقة الفيزيائية للمساعدة في دخول الخلية. أدى استخدام الجسيمات الشحمية والمجمعات المتشعبة إلى تحسين توصيل الجينات إلى بعض الأنسجة في الجسم الحي، ولكن كان التحسين الأكثر أهمية هو استخدام أنظمة التوصيل الفيزيائية التي تمكّن توصيل الجينات القائمة على البلازميد للوصول إلى كفاءات قريبة من تلك التي تحققت مع النواقل الفيروسية.

على الرغم من أن DNA البلازميد في حد ذاته جزيء معقد ، إلا أنه أسهل بكثير في الإنتاج الشامل ومراقبة الجودة من النواقل الفيروسية. هذه المشكلات ، جنبًا إلى جنب مع انخفاض المناعة وعدم التكامل الملحوظ مع DNA البلازميد ، تجعله كاشفًا جذابًا للغاية للعلاج الجيني البشري بشرط أن يتم تحقيق توصيل عالي الكفاءة. لم تسجل التجارب السريرية حتى الآن باستخدام DNA البلازميد العاري أي آثار ضارة. 1 ، 2

أظهرت الطرق الفيزيائية لتعزيز تعداء البلازميد في الجسم الحي تتم مراجعتها أدناه. تعمل جميع الطرق على تعزيز نقل الجينات عن طريق تقريب DNA البلازميد من غشاء الخلية و / أو التسبب في تمزق دقيق مؤقت لغشاء الخلية ، وبالتالي زيادة مرور البلازميد إلى الخلية.

تطبيق مجال كهربائي يعزز بشكل كبير نقل الجينات البلازميد في الجسم الحي

لوحظ التغيير الأكثر جوهرية في كفاءة نقل الجينات القائم على البلازميد عندما يتبع توصيل البلازميد تطبيق سلسلة من النبضات الكهربائية كشكل من أشكال في الجسم الحي التثقيب الكهربائي (يشار إليه أيضًا باسم التثبيط الكهربائي أو النقل الكهربائي). تعتمد هذه التقنية على الدراسات السابقة لـ في المختبر التثقيب الكهربائي و في الجسم الحي توصيل الجزيئات الكبيرة إلى الأورام الموضعية. وقد تم استخدام المنهجية الأخيرة بنجاح من خلال التجارب السريرية باستخدام عقار بليوميسين السام للخلايا. 3

في الجسم الحي تم استخدام الترميم الكهربائي للحمض النووي للبلازميد لأول مرة للجلد والكبد ولكن عضلات الهيكل العظمي جذبت الكثير من الاهتمام مؤخرًا ، حيث يمكن أن يستمر التعبير عن البلازميد episomal في هذا النسيج. في الواقع ، تمت دراسة مجموعة واسعة من الأنسجة بما في ذلك الجلد والكلى والرئة والكبد وعضلات الهيكل العظمي والقلب والمفاصل والحبل الشوكي والدماغ وشبكية العين والقرنية والأوعية الدموية. 4 ، 5 ، 6 ، 7 في معظم الدراسات ، زاد التثقيب الكهربائي من التعبير الجيني بمقدار 100 إلى 1000 ضعف مقارنة بحقن DNA البلازميد العاري. الآلية الدقيقة التي يتم من خلالها تحسين توصيل البلازميد إلى الخلايا غير مؤكدة ، على الرغم من أنه من الواضح أن الأغشية تصبح قابلة للاختراق بشكل فعال بمجرد تحقيق جهد حرج (في حدود 200 فولت / سم). في الجسم الحي). يُعتقد أن هذا يحدث من خلال تكوين المسام المحبة للماء وحركة البلازميد اللاحقة عبر هذه المسام كتأثير كهربائي محلي. وقد تحدت ورقة حديثة هذا الرأي السائد على نطاق واسع. جولزيو وآخرون 8 يستخدم البلازميد المسمى الفلورسنت لتصور التفاعل مع الخلايا المفردة في المختبر. في نظامهم ، شوهد البلازميد يتراكم في غشاء الخلية عن طريق تأثير الكهربي لكنه لم ينتقل على الفور إلى العصارة الخلوية. كانت الحركة في السيتوبلازم بطيئة نسبيًا واستمرت بعد انتهاء تطبيق المجال الكهربائي. هذا يتوافق مع آلية الامتصاص النشط للحمض النووي التي اقترحها بودكر وآخرون، 9 ولكن قد يمثل تفاعلًا فيزيائيًا جديدًا مع غشاء الخلية ، حيث أصبح البلازميد الذي لم يدخل السيتوبلازم بعد في السيتوبلازم غير قابل للوصول إلى صبغة DNA. ومع ذلك ، فإن هذا التراكم البلازميد لم يتم ملاحظته بعد في الجسم الحي وقد يؤدي التنظيم المعقد للأنسجة مثل العضلات إلى تعديل هذه العملية بشكل كبير. مؤخرا جدا ، المكتب وآخرون أبلغ 10 عن وجود مجموعة من البلازميد يبدو أنها تفلت من انتباه نوكليازات خارج الخلية ويمكن نقلها كهربائيًا بنجاح حتى 4 ساعات بعد حقن الحمض النووي.

إن اختيار تصميم القطب الكهربي متغير للغاية حاليًا وهناك حاجة واضحة لإجراء دراسات مقارنة جيدة. تشانغ وآخرون 11 فحص التثقيب الكهربائي للجلد باستخدام قطب مسماك وقارن هذا مع قطب كهربائي متعرج (الأخير عبارة عن مجموعة من الأقطاب الكهربائية المتشابكة الإيجابية والسلبية الشكل 1 أ). كلاهما كانا فعالين بنفس القدر ولكن يبدو أن القطب الكهربي المتعرج كان تصميمًا أكثر ملاءمة للمرضى لأنه يتجنب الحاجة إلى الضغط على الجلد بين المسماك. بالنسبة للأنسجة الأخرى مثل الكبد والعضلات ، هناك خيار بين أقطاب الصفيحة والإبرة (الشكل 1 ب و ج). بشكل عام ، يبدو أن الأقطاب الكهربائية للوحة تعطي مجالًا كهربائيًا أكثر اتساقًا وتستخدم بشكل أكثر شيوعًا لدراسات الحيوانات الصغيرة ولكنها قد لا تكون مناسبة للنقل الكهربائي في الحيوانات الكبيرة بسبب المجالات الكهربائية الكبيرة التي يجب تطبيقها على الأنسجة الأكبر. يختلف نمط النبضات الكهربائية أيضًا بشكل كبير بين الدراسات التي تتراوح من نبضات الجهد المتوسط ​​(على سبيل المثال 200 فولت / سم) لعشرات الميلي ثانية إلى نبضات ميكرو ثانية عالية الجهد. ليس من الواضح بعد ما هو النمط الأمثل غير المكتب وآخرون أظهر الشكل 12 أن أفضل نتائجهم في العضلات الهيكلية تم الحصول عليها عندما أعقب نبضة واحدة عالية الجهد سلسلة من النبضات ذات الجهد المنخفض. واقترحوا أن النبضة الأولية أثرت في التثقيب الكهربائي للغشاء وأن النبضات اللاحقة تنقل الحمض النووي إلى ألياف العضلات. حاليًا ، يبدو أن غالبية الأوراق تستخدم نمطًا بمتوسط ​​6-10 نبضات من 20-40 مللي ثانية عند 1 هرتز مع شدة مجال في حدود 200 فولت / سم.

التعرج (أ) ، المسماك (ب) والإبرة (ج) الأقطاب المستخدمة في الجسم الحي كهربي. في حالة القطب الكهربي المتعرج ، يتم إنشاء مجال كهربائي بين كل قطب موجب وسالب مع دخول جزء من المجال إلى النسيج. تصميم القطب الكهربائي هذا هو الأقل توغلاً من الثلاثة. باستخدام أقطاب المسماك ، يتم إنشاء مجال كهربائي شبه موحد بين ألواح القطب. باستخدام أقطاب الإبرة ، يتم إنشاء حقل بين الإبر. في بعض الحالات ، تم استخدام أقطاب متعددة الإبرة.

أحد قيود النقل الكهربائي هو أنه يمكن أن يكون هناك ضرر كبير مرتبط بالإجراء وأن هذا يمكن أن يحد من كفاءة تعداء العدوى. 13 ورقة حديثة بقلم Durieux وآخرون يوضح الشكل 14 بشكل مقنع أن تلف العضلات يرتبط ارتباطًا وثيقًا بوجود DNA البلازميد أثناء النقل الكهربائي ويزداد سوءًا عندما يتم التعبير عن جين مراسل LacZ. يمكن أن يؤدي تعديل حجم ومدة النبضات الكهربائية إلى تحسين ولكن لا يمنع تمامًا كل الضرر المرتبط بالبلازميد بعد علاج العضلات الهيكلية.

عميد وآخرون 15 قد قدمت مؤخرًا عرضًا مثيرًا لإمكانيات في الجسم الحي التثقيب الكهربائي للرئة. قاموا بتطبيق أقطاب المسماك على جانبي صدر الفئران بعد تقطير داخل الرغامى لمحلول DNA البلازميد. أظهروا تعبيرًا جينيًا جوهريًا قصير المدى للمراسل في الرئة بعد هذا الإجراء مع معدل وفيات منخفض في الحيوانات المعالجة. شوهد التعبير الجيني في الغالب في الحويصلات الهوائية المحيطية وفي كل من الخلايا الظهارية والخلايا العميقة. لم يكشف التحليل النسيجي للرئتين بعد 24 ساعة من العلاج عن أي علامات تلف واضحة. وبالتالي يبدو إجراء عملية التثقيب الكهربائي إجراءً آمنًا نسبيًا في الرئتين. قد يكون التطبيق على البشر ممكنًا باستخدام أقطاب كهربائية موجهة بواسطة منظار القصبات ولكنه لن يؤدي إلا إلى علاج المناطق المحلية من الرئة.

تشمل الأهداف الأخرى التي تم تطويرها مؤخرًا للتثقيب الكهربائي المفاصل و 16 من الحبل الشوكي 17 وشبكية العين. 18 وهكذا ، أبلغ ماتسودا وسيبكو 19 أن كفاءة نقل الجينات العالية جدًا إلى خلايا الشبكية ، ولا سيما المستقبلات الضوئية ، يمكن تحقيقها باستخدام التثقيب الكهربائي في الجرذان والفئران حديثي الولادة. لقد أثبتنا أنه يمكن أيضًا استخدام التثقيب الكهربائي لإيصال أليغنوكليوتيدات إلى العضلات ، وتحديداً من أجل تخطي exon بوساطة مضادة للتأثير في عضلات الهيكل العظمي الضمور. 20

تم اختبار Electroporation على نطاق واسع لنقل الجينات إلى الأورام. حتى نقل ناقل البلازميد الفارغ يكفي لإحداث تراجع كبير في الورم في بعض النماذج. أظهر التثقيب الكهربائي للبلازميدات المحتوية على إنترلوكين 12 (IL-12) وإنترلوكين 18 (IL-18) تأثيرًا تآزريًا في تثبيط نمو الورم ، سواء بالنسبة للورم المعالج أو للورم المقابل غير المعالج. 22 في دراسة أخرى ، لم ينتج عن النقل الكهربائي لمزيج من البليوميسين والبلازميد المشفر IL-12 فقط مغفرة كاملة في نسبة من الفئران التي تحمل ورمًا ميلانيًا تحت الجلد ، بل قدم أيضًا تأثيرًا وقائيًا كبيرًا ضد النقائل الثابتة. 23 بالنظر إلى نجاح النقل الكهربائي للبليوميسين في العديد من التجارب السريرية 3 ، يبدو أن الجمع بين نقل الجينات يوفر إمكانات إضافية في تقديم علاج فعال سريريًا.

استخدم Liu و Huang 24 مزيجًا من توصيل الأوعية الدموية مع التثقيب الكهربائي للكبد. إن إعطاء البلازميد في الوريد عبر الوريد الذيل في الفأر يعزز التعبير الجيني في الكبد بعد التثقيب الكهربائي مقارنة بالحقن المباشر في الكبد قبل التثقيب الكهربائي. تم تحسين التعبير بشكل أكبر عن طريق منع تدفق الدم مؤقتًا عبر الوريد الأجوف أو الوريد البابي والوريد الكبدي. يبقى أن نرى ما إذا كان هذا النهج المركب سيعمل في الأنسجة الأخرى.

يمكن أيضًا استخدام النقل الكهربائي للتلقيح الجيني ، وقد أظهر عدد من المختبرات تحسينات كبيرة في الاستجابات لمجموعة متنوعة من المستضدات. 25 ، 26 ، 27 تجيل وآخرون اقترح رقم 28 أن النقل الكهربائي للجلوبيولينات المناعية المشفرة للحمض النووي للبلازميد قد يكون بديلاً عن إعطاء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في علاج مجموعة متنوعة من الحالات وقد أظهر تعبيرًا مطولًا في كل من الفئران والأغنام.

تطور مثير للاهتمام في الجسم الحي كان Electroporation للأغراض البحثية هو تطبيق هذه التكنولوجيا على تطوير الجهاز العصبي المركزي (CNS) لأجنة القوارض. 29 ، 30 ، 31 باستخدام أقطاب كهربائية دقيقة للغاية ، من الممكن توصيل البلازميدات إلى مناطق محددة من الدماغ النامي لتتبع هجرة الخلايا وتعديل أنماط التطور. في الآونة الأخيرة ، وي وآخرون قام 32 بتوسيع هذه التقنية لتشمل القوارض البالغة ، مما يدل على أنه من الممكن التعبير عن التركيبات القائمة على البلازميد بشكل انتقائي في مناطق معينة من الجهاز العصبي المركزي البالغ.

أخيرًا ، لم يتم الإبلاغ سابقًا عن تكامل DNA البلازميد بعد الحقن العضلي المباشر على الرغم من عدد من الدراسات الدقيقة من العديد من المعامل. في المقابل ، وانغ وآخرون أفاد 33 مؤخرًا أنه يمكن اكتشاف تكامل DNA البلازميد بعد التثقيب الكهربائي للعضلات الهيكلية في الجسم الحي. ومع ذلك ، لا يزال هذا حدثًا نادرًا جدًا ، دون مستوى الطفرة الجينية الخلفية ، وبالتالي من غير المحتمل أن يكون خطرًا كبيرًا على السلامة فيما يتعلق بالتطبيق السريري.

توصيل الأوعية الدموية المضغوط يحسن تعداء البلازميد في الجسم الحي مع توزيع أكثر انتشارًا من الحقن الموضعي

نظرًا لأن DNA البلازميد لا يحتوي على بروتينات للارتباط بالمستقبلات الخلوية ، فإن البلازميد العاري ليس له استهداف محدد لأنواع مختلفة من الخلايا ، وبالتالي من الضروري وضع الحمض النووي على اتصال وثيق مع نوع الخلية المطلوب. كما أدى استخدام الضغط لتحقيق هذا الاتصال الوثيق إلى زيادة كبيرة في كفاءة التوصيل ، خاصةً في الكبد والعضلات الهيكلية.

يؤدي استخدام الحقن ذات الحجم الكبير جدًا (ما يعادل الحجم الكلي للدم) التي يتم تسليمها بسرعة عبر الوريد الذيل للفأر إلى تعداء خلايا الكبد عالية الكفاءة في معظم أنحاء الكبد. حاولت سلسلة من الأوراق البحثية الحديثة جدًا شرح الأساس المادي لهذه الظاهرة. تشانغ وآخرون لقد أظهر 34 أن توصيل الجين الهيدروديناميكي يؤدي إلى انخفاض عابر في وظائف القلب وارتفاع سريع في الضغط الوريدي مما يؤدي إلى تضخم النوافذ في أشباه الجيوب الكبدية. وهذا بدوره يسمح للضغط الهيدروستاتيكي بالعمل على أغشية خلايا خلايا الكبد مما يتسبب في حدوث مسام أو عيوب عابرة ، وهي عملية يطلق عليها اسم hydroporation. أظهرت المجموعات الأخرى 35 ، 36 ، 37 أن ديناميكيات عملية تعداء الخلايا تدعم مفهوم فرط نفاذية غشاء الخلية الكبدية ولا تدعم آلية الامتصاص النشطة التي اقترحها Budker وآخرون. 9 سمح استخدام هذه التقنية الهيدروديناميكية في الفأر بمقارنة تأثير متواليات ناقلات مختلفة ، 38 باختبار تركيبات التعبير الأمثل 39 والتوصيل الفعال لـ siRNA إلى الكبد. 40 ، 41 تم تطبيق نفس التقنية على الفئران. 42 ومع ذلك ، فإن هذا النهج ، على الرغم من أنه مفيد للدراسات على القوارض ، إلا أنه لا ينطبق بشكل مباشر على البشر. ايستمان وآخرون قام 43 بفحص التوصيل الهيدروديناميكي المحلي في فصوص معينة من كبد الأرانب باستخدام قثاطير الكفة البالونية. لقد أثبتوا أن الولادة الموضعية بوساطة الضغط يمكن تحقيقها بأمان من خلال هذا النهج دون الحاجة إلى إجراء عملية جراحية لكشف الكبد. كما هو الحال مع حقن الوريد الذيل ، لم يكن هناك سوى ارتفاعات عابرة في إنزيمات الكبد المحددة التي تم إطلاقها في الدم. كما تم استخدام توصيل البلازميد بوساطة الضغط لأنسجة أخرى ، مثل الكلى. 44 تم توضيح أهمية الضغط الهيدروستاتيكي المحلي من خلال عمل Liu وآخرون، 45 الذين أفادوا بأن التدليك الميكانيكي للكبد يزيد من نقل الجينات بعد الحقن الوريدي للحمض النووي البلازميدي.

هوانغ وآخرون 46 نجح أيضًا في توصيل البلازميد إلى الحجاب الحاجز باستخدام الطريقة الوريدية مع انسداد مؤقت للوريد الأجوف القحفي. للتسليم إلى عضلات الأطراف ، يتم إجراء توصيل البلازميد بوساطة الضغط بشكل عام عبر الجهاز الشرياني. تم استخدام هذا النهج لإيصال البلازميد إلى عضلات متعددة في الأطراف المعزولة مؤقتًا من الرئيسيات ، ويعتبر نضح الأطراف المعزول أسلوبًا راسخًا في الممارسة السريرية لعلاج الأورام. كان امتصاص وتعبير البلازميد أكثر كفاءة من الحقن العضلي المباشر وتم اكتشافه في جميع عضلات الطرف المروي. لم تكن هناك منشورات لاحقة باستخدام منهجية توصيل الجينات هذه ، على الرغم من الإبلاغ عن دراسات غير منشورة في المراجعة التي أجراها Herweijer و Wolff. 49 لقد لاحظنا التعبير عن minidystrophin البشري (باستخدام جسم مضاد خاص بالأنواع) في ما يصل إلى 30 ٪ من ألياف العضلات في عضلات أطراف الفئران بعد الولادة الشريانية بوساطة الضغط (Fletcher و Wells and Wells ، نتائج غير منشورة). يتم استخدام نفس التقنية حاليًا لإيصال الدستروفين إلى العضلة الضمور في أرجل النموذج النابي للحثل العضلي المرتبط بالكروموسوم X. أظهرت ورقة بحثية حديثة جدًا من مجموعة Huang 51 أنه قد لا يكون من الضروري استخدام الطريق الشرياني لتوصيل البلازميد إلى العضلات الهيكلية. لقد أظهروا كفاءة عالية بشكل ملحوظ في توصيل بلازميد ديستروفين إلى عضلة الفأر الحثلي عن طريق كل من الطرق الشريانية والوريدية بشرط أن يكون هناك انسداد مؤقت لإمدادات الدم مما أدى إلى زيادة الضغط داخل السرير الوعائي للعضلات.

يمكن أن تعزز الموجات فوق الصوتية القابلة للتطبيق سريريًا توصيل الجينات القائمة على البلازميد في الجسم الحي

في الجسم الحي التثقيب الكهربائي والتوصيل بوساطة الضغط ، على الرغم من فعاليته الشديدة ، إلا أنهما تقنيات اجتياحية. وبالتالي ، تم فحص طرق أخرى لقدرتها على توفير القوة الدافعة في توصيل DNA البلازميد. الموجات فوق الصوتية في الاستخدام السريري العام للأغراض العلاجية والتشخيصية. تستخدم الموجات فوق الصوتية منخفضة المستوى للتصوير التشخيصي ، وتستخدم موجات الصدمة فوق الصوتية في علاج حصوات الكلى (مفتت الحصى) وتستخدم الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة (HIFU) للتدمير الحراري للأورام. أظهر عدد من المجموعات فائدة هذه الطرائق المختلفة للموجات فوق الصوتية في تعزيز توصيل DNA البلازميد. على سبيل المثال ، تانياما وآخرون استخدموا الموجات فوق الصوتية بجرعة منخفضة (دقيقة واحدة عند 1 ميجا هرتز ، 2.5 واط / سم 2) لتحسين توصيل الجينات في العضلات الهيكلية 52 والشريان السباتي. 53 وبالمثل ، استخدمت مجموعات أخرى نهجًا مشابهًا لنقل الجينات إلى العضلات الهيكلية 54 و 55 و 56 والقلب. 57 ، 58 في المقابل ، هوبر وآخرون 59 استخدم HIFU (دقيقة واحدة عند 0.85 ميجاهرتز ، 155 وات فوق عرض 2 مم) لإجراء نقل الجينات إلى الشريان السباتي على أساس أن هذه الطريقة تسمح بالتوطين المحدد لنقل الجينات المحسن. أظهروا زيادة ثمانية أضعاف في التعبير الجيني الكلي للمراسل باستخدام HIFU وحده وزيادة 17.5 ضعفًا عند استخدام فقاعات التباين بالموجات فوق الصوتية. ومع ذلك ، فإن الزيادة المبلغ عنها في تعداء العدوى مع التباين المحسن HIFU لا تختلف اختلافًا كبيرًا عن زيادات الطيات الموضحة في العديد من دراسات الموجات فوق الصوتية لتوصيل الطاقة المنخفضة. تم استخدام موجات الصدمة HIFU ومفتت الحصى لاستئصال الأورام في وقت واحد وإجراء نقل الجينات إلى الكتلة المتبقية ولكن التعبير الجيني كان متغيرًا للغاية ، ربما بسبب درجات متفاوتة من استئصال الورم. 60

ينتج عن تطبيق الموجات فوق الصوتية تجويف صوتي يمكن أن يعطل الأنسجة وينتج نفاذية غشاء عابر ، وبالتالي تعزيز توصيل البلازميد إلى السيتوبلازم. يمكن لعوامل التنوي مثل عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية أن تعزز التجويف ، وقد قامت العديد من الدراسات بفحص مجموعة من عوامل التباين هذه ، وخلصت إلى أن الفقاعات الدقيقة المكونة من غاز الثماني والفلوروبروبان المغلفة بالألبومين (Optison) مفضلة على العديد من العوامل الأخرى المتاحة بشكل شائع. 61 ، 62 تانياما وآخرون أظهر 52 صورًا مجهرية إلكترونية للخلايا المعالجة باستخدام Optison والموجات فوق الصوتية في الثقافة التي تشير إلى أن المسام العابرة في غشاء الخلية يتم فتحها بالفعل فورًا بعد العلاج. حتى مع استخدام كواشف التباين بالموجات فوق الصوتية ، فإن معظم الدراسات تظهر فقط زيادة في المتوسط ​​من 10 إلى 15 ضعفًا في التعبير الجيني المراسل ، وهو أقل بكثير مما يمكن تحقيقه باستخدام التثقيب الكهربائي.

تم وصف مزيج من التثقيب الكهربائي والموجات فوق الصوتية (electro-sonoporation) بواسطة Yamashita وآخرون. 63 في دراستهم ، كان السونوبوريشن الكهربائي متفوقًا على التثقيب الكهربائي أو الموجات فوق الصوتية وحدها. ومع ذلك ، من الصعب مقارنة هذه الدراسة بالآخرين في هذا المجال بسبب عدم كفاية التفاصيل المنهجية لعنصر التثقيب الكهربائي.

يمكن أيضًا استخدام طرق فيزيائية أخرى مثل الليزر والمجالات المغناطيسية والتسليم الباليستي في الجسم الحي نقل الجينات ولكنها أقل فعالية بشكل عام

يوفر الليزر المركز مصدرًا بديلًا للطاقة ، وقد تم توضيح إمكانات هذه التقنية في ورقة بحثية حديثة من Zeira وآخرون. 64 ذكر المؤلفون أنه يمكن تحسين توصيل الجينات إلى العضلات عن طريق تطبيق ليزر الأشعة تحت الحمراء فيمتوثانية (5 ثوانٍ عند 30 ميغاواط) وقارنو ذلك بـ في الجسم الحي التثقيب الكهربائي لنفس كمية الحمض النووي في نفس العضلة (نبضات 16 × 20 مللي ثانية عند 200 فولت / سم). استنتج المؤلفون أن هناك كفاءة مماثلة في توصيل الجينات وأن هذا كان مصحوبًا بضرر أقل بشكل كبير عند استخدام نقل الجينات بشعاع الليزر (LBGT). لم تكن الآلية التي بواسطتها نقل الجينات المعزز بالليزر واضحة ولكنها على الأرجح تنطوي على اضطراب محلي في غشاء الخلية العضلية. مسألتان تنشأ من هذا العمل. لم تكن المقارنة مع Electroporation غير متوقعة لأن العديد من المجموعات الأخرى ، بما في ذلك نحن ، أظهرت أن النبضات المتعددة عند 200 V / cm تسبب تلفًا كبيرًا في العضلات وأن التعديلات على البروتوكول يمكن أن تقلل من هذا الضرر. 13 ، 65 ثانيًا ، تم تركيز الليزر على 2 مم تحت الجلد في حين أن التركيز الأعمق سيكون مطلوبًا للتسليم عن طريق الجلد إلى العضلات الهيكلية البشرية. يبقى أن نرى ما إذا كان يمكن زيادة LBGT بشكل كبير في دراسات العضلات الكبيرة أو الأنسجة الأخرى.

يمكن أيضًا استخدام المجالات المغناطيسية القوية لتوفير مصدر طاقة للمساعدة في نقل الجينات عندما يقترن DNA البلازميد بجسيمات نانوية مغناطيسية. تم الإبلاغ عن أن تطبيق المجالات المغناطيسية بعد الحقن الموضعي للجسيمات النانوية المرتبطة بالبلازميد (العدسة المغناطيسية) يعزز في الجسم الحي نقل الجين إلى الجهاز الهضمي والأوعية الدموية في الأذن. 66 لا يبدو أن نقل الجينات المحسن المرتبط بالحصبة المغناطيسية كبير مثل ذلك الذي شوهد مع التوصيل الهيدروديناميكي أو التثقيب الكهربائي ، على الرغم من أنه لم يتم إجراء مقارنات مباشرة بعد.

تلقى قصف الأنسجة بواسطة الجسيمات الدقيقة المغلفة بالبلازميد اهتمامًا كبيرًا في السابق لنقل الجينات في الحيوانات بعد تطويرها في الأصل لتوصيل الجينات إلى النباتات. اقتصر تطبيق تقنية بندقية الجينات في الحيوانات على الأنسجة السطحية مثل الجلد. استمرت الأوراق البحثية الحديثة في استخدام هذا النهج لتطبيقات مثل العلاج الجيني لألم المثانة باستخدام نقل الجينات المؤيدة للأفيوميلانوكورتين في نموذج الفئران ، 67 نقل IL-10 و IL-12 و B7.1 إلى أورام الفئران ، ونقل الجينات 68 في القلب ، نقل 69 جينًا إلى أجنة الفئران 70 والعلاج عبر جلد نموذج فأر لنقص مالتاز حمض الليزوزوم (GAA ، المعروف أيضًا باسم مرض تخزين الجليكوجين من النوع الثاني). 71 الأهم ، ديليو وآخرون أبلغ 72 مؤخرًا عن تصميم جديد لمدفع الجينات الذي يسلم الجسيمات الدقيقة عند ضغط أعلى ، وبالتالي الوصول إلى الأنسجة تحت الجلد ، مثل العضلات أو الأورام ، وبالتالي تحقيق التعبير الجيني على المدى الطويل.

تم استخدام توصيل الجينات الباليستية على نطاق واسع لإيصال لقاحات الحمض النووي للجلد. تم الإبلاغ عن أن هذا النهج متفوق على الطرق الأخرى لإيصال البلازميد إلى الجلد 73 ، 74 ولكنه يميل إلى توليد استجابة مناعية Th2 (خلطية) بدلاً من الاستجابة المناعية Th1 (السامة للخلايا) التي تتبع الإعطاء العضلي عادةً. 75 ، 76 يمكن تعديل هذا الاختلاف في طبيعة الاستجابة المناعية من خلال استراتيجيات تعزيز مختلفة بعد التطعيم الأولي الأولي عن طريق توصيل DNA البلازميد بمدفع جيني. 77


نتائج

تعداء بواسطة الكواشف

من أجل تحديد كاشف تعداء المفضل لكل نوع من الخلايا ، درسنا ما يلي نسبيًا: كمية CAT المنتجة ، والنسبة بين CAT / البروتين الكلي وبقاء الخلية. عند النظر في النتائج التي تم الحصول عليها في أنواع الخلايا الأربعة المستخدمة ، تُظهر النتائج أن الكواشف الثلاثة الأفضل أداءً هي FuGENE 6 و Lipofectamine PLUS و GenePORTER (الجدول 1 والشكل 1). كما هو موضح في الجدول 1 ، تعرض القيم نطاقًا عبر أنواع الخلايا الأربعة المستخدمة. تم الإبلاغ عن النتائج الفردية في النص أدناه وفي الشكل 1 ، حيث يتم عرض النتائج التي تم العثور عليها باستخدام التركيز الأمثل للبلازميد لكل كاشف.

يوضح الشكل (أ) كمية الكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز (CAT) المنتج في كل من خطوط الخلايا ، عند استخدام كواشف تعداء مختلفة ، بكمية البلازميد المثلى. يوضح الشكل (ب) نسبة البقاء على قيد الحياة المقابلة عند استخدام كل من هذه الكواشف وكميات البلازميد. ملاحظة: يتم عرض النتائج على أنها متوسط ​​+/- SD لتجربتين فرديتين (تم إجراؤها في نسختين).

في CoASMC ، حقق استخدام FuGENE 6 أفضل النتائج. أنتجت ما يقرب من ضعف كمية CAT لكل مل من الوسائط من الخلايا المنقولة باستخدام ثاني أفضل كاشف أداء ، Lipofectamine PLUS (الشكل 1). When 1 μg and 2 μg plasmid were used, ratios of 3–5 were obtained and the cell survival rate was between 69 and 74%, respectively (Figure 1). In AoSMC, Lipofectamine PLUS gave the best results. It produced more CAT per ml media than cells transfected with the next best performing reagent, FuGENE 6 (Figure 1). When 0.8 μg and 1.6 μg plasmid was used, ratios of 10–18 were obtained and the cell survival rate was between 53 and 58%, respectively (Figure 1).

In CoAEC, best transfection efficiency was achieved by FuGENE 6 : it produced more than double the amount of CAT per ml than cells transfected using the other reagents (Figure 1). When 1 μg and 2 μg of plasmid were used, ratios of 8–11 were obtained and the cell survival rate was between 64 and 73%, respectively (Figure 1).

FuGENE 6 gave the best results in AoEC, as well : it produced more CAT per ml media than cells transfected with the second best liposome, Lipofectamine PLUS (Figure 1). When 1 μg and 2 μg of plasmid was used, ratios of 7–16 were obtained and the cell survival rate was between 79 and 88%, respectively (Figure 1).

Transfection by electroporation

Electroporator

To optimize the electroporation procedure, a range of voltage, capacitance and resistance settings were used. For SMC the initial resistance and capacitance settings were 725Ω and 125 μF and for EC they were 950Ω and 25 μF. The voltage settings tested varied from 400 – 500 V. The optimal voltage in all four cell types was 450 V, illustrated by AoSMC (Figure 2).

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when voltage settings were varied using the ECM 630 electroporator. Capacitance and Resistance were held constant at 125 μF and 725Ω respectively. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding settings. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

After the voltage settings had been established the optimal resistance and capacitance were found. For CoA and Ao SMC the best resistance setting was found to be in the area 725–900Ω (Figure 3), but best capacitance varied between the two cell types. In CoASMC, the best capacitance setting was 75 μF (Ratio 2.5 and 70% survival). In some experiments, we achieved a ratio of up to 6 when 125 μF was used, but survival dropped to around 30%. Nevertheless, we choose 75 μF as the best setting because it resulted in higher cell survival. In AoSMC the best results were obtained when 125 μF were used (Ratio of 0.92 and a survival of 30%) (Figure 4). The higher the capacitance settings was, the lower become the cell survival (Figure 4b).

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when resistance settings were varied using the ECM 630 electroporator. Voltage and capacitance were held constant at 450 V and 125 μF respectively. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding settings. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when different capacitance settings were used on the ECM 630 electroporator (BTX, San Diego, USA). Voltage and resistance were held constant at 450 V and 800Ω, respectively. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding settings. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

Both CoA and Ao EC reacted similarly to the different settings. Resistance was tested between 850–1050Ω and at 900Ω a ratio of 25 was obtained (55% survival). We tested capacitance varying from 25 – 75 μF. When 50 μF was used, we obtained a ratio of 40 and a survival of 38%. However, 25 μF was the best setting since it resulted in better cell survival (61%) (results not shown).

Nucleofector

Optimized nucleofector protocols were available for AoSMC and CoAEC. These methods were tested and the results were compared with the electroporation results. For AoSMC we tested two cell suspensions, 5 × 10 5 and 1 × 10 6 cells per reaction. Both the ratio and the survival increased by increasing the number of cells used (Figure 5a). At the highest plasmid dose, the cell survival was 80% (Figure 5b).

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when different amounts of CAT plasmid were transfected into different cell numbers using the Nucleofector instrument, program U-25. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding plasmid amounts. Results represent mean of duplicates +/- SD.

In CoAEC, we observed a dose-response for the CAT/protein ratio when 1–10 μg plasmid was used (Figure 6a), and at the highest plasmid dose of 10 μg, 30–46 % cell survival was achieved (Figure 6b).

(a) and (b): Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in CoAEC when different amounts of CAT plasmid were transfected, using the Nucleofector instrument (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany), program S-05. Figure (b) shows the % survival at the corresponding plasmid amounts. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

Transfection by PCI

The initial experiments with PCI were aimed to find the light dose at which we obtained at least 50 % survival. For AoSMC this was observed to be 100 sec. In further experiments light doses varying from 25 to 100 seconds were used. A low transfection effect, ratio of 0.3, was achieved when the cells were exposed to light before the transfection of 5 μg plasmid (Table 2).

The light dose that gave 50% survival in CoAEC was between 40 and 50 seconds, and for AoEC it was 32 seconds. The best transfection effect obtained had a ratio of 4.7 and 55% survival, when the cells were given 5 μg plasmid before exposure to light for 25 seconds (Table 2). None effect was seen when the cells were exposed to light after addition of plasmid.


Electroporation is based on a simple process. Host cells and selected molecules are suspended in a conductive solution, and an electrical circuit is closed around the mixture. An electrical pulse at an optimized voltage and only lasting a few microseconds to a millisecond is discharged through the cell suspension. This disturbs the phospholipid bilayer of the membrane and results in the formation of temporary pores. The electric potential across the cell membrane simultaneously rises to allow charged molecules like DNA to be driven across the membrane through the pores in a manner similar to electrophoresis (Shigekawa and Dower, 1988).

The main advantage of electroporation is its applicability for transient and stable transfection of all cell types. Furthermore, because electroporation is easy and rapid, it is able to transfect a large number of cells in a short time once optimum electroporation conditions are determined. The major drawback of electroporation is substantial cell death caused by high voltage pulses and only partially successful membrane repair, requiring the use of greater quantities of cells compared to chemical transfection methods. While more modern instrumentation, such our Invitrogen™ Neon™ Transfection System, overcome high cell mortality by distributing the electrical pulse equally among the cells and maintaining a stable pH throughout the electroporation chamber, optimization of pulse and field strength parameters is still required to balance the electroporation efficiency and cell viability.


Electroporation and Nucleofector TM Technology

The ability to introduce DNA, RNA or proteins into cells to alter their genotype or phenotype (a process called transfection) is crucial in a variety of life science applications. Various types of transfection methods exist and choosing which approach to use often depends on its suitability to the application in question. Electroporation is a physical transfection method that permeabilizes the cell membrane by applying an electrical pulse and moves molecules via the electrical field into the cell. It is a powerful tool for transfecting large DNA fragments and achieving good transfection efficiencies in cell lines. However, due to high toxicity traditional electroporation has been less successful for efficiently transfecting more biologically relevant primary cells and stem cells, which has limited its application.

Our solution is an improved electroporation technology, the Nucleofector TM Technology, originally introduced into the market by legacy Amaxa in 2001. It enables highly efficient, transfection of primary cells, stem cells, neurons, and cell lines that have traditionally been difficult to transfect via electroporation and other non-viral transfection methods. In recent years, this has opened novel opportunities for disease research and therapeutic development, including the advancement of gene therapies, immunotherapies, and stem cell generation.

In the following sections, we provide an overview of Nucleofector TM Technology, and explore what benefits it can bring to your research over traditional electroporation methods. We also summarize the transfection capabilities and flexible scaling offered by our various Nucleofector TM Platforms, to help you choose which one is best suited to your specific application. This can ensure you obtain the very highest levels of transfection efficiency and quality for your research.


الانتماءات

Rutgers, The State University of New Jersey, Department of Biomedical Engineering, Piscataway, 08854, United States

Joseph J. Sherba, Stephen Hogquist, David I. Shreiber & Jeffrey D. Zahn

Rutgers, The State University of New Jersey, Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Piscataway, 08854, United States

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

J.J.S., H.L., J.W.S., D.I.S. and J.D.Z. conceived the study. J.J.S. and S.H. conducted the experiments. All authors analyzed the results. All authors reviewed the manuscript.

المؤلف المراسل


خلفية

Electroporation is a physical method that can be used for gene delivery characterized by application of brief electric pulses to permeabilize the cell membrane, and thereby facilitating the uptake of negatively charged DNA [1, 2]. The application of a potential difference across a membrane is an effective strategy to form transient pores [3]. In principle, cell membranes act as electrical capacitors and the application of a high-voltage electric field results in a temporary depolarization of a cell membrane and the formation of pores, which allows the entrance of macromolecules. The application of electric pulses is not only used for cell permeabilization in vitro for delivery of micro-and macromolecules, but is also used in vivo for permeabilization of tissues during certain specific treatments against cancers via electrochemotherapy (ECT) where electric pulses are applied to enable entry of non-permeant cytotoxic molecules [4]. The conventional electroporation is done in cuvette-style parallel plate setups, where the cell suspension and molecules to-be-delivered are mixed together in the electroporation buffer between two plate electrodes connected to a generator of high electric voltage, and is called bulk electroporation [3]. Electroporation is viewed as a promising method for intracellular delivery of a wide variety of cargos and being relatively efficient as compared to other methods [3, 5]. Fibroblasts are the most preferred somatic cells in gene transfection studies, since they can be derived either from fetal or adult tissue samples [6]. Many authors previously reported the use of electroporation in bovine fibroblasts and in fibroblastoid cells of other mammals as an efficient method of DNA transfection [7]. Though primary fibroblasts are commonly used cells in many studies, they are considered as difficult to transfect cells [8]. Till date, few data are available describing the optimization of electroporation conditions for bovine fetal fibroblasts (BFFs). Cattle is an economically important livestock [9], and increasingly used as a model species for research in artificial reproduction [10, 11]. The establishment of somatic cell nuclear transfer (SCNT) [12] allowed the generation of transgenic and knock-out cattle via the use of genetically modified fibroblast donor cells [13, 14]. The recently developed designer nuclease (ZNF, TALEN and Crispr/Cas9) were also employed to edit endogenous genes or knock-in genes-of-interest into bovine primary cells, which are subsequently used in animal cloning via SCNT [15,16,17,18,19]. These examples highlight the importance of efficient transfection methods for bovine primary cells.

In principal, two distinct wave forms of a pulse can be generated in a bulk electroporation setting, exponential decay and square wave [20]. Whereas both wave forms were used for electroporation, the latter was proven to be optimal [20] for mammalian cells. Square-wave electroporators represent the most widely used systems, they allow to control both voltage and pulse duration, and can produce rapidly repeating pulses. Several factors play a critical role in optimal transfection during electroporation. These include pulse amplitude, number, duration, interval between multiple pulses, and cuvette type [21, 22]. The most important factor that determines ionic strength on the cells and thereby the viability of cells post electroporation is the electroporation buffer. It is recommended to maintain hypo-osmolar conditions during electroporation since it enables easier and controlled electroporation [23]. However, some sources recommend iso-osmolar conditions to promote efficient DNA uptake and cell viability [18].

Whereas the gene delivery is the primary aim and protein expression being the ultimate aim of the transfection, viability is critical in terms of maintaining critical seeding density post electroporation. Though there are recent advances in electroporation technique, like micro- and nano-electroporation, such novel strategies have not yet been demonstrated to supersede the basic cuvette-style electroporation [3]. Hence, in spite of being a well-established technique, there is still a great potential to enhance the square wave electroporation outcome. Also, the rational cell type-dependent approach of electroporation, paves the way for getting additional insights into physical prerequisites for optimum transfection and better electroporation outcomes [24]. Hence, we hypothesized that such improved transfection performances can be obtained with selective interventions at critical steps in the process like choice of electroporation buffer, altering pulse parameters, and type of the cuvettes. The hypothesis was drawn by considering the already established concept of Maxwell-Wagner polarization, a key parameter for electroporation, which is an induced transmembrane voltage generated by an external electric field due to the variations in electrical properties of cell membrane, cytoplasm, and external medium [25]. Here, the transient expression was assessed, but a high initial transfer is of course a prerequisite for a stable long-term transformation.


Electroporation vs gene guns - Biology

Efficient DNA-mediated transformation of Tetrahymena cells has been accomplished by three methods: microinjection [1], electrotransformation [2] and biolistic bombardment [3]. Both the germline nucleus (micronucleus) or the somatic nucleus (macronucleus) can be transformed. (Click here for a description of the two types of nuclei.) Fig. 1 below shows the optimum life cycle stages for various types of transformation. By the appropriate choice of vectors and conditions, the incoming plasmid can be autonomously replicated in the MAC for many fissions, or the plasmid DNA can be inserted at the appropriate chromosome location by exact insert-mediated homologous recombination. The latter phenomenon allows gene replacements and knockouts, either in the MAC [ref.4 Fig. 2 below] or the MIC (ref.5 Fig. 3 below). Replacements and knockout strains are extremely valuable experimental tools, including the testing the indispensability of cloned genes and isolation of mutants after random mutagenesis of cloned genes. (Click here for a general Introduction to Tetrahymena Genetics.)

مراجع

1. Tondravi,MM Yao,M-C (1986): Transformation of Tetrahymena thermophila by microinjection of ribosomal RNA genes. بروك. ناتل. أكاد. علوم. USA 83, 4369-4373.

2. Gaertig,J Gorovsky,MA (1992): Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila by electroporation of conjugants. بروك. ناتل. أكاد. علوم. USA 89, 9196-9200.

3. Cassidy-Hanley,D Bowen,J Lee,JH Cole,E VerPlank,LA Gaertig,J Gorovsky,MA Bruns,PJ (1997): Germline and somatic transformation of mating Tetrahymena thermophila by particle bombardment. Genetics 146, 135-147.

4. Gaertig,J Thatcher,TH Gu,L Gorovsky,MA (1994): Electroporation-mediated replacement of a positively and negatively selectable beta-tubulin gene in Tetrahymena thermophila. بروك. ناتل. أكاد. علوم. U. S. A. 91, 4549-4553.

5. Hai,B Gorovsky,MA (1997): Germ-line knockout heterokaryons of an essential alpha-tubulin gene enable high-frequency gene replacement and a test of gene transfer from somatic to germ-line nuclei in Tetrahymena thermophila. بروك. ناتل. أكاد. علوم. U. S. A. 94, 1310-1315.

Fig. 1. Stages of the Tetrahymena life cycle used for various methods of DNA-mediated transformation.

Hours indicate time after mixing of starved cells to initiate conjugation. BGg, germline transformation with the biolistic gun BGc, conjugant transformation of macronuclei with the biolistic gun CET, conjugant electrotransformation of developing macronuclei BGv, vegetative macronuclei transformation with the biolistic gun INJc, microinjection of developing macronuclei INJv, microinjection of vegetative macronuclei.

Fig. 2. Gene replacement by phenotypic assortment in transformed macronuclei.

Selection for complete gene replacement by phenotypic assortment enables the distinction between essential and non-essential genes. The initial transformant contains one transformed gene which has been disrupted with an expression cassette containing a drug-selectable marker. Its clonal progeny are serially transferred to higher drug concentrations thus killing cells with fewer copies of the selectable markers. For a non-essential gene (top diagram), complete replacement is possible. For an essential gene (bottom diagram), only incompletely assorted cells whose macronuclear copies of the gene have been partially replaced can be obtained. All arrows indicate multiple generations.

Fig. 3. Gene replacement in the germline knockout heterokaryons.

Creation and testing of knockout heterokaryons homozygous for disrupted ATU (alpha tubulin) genes in the micronucleus (deltaATU) and containing only wild type ATU genes in the macronucleus [4]. Chx is a dominant gene conferring resistance to cycloheximide (cy-r) while the wild type Chx+ is sensitive (cy-s). Mpr is a dominant gene conferring resistance to 6-methylpurine (mp-r) to which the wild type Mpr+ gene is sensitive (mp-s). Roman numerals indicate mating types mating types not determined are indicated by ?. Crosses (a), (b) and (d) are normal crosses, while cross (c) is a genomic exclusion cross (see Fig. 4 below for explanation of genomic exclusion). Note that in cross (d) only a mutant deltaATU/deltaATU Round I product of cross (c) is shown. An approximately equal number of non-mutant ATU/ATU Round I cells are obtained that do not yield any pm-r progeny. The genotype of the Mpr locus in Round I exconjugants was not determined. Values obtained for test crosses (b) and (d) are from a single subline.

Fig. 4. Genomic Exclusion

* ("star") strains, have defective micronuclei they can form conjugal pairs, but cannot donate genetic material [Allen,SL (1967) Genetics 55, 797-822]. When mated to a "star" strain, a normal strain ("left" conjugant, round 1) donates a gametic nucleus, but receives nothing in return. The single haploid nucleus in each conjugant then diploidizes and most cells separate without forming a new macronucleus. These cells retain their old (macronuclear) phenotype and are mature (can be immediately re-mated) but can have new micronuclear genotypes, depending on the genetic make-up of the normal parent and which meiotic product was (randomly) selected to form gametic nuclei. This process, referred to as Round 1 of genomic exclusion, greatly facilitates complementation testing and mutant rescue by cytoplasmic exchange during conjugation. Round 1 genomic exclusion or phenotypic assortment of heterozygotes each allow production of heterokaryons, cells with different macro- and micronuclear genotypes. Heterokaryons homozygous or heterozygous for a drug resistance gene in the transcriptionally inert micronucleus but having only drug-sensitive alleles in the macronucleus are drug sensitive. When these cells conjugated, the drug sensitive macronucleus is discarded and the drug resistance allele is expressed in the new macronucleus, allowing simple drug selection for successful mating. Round 1 genomic exclusion also allows creation of strains homozygous for deleterious or even lethal genes in their micronuclei and wild type genes in their macronuclei.


شاهد الفيديو: مدى تأثير علم الجينات على الأصول العربية. وحقيقة تقنية كرسبر (ديسمبر 2022).