معلومة

لماذا تنخفض الفسفرة الكلية لبعض البروتينات العصبية أثناء التطور؟

لماذا تنخفض الفسفرة الكلية لبعض البروتينات العصبية أثناء التطور؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

النظر في تأثيرات RIM1a وهو بروتين يشارك في إطلاق الناقل العصبي. هل توجد أي أفكار حول سبب انخفاض إجمالي الفسفرة مع تطور الفئران؟

تشكرات

صورة؛ https://i.gyazo.com/16170fd79bd1f96517e028dfa2e70fbf.png">http://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(03)00727-X.pdf


إليك بعض مقالات ويكيبيديا التي قد تساعدك:

فترة حرجة - فترة حرجة: فكرة أن أنواعًا معينة من اللدونة في الجهاز العصبي تحدث فقط في أوقات "حرجة" معينة.

التقوية طويلة المدى - تحدثت LTP كثيرًا في الورقة التي ربطتها: إنها آلية لتقوية الاتصالات المشبكية.

تقليم متشابك - تميل # نقاط الاشتباك العصبي / قوة المشابك إلى الانخفاض من مرحلة المراهقة إلى مرحلة البلوغ

تتحدث الورقة التي ربطتها كثيرًا عن دور RIM1a الفسفوري في LTP. بدون معرفة المزيد عن هذا البروتين بشكل أكثر تحديدًا ، ومن مجرد لمحة على الورقة التي ربطتها ، كنت أشك في أن RIM1a قد تمت فسفرته خلال فترات زيادة LTP ، لا سيما في وقت مبكر من التطور ، ومع تقدم الحيوانات في العمر ودماغها تدخل في التقليم التشابكي المرحلة ، LTP خاضعة للتنظيم بشكل عام ، ويمكن أن تكون إحدى الآليات هي عدم وجود RIM1a phoshporylated.


لماذا تنخفض الفسفرة الكلية لبعض البروتينات العصبية أثناء التطور؟ - مادة الاحياء

تم افتراض أن اضطرابات طيف التوحد مثل متلازمة ريت (RTT) تنشأ من عيوب في نضج المشابك المعتمد على الخبرة. تحدث RTT بسبب طفرات في MECP2 ، وهو بروتين نووي يتفسفر في S421 استجابة لتنشيط الخلايا العصبية. نوضح هنا أن تعطيل الفسفرة MeCP2 S421 في الجسم الحي ينتج عنه عيوب في تطور وسلوك المشابك ، مما ينطوي على التنظيم المعتمد على النشاط لـ MeCP2 في نمو الدماغ و RTT. لقد بحثنا في الآلية التي ينظم بها الفسفرة S421 وظيفة MeCP2 ويظهر من خلال تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين أن هذا التعديل يحدث على MeCP2 المرتبط عبر الجينوم. يبدو أن الفسفرة في MeCP2 S421 لا تنظم التعبير عن جينات معينة بدلاً من ذلك ، يعمل MeCP2 كعامل شبيه بالهيستون قد تسهل فسفرته استجابة الجينوم الواسعة للكروماتين للنشاط العصبي أثناء تطور الجهاز العصبي. نقترح أن ينتج عن RTT جزئيًا فقدان إعادة تشكيل الكروماتين المعتمد على التجربة.

يسلط الضوء

► فقدان MeCP2 phospho-S421 المعتمد على النشاط في الجسم الحي يغير التطور المشبكي ► تعرض الفئران المدققة MeCP2 S421A استجابات سلوكية غير طبيعية للحداثة ► لا يتم تغيير ارتباط MeCP2 عبر جينوم الخلايا العصبية بشكل يمكن اكتشافه عن طريق التحفيز ► يحدث pS421 MeCP2 المعتمد على النشاط على مستوى الجينوم مما يشير إلى لها وظيفة عالمية


الملخص

ينظم البروتين بالميتويليشن ، وهو تعديل تقليدي وشائع للدهون ، جوانب متنوعة من تهريب البروتينات العصبية ووظيفتها. توفر الطبيعة القابلة للانعكاس لتكوين النخلة آلية عامة محتملة لانتقال البروتين بين الأجزاء داخل الخلايا. أدى الاكتشاف الأخير لأنزيمات البالميتويلينج - وهي عائلة بروتين DHHC كبيرة (Asp-His-His-Cys) - وتطوير طرق بروتينية وتصوير جديدة إلى تسريع تحليل البالميتول. أصبح من الواضح أن إنزيمات DHHC الفردية تولد وتحافظ على التجزئة المتخصصة للركائز في الخلايا العصبية المستقطبة. هنا ، نناقش الآليات التنظيمية لتأثير البروتين الحيوي والأدوار الناشئة لبروتين النخلة في جوانب مختلفة من الفيزيولوجيا المرضية ، بما في ذلك تطور الخلايا العصبية واللدونة المشبكية.


نتائج

يؤثر فقدان بروتينات Bbs على مورفولوجيا الخلايا العصبية التغصنية الرئيسية

بالنظر إلى أن الأهداب الأولية مطلوبة لتشكيل التشعبات العصبية [21] ، فقد بحثنا في تأثير فقدان بروتينات Bbs الهدبية على التشكل التغصني للخلايا العصبية الرئيسية في ببس نماذج الماوس. قمنا بقياس الطول التغصني ، وعدد العمود الفقري ، وكثافة العمود الفقري للتلفيف المسنن (DG) ، واللوزة القاعدية الوحشية (BLA) ، والخلايا العصبية الهرمية للطبقة V من القشرة الأمامية باستخدام طريقة التشريب Golgi-Cox. وجدنا أن الكثافة الكلية للعمود الفقري انخفضت بنسبة 55٪ في خلايا الحبيبات DG من P42 القديم ببس 4 −/− الفئران (الشكل 1 أ و 1 ب و S1 فيديو). تم تقليل الكثافة الكلية للعمود الفقري على التشعبات القاعدية والقمية (يشار إليها أيضًا باسم كثافة العمود الفقري القاعدية والقمية) للخلايا العصبية للطبقة V بنسبة 55 ٪ و 54 ٪ (الشكل 1A و 1E) ، على التوالي ، وإجمالي كثافة العمود الفقري القاعدية والقمية لـ BLA تم تخفيض الخلايا العصبية بنسبة 23 ٪ و 22 ٪ على التوالي (الشكل 1A و 1J). كشف تحليل Sholl عن انخفاض كبير في كثافة العمود الفقري لجميع الفروع وكل فاصل 30 ميكرون في DG باستثناء الفرع الأبعد ودائرة 300 ميكرون في ببس 4 −/− الفئران (الشكل 1C و 1 D). تم العثور على نتائج تحليل شول مماثلة في التشعبات القمية والقاعدية للخلايا العصبية من الطبقة الخامسة ، حيث تأثرت كثافة العمود الفقري الشجيري لكل ترتيب فرعي ولكل فترة 30 ميكرون (الشكل 1F-1I). تشعبات BLA قمي وقاعدية لـ ببس 4 −/− كشفت الفئران عن أنماط غير متكافئة في تصغير العمود الفقري تؤثر فقط على عدد قليل من الفروع والدوائر متحدة المركز (الشكل 1K - 1N). لم يتأثر عدد من التقاطعات التغصنية في الخلايا العصبية DG و Layer V و BLA عند مقارنتها بالفئران الضابطة (S1A-S1E Fig). تم تقليل الطول التغصني الكلي بنسبة 48٪ في الخلايا العصبية DG وبنسبة 25٪ في التشعبات القاعدية للخلايا العصبية في الطبقة الخامسة من القشرة في ببس 4 −/− الفئران. تغيير في طول التشعبات القمية للخلايا العصبية في الطبقة الخامسة من القشرة ببس 4 −/− لم تكن الفئران ذات دلالة إحصائية. أظهرت التشعبات القمية والقاعدية BLA انخفاضًا مهمًا من الناحية الإحصائية في الطول بنسبة 14 ٪ و 19 ٪ ، على التوالي (S1F - S1J الشكل). بشكل عام ، تظهر هذه البيانات انحرافات كبيرة في التشكل التغصني في ببس نموذج الفأر.

(أ) صور تمثيلية للخلايا العصبية الهرمية DG المشبعة من Golgi و BLA و Layer V لـ P42 ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران (شريط مقياس 100x ، 5 ميكرومتر). (B-D) كثافة العمود الفقري للخلايا العصبية DG. (ب) الكثافة الكلية للعمود الفقري. (ج) كثافة العمود الفقري لكل طلب فرع. (د) كثافة العمود الفقري لكل فاصل زمني 30 ميكرومتر. (EI) كثافة العمود الفقري للخلايا العصبية الهرمية من الطبقة الخامسة. (هـ) الكثافة الكلية للعمود الفقري. (و) كثافة العمود الفقري في التشعبات القمية لكل ترتيب فرع. (ز) كثافة العمود الفقري في التشعبات القاعدية لكل ترتيب فرع. (H) كثافة العمود الفقري في التشعبات القمية لكل فترة 30 ميكرومتر. (I) كثافة العمود الفقري في التشعبات القاعدية لكل فترة 30 ميكرون. (J-N) الكثافة الكلية للعمود الفقري لـ BLA. (J) الكثافة الكلية للعمود الفقري. (ك) كثافة العمود الفقري في التشعبات القمية لكل ترتيب فرع. (ل) كثافة العمود الفقري في التشعبات القاعدية لكل طلب فرع. (م) كثافة العمود الفقري في التشعبات القمية لكل فاصل زمني 30 ميكرومتر. (N) كثافة العمود الفقري في التشعبات القاعدية لكل فترة 30 ميكرون (نالفئران/WT = 5 نالفئران / KO = 7, نالخلايا/WT = 25, نالخلايا /KO = 35 ، يعني ± SD ، ***ص & lt 0.001 **ص & lt 0.01 *ص & lt 0.05). أحادي الاتجاه ANOVA ، اختبار Tukey اللاحق باستثناء B ، E ، J ، حيث يكون غير مقترن ر تم استخدام الاختبار. البيانات الأساسية متوفرة في بيانات S1. ببس 4، متلازمة بارديت بيدل 4 BLA ، اللوزة القاعدية DG ، التلفيف المسنن KO ، الضربة القاضية ns ، غير مهم WT ، النوع البري.

لتحديد متى العمارة التغصنية ببس 4 −/− تبدأ الخلايا العصبية DG في التغيير ، وقمنا بتحليل الطول التغصني وكثافة العمود الفقري لكل ترتيب فرع وكل فترة 30 ميكرون عند E19.5 و P21. كانت نتائج P21 مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في P42: لقد لاحظنا انخفاضًا كبيرًا في طول الشجيري وكثافة العمود الفقري وعدم وجود تغييرات كبيرة في عدد من التقاطعات التغصنية (S2A-S2F الشكل). على النقيض من ذلك ، في E19.5 ، كثافة أرجل خيطية شجرية (نتوءات شجيرية على الخلايا العصبية النامية) في ببس 4 −/− لم تتأثر الخلايا العصبية DG. ومع ذلك ، انخفض الطول التغصني بشكل ملحوظ عند E19.5 (S2A و S2G-S2K الشكل). مجتمعة ، فإن ببس 4 −/− يُظهر نموذج الفئران انخفاضًا تدريجيًا في كثافة العمود الفقري الشجيري عند P21 (38٪) و P42 (55٪) ، ولكن ليس في المراحل الجنينية المتأخرة (الشكل S2L).

لفحص ما إذا كان يمكن اكتشاف تشوهات شجيرية مماثلة في مناطق أخرى ببس النماذج ، قمنا بتحليل مورفولوجيا DG dendrite لـ P21 Bbs5 و Bbs1 موديلات M390R. والجدير بالذكر أن فقدان بروتين Bbs5 أدى إلى انخفاض كبير في الطول التغصني DG (34٪) والكثافة الكلية للعمود الفقري (32٪) في الخلايا الحبيبية المسننة لفئران خروج المغلوب (S3A-S3C Fig). كشف تحليل شول أيضًا عن كثافة العمود الفقري غير الطبيعية في Bbs5 - / - الفئران ، مع انخفاض كبير في العمود الفقري من الترتيب الفرعي الثاني إلى الخامس ومن الفاصل الزمني 60 ميكرومتر إلى 150 ميكرومتر ، على التوالي (S3D - S3F الشكل). ومن المثير للاهتمام، Bbs1 M390R / M390R كان مرتبطًا بتشوهات متسقة ولكن هامشية في تكوين العمود الفقري للخلايا العصبية DG تظهر انخفاضًا بنسبة 10 ٪ فقط في الكثافة الكلية للعمود الفقري. ومع ذلك ، لم يتأثر طول التغصن (S3A و S3G-S3K الشكل). هذه النتيجة تتفق مع ملاحظاتنا السريرية BBS1 M390R المرضى لديهم أخف نمط ظاهري معرفي.

لتحديد ما إذا كانت أنواع فرعية محددة من العمود الفقري تم تمثيلها بشكل كبير على الخلايا العصبية DG لـ ببس 4 −/− الفئران ، قمنا بتحليل العمود الفقري بناءً على حجمها وشكلها (الشكل S4A) [22]. لاحظنا أن إجمالي عدد العمود الفقري انخفض في جميع الأنواع الفرعية للعمود الفقري باستثناء العمود الفقري "المتفرعة". ومع ذلك ، عند الحد من طول شجيري ببس 4 −/− تم أخذ الخلايا العصبية في الاعتبار ، ووجدنا أنه تم تقليل كثافة العمود الفقري "الرقيق" فقط بشكل كبير (22٪) (S4B-S4E Fig).

تقليل ذاكرة الخوف السياقية والملموسة ولكن لا يوجد ضعف في السلوك الشبيه بالقلق في ببس 4 −/− الفئران

الحصين واللوزة والقشرة أمام الجبهية هي هياكل تشارك في التعلم والذاكرة والتفاعل الاجتماعي. لاستكشاف ما إذا كان فقدان العمود الفقري التغصني للخلايا العصبية DG و BLA والقشرة قبل الجبهية يرتبط بالتغيرات السلوكية في ببس 4 −/− على الفئران ، أجرينا مجموعة من الاختبارات السلوكية. ببس من المعروف أن الفئران تصاب بعدد من العيوب ، بما في ذلك ضعف البصر والسمنة [23]. لتقليل تأثير هذه العوامل المربكة ، أجرينا الاختبارات على الفئران الأصغر سنًا (8 أسابيع). وفقًا لغالبية الأدبيات وتقييماتنا الخاصة ، فإن التغييرات التنكسية في شبكية العين في هذا ببس 4 يبدأ النموذج في التطور في غضون 7-8 أسابيع ، مما يجعل ضعف البصر من غير المرجح أن يفسر الاختلافات في الاختبار. وبالمثل ، لا ينبغي أن تخلط السمنة في نتائجنا ، حيث لا توجد فروق في الوزن في هذا العمر ببس 4 −/− و ببس 4 +/+ الفئران. لتقييم ذاكرة الخوف ، أجرينا اختبارات سياقية وتكييف الخوف. في جلسة التكييف في اليوم الأول ، تم استخدام سلوك التجميد والمسافة المقطوعة خلال أول 150 ثانية دون إدخال حافز مشروط (نغمة) ومحفز غير مشروط (صدمة القدم) لتقييم النشاط الأساسي في البيئة الجديدة لتجربة الخوف السياقية. لم يؤثر فقدان Bbs4 على النسبة المئوية للتجميد أو المسافة المقطوعة في نشاط خط الأساس لـ ببس 4 −/− ذكور وإناث الفئران. ومع ذلك ، بعد إدخال حافز الصدمة المزدوجة في اليوم الأول ، أظهر التحليل اللاحق انخفاضًا كبيرًا في النسبة المئوية للتجميد وزيادة في المسافة المقطوعة في اليوم الثاني من ببس 4 −/− إناث الفئران مقارنة بإناث الفئران الضابطة. لم تكن النسبة المئوية للتجميد والزيادة في المسافة المقطوعة ذات دلالة إحصائية في ذكور الفئران (الشكل 2 أ ، 2 ب ، 2 د).

(أ) عرض تخطيطي لاختبار تكييف الخوف السياقي والملصق. في اليوم الأول ، تم وضع الفئران في غرفة تكييف الخوف لمدة 616.6 ثانية. بعد 150 ثانية ، يتم تشغيل نغمة مدتها 5 ثوانٍ ، متبوعة بصدمة مدتها 0.5 ثانية ، 0.5 مللي أمبير. يتم تكرار النغمة والصدمة مرتين أخريين بفواصل زمنية مدتها 150 ثانية. في اليوم الثاني ، تم وضع الفئران في نفس الحجرة تمامًا لمدة 300 ثانية بدون نغمات أو صدمات. بعد 4 ساعات (اليوم 2) ، توضع الفئران في السياق المعدل وتترك لمدة 180 ثانية. في 180 ثانية ، يتم تشغيل نغمة مدتها 5 ثوان ، والتي تتكرر مرتين بفواصل زمنية مدتها 60 ثانية. تم استخدام أول 150 ثانية من تجربة التكييف كخط أساس لبيانات السياق. تم استخدام أول 180 ثانية في السياق المعدل كخط أساس لبيانات التلميح. (ب) التجميد (٪) في اختبار الذاكرة السياقية. (C) التجميد (٪) في اختبار ذاكرة التلميح. (د) المسافة المقطوعة (سم) في اختبار التكييف ، واختبار السياق ، والاختبار الملصق (إناث: نWT = 11, نKO = 11 ذكور: نWT = 13, نKO = 12 يعني ± SD ، ***ص & lt 0.001 **ص & lt 0.01 *ص & lt 0.05). اتجاه واحد ANOVA ، اختبار Tukey بعد المخصص. # لوحظ أنه كان هناك مستوى كبير من انخفاض النسبة المئوية لتجميد الوقت والمسافة المقطوعة ببس 4 −/− عند الفئران غير الزوجية ، ثنائية الذيل ر اختبار (ص & lt 0.05). البيانات الأساسية متوفرة في بيانات S3. ببس 4، متلازمة بارديت بيدل 4 KO ، الضربة القاضية WT ، النوع البري.

تم استخدام السياق الذي تم تغييره في اليوم الثاني قبل إدخال النغمة كخط أساس لبيانات التلميح. كشفت البيانات أنه لم يكن هناك تغيير كبير في النسبة المئوية للتجميد في النشاط الأساسي للسياق المتغير (الشكل 2C و 2 D). أثناء جلسة التكييف الملصقة بالنغمة (اليوم الثاني ، 180-360 ثانية) ، انخفضت النسبة المئوية للتجميد بشكل كبير ، وزادت المسافة المقطوعة في ببس 4 −/− ذكر ولكن ليس في إناث الفئران (الشكل 2C و 2 D). تشير هذه المجموعة من النتائج إلى أن فقدان بروتين Bbs4 يؤثر على ذاكرة الخوف السياقية والملموسة بطريقة تعتمد على نوع الجنس.

يتم زيادة سعة التيارات المثيرة بعد المشبكية المصغرة في ببس 4 −/− الخلايا العصبية DG

إن مورفولوجيا العمود الفقري التغصني ديناميكي للغاية ، ويعتمد تكوينها وصيانتها على الوظيفة المشبكية والنشاط العصبي [24]. لتقييم الوظيفة المشبكية والعصبية في نموذج Bbs ، قمنا بقياس الخصائص الجوهرية والمتشابكة للخلايا الحبيبية الحُصينية التي يبلغ عمرها 3-4 أسابيع ببس 4 −/− و ببس 4 +/+ الفئران في شرائح الحصين الحادة. وجدنا أن الخصائص الجوهرية لـ ببس 4 −/− لم تتأثر الخلايا العصبية مقارنة مع زملاء التحكم المتطابقين مع العمر (الشكل 3 أ -3 ج). لتقييم الخصائص التشابكية للخلايا الحبيبية في هاتين المجموعتين ، قمنا بقياس التيارات المثيرة المصغرة بعد المشبكي (mEPSCs). والجدير بالذكر ، في حين أن تواتر mEPSCs لم يكن مختلفًا بين المجموعتين ، كانت سعة mEPSC أكبر بشكل ملحوظ في ببس 4 −/− الخلايا العصبية (الشكل 3D – 3F). هذه البيانات تجعل من غير المحتمل أن يكون انخفاض نشاط الخلايا العصبية وراء انخفاض كثافة العمود الفقري. على العكس من ذلك ، تشير الزيادة الملحوظة في سعة mEPSC إلى تنشيط الآليات التعويضية في مواقع ما قبل المشبكي و / أو ما بعد المشبك استجابة لفقدان العمود الفقري.

(أ) مقارنة بين أنماط إطلاق النار استجابة للحقن الحالية أثناء تسجيلات المشبك الحالية من خلايا الحُصين الحبيبية. (ب) الرسوم البيانية الشريطية تلخص خصائص الغشاء السلبي. لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية بين ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران في مقاومة الإدخال (يسار) ، ثابت وقت الغشاء (وسط) ، وإمكانات غشاء الراحة (يمين). (ج) تم رسم تردد إطلاق النار مقابل اتساع الحقن الحالي. لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية بين ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران. (D) تم تسجيل mEPSCs من الخلايا الحبيبية في الحصين ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران (ن = 6). (هـ) مخطط الاحتمال التراكمي الذي يقارن بين اتساع mEPSC ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران. اتساع mEPSC في الخلايا الحبيبية من ببس 4 - / - الفئران أكبر بشكل ملحوظ (ن = 6, ص & lt 0.05 ، اختبار Kolmogorov-Smirnov). (F) مؤامرة الاحتمالية التراكمية التي تقارن الفواصل الزمنية بين الأحداث (IEIs) من mEPSCs بين ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران (ن = 6 ص = 0.27 ، اختبار Kolmogorov-Smirnov). البيانات الأساسية متوفرة في بيانات S3. ببس 4، متلازمة بارديت بيدل 4 IEI ، الفاصل الزمني بين الأحداث KS ، Kolmogorov-Smirnov mEPSC ، التيار المثير بعد المشبكي المصغر.

يتم إلغاء تنظيم إشارات المصب IGF-1R في ببس 4 −/− المشابك

من المعروف أن عددًا من مستقبلات التيروزين كيناز (RTKs) ، بما في ذلك IGF و RET و TrkB و PDGF و EphB يعزز النمو التغصني ويعزز تكوين وصيانة العمود الفقري الشجيري [7،25]. لتقييم تشوير RTK في الكسور المشبكية لـ ببس 4 −/− و ببس 4 +/+ الفئران ، قمنا بتحديد مستوى الفسفرة في RTK باستخدام صفيف Phospho-RTK. بالنظر إلى أن فقدان العمود الفقري التغصني يحدث بين P1 و P21 وللتقاط تغييرات الإشارة الأولية قبل أن تبدأ الآليات التعويضية المحتملة في الحدوث ، استخدمنا كسورًا متشابكة من الفئران P7. كسور المشابك من ببس 4 −/− و ببس 4 +/+ تم تحضين الفئران بغشاء يحتوي على أجسام مضادة لـ RTK ثابتة متبوعة باكتشاف فسفرة RTK بواسطة جسم مضاد للفوسفو-تيروزين. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم تغيير مستويات الفسفرة لعدد من RTK ، بما في ذلك مستقبلات الأنسولين ومستقبلات IGF1 (الشكل 4A و S5 الشكل). ركزنا على إشارات مستقبلات IGF-1R / مستقبلات الأنسولين (IR) ، حيث من المعروف أن لها تأثيرًا عميقًا على المرونة العصبية في الجهاز العصبي المركزي [7-9]. أكدت التجارب المنسدلة أن فسفرة IGF-IR / InsulinR قد انخفض في الجزء المشبكي المخصب P7 من ببس 4 −/− الفئران (الشكل 4 ب). بالإضافة إلى ذلك ، تم تقليل مستويات الفسفرة لـ Akt ، وهو هدف لاحق لإشارة IGF الكنسي ، بشكل كبير (الشكل 4 ب). بعد ذلك ، اختبرنا مستوى الفسفرة لركيزة مستقبلات الأنسولين P53 (IRS p58) ، وهو بروتين محول يتم فسفرته بواسطة IR و IGF-1R [26]. ومن المثير للاهتمام ، أن بروتين IRS p58 سبق أن ثبت أنه غني جدًا في PSD من المشابك الجلوتاماتيكية ، مما يبرز دور هذا البروتين في الخلايا العصبية [27]. وجدنا أن الفسفرة لـ IRS p58 قد انخفضت بشكل كبير في الكسور المشبكية لـ P7 ببس 4 −/− الفئران (الشكل 4 ب). علاوة على ذلك ، نظرًا لأن أنشطة IGF-1R و IRS p58 تعتمد على التفاعل مع عائلة Rho GTPases [28 ، 29] ، فقد بحثنا في أنشطة Rac1 و RhoA GTPases. لاحظنا أن نشاط RhoA قد زاد ، وبالتزامن مع ذلك ، انخفض نشاط Rac1 في الجزء المشبكي المخصب لـ P7 ببس 4 −/− الفئران (الشكل 4 ج و 4 د). قمنا بعد ذلك بتقييم ما إذا كان عدم تنظيم إشارات IGF-1 في الفئران Bbs يؤثر على مستويات N-methyl-D-aspartate (NMDA) و Alpha-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazole Propionic Acid (AMPA) ) المستقبلات في الكسور الكلية والمتشابكة من ببس 4 −/− و Bbs4 +/+ الفئران بالنشاف الغربي. لاحظنا زيادة كبيرة في مستوى مستقبلات NMDA و AMPA في الجزء المشبكي من P7 ببس 4 −/− الفئران ، بينما لم يتم الكشف عن أي تغييرات في مستويات المستقبلات في الجزء الكلي من الدماغ (الشكل 4E). تتوافق هذه البيانات مع النتائج السابقة التي توصلنا إليها بشأن زيادة سعة mEPSC في ببس 4 −/− الخلايا العصبية (الشكل 3E) ، مما يشير إلى آلية تعويضية استجابة لفقدان العمود الفقري.

(أ) تكشف مجموعة Phospho-RTK عن انخفاض كبير في فسفرة الأنسولين ومستقبلات IGF1 في ببس 4 −/− (ن = 2 ، يعني ± SD). (ب) يُظهر التحليل المنسدل إشارة شاذة لـ IGF-1R في اتجاه مجرى النهر. ببس 4 - / - و ببس 4 + / + تم تحضين الكسور المشبكية المخصبة مع الجسم المضاد للفوسفوتيروزين للفئران طوال الليل ، تليها الحضانة مع Dynabeads M-280 لمدة ساعتين. تم إجراء تحليل التجلط المناعي للبروتينات المستخرجة من الحبيبات باستخدام الأجسام المضادة لـ IGFR / InsR و anti-Akt و anti-IRS p58. المدخلات: إجمالي جزء بروتين الدماغ قبل الحضانة بالأجسام المضادة المضادة للفوسفوتيروزين ، والتي تشير إلى المستوى الإجمالي لـ IGFR / InsR و Akt و IRS p58 في ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران. (C ، D) فحوصات تنشيط RhoA و Rac1 G-LISA. تم قياس مستويات RhoA (c) و Rac1 (d) المنشط في مستخلصات الدماغ الكلية والجزء المشابك المخصب من ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران (ن = 3 ، يعني ± SD غير مقترن ر اختبار). (E) صورة تمثيلية لتحليل اللطخة الغربية لمستويات مستقبلات NMDA و AMPA في مستخلص الدماغ الكلي والجزء المشبكي المخصب من ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران. (F) البقع الغربية التمثيلية لعلامات الالتهام الذاتي LC3-II و p62 في الكسور المشبكية لـ ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران في P1 و P7 و P14 و P21 (ن = 3 ، يعني ± SD). LC3-I هو شكل عصاري خلوي من LC3. LC3-II هو اتحاد LC3-فوسفاتيدي إيثانول أمين (LC3-II) ، والذي يتم تجنيده في أغشية البلعمة الذاتية. تم قياس مستويات LC3-II و p62 عن طريق قياس شدة نطاق اللطخة الغربية باستخدام برنامج Image J (ن = 3 ، يعني ± SD ، غير مزدوج ر اختبار). لا يمكن استخدام جينات التدبير المنزلي (الأكتين ، GAPDH ، إلخ) كعناصر تحكم تطبيع بسبب التغيرات في مستويات التعبير الجيني في ببس 4 - / - الفئران (ملاحظاتنا غير المنشورة). (ز) قياس الأنشطة المعقدة للفسفرة المؤكسدة (OXPHOS) في متجانسات الدماغ بالكامل ببس 4 - / - و ببس 4 + / + الفئران. الوحدات: mU: U CS تم تطبيع البيانات الأولية لتصنيع السترات ن = 4 ، يعني ± SD ns ، ليست كبيرة غير مقترنة ر اختبار. البيانات الأساسية متوفرة في بيانات S2. AMPAR ، alpha-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazole Propionic Acid receptor NMDAR ، مستقبلات N-methyl-D-aspartate ببس 4، متلازمة بارديت بيدل 4 CI ، مجمع الميتوكوندريا I CII ، مجمع الميتوكوندريا II CIII ، مجمع الميتوكوندريا III CS ، سينثيز السترات ، GAPDH ، Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GluR ، مستقبلات الجلوتامات IGF-1R ، مستقبلات الأنسولين ، عامل النمو الشبيه بالأنسولين مستقبلات LC3 ، بروتين مرتبط بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B-light chain 3 LC3-I ، شكل عصاري خلوي من LC3 LC3-II ، LC3-phosphatidylethanolamine المتقارن المعين إلى أغشية البلعمة الذاتية OXPHOS ، الفسفرة المؤكسدة RTK ، إنزيم السوكوكتير السيتوزيني (= المركب II + III مجتمعين) WB ، لطخة غربية.

إحدى الآليات الممكنة لتقليم العمود الفقري التغصني هي التلتهب الكلي [18] ، وهي عملية يتم تنظيمها بإحكام بواسطة إشارات IGF-1R و GTPases الصغيرة. لاختبار ما إذا كانت الالتهام الذاتي غير منظم في منطقتنا ببس النموذج ، قمنا بتحليل مستوى علامات الالتهام الذاتي LC3-II و p62 في الكسور المشبكية المخصبة المعزولة من ببس 4 −/− و ببس 4 +/+ أدمغة الفئران في مراحل مختلفة بعد الولادة. لاحظنا زيادة كبيرة في مستوى LC3-II عند P1 و P7 من ببس 4 −/− الفئران (الشكل 4F). نظرًا للمفهوم المعترف به على نطاق واسع بأن مستوى p62 يرتبط عكسيًا بالالتهام الذاتي ، كان من غير المتوقع أن نرى زيادة في p62 في متشابك P1 في تجربتنا. ومع ذلك ، فإنه يتماشى مع التقارير التي تفيد بأن مستويات p62 يمكن تنظيمها أثناء التدفق الذاتي العالي بسبب الدور متعدد الوظائف لـ p62 [30]. لاستبعاد الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي كمحفزات للتحريض الذاتي [31] ، قمنا بتقييم أنشطة معقدات سلسلة الجهاز التنفسي الأول والثاني والثالث والرابع والسكسينات: سيتوكروم سي أوكسيدريدوكتاز (مجمع SCC الثاني والثالث مجتمعين) في مجموع متجانسات الدماغ من ص 7 ببس 4 −/− و ببس 4 +/+ الفئران. تم تحديد الأنشطة المعقدة للفسفرة التأكسدية (OXPHOS) ، وتم تطبيع النتائج مع نشاط مركب السترات (CS). لم نعثر على فروق ذات دلالة إحصائية في أنشطة OXPHOS بين ببس 4 −/− و ببس 4 +/+ الفئران (الشكل 4G) ، وبالتالي استبعاد خلل الميتوكوندريا كسبب للالتهام الذاتي في BBS. تشير النتائج التي توصلنا إليها معًا إلى أن إشارات IGF-1 الشاذة قد تؤدي إلى خلل في تنظيم المسارات الخلوية المختلفة المعروف أنها تتحكم في مورفولوجيا العمود الفقري الشجيري واللدونة.

توطين متشابك لبروتينات BBS

تم توسيع دور بروتينات Bbs في تنظيم الأهداب الأولية مؤخرًا من خلال الدراسات التي أظهرت أن بروتينات Bbs تشارك في تثبيت الأنابيب الدقيقة ، وإعادة تشكيل الأكتين ، وتنظيم النسخ ، والاتجار الداخلي [16 ، 17 ، 32]. مع الأخذ في الاعتبار هذا الطيف الواسع من وظائف Bbs بالإضافة إلى نتائجنا الحالية التي توضح دور Bbs ، مثل تقليل كثافة العمود الفقري الشجيري جنبًا إلى جنب مع إشارات مستقبلات IGF المشبكية الشاذة ومستويات مستقبلات الناقل العصبي المتغيرة (NMDA و AMPA) ، افترضنا أن Bbs قد تلعب البروتينات دورًا حيويًا في المشابك العصبية. كشفت إعادة تقييم تحليلاتنا السابقة لقياس الطيف الكتلي للكسور المشبكية [33،34] والكسور المشبكية الخام [35] من قشرة الفئران والمخطط الظهري و DG عن وجود بروتينات Bbs1 و Bbs2 و Bbs4 و Bbs5 و Bbs7 و Bbs10 (جدول S1).

للتوسع في التوطين المشبكي لبروتينات BBS كيميائيًا حيويًا ، قمنا بإثراء المشابك الخلوي القابل للذوبان في المنظفات (المخصب قبل المشبك DSS) ، وأجزاء PSD من المستحضرات المشبكية من حصين الفئران البالغة باستخدام طريقة موصوفة مسبقًا (الشكل S6) [36]. كشفت كمية LC-MS الخالية من الملصقات على أساس كثافة MS1 عن وفرة عالية من البروتينات Bbs1 و Bbs2 و Bbs5 و Bbs9 في جزء PSD ، بينما كان Bbs7 موجودًا في الغالب في الجزء العصاري الخلوي (الشكل 5 أ و 5 ب). تم تحديد مستوى منخفض من بروتين Bbs4 بشكل لا لبس فيه في كسور PSD (الشكل 5 أ و 5 ب). أكد تحليل التألق المناعي لتوطين Bbs4 و Bbs5 وجود نقطتين Bbs في جميع أنحاء الشجرة المتفرعة للخلايا العصبية الحصينية المنفصلة بالماوس (الشكل 5C و S7A-S7C الشكل). بشكل جماعي ، تشير هذه البيانات بوضوح إلى وجود بروتينات Bbs في العمليات العصبية و PSDs.

(أ) الملف البروتيني لبروتينات BBS في الكسور البيوكيميائية باستخدام تحليل nano-LC-MS / MS. تم تقدير مستويات البروتين لبروتينات Bbs والعلامات المشبكية من خلال تحليلات LC-MS الخالية من الملصقات من الكسور الكيميائية الحيوية التالية لحصين الفئران: تحضير المشابك الخلوي ، والمنظفات القابلة للذوبان في المنظفات (DSS ، المخصب قبل المشبك) ، وإعداد الكثافة بعد المشبكي (PSD) . يتم إثراء مستويات البروتين في علامات البروتين قبل المشبكي (VGLU1 ، SYP) وما بعد المشبكي (NMDAR1 ، PSD95) في تحضيرات DSS و PSD ، على التوالي. (ب) يتم الحصول على وفرة البروتين الموضحة في خريطة الحرارة من إجمالي شدة الببتيد MS1 التي تم تحجيمها إلى متوسط ​​جميع العينات. يتم إثراء مستويات البروتين في علامات البروتين قبل المشبكي (VGLU1 ، SYP) وما بعد المشبكي (NMDAR1 ، PSD95) في تحضيرات DSS و PSD ، على التوالي. (ج) صورة تمثيلية للتوسيم المناعي لبروتينات Bbs. تم وضع علامات مناعية على الخلايا العصبية في قرن آمون الفئران المزروعة بكثافة منخفضة بأجسام مضادة Bbs4 و Bbs5 (حمراء) ، و phalloidin (أخضر) ، و beta-III tubulin (أخضر) بعد 6 أيام في المختبر (DIV6). شريط المقياس ، 20 ميكرومتر (اللوحة العلوية) و 5 ميكرومتر (اللوحات السفلية). البيانات الأساسية متوفرة في بيانات S4. BBS ، متلازمة بارديت بيدل DIV6 ، ستة أيام في ثقافة الحصين في المختبر DSS ، المنظفات القابلة للذوبان في المنظفات LC-MS / MS ، اللوني السائل - قياس الطيف الكتلي الترادفي MS ، مطياف الكتلة NMDAR1 ، مستقبلات N-methyl-D-aspartate 1 PSD ، postynaptic الكثافة SYP ، synaptophysin TUBB3 ، β-tubulin III المشفر بواسطة جين TIBB3 VGLU1 ، ناقل الغلوتامات الحويصلي 1.


النتائج

يتم تعزيز أو منع تكوين العملية الناجم عن بروتين تاو في خلايا Sf9 بواسطة مواقع الفسفرة المختلفة

كان هدفنا في هذه الدراسة هو استخدام نظام خلايا Sf9 المنقولة بفيروس باكولوفيروس لاستكشاف دور فسفرة تاو في إنشاء قطبية الخلية. تاو هي خريطة عصبية تشارك في دعم نمو المحاور العصبية وتثبيتها (دروبين وكيرشنر ، 1986 لي وآخرون.، 1988 بارلو وآخرون.، 1994 إسماعيل آزاد وآخرون.، 1994). يتم أيضًا تحفيز عمليات الخلايا عندما يتم نقل tau إلى خلايا غير عصبية ، على سبيل المثال ، خلايا COS (Kanaiوآخرون.، 1989) أو خلايا الحشرات Sf9 (Baas وآخرون.، 1991 ، 1994 كنوبس وآخرون.، 1991). تجعل كفاءة نظام تعداء الفيروسات الباكية نموذجًا جذابًا لدراسة التفاعلات الخلوية. إن استخدام هذا النظام لدراسة خرائط MAP ومتغيراتها راسخ (للمراجعة ، انظر Kosik and McConlogue ، 1994). ومع ذلك ، لتوسيع هذه الدراسات في مجال الفسفرة ، كان علينا التأكد أولاً من أن خلايا Sf9 تحتوي على كينازات داخلية قادرة على فسفرة تاو بعد تعداء العدوى.

اخترنا العديد من تركيبات tau كمجسات تم تمييزها على نطاق واسع في المختبر ، باستخدام عدة معايير مثل التقارب للأنابيب الدقيقة والقدرة على نواة أو تثبيت الأنابيب الدقيقة ، أو لتغيير عدم استقرارها الديناميكي ، أو لتحفيز تجميع الأنابيب الدقيقة (Butner and Kirschner، 1991 Gustke وآخرون.، 1994 باندا وآخرون.، 1995 Trinczek وآخرون.، 1995 جود وآخرون.، 1997). يوجد في تاو العديد من مواقع الفسفرة ويمكن أن تتم فسفرتها بواسطة كينازات مختلفة ، ولكن هناك فئتان من مواقع الفسفرة مثيرة للاهتمام بشكل خاص. فئة واحدة تضم زخارف SP و TP ، والتي هي أهداف للعديد من الكينازات الموجهة بالبرولين. يتم تنظيم هذا النوع من الفسفرة من الناحية التطورية ، أي أنه يتم تحسينه في أنسجة الجنين (Bramblett وآخرون.، 1993) ، وهي بارزة في الحالات المرضية لمرض الزهايمر (للمراجعة ، انظر Johnson and Jenkins، 1996 Mandelkow and Mandelkow، 1998). لذلك قمنا بصنع تركيبات تم فيها تحور بعض أو كل مواقع SP أو TP إلى AP وبالتالي لم تعد قابلة للفوسفور. أصغر شكل إسوي بشري (جنيني) يحتوي على 14 موقعًا من هذا القبيل ، تم تحويلها جميعًا إلى AP في بناء tau23 / AP (الشكل 1 أ). يمكن مراقبة بعض أشكال SP و TP هذه بسهولة ، نظرًا لوجود عدد من mAbs التي تتعرف عليها بطريقة تعتمد على الفسفرة (تم إنشاء العديد من هذه الأجسام المضادة في الأصل ضد Alzheimer tau ، على سبيل المثال ، AT-8 [Mercken وآخرون.، 1992] و PHF-1 [جرينبيرج وآخرون.، 1992 للمراجعة ، انظر Friedhoff and Mandelkow، 1999]). تشتمل فئة أخرى من مواقع الفسفرة على أشكال KXGS في مجال التكرار (X = I أو C). الفسفرة الأولى من هذه (في Ser262) لها تأثير واضح على ارتباط تاو بالأنابيب الدقيقة (بيرنات وآخرون.، 1993) ومرتفع في مرض ألزهايمر تاو (موريشيما كاواشيماوآخرون.، 1995 سيوبرت وآخرون.، 1995). أشكال KXGS هي أهداف للأنابيب الدقيقة - التي تنظم تقارب كيناز MARK وكذلك PKA (Drewes وآخرون.، 1995 ، 1997 Zheng-Fischhöfer وآخرون.، 1998). لذلك قمنا بعمل تصميمات تم فيها تحويل شكل KXGS في تكرار 1 من tau23 إلى KXGA (بناء KXGA / R1) ، في التكرارات 1 و 4 (KXGA / R1 / 4) ، أو في التكرارات الثلاثة ، R1 ، R3 ، و R4 ، من tau23 (KXGA / R1 / 3/4 الشكل 1 أ لاحظ أن تسمية التكرارات والترقيم التسلسلي مشتق من أطول شكل إسوي ، tau40).

التين. 1. مخططات للأشكال الإسوية تاو أو التركيبات والحلقات المضادة للأجسام المضادة. (أ) يُنشئ: 1) htau40 ، أكبر شكل إسوي لـ tau في الجهاز العصبي المركزي البشري ، يحتوي على أربعة مكررات مكونة من 31 بقايا في النصف الطرفي C (مربعات مرقمة) وإدخالات بالقرب من الطرف N (411 وحدة بنائية). يتم تسمية المناطق المحيطة بالتكرارات P1-P2 و R ′ (تفقس). 2) htau23 ، أصغر الأشكال الستة المتولدة عن طريق الربط البديل (352 من البقايا). يفتقر إلى إدراج N-terminal والتكرار الثاني. 3) قم ببناء KXGA / R1 ، حيث يتم استبدال Ser262 في شكل KXGS للتكرار الأول بـ Ala.4) قم ببناء KXGA / R1 / 4 ، حيث يتم استبدال عناصر serines في أشكال التكرار KXGS 1 و 4 بـ Ala ( S262A و S356A). 5) قم ببناء KXGA / R1 / 3/4 ، حيث يتم استبدال عناصر serines الموجودة في أشكال التكرارات 1 و 3 و 4 بـ Ala (S262A و S324A و S356A). 6) قم ببناء tau23 / AP ، حيث يتم استبدال جميع أشكال SP و TP بـ AP. بناء tau23 / AP / R1 / 4 متشابه ، ولكن بالإضافة إلى ذلك يتم تغيير Ser262 و Ser356 إلى Ala.7) يمثل Construct K19 التكرارات فقط. (ب) حواتم الجسم المضاد. تتفاعل معظم الأجسام المضادة المعتمدة على الفسفرة مع الأشكال SP و TP في المجالات المحيطة قبل التكرارات أو بعدها.

أصيبت الخلايا بفيروس باكول الذي يعبر عن تاو ولوحظت في طبقة أحادية تحت المجهر. أجسام الخلايا لها شكل دائري بقطر 16-22 ميكرومتر (يتم تحديده في الحجم المقابل لمقياس الدم ، 2–4 pl) ، والذي يظل ثابتًا تقريبًا طوال فترة حياتها. تبدأ العمليات في الظهور بعد فترة حضانة تبلغ 30 ساعة. عادة هناك عملية واحدة لكل خلية ، بقطر موحد (1-2 ميكرومتر) ويصل طوله إلى 100 ميكرومتر (الشكل 2). يزيد تواتر العمليات خطيًا بمرور الوقت (الشكل 3 أ) ، بالتوازي مع الزيادة في تركيز بروتين تاو. ومع ذلك ، فإن كفاءة عملية الحث تختلف اختلافا كبيرا. تعمل حالة tau23 كتكوين عملية قياسي يبدأ عند -34 ساعة ويزيد بوتيرة 1.4٪ / ساعة ، لتصل إلى مستوى ∼60٪ بعد 75 ساعة. مع بناء tau23 / AP ، حيث لا يمكن فسفرة أشكال SP و TP ، تكون الكفاءة أعلى بكثير (t0 = 32 ساعة منحدر ، 1.9٪ / ساعة المستوى النهائي ، 80٪). على العكس من ذلك ، عندما يكون اثنان أو ثلاثة أشكال KXGS في تكرارات tau23 غير قابلة للفوسفور ، كما هو الحال في KXGA / R1 / 4 أو KXGA / R1 / 3/4 ، تنخفض الكفاءة بشكل حاد (البداية المتأخرة ، t0 = 38 ساعة وارتفاع أبطأ بخمسة أضعاف ، 0.3٪ / ساعة). لا ترتبط هذه السلوكيات المختلفة بتعبير البروتين ، والذي يصل إلى مستويات مماثلة في جميع الحالات (45 ميكروغرام / 10 6 خلايا الجدول 1). وبالتالي فإن الاختلافات ترجع إلى طبيعة البروتينات المنقولة.

التين. 2. التألق المناعي لخلايا Sf9 المنقولة بتركيبات تاو المختلفة. تم نقل الخلايا باستخدام htau23 (A) أو KXGA / R1 (B) أو KXGA / R1 / 3/4 (C) وتم تحصينها مناعًا لمدة 60 ساعة بعد الإصابة بالأجسام المضادة DM1A (للتوبيولين ، على اليسار) و K9JA (لـ tau ، على اليمين) . يؤدي ترنسفكأيشن مع htau23 (A) إلى العديد من العمليات عندما يتحول Ser262 إلى Ala (B) ، ولا يزال المرء يجد عمليات مشابهة لـ tau23 ، ولكن عندما يتم تغيير أشكال KXGS الثلاثة إلى KXGA (C) ، يتم منع تكوين العمليات بالكامل تقريبًا . لاحظ أنه في حالة تلطيخ تاو ، تظهر أجسام الخلايا معرّضة بشكل مفرط لتصوير العمليات الأكثر ضعفًا. بار ، 50 ميكرومتر.

الشكل 3. الدورة الزمنية لتشكيل العملية. (أ) الكمي من الثقافة أحادية الطبقة. تبدأ العمليات في الظهور عند -30-40 ساعة بعد الإصابة يزداد تواترها خطيًا بعد ذلك. بالنسبة إلى tau23 (الدوائر المملوءة) ، تكون البداية المستقرأة عند t0 = 34 ساعة ، تكون الزيادة في الخلايا الحاملة للعملية 1.4٪ خلية / ساعة. يعد إنشاء tau23 / AP (المربعات المفتوحة) عمليات أكثر كفاءة تظهر في وقت سابق وتزيد بشكل أسرع (t0 = انحدار 32 ساعة ، 1.9٪ / ساعة) ، مما يدل على أنه عندما تظل مواقع SP و TP بدون فسفرة ، يتم تحسين تكوين العمليات. بناء KXGA / R1 / 3/4 (مثلثات ممتلئة) أقل كفاءة (ر0 = انحدار 38 ساعة ، 0.3٪ / ساعة) ، مما يدل على أن الفسفرة لأشكال KXGS تعزز تشكيل العملية. يتصرف بناء KXGA / R1 بشكل مشابه لـ tau23 ، بينما يتصرف KXGA / R1 / 4 (الدوائر المفتوحة) بشكل مشابه لـ KXGA / R1 / 3/4 ، مما يشير إلى أن اثنين أو أكثر من أشكال KXGS يجب أن تتعاون لتغيير استجابة الخلايا. وبالمثل ، يتم أيضًا منع تكوين العملية باستخدام tau23 / AP / R1 / 4 (الماس) ، مما يدل على أن التأثير المهيمن للفسفرة يكون في التكرارات ، وليس في المناطق المحيطة. (ب) التحديد الكمي لتشكيل العملية من ثقافة التعليق. يؤدي هذا إلى المبالغة في التأكيد على الخلايا ذات العمليات المستقرة ، لأن قوى القص تُفقد بسهولة أكبر. وبالتالي ، فإن العمليات أقل عددًا ، ولكن من الناحية النوعية ، فإن الاتجاهات هي نفسها كما في A ، أي أن إنشاء tau23 / AP هو الأكثر كفاءة ، في حين أن KXGA / R1 / 3/4 لا يؤدي إلى أي عمليات تقريبًا. لاحظ الاختلاف الرباعي بين tau23 و tau23 / AP ، مما يشير إلى ثبات أكبر للعمليات ، لأنه لا يمكن فسفرة أشكال SP و TP. القضبان والانحرافات المعيارية.

الجدول 1. تركيزات بروتين تاو في خلايا Sf9 كدالة للوقت بعد الإصابة

لاحظ أن التركيزات قابلة للمقارنة لجميع التركيبات بحيث يتم حساب الاختلافات في امتدادات الخلايا عن طريق الطفرات بدلاً من التركيز.

لوحظ في البداية قمع قوي للعمليات الموصوفة أعلاه عندما تم تحور أشكال KXGS الثلاثة إلى KXGA في وقت واحد. لأن موقعًا واحدًا (Ser262 في التكرار الأول) كان له تأثير سائد على تقارب تاو للأنابيب الدقيقة (بيرنات وآخرون.، 1993) ، سألنا عما إذا كان هذا هو الحال أيضًا في المقايسات المستخدمة هنا. ومع ذلك ، وجدنا أن طفرة الموقع الفردي لـ Ala262 (بناء KXGA / R1) ليس لها أي تأثير ، في حين أن طفرتين من هذا القبيل في التكرارات 1 و 4 (Ala262 و Ala356 ، بناء KXGA / R1 / 4) لهما نفس التأثير المثبط للطفرات. في جميع الأشكال الثلاثة (Ala262 و Ala324 و Ala356 ، قم بإنشاء KXGA / R1 / 3/4 الشكل 3 أ). نستنتج أن طفرات KXGA في التكرارات 1 و 4 ضرورية وكافية للتأثير المثبط الكامل على تكوين العملية. تتزامن هذه المواقع مع أقوى مواقع الفسفرة للكيناز مارك (Ser262 و Ser356 Drewes وآخرون.، 1995) يمكن فسفرتها بواسطة PKA أيضًا وتحدث في خلايا Sf9 (انظر الشكل 6 ، A و D).

نظرًا لأن الطفرات في مواقع SP أو TP لها تأثير معاكس لطفرات KXGA ، فقد سألنا أيضًا عن أي من هذه الطفرات تهيمن عند مزجها. في طفرة واحدة ، تم تحويل جميع مواقع SP أو TP إلى AP ، بالإضافة إلى مواقع KXGA في التكرارات 1 و 4 (بناء tau23 / AP / R1 / 4). تم قمع تشكيل العملية بقوة كما هو الحال في البناء KXGA / R1 / 4 (الشكل 3 أ). هذا يدل على أن طفرات KXGA في التكرارات تهيمن على طفرات AP في المناطق المحيطة.

عندما يتم تحديد عمليات الخلية من التعليق ، يحصل المرء على صورة مماثلة نوعيا ، باستثناء أن الاختلافات بين بنيات تاو أصبحت أكثر وضوحا (الشكل 3 ب). على سبيل المثال ، في 70 ساعة بعد الإصابة ، ∼3٪ من الخلايا المنقولة بواسطة tau23 تطور عمليات. بالنسبة للخلايا التي تحتوي على متحولة tau23 / AP ، يكون التردد أعلى بخمسة أضعاف (15٪) ، في حين أن الخلايا ذات الطفرة KXGA / R1 / 3/4 لا تحتوي على أي شيء تقريبًا. نظرًا لأن العمليات في حالة التعليق تخضع لقوى القص ، والتي تميل إلى كسرها ، فإن هذه البيانات تجادل بأن الإنشاءات التي تولد العمليات بشكل أكثر كفاءة (من حيث البداية المبكرة والزيادة السريعة) تجعلها أيضًا أكثر استقرارًا ميكانيكيًا.

فسفرة تاو في خلايا Sf9

يعتمد تفسير أن تكوين العملية يتأثر بفسفرة تاو على المواقع المستهدفة فعليًا بواسطة كينازات داخلية المنشأ لخلايا Sf9. تم تحديد هذه المشكلة بعدة طرق: التحول الهلامي ، تفاعلات الأجسام المضادة ، وتحليل الفوسفوببتيد (الأشكال 4-6). يمكن الحصول على مسح تقريبي من التحول التصاعدي لـ tau في هلام SDS ، والذي يمكن أن يصل إلى زيادة واضحة بمقدار ≥5 كيلو دالتون ، اعتمادًا على موقع الفسفرة (بيرنات وآخرون.، 1993).هذا التحول هو أيضًا سمة من سمات مرض ألزهايمر تاو (بروتين A68 ، لي وآخرون.، 1991). يوضح الشكل 4 أن تاو من خلايا Sf9 المنقولة تعرض أيضًا تحولًا واضحًا (موزعة على عدة نطاقات) ، مما يشير إلى أن تاو يتم فسفرته بواسطة كينازات داخلية في خلايا Sf9. يكون التحول مرئيًا مع tau23 من النوع البري ، مع المسوخات "المتكررة" KXGA / R1 و KXGA / R1 / 3/4 ولكن ليس مع متحولة "الجناح" tau23 / AP (التي تعمل كنطاق متجانس ، بشكل أساسي غير فوسفوري ، معبر بكتيريا تاو). يؤكد هذا ملاحظاتنا السابقة أن مواقع SP و TP متورطة بشكل أساسي في التحول ويظهر أن كينازات داخلية المنشأ والموجهة بالبرولين نشطة في خلايا Sf9.

الشكل 4. فسفرة بنى تاو وتاو المنقولة في خلايا Sf9. (أ) 10٪ SDS-PAGE. تم عزل بروتين Tau أو المسوخ (tau23 و KXGA / R1 و KXGA / R1 / 3/4 و tau23 / AP) من كميات متساوية من خلايا Sf9 المنقولة باستخدام تركيبات تاو المناسبة وتم تحضيرها بأحجام متساوية من المخزن المؤقت للعينة. تم تحميل كميات متساوية من محلول البروتين تمثل نقاط وقت الحصاد المختلفة على هلام SDS (10٪). تتوافق كميات البروتينات المحملة تقريبًا مع 0.4 ميكروغرام (48 ساعة) و 2.5 ميكروغرام (66 ساعة) و 3 ميكروغرام (73.5 ساعة). كما يتضح من النطاقات المتعددة والمتحولة بشدة ، فإن tau23 شديد الفسفرة بطريقة غير متجانسة. الأمر نفسه ينطبق على البناءات KXGA / R1 و KXGA / R1 / 3/4 (التي تفتقر إلى موقع واحد أو ثلاثة مواقع فسفرة في أشكال KXGS ولكنها تحتفظ بجميع مواقع SP أو TP). على النقيض من ذلك ، يُظهر بناء tau23 / AP القليل جدًا من الفسفرة ولا يوجد تحول ، لأنه يفتقر إلى معظم مواقع الفسفرة (لاحظ أن مواقع KXGS لا تحفز التحول في Drewes وآخرون.، 1995). بشكل ضمني ، فإن مواقع التحول القوية S409 و S416 (أهداف PKA أو CaMKII) لا يتم فسفرتها أيضًا في خلايا Sf9. (ب) تم تطعيم نفس العينات بالجسم المضاد 5E2 ، والذي يتفاعل بشكل مستقل عن الفسفرة ويعكس الكمية الإجمالية لبروتين تاو. لين M ، بروتينات علامة.

يتوفر عدد من الأجسام المضادة الحساسة للفسفرة ضد تاو ، والتي يمكن استخدامها كأدوات تشخيص (الشكل 1 ب). كمرجع ، تم تكتل مستخلصات الخلايا من خلايا Sf9 المنقولة بواسطة الجسم المضاد المستقل عن الفسفرة 5E2 (Kosik وآخرون.، 1988) ، مما يشير إلى إجمالي كمية تاو. كما هو موضح في البقع الغربية (الشكل 5) ، يتعرف Tau-1 بشكل ضعيف على جميع مشتقات tau23 المعبر عنها في خلايا Sf9 ، مما يشير إلى أن جزءًا صغيرًا لا يتم فسفرته حول البقايا 200. يكشف الجسم المضاد التكميلي AT-8 عن إشارة قوية بواسطة htau23 ، KXGA / R1 و KXGA / R1 / 3/4. يتم التعرف على هذه الطفرات المتكررة أيضًا بشكل واضح من خلال الأجسام المضادة الأخرى الحساسة للفسفرة الموجهة بالبرولين (AT-270 و AT-180 و SMI-34 و PHF-1) ، مما يشير إلى الفسفرة في Thr181 و Thr231 و Ser235 و Ser396 و Ser404 (الشكل 1 ب). والمثال المثير للاهتمام بشكل خاص هو ذلك الموجود في الجسم المضاد AT-100 ، وهو خاص بشكل فريد لمرض ألزهايمر تاو (ماتسو وآخرون.، 1994). يتم تشكيل الحاتمة عن طريق الفسفرة المتسلسلة أولاً من Thr212 بواسطة GSK-3 ثم من Ser214 بواسطة PKA وتتطلب تشابهًا شبيهًا بـ PHF الناجم عن polyanions (Zheng-Fischhöfer وآخرون.، 1998). هذه الحاتمة موجودة على تاو في خلايا Sf9 المنقولة (الشكل 5). وبالمثل ، من الواضح أن Ser262 / Ser356 فسفرته ، كما يتضح من التفاعل مع الجسم المضاد 12E8. تعتبر الفسفرة في حواتم AT-100 و 12E8 حساسة بشكل خاص للفوسفاتازات لأنها تختفي بسرعة أثناء الخطوات الأولية للتحضير.

التين. 5. مواقع الفسفرة لبنى تاو وتاو المعبر عنها بفيروس باكولوفيروس. تم مسح محلولات الخلايا Sf9 (72 ساعة بعد الإصابة) واحتضانها بمختلف mAbs المعتمدة على الفسفرة والمستقلة. تكوينات tau ، من اليسار إلى اليمين: 1) tau23 / AP ، 2) KXGA / R1 ، 3) htau23 ، 4) KXGA / R1 / 3/4 ، 5) مستخلص خلية Sf9 غير المنقولة (تحكم بدون تاو) ، 6) خلايا Sf9 المنقولة بفيروس باكول من النوع البري (التحكم بدون تاو) ، 7) تم التعبير عن htau23 فيبكتريا قولونية (التحكم غير الفسفوري) ، و 8) htau23 المعبر عنه في بكتريا قولونية و فسفرته مع نشاط كيناز مستخلص الدماغ (يؤثر بشكل كبير على مواقع SP و TP ويحفز قوة مص التحول انظر بيرناتوآخرون.، 1993). الأجسام المضادة ، من أعلى إلى أسفل: 5E2 (جسم مضاد بان تاو) يتعرف على جميع المستحضرات التي تحتوي على تاو. يُظهر Tau-1 تفاعلًا معتدلًا فقط مع بنيات tau المعبر عنها في خلايا Sf9 ، لأن موقع P واحد بالقرب من البقايا 200 يكفي لتقليل الارتباط ، ولكن هناك تفاعل قوي مع tau غير الفسفوري المعبر عنه في بكتريا قولونيةأو tau23 / AP. تعتبر الأجسام المضادة AT-8 إلى SMI-34 خاصة بمختلف أشكال SP و TP المُفسفرة وبالتالي لا تظهر أي تفاعل مع متحولة tau23 / AP أو مع بكتريا قولونية–يعبر عن htau23. يتعرف الجسم المضاد 12E8 فقط على تلك التركيبات التي تحتوي على Ser262 و / أو Ser356 في التكرارات. يتعرف AT-100 على tau phosphorylated عند Thr212 و Ser214 وهذا التفاعل خاص للغاية بمرض Alzheimer tau ولكنه يحدث في خلايا Sf9 أيضًا ، بشرط أن يكون كلا الموقعين قابلين للفوسفور (على سبيل المثال ، ليس في متحولة tau23 / AP).

وضع العلامات الأيضية على تاو وتحليل الفوسفوببتيدات

إن اكتشاف مواقع الفسفرة بواسطة الأجسام المضادة يعاني من عيبين: 1) قد تكون هناك مواقع لا توجد فيها أجسام مضادة ، و 2) لا يعد تلطيخ الأجسام المضادة مؤشرًا موثوقًا به لمدى الفسفرة (لأن تقاربات الجسم المضاد متغيرة و غالبًا غير معروف). لمزيد من التوصيف لمواقع الفسفرة في htau23 ومشتقاته ، أجرينا وضع العلامات الأيضية لخلايا Sf9 باستخدام حمض الفوسفوريك [32 ف]. تم عزل بروتين تاو المسمى ، وهضمه بالتريبسين ، ثم معالجته لتحليل الببتيد ثنائي الأبعاد (Boyle وآخرون.، 1991). لتحديد الببتيدات ، أعرب تاو في الإشريكية القولونية تم فسفرته إشعاعيًا باستخدام كينازات مختلفة في المختبر وهضمها مع التربسين ، وتمت تنقية الببتيدات بواسطة HPLC وتم التعرف عليها بواسطة المصفوفة بمساعدة المصفوفة بالليزر والتأين ، وتسلسل الفوسفوببتيد ، ورسم خرائط الفوسفوببتيد (لمزيد من التفاصيل ، انظر Drewes وآخرون.، 1995 إلينبرجر وآخرون.، 1998Zheng-Fischhöfer وآخرون.، 1998). يوضح الشكل 6 أ خريطة الفوسفوببتيد الموجودة مع tau23 الفسفرة في خلايا Sf9 ، حيث يتم تحديد البقع الرئيسية من خلال موقع الفسفرة (للحصول على تفاصيل حول التعريف ، انظر Illenberger وآخرون.، 1998). مكنتنا التجارب مع المسوخ من تحديد مواقع الفسفرة عن طريق استبعاد المواقع المقابلة من الخريطة ثنائية الأبعاد (الشكل 6 و B و C). تمثل غالبية المواقع مواقع SP أو TP ، تحتوي على 80 ٪ من إجمالي النشاط الإشعاعي. تختفي هذه البقع في حالة متحولة tau23 / AP ، حيث تبقى المواقع غير SP أو TP فقط ، من بينها S214 و S262 و S320 و S356 وموقعان غير معروفين (الشكل 6 ب). من اللافت للنظر أن توزيع وشدة مواقع الفسفرة في tau23 مشابه تمامًا لتوزيع الخلايا المستنبتة الأخرى أثناء الطور البيني ، بما في ذلك الخلايا العصبية (Illenbergerوآخرون.، 1998). يوضح هذا أن توازن الكينازات والفوسفاتازات متشابهة في هذه الخلايا ، وتوفر أساسًا منطقيًا إضافيًا لاستخدام خلايا Sf9 المنقولة بالفيروس البكتيري كنظام نموذجي.

التين. 6. خرائط فسفوببتيد ثنائية الأبعاد لبنى تاو معبراً عنها في خلايا Sf9 و فسفرتها بواسطة كينازات داخلية. (أ) htau23 (تكبير أعلى) (ب) htau23 / AP (C) KXGA / R1 / 3/4 (D) بناء K19 مفسفر بمزيج PKA (E) من tau23 و K19 فسفرته باستخدام PKA. في A ، يتم إنشاء غالبية البقع عن طريق الفوسفوببتيدات التي تحتوي على واحد أو أكثر من 14 SP و TP. تم تمييز مواقع الفسفرة الأربعة في التكرارات وتسطيرها (ثلاثة أشكال KXGS مع S262 و S324 و S356 ، بالإضافة إلى S320). في B ، يتم تغيير جميع أشكال SP أو TP إلى AP بحيث تكون مواقع الفسفرة الرئيسية المتبقية هي Ser214 وتلك الموجودة في التكرارات ، بالإضافة إلى بعض النقاط غير المعروفة. في C ، تم تغيير أشكال KXGS في التكرارات إلى KXGA وبالتالي فهي غائبة عن الخريطة إلى جانب الأشكال الفسفورية SP و SP التي يلاحظها المرء S214 و S320. في D ، تمت فسفرة الإنشاء المتكرر K19 باستخدام PKA ، حيث تظهر فقط المواقع S262 و S324 و S356 و S320. تم تشغيل هذه العينة مع tau23 في E لتحديد المواقع. للحصول على تفاصيل حول تحليل الفوسفوببتيدات ، انظر Illenberger وآخرون. (1998).

يوضح الشكل 6 ج خريطة الببتيد الفوسفاتي لـ KXGA / R / 1/3/4 المتحولة ، حيث تم استبدال المواقع الثلاثة S262 و S324 و S356 بـ Ala وبالتالي لم تعد تظهر على الخريطة (هذه البقع عادة ضعيفة مقارنة مع مواقع SP و TP ومرئية فقط عند التعرض الأطول راجع الشكل 6A). أكدنا الفسفرة في المواقع في التكرارات عن طريق خلط الببتيدات الفوسفاتية من tau23 المسمى استقلابيًا في خلايا Sf9 مع الببتيدات الفوسفورية من البناء K19 (ثلاثة تكرارات فقط) الفسفرة في المختبر باستخدام MARK أو PKA ، مما أدى إلى تداخل البقع التي تمثل الفسفرة المتكررة المواقع (S262 و S324 و S356 plus S320 الشكل 6 و D و E).


فسفرة تاو في مرض الزهايمر وأمراض تاوباثيات الأخرى

تم صياغة فرضية تتالي & # x0201Camyloid & # x0201D بعد الإبلاغ عن طفرة بروتين أميلويد (APP) في عائلة ذات نسيج نموذجي AD وتقترح أن تراكم منتج انشقاق APP ، بيتا أميلويد (A & # x003B2) ، يحفز الكيمياء الحيوية التغييرات النسيجية والسريرية لمرضى الزهايمر (هاردي وهيجينز ، 1992). في وقت لاحق ، تم اقتراح أوليغومرات A & # x003B2 لتحفيز السمية العصبية في AD ربما عن طريق الفسفرة تاو. تم اقتراح تنشيط Glycogen synthase kinase-3 & # x003B2 (GSK-3 & # x003B2) كوسيط للتأثيرات المستحثة بأوليجومير A & # x003B242 على فسفرة تاو في الفئران P301L (Selenica et al. ، 2013).

دور الفسفرة في السمية الخلوية والتجمع في تاو

يحتوي Tau ، في أطول شكل إسوي ، على 35 ثريونين ، 45 سيرين ، و 5 بقايا من التيروزين مما يعني أن ما يقرب من 20 ٪ من بروتين تاو لديه القدرة على الفسفرة. كشفت الدراسات المبكرة أن تاو أكثر كفاءة في تعزيز تجميع الأنابيب الدقيقة (MT) في حالة غير فسفرة أكثر (Lindwall and Cole ، 1984). بعد بضع سنوات ، تم إثبات أن تاو تتكون من الخيوط الحلزونية المزدوجة (PHFs) التي تشكل التشابك الليفي العصبي (NFTs) الموجودة في دماغ الزهايمر وتفسفر بشكل غير طبيعي في هذه الهياكل (Grundke-Iqbal et al. ، 1986 Goedert et. آل ، 1988 Kosik وآخرون ، 1988 Wischik وآخرون ، 1988). كشفت التحليلات الإضافية أن PHF-tau مُفسفر في مواقع & # x0201Cpathological & # x0201D ، والتي يُفترض أنها تساهم في العمليات المرضية في ميلادي. لوحظ نشاط مناعي محسن في أنسجة AD البشرية مع الأجسام المضادة المعتمدة على الفسفرة AT8 (epitope pS199 / pS202 / pT205) و PHF-1 (epitope pS396 / pS404) و pS262 (Gu et al.، 2013a Mondragon-Rodriguez et al.، 2014). تبين أن فرط الفسفرة في تاو متورط في تراكم تاو والسمية الخلوية (الجدول 2) (Kosik and Shimura ، 2005 Noble et al. ، 2013).

الجدول 2. مواقع وتأثيرات الفسفرة تاو.

كثيرًا ما يتم ملاحظة مستويات عالية غير طبيعية من تاو داخل الخلايا في مرضى الزهايمر وقد تكون متورطة بشكل مباشر في تراكم تاو وتشكيل PHF وفقدان الخلايا العصبية (Gomez-Isla et al. ، 1997). تم التكهن بأن فرط الفسفرة في تاو يسبق علم الأمراض NFT ، والأهم من ذلك ، هو حدث رئيسي لدمج تاو في الألياف (Bancher et al. ، 1991). تم تنقيح مرحلة علم الأمراض العصبية الليفي العصبي المرتبط بمرض الزهايمر باستخدام تقنية صبغة الفضة باستخدام التلوين المناعي لتاو مفرط الفسفرة في حلقة AT8 (Braak et al. ، 2006). تناولت العديد من الدراسات مسألة ما إذا كان نمط فرط فسفرة تاو يرتبط بتطور أمراض الخلايا العصبية وتشكيل أنواع تاو عالية المستوى في ميلادي. تم تصنيف أنسجة المخ إلى ما قبل NFTs و NFTs داخل الخلايا العصبية و NFTs خارج الخلايا العصبية ، وتم فحصها فيما يتعلق بالتلوين الأكثر بروزًا للأجسام المضادة تاو المعتمدة على الفسفرة. تشمل الحواتم التي ارتبطت بالمستطيل ، والتاو غير الليفي pS199 ، و pS202 ، و pT231 ، و pS262 ، و pT153 ، و S409. تم تلوين الهياكل الليفية داخل الأعصاب بأجسام مضادة تتعرف على pS46 و pT175 / pT181 و pT231 و pS262 / pS356 (12E8 epitope) و pS396 و pS422 و pS214. تشمل الحواتم المرتبطة بـ tau الخيطي خارج الخلية AT8 و AT100 (pT212 / pS214) و PHF-1 (Morishima-Kawashima et al.، 1995b Kimura et al.، 1996 Augustinack et al.، 2002). بشكل ملحوظ ، مع تطور المرض ، يتم فسفرة تاو في حواتم مرضية متعددة المواقع (AT8 ، AT100 ، AT180 ، PHF-1 ، 12E8). لوحظ وجود شوائب تاو في اضطرابات التنكس العصبي الأخرى مثل MSA (Giasson et al. ، 2003b) ، والاضطرابات النفسية العائلية والمتفرقة (Ishizawa et al. ، 2003 Rajput et al. ، 2006) ، وفي متلازمة داون (Flament et al. ، 1990 موندراجون رودريغيز وآخرون ، 2014). تم الكشف عن مستويات مرتفعة من AT180 (pT231 / pS235) تاو فوسفوريلاتيد في السائل الدماغي الشوكي (CSF) للمرضى الذين يعانون من ضعف إدراكي خفيف والذين تطوروا لاحقًا إلى AD (Arai et al. ، 2000a).

تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية لتلخيص فرط الفسفرة في تاو وتشكيل NFTs كجوانب رئيسية لاعتلالات تاووباتي (Ribeiro et al. ، 2013). أظهرت بعض الدراسات أن الإفراط في التعبير عن طافرة تاو البشرية في الفئران المعدلة وراثيًا أدى إلى زيادة فسفرة تاو وتشكيل شوائب تاو والركام والألياف. تم الكشف عن فسفرة تاو في الحلقات المعروفة المرتبطة بالأمراض S202، T205، S212، S216، T231، S262، S356، S422، AT100 (Kohler et al.، 2013 Nilsen et al.، 2013 Sahara et al.، 2013 ). وبالمثل ، فإن الإفراط في التعبير عن LRRK2 أو p25 / Cyclin المعتمد على كيناز -5 (Cdk5) في الفئران أدى إلى فرط فسفرة تراكم تاو ، تاو في هياكل تشبه NFT ، وموت الخلايا العصبية (كروز وآخرون ، 2003 نوبل وآخرون ، 2003 بيلي وآخرون ، 2013). استفادت النماذج الأخرى من التعبير المشترك للبروتينات الأخرى المرتبطة بالأمراض مثل APP و presenilin 1 (Oddo et al. ، 2003 Grueninger et al. ، 2010) ، أو استفادت من حقن الألياف A & # x003B2 (Gotz et آل ، 2001).

تعتمد جميع النماذج الحيوانية المتوفرة حاليًا في م على الإفراط في التعبير عن أشكال تاو المتحولة المسببة للأمراض. لذلك ، من المثير للجدل مدى جودة تلخيص هذه النماذج لحالات AD حيث لا توجد طفرات في أي من تاو أو APP. ومع ذلك ، فإن النماذج الأولى من tauopathy ، استنادًا إلى الإفراط في التعبير عن WT tau 3 أو 4 مرات متكررة ، قدمت فرط فسفرة tau ولكن لم يتم تشكيل NFT. يعد التعبير عن tau-P301L ، غالبًا بالاقتران مع البروتينات الأخرى المرتبطة بالأمراض ، هو النهج الأكثر استخدامًا والأكثر نجاحًا لتلخيص الجوانب الرئيسية لمرض الزهايمر مثل فرط فسفرة تاو ، والتجمع ، وتشكيل الخيوط وكذلك موت الخلايا العصبية. في هذه النماذج ، غالبًا ما يكون غير واضح ما الذي يدفع فرط الفسفرة. في المختبر قد تساعد الدراسات في فك شفرة تأثير طفرات مُمْرِضة محددة على فسفرة تاو لكن البيانات الموجودة ليست متسقة. تبين أن طفرات تاو الخاطئة المعروفة المرتبطة بـ FTDP-17 R406W و V337M و G272V و P301L تجعل تاو ركيزة أكثر ملاءمة للفسفرة بواسطة كينازات دماغ الفئران ، مقارنة ببروتين WT tau (Alonso Adel et al. ، 2004 ). في دراسة أخرى ، تبين أن الطفرات نفسها تعزز أو تمنع الفسفرة في مواقع محددة (هان وآخرون ، 2009). في المختبر أدت عملية الفسفرة بواسطة GSK-3b المؤتلف إلى حدوث فسفرة مخفضة لطفرة R406W ، ربما من خلال تغييرات توافقية طويلة المدى. على العكس من ذلك ، لم يكن لطفرات P301L و V337M أي تأثير (Connell et al. ، 2001). تم الحصول على نتائج مماثلة في زراعة الخلايا (Dayanandan et al. ، 1999). في المقابل ، تشير العديد من الدراسات الأخرى التي تستخدم نماذج استنبات الخلايا وأنسجة المخ البشري إلى أن طفرة R406W تقلل من فسفرة تاو ، ليس فقط في حلقة PHF1 المجاورة ولكن في عدة مواقع (Miyasaka et al.، 2001 Deture et al.، 2002 Tackenberg and Brandt ، 2009 Gauthier-Kemper et al. ، 2011). ومع ذلك ، اعتمادًا على السياق الخلوي ، تبين أيضًا أن R406W يزيد من الفسفرة ، والطفرات الأخرى ، مثل V337M ، وتقليل الفسفرة في تاو في مواقع محددة (Deture et al. ، 2002 Krishnamurthy and Johnson ، 2004). يمكن أن يكون للتغييرات في حالة الفسفرة تأثيرات هائلة على الخصائص الهيكلية والوظيفة وعلم الأمراض في تاو كما هو موضح أدناه.

في المختبر تشير البيانات إلى أن فسفرة tau عند بعض الحواتم تؤثر بشكل مباشر على الخصائص الهيكلية المحلية أو التشكل العالمي لـ tau والذي بدوره قد يؤثر على تجميعه في PHFs. تم اقتراح مواقع مختلفة لتكون مهمة لميل التجميع وتشكيل خيوط تاو بما في ذلك AT8 و AT100 و AT180 و PHF-1 و S305 المنبع لعزر PHF6-hexapeptide المعروف بأهميته في الرجفان tau (Sun and Gamblin ، 2009 Bibow وآخرون ، 2011 Inoue et al. ، 2012). اقترحت بعض الدراسات أن ضغط شكل مشبك الورق الخاص بـ tau يصبح أكثر إحكامًا أو تخفيفًا اعتمادًا على الفسفرة في حواتم AT8 و PHF-1 و AT100 (Jeganathan et al. ، 2008 Bibow et al. ، 2011). وبالمثل ، فإن الفسفرة داخل منطقة التكرار ، لا سيما في أشكال KXGS ، تسببت في تغييرات مطابقة محددة غيرت خصائص ربط MT لـ tau (Fischer et al. ، 2009). في حالات أخرى ، تم توطين التغييرات الهيكلية على مقربة من مواقع الفسفرة دون التأثير على التشكل العالمي (Schwalbe et al. ، 2013).

على الرغم من البحث المكثف في هذا المجال ، لا تزال مساهمة الفسفرة في تكوين مجاميع تاو مثيرة للجدل (الجدول 2). النتائج الأخيرة من في المختبر التجارب ، التي تُظهر أن تكوين ليفي ناتج عن تأشيب تاو غير الفسفوري مشابه لمركبات PHF المشتقة من AD ، شكك في ضرورة فسفرة تاو لعملية الرجفان (Morozova et al. ، 2013). علاوة على ذلك ، تم إرجاع شكل العمود الفقري المتغير وفقدان العمود الفقري في أنسجة حالات الزهايمر إلى محتوى التشابك بدلاً من كمية تاو الفسفرة (Merino-Serrais et al. ، 2013). في دراسة أجريت على الفئران PS19 (طفرة tauP301S) ، تسببت ألياف tau الاصطناعية في أمراض NFT في غياب فرط فسفرة تاو (Iba et al. ، 2013). كشف إدخال طفرات التجميع & # x0201Cpro - & # x0201D و & # x0201Canti - & # x0201D أن الزخارف السداسية الببتيدية لتاو قد تعمل كنواة لتشكيل هيكل محلي & # x003B2 للورقة ، وبالتالي ، للحث على تشكيل PHF (Von Bergen et al.، 2000 Eckermann et al.، 2007). قد تساهم مستويات تاو المحسّنة ، من خلال تثبيت tau mRNA ، في علم أمراض تاو بشكل مستقل عن فسفرة تاو (Qian et al. ، 2013).

قد تتداخل PTMs الأخرى من tau مع الفسفرة ، وبالتالي تؤثر على بنية البروتين ووظيفته وتنظيمه ، لكن البيانات ليست متسقة. تم العثور على أشكال KXGS لتكون ناقصة الأسيتيل وفرط الفسفرة في المرضى المصابين بمرض الزهايمر ، بما يتوافق مع في المختبر تظهر البيانات أن أستلة تاو تمنع الفسفرة وتمنع تراكم تاو (إيروين وآخرون ، 2013 كوك وآخرون ، 2014).على النقيض من ذلك ، ارتبط أستلة تاو عند K280 بالفسفرة في حلقة AT8 في مجاميع تاو من الفئران المعدلة وراثيا تاو ، وتم اكتشافها في أنسجة ما بعد الوفاة للحالات المصابة بمرض الزهايمر أو اعتلالات تاوباثية أخرى (مين وآخرون ، 2010 كوهين وآخرون ، 2011 إيروين وآخرون ، 2012). تم تقديم دليل حديث على أن تاو نفسها تمتلك نشاط أسيتيل ترانسفيراز ، وهي قادرة على تحفيز الأستلة الذاتية (كوهين وآخرون ، 2013). في المختبرارتبط ارتباط O-link & # x003B2-N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAcylation) في S400 بشكل عكسي مع فسفرة تاو في S396 (Smet-Nocca et al. ، 2011). ومع ذلك ، فإن علاج الفئران المعدلة وراثيا تاو مع مثبط O-GlcNAcase زاد من tau O-GlcNAcylation ، وأعاق تكوين مجاميع tau ، وأبطأ التنكس العصبي دون التأثير على فسفرة tau (Yuzwa et al. ، 2012 Graham et al. ، 2013).

تؤدي الفسفرة في تاو في العديد من المخلفات إلى السمية الخلوية (الجدول 2). تشير العديد من البيانات إلى أن فسفرة تاو يجب أن تكون متوازنة بشكل جيد. تم الافتراض بأن انفصال tau عن MTs يؤدي إلى ضعف استقرار MT والكمية الزائدة من tau غير المرتبط بفرط الفسفرة في العصارة الخلوية ، مما يساهم في إهانة سامة. في المختبر قدمت التجارب دليلًا على أن فسفرة tau في S262 و T231 و S214 ضروري للفصل الكامل لـ tau عن MTs (Illenberger et al. ، 1998 Sengupta et al. ، 1998). باستمرار ، أدى الفسفرة المحسنة في S262 و T231 إلى عدم استقرار MT والسمية الخلوية في نماذج الخلايا والحيوانات (Steinhilb et al. ، 2007 Qureshi et al. ، 2013). علاوة على ذلك ، تم إنقاذ العمليات المرضية عن طريق الإفراط في التعبير وتفعيل كينازات تنظيم تقارب الأنابيب الدقيقة (MARKs) التي فسفوريلات تاو في أشكال KXGS لنطاقات التكرار (Mandelkow et al.، 2004 Thies and Mandelkow، 2007). قد يؤدي الفسفرة الشاذة لـ tau في المواقع المرضية إلى تغيير ارتباط tau-MT ، مما يؤثر على تنظيم وديناميكيات شبكات MT. وهذا بدوره قد يضر بتدفق الأكسوبلازم والوظيفة العصبية المناسبة ، ويؤدي في النهاية إلى موت الخلايا. يبدو أن الفسفرة داخل أشكال KXGS ، خاصة في S262 ، و GSK-3 & # x003B2 ، تأخذ أدوارًا رئيسية بين مواقع الفسفرة و tau kinases ، على التوالي.

يرتبط الخلل الوظيفي بالميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي ارتباطًا وثيقًا بموت الخلايا في التنكس العصبي. الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا في الفائق النقص في ديسموتاز 2 و APP الذي يعبر عن الفئران أدى إلى تفاقم عبء الأميلويد وفرط الفسفرة في تاو في S396. منع العلاج بجرعات عالية من مضادات الأكسدة من فرط فسفرة تاو وعلم الأمراض العصبية (ميلوف وآخرون ، 2007). قامت الفئران الثلاثية AD التي تعبر عن متحولة tau و APP و presenilin 1 بتطوير التشابك واللوحات A & # x003B2 ، وعرضت تحرير العديد من بروتينات الميتوكوندريا مما يشير إلى التأثيرات التآزرية لـ A & # x003B2 و tau في الميتوكوندريا المهلكة (Rhein et al. ، 2009).

مما لا شك فيه أن فرط فسفرة تاو هو ظاهرة مهمة في مرض الزهايمر وغيره من اعتلالات تاوباثيات ويوازي ظهور تكتلات تاو و NFTs ، ولكن على الرغم من الجهود الكبيرة ، تظل الآليات الأساسية التي تؤدي في النهاية إلى السمية والتنكس العصبي بعيدة المنال (بابانيكولوبولو وآخرون ، 2010 أمبيجاوكار وجاكسون ، 2011). في السنوات الأخيرة ، تم الافتراض بأن عزل تاو في الركام داخل الخلايا هو طريق للهروب للخلية من الكمية الزائدة من البروتين. بدلاً من ذلك ، تم اعتبار أوليغومرات تاو من الأنواع السامة التي تضر الخلية وتؤدي في النهاية إلى موت الخلايا (Sahara and Avila ، 2014).

تم الكشف عن تراكم الفسفرة (AT8 ، PHF-1 ، S422) في المشابك AD البشرية المصاحبة لخلل في UPS (Henkins et al. ، 2012 Tai et al. ، 2012). كشف استخدام الجسم المضاد الخاص بـ tau oligomer في عينات الدماغ البشري AD أن أوليغومرات tau تظهر في مراحل مبكرة من الزهايمر ، إما قبل أو بعد ظهور فسفرة تاو في حواتم محددة (Lasagna-Reeves et al. ، 2012). وبالتالي ، فإن تجميع أشكال تاو المفرطة الفسفرة في هياكل PHF يمكن أن يكون سامًا للأعصاب عن طريق عزل البروتينات الخلوية المهمة ، ولكن يمكن أيضًا أن يكون محميًا للأعصاب عن طريق تجنب تراكم تاو قليل القسيمات السام.

الآثار الفسيولوجية والمرضية لفسفرة تاو

في المستويات الطبيعية من الفسفرة ، يحتوي تاو على 2 & # x020133 مول فوسفات / مول من البروتين وهو بروتين عصاري خلوي قابل للذوبان (Khatoon et al. ، 1992). من إجمالي 85 من المخلفات الفسفورية القابلة للنفخ ، يتم فسفرة ما يقرب من 30 من البقايا في بروتينات تاو العادية (Morishima-Kawashima et al. ، 1995a Hanger et al. ، 2009a). تتجمع معظم مواقع الفسفرة في تاو في المنطقة الغنية بالبرولين ، ويتكرر ارتباط الأنابيب الدقيقة (MTBR) أو المجالات المرافقة لـ MTBR.

يتم تنظيم تعبير تاو والفسفرة من الناحية التنموية. يتم التعبير عن شكل إسوي واحد من تاو في دماغ الإنسان الجنيني بينما يتم التعبير عن ستة أشكال إسوية في دماغ الإنسان البالغ ، مع تاو الجنين المقابل لأقصر شكل إسوي تاو بالغ. تنخفض درجة فسفرة تاو أثناء عملية التطور الجنيني (موال ديوان وآخرون ، 1994) ، والتي قد تكون مرتبطة بزيادة مرونة الخلايا العصبية في عملية النمو المبكرة (بريون وآخرون ، 1993 هانجر وآخرون ، 2009 أ). يحتوي PHF-tau على 3 & # x020134 فوسفات أضعاف فوق تاو البالغ الطبيعي (Khatoon et al. ، 1992 Iqbal et al. ، 2013). في الدماغ غير الناضج ، كما هو الحال في PHFs ، يتم فسفرة tau في عدد كبير من المواقع (Kenessey and Yen ، 1993 Morishima-Kawashima et al. ، 1995b). ومع ذلك ، كما هو الحال في الدماغ البالغ ، فإن الفسفرة في تاو الجنين تكون جزئية فقط. يتم تصنيف فسفرة تاو في PHFs كـ & # x0201Chyperphosphorylation & # x0201D والتي تأخذ في الاعتبار أن المواقع الأخرى غير الفسيولوجية يتم فسفرتها. يشار إلى هذه الحالة أيضًا باسم & # x0201Cabnormal & # x0201D أو & # x0201Cpathological & # x0201D phosphorylation.

تعتمد ديناميكيات MT على نسبة متوازنة بين جزيئات tau ومسارات MT. يؤدي الارتباط الزائد أو الضعيف لجزيئات تاو ، على سبيل المثال ، من خلال عدم تنظيم حالة الفسفرة في تاو ، إلى زعزعة الاستقرار وانهيار شبكات الترجمة الآلية. هذا له تأثير مباشر على وظيفة MT في تكوين بنية الهيكل الخلوي وكمسار لنقل المحاور والعضيات ، ويتم استئنافه في فرضية & # x0201CTau-microtubule & # x0201D (Alonso et al. ، 1994).

أظهرت الدراسات المبكرة بوضوح أن تاو يلعب دورًا مهمًا في إنشاء القطبية العصبية ونمو المحاور العصبية (كاسيريس وكوزيك ، 1990). قد يتم تنظيم تمديد وسحب نيوريت بواسطة MARK و GSK-3 & # x003B2 بوساطة فسفرة تاو (بيرنات وآخرون ، 2002 ساياس وآخرون ، 2002). تم التكهن بأن الفسفرة في tau داخل MTBR ضرورية لنمو النوريت المناسب في حين أن الفسفرة في أشكال SP و TP داخل المجالات المرافقة تؤخر تمايز الخلايا العصبية (Biernat and Mandelkow ، 1999). قد تزيح Tau ، وهي شحنة من kinesin ، البضائع الأخرى المستندة إلى kinesin مما يشير إلى أن تطوير واستقرار المحاور العصبية يعتمدان على توازن عناصر الهيكل الخلوي (Dubey et al. ، 2008).

من المعروف أن الإفراط في التعبير عن تاو يضعف النقل المحوري المعتمد على MT بطريقة تعتمد على الفسفرة (Sato-Harada et al. ، 1996). تفاقم التعبير المشترك عن GSK-3 & # x003B2 النشط بشكل أساسي ، في حين أن تثبيط GSK-3 & # x003B2 أنقذ تراكم الحويصلات والخلل الوظيفي الحركي في ذبابة الفاكهة نموذج (مضر وآخرون ، 2004 كوان وآخرون ، 2010 ب). تم اقتراح فسفرة tau في Y18 بواسطة Fyn kinase لمنع تنشيط سلسلة إشارات GSK-3 & # x003B2 ، وبالتالي مواجهة التأثير المثبط tau & # x00027s على النقل المحوري السريع المتقدم (Kanaan et al. ، 2012). تشير هذه البيانات إلى أن التنشيط المفرط المرضي لـ GSK-3 & # x003B2 يمنع النقل المحوري من خلال فرط فسفرة تاو. في المقابل ، أظهرت دراسات أخرى أن تثبيط فسفرة تاو بواسطة مثبطات GSK-3 & # x003B2 كان مرتبطًا بانخفاض نقل الميتوكوندريا وحركتها وزيادة تجمع الميتوكوندريا في الخلايا (Tatebayashi et al. ، 2004 Llorens-Martin et al. ، 2011). قد يتحكم Tau في الاتجار داخل الخلايا من خلال التأثير على ترددات التعلق وفصل المحركات ، ولا سيما kinesin ، إلى مسارات MT (Trinczek et al. ، 1999 Morfini et al. ، 2007). تم التكهن بأن tau الزائد يعمل ككتلة نقل للحويصلات والعضيات والتي يتم عكسها عن طريق إزالة تاو من خلال فسفرة تاو بوساطة MARK وفصل تاو اللاحق عن MTs (Thies and Mandelkow ، 2007). ومع ذلك ، قد يساهم فصل tau عن MT أيضًا في انسداد النقل المحوري والتنكس العصبي (Iijima-Ando et al. ، 2012). قد تعمل دورات نزع الفسفرة والفسفرة من تاو ، من خلال التفاعل بين كينازات تاو والفوسفاتازات ، كآلية عامة لتنظيم وظيفة تاو & # x00027s للحفاظ على شبكة MT ديناميكية لنمو النوريت والنقل المحوري (Fuster-Matanzo et al.، 2012 Mandelkow and ماندلكو ، 2012). ومن المثير للاهتمام ، أن التوزيع غير المناسب للتاو المفرط التعبير في المقصورة المصابة بالتهاب الجسد قد ينتج عنه عدد أكبر من الـ MTs ومعبأة بكثافة في المحاور والتشعبات. تسببت الطفرات الفوسفومية في حاتمة AT8 في توسيع المساحة بين MTs وقد تساهم بالتالي في النقل المحوري وعيوب حركة الميتوكوندريا (Thies and Mandelkow ، 2007 Shahpasand et al. ، 2012). علاوة على ذلك ، قد يقوم تاو الفسفوري بفصل تاو الطبيعي في نيريتس بعيدًا عن MTs مما يؤدي إلى تعطيل الهيكل الخلوي الدقيق وزوال النقل المحوري (Niewiadomska et al. ، 2005 Cowan et al. ، 2010a Iqbal et al. ، 2013).

تم اقتراح أيضًا خارج الخلية A & # x003B2 ، الذي يؤدي إلى تفاقم فرط الفسفرة في تكوين tau و NFT ، لتعديل وظيفة مستقبلات N-methyl-D-aspartate (NMDAR) والحث على الإثارة (Lauren et al. ، 2009). ومع ذلك ، من بين عدد كبير من الجزيئات المتفاعلة المعروفة A & # x003B2 ، يظل الهدف المحدد A & # x003B2 والانتشار داخل الخلايا للإشارة بعيد المنال. تم اقتراح بروتين البريون كشريك ملزم لـ A & # x003B2 ولكن لا يزال هناك جدل حول أهمية هذا التفاعل (Balducci et al. ، 2010 Kessels et al. ، 2010 Chen et al. ، 2013a). يحث A & # x003B2 على تنشيط Fyn والذي بدوره يزيد من فسفرة وحدة فرعية من NMDARs التي تعتمد على حالة الفسفرة tau وتوطين تاو في مرحلة ما بعد المشبك. بعد الزيادة الأولية ، انخفض عدد NMDARs السطحية مما أدى إلى فقدان العمود الفقري الشجيري والسمية المثيرة (Um et al. ، 2012). يبدو أن تفاعل Fyn و tau ، اللذان يشكلان معقدًا مع NMDAR ، يعدل اللدونة المشبكية ويحسس المشابك لإثارة الجلوتامات في AD (Ittner et al. ، 2010).

كما تم ربط فسفرة تاو بتغيير معدل الدوران وتحلل البروتين. تم تفسير الكشف عن نشاط مناعة اليوبيكويتين في شوائب تاو على أنه فشل في نظام يوبيكويتين البروتيازومي (UPS) في تحلل بروتين تاو الزائد (بانشر وآخرون ، 1989). أدى تثبيط البروتوزوم إلى تراكم أنواع تاو مفرطة الفسفرة بشكل خاص (Shimura et al. ، 2004) وتعطيل النقل العصبي (Agholme et al. ، 2013). أدى تثبيط الالتهام الذاتي في الخلايا العصبية إلى تراكم ثلاثي فوسفوميك تاو على النوع البري تاو مما يشير إلى أن كلا من مسارات البلعمة الذاتية والبروتوزومية ، مسؤولة عن إزالة أنواع تاو الفسفورية (رودريغيز-مارتن وآخرون ، 2013). كشف التحليل البيوكيميائي والمورفولوجي لقشور الزهايمر أن تاو يصبح مفرط الفسفرة وسوء الطي في المحطات قبل المشبكية وما بعد المشبكي ، بالاقتران مع زيادة في الركائز المنتشرة ومكونات البروتيازوم (تاي وآخرون ، 2012).

تم اقتراح العديد من الآليات الأخرى لتضمين فرط الفسفرة تاو في اعتلالات تاووبات. كان موت الخلية مصحوبًا بتعبير عن البروتينات المنظمة لدورة الخلية في الفئران المسنة التي تعبر عن الأشكال الإسوية تاو البشرية على خلفية خروج المغلوب (Andorfer et al. ، 2003). تلعب إعادة الدخول غير المناسب إلى دورة الخلية دورًا في مرض الزهايمر وقد تكون مرتبطة بفرط فسفرة تاو عن طريق تنشيط كينازات دورة الخلية ذات الصلة (Delobel et al. ، 2002 Absalon et al. ، 2013). قد يكون التفاعل غير الطبيعي مع بروتين انشطار الميتوكوندريا Drp1 مسببًا لخلل وظيفي في الميتوكوندريا وتلف الخلايا العصبية (Manczak and Reddy ، 2012). أدى تلف الحمض النووي إلى تنشيط كينازات نقاط التفتيش Chk1 و 2 ، وتفسفر تاو اللاحق في المواقع المرتبطة بمرض الزهايمر ، وتعزيز التنكس العصبي الناجم عن تاو في التعبير عن تاو البشري ذبابة الفاكهة (إيجيما-أندو وآخرون ، 2010). كشف التحليل الكيميائي الهيستوكيميائي المناعي لأدمغة الزهايمر أن تاو مقطوع في D421 ، وأن هذا الانقسام يحدث بعد التغييرات التوافقية التي اكتشفها الجسم المضاد Alz-50 ولكنه يسبق الانقسام في E391 (Guillozet-Bongaarts et al. ، 2005). يحدث تراكم الأنواع المقتطعة من D421 و E391 في وقت مبكر من المرض ويرتبط بالتقدم في مرض الزهايمر (Basurto-Islas et al. ، 2008). في الفئران المعدلة وراثيا ، تبين أن اقتطاع تاو يقود إلى علم أمراض ما قبل التشابك (McMillan et al. ، 2011). في الخلايا ، عزز فرط فسفرة تاو في العديد من المخلفات وانقسام تاو في D421 ، موقع الانقسام التفضيلي لكاسباس 3 ، من إفراز تاو. تم اقتراح هذا كآليات محتملة لانتشار علم أمراض تاو في الدماغ وتراكم تاو في CSF (Plouffe et al. ، 2012).

كينازات تشارك في الفسفرة تاو

على غرار نمط فرط فسفرة تاو ، ظهرت فكرة نمط مميز خاص بالتوقيع لتنشيط تاو كيناز (دوكا وآخرون ، 2013). تم إجراء عدة محاولات لتحديد الكينازات المسؤولة ومواقع الفسفرة المقابلة في تاو (الجدول 2). ومع ذلك ، فإن معظم كينازات الفوسفوريلات العديد من بقايا تاو ، ومعظم مواقع الفسفرة تاو أهداف لأكثر من كيناز واحد (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، فإن وجود فتيلة ، مما يعني أن الفسفرة في موقع ما تسهل الفسفرة في موقع آخر ، وأحداث التغذية الراجعة لتنظيم المستوى العام لفسفرة تاو ، يعيق تخصيص موقع فسفرة معين لوظيفة معينة (خلل) تاو (برتراند وآخرون ، 2010 كيريس وآخرون ، 2011).

الشكل 3. تمثيل تخطيطي يوضح المخلفات المختلفة في أطول شكل إسوي لـ tau والتي يمكن فسفرتها. يمكن فسفرة أشكال SP / TP (ممثلة باللون الأزرق) ، وزخارف KXGS (ممثلة باللون الأصفر) ، ومواقع أخرى (ممثلة باللون الرمادي) بواسطة كينازات موجهة بالبرولين (ممثلة باللون الأزرق) وكينازات Ser / Thr الموجهة غير البرولين (ممثلة بالأخضر). تشتمل حلقات الجسم المضاد AT8 و AT100 و AT180 و PHF-1 على بقايا سيرين / ثريونين ثنائية وثلاثية (يشار إليها بالأقواس). تظهر بعض الطفرات المرتبطة بـ FTDP-17 باللون الأحمر. يولد التضفير البديل لـ N1 و N2 و R2 الأشكال الستة المختلفة لـ tau. N1 ، N2 ، N-terminal إدراج 1 و 2 R1-R4 ، يتكرر ربط MT 1 & # x020134 GSK-3 & # x003B2 ، Glycogen synthase kinase 3 & # x003B2 Cdk5 ، كيناز المعتمد على Cyclin 5 CK ، الكازين كيناز MARK ، تنظيم تقارب الأنابيب الدقيقة كيناز LRRK2 ، كيناز متكرر غني بالليوسين 2 DAPK ، بروتين كيناز مرتبط بالموت Dyrk1A ، بروتين كيناز مزدوج النوعية.

تم عرض العديد من كينازات ، بما في ذلك أكثر من 20 سيرين / ثريونين كيناز ، لتفسفر تاو في المختبر لكن صلتها بمرض الزهايمر لا تزال قيد التحقيق (Hanger et al.، 2009b Cavallini et al.، 2013).

ارتبط كيناز GSK-3 & # x003B2 الموجه بالبرولين بشكل خاص بتكوين PHFs و NFTs واقترح كوسيط رئيسي في التسبب في مرض الزهايمر (Hooper et al.، 2008 Terwel et al.، 2008 Ma، 2014 Medina and Avila، 2014). تستهدف GSK-3 & # x003B2 tau في مواقع SP / TP ، بما في ذلك الحلقات PHF-1 و AT8 و AT180 و AT100 و S404 و S413 (Pei et al.، 1999 Medina and Avila، 2014). ارتبطت التعديلات في مستويات GSK-3 & # x003B2 بالتغيرات في فسفرة تاو في العديد من نماذج الخلايا والحيوانات (هيرنانديز وآخرون ، 2013). أدت محفزات الإجهاد مثل سموم الميتوكوندريا أو الإجهاد التأكسدي لمحاكاة الظروف في الاضطرابات التنكسية العصبية إلى زيادة فسفرة تاو بوساطة GSK-3 & # x003B2 ، وانخفاض نشاط التمثيل الغذائي الخلوي وزعزعة استقرار MT (Hongo et al. ، 2012 Selvatici et al. ، 2013) . تضع دراسات أخرى GSK-3 & # x003B2 كلاعب بارز في التسبب في مرض الزهايمر بالإضافة إلى دوره باعتباره tau phosphorylating kinase. طورت الفئران Tau-P301Lx GSK-3 & # x003B2 اعتلالًا شديدًا للدماغ الأمامي مع تشابكات في غالبية الخلايا العصبية ولكن في حالة عدم وجود فرط فسفرة تاو (Muyllaert et al. ، 2006). في ذبابة الفاكهة النموذج ، التعبير المشترك لـ GSK-3 & # x003B2 homolog و tau البشري أدى إلى زيادة السمية على الأرجح بسبب حقيقة أن GSK-3 & # x003B2 هو بروتين مؤيد لموت الخلايا المبرمج أكثر من زيادة فسفرة تاو (جاكسون وآخرون ، 2002).

يلعب سيرين / ثريونين كيناز Cdk5 أدوارًا مهمة في تطور الخلايا العصبية والهجرة ، ونمو النوريت ، والانتقال المشبكي ، وهو متورط في التسبب في مرض الزهايمر (Cheung and Ip ، 2012 Shukla et al. ، 2012). ارتبط النشاط المناعي لـ Cdk5 في العديد من مناطق الدماغ في AD بمراحل ما قبل التشابك ومراحل NFT المبكرة ، وتم تحديده مع تاو إيجابي AT8 في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية (Pei et al. ، 1998 Augustinack et al. ، 2002). تم العثور على نشاط Cdk5 أعلى في AD من حالات التحكم ربما بسبب تحويل المنشط Cdk5 p35 إلى الشكل النشط التأسيسي p25 (Lee et al. ، 1999 Patrick et al. ، 1999 Shukla et al. ، 2012).

أظهرت الفئران التي أفرطت في التعبير عن p25 / Cdk5 نشاطًا Cdk5 محسنًا ، وفرط فسفرة تاو ، واضطراب الهيكل الخلوي (Ahlijanian et al. ، 2000). ارتبط تنشيط Cdk5 جنبًا إلى جنب مع الإفراط في التعبير عن طافرة تاو بفرط فسفرة تاو وتشكيل التشابك (نوبل وآخرون ، 2003). أظهرت الفئران APPswe نشاطًا متزايدًا لـ Cdk5 بسبب الزيادات في مستويات p25 ، وفسفرة كبيرة لـ tau في AT8 و PHF-1 حواتم تربط علم الأمراض A & # x003B2 بفرط فسفرة تاو عن طريق زيادة نشاط Cdk5 (Otth et al. ، 2002). علاوة على ذلك ، تم اقتراح ربط Cdk5 بـ GSK-3 & # x003B2. أظهرت الفئران التي تعبر عن p25 البشري مستويات مرتفعة من A & # x003B2 ولكنها انخفضت مستويات الفوسفو-تاو وخفضت نشاط GSK-3 & # x003B2. خفضت إدارة مثبطات Cdk5 إنتاج A & # x003B2 لكنها لم تغير فسفرة tau مما يشير إلى أن Cdk5 ينظم في الغالب معالجة APP ، بينما يلعب GSK-3 & # x003B2 دورًا مهيمنًا في فسفرة تاو (Wen et al. ، 2008 Engmann and Giese ، 2009 ). يشير الحديث المتبادل بين مسارات Cdk5 والبروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) إلى وجود علاقة مع موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية وإشارات البقاء على قيد الحياة (Sharma et al. ، 2002 Zheng et al. ، 2007). تم اقتراح عدم تنظيم مسارات إشارات MAPK ، التي تشتمل على شلالات الإشارات الثلاثة التي تنظم إشارة خارج الخلية كيناز (ERK) ، و p38 ، و c-Jun N-terminal kinase (JNK) ، لتكون متورطة في AD وغيرها من الاضطرابات العصبية التنكسية (Kim and Choi ، 2010).في سياق AD ، يتم تنشيط ERK و JNK في جميع المراحل ، و p38 في الحالات الخفيفة إلى الشديدة (مراحل Braak من الثالث إلى السادس) (Pei et al. ، 2001 Zhu et al. ، 2001). ارتبط نشاط المناعة p38 و JNK بالخلايا العصبية التي تحتوي على لويحات عصبية ، وخيوط عصبية ، و NFTs ، وهي هياكل تم التعرف عليها أيضًا بواسطة الأجسام المضادة التي أثيرت ضد PHF-tau الفسفوري (Hensley et al. ، 1999 Atzori et al. ، 2001).

كينازات MARK1-4 عبارة عن كينازات موجهة غير برولين تشارك في إنشاء قطبية الخلايا العصبية وتنظيم نمو النوريت (Biernat et al.، 2002 Matenia and Mandelkow، 2009 Reiner and Sapir، 2014). تمت تسمية العلامات بعد قدرتها على تنظيم ألفة تاو إلى MTs من خلال الفسفرة (دريوز وآخرون ، 1997). الأهم من ذلك ، MARKs phosphorylate tau ضمن أشكال KXGS ، لا سيما في S262 ، والتي تم اكتشاف الفسفرة في وقت مبكر من مسار ميلادي. تم تحسين التعبير عن MARK2 و MARK4 ، بالإضافة إلى تفاعلات هذه الكينازات مع tau ، بشكل كبير في أدمغة AD ، المرتبطة بمراحل Braak من المرض ، وكانت مرتبطة بـ NFTs (Chin et al. ، 2000 Gu et al. ، 2013 أ).

في المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة، الإفراط في التعبير عن ذبابة الفاكهة ارتبط homolog Par-1 بزيادة الفسفرة وزيادة سمية تاو البشري. فقدان وظيفة Par-1 وطفرة في تاو في مواقع الفسفرة الموجهة Par-1 (S262 ، S356) التي تم إنقاذها من السمية التي يسببها تاو. ومن المثير للاهتمام ، أن الفسفرة Par-1 لـ tau كانت شرطًا أساسيًا للفسفرة النهائية من خلال GSK-3 & # x003B2 و Cdk5 ، وتوليد حواتم الفسفرة المرتبطة بالأمراض (Nishimura et al. ، 2004). تم إنقاذ تنشيط MARK2 من الاضمحلال المشبكي الناجم عن الإفراط في التعبير والتوزيع غير الصحيح لـ tau في المقصورة الجسدية العصبية (Mandelkow et al.، 2004 Thies and Mandelkow، 2007). ومع ذلك ، أدى الإفراط في التعبير عن MARK4 إلى فرط فسفرة تاو وفقدان العمود الفقري ، والذي ظهر أيضًا بعد العلاج A & # x003B2. لذلك ، قد يكون لـ MARKs وظائف تنظيمية في مورفولوجيا العمود الفقري والانتقال المشبكي ، ولكنها قد تعمل أيضًا كوسطاء مهمين في السمية التي يسببها A & # x003B2 على نقاط الاشتباك العصبي والعمود الفقري الشجيري (Zempel et al. ، 2010 Hayashi et al. ، 2011 Yu et al. ، 2012). علاوة على ذلك ، تم اقتراح فسفرة tau بواسطة MARK لتثبيط تجميع tau & # x00027s في PHFs (Schneider et al. ، 1999) ، بما يتناقض مع الفرضية القائلة بأن مجموعة tau مفرطة الفسفرة ، MT-ungound تتجمع في PHFs. الفسفرة في tau في مواقع SP / TP لها تأثير منخفض على ربط tau-MT ويتم ملاحظتها في AD ، مما يؤدي إلى فصل فصل tau عن MTs عن إمكانية التجميع في PHFs. تم عرض GSK-3 & # x003B2 على فسفرة MARK2 في موقعين مختلفين ، التفعيل T208 والمثبط S212 ، وبالتالي تعديل فسفرة tau ، خاصة في S262 (Kosuga et al. ، 2005 Timm et al. ، 2008). تم تنظيم نشاط MARK1 / 2 أيضًا من خلال مجال وفاة DAPK. قام DAPK بتنشيط MARK وتعزيز فسفرة tau ولكن يبدو أيضًا أنه يعمل عبر مسارات MARK المستقلة على T231 و S262 و S396 من تاو (Wang et al. ، 2010 Duan et al. ، 2013). علاوة على ذلك ، تسبب DAPK في حدوث تقشر في العين وفقدان الخلايا العصبية المستقبلة للضوء في a ذبابة الفاكهة النموذج ، جزئيًا من خلال تنشيط ذبابة الفاكهة تقويم العظام Par-1 (Wu et al. ، 2011b). تم وصف PKC كمنظم سلبي لـ MARK2 ، حيث يلعب دورًا مهمًا في قطبية الخلايا العصبية (Chen et al. ، 2006).

CK1 و CK2 عبارة عن كينازات بروتين سيرين / ثريونين انتقائية. يتم تقليل نشاط المناعة CK2 بشكل عام في الدماغ في حالات الزهايمر على الرغم من أن NFTs قوية جدًا مع الأجسام المضادة لـ CK2 (Iimoto et al. ، 1990). يتم تنظيم CK-1 & # x003B4 في دماغ الزهايمر ، بما يتوافق مع درجة علم الأمراض الإقليمي. يتحد CK-1 & # x003B4 مع NFTs ، وخيوط عصبية ضارة (Yasojima et al. ، 2000). في الخلايا ، أدى تثبيط CK1 & # x003B4 إلى تقليل الفسفرة في تاو في S396 / S404 بأكثر من 70٪. أدى التعبير الخارجي عن CK1 & # x003B4 إلى زيادة فسفرة tau في S202 / T205 و S396 / S404 وتقليل ارتباط tau-MT (Lee and Leugers ، 2012).

يتم استهداف العديد من المواقع في PHF-tau بواسطة CK1 بالتنسيق مع كينازات أخرى مثل GSK-3 & # x003B2 وبروتين كيناز A (PKA). علاوة على ذلك ، تم فسفرة ثلاثة مواقع ، S113 و S238 و S433 ، فقط بفعل CK1 & # x003B4 مما يشير إلى دور ذي صلة لهذا الكيناز في علم أمراض تاو (Hanger et al. ، 2007). تم الإبلاغ عن مادة اصطناعية A & # x003B2 لتحفيز أنشطة CK1 و CK2 والتوسط في فسفرة الكازين الركيزة في المختبر (شوهان وآخرون ، 1993). تمت زيادة إنتاج A & # x003B2 في الخلايا ذات التعبير الخارجي عن CK1 النشط بشكل أساسي وتم تقليله عن طريق تثبيط محدد لـ CK1 (Flajolet et al. ، 2007).

تم تنظيم Dyrk1A في AD ومتلازمة Down & # x00027s ومرض Pick & # x00027s. لوحظ نشاط مناعي Dyrk1A في السيتوبلازم ونواة الخلايا العصبية المتناثرة ، واكتشف في كسور PHF غير القابلة للذوبان في ساركوسيل. أدى الإفراط في التعبير عن Dyrk1A في الفئران المعدلة وراثيًا إلى زيادة مستويات تاو في الدماغ والتراكم في NFTs (Wegiel et al. ، 2008). لا تزال الفسفرة المباشرة لـ tau في T212 بواسطة Dyrk1A تفتقر إلى الأدلة في الجسم الحي.

اكتسب LRRK2 ، وهو كيناز مفترض ، اهتمامًا في السنوات الأخيرة بسبب ارتباطه الوراثي بكل من PD الموروث والمتقطع ، والتداخل المحتمل مع AD (Zhao et al. ، 2011 Ujiie et al. ، 2012). تم إعطاء التلميحات الأولى لتورط LRRK2 في علم أمراض تاو في الفئران المعدلة وراثيًا التي تعبر عن LRRK2 المتحولة. أظهرت هذه الحيوانات زيادة في فسفرة تاو في T149 و T153 و AT8 و CP13 و 12E8 و PHF-1 ، وتضليل تاو في أجسام الخلايا والخلايا العصبية وتجميع تاو (Li et al. ، 2009 ، 2010 Melrose et al. ، 2010 بيلي وآخرون ، 2013). في المقابل ، انخفض الفسفرة في tau في حاتمة AT8 في الفئران LRRK2 الضربة القاضية (Gillardon ، 2009). تشير العديد من الدراسات إلى أن LRRK2 فسفوريلات وتنشط كينازات أخرى ومسارات نقل الإشارة ، مما يساهم في تعزيز فسفرة تاو ، والتوزيع الخاطئ ، والتنكس الشجيري (Gloeckner et al. ، 2009 Lin et al. ، 2010 Chen et al. ، 2012).

قد تكون العديد من الكينازات الأخرى متورطة في أمراض الزهايمر ، المتوقعة من نشاطها الشاذ في الدماغ البشري (مارتن وآخرون ، 2013). بشكل عام ، من المحتمل أن يكون خلل تنظيم الكينازات مسؤولاً عن فرط فسفرة تاو ، وربط تاو-إم تي غير الطبيعي ، وتحديد موقع تاو الخاطئ ، وتجميع تاو في PHFs. ومع ذلك ، لا يزال من غير المعروف ، أي مواقع الفسفرة في تاو هي الأكثر أهمية ، وما هي الكينازات التي تلعب دورًا رئيسيًا ، وكيف ترتبط هذه العمليات ميكانيكيًا بالسمية في مرض الزهايمر وغيره من الاضطرابات العصبية التنكسية.


محتويات

لاحظ العلماء النشاط الحراري في الأنسجة الدهنية البنية ، مما أدى في النهاية إلى اكتشاف UCP1 ، المعروف في البداية باسم "Uncoupling Protein". [3] أظهر النسيج البني مستويات مرتفعة من تنفس الميتوكوندريا وتنفسًا آخر غير مقترن بتخليق ATP ، والذي يرمز إلى النشاط الحراري القوي. [3] كان UCP1 هو البروتين المكتشف المسؤول عن تنشيط مسار البروتون الذي لم يتم اقترانه بفسفرة ADP (يتم ذلك عادةً من خلال ATP Synthase). [3]

هناك خمسة متماثلات UCP معروفة في الثدييات. في حين أن كل من هذه تؤدي وظائف فريدة ، يتم تنفيذ وظائف معينة من قبل العديد من المتجانسين. المتجانسات هي كما يلي:

  • UCP1 ، المعروف أيضًا باسم thermogenin أو SLC25A7 ، المعروف أيضًا باسم SLC25A8 ، المعروف أيضًا باسم SLC25A9
  • UCP4 ، المعروف أيضًا باسم SLC25A27
  • UCP5 ، المعروف أيضًا باسم SLC25A14

الحفاظ على درجة حرارة الجسم

تم اكتشاف أول بروتين غير مقارن تم اكتشافه ، UCP1 ، في الأنسجة الدهنية البنية في السباتات والقوارض الصغيرة ، والتي توفر حرارة غير مرتجعة لهذه الحيوانات. [3] هذه الأنسجة الدهنية البنية ضرورية للحفاظ على درجة حرارة الجسم من القوارض الصغيرة ، وتظهر الدراسات التي أجريت على الفئران (UCP1)-knockout الفئران أن هذه الأنسجة لا تعمل بشكل صحيح دون عمل بروتينات منفصلة. [3] في الواقع ، كشفت هذه الدراسات أن التأقلم مع البرودة غير ممكن لهذه الفئران التي خرجت من قوتها ، مما يشير إلى أن UCP1 هو المحرك الأساسي لإنتاج الحرارة في هذه الأنسجة الدهنية البنية. [7] [8]

في أماكن أخرى من الجسم ، من المعروف أن فصل أنشطة البروتين يؤثر على درجة الحرارة في البيئات الدقيقة. [9] [10] يُعتقد أن هذا يؤثر على نشاط البروتينات الأخرى في هذه المناطق ، على الرغم من أن العمل لا يزال مطلوبًا لتحديد العواقب الحقيقية للتدرجات الحرارية الناتجة عن فك الاقتران داخل الخلايا. [9]

تحرير الدور في تركيزات ATP

يختلف تأثير UCP2 و UCP3 على تركيزات ATP باختلاف نوع الخلية. [9] على سبيل المثال ، تعاني خلايا بيتا البنكرياس من انخفاض في تركيز ATP مع زيادة نشاط UCP2. [9] وهذا مرتبط بتنكس الخلايا ، وانخفاض إفراز الأنسولين ، ومرض السكري من النوع الثاني. [9] [11] على العكس من ذلك ، تحفز UCP2 في خلايا الحصين و UCP3 في خلايا العضلات إنتاج الميتوكوندريا. [9] [12] يزيد العدد الأكبر من الميتوكوندريا من التركيز المشترك لـ ADP و ATP ، مما يؤدي في الواقع إلى زيادة صافية في تركيز ATP عندما تقترن بروتينات الفصل هذه (أي يتم منع آلية السماح بتسريب البروتون). [9] [12]

الحفاظ على تركيز أنواع الأكسجين التفاعلية

القائمة الكاملة لوظائف UCP2 و UCP3 غير معروفة. [13] ومع ذلك ، تشير الدراسات إلى أن هذه البروتينات متورطة في حلقة ردود فعل سلبية تحد من تركيز أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). [14] الإجماع العلمي الحالي ينص على أن UCP2 و UCP3 يقومان بنقل البروتون فقط عند وجود أنواع التنشيط. [15] من بين هذه المنشطات الأحماض الدهنية وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وبعض منتجات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تكون أيضًا تفاعلية. [14] [15] لذلك ، تؤدي المستويات الأعلى من أنواع الأكسجين التفاعلية بشكل مباشر وغير مباشر إلى زيادة نشاط UCP2 و UCP3. [14] وهذا بدوره يزيد من تسرب البروتون من الميتوكوندريا ، مما يقلل من القوة المحركة للبروتون عبر أغشية الميتوكوندريا ، وينشط سلسلة نقل الإلكترون. [13] [14] [15] يؤدي الحد من القوة المحركة للبروتون من خلال هذه العملية إلى حلقة ردود فعل سلبية تحد من إنتاج ROS. [14] على وجه الخصوص ، يقلل UCP2 من إمكانات الميتوكوندريا عبر الغشاء ، وبالتالي يقلل من إنتاج ROS. وبالتالي ، قد تزيد الخلايا السرطانية من إنتاج UCP2 في الميتوكوندريا. [16] هذه النظرية مدعومة بدراسات مستقلة تظهر زيادة إنتاج ROS في كل من الفئران التي خرجت من فئة UCP2 و UCP3. [15]

هذه العملية مهمة لصحة الإنسان ، حيث يعتقد أن التركيزات العالية من أنواع الأكسجين التفاعلية تشارك في تطور الأمراض التنكسية. [15]

وظائف في الخلايا العصبية تحرير

من خلال الكشف عن مرنا المرتبط ، تبين أن UCP2 و UCP4 و UCP5 يقيمون في الخلايا العصبية في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي البشري. [17] تلعب هذه البروتينات أدوارًا رئيسية في وظيفة الخلايا العصبية. [9] في حين أن العديد من نتائج الدراسة لا تزال مثيرة للجدل ، إلا أن العديد من النتائج مقبولة على نطاق واسع. [9]

على سبيل المثال ، تغير UCPs تركيزات الكالسيوم الحرة في الخلايا العصبية. [9] تعد الميتوكوندريا موقعًا رئيسيًا لتخزين الكالسيوم في الخلايا العصبية ، وتزداد سعة التخزين مع زيادة الإمكانات عبر أغشية الميتوكوندريا. [9] [18] لذلك ، عندما تقلل بروتينات الفصل من الإمكانات عبر هذه الأغشية ، يتم إطلاق أيونات الكالسيوم إلى البيئة المحيطة في الخلايا العصبية. [9] نظرًا للتركيزات العالية للميتوكوندريا بالقرب من المحاور المحورية ، فإن هذا يعني أن UCPs تلعب دورًا في تنظيم تركيزات الكالسيوم في هذه المنطقة. [9] بالنظر إلى أن أيونات الكالسيوم تلعب دورًا كبيرًا في النقل العصبي ، يتنبأ العلماء بأن هذه UCPs تؤثر بشكل مباشر على النقل العصبي. [9]

كما نوقش أعلاه ، تعاني الخلايا العصبية في قرن آمون من زيادة تركيزات ATP في وجود هذه البروتينات المنفصلة. [9] [12] هذا يقود العلماء إلى افتراض أن UCPs تعمل على تحسين اللدونة المتشابكة والانتقال. [9]


النتائج

يتطلب نمو النوريت في خلايا N2a الفسفرة في نماذج KXGS في مجال التكرار في تاو

كان أحد أهداف دراساتنا هو تحديد دور بروتين تاو ، وفسفرته ، وحالات إنزيمات البروتين في تكوين العصبونات. لتحقيق هذا يحتاج المرء إلى نظام تجريبي يسمح لكل من الملاحظات البيولوجية والكيميائية الحيوية للخلية. ركزنا على خط خلية الورم الأرومي العصبي للماوس N2a لأنه يمكن تمييزه بسهولة بحمض الريتينويك بعد الحرمان من المصل لتشكيل عمليات خلايا تشبه نيريت (الشكل 2). يتطلب تمايز الخلايا العصبية تاو داخليًا (دروبين وكيرشنر 1986 كاسيريس وكوسيك ، 1990 إسمايلي آزاد وآخرون.، 1994) في خلايا N2a ، يوجد تاو فقط بتركيزات منخفضة ، أقل من قابلية الكشف عن طريق التألق المناعي. قمنا بنقل الشكل الإسوي لجنين الإنسان tau htau23 (352 من البقايا) بشكل عابر إلى خلايا N2a من النوع البري التي تحفزهم على تطوير نيوريتيس طويلة بعد تحفيز التمايز. في مثال الشكل 2 أ ، 60٪ من الخلايا المنقولة لديها عمليات أطول من ضعف قطر جسم الخلية. كعنصر تحكم ، من بين الخلايا التي لا تعبر عن htau 23 خارجيًا ، يطور 20 ٪ فقط عمليات ممتدة (الشكل 2 ، أ ، ب ، و).

التين. 2. ثمرة النوريت بواسطة خلايا N2a والاعتماد على فسفرة تاو. تم تمييز خلايا N2a عن طريق انسحاب المصل وحمض الريتينويك ثم تم نقلها بشكل عابر بطفرات تاو أو تاو ، وسجلت لتطور نوبات طويلة أطول من قطري جسم الخلية (& gt40 ميكرومتر). (أ و ج) تلطيخ تاو (الجسم المضاد K9JA). (ب و د) تلطيخ توبولين (DM1A). (أ و ب) الخلايا المنقولة بشكل عابر بـ htau23 (كفاءة 50٪). من بين الخلايا التي لا تعبر عن تاو خارجي ، 20 ٪ فقط يطورون نيوريتيس ممتدة (التحكم في الشكل 2 هـ). في المقابل ، من بين الخلايا التي تعبر عن htau23 خارجيًا ، يرتفع الكسر مع العصبونات الممتدة إلى 60 ٪ (الشكل 2 ، أ و ب ، الأسهم ، و). (ج و د) الخلايا المنقولة بواسطة متحولة KXGA لـ htau23: من بين الخلايا التي تعبر عن متحولة تاو الخارجية (ثلاث خلايا مظللة بالسهام في 2 و c و d) فقط عدد قليل من الخلايا تتطور بشكل أطول من قطري جسم الخلية (قارن الخلايا الأخرى غير المنقولة في د). يوضح هذا أن الفسفرة في أشكال KXGS مهمة لنمو النوريت. (هـ) خلايا N2a للتحكم المتمايزة (لا توجد تعداء مع تاو). (و) رسم بياني لتشكيل النوريت بتركيبات تاو مختلفة: 20٪ فقط من خلايا التحكم تظهر نوبات موسعة ، لكن 60٪ من الخلايا المصابة بـ htau. الخلايا المنقولة بواسطة متحولة KXGA من htau23 قابلة للمقارنة مع عناصر التحكم (20 ٪ ، لا يوجد فسفرة بواسطة MARK2 ممكن). الخلايا المنقولة عن طريق طفرة AP قابلة للمقارنة مع تعداء بواسطة htau23 (60 ٪ ، لا يوجد فسفرة بواسطة كينازات موجهة بالبرولين). تُظهر البيانات أن تعداء العدوى مع htau23 و طفرة AP فعالة بالمثل في تعزيز نمو نوريت ، في حين أن تعداء العدوى مع متحولة KXGA ليس لها أي تأثير. تظهر أشرطة الخطأ SE.

يحتوي Tau على العديد من مخلفات Ser أو Thr التي يمكن فسفرتها بواسطة عدة كينازات. لاستكشاف ما إذا كان نمو النوريت يعتمد على فسفرة تاو ، قمنا بإنشاء العديد من بنيات تاو التي تم فيها تحور بعض بقايا Ser أو Thr إلى Ala ، مما يجعلها غير قابلة للوصول إلى الفسفرة. من بين مواقع الفسفرة ، يمكن للمرء أن يميز فئات مختلفة: 1) يمكن فسفرة الأشكال S-P أو T-P (14 في الشكل الإسوي htau23 ، معظمها في المجالات المحيطة بالتكرارات الشكل 1) بواسطة كينازات موجهة بالبرولين مثل GSK-3β و cdk5. يُعتقد أنها تلعب دورًا في التنكس العصبي (Imahori and Uchida ، 1997 Mandelkow and Mandelkow ، 1998) ، فهي تحفز حواتم العديد من الأجسام المضادة المميزة لمرض ألزهايمر تاو (على سبيل المثال ، AT-8 ، AT-100 ، AT-180 ، و PHF -1) ، ولكن ليس لها سوى تأثير متواضع على تفاعلات الأنابيب الدقيقة تاو (Biernat وآخرون.، 1993). 2) أشكال KXGS (واحد لكل تكرار ، ثلاثة في htau23 ، أربعة في htau40 الشكل 1) هي أهداف للكينازات غير الموجهة بالبرولين ، بشكل أساسي MARK (وأقل كفاءة PKA Biernat وآخرون.، 1993 درويس وآخرون.، 1997) ، والذي له تأثير واضح على فصل tau من الأنابيب الدقيقة (خاصة Ser262 في التكرار الأول) وجعلها ديناميكية في المختبر وفي الجسم الحي (Ebneth وآخرون.، 1999). لذلك قمنا بعمل تركيبات معدلة من htau23 ، واحدة بها جميع أشكال S-P أو T-P الـ 14 التي تم تحورها إلى A-P (AP-tau) ، والأخرى مع نماذج KXGS التي تحورت إلى KXGA (KXGA-tau غير الفسفوري) (الشكل 1). عندما تم نقل AP-tau إلى خلايا N2a ، كان التأثير مشابهًا لتأثير تاو من النوع البري ، أي تحريض قوي للنيوريت ، مع حوالي نصف الخلايا المنقولة بالعدوى تعرض عمليات ممتدة (الشكل 2 و). نظرًا لأن الكينازات الموجهة بالبرولين نشطة في الخلايا (انظر أدناه) ، فإن هذه النتيجة تعني أن الفسفرة في أشكال SP أو TP أقل أهمية لنمو النوريت.

على النقيض من ذلك ، عند تكرار التجربة مع KXGA-tau ، كان نمو العصبونات الممتدة بعد حافز التمايز قد تم إلغاؤه تقريبًا. كعنصر تحكم ، كان التأثير مقصورًا على الخلايا التي تعبر فعليًا عن متحولة تاو (الشكل 2 ج ، الخلايا ذات الأسهم) ، بينما يحصل الآخرون على عمليات طبيعية بعد التمايز (الشكل 2 د ، خلايا بدون أسهم). وبالتالي ، فإن طفرات KXGA في التكرارات تلغي بشكل أساسي قدرة تاو على تحفيز العصبونات (الشكل 2f). نلاحظ أن متحولة KXGA لها نفس القدرة على ربط الأنابيب الدقيقة وبلمرةها مثل tau من النوع البري غير الفسفوري ، على عكس tau فسفرته في أشكال KXGS (Biernat وآخرون.، 1993 بياناتنا غير المنشورة). تشير هذه النتائج إلى أن خلايا N2a تحتوي على كيناز (مركبات) نشطة تفسد أشكال KXGS وأن الفسفرة في هذه الأشكال مهمة لنمو النوريت.

يتم تعزيز نمو نيوريت من خلال نشاط MARK2

بالنظر إلى أن أشكال KXGS لـ tau مهمة لنمو النوريت ، كان السؤال التالي هو تحديد الكيناز (الكيناز) المسؤول. لقد أظهرنا سابقًا أن الكيناز الذي يفسفر أشكال KXGS في تاو والخرائط ذات الصلة بكفاءة أكبر هو MARK (Drewesوآخرون.، 1995 إلينبرجر وآخرون.، 1996). لذلك اقتربنا من تحديد الكيناز عن طريق السؤال عن كيفية تأثير MARK على نمو النوريت وفسفرة tau في خلايا N2a. من المثير للدهشة أن تعداء MARK2 العابر إلى خلايا N2a تسبب في تمايز دون محفزات أخرى (مثل انسحاب المصل وحمض الريتينويك الشكل 3 أ ، ب ، هـ) ، على الرغم من أن معدل تعداء الخلايا كان منخفضًا (1-2٪). في المقابل ، لم تكن غالبية خلايا N2a التي تعبر عن الطفرة السلبية السائدة لـ MARK2 (الشكل 3 و c و d و e) قادرة على تكوين نوبات موسعة ، حتى بعد منبه التمايز. كما هو موضح سابقًا (Drewes وآخرون.، 1997) ، تم جعل هذا المسخ غير نشط في المختبر وفي الخلايا عن طريق استبدال بقايا الفسفور القابلة للنفخ في الحلقة التنظيمية بواسطة الألانين (T208A و S212A). تحتوي خلايا N2a من النوع البري على تاو داخلي المنشأ فقط عند مستوى منخفض يبلغ 24 نانوغرام / 10 7 خلية (باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم الذي طوره أكمان وآخرون.، 2000).لذلك أنشأنا خلايا N2a تعبر بثبات عن htau40 ، وهو أكبر شكل إسوي تاو في الجهاز العصبي المركزي ، بمستوى أعلى بمقدار 40 ضعفًا (∼1 ميكروغرام / 10 7 خلايا) ، لتحليل حالة الفسفرة في تاو كيميائياً. تم نقل هذه الخلايا بشكل عابر باستخدام dnMARK2. لا يمكن للخلايا التي تعبر عن المتحولة غير النشط لـ MARK2 أن تشكل نيوريت (الشكل 4 ، أ- د ، أسهم) ، في حين أن الخلايا التي لا تعبر عن dnMARK2 كانت قادرة على التمييز (الشكل 4 ، أ ، د ، العلامات النجمية). هذا يجادل بأن MARK2 أو شكل إسوي وثيق الصلة قد يكون مهمًا لنمو النوريت وللفسفرة لأشكال KXGS في تاو. للتحقق من أن MARK2 يعمل عبر فسفرة تاو ، تم نقل خلايا N2a باستخدام GFP-MARK2 و KGXA-htau (الشكل 4 ، هـ - ح). في الحالات التي تعبر فيها الخلايا عن متحولة KXGA لـ tau ، أو كلاهما MARK2 و KXGA mutant ، يتم تقليل تكوين العصبونات الممتدة بشدة. بعبارة أخرى ، يمكن القضاء على التأثيرات المعززة للنيريت لـ tau إما عن طريق تحور الشكل المستهدف KXGS على tau (الأشكال 2c و 4 ، e-g) ، أو عن طريق تعطيل كيناز MARK2 (الشكل 3 ، c – e ).

الشكل 3. ترنسفكأيشن لخلايا N2a مع MARK2 يعزز تكوين النوريت ، ويمنعه MARK2 السالب السائد. تم نقل خلايا N2a بشكل عابر باستخدام MARK2 (أ و ب) أو متحولة سلبية سائدة لـ MARK2 (ج و د). (أ و ج) تلطيخ لـ MARK2 (الجسم المضاد 12CA5). (ب و د) تلطيخ التوبولين (الجسم المضاد DM1A). (أ و ب) على الرغم من أن الخلايا التي تحتوي على المستويات المنخفضة فقط من تاو الذاتية لا تظهر أي نيريتس في مصل الدم قبل التمايز (انظر الخلايا المستديرة في ب ، العلامات النجمية) وتتطلب شروط تمايز لتطوير العمليات (انسحاب المصل ، حمض الريتينويك ، إلخ) ، يتغلب ترنسفكأيشن مع MARK2 على هذا الحاجز ويسمح لـ 60٪ من الخلايا المنقولة MARK2 حتى بدون انسحاب المصل وحمض الريتينويك للتمييز وتوسيع الخلايا العصبية (انظر الخلية في المركز في a و b ، السهم وانظر الرسم البياني e). (ج و د) عندما يتم نقل خلايا N2a باستخدام dnMARK2 ، فإن جزءًا صغيرًا فقط من الخلايا التي تعبر عن dnMARK2 (6 ٪) تشكل نوبات موسعة بعد التمايز (الشكل 3 هـ).

التين. 4. تثبيط نمو النورت بواسطة MARK2 الخامل (dnMARK2) أو تاو غير الفسفوري (KXGA). يمكن تمييز خلايا N2a المنقولة بشكل ثابت باستخدام htau40 عن طريق انسحاب المصل وحمض الريتينويك (انظر ب و ج ، العلامات النجمية). ومع ذلك ، يمنع dnMARK2 تكوين نيريت (انظر أ ، الأسهم). (د) رسم بياني يوضح أن dnMARK2 يقمع العصبونات (حوالي 90٪ من الخلايا المنقولة تفشل في تطوير نيريتس). (أ - ج) التعبير عن متحولة سلبية سائدة (dnMARK2) في خلايا N2a / htau40. (أ) تلطيخ لـ dnMARK2 (الجسم المضاد 12CA5). (ب) تلطيخ تاو (K9JA). (ج) تلطيخ التوبولين (DM1A). (هـ - ز) خلايا N2a تنتقل بشكل عابر باستخدام GFP-MARK2 و KXGA / htau ومن ثم تمايزها. لا تظهر الخلايا المصابة بالعدوى بشكل مضاعف (الأسهم) أي نيوريتيس ، في حين أن الخلية غير المنقولة لديها نوبات ممتدة. (ح) رسم بياني يوضح جزء N2a مع neurites الممتدة بعد ترنسفكأيشن: التحكم في خلايا N2a ، الخلايا المنقولة بـ htau23 ، MARK2 ، htau23-KXGA متحولة ، تعداء مزدوج مع htau23-KXGA و MARK2. توضح البيانات أن htau23 و MARK2 يعززان نمو النوريت ، ويلغي htau23-KXGA هذا التنشيط ، وحتى MARK2 غير قادر على إنقاذ التأثير المثبط لطفرة KXGA-tau على تكوين النوريت بعد التمايز ، لأن فسفرة تاو في أشكالها KXGS تم حظره.

لإثبات أن MARK2 بالفعل فسفرة أشكال KXGS الخاصة بـ tau في الخلايا الحية ، قمنا بنقل GFP-MARK2 عابرًا (أو متحولة سلبية سائدة) إلى خلايا N2a المنقولة بشكل ثابت باستخدام تاو. تم تحليل الخلايا المتمايزة بواسطة مضان GFP (يظهر MARK2 الشكل 5 أ) ، التألق المناعي مع الجسم المضاد p-MARK ضد MARK2 النشط (الشكل 5 ب) ، والزخارف phospho-KXGS في تاو (الجسم المضاد 12E8 Seubert وآخرون.، 1995 Figure5c). كانت الأنماط الثلاثة متشابهة ، مما يشير إلى أن MARK2 النشط يتم توطينه في نفس الأجزاء مثل tau في جميع أنحاء الخلية وبالتالي سيكون قادرًا على فسفرته. في المقابل ، لم يُظهر تعداء العدوى باستخدام dnMARK2 أي تمايز ، ولا تلطيخ لـ MARK2 النشط ، ولا يوجد فسفو- KXGS تاو (بياناتنا غير المنشورة). لتأكيد هذه النتائج ، تم عزل البروتينات من خلايا N2a ، وتم تحديد مواقع الفسفرة بواسطة الأجسام المضادة الحساسة للفوسفور ذات الخصائص المعروفة في البقع الغربية (الشكل 5 ، د ، هـ). يكتشف الجسم المضاد بان تاو K9JA تاو بغض النظر عن الفسفرة ويعمل كمعيار لتركيز البروتين. يكتشف الجسم المضاد 12E8 أشكال KXGS المفسفرة في تكرارات تاو 1 و 4 (تحتوي على S262 و S356). يتم تحسين إشاراتها عندما يتم نقل MARK2 (الشكل 5 د ، الممر 2) ولكنها ضعيفة مع عدم وجود تعداء أو بعد تعداء مع dnMARK2 (الشكل 5 د ، الممرات 1 و 3). يُفترض أن التفاعل الضعيف في الممر 1 يعكس النشاط المتبقي للأشكال الإسوية MARK الداخلية. كعنصر تحكم ، يتم الكشف عن تعبير MARK2 (نشط أو غير نشط) بواسطة الجسم المضاد ضد علامة HA (الشكل 5 و d و e). أخيرًا ، يتم عرض حالة تنشيط MARK2 بواسطة الجسم المضاد للببتيد متعدد الأضلاع للأرنب p-MARK (SA6941) المرتفع مقابل ببتيد حلقة التنشيط الفسفورية لـ MARK2 (مع الفسفرة T208 و S212). تم تنقية هذا الجسم المضاد وتمييزه بالتفصيل. يوضح الشكل 5g أن المؤتلف MARK2 يمكن فسفرته وتنشيطه 10 أضعاف بواسطة نشاط كيناز في مستخلص الدماغ (Drewes)وآخرون.، 1997). يتسبب هذا الفسفرة في MARK في حدوث تحول في هلام SDS والتفاعل مع الجسم المضاد p-MARK (الشكل 5f). يُظهر الجسم المضاد p-MARK إشارة واضحة في اللطخة بعد تعداء الخلايا ذات MARK2 النشط ، ولكن فقط إشارة ضعيفة بدون تعداء MARK2 أو مع dnMARK2 (الشكل 5 د ، الممرات 1-3). تجادل البيانات بأن تطوير نيوريت يتم تحقيقه عن طريق فسفرة MARK2 لأشكال KXGS على تاو. يمكن إظهار التأثير بشكل أكثر وضوحًا عند تكرار التجربة ، ولكن يتم تحضين الخلايا باستخدام حمض أوكاديك المانع للفوسفاتاز (0.2 ميكرومتر ، 30 دقيقة) قبل الحصاد. في هذه الحالة ، تظهر الفسفرة في أشكال KXGS التي يراها الجسم المضاد 12E8 (مقابل p-Tau) في البقع بشكل خاص بعد تعداء مع MARK2 (الشكل 5e ، الممر 2) ، ولكن ليس مع dnMARK2 (الشكل 5 هـ ، الممر 3) ، مما يشير إلى ذلك لا تعمل الكينازات الأخرى على فسفرة أشكال KXGS في وجود حمض أوكادايك.

التين. 5. فسفرة تاو الناجم عن MARK2. (أ - ج) خلايا N2a / htau40 المنقولة بشكل عابر باستخدام GFP-MARK2 ، متباينة ، ثابتة بعد 24 ساعة ، وتحليلها بالمجهر الفلوري. (أ) توزيع GFP-MARK2. (ب) التألق المناعي للجسم المضاد p-MARK ضد MARK2 النشط (حلقة T الفسفورية). (ج) الجسم المضاد 12E8 ضد أشكال الفوسفو- KXGS لتاو. لاحظ أن MARK2 النشط و tau الفسفوري في مواقع KXGS يتحدان (انظر أدناه). (د و هـ) تم نقل خلايا N2a / htau40 بشكل عابر باستخدام MARK2 أو متحولة سلبية سائدة (dnMARK2) ، متباينة لمدة 6 ساعات ، وتم تحليلها عن طريق تحضير محلول الخلية والتحقيق عن طريق النشاف الغربي باستخدام لوحة من الأجسام المضادة ضد الفسفرة MARK2 و tau . تُظهر البيانات أن MARK2 يتسبب في فسفرة أشكال KXGS لتاو و dnMARK2 يمنع ذلك. (د) المسار 1 ، مستخلص خلية التحكم N2a / htau40. لين 2 ، تعداء مع MARK2. المسار 3 ، تعداء مع MARK2 السائد (T208A و S212A). يصبغ الجسم المضاد K9JA ("تاو") تاو بشكل مستقل عن الفسفرة. تحتوي العينات الثلاثة على نفس الكمية من تاو. يُظهر الجسم المضاد 12E8 ضد أشكال KXGS الفسفورية في tau 1 و 4 (phospho-S262 و -S356 ، "p-Tau") تلطيخًا أقوى في حالة تعداء MARK2 (الممر 2) ، ولكن تلطيخًا ضعيفًا فقط بدون انتقال MARK2 (الممر) 1) ، ولا تلطيخ مع dnMARK2 (حارة 3). يكشف الجسم المضاد ضد علامة hemagglutinin ("MARK") عن التعبير الخارجي عن MARK2 أو dnMARK2 (الممران 2 و 3) ولكنه غائب عن الخلايا غير المنقولة (الممر 1). يُظهر الجسم المضاد SA6941 ضد الببتيد T-loop المفسفر على MARK2 (pT208 ، pS212 ، المقابل لـ MARK2 المنشط) تلطيخًا واضحًا بعد تعداء MARK2 الخارجي (الممر 2) ولكن تلطيخ ضعيف فقط في عناصر التحكم (الممر 1) ، والذي يتوافق مع النشاط الداخلي. كينازات شبيهة بـ MARK ، ولا تلطيخ في وجود dnMARK. (هـ) تم نقل خلايا N2a / htau40 بشكل عابر باستخدام MARK2 أو متحولة سلبية سائدة ، dnMARK2 ، متباينة لمدة 6 ساعات ، وقبل الحصاد تمت معالجتها لمدة 30 دقيقة باستخدام 0.2 ميكرومتر من حمض okadaic. لاحظ أن العينة فقط التي تعبر عن وزن MARK2 المنقولة ، ولكن ليس dnMARK2 ، قد زادت الفسفرة بوضوح في أشكال KXGS الموضحة بالتفاعل مع الجسم المضاد 12E8 ("p-Tau" ، الممر 2). هذا يعني أن MARK2 وليس كينازات داخلية أخرى مثل PKA هي المسؤولة عن فسفرة تاو في أشكال KXGS في هذه الظروف. (f و g) تحليل اللطخة الغربية الذي يوضح خصوصية الجسم المضاد p-MARK (الجسم المضاد متعدد الأضلاع SA6941) مقابل مواقع البسفرة T208 و S212 في حلقة التنشيط في كيناز MARK2. أعلى ، بروتين MARK2 قبل (الخط 1) وبعد الفسفرة (الخط 2) عن طريق نشاط كيناز مستخلص الدماغ (انظر المواد والطرق). الجزء السفلي ، الجسم المضاد p-MARK (SA6941) يتعرف حصريًا على MARK2 الفسفوري (الممر 2) الذي يظهر نشاطه المتزايد في الرسم البياني (g). (ح - ي) خلايا N2a / htau40 المنقولة بشكل عابر باستخدام MARK2 الموسومة بـ HA ، تم إصلاحها لمدة 24 ساعة بعد التمايز وتحليلها بواسطة الفحص المجهري مضان متحد البؤر. (ح) توزيع MARK2 باستخدام الأجسام المضادة HA الفلورية. (ط) مضان الأكتين المسمى phalloidin. (ي) دمج h و i. لاحظ أن MARK2 والأكتين يتحدان إلى حد كبير.

كما هو موضح في الشكل 5 ، a-c ، أظهرت خلايا N2a المتمايزة العديد من الأرجل الخيطية والدفقات الدقيقة المنبثقة من جسم الخلية والعصبونات ، مما يشير إلى أن MARK2 النشط والفوسفو-تاو قد يتحدان مع شبكة الأكتين. لذلك قمنا بنقل MARK2 بشكل عابر إلى خلايا N2a-htau40 وفحصنا توزيع MARK2 والأكتين عن طريق التألق المناعي. يوضح الشكل 5 ، h-j ، بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر أن نمط MARK2 يتطابق إلى حد كبير مع نمط الأكتين. نحن نفترض أن tau phosphorylated في أشكال KXGS ينفصل عن الأنابيب الدقيقة وينتقل جزئيًا إلى شبكة الأكتين أثناء نمو النوريت ، بما يتوافق مع الملاحظات الأخيرة مع MAP2 فسفرته في أشكال KXGS (Ozer and Halpain ، 2000).

يتم تثبيط MARK بقوة بواسطة Hymenialdisine

يحتوي Tau على العديد من مواقع الفسفرة التي يمكن أن تؤثر على وظيفتها بطرق مختلفة. تحدث الغالبية (95٪) من الفسفرة الداخلية لتاو في الخلايا على أشكال SP أو TP في المناطق المحيطة بالتكرارات (Illenberger وآخرون.، 1998 Biernat and Mandelkow، 1999). تتم فسفرة هذه المواقع بواسطة كينازات موجهة بالبرولين مثل cdk5 و GSK-3β ، والتي من المعروف أنها تلعب دورًا في تمييز الخلايا العصبية. لتحليل دور هذه الكينازات في نمو العملية ، استخدمنا مثبطين فعالين جديدين لكل من cdk5 و GSK-3β و FL و HD (Meijer وآخرون.، 2000 لوكلير وآخرون.، 2001) ، وطبقتهم على خلايا N2a المنقولة بشكل ثابت بـ htau40. يوضح الشكل 6 أ أن خلايا التحكم تطور نوبات ممتدة (∼25 ٪) في وسط التمايز. عندما تعرضت الخلايا لـ 50 ميكرومتر FL ، كان نمو النوريت مشابهًا أو محسنًا إلى حد ما (الشكل 6 ، ب و د) ، بما يتفق مع ملاحظتنا السابقة بأن الفسفرة في tau في أشكال SP أو TP كانت محايدة أو مثبطة إلى حد ما (Biernat و Mandelkow ، 1999). في المقابل ، عندما عولجت خلايا N2a / htau40 بمثبط كيناز HD (50 ميكرومتر) ، تم تثبيط نمو النوريت بشدة (∼3 ٪ الشكل 6 ، ج ، د). كيف يمكن تفسير هذا التناقض الظاهر بين مثبطي الكيناز؟ للإجابة على هذا السؤال ، يجب تحديد مواقع الفسفرة المتأثرة في تاو بمزيد من التفصيل. لا يمكن تحقيق ذلك باستخدام خلايا N2a أو N2a / htau40 نظرًا لأن مستوى تاو منخفض جدًا بالنسبة للتحليل الكيميائي الحيوي. لذلك لجأنا إلى نظام الخلايا Sf9 الذي يولد كميات كافية من البروتين للتحليل الكيميائي الحيوي لـ tau المنقولة. التبرير هو ملاحظة أن التفاعل بين tau و tau kinases أثناء تكوين العملية متشابه نوعيا بين الخلايا العصبية وغير العصبية (Biernat and Mandelkow، 1999).

الشكل 6. تأثير مثبطات كيناز FL و HD على نمو نوريت الناجم عن تاو في خلايا N2a المنقولة بشكل ثابت مع htau40. (أ) تم تمييز خلايا التحكم N2a / htau40 وتلطيخها من أجل التألق المناعي مع الجسم المضاد تاو K9JA ∼25 ٪ من الخلايا تطور عمليات خلية ممتدة. (ب) تمايز خلايا N2a / htau40 ومعالجتها بـ 50 ميكرومتر FL ، وهو مثبط قوي لـ cdk5 و GSK-3β (Leclerc وآخرون.، 2001). تم تحسين نمو نيوريت إلى حد ما (35 ٪). (ج) تمايز خلايا N2a / htau40 ومعالجتها بـ 50 ميكرومتر HD ، وهو أيضًا مثبط قوي لـ cdk5 و GSK-3β (Meijerوآخرون.، 2000). تم منع نمو نيوريت بشدة (3٪). (د) رسم بياني يوضح جزء الخلايا N2a / htau40 التي تحمل نيريتس ممتدة بعد التمايز والعلاج بمثبطات كيناز HD و FL. يقلل HD بشدة من مدى تكوين النورت ، ويسبب FL زيادة طفيفة.

يوضح الشكل 7 خلايا Sf9 غير المعالجة (قطرها حوالي 20 ميكرومتر ، ولا توجد عمليات خلية الشكل 7 أ) والخلايا المنقولة باستخدام htau23 (الشكل 7 ب). بعد 30 ساعة من تعداء ، تم تكبير ∼25 ٪ من هذه الخلايا وتطوير عملية خلية واحدة ذات قطر موحد. بعد ذلك ، قمنا بتعريض الخلايا للعقار FL (50 ميكرومتر). نتج عن ذلك زيادة واضحة بمقدار ثلاثة أضعاف في الخلايا ذات العمليات (75 ٪ الشكل 7 و c و e) ، بحجة أن الفسفرة الموجهة بالبرولين لـ tau بواسطة cdk5 و GSK-3β مثبطة لعمليات الخلية. ومع ذلك ، عندما تعرضت الخلايا لـ HD ، تم تقليل تكوين العملية بشدة (∼10 ٪ الشكل 7 ، د و هـ). أظهرت النتائج أن كل من خلايا N2a وخلايا Sf9 المصابة بنقل تاو كان لها استجابة مماثلة لمثبطات كيناز FL و HD.

الشكل 7. تأثير مثبطات كيناز FL و HD على نمو العملية التي يسببها تاو في خلايا Sf9. (أ) خلايا Sf9 غير المعالجة (تحكم) ، تظهر أشكالًا مستديرة) ولا توجد عمليات خلية. (ب) خلايا Sf9 المنقولة بواسطة htau23 بواسطة ناقل الفيروس البكتيري ∼30 ٪ تنمو عمليات الخلايا الممتدة حتى 100 ميكرومتر. لديهم أيضًا أجسام خلايا أكبر (2 إلى 3 أضعاف). (ج) خلايا Sf9 المنقولة بواسطة htau23 وتعالج بمثبط كيناز FL (50 ميكرومتر). يزداد عدد الخلايا ذات العمليات بقوة (3 أضعاف). (د) خلايا Sf9 المنقولة بواسطة htau23 ومعالجتها بمثبط كيناز HD (50 ميكرومتر). ينخفض ​​عدد الخلايا ذات العمليات إلى -10٪. (هـ) رسم بياني يوضح كفاءة تكوين العملية بواسطة خلايا Sf9 في وجود مثبطات كيناز. HD يمنعهم بشدة ، يروج LiCl و H89 بشكل متواضع ، و FL يروج بقوة.

تم تحديد مواقع الفسفرة في تاو باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالموقع على البقع الغربية ، ورسم خرائط الفوسفوببتيد ثنائي الأبعاد (الشكل 8). كما هو موضح سابقًا (Illenbergerوآخرون.، 1998 جودمان وآخرون.، 1999) ، الأهداف الرئيسية لـ GSK-3β على tau هي S404 ، تليها S396 (التي تشكل معًا قمة PHF-1) ، وبدرجة أقل S202 و T205 (الجسم المضاد AT-8). الأهداف الرئيسية لـ cdk5 هي S235 تليها T231 (قمة الجسم المضاد AT-180) ، S202 / T205 (حلقة AT-8) ، في حين أن التفاعل مع PHF-1 ضعيف جدًا لأن S404 موقع رئيسي ولكن ليس S396. تحتوي خلايا Sf9 على كينازات نشطة جدًا بحيث يتم ملاحظة جميع تفاعلات الأجسام المضادة المعتمدة على الفسفرة في تاو المنقولة (Biernat and Mandelkow ، 1999). يوضح الشكل 8 أ (الممر 1) هذا بالنسبة للأجسام المضادة 12E8 (pS262 و pS356) و AT-100 (pT212 و pS214) و AT-180 (pT231 و pS235) و AT-8 (pS202 و pT205) و PHF-1 ( pS396 و pS404). عند إضافة المانع FL إلى الخلايا (الشكل 8 أ ، الممر 3) ، يتم قمع بشدة تفاعلات تاو في البقع الغربية مع الأجسام المضادة AT-100 و AT-180 و AT-8 و PHF-1. وينطبق الشيء نفسه على المانع HD (الشكل 8 أ ، الممر 2). ومع ذلك ، كان هناك اختلاف غير متوقع فيما يتعلق بالجسم المضاد 12E8 ، التشخيصي لنماذج KXGS التي تحتوي على الفوسفو- S262 / S356. يسمح FL بالفسفرة في هذه المواقع ، ويمنعها HD ، كما هو موضح في لطخة ويسترن (الشكل 8 أ ، الممران 2 و 3). لأنه لا GSK-3β ولا cdk5 phosphorylate S262 أو S356 (Godemann وآخرون.، 1999) ، تشير النتيجة إلى أن HD هو أيضًا مثبط لـ MARK2 ، وهو الكيناز الذي يعمل على فسفرة هذه المواقع بشكل أكثر كفاءة. تم اختبار هذا مباشرة عن طريق فحوصات نشاط كيناز التي أجريت باستخدام المؤتلف MARK2 و GSK-3β في المختبر (الشكل 9). في حالة GSK-3β ، وجدنا تثبيطًا قويًا نسبيًا بواسطة HD (IC50 = 0.13 ميكرومتر) و FL (IC50 = 0.55 ميكرومتر الشكل 9). في حالة MARK2 ، يكون HD فقط مثبطًا قويًا (IC50 = 0.67 ميكرومتر).

الشكل 8. تأثير مثبطات كيناز على فسفرة htau23 في خلايا Sf9. (أ و ب) لطخات الجسم المضاد. (ج و و) خرائط فسفوببتيد ثنائية الأبعاد. (أ) المسار 1 ، لا يوجد مانع (تحكم). لين 2 ، 50 ميكرومتر HD. لين 3 ، 50 ميكرومتر FL. من أعلى إلى أسفل: هلام Coomassie الملون (تحكم) يُظهر كميات متساوية تقريبًا من لطخة tau Western مع الجسم المضاد K9JA الذي يتعرف على tau بشكل مستقل عن الجسم المضاد للفسفرة 12E8 (ضد أشكال KXGS المفسفرة). يمنع المانع HD الفسفرة (الخط 2) لأنه يثبط MARK والكينازات ذات الصلة ، وليس بسبب تثبيط GSK-3β (انظر أدناه). مثبطات LiCl و PKA ليس لها تأثير واضح (الشكل 8 ب ، الممرات 1 و 2). الجسم المضاد AT-100 (ضد phospho-T212 و S214). تتطلب هذه الحلقة اللاصقة نشاط GSK-3β (لفوسفوريلات T212) ، و PKA (لتفسفوريلات S214 Zheng-Fischhofer وآخرون.، 1998). لذلك ، يتم حظر الحلقة الحلقية بواسطة كل من HD و FL (الممران 2 و 3). الجسم المضاد AT-180 (ضد الفوسفو- T231 و S235). هذه حاتمة مستحثة بواسطة cdk5 و GSK-3β ، وبالتالي يتم حظر الإشارة بواسطة كل من HD و FL (الممران 2 و 3). الجسم المضاد AT-8 (ضد phospho-S202 و T205). هذه حاتمة ناتجة بشكل أساسي عن cdk5 ، وبالتالي يتم حظر الإشارة بواسطة كل من HD و FL (الممران 2 و 3). الجسم المضاد PHF-1 (ضد phospho-S396 و S404). يتم تأطير هذه الحلقة اللاصقة بشكل أساسي بواسطة GSK-3β ، وبالتالي يتم تثبيط الإشارة بواسطة HD ، ولكن أقل بواسطة FL. (ب) المسار 1 ، 50 ملي ليكل. حارة 2 ، 50 ميكرومتر H89 ، مثبط PKA. (ج - و) خرائط فسفوببتيد ثنائية الأبعاد لبروتين htau23 معبرًا عنها في خلايا Sf9 وفسفرتها بواسطة كينازات داخلية بدون (ج) ، أو في وجود مثبطات كيناز (د - و). (ج) التحكم ، tau المعبر عنه في خلايا Sf9. (د) تثبيط بمقدار 50 ميكرومتر HD لتثبيط cdk5 و GSK-3β و MARK. (هـ) تثبيط بمقدار 50 ملي ليكل لتثبيط GSK-3β. (و) التثبيط بمقدار 50 ميكرومتر FL لتثبيط cdk5 و GSK3β لاحظ أن c و e و f تظهر البقع لـ S262 الفسفوري (الدائرة ، انظر أيضًا الإدخال في e عند التعرض العالي) ، d لا لأن HD يثبط نشاط MARK.

الشكل 9. في مقايسة تثبيط المختبر من كينازات تاو بواسطة مثبطات HD و FL. (أ) MARK2. (ب) GSK3β. لاحظ أن GSK-3β تم تثبيته بواسطة HD (IC50 = 0.13 ميكرومتر) و FL (IC50 = 0.55 ميكرومتر) ، ولكن يتم تثبيط MARK2 بشكل أساسي بواسطة HD (IC50 = 0.67 ميكرومتر) ، في حين أن FL ليس سوى مثبط ضعيف (IC50 = 38 ميكرومتر).

تم إجراء تجارب تحكم إضافية على خلايا Sf9 باستخدام LiCl ، وهو مثبط محدد لـ GSK-3β (Stambolic وآخرون.، 1996) ، و H89 ، أحد مثبطات PKA (Chijiwa وآخرون.، 1990). كانت هذه التجارب مدفوعة بملاحظاتنا السابقة التي تفيد بأن PKA يمكنه فسفرة أشكال KXGS لتاو في المختبر ، وإن كان ذلك بكفاءة منخفضة (شنايدر) وآخرون.، 1999) ، ومن خلال التقارير المتضاربة التي تفيد بأن GSK-3β يمكن أيضًا أن تفسد أشكال KXGS (Morenoوآخرون.، 1995 جودمان وآخرون.، 1999). اختبرنا هذين الكينازين مع مثبطاتهما (LiCl لـ GSK-3β ، H89 لـ PKA) ووجدنا أن التفاعل مع الجسم المضاد 12E8 ضد pSer262 لم يتأثر (الشكل 8 ب ، الممرات 1 و 2 ، قارن مع التحكم في الشكل 8 أ ، الممر 1) في المقابل ، قمع 50 ميكرومتر HD التفاعل مع الجسم المضاد 12E8 (الشكل 8 أ ، الممر 2). تم تأكيد ذلك من خلال رسم خرائط فسفوببتيد لـ tau في خلايا Sf9 بعد العلاج بـ 50 ملي مولار من LiCl لتثبيط GSK-3β (انظر أدناه ، الشكل 8 هـ ، بقعة دائرية). علاوة على ذلك ، أظهر التقدير الكمي لعمليات الخلايا التي يسببها تاو لخلايا Sf9 بعد العلاج بمثبطات LiCl أو H89 زيادة طفيفة ، بدلاً من الانخفاض الواضح الذي لوحظ مع مثبط MARK HD (الشكل 7 هـ). يشير هذا إلى أن GSK-3β و PKA ليسا مسؤولين عن فسفرة أشكال KXGS في تاو أثناء تكوين عملية الخلية.

أخيرًا ، أجرينا وضع العلامات الأيضية لخلايا Sf9 مع 32 P وقمنا بتحليل حالة الفسفرة في تاو عن طريق رسم خرائط الفوسفوببتيد (الشكل 8 ، ج - و). تظهر الخريطة المرجعية للفوسفوببتيدات التجريبية لـ tau المعبر عنها في خلايا Sf9 في الشكل 8 ج ، يتم وصف تحديد البقع بالتفصيل في مكان آخر (Illenberger وآخرون.، 1998 Biernat and Mandelkow، 1999). نقاط pS262 و pS356 ضعيفة نوعًا ما مقارنة بتلك الخاصة بزخارف SP أو TP. ومع ذلك ، فإن بقعة pS262 مرئية بوضوح في الخرائط التي تم الحصول عليها باستخدام LiCl أو FL (الشكل 8 ، e و f ، الدوائر ، انظر الشكل الداخلي) ، ولكن ليس مع HD (الشكل 8 د ، الدائرة). هذا يؤكد أن HD هو أيضًا مثبط لـ MARK2 ، وأن GSK-3β أو cdk5 ليست مسؤولة عن فسفرة tau في S262 في خلايا Sf9.

توضح النتائج مع مثبطات كيناز تفاعلات الأجسام المضادة (اختفاء تلطيخ 12E8 في وجود مثبط HD) ، ولكن الأهم أنها تفسر استجابة الخلايا للعلاج المثبط. كما هو مذكور أعلاه ، فإن الفسفرة في أشكال KXGS ضرورية لتشكيل العملية. نظرًا لأن هذا يتحقق بواسطة MARK2 ، فإن المانع HD (وليس FL) يثبط عمليات الخلية (الشكل 7 و d و e) لأنه أيضًا مثبط لـ MARK2 وليس لأنه أيضًا مثبط لـ GSK-3β و cdk5.


الملخص

يطلق الإخصاب توقف الانتصافي ويبدأ الأحداث التي تعد البويضة لبرنامج النمو اللاحق. من المعروف أن تحلل البروتين والفسفرة ينظمان نشاط البروتين خلال هذه العملية. ومع ذلك ، فإن المدى الكامل لفقدان البروتين وتنظيم الفسفور لا يزال غير معروف. قمنا بفحص ديناميكيات البروتين والفوسفوزيت المطلق لاستجابة الإخصاب بواسطة البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي في البيض المنشط كهربائيًا. للقيام بذلك ، قمنا بتطوير نهج لحساب القياس المتكافئ للفوسفوسيت من البروتينات متعددة الإرسال المتوافقة مع الفسفرة الديناميكية والمستقرة والمتعددة المواقع. بشكل عام ، تشير البيانات إلى أن التحلل يقتصر على عدد قليل من البروتينات منخفضة الوفرة. ومع ذلك ، فإن هذا التحلل يعزز نزع الفسفرة على نطاق واسع الذي يحدث على نطاق واسع من الوفرة أثناء الخروج الانتصافي. نظهر أيضًا أن البيض يطلق كمية كبيرة من البروتين في الوسط بعد الإخصاب مباشرة ، ويرتبط على الأرجح بكتل تعدد النطاف. بالتزامن مع ذلك ، هناك زيادة كبيرة في الفسفرة المرتبطة على الأرجح بالكينازات التي تنشط بالكالسيوم. نحدد أهداف التدهور المفترضة ومكونات الكتلة البطيئة لتعدد النطاف. المناهج التحليلية الموضحة هنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسات الأنظمة البيولوجية الديناميكية.

لعقود من الزمان ، قدمت أحداث الإخصاب المتزامنة للغاية نظامًا مفيدًا لدراسة العديد من جوانب التنظيم الخلوي ، وخاصة تدهور البروتين والفسفرة. يتم تحفيز تدمير Cyclin-B والبروتينات الأخرى بواسطة مجمع تعزيز الطور (APC / C) ، والذي يعزز خروج الطور M (1). المنشطان لـ APC / C هما Cdc20 و Cdh1. في البويضة ، تتضمن دورة الخلية عادةً فقط Cdc20 (2). بينما تستمر قائمة ركائز Cdh1 المعروفة في النمو (3) ، تظل قائمة Cdc20 المستهدفة صغيرة (4 ⇓ –6). من الأهمية بمكان وصف مجموعة الحد الأدنى من ركائز Cdc20 التي تمد دورة الخلية المبكرة. نشاط كيناز مهم بنفس القدر لهذه اللائحة. يعزز تدهور Cyclin-B الخروج الانقسامي عن طريق تثبيط نشاط كيناز 1 المعتمد على Cyclin (Cdk1). هناك خسارة كبيرة في الفسفرة بعد تنشيط البويضة (7). تظل هويات الغالبية العظمى من هذه البروتينات غير مكتشفة. ومع ذلك ، هناك توقع قوي بأن هذا التنظيم يعكس انعكاس الفسفرة Cdk1. يستخدم الإخصاب تنظيمًا إضافيًا غير شائع في دورات الخلايا الأخرى. هناك موجات موقوتة من الفسفرة تتوافق مع إطلاق الحبيبات القشرية بعد الإخصاب مباشرة كجزء من الكتلة البطيئة لتعدد النطاف. هذا الإطلاق حساس للكالسيوم وقد يعكس الزيادات في نشاط بروتين كيناز سي (PKC) (8 ، 9) و CaMKII (10). إن حساب البروتينات المُفرزة ووظائفها ومكونات إشاراتها الأولية محدودة. للتحقيق في هذه الجوانب غير المعروفة من تدهور البروتينات وإطلاقها وتعديلها عند الإخصاب بشكل شامل ، استخدمنا مقياس الطيف الكتلي (MS) في Xenopus laevis بيض. تسمح التطورات الحديثة في البروتينات متعددة الإرسال بإجراء مقارنات كمية لظروف متعددة باستخدام علامات الكتلة الترادفية (TMTs) (11 –13). يوضح عملنا الأخير قوة البروتينات في Xenopus لدراسات التنمية المبكرة (14 –16). على الرغم من دراسة التخصيب من قبل مع مرض التصلب العصبي المتعدد (17 ⇓ –20) ، كانت الدراسات إما نوعية أو لم تقيس الفسفرة. من خلال خطوة الإثراء (21 –23) ، من الممكن قياس التغيرات النسبية في عدد كبير من البروتينات الفوسفورية. ومع ذلك ، فإن مثل هذه الدراسات ذات فائدة محدودة دون قياس قياس العناصر المتكافئة في الموقع. الاعتماد على تغيير الطية وحده لدراسات الفسفرة لن يميز بين التغييرات النسبية 10 أضعاف من 1٪ شغل إلى 10٪ مقابل 10 إلى 100٪. تتوفر عدة طرق (24 × 26) ، ولكن لا أحد من هذه الأساليب قادر على تحديد إشغال الببتيدات المقاسة باستخدام MS متعددة الإرسال أو التي تحتوي على العديد من البقايا الفسفورية. تقدم هذه الورقة نتائج بيولوجية حول الإخصاب وتطور دورة الخلية بالإضافة إلى طرق قياس القياس الكيميائي المطلق للفوسفوسيت التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع في دراسات تعديل بروتين MS.


نقاش

في هذه الدراسة ، سألنا كيف يتم تنظيم وظيفة tau ، وهو بروتين معروف ببدء نمو المحوار ، عن طريق الفسفرة ، وما هي الكينازات المسؤولة عن ذلك. نجادل بأن فسفرة tau في أشكالها KXGS بواسطة كيناز MARK أمر بالغ الأهمية في الخلايا العصبية ونماذج الخلايا غير العصبية (خلايا N2a و Sf9). نظرًا لأن أنواع الخلايا هذه تحتوي على القليل من تاو الذاتية أو لا تحتوي على أي منها على الإطلاق ، يمكن تعزيز عمليات الخلايا بقوة عن طريق تعداء الخلايا باستخدام تاو الخارجية. يعتمد الدليل على أهمية MARK على التجارب التي قمنا فيها بتغيير إما نشاط منظم كيناز MARK أو المواقع الموجودة على بروتين المستجيب تاو. تم تغيير وظيفة tau من خلال الطفرات النقطية في المواقع المستهدفة لـ MARK عن طريق استبدال أشكال KXGS بزخارف KXGA غير الفسفورية. لم يكن KXGA-tau قادرًا على تحفيز نمو النوريت في خلايا N2a. تم تغيير نشاط MARK بثلاث طرق: 1) تعداء عابر للخلايا باستخدام MARK2 ، أحد الأشكال الإسوية MARK ، والتي يمكن تنشيطها عن طريق الفسفرة في حلقة التنشيط (Drewes) وآخرون.، 1997) 2) تعداء مع علامة MARK سلبية سائدة تفتقر إلى مواقع الفسفرة التنظيمية (T208A و S212A) و 3) تعطيل MARK بواسطة hymenialdisine ، مثبط كيناز جديد (Meijer وآخرون.، 2000). عندما تم تعطيل MARK ، لم يحدث أي تحفيز لنمو النورت.

نظرًا لأن تاو يحتوي على العديد من مواقع الفسفرة ، فإن المشكلة الواضحة هي التمييز بين تأثيراتها على وظائف تاو. هذه مشكلة شائعة في هذا المجال لأن فسفرة تاو في الخلايا غالبًا ما يتم اكتشافها بواسطة الأجسام المضادة التي قد تختلف في التقارب والنوعية. يتم توجيه العديد من الأجسام المضادة "لتشخيص مرض الزهايمر" ضد أشكال phospho-SP أو -TP ، مما يشير إلى نشاط كينازات البرولين الموجهة (على سبيل المثال ، MAP kinase أو GSK-3β أو cdk5). في حالتنا ، يمكننا أن نستبعد دورًا رئيسيًا لهذه الكينازات في نمو النوريت الناجم عن تاو لأن متحولة AP-tau (حيث تم تحويل جميع أشكال SP أو TP إلى AP) تُظهر تحفيزًا مشابهًا أو أكبر من neurites من تاو العادي ، على عكس KXGA- متحولة تاو. هذا يتفق مع الملاحظات السابقة على خلايا Sf9 (Biernat and Mandelkow ، 1999). مواقع الفسفرة الأخرى غير KXGS أو غير SP / TP هي أيضًا ذات أهمية ثانوية لأنها تمثل جزءًا صغيرًا من مواقع الفسفرة الخلوية (واتانابي وآخرون.، 1993 ، Illenbergerوآخرون.، 1998) ، ولم يتم فسفرتها بواسطة MARK بحيث لا يمكنهم شرح تأثيرات تثبيط MARK (Drewesوآخرون.، 1995). هناك قضية خاصة تتمثل في الفسفرة المحتملة لأشكال KXGS بواسطة اثنين من كينازات أخرى ، GSK-3β أو PKA. في إحدى الدراسات ، كان يُعتقد أن GKS-3β يفسفوريلات تاو في S262 (مورينووآخرون.، 1995) ، لكن تحليلنا اللاحق أظهر أن هذا كان بسبب أنشطة أخرى في تحضير كيناز (Godemannوآخرون.، 1999). تم تأكيد ذلك هنا من خلال تجربة LiCl التي تمنع أهداف GKS-3β على tau (أشكال SP أو TP الشكل 8 ب ، الممر 1 ، تلطيخ PHF1) دون التأثير على مواقع KXGS (الشكل 8 ب ، الممر 1 ، التلوين بـ 12E8 ، والشكل 8 هـ ، بقعة الفوسفو- S262 في أقحم). يظل PKA احتمالًا آخر ، فهو بالفعل يقوم بفوسفوريلات تاو في العديد من المواقع ، بما في ذلك نماذج KXGS (وإن كان ذلك أقل كفاءة بكثير من MARK Drewes) وآخرون.، 1995 شنايدر وآخرون.، 1999). ومع ذلك ، فإن تثبيط PKA بواسطة H89 لم يمنع تكوين العملية (الشكل 7 هـ) ، على عكس تثبيط MARK بواسطة HD ولم يمنع الفسفرة لأشكال KXGS (الشكل 8 ب ، الممر 2 ، تلطيخ 12E8). أظهرنا أيضًا في اختبار نشاط في المختبر (الشكل 9) أن غشاء البكارة قادر على تثبيط MARK ، ولكن ليس PKA. علاوة على ذلك ، أدت معالجة خلايا N2a / htau40 بحمض okadaic إلى زيادة الفسفرة في أشكال KXGS فقط بعد نقل الخلايا باستخدام MARK2 (ولكن ليس مع dnMARK2) ، ولا في الخلايا التي لا تحتوي على MARK2 المنقولة (الشكل 5 هـ ، الممرات 1-3) . يشير هذا إلى أنه لا يوجد فوسفوريلات كيناز أخرى في أشكال KXGS لتاو في التفريق بين خلايا N2a حتى في ظل ظروف حمض أوكادايك ، مشيرًا إلى MARK2 باعتباره كيناز المسؤول. أخيرًا ، في الخلايا الحية ، يتحد GFP-MARK2 (ولكن ليس dnMARK2) مع نشاط MARK2 (كما هو موضح في الجسم المضاد p-MARK) و phospho-KXGS tau (الشكل 5 ، أ-ج). بشكل جماعي ، تشير الأدلة البيوكيميائية والتألق المناعي إلى أن MARK2 أو كيناز من عائلة MARK هو كيناز فسفرة تاو في أشكال KXGS في تمييز خلايا N2a.

يعتبر استقرار الأنابيب الدقيقة ضروريًا للعصابات لأنها توفر قوة ميكانيكية ومسارات للنقل داخل الخلايا. تميل الفسفرة لأشكال KXGS لتاو أثناء نمو النوريت إلى فصل tau عن الأنابيب الدقيقة وبالتالي تجعل الأنابيب الدقيقة أقل استقرارًا. هذا هو عكس ما يتوقعه المرء بشكل حدسي ، وبالتالي فإن السؤال الذي يطرح نفسه هو لماذا يجب أن يكون هذا مهمًا لنمو النوريت. قد تكمن الإجابة في دور أكثر دقة للأنابيب الدقيقة: مع تقدم مخروط النمو ، تمهد خيوط الأكتين الأرض على شكل أرجل صفائحية وعابرة خيطية عابرة. يتم التحقيق في هذه الأرضية من خلال الأنابيب الدقيقة الرائدة التي تقوم برحلات مؤقتة في شبكة الأكتين وتتراجع مرة أخرى ، حتى يتم اتخاذ قرار في النهاية بتثبيتها ، وتشكيل حزم ، والسماح لمخروط النمو بالتقدم (تمت مراجعته في Borisy and Svitkina ، 2000Bradke و Dotti ، 2000 جود وآخرون.، 2000). وبالتالي ، يجب أن تكون الأنابيب الدقيقة غير مستقرة ديناميكيًا قبل أن تتمدد العصبونات. وهذا يفسر سبب كفاية قمع عدم الاستقرار الديناميكي لمنع نمو العصبونات ، حتى عندما لا تتغير كتلة البوليمر (Baas and Ahmad، 1993 Liao وآخرون.، 1995 تاناكا وآخرون.، 1995 روشلين وآخرون.، 1996 كافيرينا وآخرون.، 1998). يبدو أن الخلية تستخدم tau أو خرائط ذات صلة لهذا التنظيم (Drubin and Kirschner ، 1986 Panda وآخرون.، 1999). Tau موجود في مخروط النمو ، لكنه منفصل إلى حد كبير عن الأنابيب الدقيقة (أسود وآخرون.، 1996). لماذا لا ينبغي لمجمع تاو هذا أن يثبت الأنابيب الدقيقة حتى تتمكن من الخروج من جذع النوريت؟ نقترح أن tau يتم فسفرته محليًا في أشكال KXGS ، وبالتالي غير قادر على الارتباط بالأنابيب الدقيقة (مما يجعلها غير مستقرة) ، وينتقل إلى شبكة الأكتين (الشكل 5c Ozer و Halpain ، 2000 ، للحالة المماثلة لـ MAP2). فقط جزء صغير من الأنابيب الدقيقة ديناميكية للغاية (Waterman-Storer and Salmon، 1997 Kabir وآخرون.، 2001) ، وهذا ما يفسر سبب انخفاض المدى الإجمالي للفسفرة KXGS في الخلايا الطبيعية ، على الرغم من دورها الحاسم (Biernat and Mandelkow ، 1999).

من المثير للاهتمام مقارنة نتائجنا بدراستين أخريين حول فسفرة تاو في الخلايا العصبية. جادل Mandell and Banker (1996) بأن فسفرة تاو كانت أقل في الطرف البعيد من النوريت حيث تكون الأنابيب الدقيقة أكثر ديناميكية. بدا هذا محيرًا لأن tau غير الفسفوري غالبًا ما يُعد بمثابة أنابيب دقيقة مستقرة. يمكن تفسير النتيجة من خلال ملاحظة أن المؤلفين قد استخدموا الجسم المضاد AT-8 ، والذي يستشعر شكلي SP و TP مُفسفرتين خارج مجال التكرار (S202 و T205) ، لكنه لا يتعرف على الفسفرة في أشكال KXGS. لقد أظهرنا في مكان آخر أن الفسفرة في مواقع نماذج SP أو TP لها تأثير متواضع فقط على ارتباط tau-microtubule (Biernat). وآخرون.، 1993) ، وفي الواقع جميع المواقع الموجهة بالبرولين مجتمعة ليس لها تأثير كبير على نمو النوريت (الشكل 2f) ، على عكس أشكال KXGS. بشكل عام ، فإن دور الفسفرة الموجهة بالبرولين في تاو غير مفهوم جيدًا وقد يكون مهمًا في سياقات أخرى ، على سبيل المثال ، الحماية من التدهور (Litersky and Johnson ، 1995) ، انقسام الخلايا (Ookata وآخرون.، 1997 Illenberger وآخرون.، 1998) ، والتجزئة في الخلايا العصبية (Binder وآخرون.، 1985 هيروكاوا وآخرون., 1996).

في دراسة ذات صلة ، قام Ozer و Halpain (2000) بالتحقيق في فسفرة MAP2 في خلايا هيلا. تشبه MAP هذه tau و HeLa MAP4 الذاتية من خلال وجود تكرارات متماثلة ، بما في ذلك أشكال KXGS ، ويتم تصنيفها في حجرة العصبونات الجسدية للخلايا العصبية (على عكس تاو محور عصبي). وجد المؤلفون أن أشكال KXGS لـ MAP2 يمكن فسفرتها بواسطة PKA ، مما يؤدي إلى تفكك MAP2 من الأنابيب الدقيقة والانتقال إلى شبكة الأكتين. سيكون هذا متسقًا مع حقيقة أن PKA يرتبط بـ MAP2 من خلال الوحدة الفرعية التنظيمية RII (Obar وآخرون.، 1989) ، وهذا ليس هو الحال بالنسبة لـ tau. سيكون القاسم المشترك لنتائجهم ونتائجنا هو أن الخلية تحتاج إلى التحكم في ديناميكيات الأنابيب الدقيقة عن طريق فسفرة خرائط الخرائط المتوفرة محليًا في أشكال KXGS الخاصة بهم. يمكن أن يكون هذا تاو في محاور عصبية ، MAP2 في التشعبات ، ويفترض MAP4 في أنواع الخلايا الأخرى. يمكن تحقيق الفسفرة بواسطة كينازات مختلفة (على سبيل المثال ، MARK أو PKA) ، مع نفس النتيجة لفصل MAPs عن الأنابيب الدقيقة. بدلاً من ذلك ، من الممكن أن تكون هناك آلية أكثر تعقيدًا تتضمن تنشيط الكينازات و / أو الفوسفاتازات. في نظامنا التجريبي ، لم نعثر على أي دليل على الدور الرئيسي لـ PKA في بدء نمو النوريت ، بما يتوافق مع دور كينازات عائلة MARK / PAR-1 في إنشاء قطبية الخلية (Drewes وآخرون.، 1998 Kemphues، 2000، Shulman وآخرون.، 2000 تومانكاك وآخرون., 2000).

تحتوي الخلايا العصبية على العديد من MAPs بتوزيعات مختلفة ووظائف متداخلة جزئيًا. على سبيل المثال ، يمكن أن يحل tau و MAP1b محل بعضهما البعض أثناء نمو محور عصبي في بيئات مختلفة خارج الخلية (DiTella وآخرون.، 1996). يكون الفأر المعدّل وراثيًا الذي يفتقر إلى tau فقط قابلاً للتطبيق ، لكن نموذج الماوس الذي يفتقر إلى كل من tau و MAP1b يُظهر عيوبًا خطيرة في تكوين المحاور (Harada وآخرون.، 1994 تاكي وآخرون.، 2000). يمتد التكامل حتى إلى الخصائص الجزيئية: فسفرة تاو في مواقع معينة تفصل تاو عن الأنابيب الدقيقة وتجعلها أكثر ديناميكية ، في حين أن بعض الفسفرات لـ MAP1b تعزز الارتباط بالأنابيب الدقيقة ، وفي كلتا الحالتين يوجد تدرج على طول المحاور ، مع تقارب أقل الأنواع بالقرب من مخروط النمو (Ulloa وآخرون.، 1994). يؤدي التنظيم السفلي لـ GSK-3β عن طريق مسار إشارات WNT أو تثبيطه بواسطة الليثيوم إلى نزع الفسفرة من MAP1b ، وفصله عن الأنابيب الدقيقة ، وبالتالي إعادة تشكيل المحور العصبي مثل زيادة حجم مخروط النمو والتفرع (Lucas) وآخرون.، 1998). لأن hymenialdisine هو مثبط ليس فقط لـ MARK ولكن أيضًا لـ GSK-3β (Meijer وآخرون.، 2000) ، يمكن للمرء أن يجادل في أن تأثيره على ثمرة النوريت يمكن توسطه بواسطة GSK-3β وربما MAP1b. ومع ذلك ، يمكن استبعاد ذلك لأن مثبطين آخرين من GSK-3β ، الليثيوم والفلافوبيريدول ، لا يعيد إنتاج تأثيرات HD. علاوة على ذلك ، فإن تأثيرات تثبيط MARK بوساطة تاو (أي تثبيط نمو نوريت) تكون معاكسة لتأثيرات تثبيط GSK-3β بوساطة MAP1b (إعادة تشكيل مخروط النمو). بمعنى آخر ، يؤدي تثبيط MARK إلى تقليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة ، في حين أن تثبيط GSK-3β يعزز الديناميكيات.

أخيرًا ، نلاحظ أن هناك أدلة متزايدة على وجود تفاعل بين ديناميات الأنابيب الدقيقة وديناميكيات الأكتين بوساطة فسفرة مكونات الملحقات أثناء نمو النوريت. تم وصف العديد من الكينازات التي ترسو على أحد أنظمة الألياف هذه أو كليهما وتعزز تنظيمها ، على سبيل المثال ، c-Abl أو PAK5 أو بروتين كيناز C (كبير وآخرون.، 2001 دان وآخرون.، 2002 وودرينغوآخرون.، 2002) ، وسيكون MARK مثالًا آخر على ذلك. عادةً ما يحدث ذلك بتنسيق محكم مع بروتينات G الصغيرة من عائلة rho (Daub وآخرون.، 2001 بالازو وآخرون.، 2001). يمكن أن تنظم فسفرة MAPs جوانب فرعية مختلفة من سلوك الأنابيب الدقيقة في مخروط النمو ، مثل تجميع الأنابيب الدقيقة في العمود ، وعدم الاستقرار الديناميكي للأنابيب الدقيقة الرائدة ، وتنشيط كاسحات التوبولين مثل stathmin ، والتثبيت عند جهات الاتصال البؤرية. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتفاعل MAPs مع مكونات أخرى غير الأنابيب الدقيقة مثل الهيكل الخلوي أكتين (Griffith and Pollard ، 1982 DiTella وآخرون.، 1994 كننغهام وآخرون.، 1997 أوزير وهالبين ، 2000). قد يفسر هذا سبب وجود تأثيرات متداخلة للكينازات المختلفة على سلوك مخروط النمو ، ويفترض أنه استجابة لإشارات خارجية مختلفة لا يزال يتعين توضيح طبيعتها.


شاهد الفيديو: Is Het Verstandig om Proteïnepoeder te Gebruiken? (ديسمبر 2022).