معلومة

ما الذي ترمز إليه الاختصارات في أسماء الخلايا العصبية الرشيقة؟

ما الذي ترمز إليه الاختصارات في أسماء الخلايا العصبية الرشيقة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في هذا الموقع ، أرى مجموعة متنوعة من الأسماء المختصرة لـ جيم الرجلين الخلايا العصبية ولكن ماذا تعني هذه الأسماء (على سبيل المثال AVAL ، AVAR)؟


لسوء الحظ ، لا يبدو أن هناك تسمية منهجية للغاية. بعض الحروف عبارة عن اختصارات بينما يصف البعض الآخر فئة من الخلايا العصبية. عادةً ما يصف الحرفان V و D النظير البطني والظهري لزوج من الخلايا العصبية. الشيء نفسه ينطبق على L و R (اليسار واليمين).

تقوم هذه القائمة بتسمية جميع الخلايا العصبية C. elegans ويمكنك أن ترى ذلك ، على سبيل المثال ، "صعمل أناnterneurons "أو متبدأ الخلايا العصبية الحركية بـ RI أو RM. "أنانر لأبيال "أو"االرحم لتسمى الخلايا العصبية الأبوية IL أو OL. تبدأ الخلايا العصبية الحركية للحبل البطني بـ V وتسمى فئاتها المختلفة VA و VB و VC و VD بالإضافة إلى رقم. يتم تحديد الفئات حسب أصول النسب أو الأسباب التاريخية ؛) وهناك الكثير من الاستثناءات لهذه القواعد ، لأن أسمائها التاريخية تظل على الرغم من استمرارنا في معرفة المزيد عن هذه الخلايا العصبية.

المثال AVAL / AVAR عبارة عن عصبونات داخلية للحبل البطني. إنهم يشكلون فئة مع عصبونات أخرى في الحبل البطني تسمى AVB و AVD و AVE. لذا ، فإن الحرفين الأولين يشيران إلى الفئة الرئيسية ، والحرف الثالث إلى الفئة الفرعية. يشير الحرفان L أو R إلى العضو الأيمن والأيسر لهذا الزوج.

أخبرني بعض الأصدقاء العاملين في علم الأعصاب C. elegans أنك في الأساس تعامل رموز الأحرف هذه كأسماء فردية للخلايا العصبية دون القلق بشأن أصلها ومعناها أكثر من اللازم.


منظمة الساعة الرملية أنواع معينة انيقة عصبية

قسم الانتماءات الوراثة المعقدة للسمات ، مركز علم الأعصاب والأبحاث المعرفية ، أمستردام علم الأعصاب ، جامعة فريجي أمستردام ، أمستردام ، هولندا ، قسم علم الوراثة السريرية ، المركز الطبي بجامعة أمستردام ، أمستردام علم الأعصاب ، أمستردام ، هولندا

تصور الأدوار ، المنهجية ، الإشراف ، الكتابة - المسودة الأصلية

مدرسة الانتساب لعلوم الكمبيوتر ، معهد جورجيا للتكنولوجيا ، أتلانتا ، جيوجريا ، الولايات المتحدة الأمريكية


المقدمة

على عكس المادة غير الحية ، طورت الكائنات الحية آليات مختلفة للاستشعار والاستجابة لتقلبات الظروف البيئية ، خاصة عندما تصبح هذه التقلبات غير مواتية للغاية (عادة ما يتم تحديدها على أنها ظروف إجهاد). سيسمح الدخول في حالة نائمة أثناء الراحة لبعض الكائنات الحية بمقاومة الظروف المعاكسة بشكل فعال ، وبالتالي ، تم تبنيها كاستراتيجية بقاء مشتركة من قبل كل من بدائيات النوى (على سبيل المثال., بكتريا قولونية و مرض السل) وحقيقيات النوى (على سبيل المثال. ، الخمائر ، ciliates ، والديدان الخيطية).

لوحظ منذ فترة طويلة دخول العديد من الحيوانات إلى حالة غير نشطة ، تُعرف باسم السبات ، خلال فصل الشتاء عندما يكون توافر الغذاء محدودًا. البيض المخصب لديدان التربة C. ايليجانس يتطور بشكل طبيعي إلى مرحلة البلوغ والنضج التناسلي في غضون 3-5 أيام ، بعد المرور بسرعة عبر مراحل اليرقات من L1 إلى L4 ، ويطرح الريش في نهاية كل مرحلة. مع ذلك، C. ايليجانس قادر أيضًا على الدخول إلى حالة الهدوء ، المعينة باسم dauer (كلمة ألمانية تعني "دائم أو مستمر") ، عادةً في نهاية مرحلة اليرقة L2 (أو أقل شيوعًا من L1) ، في ظل ظروف قاسية مثل عدم وجود الغذاء ، أو الكثافة السكانية العالية ، أو زيادة درجة الحرارة (انظر الشكل 1) (2 ، 3). دولة الداور تسمح بذلك C. ايليجانس للبقاء على قيد الحياة بشكل عام لمدة تصل إلى 120 يومًا (بدلاً من 20 يومًا العادية!) ، بالإضافة إلى الانتشار الفعال عبر الفرس (العلاقة التي ينقل فيها كائن حي كائنًا آخر من نوع مختلف) إلى مكان أكثر ملاءمة.

دورة حياة C. ايليجانس. Dauer هي مرحلة يرقات بديلة ، تؤخذ عندما تكون الظروف البيئية غير مواتية لمزيد من النمو. يبدو أن يرقات Dauer لا تتقدم في العمر ويمكن أن تعيش ما يقرب من 10 أضعاف عمرها الطبيعي (حوالي 20 يومًا). يشار إلى طول الوقت الذي يقضيه الحيوان في مرحلة معينة.

يمكن تمييز يرقات الداور بسهولة عن مراحل النمو الأخرى من خلال تقديم حالة مقاومة معاكسة وموفرة للطاقة: تتوقف الحيوانات عن تناول أي طعام ، وتبدو رقيقة وكثيفة ، وعادة ما تظل بلا حراك ، ولكنها يمكن أن تستجيب بشكل ملحوظ لبعض المحفزات. أيضًا ، تمتلك يرقات dauer غير المغطاة سلوكًا خاصًا بـ dauer يُعرف باسم nictation ، حيث تقوم اليرقة بإسقاطها وتقف على ذيلها ، وتلوح برأسها في الهواء. ترتبط حالة الداور أيضًا بالتعليق التنموي للأعضاء التناسلية. عند العودة إلى ظروف معيشية مواتية ، تخرج اليرقة من حالة dauer وتستأنف عملية التطور الطبيعي عن طريق الدخول أولاً إلى مرحلة اليرقة L4. كانت الدراسات الجينية فعالة جدًا في تحديد الجينات التي تعمل طفراتها إما على تعزيز أو كبت تكوين dauer. ومع ذلك ، لا تزال الدراسات البيوكيميائية لفهم كيفية مشاركة البروتينات المشفرة بالفعل في عملية تكوين Dauer وتوليد التحولات المورفولوجية والتمثيل الغذائي الدراماتيكية نادرة. تؤكد هذه المراجعة على التقدم الذي تم إحرازه حتى الآن في فهم العملية البيوكيميائية لتشكيل داوير.


2. أساسيات C. ايليجانس

2.1. النمو والصيانة

C. elegans ، على الرغم من أنها غالبًا ما يتم وصفها بشكل خاطئ على أنها نيماتودا في التربة ، إلا أنه يمكن عزلها بسهولة عن المواد النباتية المتعفنة ، والتي تحتوي على مصدر غذاء بكتيري وافر (Barri & egravere and F & eacutelix 2014). في المختبر ، تُزرع الحيوانات بشكل طبيعي على ألواح أجار تحتوي على حشيش من بكتيريا Escherichia coli. بمجرد أن تستنفد الحيوانات البكتيريا ، فإنها تستخدم مخزونها من الدهون. بدون طعام ، يتم إيقاف نمو حيوانات مرحلة اليرقات الصغيرة. نتيجة لدخول هذا الركود ، يمكن للحيوانات البقاء على قيد الحياة لمدة شهر على الأقل (غالبًا ما يمكن الاحتفاظ باللوحات المتعطشة بشكل مفيد لمدة تصل إلى ستة أشهر عند 15 درجة) ، وكمخزون ، فإنها لا تتطلب إطعامًا مستمرًا. كلما دعت الحاجة إلى نمو حيوانات صحية ، يمكن نقل قطعة أجار من اللوحة القديمة إلى صفيحة جديدة بها بكتيريا. تنتقل الحيوانات إلى البكتيريا الجديدة وتستأنف نموها.

العديد من الميزات الأخرى تسهل بشكل كبير صيانة مخزونات C. elegans واستخدامها التجريبي. أولاً ، نظرًا لأن C. elegans هي خنثى ذاتية الإخصاب (انظر القسم التالي) ، يمكن لحيوان واحد أن يملأ طبقًا. ثانيًا ، يمكن تجميد أعداد الحيوانات لسنوات وإحيائها عند الحاجة. ثالثًا ، الحجم الصغير للحيوان يعني أنه يمكن للكثير أن ينمو في مساحة صغيرة. رابعًا ، يمكن تربية الحيوانات في درجات حرارة تتراوح من 12 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية10 للنمو

2 (أي زيادة 10 درجة تسرع النمو مرتين). النمو في درجات حرارة مختلفة يجعل من الممكن التحكم في معدل نمو الحيوان ويساعد في عزل واستخدام المسوخات الحساسة للحرارة. النمو المستمر فوق 25 درجة غير ممكن لأن الحيوانات تصبح عقيمة. يمكن أن يكون الحد الأعلى لدرجة الحرارة مشكلة إذا تم الاحتفاظ بالحيوانات على أسطح مقاعد (بدلاً من حاضنات يمكن التحكم في درجة حرارتها) في غرف دافئة جدًا. من الممكن التعرض لأقصر لدرجات حرارة أعلى لتجارب الصدمة الحرارية ولزيادة إنتاج الذكور (Sulston and Hodgkin 1998). خامسًا ، يمكن مزامنة الحيوانات عن طريق عزل اليرقات التي فقسها حديثًا أو عن طريق معالجة الحشرات البالغة بالحامل باستخدام مادة التبييض (التي تعمل على إزالة التلوث عن طريق قتل كل شيء ما عدا الأجنة) وعزل البيض المقاوم للعلاج بالتبييض. سادساً ، لتسهيل الدراسات البيوكيميائية ، يمكن تربية الحيوانات بكميات كبيرة في وسط سائل. & # 8221 فارز الدودة & # 8221 مثل أداة الفرز الحيوي COPAS متاحة أيضًا لتحديد كميات كبيرة من الديدان الفردية ذات الخصائص المرغوبة بسرعة. أخيرًا ، لا يحتاج المرء إلى معدات باهظة الثمن بشكل خاص بخلاف مجهر تشريح جيد ومجهر مركب للعمل مع هذا الحيوان. بشكل عام ، الحيوانات غير مكلفة وملائمة للصيانة.

2.2. الأشكال الجنسية وأهميتها

النوع البري C. elegans له شكلين جنسيين: خنثى ذاتية الإخصاب وذكور (الشكل 2 والشكل 3 ، A و B). تشكل مناسل الخنثى بويضة تنتج أولاً الحيوانات المنوية أحادية الصيغة الصبغية التي يتم تخزينها في الحيوانات المنوية في المرحلة L4 ثم بالقرب من مرحلة البلوغ ، يقوم خط الجرثومة بتحويل مصيرها لإنتاج بويضات أكبر بكثير. المخنثين بشكل أساسي هم الإناث التي تنتج الغدد التناسلية الحيوانات المنوية مؤقتًا قبل أن تنتج البويضات. يمكن أن ينتج الخنثى ما يصل إلى 300 ذرية ذاتية يتم تخصيبها بواسطة الحيوانات المنوية المخزنة. إذا تزاوج مع الذكور ، فإن المخنثين قادرون على الإنتاج

1000 نسل ، مما يشير إلى أن الحيوانات المنوية التي ينتجها خنثى هي عامل مقيد في الإخصاب الذاتي. كلا الجنسين ثنائي الصبغيات للكروموسومات الصبغية الخمسة. تختلف الجنسين في أن الخنثى لديهم اثنين من الكروموسومات X والذكور لديهم كروموسوم X واحد & # 8212 C. elegans لا يحتوي على كروموسوم Y & # 8212 ويشار إلى النمط الجيني للذكور باسم XO. يتم تحديد الجنس من خلال نسبة X إلى صبغي (X: A) (Zarkower 2006). غالبية النسل الناتج عن الإخصاب الذاتي هم من خنثى فقط 0.1-0.2 ٪ من النسل هم من الذكور بسبب عدم انفصال الكروموسوم X النادر. نظرًا لأن المخنثين يصنعون حيواناتهم المنوية الخاصة بهم ، في التهجينات الوراثية ، يجب تمييز النسل الذاتي (البويضات المخصبة بواسطة الحيوانات المنوية للخنثى) عن النسل المتصالب. على سبيل المثال ، عندما تتزاوج الخنثى متماثلة اللواقح لطفرة متنحية تسبب نمطًا ظاهريًا متحورًا مرئيًا مع ذكور من النوع البري ، يُظهر الخنثى ذرية ذاتيًا النمط الظاهري الطافرة والخنثى عبر النسل لا تفعل ذلك.

الشكل 3. جيم ايليجانس تشريح. يتم عرض السمات التشريحية الرئيسية للخنثى (أ) والذكور (ب) بشكل جانبي. (أ) يعمل الحبل العصبي الظهري (DNC) والحبل العصبي البطني (VNC) على طول الحيوان بأكمله من الحلقة العصبية. يظهر اثنان من الأرباع الأربعة لعضلات جدار الجسم. (ب) يتم حذف الجهاز العصبي والعضلات في هذا الرأي ، مما يكشف بشكل أوضح عن البلعوم والأمعاء. (C) المقطع العرضي عبر المنطقة الأمامية من C. elegans hermaphrodite (موقع مميز بخط أسود في A) يُظهر أرباع العضلات الأربعة المحاطة بالبشرة والجلد مع الأمعاء والغدد التناسلية الموجودة داخل التجويف الكاذب الكاذب. الصور معدلة من تلك الموجودة في www.wormatlas.org (Altun et al.2002-2015).

توفر خنثى الإخصاب الذاتي العديد من المزايا للتحليل الجيني. أولاً ، يُبسط الإخصاب الذاتي (غالبًا ما يشار إليه باسم الإخصاب الذاتي) الاحتفاظ بالمخزونات لأن حيوانًا واحدًا يمكن أن يؤدي إلى ظهور مجموعة كاملة. ثانيًا ، كما كتب سيدني برينر (1974) ، & # 8220 ، يتم دفع الحيوانات إلى تماثل الزيجوت ، & # 8221 أي تميل مجموعات الخنثى إلى فقدان متغايرة الزيجوت (لأن الخنثى لا يمكنها التزاوج مع خنثى أخرى). وبالتالي ، فإن السلالات التي يتم تحويرها تكون متجانسة في الأساس. ثالثًا ، تتبع الذات القواعد المندلية القياسية للفصل العنصري ، لذا فإن الوالد الذي يكون متغاير الزيجوت لسمة متنحية سينتج النمط القياسي 1: 2: 1 للفصل ، بحيث يكون 25٪ من السلالة متماثلة اللواقح للأليل الطافر والعرض السمة المتنحية الجسدية. وبالتالي ، فإن التعرّف على الذات يقلل بشكل كبير من الجهد المطلوب للعثور على مثل هذه المسوخات. رابعًا ، لا يزال من الممكن الحفاظ على الطفرات المصابة بعيوب عصبية عضلية تضعف القدرة على التزاوج في المختبر. في الواقع ، 11 فقط من 302 خلية عصبية من الخنثى: ثمانية خلايا عصبية ADF و ASG و ASI و ASJ ، والتي عند قتلها كمجموعة تتسبب في أن تصبح الحيوانات يرقات داوير (Bargmann and Horvitz 1991) ، خليتا CAN ( Forrester and Garriga 1997) ، والخلايا العصبية M4 في البلعوم (Avery and Horvitz 1989) من المعروف أنها ضرورية لدعم التطور لمرحلة الإنجاب البالغة. خامسًا ، تسمح إمكانية بقاء الطفرات المعيبة بشدة وقدرتها على الإخصاب الذاتي بشاشات سهلة للطفرات المعدلة (المُحسِّن والقمع). كانت هذه الشاشات مفيدة وغنية بالمعلومات بشكل استثنائي. على سبيل المثال ، طفرات lin-12 (تم تحديد تسميات C. elegans في المربع 1) ​​معيبة في التطور الفرجي وتم تحديد مكونات مسار إشارات LIN-12 / Notch مع كل من شاشات القامع والمعزز (Greenwald and Kovall 2013).

المربع 1. جيم ايليجانس التسمية

تختلف التسمية الجينية من نوع لآخر. هنا ، نصف المصطلحات الرئيسية المستخدمة في أبحاث C. elegans. يمكن العثور على وصف أكثر اكتمالاً على http://www.wormbase.org/about/userguide/nomenclature.
لمحة عن التسمية 1 : تعريف
ZK154.3 تحديد الجينات المنهجي (3 rd ORF على cosmid ZK154)
ميك -7 اسم الجين (الشذوذ الحسي الميكانيكي السابع & # 8220 & # 8221 المسمى الجين)
ميك -7 (e1506) اسم أليل (من مختبر MRC للبيولوجيا الجزيئية - هـ)
MEC-7 اسم البروتين (منتج من جين ميك -7)
ميك النمط الظاهري (النمط الظاهري غير الطبيعي الحسي الميكانيكي)
e1506 أليل متماثل الزيجوت
e1506 / + أليل متغاير الزيجوت
دقيقة 30 الازدواجية (من مختبر هيرمان - مليون)
nDf6 النقص / الحذف (من معمل هورفيتز - ن)
مويس 35 التحوير المتكامل (من مختبر كينيون - مو)
evEx1 مجموعة الجينات غير الصبغية (من مختبر كولوتي - EV)
CB3270 اسم السلالة (من مختبر MRC للبيولوجيا الجزيئية - CB)
mec-7p :: gfp اندماج نسبي GFP (باستخدام مروج الجين فقط)
ميك -7 :: gfp اندماج GFP متعدية (حيث يتم إدخال gfp في تسلسل ترميز الجين)
ceh-6 (pk33 :: Tc1) إدخال Transposon (Tc1) في جين ceh-6
1 جميع أسماء جينات C. elegans وتسميات الأليل وجينات المراسل مكتوبة بخط مائل. الكوسميدات والبروتينات والأنماط الظاهرية وأسماء السلالات غير مكتوبة بخط مائل.
أسماء الطفرات (الأليل) : يتم تحديد أليل النوع البري لأي جين بعلامة زائد مائلة ، +. يتم تمثيل الأليلات الطافرة من خلال 1-3 أحرف صغيرة ، والتي تشير إلى مختبرات محددة ، متبوعة برقم. جميع رموز الجينات والأليل مائلة ، على سبيل المثال ، unc-54 و e678 و mn5. يتم تمثيل النمط الجيني متماثل الزيجوت بنسخة واحدة من اسم الأليل (e678). يشار إلى حالة غير متجانسة بشرطة مائلة ، على سبيل المثال ، e364 / + ، e364 / e1099. يشار إلى تشوهات الكروموسومات بحرف واحد أو حرفين بعد رمز المختبر ، على سبيل المثال ، mnDp30 هو تكرار ، nDf6 هو حذف (يسمى نقصًا) ، و szT1 هو إزفاء. يمكن إضافة حرف أو حرفين بعد اسم الأليل للإشارة إلى خصائص معينة تنقلها الطفرة على سبيل المثال حساسية درجة الحرارة (ts) ، كهرماني (amber) ، عائد (r) ، مهيمن (d) ، وشبه سائد (sd). عندما يكون للجين أكثر من طفرة ، مثل التي يمكن أن تنتج عن الارتداد داخل الجين لأليل متحور ، يشار إلى الطفرات القديمة والجديدة ، على سبيل المثال ، يمكن أن ينتج عن الارتداد داخل الجين لـ e1498 e1498u124r.
أسماء الجينات : يتم تحديد الجينات من خلال 3 أو 4 أحرف صغيرة ، وشرطة ، ورقم (كلها مائلة) ، على سبيل المثال lon-2 و إنش -1. لتمييز الأليلات من نفس الجين ، يتم وضع أسماء الأليل بين قوسين مع عدم وجود مسافة بين اسم الجين والأليل ، على سبيل المثال ، mec-7 (e1343) و mec-7 (e1506). تحصل الجينات التي تم تحديدها كإطار قراءة مفتوح (ORF) من خلال مناهج المعلوماتية الحيوية على تحديد جيني منهجي (على سبيل المثال ZK154.3) حتى تطالب الدراسات اللاحقة بإعطائها اسمًا جينيًا. يشار إلى منطقة المروج المنبع للجين باسم الجين متبوعًا بـ & # 8220p. & # 8221 يتم فصل المروج وأسماء ترميز البروتين بواسطة نقطتين كأجزاء من بروتينات الاندماج. وبالتالي ، فإن الجين الذي يشفر الاندماج الترجمي MEC-7 :: GFP مدفوعًا من مروج mec-7 سيكون mec-7 :: gfp ، في حين أن الانصهار النسخي mab-5 سيكون mab-5p :: gfp. يتم عرض إدخال الينقولات في الجين بشكل مشابه باستخدام اسم الينقولات ونقطتين ، على سبيل المثال ، unc-22 :: Tc1 [معظم الينقولات C. elegans تحمل علامة Tc (الينقولات ، Caenorhabditis) ورقم].
الأنماط الظاهرية : يتم تحديد الأنماط الظاهرية المتحولة من خلال اسم الجين غير المائل بدون شرطة ورقم ومع الحرف الأول بأحرف كبيرة ، على سبيل المثال ، حيوانات Unc أو Sma غير منسقة أو صغيرة في حجم الجسم.
منتجات الجينات : يتم تعيين الحمض النووي الريبي بواسطة اسم الجين المائل يتم تعيين البروتينات بواسطة اسم الجين في جميع الأحرف الاستهلالية وليس مائلًا (MEC-7). في بعض الأحيان يشار إلى تغييرات محددة في الأحماض الأمينية.
أسماء السلالة : حرفان كبيران ورقم ، على سبيل المثال. CB429 و TU38 ، يعينان سلالة تحتوي على واحد أو أكثر من الاختلافات الجينية. تشير الحروف إلى المختبر الذي أنشأ السلالة (http://www.cbs.umn.edu/research/resources/cgc/lab-head). لم يتم كتابة أي من هذه الرموز بخط مائل. نظرًا لأن سلالة معينة يمكن أن تحمل أكثر من طفرة واحدة ، يمكن اعتبار أسماء السلالات اختصارًا لوصف الحيوانات التي تحمل أنماطًا وراثية معقدة. يتم سرد الجينات (و / أو الأليلات) في السلالات ذات الطفرات المتعددة في الكروموسوم ثم ترتيبها مع الجينات الموجودة على نفس الكروموسوم مفصولة بمسافات وجينات على كروموسومات مختلفة مفصولة بنصف نقطتين. يمكن أيضًا تضمين الاسم المائل للكروموسوم ، على سبيل المثال ، lon-2 (e678) mec-7 (e1506) X و unc-54 myo-3 و e364 e66 u38 / szT1. szT1 هو واحد من العديد من كروموسومات الموازن التي غالبًا ما تستخدم للحفاظ على الطفرات القاتلة مثل الزيجوت المتماثلة الزيجوت ولكنها قابلة للحياة مثل الزيجوت متغايرة الزيجوت. بالنسبة للسلالات التي تحتوي على جينات المراسل ، هناك نوعان من التعيينات النموذجية. يتم تسمية المراسلين لمختبرات محددة مشابهة للأليلات الطافرة ، ويتم تسميتهم أيضًا وفقًا لما إذا كان الجين المراسل يتم الاحتفاظ به خارج الصبغيات على مصفوفة متعددة النسخ باستخدام علامة & # 8220Ex & # 8221 (على سبيل المثال ، evEx1) أو يتم الاحتفاظ بها من خلال دمج التسلسل ( في معظم الحالات بشكل عشوائي) في الجينوم باستخدام تسمية & # 8220Is & # 8221 (على سبيل المثال muIs35).

تعتبر الذكور مهمة لأنها تسمح بتبادل المواد الجينية اللازمة لتكوين حيوانات ذات تركيبات وراثية مختلفة ورسم خرائط للجينات. في الواقع ، تطور الحيوان للاستفادة من المساهمة الجينية للذكور النادرة باستخدام الحيوانات المنوية الذكرية (outcross) قبل استخدام الحيوانات المنوية خنثى (ذاتية) (Ward and Carrel 1979). وبالتالي ، إذا كان الذكور قادرين على التزاوج ، فإن السلالة المتصالبة تسود (لمساعدة الذكور في العثور على خنثى ، يستخدم الباحثون ألواح بتري مع بقعة صغيرة من البكتيريا).

2.3 دورة الحياة

يستغرق التطور الجنيني لـ C. elegans حوالي 16 ساعة عند 20 درجة (جميع الأوقات اللاحقة هي أيضًا للتطور عند 20 درجة) (الشكل 2). تُصنع قشرة بيضة غير منفذة تقريبًا بعد الإخصاب ، مما يسمح للجنين بالتطور بشكل مستقل تمامًا عن الأم. ومع ذلك ، عادة ما يتم الاحتفاظ بالأجنة داخل خنثى حتى مرحلة 24 خلية تقريبًا في الوقت الذي يتم فيه وضعهم. يفقس الجنين الخنثى مع 558 نواة (بعض النوى في مخلوي متعدد النواة ، لذلك يكون عدد الخلايا أقل) ويصبح المرحلة الأولى (L1) يرقة. تبدأ الحيوانات في الأكل وتتطور من خلال أربع مراحل يرقات (L1-L4). المرحلة L1 هي

16 ساعة في المراحل الأخرى

12 ساعة طويلة. تنتهي كل مرحلة بفترة خمول تشبه النوم تسمى الخمول (Raizen et al. 2008) حيث تتكون بشرة جديدة (الطبقة الخارجية الكولاجينية). ينتهي Lethargus بطرح الجلد القديم. بعد حوالي 12 ساعة من تساقط السائل المنوي L4 ، يبدأ الخنثى البالغون في إنتاج ذرية لمدة 2-3 أيام حتى يتمكنوا من استخدام جميع الحيوانات المنوية المنتجة ذاتيًا ، ويمكن إنتاج ذرية إضافية إذا كان تزاوج خنثى مستنفد للحيوانات المنوية مع ذكر. بعد فترة الإنجاب ، يمكن أن تعيش المخنثين عدة أسابيع أخرى قبل أن تموت من الشيخوخة.

عندما تنضب البكتيريا وتزدحم الحيوانات ، تقوم يرقات L2 بتنشيط دورة حياة بديلة (Hu 2007) وتطرح في مرحلة يرقات L3 بديلة تسمى & # 8220dauer & # 8221 يرقة (& # 8220dauer & # 8221 باللغة الألمانية تعني & # 8220last " تتم معالجة الإشارة فعليًا بواسطة حيوانات L1 ، لكن نتائجها لا تظهر حتى ما يسمى & # 8220L2d & # 8221 stage Golden and Riddle 1984). يحيط بشرة اليرقة الدائرية الحيوان تمامًا ويسد الفم ويمنع الحيوان من الأكل و مما يوقف التطور. عززت بشرة الداور مقاومة المواد الكيميائية ، لذلك فهي توفر حماية أكبر للداور ضد الضغوط البيئية والعوامل الكاوية. يمكن أن تعيش يرقات الداور لعدة أشهر وهي الشكل الأكثر شيوعًا في البرية. يتم نقل اليرقات إلى صفائح بها البكتيريا ، وتلقي بسدادات الفم ، وتقلل ، وتستمر في نموها على شكل يرقات L4 مختلفة قليلاً.


الفحص المجهري للتوسع C. ايليجانس

4.5x توسع خطي) عن طريق تورم الخواص للأنسجة المعالجة كيميائياً والمضمنة بالهيدروجيل. ExM من C. ايليجانس يتم تحديها من خلال بشرة ، والتي تكون قاسية وغير منفذة للأجسام المضادة. نقدم هنا استراتيجية توسيع C. ايليجانس (إكسيل) ، لتوسيع ثابتة ، سليمة C. ايليجانس. يتيح ExCel قراءة متزامنة للبروتينات الفلورية ، والحمض النووي الريبي ، وموقع الحمض النووي ، والهياكل التشريحية بدقة

65-75 نانومتر (3.3-3.8x توسع خطي). قمنا أيضًا بتطوير ExCel الحافظ للحلقة ، والذي يتيح تصوير البروتينات الداخلية الملطخة بالأجسام المضادة ، و ExCel التكراري ، والذي يتيح تصوير البروتينات الفلورية بعد التوسع الخطي بمقدار 20 ضعفًا. نوضح فائدة صندوق أدوات ExCel لرسم خرائط للبروتينات المتشابكة ، لتحديد البروتينات التي لم يتم الإبلاغ عنها سابقًا عند تقاطعات الخلايا ، ولتحليل التعبير الجيني في خلايا عصبية فردية متعددة لنفس الحيوان.

الكلمات الدالة: ايليجانس تطور علم الأحياء المجهري التعبير الجيني الكيمياء الهيستولوجية المناعية في موقع علم الأعصاب التهجين فائقة الدقة المشابك التصويرية.

بيان تضارب المصالح

CY ، AW ، AS ، FC هو مخترع مشارك في براءات الاختراع المتعلقة بالمجهر التوسعي: WO2015127183A2 ، US20170089811A1 ، US20160305856A1 ، US20170067096A1 ، US20160304952A1 ، WO2017147435A1 ، US20190256633A8 ، و WAO12013 أعلن ، محرر مراجعة OH ، eLife ، EB هو مخترع مشارك في براءات الاختراع المتعلقة بالمجهر التوسعي: WO2015127183A2 ، US20170089811A1 ، US20160305856A1 ، US20170067096A1 ، US20160304952A1 ، WO2017147435A1 ، US201902566O20A1 ، مؤسس الشركة من الفحص المجهري للتوسع.

الأرقام

الشكل 1 .. سير العمل للتوسع ج ...

الشكل 1 .. سير العمل للتوسع C. ايليجانس (ExCel) معالجة العينات.

الشكل 2 .. يتيح ExCel تصورًا بوساطة الجسم المضاد لـ ...

الشكل 2 .. يتيح ExCel تصور البروتينات الفلورية بوساطة الأجسام المضادة.

( أ ) صور تمثيلية لـ ...

الشكل 3 .. الخواص من ExCel.

الشكل 3 .. الخواص من ExCel.

( أ ) صور تمثيلية لثابت بارافورمالدهيد ، وبيتا-مركابتوإيثانول مخفض ، ومعالج بـ AcX ، و ...

الشكل 3 - ملحق الشكل 1 .. تشويه محلي عند ...

الشكل 3 - ملحق الشكل 1 .. تشويه موضعي في منطقة الغدد التناسلية في اليوم الأول - اليوم ...

الشكل 3 - ملحق الشكل 2 .. تشويه محلي عند ...

الشكل 3 - الشكل الملحق 2 .. تشويه موضعي في منطقة الفم.

صور تمثيلية لمناطق الفم ...

الشكل 4 .. تلطيخ NHS-ester بعد ExCel يكشف عن تشريحي ...

الشكل 4 .. يكشف تلطيخ NHS-ester بعد ExCel عن الهياكل التشريحية.

صور تمثيلية لـ ( أ ) بلعومي ...

الشكل 5 .. يتيح ExCel قراءة متزامنة لـ…

الشكل 5 .. يتيح ExCel قراءة متزامنة للبروتينات الفلورية ، والحمض النووي الريبي ، وموقع الحمض النووي ، والخصائص التشريحية.

الشكل 6 .. تصوير فائق الدقة للبروتينات المشبكية ...

الشكل 6 .. تصوير فائق الدقة للبروتينات المشبكية باستخدام ExCel.

( أ ) صور تمثيلية لـ ...

الشكل 7 .. تصوير فائق الدقة للمشابك الكهربائية ...

الشكل 7 .. تصوير فائق الدقة للمشابك الكهربائية باستخدام ExCel.

صور تمثيلية لبروتين إنكسين تنصهر TagRFP ...

الشكل 8 .. كشف الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية.

الشكل 8 .. كشف الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية.

معالج ExCel (ثابت بالفورمالديهايد ، β- مركابتوإيثانول مخفض ، معالج LabelX و AcX ، هيدروجيل مضمن ، بروتين K مهضوم ...

الشكل 9 .. كشف الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية ، في ...

الشكل 9 .. كشف الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية ، بدقة شبه خلوية.

صور تمثيلية لمعالجتها ExCel (ثابت بالفورمالديهايد ، β-mercaptoethanol-مخفض ، ...

الشكل 10 .. القرار الكمي الحمض النووي الريبي واحد قرار الخلايا العصبية.

الشكل 10 .. القرار الكمي الحمض النووي الريبي واحد قرار الخلايا العصبية.

( أ ) ممثل معالج ExCel (ثابت بالفورمالديهايد ، β- مركابتوإيثانول مخفض ، LabelX- ...

الشكل 11 .. شاشة من علاجات ما بعد التجلط التي ...

الشكل 11 .. شاشة من علاجات ما بعد التجلط والتي تمنح قابلية تمدد الأنسجة واستقرار عام للحلقات.

الشكل 12 .. الكيمياء الهيستولوجية المناعية بعد علاجات مختارة بعد التكوّن.

الشكل 12 .. الكيمياء الهيستولوجية المناعية بعد علاجات مختارة بعد التكوّن.

( أ ) نسبة الإشارة إلى الضوضاء المقدرة للتأثير المناعي ...

الشكل 13 .. سير العمل لتوسيع الحفاظ على الحاتمة لـ ...

الشكل 13 .. سير العمل لتوسيع حاتمة الحفاظ على C. ايليجانس (ExCel الحفاظ على حاتمة) معالجة العينات.

70٪ مقدرة من نتائج التلقيح المناعي من لوحة 12 من الأجسام المضادة غير IgM في الشكل 12 أ). معالجة العينة قبل اللوحة A مطابقة لسير العمل لبروتوكول ExCel القياسي بدون ExFISH (كما هو موضح في الأسهم الزرقاء في الشكل 1) حتى ، بما في ذلك ، خطوة الهلام (الشكل 1A-C ، E-G). يظهر عامل التمدد الخطي لمركب عينة هيدروجيل بين قوسين. بالنسبة للمراحل التي يتوسع فيها نسيج الدودة إلى حد أقل من الهيدروجيل المحيط ، والذي يحدث بسبب التجانس غير الكامل للقوة الميكانيكية لنسيج الدودة الثابتة ، تظهر عوامل تمدد الدودة والهيدروجيل أمام وبعد علامة مائلة ، على التوالي. (أ-ل) خطوات البروتوكول ، مع النص الغامق الذي يشير إلى عنوان الخطوة. (أ) يتم إجراء بلمرة الهيدروجيل على العينة ، عن طريق احتضان العينات أولاً في محلول المونومر المنشط (0.015٪ 4-hydroxy-TEMPO ، 0.2٪ TEMED ، 0.2٪ APS ، بالإضافة إلى محلول المونومر غير المنشط) لمدة ساعة واحدة عند 4 درجة مئوية ، ونقل العينات إلى غرفة الهلام ، واحتضان الغرفة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. أثناء البلمرة ، يتم ربط البروتينات المعدلة بواسطة AcX تساهميًا في شبكة الهيدروجيل. (ب) يتم التعامل مع العينات باستخدام كولاجيناز من النوع السابع المنقى بالكروماتوغرافيا عند 0.5 كيلو / مل ، في محلول ملحي يحتوي على الكالسيوم (100 ملي تريس أس هيدروجيني 8.0 ، 500 ملي كلوريد الصوديوم ، 40 ملي كلوريد الصوديوم2) بين عشية وضحاها (18-24 ساعة) عند 37 درجة مئوية. خلال هذا العلاج ، يتمدد هيدروجيل

1.2x خطيًا ، في حين أن حجم الدودة يقل قليلاً إلى

0.9x خطيًا. نظرًا لعدم التطابق في عامل التمدد بين الدودة والهلام ، ينفصل نسيج الدودة عن الهيدروجيل المحيط ، لكنه يظل فعليًا في قالب الهيدروجيل المصنوع من شكله الخاص أثناء خطوة تكوين الهلام في A. (ج) تتم معالجة العينات بمعالجة التمسخ ، حيث يتم تحضينها في مخزن مؤقت لتغيير طبيعة البروتين متوسع إلى الحد الأدنى (محلول MAP5 50 ملي مولار تريس الأس الهيدروجيني 9.0 ، 5.72٪ (وزن / وزن) كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 400 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 20 ملي كاكل2) بين عشية وضحاها (18-24 ساعة) عند 37 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها (18-24 ساعة) عند 70 درجة مئوية ، وساعتين عند 95 درجة مئوية. يتم استخدام تراكيز منخفضة من الكالسيوم وكلوريد الصوديوم في هذا المخزن المؤقت ، مقارنة بالمحاليل غير المتوسعة الأخرى المصممة في هذا الورق ، نظرًا لعدم قابليتها للذوبان مع SDS بتركيزات أعلى. (د) تُغسل العينات أربع مرات في محلول ملحي مخزّن من تريس (TNC40020 (تُستخدم الاختصارات في البروتوكولات التكميلية في الملحق 1) المخزن المؤقت 50 مم تريس درجة الحموضة 8.0 ، 400 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي كلوريد الصوديوم2) لإزالة SDS من عينة هيدروجيل. تُغسل العينات بعد ذلك أربع مرات في محلول ملحي مخزّن من تريس مع تقليل تركيز الكالسيوم (مرة واحدة باستخدام TNT Buffer + 10 ملي مولار CaCl2، ثم ثلاث مرات مع TNT Buffer TNT Buffer هو 50 ملي تريس درجة الحموضة 8.0 ، 1 مول كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ تريتون X-100) لإزالة أيونات الكالسيوم من عينة الهيدروجيل. أخيرًا ، يتم غسل العينات بمحلول ملحي فوسفاتي مع تقليل تركيز كلوريد الصوديوم (مرة واحدة باستخدام PBST + 500 ملي كلوريد الصوديوم ، مرتين مع PBST PBST هو 1x PBS + 0.1 ٪ Triton X-100). (ه) يتم تحصين العينات بالأجسام المضادة الفلورية ضد المستضدات المستهدفة. (F) تم تحضين العينات باستخدام AcX بتركيز 0.1 مجم / مل في PBST (1x PBS + 0.1٪ Triton X-100) طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة. تزود هذه الخطوة البروتينات ، بما في ذلك الأجسام المضادة الفلورية التي تم إدخالها في E ، بشق بوليمر قابل للإرساء. (جي) يتم تحضين العينات في محلول مونومر G2 غير نشط (50 ملي مابس درجة الحموضة 7.0 ، 2 م كلوريد الصوديوم ، 7.5٪ (وزن / وزن) أكريلات الصوديوم ، 2.5٪ (وزن / وزن) أكريلاميد ، 0.15٪ (وزن / وزن) N ، N'-methylene-bis-acrylamide) طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، لضمان الانتشار الكامل لمحلول المونومر في جميع أنحاء العينة ، قبل تفاعل الهلام. (ح) يتم إعادة دمج العينات في هيدروجيل ثانٍ قابل للتوسيع ، عن طريق احتضان العينات في محلول المونومر المنشط (0.015٪ 4-hydroxy-TEMPO ، 0.2٪ TEMED ، 0.2٪ APS ، بالإضافة إلى محلول المونومر غير المنشط) لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ونقل العينات إلى غرفة الهلام ، واحتضان الغرفة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. أثناء البلمرة ، يتم تثبيت الأجسام المضادة الفلورية المعدلة بواسطة AcX تساهميًا في شبكة الهيدروجيل للهيدروجيل الثاني (الشبكات البرتقالية). نحن نستخدم الشبكات الزرقاء لتمثيل شبكة هيدروجيل أول هيدروجيل DATD المتشابك (أي الشبكة المركبة في اللوحة أ) ، لتمييزها عن شبكة هيدروجيل إعادة التضمين الثاني. (أنا) يتم معالجة العينات باستخدام بروتيناز K بمعدل 8 وحدات / مل ، في محلول هضم غير متوسع (50 ملي مولار تريس pH 8.0 ، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 40 ملي كلوريد الصوديوم2، 0.1٪ Triton X-100) بين عشية وضحاها (18-24 ساعة) عند درجة حرارة الغرفة ، لزيادة تقليل القوة الميكانيكية للنسيج الدودي الأصلي والسماح بتمدد أكبر. خلال هذا العلاج التحلل للبروتين ، تفقد معظم البروتينات القدرة على الاستضداد ، ولكن يتم الاحتفاظ ببعض إشارات الفلورسنت من البروتينات الفلورية المثبتة على AcX ، كما هو مستخدم في بروتوكول ProExM الأصلي. (ي) يتم التعامل مع العينات بمحلول تشقق DATD (20 ملي مولار ميتا-دورتات الصوديوم في 1x PBS ، درجة الحموضة 5.5) لمدة 30 دقيقة عند RT ، لتفكيك هيدروجيل كيميائيًا الأول ، والذي يحتوي على الرابط المتشابك القابل للانقسام الدوري N ، N'-diallyl-tartardiamide (DATD) ، أثناء تجنيب الهيدروجيل الثاني ، والذي يحتوي على رابط متشابك مقاوم للدورات ، N ، N ، N-methylene-bis-acrylamide (bis). (ك) لتصور الميزات التشريحية ، يمكن تلطيخ العينات باستخدام إستر N-hydroxysuccinimide (NHS est) من صبغة الفلورسنت (المقدمة في النص الرئيسي ، الشكل 4 ، مقاطع الفيديو 1 و 2). يتم إجراء تلطيخ NHS-ester عند 5 ميكرومتر في PBST (1x PBS + 0.1 ٪ Triton X-100) بين عشية وضحاها في RT. يمكن تطبيق تلطيخ DAPI في هذه المرحلة ، لكن النتيجة لا تتوافق مع النمط النووي المتوقع كما هو ملاحظ في الأشكال 2 و 5 و 9 (انظر الشكل 13 - ملحق الشكل 1). (إل) يتم توسيع العينات بغسل واحد في 0.1x PBS وغسلتين في ماء منزوع الأيونات. في هذه المرحلة ، يتوسع الهيدروجيل

7.4x خطيًا ، بينما يتمدد نسيج الدودة بمقدار

2.8x خطيًا ، ضمن نطاق من 2.5 إلى 3.5x (متوسط ​​، 2.78x متوسط ​​، 2.83x n = 10 الهلاميات المائية المعالجة بشكل مستقل من مجموعتين من التجارب). بعد التوسع ، تكون العينات جاهزة للتصوير.

الشكل 13 - الشكل الملحق 1 .. تلطيخ DAPI بعد ...

الشكل 13 - الشكل الملحق 1 .. تلطيخ DAPI بعد إكسل للحفاظ على الحاتمة.

صور تمثيلية للحلقة الحافظة-المعالجة بـ ExCel (الفورمالديهايد الثابت ، β-mercaptoethanol-low ، ...

5 ميكرومتر ، في الوحدات البيولوجية) من الأنسجة ، وليس عبر الحيوان بأكمله ، من أجل تسهيل تصور نمط التلوين (نظرًا لأن الإسقاط الأقصى عبر الحيوان بأكمله سيحتوي على إشارات من طبقات متداخلة من النوى ، مما يعيق التفسير) . إعدادات السطوع والتباين: يتم ضبطها أولاً بواسطة وظيفة الضبط التلقائي في فيجي ، ثم ضبطها يدويًا (رفع الحد الأدنى للشدة وخفض الحد الأقصى للكثافة) لتحسين التباين. عامل التمدد الخطي: دودة ، 3.0–3.2x محيط هيدروجيل ، 7.6x. أشرطة مقياس: (أ ، ج) 5 μm (B, D) 1 μm (in biological units, i.e. post-expansion lengths are divided by the expansion factor of the worm).

Figure 14.. Isotropy of epitope-preserving ExCel.

Figure 14.. Isotropy of epitope-preserving ExCel.

( أ ) Representative images of paraformaldehyde-fixed, β-mercaptoethanol-reduced, AcX-treated,…

Figure 15.. Epitope-preserving ExCel allows multiplexed imaging…

Figure 15.. Epitope-preserving ExCel allows multiplexed imaging of endogenous proteins at nanoscale resolution.

Figure 16.. Super-resolution imaging of pre-synaptic active…

Figure 16.. Super-resolution imaging of pre-synaptic active and peri-active zones with epitope-preserving ExCel.

Figure 17.. Workflow for iterative expansion of…

Figure 17.. Workflow for iterative expansion of C. ايليجانس (iExCel) sample processing.

20x. Sample processing prior to Panel A is identical to the workflow for the standard ExCel protocol without ExFISH (as shown in blue arrows in Figure 1) until, and including, the post-Proteinase-K partial expansion step (Figure 1A–C, E–G). The linear expansion factor of the hydrogel-specimen composite is shown in parentheses. (A–I) Steps of the protocol, with the bold text indicating the title of the step. (أ) Specimens are partially expanded from a linear expansion factor of 1.0x to 1.8x, with the same protocol as shown in Figure 1I. (ب) Specimens are immunostained first with primary antibodies against fluorescent proteins in 5x SSCT overnight at 4°C, and then with secondary antibodies that have been conjugated to a 24-base DNA oligonucleotide, in DNA-conjugated Antibody Staining Buffer (2x SSC, 2% (w/v) dextran sulfate, 1 mg/mL yeast tRNA, 5%(v/v) normal donkey serum, 0.1% Triton X-100) overnight at 4°C. The DNA oligo is conjugated to the antibody at the 3’ end, and contains a gel anchorable group at the 5’ end. (ج) Specimens are expanded from a linear expansion factor of 1.8x to 3.8x, with the same protocol as shown in Figure 1M. (د) Specimens are re-embedded into another non-expandable hydrogel (‘Gel #2’) to lock up its size at the expanded state, as shown in Figure 1N, except that the monomer solution is replaced by DATD-crosslinked re-embedding monomer solution (10% acrylamide, 1% N,N'-diallyl-tartardiamide (DATD), 0.05% TEMED, 0.05% APS), which results in a hydrogel that can be later disintegrated via crosslinker cleavage, to allow full expansion of the final expandable gel. The DATD-crosslinked re-embedding monomer solution contains a charged molecule APS. Therefore, the linear expansion factor slightly drops from 3.8x to 3.6x during this step. During hydrogel polymerization, the DNA oligo on the antibody, which contains a gel-anchorable group, is covalently anchored to the second hydrogel network (orange grids). (ه) Specimens are incubated with a 100-base DNA oligonucleotide (‘Linker’), which hybridizes to the 24-base DNA oligo on the secondary antibodies, and which contains a gel anchorable group on its 5’ end, in iExCel hybridization buffer (4x SSC, 20% (v/v) formamide) overnight at RT. (F) Specimens are re-embedded into another expandable hydrogel (‘Gel #3’), by incubating the specimens in activated Gel #3 monomer solution (1x PBS pH 7.4, 7.5% (w/w) sodium acrylate, 2.5% (w/w) acrylamide, 0.15% (w/w) N,N’-methylene-bis-acrylamide, 2M NaCl, 0.015% 4-hydroxy-TEMPO, 0.2% TEMED, 0.2% APS) for 50 min at 4°C, transferring the specimens into a gelation chamber, and incubating the chamber for 2 hr at 37°C. During polymerization, the linker DNA oligo, which contains a gel-anchorable group, is covalently anchored to the hydrogel network of the third hydrogel (magenta grids). (جي) Specimens are treated with DATD cleaving solution (20 mM sodium meta-periodate in 1x PBS, pH 5.5) for 30 min at RT, to chemically disintegrate the first and the second hydrogels, which contain a periodate-cleavable crosslinker N,N'-diallyl-tartardiamide (DATD), while sparing the third hydrogel, which contains a periodate-resistant crosslinker N,N’-methylene-bis-acrylamide (bis). (ح) Specimens are incubated with a fluorophore-conjugated 15-base locked nucleic acid (LNA) oligonucleotide, which hybridizes to the 100-base linker DNA oligo at four locations, in iExCel hybridization buffer (4x SSC, 20% (v/v) formamide) overnight at RT. (أنا) Specimens are expanded to a linear expansion factor of

20x, with three washes in deionized water. After expansion, specimens are ready for imaging.


مقدمة

أنواع معينة انيقة is an important model system in biology, because of its tractable size (959 somatic cells in adult hermaphrodites), its genetic manipulability, and its optical transparency, which yields the possibility of whole-organism imaging of biological processes and signals. Perhaps not surprisingly, therefore, super-resolution microscopy has been useful to the analysis of C. ايليجانس, with studies applying STORM, PALM, SR-SIM, and STED to C. ايليجانس to investigate cells and tissues in both intact or dissected C. ايليجانس (Rankin et al., 2011 Gao et al., 2012 Vangindertael et al., 2015 He et al., 2016 Köhler et al., 2017 Krieg et al., 2017). However, the depths of imaging of such studies were largely physically limited to a few microns to tens of microns, insufficient to map the entire depth of an adult animal, and the hardware required for super-resolution microscopy is not available in all laboratories, and can be slow and/or expensive to deploy. Furthermore, the tough cuticle of C. ايليجانس presents a barrier to immunostaining in the intact animal, important for STORM and STED imaging and for the general labeling of proteins in a variety of scientific contexts.

Recently, we discovered that it is possible to isotropically expand biological specimens by permeating them evenly and densely with a swellable hydrogel polymer network, anchoring key biomolecules or labels to the hydrogel, softening the tissue through a chemical process, and then adding water, which swells the polymer and in turn the tissue (Chen et al., 2015). This technique, expansion microscopy (ExM), is now being adapted and improved by many groups, and has been applied to tissues of mice, human patients, and in many other biological contexts (Chen et al., 2015 Chen et al., 2016 Chozinski et al., 2016 Ku et al., 2016 Tillberg et al., 2016 Chang et al., 2017 Zhao et al., 2017 Park, 2018 Truckenbrodt et al., 2018 Gambarotto et al., 2019 Wassie et al., 2019). لكن، C. ايليجانس is wrapped in a multi-layer cuticle, which is well known to be impermeable to many small molecules and all antibodies, and mechanically stiff to the point where physical expansion would be expected to proceed poorly (Duerr, 2006 Page and Johnstone, 2007 Chisholm and Xu, 2012). Thus, we set out to develop an ExM protocol customized for the C. ايليجانس context that would overcome these barriers.

To achieve this goal, we modified previously published protocols in a number of ways (Figure 1, green steps) to generate a new protocol which we call expansion of C. ايليجانس (or ExCel). This protocol results in high signal-to-background antibody staining against protease-resistant fluorescent proteins, low-distortion (

1–6% over length scales of 0–100 μm) physical expansion by

3.3x, and both protein and RNA detection with sub-cellular resolution. Using ExCel, we were able to resolve synaptic and gap junction proteins better than with ordinary confocal microscopy, and simultaneously image proteins, RNA, and DNA location within the same specimen. In particular, such multiplexed capability has not been demonstrated with previous super-resolution methods in C. ايليجانس, and facilitates nanoscale-precise analyses of how multiple molecular types are spatially organized in the context of an entire animal.

Workflow for expansion of C. ايليجانس (ExCel) sample processing.

A method for expanding cuticle-enclosed intact C. ايليجانس, extending published proExM and ExFISH protocols with specific modifications (shown in green text full key in lower left). Depending on whether the user intends to visualize RNAs or not, the protocol branches into two forms. The protocol without ExFISH, which supports the readout of fluorescent proteins, DNA location (in the form of DAPI staining), and anatomical features, is indicated with blue arrows, ending in Panel L. The protocol with ExFISH, which additionally supports readout of RNAs, is indicated with orange arrows, ending in panel Q. For all steps after hydrogel formation (Panels G-Q), the linear expansion factor of the hydrogel-specimen composite is shown in parentheses. (A–Q) Steps of the protocol, with the bold text indicating the title of the step see text for details of each step.

The standard ExCel protocol visualizes fluorescent reporters, such as those fused to proteins of interest, which requires transgenesis, and could in principle affect the function and localization of the target protein. Thus, we additionally developed an alternative ExCel protocol, which we call epitope-preserving ExCel, that enables detection of untagged, completely endogenous proteins, using off-the-shelf primary antibodies. The epitope-preserving ExCel protocol replaces the use of Proteinase K, a general protease that disrupts most epitopes in the standard ExCel protocol, with an epitope-preserving cuticle-permeabilization treatment that we identified in a systematic screen of chemical treatments. This protocol enables antibody staining of protein epitopes at the expense of a slightly reduced expansion factor (

2.8x) and lower expansion isotropy (

8–25% error over length scales of 0–100 μm). We showed that epitope-preserving ExCel allows multiplexed readout of multiple native proteins at super-resolution, a capability that we used to identify a previously unreported protein localization at the junctions between developing vulval precursor cells, and to resolve the peri-active and active zones of chemical pre-synapses.

Lastly, we developed a third protocol, iterative ExCel (iExCel), which enables two successive rounds of hydrogel-mediated expansion of a given worm, by incorporating the previously validated strategies of iterative expansion microscopy into the ExCel context (Chang et al., 2017). iExCel brings the expansion factor from

20x, and the theoretical limit of resolution down to

25 nm, at a low level of distortion (

1.5–4.5% over length scales of 0–100 μm), on par with that of standard ExCel, on which it builds. With iExCel, we were able to resolve fluorescent puncta that may represent individual GFP molecules expressed in the neuronal cytosol.

Each of these ExCel protocols highlights some of the challenges remaining in deploying ExM in C. ايليجانس, including distortion in the gonad and mouth regions, reduced general isotropy with epitope-preserving ExCel, and the ability to only detect fluorescent proteins with the current form of iExCel, which provide grounds for further optimization in the future.


نظرة عامة على الحديث

Can a single human brain ever understand how a human brain works? Colón-Ramos argues not – but a network of brains might! Networks are an essential part of science, whether it is at the level of single neurons connecting to form a brain, or networked brains forming a scientific community. Colón-Ramos studies neural networks in the nematode C. elegans to uncover how neurons organize and communicate with each other to form the nervous system. Using the nervous system as a metaphor, he explains how our own brains, similar to neurons, are “wired to be wired”, and how scientists connect their brains to weave new knowledge.


Supporting information

S1 Fig. csGPCR gene locus analysis.

(A) Histogram of upstream intergenic region distances of all ج. elegans csGPCR genes.

The average size of the 5’ intergenic region (= distance to next gene) is 1.8 kb.

Eighty-nine percent of all loci have a 5’ intergenic region smaller than 4 kb.

(B) Histogram of average combined intron length (bp) per GPCR gene.

(C) The intergenic region of the majority of GPCR is substantially larger

than the combined intronic region. bp, base pair csGPCR, chemosensory-type GPCRs GPCR, G-protein-coupled receptor.

جدول S1. Masterlist of all examined GPCR reporters.

GPCR, G-protein-coupled receptor protein.

الجدول S2. List of all identified sensory neurons with GPCR expression.

Gene in bold: newly identified in this paper

Gene in non-bold: previously identified

(Gene in parenthesis): ID based on position and morphology, not confirmed with neuron-specific reporter.

GPCR, G-protein-coupled receptor protein.

جدول S3. Primers.

Primer sequences for the reporters generated by the Vancouver consortium (BC strains) can be found at http://www.gfpworm.org.


H1N1? H2N5? What Do Flu Names Mean?

The fall brings with it cooler days, apple picking and flu season.

We know what the symptoms of the flu are, how it is spread and the importance of getting a flu shot. What we may not know is the difference between the strains of the influenza virus and why are they referred to by the letters H and N - followed by numbers.

This may be a bit "inside biology" for some, but, in case you are wondering what these names mean and how they come about, here is a look into the virology behind the influenza virus.

Strains of influenza are characterized by two proteins that are on the outer surface of the virus: hemagglutinin and neuraminidase. This is where the "H" and "N" in the name come from. The proteins can be seen in the picture above, represented by the blue "spikes" on the outside of the virus. Both of these proteins are required for the virus to cause an infection and perform complementary functions. The hemagglutinin is critical for the virus to be able to attach to, and then enter the cell. Without hemagglutinin, the entire process of infection could not be initiated.

Once in the cell, the virus takes over the normal cell machinery and uses it to make many copies of itself.

Then, the neuraminidase enzyme comes into play. Neuraminidase is required for the newly made viruses to escape the host cell, where they can then perpetuate the infection. It's role is to clip the newly made viruses from the membrane of host cell and release them. Without neuraminidase, the new viruses would stay attached to the host cell, unable to infect new cells.

When a person becomes infected with influenza virus, their body's immune system responds by making antibodies to the H and N proteins. Then the antibodies bind to the H and N proteins, and block them from doing their job, stopping the virus in its tracks.

However, with influenza virus, the situation is even more complicated.

Influenza's complexity starts with the fact that there are 14 versions of H protein and 9 versions of N which means that there are a total of 144 varieties of flu. Not all of these 144 are infective.

Additionally, there are two major processes that create a complicated situation even worse. تسمى هذه antigenic drift و antigenic shift.

Antigenic drift means that either H or N change in a particular strain. This results in new strains, and this trips up the immune system. When H and N mutate, it is possible that they change so much that the antibodies may not bind to them anymore, leaving the virus fully infective.

The concept of antigenic shift is more complicated, but, stay with me for a moment. In order to understand antigenic shift, first we must understand how the genome of influenza is stored inside the virus. Influenza belongs to the orthomyxoviridae family of viruses. This means that, unlike our genes, which are made up of DNA, the flu virus's genome is made up of RNA - eight separate pieces of RNA. Flu is an example of an RNA virus with the hemagglutinin and neuraminidase genes are found on different pieces of RNA.

When two different strains of flu infect a cell at the same time, the pieces of RNA (eight from each virus) mix together. This is called reassortment and results in a new strain.

In looking at the figure below, let's say that strain A (with the green RNA) is an H1N1 virus and strain B (with the blue RNA) is an H2N5. In the figure, both of these viruses are infecting the same cell at the same time. When in the cell, the 16 pieces of RNA mix together and the virus that is released from the cell is different (a combination of some green RNA and some blue RNA) from either of the original ones that went in.

This process makes pandemics more likely because the strain that results from the reassortment may be a more dangerous strain and also one that no one has been exposed to before.

Within the past century, there have been four flu pandemics (worldwide epidemics.) They occurred in 1918 (H1N1 - swine flu), 1957 (H2N2), 1968 (H3N2) and 2009 (H1N1) and experts agree that it is not a matter of if, but when, the next pandemic will strike. It is not simple to predict which flu strain will be wreaking havoc next and the flu vaccine varies in how effective it is from year to year. Knowing about the complexity of the influenza virus's genome and its ability to undergo antigenic shift and drift help us understand, at least to some extent, what we are up against each year.


AUTHOR CONTRIBUTIONS

Erick O. Olivares: Data curation Formal analysis Methodology Software Visualization Writing – original draft Writing – review & editing. Eduardo J. Izquierdo: Conceptualization Formal analysis Funding acquisition Investigation Methodology Project administration Supervision Visualization Writing – original draft Writing – review & editing. Randall D. Beer: Conceptualization Formal analysis Funding acquisition Investigation Methodology Project administration Resources Software Supervision Writing – original draft Writing – review & editing.


شاهد الفيديو: رحلة عبر جهازك العصبي (ديسمبر 2022).