معلومة

مروج مستقر وقوي؟

مروج مستقر وقوي؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحتاج إلى محفز للثدييات يحافظ على ثبات التعبير من خلال التمايز.

كنت أخطط في الأصل لتوظيف UbC لهذا المشروع المحدد ، ولكن ظهرت معلومات جديدة من تجربة مختلفة ، والآن أحتاج إلى مروج يتمتع باستقرار شديد وقوة عالية (كما تعلم ، تشتهر UbC بتعبيرها المنخفض جدًا معدلات).

هل لدى أي منكم اقتراحات؟ ربما ينبغي أن أبحث في نوع من المروج المختلط ...

شكرا لك،

CDB


يبدو أن هناك قدرًا كبيرًا من الموارد لمساعدة OP.

يحتوي Addgene على صفحة حول الموضوع تحتوي على قائمة ووصف للمروجات الشائعة التي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية: Plasmids 101: The Promoter Region

يذكر كتاب الفيزياء الحيوية التجريبية بعض المروجين المفيدين أيضًا ، أو هذه المراجعة.

من المثير للدهشة أنه كان هناك بعض التحليل الكمي لقوة المروج: مقارنة منهجية للمروجين التأسيسي والمروج المحفز للدوكسيسايكلين ، بالإضافة إلى الجهود المبذولة نحو تصميم تركيبي أقوى (نسخة من CMV).

استنتاجي هو أن المروجين الفيروسي أو CAG (استنادًا إلى أكتين الدجاج) قد يكونون مرشحين مفيدين. لكن لا يمكن للمرء أن يتوقع وجود تعبير في كل مكان وحتى في أنواع مختلفة من الأنسجة / الخلايا دون ضبط شريط التعبير.


مروج مستقر وقوي؟ - مادة الاحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يمكن إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من قبل المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة والتي يعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


مجردة رسومية

دودة جيش الخريف Spodoptera frugiperda، موطنها الأصلي في الأمريكتين ، أصبحت آفة عالمية تلحق أضرارًا بمحاصيل متعددة (Jing et al. ، 2019). S. frugiperda تم تطوير خط الخلية ، Sf9 من المبايض ، وقد تم استخدام Sf21 المختار من Sf9 على نطاق واسع لإنتاج البروتينات المؤتلفة (Davis et al. ، 1993 McCall et al. ، 2005). ترنسفكأيشن عابر للبلازميد في هذه الخلايا (Chang et al. ، 2018 Shen et al. ، 2014) ، واختيار الخلايا المستقرة من الخلايا المنقولة (Fernandes et al. ، 2012 Kempf et al. ، 2002) ، ونظام ناقل التعبير الفيروسي البكتيري (BEVS) (سميث وآخرون ، 1983) تستخدم بشكل شائع لإنتاج البروتينات المؤتلفة في هذه الخلايا. محفزات الجينات الفيروسية المبكرة ، OpIE1 (ثيلمان وستيوارت ، 1991) ، OpIE2 (Theilmann and Stewart، 1992) و hr5 /ie1 (جارفيس وآخرون ، 1996) هي المروجين الأكثر استخدامًا في التعبير القائم على البلازميد في S. frugiperda الخلايا. ومع ذلك ، فإن انخفاض مستويات التعبير عن البروتينات الأجنبية يمثل قيدًا في استخدام هذه المحفزات الفيروسية (Chang et al. ، 2018 Zhao and Eggleston ، 1999). تم إثبات أن المروجين الداخليين يدعمان مستويات عالية من إنتاج البروتين في ذبابة الفاكهة سوداء البطن خلايا S2 (Angelichio et al. ، 1991). لذلك ، المروجين الذاتية نشطة للغاية من S. frugiperda يمكن أن يزيد من التعبير عن البروتينات المؤتلفة في S. frugiperda خطوط الخلية. محفزات الجينات الفيروسية المتأخرة النشطة للغاية ، ص 10 و متعدد الهيدرين دعم مستويات عالية من التعبير عن البروتين من خلال استخدام فيروسات باكول في S. frugiperda لذلك ، يستخدم هذا النظام على نطاق واسع للتعبير عن البروتينات المؤتلفة (Hill-Perkins and Possee ، 1990). ومع ذلك ، فإن التعبير عن البروتينات المؤتلفة يحدث في المرحلة المتأخرة من عدوى الفيروس البكتيري عندما تكون آلية تخليق البروتين في الخلايا المضيفة معطلة بالفعل (Schultz and Friesen ، 2009) ، وهذا يؤدي إلى معالجة غير فعالة وتعديل لاحق للترجمة للبروتينات المؤتلفة ( جارفيس وآخرون ، 1993 جارفيس وسامرز ، 1989 شولتز وفريزين ، 2009). قد تسهل المحفزات الذاتية النشطة للغاية التعبير عن البروتينات المؤتلفة خلال المراحل المبكرة من عدوى الفيروس البكتيري مما يؤدي إلى تحسينات في المعالجة والتعديل اللاحق للترجمة للبروتينات المؤتلفة.

تم استخدام المروجين المشتق من الحشرات المضيفة بنجاح في دفع التعبير الجيني في الحشرات النموذجية ، بما في ذلك تريبوليوم كاستانيوم (Eckermann et al.، 2018 Lorenzen et al.، 2002 Rylee et al.، 2018) ، الزاعجة المصرية (Anderson et al.، 2010 De Valdez et al.، 2011 Li et al.، 2017) و بومبيكس موري (Sakai et al. ، 2016 Tamura et al. ، 2000 Xu et al. ، 2019) ، مما ساعد في البحث الأساسي والتطبيقي في هذه الحشرات. العديد من S. frugiperda تم تحديد المروجين من خلال تحليل النسخ والجينوم لخلايا Sf21 ، ومع ذلك ، لم يتفوق أي منها على المروج الفيروسي المبكر OpIE2 في خلايا SF21 (Bleckmann et al. ، 2015). لقد حددنا سابقًا العديد من المروجين المحفز للحرارة النشطة في خلايا Sf9 ، وكان اثنان منهم أكثر قوة من OpIE2 مروج ولكنه أقل نشاطًا من hr5 /ie1 المروج (Chen et al. ، 2020). لتحديد S. frugiperda المروجين الأكثر نشاطًا من المروجين الفيروسي المستخدم تجاريًا ، قمنا بتحليل مجموعة من الجينات المعبر عنها بدرجة عالية من نسختين S. frugiperda خطوط الخلايا وثلاثة أنسجة. تم تقييم أداء المروجين المحتملين للجينات المعبر عنها بدرجة عالية في خلايا Sf9 و Sf17. المحفزات التي أظهرت نشاطًا أعلى من المروج المستخدم تجاريًا (hr5 /ie1) عن طريق التعبير عن الجينات المحورة بشكل عابر وثابت في خلايا Sf9 و FAW باستخدام أنظمة التعبير القائمة على البلازميد و baculovirus ، على التوالي. حددت هذه الدراسات اثنين من النشطين للغاية S. frugiperda المحفزات التي قد تكون مفيدة للتعبير عن البروتين ، وتحرير الجينوم وإنتاج الحشرات المعدلة وراثيا في دودة الحشد الخريفية وغيرها من الحشرات lepidopteran.


نتائج ومناقشة

فحص المروجين القوي الداخلي من P. مندوسينا NK-01 عبر تحليل RNA-seq والتنبؤ بالمروج

لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي ، يرتبط مستوى النسخ من الجين بشكل إيجابي بقيمة RPKM 26. من خلال تحليل RNA-seq لـ P. مندوسينا NK-01 ، تم تصنيف مستويات النسخ لجميع الجينات من الأعلى إلى الأدنى بناءً على قيم RPKM الخاصة بهم. تم افتراض أن أول 30 جينة مرتبة حسب قيم RPKM نشطة للغاية على مستوى النسخ (الجدول S1). وبالتالي ، تم اختيار مناطق المنبع من 30 جينًا ذات قيم RPKM عالية كأهداف الكشف للتنبؤ بالمروج. من خلال مزيد من الفحص باستخدام برنامج تنبؤ مروج عبر الإنترنت ، تم تحديد 10 من 30 تسلسلًا مرشحًا على أنها تسلسل محفز مفترض (الشكل S1) وتم اختيارها للاستنساخ والتوصيف اللاحقين (الجدول 1).

استنساخ المروجين الأقوياء من P. مندوسينا NK-01

تم تضخيم مناطق المروج للجينات العشرة المعبر عنها بشدة من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل من الحمض النووي الجيني لـ P. مندوسينا NK-01. للحصول على تسلسل المروج السليم لكل من الجينات العشرة المعبر عنها بشدة ، في هذا العمل ، تم اختيار المنطقة الجينية بأكملها بين الجين المعبر عنه بشدة وجينه المنبع كمنطقة مستهدفة ليتم استنساخها بواسطة PCR ، باستثناء الارتباط الريبوسومي الأصلي موقع (RBS). أظهرت نتائج تسلسل الحمض النووي أن شظايا الحمض النووي المستنسخة تزامنت مع المناطق الجينية المختارة على مستوى النوكليوتيدات (البيانات غير معروضة).

توصيف المروجين المستنسخين عبر qPCR

لتقييم نقاط قوة المروجين المستنسخين ، تم دمج تسلسل المروجين حتى نهاية 5′ من التضخيم. gfp الجين ثم إدخاله في ناقل استنساخ واسع النطاق pBBR1MCS-2 قادر على التكاثر في مختلف البكتيريا سالبة الجرام 27 باستخدام إعادة التركيب المتماثل (الشكل 1). تم استخدام qPCR لتحليل مستويات النسخ gfp تحت مروجات مختلفة في مراحل نمو مختلفة ، أي ، مرحلة التسجيل المبكر (6 ساعات) ، مرحلة ما بعد السجل (12 ساعة) والمرحلة الثابتة (15 ساعة) (الشكل S2). من بين المروجين العشرة المختبرين ، كانت مستويات النسخ للمروجين الخمسة P4 و P6 و P9 و P16 و P25 أعلى بكثير من تلك الموجودة في لاك المروج في مراحل النمو المختلفة. مقارنة مع لاك المروج ، أظهر أقوى مروج P4 زيادة قدرها 36 ضعفًا في نشاط النسخ في المرحلة الثابتة (الشكل 2). عند الكشف مع معظم المروجين المستنسخين ، مستويات النسخ لجين المراسل gfp تباينت بشكل كبير في مراحل النمو المختلفة. كان للمروجين الأقوياء الخمسة P4 و P6 و P9 و P16 و P25 مستويات نسخ أعلى في مرحلة اللوغاريتم اللاحقة من المرحلة الثابتة أو مرحلة التسجيل المبكر (الشكل S3). في المقابل ، تم الكشف عن اختلافات طفيفة نسبيًا في مستويات النسخ مع المروجين الأقوياء الخمسة بين المرحلة الثابتة ومرحلة التسجيل المبكر (الشكل S3). كان للمروج P16 نشاط نسخي ثابت نسبيًا طوال فترة النمو (الشكل S3). في الدراسات السابقة ، تم تمييز أنواع مختلفة من المروجين بما في ذلك المروجين الأقوياء والمروجين المعتمدين على مرحلة النمو والمروجين التأسيسي بشكل جيد 10،13. بسبب التوافق الجيد للنظام مع الخلية المضيفة ، قد يكون اختيار المروجين الداخليين أكثر عملية وهادفة لتطبيقاتهم في البيولوجيا التركيبية والهندسة الأيضية للمضيف نفسه.

المؤتلف لتوصيف المروج مع gfp كمراسل الجينات. (أ) البلازميد المؤتلف مع أ لاك المروج كعنصر تحكم. (ب) البلازميدات المؤتلفة لتوصيف نقاط القوة لـ 10 محفزات داخلية مختارة.

توصيف المروجين المختارين و لاك المروج عبر تحليل qPCR. نسخ gfp الجين تحت مروجات مختلفة في P. مندوسينا تم قياس NKU في مراحل نمو مختلفة. تم استخدام جين 16S rDNA كمرجع داخلي. قيمة النسخ النسبية gfp الجين تحت لاك تم تعيين المروج على أنه 1. تمثل البيانات القيم المتوسطة ± الانحرافات المعيارية للقياسات الثلاثية من ثلاث تجارب مستقلة. طالب ر- تم إجراء الاختبار بين لاك المروج والمروجين المختارين. * و ** تشير ص & lt 0.05 و ص & لتر 0.01 ، على التوالي.

كان للمروجين P17 و P18 و P29 قيم RPKM عالية في تحليل RNA-seq ، لكن المروجين الموضوعة على البلازميد أظهروا مستويات نسخ أقل من لاك المروج في أي مرحلة من مراحل النمو (الشكل 2). تعمل المحفزات الداخلية المختارة بشكل جيد في الجينوم ، والذي قد يُعزى إلى مساعدة التسلسلات التنظيمية القريبة. بمجرد استنساخ المروجين بشكل منفصل ، لم يعملوا بشكل جيد.

نظرًا لأنه كان من المتوقع استخدام المروجين الداخليين الذين تم فحصهم لتحسين إنتاج PHA ، تم الحصول على بيانات RNA-seq باستخدام P. مندوسينا نمت في وسط التخمير PHA. لتوصيف المروجين المستنسخين بواسطة مقايسة الجينات المراسل ، تم أيضًا اختيار وسيط LB الشائع الاستخدام لمختلف فحوصات الجينات المراسل لهذه الدراسة 11،13. قد يكون للمروجين المتميزين جيدًا في وسط LB أيضًا إمكانية تطبيقها لتوليف منتجات أخرى في P. مندوسينا. ومع ذلك ، قد لا تكون مستويات النسخ للمروجين المرشحين العشرة التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل RNA-seq متوافقة دائمًا مع مستويات النسخ المقاسة بواسطة qPCR بسبب ظروف الثقافة المختلفة. على سبيل المثال ، كان للمروجين P17 و P18 و P29 قيم RPKM عالية في تحليل RNA-seq ، لكنهم أظهروا مستويات نسخ أقل في اختبار الجين المراسل عن لاك المروج في أي مرحلة من مراحل النمو. في المستقبل ، ينبغي النظر بشكل عام في المزيد من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي بناءً على ظروف الثقافة المختلفة لاختيار المروجين المرشح. بعد ذلك ، من خلال توصيف المروجين المفترضين بواسطة مقايسة الجينات المراسل في وسط LB ، قد يكون للمروجين الداخليين القوي الذي تم فحصه تطبيق واسع النطاق لمختلف المنتجات في P. مندوسينا.

توصيف المروجين المستنسخين عن طريق قياس مضان GFP

لتحديد مستويات التعبير عن المروجين الداخليين المختارين ، تم قياس شدة التألق النسبية في ثلاث مراحل نمو مختلفة. كما هو مبين في الشكل 3 ، فإن المروجين الأقوياء الخمسة P4 و P6 و P9 و P16 و P25 المتميزون بـ qPCR كان لديهم أيضًا شدة مضان نسبي أعلى من لاك المروج في أي مرحلة من مراحل النمو. كان P4 أقوى كثافة مضان نسبي بين المروجين العشرة المختارين ، والذي أظهر تعزيزًا بمقدار 32 ضعفًا تقريبًا مقارنةً بـ لاك المروج في المرحلة الثابتة. لكل من المروجين الأقوياء الخمسة المذكورين أعلاه ، لوحظ اختلاف كبير في شدة مضان GFP في مراحل نمو مختلفة ، والذي كان متفقًا مع النتائج السابقة على مستويات النسخ غير المستقرة لـ gfp يقاس qPCR (الشكل S3). تشير جميع النتائج إلى أن مستويات التعبير للمروجين الأقوياء الخمسة قد لا تكون ثابتة على مدار دورة النمو بأكملها (الشكل 3) ، وكانت أوامر قوة المروج المنعكسة بواسطة مراسل qPCR و GFP في الوقت الفعلي متطابقة مع النتيجة التي تم الحصول عليها بواسطة RNA-seq (قيمة RPKM) ، والتي أظهرت أن نتائج تحليل تسلسل النسخ وتجارب التحقق الوظيفي كانت متسقة للغاية.

توصيف المروجين المختارين و لاك المروج عبر قياسات شدة مضان GFP. التعبير عن gfp الجين تحت مروجات مختلفة في P. مندوسينا تم قياس NKU في مراحل نمو مختلفة. تم طرح تعبير الخلفية ، وتم حساب شدة التألق النسبية بالتطبيع مقابل كل OD600 من الخلايا الكاملة. تمثل البيانات القيم المتوسطة ± الانحرافات المعيارية للقياسات الثلاثية من ثلاث تجارب مستقلة. طالب ر- تم إجراء الاختبار بين لاك المروج والمروجين المختارين. * و ** تشير ص & lt 0.05 و ص & لتر 0.01 ، على التوالي.

ومن المثير للاهتمام أن مستوى النسخ النسبي لـ P25 كان أعلى من مستوى P6 و P9 و P16 (الشكل 2) ، لكن شدة التألق النسبية لـ P25 كانت أقل من تلك الخاصة بـ P6 و P9 و P16 (الشكل 3). كانت شدة التألق النسبية للمروجات المتبقية P17 و P18 و P20 و P23 و P29 أقل من تلك الخاصة بـ لاك المروج في أي مرحلة من مراحل النمو ، على الرغم من أن P20 و P23 أظهروا مستويات نسخ أعلى من لاك المروجين. تشير الملاحظات إلى أن المستوى النسخي العالي للجين قد لا يؤدي بالضرورة إلى تخليق عالي المستوى لهذا البروتين المشفر بواسطة الجين. للحفاظ على اتساق كفاءة بدء الترجمة ، في هذه الدراسة ، تم تقديم نفس RBS في المنبع لجين المراسل gfp. من بين ناقلات الجينات المراسل ، كانت المسافة بين متواليات المحفز المتوقعة و RBS مختلفة عن بعضها البعض ، مما قد يؤثر على كفاءة ترجمة mRNA ، مما قد يؤدي إلى التناقض بين مستوى النسخ وكثافة التألق. على سبيل المثال ، كانت المسافة بين تسلسلات المحفز المتوقعة و RBS لـ P25 أطول من تلك الخاصة بـ P6 و P9 و P16. قد يكون هذا هو السبب وراء تمتع P25 بمستوى نسخ أعلى ، ولكن شدة تألق أقل من تلك الخاصة بـ P6 و P9 و P16. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون الاختلافات في تسلسل المباعد بين المروج و RBS هي السبب الثاني للاتجاهات المختلفة بين مستوى النسخ وكثافة التألق.

عندما لوحظ عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، تعبر الخلايا gfp تحت سيطرة P4 و P6 و P9 و P16 و P25 أنتجت المزيد من التألق الأخضر الساطع من خلايا التحكم مع gfp التعبير تحت سيطرة لاك. أنتجت الخلايا ضعيفة التألق الأخضر عندما gfp كان التعبير مدفوعًا بـ P23 و P20. ومع ذلك ، لم يلاحظ التألق الأخضر على الخلايا عند التعبير عن gfp كانت تحت سيطرة P17 و P18 و P29 (الشكل 4). النتائج من مجهر متحد البؤر مطابقة جيدا مع تلك من GFP قياس كثافة مضان.

توصيف المروجين المختارين و لاك المروج عبر مجهر متحد البؤر. (أ) تألق أخضر داخل الخلية. (ب) مخطط غشاء الخلية بواسطة وصمة عار مع FM4-64 / L. (ج) تم دمج A و B معًا. تم التقاط جميع الصور في نفس حالة التعرض.

في دراسة سابقة ، تم تطبيق مجموعة من المحفزات الاصطناعية ، القادرة على التعبير الثابت والتكويني للجينات النهائية ، للتعبير الجيني غير المتجانسة المعاير في P. putida KT2440 باستخدام ناقل ترانسبوزون توصيل صغير من Tn7 يقوم بإدخال المحفزات في جينوم P. putida 28. في دراسة أخرى ، تم تمييز المروجين المحفزين المختلفين من خلال إنشاء متجهات ProUSER-reporter لاستخدامها في P. putida KT2440 ، وإنتاج ص- حمض الكوماريك في P. putida تم تحسين KT2440 من خلال استخدام المروجين المحفز المختار لتحسين تعبير المسار 29. في هذا العمل ، تم تحديد المروجين الأقوياء الخمسة P4 و P6 و P9 و P16 و P25 من P. مندوسينا NK-01 باستخدام خط أنابيب يتكون من تحليل RNA-seq ومستوى النسخ وقياسات كثافة التألق لجين المراسل gfp. حتى الآن ، لا يُعرف سوى القليل جدًا عن فحص المروجين الأقوياء من الجنس الزائفة باستخدام استراتيجية قائمة على RNA-seq.

تعزيز إنتاج PHA عن طريق الإفراط في التعبير phaC باستخدام المروجين الأقوياء في P. مندوسينا NKU

عامل التشغيل الاصطناعي mcl-PHA لـ P. مندوسينا تم شرح NK-01 في البحث السابق. أظهرت دراستنا أن PhaC1 هو المساهم الرئيسي في تخليق mcl-PHA في P. مندوسينا NK-01 23. وبالتالي ، فإن الإفراط في التعبير عن جينات سينسيز PHA ، خاصةً phaC1 الجين ، قد يكون له تأثير إيجابي على تراكم mcl-PHA. طورت قاعدة البيانات القياسية الأوروبية لهندسة المتجهات (SEVA) سلسلة من نواقل البلازميد للهندسة الأيضية والبيولوجيا التركيبية في الزائفة وغيرها من البكتيريا سالبة الجرام 30،31. ومع ذلك ، تميل أنظمة التعبير البلازميد إلى أن تكون عبئًا على البكتيريا ، خاصةً عندما تكون هناك حاجة إلى جينات متعددة للتعبير المشترك في بكتيريا. في هذا العمل ، تم اختيار المروجين الأقوياء الثلاثة P4 و P6 و P16 للإفراط في التعبير عن جينات سينسيز PHA عن طريق إدخال غير محدد من المروجين قبل المنبع. phaC1 الجين في جينوم P. مندوسينا NKU. لم تترك هذه العملية أي تسلسلات زائدة عن الحاجة في الجينوم باستثناء تسلسل المحفز المُدرج (الشكل 5). قد تمنح إستراتيجية تحرير الجينوم عديمة الندوب بعض المزايا مقارنة بالإفراط في التعبير عن الجينوم المنقولة بالبلازميد phaC الجينات.

الرسم التخطيطي للبناء لإدخال المروجين في المنبع من phaC1 الجين وللضربة القاضية phaZ في جينوم P. مندوسينا NKU.

من خلال الإدخال الكروموسومي لثلاثة محفزات قوية داخلية P4 و P6 و P16 ، فإن المستويات النسخية لـ phaC1 و phaC2 في السلالات المؤتلفة NKU-4C1 و NKU-6C1 و NKU-16C1 تم تحسينها جميعًا مقارنة بالسلالة NKU. خاصه، phaC1 أظهر تحسنًا أكثر وضوحًا من phaC2 (الشكل 6). قد يكون هذا بسبب حقيقة أن phaC1 أقرب إلى المروجين المدرجة من phaC2.

تحليل qPCR ونتائج التخمير PHA للسلالات NKU-4C1 و NKU-6C1 و NKU-16C1 و NKU. مستويات النسخ من phaC1 (أ), phaC2 (ب) و phaZ (ج) للسلالات المختلفة. (د) الوزن الجاف للخلايا (CDW) وإنتاج PHA للسلالات. تم أخذ عينات لـ qPCR في 36 ساعة من تخمير PHA. تم تعيين مستوى النسخ لـ NKU على أنه 1. تم تعريف wt٪ على أنه نسبة PHA إلى CDW. تمثل البيانات القيم المتوسطة ± الانحرافات المعيارية للقياسات الثلاثية من ثلاث تجارب مستقلة. طالب ر- تم إجراء الاختبار بين NKU والطفرات. * و ** تشير ص & lt 0.05 و ص & لتر 0.01 ، على التوالي.

وعلاوة على ذلك، فإن phaZ يقع بين phaC1 و phaC2 مستويات عالية من النسخ في السلالات المؤتلفة. خاصة بالنسبة لـ NKU-6C1 و NKU-16C1 ، فإن مستويات النسخ من phaZ تم تحسينها أكثر من phaC1، على الرغم من phaZ كان بعيدًا عن المحفز في الكتلة الجينية عند مقارنته بـ phaC1. قد يكون هذا بسبب هذا الاقتران التنظيمي المحكم بين نشاط بوليميريز PHA ونشاط ديبولميريز قد يوجد في هذه السلالة. تم الإبلاغ عن أن الإفراط في التعبير عن PhaC قد يؤدي إلى زيادة في التعبير عن PhaZ 32. وبالتالي phaZ أظهر مستوى نسخ أعلى من phaC1، عندما تم الإفراط في التعبير عن PhaC و PhaZ في وقت واحد في مجموعة جينية. أظهرت نتائج التخمير PHA أن عيارات PHA لـ NKU-4C1 و NKU-6C1 و NKU-16C1 قد انخفضت جميعها ، خاصة في NKU-6C1 (الشكل 6). تشير هذه الملاحظات إلى أن الإفراط في التعبير عن phaZ قد يؤدي إلى تخليق مفرط لـ PHA depolymerase ، وأن PHA المتراكم داخل الخلايا قد يتحلل بواسطة ديبوليميراز. تم التحقيق في الأدوار التنظيمية لـ PHA depolymerase في تخليق PHA من قبل باحثين آخرين. على سبيل المثال ، الإفراط في التعبير عن PhaC2 وحده في P. putida لم تكن السلالة U قادرة على تجميع كميات أعلى من PHA مقارنة بالسلالة البرية ، نتيجة لإزالة بلمرة PHA المرتفعة في المرحلة المتأخرة من تخليق PHA. أ phaZ- متحولة غير نشطة P. putida ومع ذلك ، فإن السلالة U تراكمت مستويات أعلى من PHA من السلالة الأبوية 32. محتوى mcl-PHA من ملف phaZ بالضربة القاضية متحولة P. putida كانت KT2442 (86٪ بالوزن ، نسبة PHA إلى CDW) أعلى من تلك الخاصة بالسلالة البرية (66٪ بالوزن) عند استخدام أوكتانوات الصوديوم كمصدر للكربون. ومع ذلك ، فإن القضاء على نشاط PHA depolymerase في P. putida KT2440 كان له تأثير ضئيل على العائد الإجمالي لـ PHA 34. كلاهما phaZ- ناقص متحولة P. الأوليوفوران GPo1 35 واثنين من الينقولات المعطلة phaZ المسوخ P. resinovorans 36 لم تظهر أي زيادة كبيرة في عيار PHA في ظل ظروف تركيب PHA المختلفة.

في هذا العمل ، نحاول تحسين عائد PHA من خلال بناء phaZ المسوخ بالضربة القاضية. ومع ذلك ، فإن عيار PHA لسلالة NKU-phaZ انخفض بنسبة 4٪ بالوزن مقارنة بسلالة NKU من 21 إلى 17٪ بالوزن (الشكل 7) ، مما يشير إلى أن الضربة القاضية لـ NKU phaZ لا يمكن تحسين المحصول والوزن الجزيئي لـ mcl-PHA في P. مندوسينا NK-01. والمثير للدهشة أن PHA تم تصنيعها من قبل الجميع phaZ كان للطفرات بالضربة القاضية أوزان جزيئية أقل من PHA التي تم تصنيعها بواسطة السلالة الأم NKU ، باستثناء NKU-phaZ-6C1 (الجدول S2). توليف mcl-PHAs بواسطة P. مندوسينا كانت NKU وسلالاتها الطافرة تتكون أساسًا من ثلاثة مونومرات مختلفة ، أي 3-هيدروكسي أوكتانوات و 3-هيدروكسي ديكانوات و 3-هيدروكسي ديكانوات ، كما يتضح من تحليل GC-MS (الأشكال S4 ، S5). لم يكن لنسب تكوين المونومر لـ mcl-PHAs تغييرات واضحة للطفرات مقارنة بـ NKU (الجدول S3).

تحليل qPCR ونتائج التخمير PHA للسلالات NKU-phaZ-4C1 ، NKU-∆phaZ-6C1 ، NKU-∆phaZ-16C1 و NKU-∆phaZ. مستويات النسخ من phaC1 (أ), phaC2 (ب) و phaZ (ج) للسلالات المختلفة. (د) إنتاج CDW و PHA للسلالات. تم أخذ عينات لـ qPCR في 36 ساعة من تخمير PHA. المستوى النسخي للسلالة NKU-phaZ تم تعيينه على أنه 1. تمثل البيانات القيم المتوسطة - الانحرافات المعيارية للقياسات الثلاثية من ثلاث تجارب مستقلة. طالب ر- تم إجراء الاختبار بين NKU-phaZ والطفرات الأخرى. * و ** تشير ص & lt 0.05 و ص & لتر 0.01 ، على التوالي.

القيم النسبيه النسبيه phaC1 و phaC2 في سلالة NKU-phaZ-4C1 ، NKU-phaZ-6C1 و NKU-phaZتم تحسين -16C1 مقارنةً بـ NKU-phaZ، (الشكل 7). ومن المثير للاهتمام أن قيم النسخ النسبية لـ phaC1 و phaC2 في سلالة NKU-phaZكان -16C1 هو الأقل بين السلالات الثلاثة المذكورة أعلاه ، بينما كان عيار PHA لسلالة NKU-phaZكان -16C1 هو الأعلى بين السلالات الثلاثة المذكورة أعلاه. عيار PHA لسلالة NKU-phaZ-4C1 كان مشابهًا لسلالة NKU-phaZ. مقارنة بالسلالة NKU-phaZ، عيار PHA لسلالة NKU-phaZتم تخفيض -6C1 بنسبة 7٪ ، وعاير PHA للسلالة NKU-phaZتم تحسين -16C1 بنسبة 6٪ إلى 23٪ بالوزن (الشكل 7). أشارت هذه النتائج إلى أن مستوى التعبير phaC لم يكن له علاقة إيجابية بمعيار PHA في السلالة NK-01. في الدراسات المستقبلية ، التعبير الأمثل عن phaC قد تكون مطلوبة للحصول على أعلى عائد PHA في السلالة NK-01. تجدر الإشارة إلى أن تسلسل RBS الأصلي لـ phaC لم يتغير الجين عندما تم إدخال المحفزات القوية الذاتية في المنبع من phaC أوبرا في جينوم P. مندوسينا. في P. مندوسينا، قد يكون تسلسل RBS الأصلي هو الأمثل لبدء الترجمة لـ phaC أوبرون. يمكن أن يعمل RBS كعنصر تنظيمي مهم لبدء الترجمة وبالتالي يؤثر بشكل واضح على مستوى التعبير الجيني 37،38. قد لا يؤدي استخدام المروجين الأقوياء فقط إلى الحصول على مستويات التعبير الأمثل. في هذه الدراسة ، قد يكون تحسين تسلسل RBS المقترن بفحص المروجين القوي الداخلي مطلوبًا للتعبير الجيني الأمثل لـ PHA synthase.

القيم النسبيه النسبيه phaC1 و phaC2 بالنسبة للسلالات الطافرة المختلفة عند 12 ساعة و 24 ساعة من تخمير mcl-PHA ، تم قياسها أيضًا بشكل محترم. كما هو متوقع ، فإن سلالات NKU-phaZ-4C1 ، NKU-phaZ-6C1 و NKU-phaZأظهرت -16C1 مستويات نسخ أعلى لـ phaC1 و phaC2 من NKU-phaZ ومع ذلك ، في الساعة 12 ، لوحظ عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين السلالات الثلاثة المذكورة أعلاه (الشكل S6). في 24 ساعة ، قيم النسخ النسبية لـ phaC1 تم أيضًا تحسين السلالات الثلاثة المذكورة أعلاه مقارنةً بـ NKU-phaZ، و NKU-phaZ-4C1 كان له أعلى مستوى نسخي بين السلالات الثلاثة (الشكل S6). والمثير للدهشة أن مستويات النسخ ل phaC2 في 24 ساعة لم يكن هناك زيادة واضحة في NKU-phaZ-4C1 ، NKU-phaZ-6C1 و NKU-phaZ-16C1 مقارنة مع NKU-phaZ (الشكل S6). سلالة NKU-phaZأظهرت -16C1 أدنى مستويات النسخ لـ phaC1 و phaC2 في أي نقاط زمنية (الشكل 7 والشكل S6). أشارت هذه النتائج إلى أن مستويات النسخ phaC1 و phaC2 بالنسبة للسلالات الطافرة لم تكن ثابتة أثناء تخمير PHA. قد تساهم التغييرات في مستويات النسخ لجينات سينسيز PHA خلال فترة تخمير PHA في تقليل زيادة محصول PHA.

نظرًا لأن المسار الأيضي المعقد متورط في تخليق PHA من الجلوكوز ، فهناك العديد من العوامل المهمة التي تؤثر على كفاءة تخليق PHA ، بما في ذلك مسار Entner-Doudoroff ، وتدفق acetyl-CoA ، والحمض الدهني من جديد مسار التوليف ، وتوافر تركيب PHA 39،40،41. قد لا يكون لتعديل بعض العوامل تأثير واضح على تحسين تخليق PHA.

في هذا العمل ، كل شيء phaZ أظهرت المسوخ بالضربة القاضية انخفاضًا في مستويات النسخ النسبية لـ phaC1 و phaC2 مقارنة بالسلالات المقابلة لها دون حذف phaZ. مقارنة بالسلالة NKU-phaZ، لوحظ انخفاض عيار PHA مع إجهاد NKU-phaZ-4C1 و NKU-phaZ-6C1 ، بينما تم تحسين عيار PHA لسلالة NKU-phaZ-16C1 (الشكل 7). تشير هذه النتائج إلى أن PhaZ لا يشارك فقط في تدهور PHA ولكنه أيضًا يلعب دورًا مهمًا في تخليق PHA في P. مندوسينا NK-01. أظهرت دراسة سابقة أن PhaZ قد يلعب دورًا مهمًا في معدل دوران mcl-PHA في ظل ظروف الجوع في P. putida KT2442 42. سيكون الضبط العقلاني لنشاط النسخ لـ PHA synthase و depolymerase نهجًا ممكنًا لتحسين إنتاج PHA في سلالة NK-01. لذلك ، نعتقد أن المحفزات القوية الذاتية التي تم فحصها لديها القدرة على تطبيقها على الإفراط في التعبير عن جينات مسار تخليق PHA لتحسين إنتاج PHA في P. مندوسينا NK-01.

تم تطبيق هندسة المروجين مثل غربلة المروجين الأقوياء على نطاق واسع لهندسة المسارات الأيضية لتحسين إنتاجية العديد من المنتجات الصناعية. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، قد لا تكون المحفزات الخارجية متوافقة مع أنظمة التعبير الجيني الأصلي في P. مندوسينا NK-01. أظهرت دراسة سابقة في مختبرنا أن محصول PHA كان له انخفاض واضح بعد الإفراط في التعبير عن جينات PHA synthase باستخدام مروج قوي خارجي J23119 في P. putida KT2440 (بيانات غير منشورة). يوضح هذا أيضًا أنه كلما زاد تعبير PhaC ، يمكن الحصول على عائد أعلى من mcl-PHA. في هذه الدراسة ، لم نختار مروجًا خارجيًا قويًا جدًا كمرجع والمستخدم بشكل شائع لاك تم استخدام المروج 43،44 كعنصر تحكم في فحوصات نشاط النسخ لفحص المروجين القوي الداخلي المناسب. بالمقارنة مع المروج lac، أظهر المروجون الداخليون الذين تم فحصهم P4 و P6 و P16 نشاط نسخ أعلى وكثافة مضان. لذلك ، اختبرنا قدرة المحفزات الذاتية التي تم فحصها على تحسين إنتاج mcl-PHA عن طريق الإفراط في التعبير عن سينسيز PHA في P. مندوسينا NK-01. هناك حاجة إلى العمل المستقبلي لفحص المروجين الأكثر ملاءمة وتحسين مسار التخليق الحيوي PHA لزيادة تحسين إنتاج mcl-PHA ، ليس فقط من خلال الإفراط في التعبير عن جينات PHA synthase. ويمكن أيضًا استخدام المحفزات الداخلية التي تم فحصها لتعزيز التخليق الحيوي لـ AO وهو منتج آخر تم تصنيعه بواسطة NK-01 من الجلوكوز. قد يكون استخدام المروجين الداخليين طريقة مجدية لتحسين التعبير عن جينات المسار التخليقي ، ويمكن استخدام هذه الاستراتيجية لتحسين إنتاج المنتجات الحيوية الأخرى القيمة.


محتويات

يطلق على نظامي التعبير المحفز الأكثر استخدامًا للبحث في بيولوجيا خلية حقيقيات النوى اسم Tet-Off و Tet-On. [3] تم تطوير نظام Tet-Off للتحكم في التعبير عن الجينات ذات الأهمية في خلايا الثدييات من قبل الأستاذين هيرمان بوجارد ومانفريد جوسين في جامعة هايدلبرج وتم نشره لأول مرة في عام 1992. [4]

يستفيد نظام Tet-Off من معاملات التتراسيكلين (tTA) البروتين ، الذي يتم إنشاؤه عن طريق دمج بروتين واحد ، TetR (tetracycline repressor) ، الموجود في الإشريكية القولونية البكتيريا ، مع مجال تنشيط بروتين آخر ، VP16 ، موجود في فيروس الهربس البسيط. [5]

بروتين tTA الناتج قادر على الارتباط بالحمض النووي على وجه التحديد TetO تسلسل المشغل. في معظم أنظمة Tet-Off ، يتم وضع العديد من التكرارات لتسلسلات TetO في مقدمة المروج الأدنى مثل محفز CMV. يُطلق على العديد من متواليات TetO ذات الحد الأدنى من المروج اسم a عنصر استجابة التتراسيكلين (TRE)، لأنه يستجيب لربط بروتين tetracycline المعامل tTA عن طريق زيادة التعبير عن الجين أو الجينات في اتجاه مجرى مروجها.

في نظام Tet-Off ، يمكن كبح التعبير عن الجينات التي تسيطر عليها TRE بواسطة التتراسيكلين ومشتقاته. إنها تربط tTA وتجعلها غير قادرة على الارتباط بتسلسلات TRE ، وبالتالي تمنع التعامل مع الجينات التي تسيطر عليها TRE.

يعمل نظام Tet-On بشكل مشابه ، ولكن في الاتجاه المعاكس. أثناء وجوده في نظام Tet-Off ، يكون tTA قادرًا على ربط المشغل فقط إذا لم يكن كذلك مرتبطًا بالتتراسيكلين أو أحد مشتقاته ، مثل الدوكسيسيكلين ، في نظام Tet-On ، يكون بروتين rtTA قادرًا على ربط المشغل فقط اذا ملزمة بالتتراسيكلين. وهكذا فإن إدخال الدوكسيسيكلين في النظام يبدأ في نسخ المنتج الجيني. يُفضل أحيانًا نظام Tet-On على Tet-Off لاستجابته الأسرع.

تُستخدم أنظمة التعبير Tet-Off أيضًا في توليد الفئران المعدلة وراثيًا والتي تعبر بشكل مشروط عن الجين محل الاهتمام.

إن معاملات Tet-On Advanced (المعروفة أيضًا باسم rtTA2 S -M2) هي نسخة بديلة من Tet-On تعرض تعبيرًا قاعديًا منخفضًا ، وتعمل بتركيز Dox أقل بمقدار 10 أضعاف من Tet-Off. بالإضافة إلى ذلك ، يعتبر تعبيره أكثر استقرارًا في الخلايا حقيقية النواة نظرًا لكونه كودون بشريًا محسّنًا ويستخدم 3 نطاقات تفعيل نسخ الحد الأدنى. تم اكتشافه في عام 2000 كواحد من اثنين من المتحولين المحسنين بواسطة H. Bujard وزملاؤه بعد الطفرات العشوائية لجزء Tet Repressor من جين المعاملات. [6] Tet-On 3G (المعروف أيضًا باسم rtTA-V10 [7]) مشابه لـ Tet-On Advanced ولكنه مشتق من rtTA2 S -S2 بدلاً من rtTA2 S -M2. وهو أيضًا كودون بشري مُحسَّن ويتألف من 3 نطاقات تفعيل VP16 الحد الأدنى. ومع ذلك ، يحتوي بروتين Tet-On 3G على 5 اختلافات في الأحماض الأمينية مقارنة بـ Tet-On Advanced والتي يبدو أنها تزيد من حساسيتها تجاه Dox بشكل أكبر. Tet-On 3G حساس لـ Dox أقل بمقدار 100 ضعف وهو أكثر نشاطًا بـ 7 أضعاف من Tet-On الأصلي. [8]

تعمل الأنظمة الأخرى مثل نظام T-REx من Life Technologies بطريقة مختلفة. [9] الجين المعني محاط بمحفز CMV المنبع وموقعين TetO2. يتم قمع التعبير عن الجين محل الاهتمام عن طريق الارتباط العالي التقارب بين المتجانسات TetR لكل متواليات TetO2 في غياب التتراسيكلين. يؤدي إدخال التتراسيكلين إلى ارتباط واحد من التتراسيكلين على كل جهاز من النوع TetR متبوعًا بإطلاق TetO2 بواسطة أجهزة القياس المتجانسة TetR. يؤدي فك ارتباط المتجانسات TetR و TetO2 إلى إزالة الجين المعني.

نسخة معدلة من T-REx هي الدائرة البيولوجية الاصطناعية Linearizer ، المحسّنة لضبط التعبير الجيني في الخلايا حقيقية النواة (الخميرة الناشئة ، البشرية ، إلخ). By incorporating TetO2 sites into the promoter driving TetR expression, it creates negative feedback, which ensures homogeneous expression (low noise) and a linear dose-response to tetracycline analogs. [10]

In the most commonly used plasmids, the tetracycline response element consists of 7 repeats of the 19bp bacterial TetO sequence ( TCCCTATCAGTGATAGAGA ) separated by spacer sequences (for example: ACGATGTCGAGTTTAC ). It is the TetO that is recognized and bound by the TetR portion of Tet-On or Tet-Off. The TRE is usually placed upstream of a minimal promoter that has very low basal expression in the absence of bound Tet-Off (or Tet-On).

The Tet system has advantages over Cre, FRT, and ER (estrogen receptor) conditional gene expression systems. In the Cre and FRT systems, activation or knockout of the gene is irreversible once recombination is accomplished, whereas, in Tet and ER systems, it is reversible. The Tet system has very tight control on expression, whereas ER system is somewhat leaky. [11] However, the Tet system, which depends on transcription and subsequent translation of a target gene, is not as fast-acting as the ER system, which stabilizes the already-expressed target protein upon hormone administration. Also, since the 19bp tet-o sequence is naturally absent from mammalian cells, pleiotropy is thought to be minimized compared to hormonal methods of control. When using the Tet system in cell culture, it is important to confirm that each batch of fetal bovine serum is tested to confirm that contaminating tetracyclines are absent or are too low to interfere with inducibility.

The mechanism of action for the antibacterial effect of tetracyclines relies on disrupting protein translation in bacteria, thereby damaging the ability of microbes to grow and repair however protein translation is also disrupted in eukaryotic mitochondria leading to effects that may confound experimental results. [12] [13]


أساليب

Chick embryos

Fertilized chick eggs from a commercial source (JA57 strain, Dangers, France) were incubated at 38.5 °C. Embryos were staged according to days in ovo. For early stages, the following day numbers and HH (Hamburger and Hamilton) stages [56] are equivalent: E2/HH13, E2.5/HH15 and correspond to 20 and 25 somite stages, respectively.

Establishment of recombinant vectors

The pT2AL-MLC-Tomato-T2A-GFP plasmid was obtained as following: The Myr-TdTomato-T2A sequence was amplified by PCR from the plasmid pCS2-TdTomato-2A-GFP [52]. To facilitate subsequent cloning, one XhoI site was added to the forward primer and one BstBI site was added to the reverse primer. The purified PCR product was then inserted into pCRII-TOPO (Invitrogen) and a clone with Tomato downstream of SP6 promoter was selected, giving rise to a plasmid named TOPO/Tomato. H2B-GFP was amplified by PCR from the plasmid pCS2-TdTomato-2A-GFP [52]. A BstbI site was added to the forward primer and one PmlI site and one ClaI site were added to the reverse primer. The purified PCR product was then inserted into pCRII-TOPO (Invitrogen) and a clone with GFP downstream of SP6 promoter was selected, resulting in a plasmid called TOPO/GFP. Next, both TOPO/Tomato and TOPO/GFP were digested with BstbI and NotI. The T2A sequence was then inserted into TOPO/Tomato using the T4 DNA ligase (New England Biolabs) to generate a plasmid named TOPO/Tomato-T2A-GFP. The Tomato-T2A-GFP cassette was then excised from TOPO Tomato-T2A-GFP using EcoRV and XhoI and cloned into the pT2AL200R150G [57] previously digested with ClaI (blunt-ended using Fermentas T4 DNA polymerase) and XhoI. The resulting plasmid was named pT2AL-Tomato-T2A-GFP. The Myosin Light Chain (MLC) mouse promoter was removed from the pT2K-MLC-Fgf4 plasmid (previously described in [44]) using NcoI and XhoI. Both extremities were then blunt-ended using T4 DNA polymerase (Fermentas). The MLC promoter was next blunt ligated to TOPO GFP previously digested with XbaI made blunt. A clone with the MLC promoter inserted with ApaI in 5’ and XhoI in 3’ was selected resulting in a plasmid called TOPO/GFP/MLC. Both TOPO/GFP/MLC and pT2AL-Tomato-T2A-GFP were digested with ApaI and XhoI. MLC was inserted into pT2AL-Tomato-T2A-GFP to obtain pT2AL-MLC-Tomato-T2A-GFP.

The pT2AL-CMV/βactin-Tomato-T2A-GFP plasmid was obtained as followed: The pT2AL-MLC-Tomato-T2A-GFP plasmid was digested with ApaI (blunt-ended using Fermentas T4 DNA polymerase) and SphI to remove the MLC promoter. The MLC promoter was then replaced by the CMV-βactin promoter (the chick βactin promoter downstream of a CMV enhancer), which was excised from the CMV-βactin-EGFP [35] using SalI (blunt-ended) and SphI to generate the pT2AL-CMV-Tomato-T2A-GFP plasmid.

The pT2AL-p57/βactin -Tomato-T2A-GFP plasmid was obtained as followed: The p57MRE regulatory sequence was excised from pSK-p57MRE plasmid [11] by digestion with Spe1 and SacII. The CMV enhancer of the pT2AL-CMV/βactin-Tomato-T2A-GFP plasmid was excised by Acc1 and SnaBI and replaced with the p57MRE using blunt ligation with the Rapid DNA Ligation Kit (Roche). The generated plasmid was named the pT2AL-p57/βactin-Tomato-T2A-GFP.

التفريد الكهربي

Limb somite electroporation was performed as previously described [35]. The DNA solution was systematically composed of the Tol2 stable vectors and the transient transposase vector CMV/βactin-T2TP, which allows the stable integration into the chick genome. The concentration of the different vectors was between 1.5 and 2 μg/μL and of 1/3 for the CMV/βactin-T2TP. DNA was prepared in solution containing carboxymethyl cellulose 0,17 %, fast green 1 %, MgCl2 1 mM and PBS 1X in water.

Lateral plate electroporation was performed as followed: Stage HH13–15 (E2) chick embryos were windowed following standard techniques in preparation for electroporation [58]. PBS without Ca 2+ /Mg 2+ was applied to the embryo. A capillary was backfilled with DNA solution, which was injected under 200 Pa pressure (injection duration 0.1–0.5 s and compensatory pressure 15–25 Pa) (Femtojet, Eppendorf) into the embryonic coelom, to fill completely the anterior to posterior extent of the forelimb territory. The negative electrode (0.8 mm diameter tungsten rod with a 4-mm length and 2-mm exposed surface) was inserted into the yolk and positioned beneath the forelimb field, approximately 2 mm below the embryo. A 0.8 mm diameter platinum rod with a 1-mm exposed tip served as the positive electrode and was positioned above the forelimb field with an approximate distance of 3 mm. A wave pulse train consisting of 50 V, five pulses, 20 ms duration with a 200 ms interpulse interval was delivered via TSS20 electroporator and EP21 current amplifier (Intracel). Embryos were returned to 37.5 °C for the remaining incubation period. DNA solution was composed of pT2AL-CMV/βactin-Tomato-T2A-GFP (1-3 μg/μL) and CMV/βactin-T2TP at a molar ratio of 1:5–1:10, diluted in a mix containing PBS without Ca 2+ /Mg 2+ and Fast Green 0.005 %. This ratio resulted in persistent gene expression in the embryonic limbs during foetal development.

الكيمياء المناعية

Experimental forelimbs were fixed in paraformaldehyde 4 % overnight at 4 °C and processed for cryostat sections (12 μm). Immunohistochemistry was performed as previously described [59]. The monoclonal antibodies MF20 that recognizes sarcomeric myosin heavy chains and Pax7 that recognizes muscle progenitors, developed by D.A. Fischman and A. Kawakami, respectively, were obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank developed under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biology Iowa City, IA 52242. After overnight incubation with the primary antibody at 4 °C, biotinylated secondary antibodies (Anti-Mouse IgG2b from Southern Biotech Anti-Mouse IgG1 from Jackson ImmunoResearch laboratories) were applied for 1 h at room temperature, followed by a 45 min incubation with Cy5-Streptavidin (Invitrogen). Hoechst (Molecular Probes) staining was performed with a dilution of 1/20000 in PBS 1X for 10 min at room temperature.

التهجين في الموقع

In situ hybridization experiments were performed for GFP و Scx probes, as previously described [35].

Image capturing

Images of the wholemount electroporated limbs were acquired with a Leica stereo-macroscope equipped with a Leica DFC300 camera. After immunohistochemistry, sectioned samples images were captured using a Nikon epifluorescence microscope, a Leica DMI600B inverted microscope or a Leica SP5 confocal system.


المواد والأساليب

ASC Isolation and Clonal Culture

Stromal vascular cells with a CD34 + CD105 + CD45 − CD31 − phenotype (ASCs) were isolated from human adipose tissue (Boquest وآخرون، 2005). In short, tissue was obtained by liposuction from the hip and thigh regions of healthy women. After washing in Hank’s balanced salt solution (HBSS), the tissue was digested for 2 h at 37°C in HBSS with collagenase and DNase I. Adipocytes were separated from stromal vascular cells after sedimentation at 400 × ز for 10 min and removed by aspiration. Erythrocytes were removed by resuspending stromal vascular cell pellets in lysis buffer (2.06 mg/ml Tris base, pH 7.2, and 7.49 mg/ml NH4Cl) for 10 min. After centrifugation, pellets were resuspended in HBSS containing 2% fetal bovine serum (FBS) (Sigma-Aldrich. St. Louis, MO) and passed through a 100-μm sieve and a 40-μm sieve. CD45 + cells were removed with paramagnetic beads conjugated to mouse anti-human CD45 monoclonal antibodies (Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Germany) using a superMACS magnet (Miltenyi Biotech). Remaining CD45 − cells were incubated with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD31 antibodies (Serotec, Oxford, United Kingdom) at a concentration of 10 μl of antibody per 10 6 cells for 15 min at 4°C. Cells were washed and incubated with anti-FITC microbeads (Miltenyi Biotech) for 15 min at 4°C. CD31 − and CD31 + cells were separated using an LS column (Miltenyi Biotech). CD31 − cells were reexposed to a new LS column to eliminate any leftover contaminating CD31 + cells. Flow cytometry analysis of each cell subset from each donor indicated that purity was >98% (our unpublished data) (Boquest وآخرون، 2005). Aliquots of each cell subset were immediately snap-frozen in liquid nitrogen for DNA and RNA isolations, or they were cultured.

CD31 − clonal cell lines were generated by culturing single CD31 − cells in each well of 48-well plates in DMEM/F-12 medium containing 50% FBS and antibiotics. After ∼16 h, the medium was replaced by DMEM/F-12 with 20% FBS. After ∼1 wk, colonies containing >10 cells were passaged by trypsinization and expanded. Only clonal lines that could be easily expanded were used in this study. Clones A1 and A2, and clones B1, B2, and B3 examined in this study were from two different female donors (age 27 and 39, respectively).

Adipogenic Differentiation

Clonal ASC lines generated from individual CD31 − cells at passage 4 were cultured to confluence before differentiation. For adipogenic differentiation (Zuk وآخرون., 2001), cells cultured in DMEM/F-12 with 10% FBS were stimulated for 3 wk with 0.5 mM 1-methyl-3 isobutylxanthine, 1 μM dexamethasone, 10 μg/ml insulin (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), and 200 μM indomethacin (Dumex-Alpharma, Copenhagen, Denmark). To visualize lipid droplets, formalin-fixed cells were washed in 50% isopropanol and stained with Oil Red-O.

Gene Loci and Regions Analyzed by Bisulfite Sequencing

Supplemental Figure S1 illustrates the promoter regions of the genes analyzed by bisulfite sequencing in this study. We examined four adipogenic genes, including leptin (LEP) (Mason وآخرون., 1998 Reseland وآخرون., 2001), peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARG2) (Fajas وآخرون., 1997), fatty acid-binding protein 4 (FABP4) (Ross وآخرون., 1990 Graves وآخرون., 1992), and lipoprotein lipase (LPL) (Bey وآخرون., 1998 Merkel وآخرون. ، 2002). We also examined genes unrelated to adipogenesis, such as myogenin (MYOG), a basic helix-loop-helix transcription factor required for myocyte differentiation (Massari and Murre, 2000) the endothelial marker gene CD31/PCAM-1 (Cao وآخرون., 2002 Chi وآخرون., 2003) and the constitutively expressed housekeeping gene جابده. ال LEP promoter region analyzed was from nucleotides 2719–2937 (GenBank accession no. U43589) and spanned 27 potentially methylated cytosines in CpG dinucleotides starting 42 base pairs upstream of the ATG translational start site. ال LEP proximal promoter activity is known to be regulated by DNA methylation (Melzner وآخرون. ، 2002). ال PPARG2 promoter region (Fajas وآخرون., 1997) spanned nucleotides 108–587 (GenBank accession no. AB005520) and included 6 CpGs starting 264 base pairs upstream of the ATG. ال FABP4 (GenBank accession no. NM_001442) promoter region examined was identified using ENSEMBL and encompassed four CpGs starting 130 base pairs upstream of the ATG. ال LPL promoter region spanned bases 1321–1777 (GenBank accession no. X68111) and included 11 CpGs starting 134 base pairs upstream of the ATG. ال MYOG region analyzed spanned nucleotides 1268–1484 (GenBank accession no. X62155) and included 16 CpGs starting 87 base pairs downstream of the ATG. ال CD31 promoter region examined included nucleotides 1095–1480 (GenBank accession no. X96848) and included 18 CpGs ranging from nucleotide −352 to +34 relative to the ATG. ال جابده promoter region spanned bases 1121–1337 (GenBank accession no. J04038) and encompassed 28 CpGs 116 base pairs upstream of the ATG.

Bisulfite Sequencing

DNA was purified either using the GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep kit (Sigma-Aldrich), or for most samples, by phenol-chloroform-isoamyl alcohol extraction. In the latter case, cells were first lysed for 10 min in lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 100 mM EDTA, and 0.5% SDS) and digested with 0.1 mg/ml proteinase K overnight. Bisulfite conversion (Warnecke وآخرون., 2002) was performed using the MethylEasy DNA bisulfite modification kit (Human Genetic Signatures, Sydney, Australia). Converted DNA was used fresh or stored at −20°C. Converted DNA was amplified by PCR using primer sets purchased from Human Genetic Signatures for the LEP, MYOG, CD31 و جابده الجينات. These primers sets are commercially available (www.geneticsignatures.com). We also designed primers using the Methprimer software (www.urogene.org/methprimer/index1.html) for the PPARG2, FABP4، و LPL genes (Table 1). ل PPARG2, FABP4، و LPL, PCR conditions were 95°C for 7 min and 40 cycles of 95°C 1 min, 54°C 2 min and 72°C 2 min, followed by 10 min at 72°C. ل LEP, MYOG, CD31، و جابده, nested PCRs were performed, each as follows: 95°C for 3 min and 30 cycles of 95°C for 1 min, 50°C for 2 min, and 72°C for 2 min, followed by 10 min at 72°C. PCR products were directly sequenced or cloned into bacteria using the TOPO TA cloning kit (Invitrogen, Oslo, Norway). Clones were sequenced using commercial services from MWG Biotech (Ebersberg, Germany).

Table 1. Bisulfite sequencing primers used in this study

a Purchased from Human Genetic Signatures.

Real-Time Reverse Transcription (RT)-PCR

RT-PCR was carried from 500 ng of total RNA using the Iscript cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Quantitative (Q)RT-PCR reactions were performed in triplicates on a MyiQ real-time PCR Detection System using IQ SYBR Green (Bio-Rad). Most samples were analyzed in duplicates from two separate cDNA preparations. Primers used are listed in Table 2. SYBR Green PCR conditions were 95°C for 4.5 min and 40 cycles of 95°C for 30 s, 60°C for 30 s, and 72°C for 30 s, using جابده as a normalization control. mRNA levels were calculated as described previously (Pfaffl, 2001).

Table 2. Real-time RT-PCR primers used in this study


Expression Vectors: Types & Characteristics

The expression vectors are vectors which act as vehicles for DNA insert and also allow the DNA insert to be expressed efficiently. These may be plasmids or viruses. The expression vectors are also known as expression constructs.

The expression vectors are genetically engineered for the introduction of genes into the target cells. In addition to the gene of interest, these expression constructs also contain regulatory elements like enhancers and promoters so that efficient transcription of the gene of interest occurs.

The simplest expression constructs are also known as transcription vectors only because they allow transcription of the cloned foreign gene and not its translation. The vectors which facilitate both transcription and translation of the cloned foreign gene are known as protein expression vectors. These protein expression constructs also lead to the production of recombinant protein.

Now, for transcription and translation, a promoter and a termination sequence are a must. Transcription initiates at the promoter and ends at the termination site. The promoters of expression vectors must have on/off switches. These switches help in the regulation of production of the gene product. Excessive amounts of product of the gene of interest can be toxic for the cell. A common promoter utilized in the expression constructs is the mutant version of the lac promoter, lacUV. The lacUV promoter initiates a high level of transcription under induced conditions. Moreover, in some expression vectors, a ribosomal binding site is present upstream to the start codon. The ribosomal binding site facilitates the efficient translation of the cloned foreign gene.

Expression vectors are used extensively in molecular biology in techniques like site-directed mutagenesis.

How do Expression Vectors work?

  • Once the expression construct is inside the host cell, the protein encoded by the gene of interest is produced by the transcription. Thereafter, it utilizes the translation machinery and ribosomal complexes of the host organism.
  • Frequently, the plasmid is genetically engineered to harbor regulatory elements like enhancers and promoters. These regulator sequences aid in efficient transcription of the gene of interest.
  • Expression vectors are extensively used as tools which help in the production of mRNAs and, in turn, stable proteins. They are of much interest in biotechnology and molecular biology for the production of proteins like insulin. Insulin is the chief ingredient in the treatment of the complex disease, Diabetes.
  • When the protein product is expressed, it is to be then purified. The purification of a protein poses a challenge since the protein of interest, whose gene is carried on the expression vector, is to be purified independently of the proteins of the host organism. To make the process of purification simpler, the gene of interest carried on the expression vector should always have a ‘tag’. This tag can be any marker peptide or histidine (His tag).
  • Expression vectors are considerably exploited in techniques like site-directed mutagenesis. Cloning vectors introduce the gene of interest into a plasmid which in turn replicates in bacteria. These cloning vectors need not necessarily result in the expression of a protein.

Therefore, expression vectors must have the following expression signals:

  • Strong promoter,
  • Strong termination codon,
  • Adjustment of distance between the promoter and cloned gene,
  • Inserted transcription termination sequence, and
  • Portable translation initiation sequence.

المروجين

  • A promoter ensures a reliable transcription of the gene of interest. Also, strong promoters are also necessary for an efficient mRNA synthesis with RNA polymerase.
  • Regulation of the promoter is another critical aspect which should always be kept in mind while constructing an expression vector.
  • The strongest promoters are those found in bacteriophages T5 and T7.

في بكتريا قولونية, the promoter is regulated in two ways:

Induction : the addition of chemical switches on the transcription of the gene.

Repression : addition of chemical switches off the transcription of the gene.

The most commonly used promoters in بكتريا قولونية expression system are:

  • It regulates the transcription of the lac Z gene. The lac Z gene is responsible for the production of β- galactosidase.
  • The lac Z gene can be induced by IPTG, isopropylthiogalactosidase.
  • The lac promoter sequences can be fused to the target gene. It will, then, result in lactose- dependent expression of the target gene.
  • Nevertheless, the lac promoter has its drawbacks. It is quite weak and cannot be utilized for the high levels of production of the desired protein. In addition to this, the lac genes carry out the basal level of transcription even in the absence of induction (inducer molecule).
  • It is responsible for the regulation of a cluster of genes which are involved in tryptophan biosynthesis.
  • Tryptophan acts as its repressor molecule, and it is induced by 3-β-indoleacrylic acid.
  • It is formed by hybridization of the lac and trp promoter. However, it is stronger than either of them.
  • The tac promoter is induced by IPTG, isopropylthiogalactosidase.
  • It is a strong promoter and is responsible for transcription of λDNA in بكتريا قولونية
  • The product of λcI gene acts as its repressor. It is called λ repressor.
  • The expression construct with the λPإل promoter is used in combination with the بكتريا قولونية mutant host. It is responsible for the production of a temperature sensitive form of λ repressor.
  • At low temperatures, the repressor protein represses the transcription whereas the transcription of the cloned gene occurs at high temperatures because the repressor is inactivated at high temperature.
  • For the expression of proteins in mammalian cells, the promoter must be located upstream of the cloned cDNA for its efficient transcription.
  • In most of the cases, viral promoters are employed only because they are reliable for a strong constitutive expression.
  • The widely used promoters are CMV promoter (derived from cytomegalovirus) and the SV40 promoter (derived from simian virus 40).

The promoters in the commercially available yeast expression vectors may be active constitutively or inducible ones.

A constitutive promoter is a kind of promoter which is unregulated and allows continual transcription of its associated gene.

Example of a constitutive promoter: GAP promoter of the gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

An inducible promoter is the one which works in a regulated manner and the expression of genes associated with them can be switched on or off at a particular stage of development or at a certain point of time.

Examples of inducible promoters: AOX1, GAL1, GAL10, nmt1, nmt42, and nmt81.

ال AOX1 promoter of the gene encoding alcohol oxidase. It is induced by methanol and is best-suited for expression of the protein in Pichia pastoris.

ال GAL1 و GAL10 promoters are other examples. They are induced by galactose and are suitable for protein expression in Saccharomyces cerevisiae.

ال nmt1, nmt42, و nmt81 promoters which are induced by thiamine for protein expression in Schizosaccharomyces pombe.

Reporter Gene

  • The reporter gene is responsible for the production of the protein which can be detected and quantified with the help of a simple assay.
  • They serve as a tool to measure the efficiency of the gene expression and also to detect the intracellular localization of the protein.
  • The rate of expression of the structural gene is dependent upon the regulatory sequences which are located upstream to it.
  • The rate of expression of the gene can be measured by replacement of its protein-encoding portion. Also, it can be fused to another gene which expresses another protein. The presence of this another protein can be easily identified.
  • Reporter genes are useful in the identification of promoters, enhancers, and other proteins or regulatory elements which bind to them.

The most commonly utilized reporter genes are:

  • It acts as a reporter in the presence of X- gal.
  • Its levels are easily detected by the intensity of colour which is produced. The intensity of the blue colour produced is quantified.

2. CAT (chloramphenicol acetyltransferase) encoding gene of بكتريا قولونية

  • The CAT gene encodes chloramphenicol acetyltransferase.
  • The transferase enzyme is responsible for the transfer of acetyl groups from acetyl CoA to the recipient antibiotic, chloramphenicol

3. Luciferase encoding gene of firefly, Photinus pyralis

  • Luciferase is accountable for the oxidation of luciferin.
  • The oxidation of luciferin results in the emission of yellow-green light. The emission of light is easily detected irrespective of the low levels.

4. Green fluorescent protein (GFP) encoding gene of jellyfish, Aequorea victoria

  • GFP was discovered by Shimomura.
  • It is an autofluorescent protein with 238 amino acid residues produced by the bioluminescent jellyfish Aequorea victoria.
  • In GFP, β-barrel is formed by eleven β strands. An α- helix runs through the center. The chromophore is located in the middle of the barrel. The amino acid residues from 65 to 67 with sequence Ser-Tyr-Gly form the chromophore, p- hydroxybenzylideneimidazolinone, which is fluorescent. The chromophore fluoresces at a peak wavelength of 508 nm (green light) when it is irradiated with UV or blue light (400 nm).
  • GFP serves as a tool for determining protein localization.
  • It serves as a tag whereby it is fused with a protein whose expression is to be monitored. Basically, the subcellular localization of the protein is investigated.
  • Genetic engineering techniques help in the production of vectors which contain the coding sequence of the unidentified protein, X, cloned in the coding sequence of the GFP.
  • This fusion product of GFP-X can now be transfected into target cells and the expression, as well as the subcellular location of the X protein, can easily be monitored and detected.

Ribosome Binding Site and Translation Initiation Site

  • The ribosomal binding site (RBS) follows the promoter. It is responsible for the efficient translation of the cloned gene.
  • The translation initiation site in case of prokaryotes is known as the Shine Dalgarno sequence. This sequence is enclosed within the RBS only.
  • The consensus sequence of the translation initiation site includes a set of 8 base pairs present upstream the AUG start codon.
  • The translation in eukaryotes is initiated at a particular sequence called Kozak sequence.
  • The ribosomal machinery for the translation of mRNA is assembled on this site.

Polylinkers

  • Each vector contains particular recognition sites for restriction enzymes. It is at the restriction site that the vector is excised to clone the foreign gene of interest.
  • These sites often lie close together and, hence, are called polylinkers or multiple cloning sites (MCS).
  • These regions are 50 to 100 base pair in length and may have a cluster of up to 25 restriction sites.

Poly-A (polyadenylation) Tail

  • The poly-A tail present, at the end of the mRNA formed, protects the mRNA from degradation by the exonucleases or endonucleases.
  • It is extremely critical for the stability of the mRNA.
  • It is also responsible for the termination of transcription and translation and stabilizes the mRNA production.
  • A nucleolytic enzyme complex and a poly-A-polymerase are prerequisites for the addition of poly-A tail at the end of the mRNA.

Expression System

The production of a protein requires an expression system. There are two types of expression systems, prokaryotic and eukaryotic expression system. Each of them has its own advantages and drawbacks which can be taken into consideration while constructing an expression system. However, there is no such expression system which can be considered universal for the heterologous protein production.

Prokaryotic Expression System

  • The specificity of the promoter of an RNA polymerase, in the case of prokaryotes, is mediated by sigma factor.
  • بكتريا قولونية is the widely used prokaryotic expression system.
  • It expresses high levels of the protein.
  • ال بكتريا قولونية strains are manipulated genetically for the production of recombinant protein so that they are rendered safe for large-scale experiments and fermentation.
  • The purification of the protein has become easier since recombinant-fusion proteins can be purified by affinity chromatography, say for example glutathione-S-transferase and maltose-binding fusion proteins.

Regardless of the advancements and improvements occurring,in the prokaryotic expression system, there are still many difficulties associated and challenges posed by the production of protein from the cloned foreign genes. These kinds of challenges can be grouped together into 2 categories:


Resilience

Reducing the effects of significant adversity on children’s healthy development is essential to the progress and prosperity of any society. Science tells us that some children develop المرونة, or the ability to overcome serious hardship, while others do not. Understanding why some children do well despite adverse early experiences is crucial, because it can inform more effective policies and programs that help more children reach their full potential.

One way to understand the development of resilience is to visualize a balance scale or seesaw. Protective experiences and coping skills on one side counterbalance significant adversity on the other. Resilience is evident when a child’s health and development tips toward positive outcomes — even when a heavy load of factors is stacked on the negative outcome side.

Over time, the cumulative impact of positive life experiences and coping skills can shift the fulcrum’s position, making it easier to achieve positive outcomes. Play Tipping the Scales: The Resilience Game to learn more.

The single most common factor for children who develop resilience is at least one stable and committed relationship with a supportive parent, caregiver, or other adult. These relationships provide the personalized responsiveness, scaffolding, and protection that buffer children from developmental disruption. They also build key capacities—such as the ability to plan, monitor, and regulate behavior—that enable children to respond adaptively to adversity and thrive. This combination of supportive relationships, adaptive skill-building, and positive experiences is the foundation of resilience.

Children who do well in the face of serious hardship typically have a biological resistance to adversity و strong relationships with the important adults in their family and community. Resilience is the result of a combination of protective factors. Neither individual characteristics nor social environments alone are likely to ensure positive outcomes for children who experience prolonged periods of toxic stress. It is the interaction between biology and environment that builds a child’s ability to cope with adversity and overcome threats to healthy development.

Research has identified a common set of factors that predispose children to positive outcomes in the face of significant adversity. Individuals who demonstrate resilience in response to one form of adversity may not necessarily do so in response to another. Yet when these positive influences are operating effectively, they “stack the scale” with positive weight and optimize resilience across multiple contexts. These counterbalancing factors include

  1. facilitating supportive adult-child relationships
  2. building a sense of self-efficacy and perceived control
  3. providing opportunities to strengthen adaptive skills and self-regulatory capacities and
  4. mobilizing sources of faith, hope, and cultural traditions.

Learning to cope with manageable threats is critical for the development of resilience. Not all stress is harmful. There are numerous opportunities in every child’s life to experience manageable stress—and with the help of supportive adults, this “positive stress” can be growth-promoting. Over time, we become better able to cope with life’s obstacles and hardships, both physically and mentally.

The capabilities that underlie resilience can be strengthened at any age. The brain and other biological systems are most adaptable early in life. Yet while their development lays the foundation for a wide range of resilient behaviors, it is never too late to build resilience. Age-appropriate, health-promoting activities can significantly improve the odds that an individual will recover from stress-inducing experiences. For example, regular physical exercise, stress-reduction practices, and programs that actively build executive function and self-regulation skills can improve the abilities of children and adults to cope with, adapt to, and even prevent adversity in their lives. Adults who strengthen these skills in themselves can better model healthy behaviors for their children, thereby improving the resilience of the next generation.


معلومات الكاتب

Present address: Federal Environment Agency, Section IV 2.2 Pharmaceuticals, Washing and Cleansing Agents, and Nanotechnology, Wörlitzer Platz 1, 06844, Dessau, Germany

الانتماءات

Department of Biochemistry, University of Bayreuth, Universitätsstr. 30, 95447, Bayreuth, Germany

Molecular Biology of Archaea, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Karl-von-Frisch Strasse, 35043, Marburg, Germany

Alexander Wlodkowski & Sonja-Verena Albers

Institute of Chemistry and Bioanalytics, School of Life Sciences, University of Applied Sciences of Northwestern Switzerland (FHNW), Gründenstrasse 40, 4132, Muttenz, Switzerland


شاهد الفيديو: تعرفوا على قصة اكبر مروج للمخدرات بفيصلية الرياض. (شهر نوفمبر 2022).