معلومة

كيف تحدد الخلايا التائية الخلايا التي فحصتها بالفعل؟

كيف تحدد الخلايا التائية الخلايا التي فحصتها بالفعل؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

مما أفهمه ، فإن الخلايا التائية تنتقل باستمرار في الجسم ، وتفحص الخلايا من خلال البحث عن المستضدات. إذا كانوا مستضدات ذاتية ، فلن تهاجم الخلية التائية ، بينما إذا كانت غير ذاتية ، فإنها تهاجم. سؤالي هو كيف تعرف الخلية التائية عندما فتشت الخلية للتو؟ هل تترك الخلية التائية شيئًا خلفها على الخلية لتمييزها على أنها محددة أم أن الخلية نفسها تقدم شيئًا على سطحها للإشارة إلى أنه قد تم فحصها للتو؟ إذا لم يكن هناك مثل هذا النظام ، فما الذي يمنع الخلايا التائية من أن تعلق في حلقة ، وتفحص نفس الخلية مرارًا وتكرارًا؟


يشمل سؤالك نشاطين للخلايا التائية المرتبطين ببعضهما البعض: الترحيل والتنشيط. تهاجر الخلايا التائية التي تبقى عادةً في الأعضاء اللمفاوية إلى الأعضاء غير اللمفاوية بآليات مختلفة لكل نوع فرعي من الخلايا التائية. عندما تهاجر إلى عضو غير ليمفاوي ، تتحرك الخلايا التائية عبر العضو بحثًا عن الخلايا المصابة.

الهجرة

كما ترى في الصورة أدناه ، هناك العديد من الآليات لتحريك الخلايا التائية عبر الطبقة البطانية.

الفكرة الرئيسية لجميع الآليات الثلاث هي أن ربط الخلية التائية بالطبقة البطانية ضعيف. بسبب التفاعل الضعيف ، يتسبب تدفق الدم في تحرك الخلية التائية عبر الطبقة البطانية مع استمرار ارتباطها بالطبقة البطانية. هذا هو المعروف باسم المتداول. هناك حاجة إلى محفزات أخرى (عادةً chemokines) مثل CCL21 أو CCL25 أو ICAM 1 لحث الخلايا التائية على الهجرة عبر الطبقة البطانية. هذا مهم لأنه يتم التعبير عن هذه الكيموكينات حيث يوجد التهاب. على سبيل المثال ، هناك علاقة بين مستوى CCL25 في القناة الهضمية والالتهاب في المنطقة.

تعبر الخلايا التائية عن α4β7 إنترين أو CCR7 التي تربط الخلية التائية بالطبقة البطانية. تعبر الخلايا التائية للذاكرة المركزية والخلايا التائية الساذجة عن CCR7 و CD62L وبالتالي تقيم بشكل تفضيلي داخل الأعضاء اللمفاوية الثانوية. ترتبط الخلايا التائية ذات ذاكرة المستجيب ببطانة الأمعاء باستخدام α4β7 α4β7 ، و CCR9 ، و LFA-1.

يتم التعبير عن CCL21 بواسطة كل من الخلايا اللحمية للعقد الليمفاوية paracortex وبطانة الأوعية اللمفاوية للمساعدة في انتقال الخلايا المتغصنة المنشطة وخلايا الذاكرة الساذجة والمركزية إلى العقدة الليمفاوية على التوالي. الخلايا المتغصنة هي خلايا تقديم مستضد محترفة (APCs) تهاجر إلى العقدة الليمفاوية حيث يمكنها التفاعل مع الخلايا التائية بشكل أكثر كفاءة.

تنشيط الخلايا التائية

أحد المفاهيم المهمة التي يجب استبعادها من تنشيط الخلايا التائية هو أنه يجب أن يكون هناك اتصال مباشر بين مجمع MHC ومستقبل الخلايا التائية (TCR).

تتفاعل الخلايا التائية التي انتقلت إلى العقدة الليمفاوية مع الخلايا المتغصنة ، والتي تحتوي على تركيز معقد معقد التوافق النسيجي الكبير على سطح الخلية. هذا يؤدي إلى التنشيط اللاحق للخلية التائية مما يؤدي إلى إطلاق السيتوكينات مثل IL-2 مما يؤدي إلى تكاثر الخلايا التائية المنشطة.

أصبحت الخلايا التائية المنشطة الآن قادرة على التحرك بحرية عبر الطبقة البطانية للأعضاء غير اللمفاوية للتسلل والبحث عن المواقع المصابة. (تدخل الخلايا التائية الساذجة الطبقة البطانية للأعضاء غير اللمفاوية أيضًا ، لكن هذا هو nad مستقل كيميائيًا وبالتالي ليس رد فعل للالتهاب).

مصادر:

الفرق بين الخلايا التائية الساذجة وخلايا الذاكرة التائية: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1782715/

دور الخلية المتغصنة في الاستجابة المناعية: http://lab.rockefeller.edu/steinman/dendritic_intro/immuneResponse

الذاكرة مقابل هجرة الخلايا التائية الساذجة: http://www.nature.com/icb/journal/v86/n3/full/7100132a.html

الخلية الشجيرية ودور CCL21: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3078419/

تسلل الأعضاء غير اللمفاوي من الخلايا التائية الساذجة: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.200535539/full

CCL25 وعلاقة الالتهاب: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896841116300014


لا تقوم الخلية التائية بفحص أي خلية حتى تظهر الخلية قطعة من المستضد "غير الذاتي" عليها بواسطة معقد التوافق النسيجي الكبير.

تتصل الخلية التائية المساعدة بالمستضد الموجود على سطح الخلية. تفرز الخلية التائية السيتوكينات التي تنشط الخلية التائية السامة للخلايا لتنقسم وتشكل مستعمرة من الخلايا السامة للخلايا. ثم تهاجم مستعمرة الخلايا السامة للخلايا الخلية التي تعبر عن المستضد "غير الذاتي".


يكشف تحليل الخلية الواحدة لتمايز الخلايا التائية CD4 + عن ثلاث حالات خلوية رئيسية وتسريع تدريجي للانتشار

كثيرًا ما يصاحب تمايز الخلايا الليمفاوية تغيرات في دورة الخلية ، والتفاعل الذي له أهمية مركزية للمناعة ولكنه لا يزال غير مفهوم تمامًا. هنا ، نقوم باستجواب ونمذجة كميًا كيف يرتبط الانتشار بالتمايز في خلايا CD4 + T.

نتائج

نقوم بإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية خارج الجسم الحي لخلايا CD4 + T خلال نموذج فأر للعدوى التي تثير استجابة مناعية من النوع 2 وتستنتج أن الخلايا المتمايزة المنتجة للسيتوكين تدور بشكل أسرع من الخلايا الأولية النشطة في وقت مبكر. لتشريح هذه الظاهرة كميًا ، نحدد ملفات تعريف التعبير عبر الأجيال المتتالية من الخلايا المتمايزة وغير المتمايزة أثناء استقطاب Th2 في المختبر. نتوقع ثلاث حالات خلوية منفصلة ، والتي نتحقق منها بواسطة PCR الكمي أحادي الخلية. بناءً على هذه الحالات الثلاث ، نستخرج معدلات الوفاة والانقسام والتمايز باستخدام نموذج ماركوف للحالة المتفرعة لوصف ديناميكيات تجمعات الخلايا. من هذا النمذجة متعددة المقاييس ، نستنتج تسارعًا كبيرًا في الانتشار من حالة الخلية المنشطة الوسيطة إلى حالة المستجيب الناضج لإفراز السيتوكين. نؤكد هذا التسارع عن طريق التصوير المباشر لخلايا Th2 الفردية ونموذج الملاريا خارج الجسم الحي Th1 بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

استنتاج

الارتباط بين إفراز السيتوكين ومعدل الانتشار موجود في كل من خلايا Th1 و Th2 في الجسم الحي وفي المختبر ، مما يشير إلى أن هذا من المحتمل أن يكون ظاهرة عامة في المناعة التكيفية.


مراجعة المادة

  • 1 مدرسة السير ويليام دن لعلم الأمراض ، جامعة أكسفورد ، أكسفورد ، المملكة المتحدة
  • 2 قسم الطب في رادكليف ، مجلس البحوث الطبية ، وحدة المناعة البشرية ، معهد ويذرال للطب الجزيئي ، جامعة أكسفورد ، أكسفورد ، المملكة المتحدة

يعمل الجهاز المناعي كخط دفاع حاسم ضد العدوى والسرطان ، بينما يساهم أيضًا في استتباب الأنسجة. يتم التوسط في الاتصال بين الخلايا المناعية بواسطة عوامل صغيرة قابلة للذوبان تسمى السيتوكينات ، وكذلك عن طريق التفاعلات الخلوية المباشرة. تعتبر تفاعلات الخلايا الخلوية مهمة بشكل خاص لتنشيط الخلايا التائية. تقوم الخلايا التائية بتوجيه الاستجابة المناعية التكيفية وبالتالي تحتاج إلى التمييز بين المستضدات الذاتية والمستضدات الأجنبية. على الرغم من مرور عقود على اكتشاف الخلايا التائية ، إلا أن سبب وكيفية قدرتها على التعرف على المستضدات والتمييز بينها لا يزال غير مفهوم تمامًا. كان التصوير المبكر للخلايا التائية ناجحًا للغاية في التقاط المراحل المبكرة من التكوين المترافق للخلايا التائية مع الخلايا العارضة للمستضد عند التعرف على مجمعات التوافق النسيجي الرئيسية المحملة بالببتيد بواسطة مستقبل الخلايا التائية (TCR). أدت هذه الدراسات إلى اكتشاف & # x0201Cs مجموعة التنشيط الجزيئي الفائق & # x0201D المعروفة الآن باسم المشبك المناعي ، متبوعًا بتحديد العناقيد الدقيقة لـ TCRs التي تشكلت عند تشغيل المستقبلات ، والتي تتجمع في النهاية في مركز المشبك. منذ ذلك الحين ، سمحت التطورات الجديدة في الفحص المجهري للضوء بالانتقال إلى المراحل المبكرة جدًا من تنشيط الخلايا التائية ، وإلى الخلايا المريحة بدقة عالية. يتضمن ذلك الفحص المجهري للتوطين أحادي الجزيء ، والذي تم تطبيقه على مسألة ما إذا كانت TCRs مجمعة مسبقًا على الخلايا التائية المسترخية ، والفحص المجهري للصفائح الضوئية الشبكية التي مكنت من تصوير الخلايا الكاملة التي تتفاعل مع الخلايا العارضة للمستضد. أسفر استخدام الفحص المجهري للصفائح الضوئية الشبكية عن رؤى مهمة في الهياكل المسماة microvilli ، وهي نتوءات غشائية صغيرة على الخلايا التائية التي يبدو من المحتمل أن يكون لها تأثير كبير على التعرف على الخلايا التائية وتنشيطها. هنا نأخذ في الاعتبار كيف شكل التصوير طريقة تفكيرنا حول تنشيط الخلايا التائية. نلخص النتائج الحديثة التي تم الحصول عليها من خلال تطبيق تقنيات الفحص المجهري الأكثر تقدمًا ومناقشة بعض قيود هذه الطرق.


1 المقدمة

تعتمد الاستجابة المناعية التكيفية على تفاعلات الخلايا التائية مع الخلايا المتغصنة (DCs) في المنطقة المجاورة للقشرة ، أو منطقة الخلايا التائية ، للعقد الليمفاوية (LNs). يحدد معدل عينة الخلايا التائية na & # x000EF عينات DC مدى السرعة التي يمكن أن يقوم بها الجهاز المناعي للاستجابة للعدوى (1). لقد أتاح تطوير طرق التصوير مثل الفحص المجهري ثنائي الفوتون (2PM) وقياس النسج إمكانية المراقبة المباشرة لمواقع الخلايا في الأنسجة. تشير العديد من الدراسات التي تُظهر الموقع النسبي للخلايا التائية والـ DC إلى أنهما تم وضعهما في LN لزيادة احتمالية تفاعلات T: DC (2 ، 3). على الرغم من التقدم في القدرة على تصوير ومراقبة الخلايا التائية في LNs ، فإن القليل من الدراسات تجري مقارنات كمية مباشرة لمدى ارتباط الخلايا التائية بأنواع خلايا أخرى متعددة في LNs.

تدخل الخلايا التائية paracortex من LN من الأوعية الدموية الصغيرة اللاحقة للشعيرات الدموية والتي تسمى الأوردة البطانية العالية (HEVs). تحتل الخلايا التائية والـ DCs والخلايا الشبكية الليفية (FRCs) هذه المنطقة جنبًا إلى جنب مع الأوعية الدموية (BVs). تنتقل الخلايا التائية بين DCs ، و FRCs ، والخلايا التائية الأخرى للتفاعل مع DCs التي تقدم المستضد. FRCs هي خلايا انسجة تغلف شبكة قنوات ألياف الكولاجين التي تسمح بنقل السائل الليمفاوي الذي يحمل مستضد قابل للذوبان والكيموكينات (4 & # x020137). تنتج FRCs chemokine CCL21 ، والذي له دور ثابت في توجيه الخلايا التائية na & # x000EFve إلى paracortex من الأوعية الدموية (8 ، 9). يوفر FRCs أيضًا الدعم الهيكلي المطلوب لتنشيط الخلايا التائية بكفاءة (10). باجينوف وآخرون. أظهر أن شبكة FRC مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالخلايا التائية na & # x000EF التي تتحرك داخل paracortex ، مما يشير إلى أن FRCs قد توفر شبكة تهاجر إليها الخلايا التائية (11).

هناك عدة فرضيات تتعلق بدور أنواع الخلايا الفردية في التوسط في تفاعلات T: DC. HEVs هي نقاط دخول للخلايا التائية التي تدخل الشبكة LN. جيرارد وآخرون يقترح أن تتجمع DC بالقرب من HEVs لزيادة معدل الاتصال مع الخلايا التائية الواردة (12). اقترح آخرون أن مراكز البيانات قد تتجمع عند تقاطعات شبكة FRC ، مما يسمح للخلايا التائية التي تنتقل على طول حواف الشبكة بمواجهة DC بمعدل متزايد (13 & # x0201316). تعد التفاعلات المكانية بين الخلايا التائية والأوعية الدموية ، و FRCs ، و DC مهمة إذا غيرت كيفية تحرك الخلايا التائية عبر paracortex وتوقيت المواجهات مع DCs التي تقدم المستضد ، وهي الخطوة الرئيسية في تنشيط الخلايا التائية وبدء المناعة التكيفية استجابة.

بالإضافة إلى الإشارات الهيكلية والخلوية ، تساهم الوسطاء الكيميائيون ، بما في ذلك الكيماويات ، في حركة الخلايا التائية واتصالات T: DC في LN. على سبيل المثال ، تبين أن جزيء الإشارة LPA الذي تنتجه FRCs يتوسط في حركة الخلايا التائية السريعة في LNs (17). بالإضافة إلى ذلك ، يعد نوع مستقبلات كيموكين C & # x02013C من النوع 7 (CCR7) ، وهو المستقبل الذي يتعرف على CCL21 ، مهمًا لحركة الخلايا التائية عالية السرعة في LN (18 ، 19). بينما يزيد CCR7 من سرعة حركة الخلايا التائية في LNs ، لم يتم التحقيق فيما إذا كان CCR7 يؤثر على اتصالات T: DC.

يتطلب فهم مساهمة مكونات LN الخلوية والهيكلية في توطين الخلايا التائية مقياسًا كميًا يسمح بإجراء مقارنات مباشرة بين الارتباطات المكانية لأنواع الخلايا المتعددة. أبلغت عدة مجموعات أخرى عن العلاقات المكانية بين الخلايا والهياكل باستخدام طرق مثل الفحص البصري (12 ، 20) ومقارنة زوايا الدوران لحركات الخلايا التائية مع الهياكل (11 ، 21). ومع ذلك ، لا يقارن أي من هذه الارتباطات بشكل مباشر بين أنواع الخلايا أو الهياكل المتعددة بمقياس كمي ثابت.

في هذه الدراسة ، نستخدم كلاً من معامل ارتباط بيرسون [PCC (22 ، 23)] وكذلك المعلومات المتبادلة [MI (24)] لمقارنة الارتباط المكاني لأنواع وهياكل الخلايا المتعددة. يقيس PCC التباين في شدة البكسل المتجانسة ، وغالبًا ما يستخدم لتحديد كولوكلونيشن ، لا سيما البروتينات الفلورية ، في أنظمة بيولوجية متعددة بما في ذلك دراسة الخلايا التائية (25 ، 26). يمكن حساب PCC و MI دون الحاجة إلى تحديد حدود الخلايا الفردية التي يمكن أن تكون صعبة بالنسبة لصور 2PM.

MI هو تطبيق لـ Shannon entropy (الذي يقيس مقدار عدم اليقين بشأن قيمة متغير عشوائي بالبتات) تم تعريفه في الأصل لفهم القيود المفروضة على معالجة الإشارات والاتصال (27). يحدد MI مقدار التخفيض في عدم اليقين بشأن متغير واحد عندما يعرف المرء قيمة متغير آخر. في تحليل الارتباطات المكانية ، نقيس انخفاض عدم اليقين بشأن موقع نوع خلية واحد بالنظر إلى موقع نوع خلية آخر. تم استخدام MI بنجاح في تطبيقات معالجة الصور الطبية الحيوية الأخرى ، لا سيما في قياس تشابه الصور في الأشعة السينية والتصوير بالرنين المغناطيسي من أجل التسجيل الآلي للصور (28 & # x0201331). علاوة على ذلك ، يتم التعرف على MI وغيرها من التدابير النظرية للمعلومات بشكل متزايد كأدوات قوية لتحليل الأنظمة المعقدة غير الخطية ، بما في ذلك الأنظمة البيولوجية المعقدة مثل جهاز المناعة (32 ، 33). في هذه المقالة ، نستخدم MI لتحديد الارتباط المكاني للخلايا التائية بأنواع الخلايا الأخرى (على سبيل المثال ، DC أو FRCs). نستخدم MI كمقياس للارتباط المكاني المستقل عن أنواع معينة من الخلايا أو الهياكل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن MI غير حساس نظريًا للحبيبات الخشنة (34). وبالتالي ، يمكن لـ MI قياس مقدار الاعتماد المكاني لعلامة الفلورسنت على أخرى مع تقليل التحيز القائم على الملاحظة. MI ، على عكس مقاييس المسافة مثل تحليل الجار الأقرب ، هو شحيح ، لأنه لا يتطلب معالجة صور مكثفة لإزالة ضوضاء الفوتون وتحديد حدود الخلية. بدلاً من ذلك ، يمكن أن يعمل MI على الصورة مباشرةً دون إدخال عتبات. في العمل التمهيدي ، استخدمنا MI لتحديد ارتباط الخلايا التائية و DC ووجدنا قدرًا أقل من المراسلات بين الخلايا التائية و DC مما كان متوقعًا (35).

ومع ذلك ، لا يمكن مقارنة MI عبر الصور ذات الأحجام المختلفة وكميات الفلورة. في هذه الدراسة ، نستخدم NMI لتطبيع MI ليكون بين 0 و 1 (36 & # x0201339) ، مما يسمح بإجراء مقارنات كمية للارتباطات المكانية بين الخلايا التي تتألق في قناة لونية واحدة وتتألق من نوع خلية آخر في قناة ألوان مختلفة عبر التجارب. نظرًا لأن كل من PCC و NMI هما طريقتان تعتمدان على البكسل ولا تتوافق مع أحجام الخلايا ، فإننا ننشئ مناطق داخل الصور تتطابق مع المقاييس الخلوية ونطبق PCC و NMI. يسمح تحليل المناطق وكذلك وحدات البكسل لهذه الأساليب بالتقاط الارتباطات في المقاييس ذات الصلة بيولوجيًا. يُظهر كل من تحليلات PCC و NMI الإقليمية أن الخلايا التائية ترتبط بشكل أقل بكثير بأهدافها النهائية ، DC ، مقارنةً بـ FRCs. تظهر نتائجنا أيضًا أن CCR7 لا يزيد من ارتباط الخلايا التائية مع DC.


تحديد العلامات الحيوية لمتلازمة التعب المزمن

أفادت دراسة جديدة أن علماء جامعة ستانفورد ابتكروا اختبارًا يعتمد على الدم يحدد بدقة الأشخاص الذين يعانون من متلازمة التعب المزمن.

رون ديفيس هو المؤلف الرئيسي لورقة بحثية تصف اختبار الدم الذي قد يكون قادرًا على تحديد متلازمة التعب المزمن.
ستيف فيش

الأشخاص الذين يعانون من مرض منهك وغالبًا ما يتم إهماله والمعروف باسم متلازمة التعب المزمن قد يكون لديهم قريبًا شيئًا كانوا يبحثون عنه منذ عقود: دليل علمي على مرضهم.

ابتكر باحثون في كلية الطب بجامعة ستانفورد اختبارًا للدم يمكنه تحديد المرض ، والذي يفتقر حاليًا إلى اختبار تشخيصي معياري وموثوق.

قال رون ديفيس ، دكتوراه ، أستاذ الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة: "في كثير من الأحيان ، يتم تصنيف هذا المرض على أنه مرض وهمي". قال ديفيس إنه عندما يطلب الأفراد المصابون بمتلازمة التعب المزمن المساعدة من الطبيب ، فقد يخضعون لسلسلة من الاختبارات التي تتحقق من وظائف الكبد والكلى والقلب ، وكذلك تعداد الدم وخلايا المناعة. وقال: "كل هذه الفحوصات المختلفة ستوجه الطبيب عادة نحو مرض أو آخر ، لكن بالنسبة لمرضى متلازمة التعب المزمن ، تعود جميع النتائج إلى طبيعتها".

وقال إن المشكلة هي أنهم لا يبحثون عميقا بما فيه الكفاية. الآن ، ابتكر ديفيس رحيم إسفاندياربور ، دكتوراه ، زميل أبحاث سابق في جامعة ستانفورد وزملاؤهم اختبارًا قائمًا على الدم نجح في تحديد المشاركين في دراسة يعانون من متلازمة التعب المزمن. ويستند الاختبار ، الذي لا يزال في طور تجريبي ، على كيفية استجابة الخلايا المناعية للشخص للتوتر. من خلال عينات الدم المأخوذة من 40 شخصًا - 20 مصابًا بمتلازمة التعب المزمن و 20 بدونها - أسفر الاختبار عن نتائج دقيقة ، حيث تم تحديد جميع مرضى متلازمة التعب المزمن بدقة وعدم وجود أي من الأفراد الأصحاء.

يمكن لمنصة التشخيص أن تساعد في تحديد الأدوية الممكنة لعلاج متلازمة التعب المزمن. من خلال تعريض عينات الدم للمشاركين للعقاقير المرشحة وإعادة إجراء الاختبار التشخيصي ، يمكن للعلماء أن يروا ما إذا كان الدواء قد حسن استجابة الخلايا المناعية. بالفعل ، يستخدم الفريق المنصة لفحص الأدوية المحتملة التي يأملون في أن تساعد الأشخاص الذين يعانون من متلازمة التعب المزمن في المستقبل.

تم نشر ورقة تصف نتائج البحث على الإنترنت في 29 أبريل في وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم. ديفيس هو المؤلف الرئيسي. إسفاندياربور ، الذي يعمل الآن في هيئة التدريس في جامعة كاليفورنيا-إيرفين ، هو المؤلف الرئيسي.

تقديم الإثبات

يعتمد تشخيص متلازمة التعب المزمن ، عندما يتم تشخيصها فعليًا ، على الأعراض - الإرهاق ، والحساسية للضوء والألم غير المبرر ، من بين أمور أخرى - ولا يأتي إلا بعد القضاء على احتمالات المرض الأخرى. يُعرف أيضًا باسم التهاب الدماغ والنخاع العضلي ويشار إليه بالاختصار ME / CFS. من المقدر أن مليوني شخص في الولايات المتحدة يعانون من متلازمة التعب المزمن ، ولكن هذا تخمين تقريبي ، كما قال ديفيس ، ومن المحتمل أن يكون أعلى من ذلك بكثير.

بالنسبة إلى ديفيس ، فإن السعي لإيجاد دليل علمي على المرض هو أمر شخصي. يأتي من رغبته في مساعدة ابنه ، الذي عانى من ME / CFS لمدة عقد تقريبًا. في الواقع ، كان الدليل البيولوجي الذي اكتشفه ديفيس لأول مرة في ابنه هو الذي دفعه هو وإسفاندياربور إلى تطوير أداة التشخيص الجديدة.

النهج ، الذي قاد إسفاندياربور تطويره ، يستخدم "مقايسة إلكترونية نانوية" ، وهو اختبار يقيس التغيرات في الكميات الضئيلة من الطاقة كمؤشر لصحة الخلايا المناعية وبلازما الدم. تحتوي تقنية التشخيص على آلاف الأقطاب الكهربائية التي تولد تيارًا كهربائيًا ، بالإضافة إلى غرف تحتوي على عينات دم مبسطة تتكون من الخلايا المناعية والبلازما. داخل الغرف ، تتداخل الخلايا المناعية والبلازما مع التيار ، مما يغير تدفقه من طرف إلى آخر. يرتبط التغيير في النشاط الكهربائي ارتباطًا مباشرًا بصحة العينة.

الفكرة هي التأكيد على العينات المأخوذة من المرضى الأصحاء والمرضى باستخدام الملح ، ثم مقارنة كيفية تأثير كل عينة على تدفق التيار الكهربائي. تشير التغييرات في التيار إلى تغييرات في الخلية: كلما زاد التغيير في التيار ، زاد التغيير على المستوى الخلوي. التغيير الكبير ليس بالشيء الجيد ، إنه علامة على أن الخلايا والبلازما تتلاشى تحت الضغط وغير قادرة على معالجتها بشكل صحيح. أحدثت جميع عينات الدم المأخوذة من مرضى ME / CFS ارتفاعًا واضحًا في الاختبار ، في حين أن العينات المأخوذة من عناصر تحكم صحية أعادت بيانات كانت متساوية نسبيًا.

قال ديفيس: "لا نعرف بالضبط لماذا تتصرف الخلايا والبلازما بهذه الطريقة ، أو حتى ما تفعله". "ولكن هناك أدلة علمية على أن هذا المرض ليس من تلفيق عقل المريض. نحن نرى بوضوح اختلافًا في الطريقة التي تعالج بها الخلايا المناعية لمتلازمة التعب الصحي والمزمن الإجهاد ". الآن ، يقوم Esfandyarpour و Davis بتوسيع عملهم لتأكيد النتائج في مجموعة أكبر من المشاركين. يتم التوظيف للمشروع الأكبر ، والذي يهدف إلى زيادة تأكيد نجاح الاختبار التشخيصي ، على أساس متجدد. يجب على المهتمين بالمشاركة الاتصال بمنسقة الأبحاث السريرية آنا أوكومو.

بمضاعفة

بالإضافة إلى تشخيص ME / CFS ، يقوم الباحثون أيضًا بتسخير المنصة لفحص العلاجات القائمة على الأدوية ، نظرًا لأن الخيارات حاليًا ضئيلة. قال إسفاندياربور: "باستخدام مقايسة الإلكترونيات النانوية ، يمكننا إضافة جرعات مضبوطة من العديد من الأدوية العلاجية المختلفة المحتملة إلى عينات دم المريض وإعادة اختبار التشخيص مرة أخرى".

إذا كانت عينات الدم المأخوذة من الأشخاص المصابين بـ ME / CFS لا تزال تستجيب بشكل سيئ للإجهاد وتولد ارتفاعًا في التيار الكهربائي ، فمن المحتمل أن الدواء لم يعمل. ومع ذلك ، إذا بدا أن الدواء يخفف من قفزة النشاط الكهربائي ، فقد يعني ذلك أنه يساعد الخلايا المناعية والبلازما على معالجة الإجهاد بشكل أفضل. حتى الآن ، وجد الفريق بالفعل عقارًا مرشحًا يبدو أنه يعيد الوظيفة الصحية للخلايا المناعية والبلازما عند اختباره في الفحص. على الرغم من نجاح هذا الدواء في الفحص ، إلا أنه لا يتم استخدامه حاليًا في الأشخاص المصابين بـ ME / CFS ، ولكن يأمل ديفيس وإسفاندياربور في أن يتمكنوا من اختبار نتائجهم في تجربة سريرية في المستقبل.

تمت الموافقة على جميع الأدوية التي يتم اختبارها بالفعل من قبل إدارة الغذاء والدواء أو سيتم قريبًا الوصول إليها على نطاق واسع للجمهور ، وهو أمر أساسي للوصول السريع والنشر في حالة خروج أي من هذه المركبات.

مؤلفو الدراسة الآخرون في جامعة ستانفورد هم علماء البحث محسن نعمات جورجاني وجولي ويلهيلمي ومساعد البحث أليكس كاشي.

تم تمويل الدراسة من قبل مؤسسة الطب المفتوح. ديفيس هو مدير المجلس الاستشاري العلمي للمؤسسة.

كما دعمت أقسام جامعة ستانفورد لعلم الوراثة والكيمياء الحيوية العمل.


مقدمة

يُعرَّف الإجهاد بأنه عملية تؤدي فيها المطالب البيئية إلى إجهاد الكائن الحي والقدرة على التكيف مما يؤدي إلى مطالب نفسية وكذلك تغييرات بيولوجية يمكن أن تعرض لخطر الإصابة بالمرض (1). الأشياء التي تسبب لنا التوتر تسمى الضغوطات. يؤثر الإجهاد على الجميع ، صغارًا وكبارًا ، غنيًا وفقيرًا. الحياة مليئة بالتوتر. الإجهاد هو كل حقيقة من حقائق الحياة التي يجب علينا جميعًا التعامل معها. يأتي في جميع الأشكال والأحجام حتى أفكارنا يمكن أن تسبب لنا التوتر وتجعل جسم الإنسان أكثر عرضة للإصابة بالأمراض. هناك ثلاث نظريات أو وجهات نظر تتعلق بالإجهاد البيئي والإجهاد النفسي (العاطفي) والإجهاد البيولوجي (1). يؤكد منظور الإجهاد البيئي على تقييم المواقف أو التجارب البيئية التي ترتبط بشكل موضوعي بمتطلبات التكيف الكبيرة. يؤكد منظور الإجهاد النفسي على التقييمات الشخصية للأفراد وقدرتهم على التعامل مع الطلبات المقدمة لهم من خلال مواقف وتجارب معينة. أخيرًا ، يؤكد منظور الإجهاد البيولوجي على وظيفة بعض الأنظمة الفسيولوجية في الجسم التي تنظمها الظروف النفسية والجسدية.

العلاقة بين التوتر والمرض معقدة. تختلف القابلية للتوتر من شخص لآخر. قد لا يتسبب الحدث الذي يتسبب في مرض لشخص ما في مرض شخص آخر. يجب أن تتفاعل الأحداث مع مجموعة متنوعة من العوامل الخلفية لتظهر كمرض. من بين العوامل التي أثرت في قابلية التعرض للتوتر الضعف الوراثي وأسلوب التكيف ونوع الشخصية والدعم الاجتماعي. عندما نواجه مشكلة ، فإننا نقيم خطورة المشكلة ونقرر ما إذا كان لدينا الموارد اللازمة للتعامل مع المشكلة أم لا. إذا اعتقدنا أن المشكلة خطيرة ولا نملك الموارد اللازمة للتعامل معها ، فسننظر إلى أنفسنا على أننا تحت الضغط (2). إنها طريقتنا في التعامل مع المواقف التي تحدث فرقًا في قابليتنا للإصابة بالمرض ورفاهيتنا بشكل عام.

ليس كل التوتر له تأثير سلبي. عندما يتحمل الجسم الإجهاد ويستخدمه للتغلب على الخمول أو لتحسين الأداء ، يكون التوتر إيجابيًا وصحيًا وصعبًا. هذا ما وصفه هانز سيلي (3) ، أحد رواد دراسة الإجهاد الحديثة eustress. يكون الإجهاد إيجابيًا عندما يجبرنا على التكيف وبالتالي زيادة قوة آليات التكيف لدينا ، ويحذرنا من أننا لا نتأقلم جيدًا وأن تغيير نمط الحياة له ما يبرره إذا أردنا الحفاظ على الصحة المثلى. هذا الضغط المعزز للعمل يمنح الرياضي الميزة التنافسية والمتحدث العام الحماس لعرضه على النحو الأمثل. يكون الإجهاد سلبيًا عندما يتجاوز قدرتنا على التأقلم ، ويجهد أجهزة الجسم ويسبب مشاكل سلوكية أو جسدية. يسمى هذا الضغط الضار محنة. ينتج عن الضيق رد فعل مبالغ فيه وارتباك وضعف تركيز وقلق من الأداء وعادة ما ينتج عنه أداء دون المستوى. يوضح الشكل 1 هذا المفهوم.

Eustress هو الضغط المعزز للعمل الذي يمنح الرياضيين ميزة تنافسية

هناك قلق متزايد بشأن التكلفة المتزايدة وانتشار الاضطرابات المرتبطة بالتوتر خاصة فيما يتعلق بمكان العمل. & # x0201c عملت حتى الموت ، وإسقاط الموت ، والعمل حتى تسقط & # x0201d يتم تمييزها & # x0201c work-related death & # x0201d في القرن الحادي والعشرين. البلدان المشهورة بساعات العمل الطويلة تعرف هذا جيدًا بما فيه الكفاية ، لدى كل من اليابان والصين كلمة تشير إلى الموت بسبب إرهاق العمل & # x02013 كاروشي و guolaosi على التوالى. تعترف كل من اليابان وكوريا بالانتحار كشرط رسمي وقابل للتعويض يتعلق بالعمل (4). ارتفع معدل الانتشار التقديري للإجهاد والظروف المرتبطة بالإجهاد في المملكة المتحدة من 829 حالة لكل 100،000 عامل في عام 1990 إلى 1700 حالة لكل 100،000 في عام 2001/2002. في ذلك العام ، تم إرجاع 13.4 مليون يوم عمل ضائع إلى التوتر أو القلق أو الاكتئاب ، مع تقدير 265000 حالة جديدة من الإجهاد. كشف أحدث تحليل لمدير الصحة والسلامة (HSE) لمعدل الأمراض المبلغ عنها ذاتيًا أن التوتر أو الاكتئاب أو القلق يؤثر على 1.3٪ من القوى العاملة (5). تشير التقديرات إلى أن 80٪ إلى 90٪ من جميع الحوادث الصناعية تتعلق بمشكلة شخصية وعدم قدرة الموظفين # x02019 على التعامل مع الإجهاد (6). أفادت الوكالة الأوروبية للسلامة والصحة في العمل أن حوالي 50 ٪ من التغيب عن العمل ناتج عن الإجهاد (7).

إن معدلات الاعتلال والوفيات بسبب الأمراض المرتبطة بالإجهاد تنذر بالخطر. الإجهاد العاطفي هو عامل رئيسي يسهم في الأسباب الستة الرئيسية للوفاة في الولايات المتحدة: السرطان وأمراض القلب التاجية والإصابات العرضية واضطرابات الجهاز التنفسي وتليف الكبد والانتحار. وفقًا لإحصاءات شركة Meridian Stress Management Consultancy في المملكة المتحدة ، يموت ما يقرب من 180 ألف شخص في المملكة المتحدة كل عام بسبب شكل من أشكال الأمراض المرتبطة بالإجهاد (7). يقدر مركز السيطرة على الأمراض والوقاية منها بالولايات المتحدة أن الإجهاد يمثل حوالي 75 ٪ من جميع الأطباء الذين يزورون (7). يتضمن ذلك نطاقًا واسعًا للغاية من الشكاوى الجسدية بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، الصداع وآلام الظهر ومشاكل القلب واضطراب المعدة وقرحة المعدة ومشاكل النوم والتعب والحوادث. وفقًا لأخبار الصحة والسلامة المهنية والمجلس الوطني لتعويض التأمين ، فإن ما يصل إلى 90٪ من جميع زيارات أطباء الرعاية الأولية هي للشكاوى المتعلقة بالإجهاد.

الإجهاد والجهاز المناعي

نظام المناعة لدينا هو منطقة أخرى عرضة للإجهاد. لقد خرج الكثير مما نعرفه عن العلاقة بين الدماغ والجهاز العصبي والاستجابة المناعية من مجال علم المناعة العصبية (PNI). تم تطوير PNI في عام 1964 من قبل الدكتور روبرت أدير ، مدير قسم السلوك والطب النفسي الاجتماعي في جامعة روتشستر. علم المناعة العصبي النفسي هو دراسة التفاعل المعقد للوعي (النفسي) والدماغ والجهاز العصبي المركزي (عصبي) ، ودفاع الجسم ضد العدوى الخارجية وانقسام الخلايا الشاذة (علم المناعة) (8). وبشكل أكثر تحديدًا فهو مكرس لفهم التفاعلات بين الجهاز المناعي والجهاز العصبي المركزي وجهاز الغدد الصماء. على الرغم من أن تخصصًا طبيًا جديدًا نسبيًا ، إلا أن الجذور الفلسفية للعلاقة بين الصحة البدنية والدماغ والعواطف يمكن إرجاعها إلى أرسطو.

يتم تنظيم الاستجابات المناعية عن طريق المستضد والأجسام المضادة والسيتوكينات والهرمونات. تعتبر الخلايا الليمفاوية هي المسئولة الأكبر عن تنظيم وظائف الجهاز المناعي. يحتوي الجهاز المناعي على حوالي 1 تريليون خلية ليمفاوية. تسمى الخلايا الليمفاوية التي تنمو وتنضج في الغدة الصعترية الخلايا التائية تسمى الخلايا الليمفاوية الأخرى الخلايا البائية. تفرز الخلايا البائية الأجسام المضادة ، والمواد الكيميائية التي تطابق غزاة معينة تسمى المستضدات (المناعة الخلطية). لا تفرز الخلايا التائية الأجسام المضادة ولكنها تعمل بمثابة رسل وقاتلة ، حيث تحدد موقع المستضدات الغازية وتدمرها (المناعة الخلوية). تسمى بعض الخلايا التائية مساعدين، تساعد في تنشيط إنتاج الخلايا التائية والبائية الأخرى. تسمى الخلايا التائية الأخرى مثبطات، وقف إنتاج المستضدات ، وإيقاف الهجوم. يجب أن يكون عدد الخلايا التائية والخلايا البائية متوازنة لكي تؤدي بشكل فعال. عندما تكون نسبة الخلايا التائية إلى الخلايا البائية غير متوازنة ، تتأثر الاستجابة المناعية ولا تعمل بشكل فعال. المواد الكيميائية الرئيسية الأخرى التي ينتجها الجهاز المناعي هي البلاعم ، وحيدات الخلايا والخلايا المحببة. تغلف هذه المواد الكيميائية الكائنات الحية الدقيقة الغازية ومستضدات أخرى وتدمرها وتهضمها. معروف بشكل عام باسم البالعات، فهم يتعاونون مع أكثر من 20 نوعًا من البروتينات التي تشكل الجهاز المناعي ونظام # x02019 المكمل. يتم تشغيل هذا النظام عن طريق الأجسام المضادة التي تحبس المستضدات ، والتي تسبب تفاعلات التهابية.

السيتوكينات هي جزيئات رسول غير جسم مضاد من مجموعة متنوعة من خلايا الجهاز المناعي. تحفز السيتوكينات الإطلاق الخلوي لمركبات معينة تشارك في الاستجابة الالتهابية. يتم تصنيعها بواسطة العديد من مجموعات الخلايا ، ولكن المنتجين الغالبين هم الخلايا التائية المساعدة (ث) والضامة. تمنع السيتوكينات Th1 و Th2 بعضها البعض & # x02019s الإنتاج والوظيفة: تحفز خلايا Th1 المناعة الخلوية وتثبط المناعة الخلطية ، في حين أن السيتوكينات Th2 لها تأثير معاكس. السيتوكينات هو اسم عام يشمل الاسم المحدد الآخر اللمفوكينات (السيتوكينات التي تنتجها الخلايا الليمفاوية) ، والكيموكينات (السيتوكينات ذات الأنشطة الكيميائية) ، والإنترلوكين (IL) (السيتوكينات التي تصنعها إحدى الكريات البيض وتعمل على الكريات البيض الأخرى) والإنترفيرون (IFN) (إطلاق السيتوكينات بواسطة الخلية التي يغزوها الفيروس والتي تحث الخلية المحيطة على إنتاج إنزيمات تتداخل مع تكاثر الفيروس).

يتم إنتاج السيتوكينات من جديد استجابة لمحفز مناعي. تعمل بشكل عام على مسافات قصيرة وفترات زمنية قصيرة وبتركيز منخفض جدًا. إنها تعمل عن طريق الارتباط بمستقبلات غشائية معينة ، والتي ترسل إشارات للخلية عبر المرسل الثاني ، غالبًا كينازات التيروزين ، لتغيير سلوكها (التعبير الجيني). تشمل الاستجابات للسيتوكينات زيادة أو نقصان التعبير عن بروتينات الغشاء (بما في ذلك مستقبلات السيتوكينات) ، وتكاثر وإفراز جزيئات المؤثرات. تحفز أكبر مجموعة من السيتوكينات تكاثر الخلايا المناعية وتمايزها. بعض المستضدات البكتيرية الشائعة تنشط المكمل وتحفز الضامة للتعبير عن جزيئات التحفيز المشترك. تحفز المستضدات الاستجابة المناعية التكيفية عن طريق تنشيط الخلايا الليمفاوية ، والتي بدورها تصنع الأجسام المضادة لتنشيط المكملات والسيتوكينات لزيادة التخلص من المستضد وتجنيد الكريات البيض الإضافية.

أظهرت العديد من الدراسات أن الإجهاد المزمن يمارس تأثيرًا عامًا مثبطًا للمناعة يثبط أو يحجب قدرة الجسم على بدء تفاعل مناعي سريع وفعال (9 ، 10). يُعزى ذلك إلى وفرة الكورتيكوستيرويدات التي يتم إنتاجها أثناء الإجهاد المزمن ، مما ينتج عنه خلل في مستويات الكورتيكوستيرويد ويضعف الكفاءة المناعية. يُعتقد أن ضعف الوظيفة المناعية يرتبط بالإجهاد العام على أجزاء الجسم المختلفة المرتبط بإنتاج وصيانة جهاز المناعة. على سبيل المثال ، يؤدي ضمور الغدة الصعترية أو تقلص الغدة الصعترية إلى عدم قدرتها على إنتاج الخلايا التائية أو الهرمونات اللازمة لتحفيزها. هذا يمكن أن يؤدي إلى خلل وعدم كفاءة في الاستجابة المناعية بأكملها. هذا يتوافق مع النتيجة التي مفادها أنه مع تقدمنا ​​في السن ، فإننا عرضة للإصابة بالعدوى والسرطان وفرط الحساسية والمناعة الذاتية.

في تحليل تلوي لـ 293 دراسة مستقلة تم الإبلاغ عنها في مجلة علمية محكمة بين عامي 1960 و 2001 مع مشاركة حوالي 18941 ، تم التأكيد على أن الإجهاد يغير المناعة (11). يعزز الإجهاد قصير المدى في الواقع جهاز المناعة لأنه يستعد لمواجهة تحدٍ والتغلب عليه مثل الاستجابة التكيفية التي تستعد للإصابة أو العدوى ، لكن الإجهاد طويل الأمد أو المزمن يسبب الكثير من البلى ، وسوف ينهار النظام بشكل خاص. إذا كان للفرد القليل من السيطرة على الأحداث. كشفت التحليلات (11) أن الضغوطات المزمنة التي تغير هويات الأشخاص أو الأدوار الاجتماعية ، هي أكثر خارجة عن سيطرتهم ويبدو أنها لا نهاية لها & # x02013 كانت مرتبطة بالتعبير العالمي عن المناعة تقريبًا ، تم إسقاط جميع مقاييس الوظيفة المناعية في جميع المجالات. تلعب مدة التوتر دورًا أيضًا. كلما طالت فترة الإجهاد ، زاد تحول جهاز المناعة من التغيرات التكيفية المحتملة (مثل تلك التي تحدث في استجابة القتال أو الطيران) إلى تغييرات قد تكون ضارة ، في البداية في المناعة الخلوية ثم في وظيفة المناعة الأوسع. ووجدوا أيضًا أن أجهزة المناعة لدى كبار السن أو المرضى بالفعل أكثر عرضة للتغيير المرتبط بالتوتر.

الرابط بين التوتر والمرض

العامل الحاسم المرتبط بالإجهاد هو تأثيره المزمن مع مرور الوقت. تشمل الضغوطات المزمنة المتاعب اليومية ، والإحباط من الاختناقات المرورية ، وعبء العمل الزائد ، والصعوبات المالية ، والحجج الزوجية أو المشاكل العائلية. هناك ، بالطبع ، العديد من الأشياء التي يمكن أن تسبب التوتر ، ولكن هذه هي الضغوطات التي نواجهها عادة في الحياة اليومية. الغضب المكبوت الذي نحمله داخل أنفسنا تجاه أي من هذه المواقف ، أو الشعور بالذنب والاستياء الذي نتمسك به تجاه الآخرين وأنفسنا ، ينتج عنه نفس التأثيرات على منطقة ما تحت المهاد. وبدلاً من التخلص من هذا الضغط ، فإننا نحتفظ به في الداخل حيث تصبح آثاره تراكمية.

تظهر الأبحاث أن كل جهاز في الجسم تقريبًا يمكن أن يتأثر بالإجهاد المزمن. عندما لا يتم التخلص من التوتر المزمن ، فإنه يثبط نظام المناعة في الجسم ويتجلى في النهاية على شكل مرض. لا يسع المرء إلا أن يتساءل عما سيحدث للجسم إذا ظل في استجابة القتال أو الطيران. لحسن الحظ ، في ظل الظروف العادية ، بعد مرور ثلاث دقائق على انتهاء حالة التهديد وإزالة الخطر الحقيقي أو المتخيل ، تنحسر استجابة القتال أو الطيران ويستريح الجسم ويعود إلى حالته الطبيعية. خلال هذا الوقت ، يعود معدل ضربات القلب وضغط الدم والتنفس وتوتر العضلات والهضم والتمثيل الغذائي والجهاز المناعي إلى طبيعته. إذا استمر الإجهاد بعد رد الفعل الأولي للقتال أو الطيران ، فإن رد فعل الجسم # x02019 يدخل مرحلة ثانية. خلال هذه المرحلة ، النشاط إذا انخفض الجهاز العصبي الودي ويقل إفراز الأدرينالين ، لكن إفراز الكورتيكوستيرويد يستمر عند المستويات الطبيعية. أخيرًا ، إذا استمر التوتر ولم يتمكن الجسم من التكيف ، فمن المحتمل أن يكون هناك انهيار في الموارد الجسدية.

الأمراض الطبية

في الربو ، تشارك العوامل الخارجية والداخلية ، وهو العامل الداخلي الأكثر تأثراً بالتأثيرات الحادة للضغوط النفسية. تم دمج العلاج الأسري على نطاق واسع في علاج الأطفال المصابين بالربو. يُعزى التحسن إلى تقليل التفاعل مع الوالدين الذي ينتج عنه مواقف مرهقة بشكل متكرر. بالإضافة إلى ذلك ، يتعرض المصابون بالربو لمادة غير ضارة اعتقدوا أنهم يعانون من الحساسية من شأنه أن يؤدي إلى نوبة شديدة (12). دراسة قام بها Gauci et al. أظهر (13) ارتباطات إيجابية مهمة بين عدد قليل من المقاييس المرتبطة بالضيق في Minnesota Multiphasic Personality Inventory (MMPI) وتفاعل الجلد استجابةً لمسببات الحساسية. بشكل جماعي ، تقدم هذه البيانات دليلًا على وجود ارتباط واضح بين الإجهاد والضعف المناعي والنشاط السريري لمرض التأتبي والربو. لمزيد من المرجع ، Liu et al. (14) قدمت أدلة ممتازة على أن الإجهاد يمكن أن يعزز الاستجابة الالتهابية التحسسية.

من المعروف أن أمراض الجهاز الهضمي مثل القرحة الهضمية (PU) والتهاب القولون التقرحي (UC) تتأثر بشكل كبير بالإجهاد. يحدث PU مرتين في كثير من الأحيان في مراقبي الحركة الجوية كما هو الحال في مساعدي الطيارين المدنيين ، ويحدث بشكل متكرر بين مراقبي الحركة الجوية في المراكز عالية الضغط (Chicago O & # x02019Hare و La Guardia و JFK ومطار لوس أنجلوس الدولي) من المراكز منخفضة الضغط (المطارات في المدن الأقل كثافة سكانية في فيرجينيا وأوهايو وتكساس وميتشيغان). على الرغم من أن الإجهاد هو عامل خطر في PU ، إلا أنه يُعتقد أن أكثر من 20 عاملاً آخر مرتبط أيضًا: فصيلة الدم ، والجنس ، ونوع مستضد HLA ، وتليف الكبد الكحولي ، وارتفاع ضغط الدم ، ومرض الانسداد الرئوي المزمن ، وتدخين السجائر ، وحتى استهلاك القهوة ، المشروبات الغازية أو الحليب أثناء الكلية (12). ارتبطت بعض أحداث الحياة المجهدة ببداية أو تفاقم الأعراض في الاضطرابات المزمنة الشائعة الأخرى في الجهاز الهضمي مثل الاضطرابات المعوية الوظيفية (FGD) ومرض التهاب الأمعاء (IBD) ومرض الجزر المعدي المريئي (GERD). يلعب ضغوط الحياة المبكرة على شكل إساءة دورًا رئيسيًا في القابلية لتطوير FGD بالإضافة إلى IBD في وقت لاحق من الحياة (15).

القرحة ناتجة عن فرط حموضة المعدة ، وقد أظهرت الدراسات التي أجريت على مرضى النواسير المعدية أن الغضب والعداء يزيدان حموضة المعدة ، بينما يقلل الاكتئاب والانسحاب منها. تربط نظرية أخرى آثار الإجهاد على تطور القرحات المرتبطة بالغشاء المخاطي الذي يبطن المعدة. تنص النظرية على أنه أثناء الإجهاد المزمن ، يتسبب إفراز النورادرينالين في انقباض الشعيرات الدموية في بطانة المعدة.وهذا بدوره يؤدي إلى توقف إنتاج الغشاء المخاطي وفقد الحاجز الواقي للأغشية المخاطية لجدار المعدة. بدون الحاجز الواقي ، يقوم حمض الهيدروكلوريك بتفتيت الأنسجة ويمكن أن يصل إلى الأوعية الدموية ، مما يؤدي إلى نزيف القرحة (16). ومع ذلك ، فقد اكتشف مؤخرًا أن العديد من حالات القرحة تسببها بكتيريا تسمى هيليكوباكتر بيلوري (جرثومة المعدة) (17). على الرغم من أن الآلية الدقيقة التي تسبب بها القرح غير معروفة ، إلا أنه يعتقد ذلك جرثومة المعدة يؤدي إلى التهاب بطانة الجهاز الهضمي ، ويحفز إنتاج الحمض أو كليهما.

لطالما اعتُبر مرض القلب التاجي (CHD) مرضًا نفسيًا جسديًا كلاسيكيًا حيث تأثر بدايته أو مساره بمجموعة متنوعة من المتغيرات النفسية والاجتماعية. تمت دراسة الجوانب النفسية والاجتماعية لأمراض القلب التاجية على نطاق واسع وهناك دليل قوي على أن الإجهاد النفسي هو عامل خطر كبير لوفيات CHD و CHD (18،19،20،21). وجد تينانت (19) علاقة إيجابية بين ضغوط الحياة واحتشاء القلب والموت المفاجئ أثناء الدراسة بواسطة Rosengren et al. (20) ذكر أن معدل وفيات أمراض القلب التاجية قد زاد مرتين للرجال الذين عانوا من ثلاثة أحداث سابقة أو أكثر في الحياة. كشفت دراسة INTERHEART (21) أن الأشخاص المصابين باحتشاء عضلة القلب أبلغوا عن ارتفاع معدل انتشار أربعة عوامل توتر: الإجهاد في العمل والمنزل ، والضغوط المالية وأحداث الحياة الكبرى في العام الماضي.

على الرغم من أن الأدلة الداعمة للارتباط بين السلوك من النوع A (السلوك العدواني والتنافسي والموجه نحو العمل والعاجل) و CHD كانت متضاربة (22) وجدت بعض الدراسات أن الأفراد من النوع A يولدون أحداثًا مرهقة في الحياة وكانوا أكثر عرضة من غيرهم لتفسير المواجهة حدث في الحياة بطريقة معاكسة عاطفياً (23 ، 24). إذا كان النوع (أ) عامل خطر ، فقد لا يعمل عن طريق الخلل الوظيفي الفسيولوجي طويل المدى (مما يؤدي إلى تصلب الشرايين) ، ولكن عن طريق أحداث الحياة الحادة التي تسبب إجهادًا شديدًا للقلب. أحد مكونات السلوك من النوع أ هو العداء ، والذي قد يكون مرتبطًا بمخاطر أمراض الشرايين التاجية. أشارت بعض الدراسات (25 ، 26) إلى أن أحداث أمراض الشرايين التاجية السريرية يتم التنبؤ بها عن طريق العداء ويبدو أن هذا مستقل عن عوامل الخطر الأخرى. وجد أيضًا أن العداء مرتبط بتصلب الشرايين في بعض دراسات تصوير الأوعية (27 ، 28). وجدت دراسات أخرى أن قمع الغضب مرتبط بحدث أمراض الشرايين التاجية (29) وتصلب الشرايين (27 ، 28). عند مراجعة هذه النتائج ، خلص تينانت (30) إلى أن احتمال ظهور العداء (أو قمعه) قد يكون له دور ما في أمراض الشرايين التاجية ، على الرغم من أن الآلية غير واضحة.

عوامل الخطر الرئيسية الثلاثة المتفق عليها بشكل عام مرتبطة بأمراض القلب التاجية هي ارتفاع نسبة الكوليسترول في الدم وارتفاع ضغط الدم وتدخين السجائر. في محاولة لتحديد أسباب زيادة مستويات الكوليسترول في الدم ، فريدمان وآخرون. (31) أجرى أحد التحقيقات المبكرة للعلاقة بين الإجهاد والكوليسترول في الدم. ووجدوا أن الإجهاد هو أحد أسباب زيادة مستويات الكوليسترول في الدم. قام باحثون آخرون درسوا طلاب الطب الذين يواجهون ضغوط الامتحان (32) والطيار العسكري في بداية فترة تدريبهم وامتحانهم (33) بالتحقق من النتائج. نظرًا لارتفاع ضغط الدم والكوليسترول في الدم أثناء الإجهاد ، فإن العلاقة بين الإجهاد وارتفاع ضغط الدم يُنظر إليها منذ فترة طويلة على أنها ضغط عاطفي تعتبر بشكل عام عاملاً رئيسًا في مسببات ارتفاع ضغط الدم (34). جاء أحد الأدلة المبكرة على هذه العلاقة من الدراسة المكثفة لـ 1600 مريض في المستشفى بواسطة دنبار (35). ووجد أن بعض السمات الشخصية كانت مميزة لمرضى ارتفاع ضغط الدم ، على سبيل المثال ، كان من السهل أن ينزعجوا من النقد أو النقص ، ويمتلكون الغضب المكبوت ويفتقرون إلى الثقة بالنفس. وإدراكًا لهذه العلاقة ، فقد تضمنت البرامج التعليمية لمرضى ارتفاع ضغط الدم إدارة الإجهاد.

يبدو أن بعض الأشخاص معرضون وراثيًا للإصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي (RA). ما يقرب من نصف المصابين بهذه الحالة لديهم بروتين في الدم يسمى عوامل الروماتويد (RF) ، وهو أمر نادر في الأشخاص غير المصابين بالتهاب المفاصل. نظرًا لأن التهاب المفاصل الروماتويدي ينطوي على قيام الجسم بالتحول إلى نفسه (استجابة مناعية ذاتية) ، فقد تم افتراض أن شخصية التدمير الذاتي قد تظهر نفسها من خلال هذا المرض (16). على الرغم من أن الأدلة التي تدعم هذه الفرضية ليست قاطعة ، فقد وجد العديد من الباحثين اختلافات في الشخصية بين مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي وغيرهم. تم العثور على المصابين بهذا المرض على أنهم مثاليون وهم يضحون بأنفسهم ، وماسوشي ، ويخجلون من أنفسهم. وُجد أن المريضات يعانين من التوتر ، وتقلبات المزاج ، والاكتئاب ، ولديهن تاريخ من الرفض من قبل أمهاتهن ولديهن آباء صارمون. لقد تم اقتراح أن الأشخاص الذين يعانون من RF والذين يعانون من الإجهاد المزمن يصبحون عرضة لـ RA (16). تؤدي أعطال الجهاز المناعي لديهم والاستعداد الوراثي لـ RA إلى تطور الحالة لديهم.

ينتج الصداع النصفي عن انقباض وتوسع الشرايين السباتية في أحد جانبي الرأس. غالبًا ما ترتبط مرحلة الانقباض ، التي تسمى البادرة ، بحساسية الضوء أو الضوضاء والتهيج واحمرار الجلد أو شحوبه. عندما يحدث توسع الشرايين ، تحفز بعض المواد الكيميائية النهايات العصبية المجاورة ، مما يسبب الألم. قد يؤدي النظام الغذائي إلى حدوث الصداع النصفي لبعض الأشخاص. ومع ذلك ، فإن الفكر السائد حول سبب الصداع النصفي يتعلق بالتوتر والتوتر العاطفي. يرتبط الشعور بالقلق أو العصبية أو الغضب أو الغضب المكبوت بالصداع النصفي. قد يتم إجهاض الهجوم عندما يعطي الفرد تنفيسًا عن الشخصية الأساسية (8). يعاني المصاب بالصداع النصفي النموذجي من الكمال ، والطموح ، والصلابة ، والنظام ، والتنافس المفرط ، وغير قادر على تفويض المسؤولية.

هناك أيضًا دليل على أن التجربة المجهدة عاطفياً مرتبطة باضطراب الغدد الصماء مثل داء السكري (36). يمكن أن تؤدي الضغوطات الجسدية أو النفسية إلى تغيير احتياجات الأنسولين ، وغالبًا ما تكون الضغوطات مسؤولة عن نوبات فقدان السيطرة ، خاصة عند الأطفال المصابين بالسكري. غالبًا ما يتأثر مرض السكري من النوع الثاني بالتوتر ، حيث يميل إلى الحدوث عند البالغين الذين يعانون من زيادة الوزن وهو شكل أقل حدة من مرض السكري (12). بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأطفال الذين تعرضوا لأحداث مرهقة في الحياة ناتجة عن خسائر فعلية أو مهددة داخل الأسرة وتحدث بين سن 5 و 9 سنوات كانوا أكثر عرضة للإصابة بمرض السكري من النوع الأول.

يمكن أن يؤدي الإجهاد الحاد إلى قمع الجسم المضاد الخاص بالفيروس واستجابات الخلايا التائية للقاح التهاب الكبد B (37). الأشخاص الذين يظهرون استجابات ضعيفة للقاحات لديهم معدل أعلى للإصابة بالأمراض بما في ذلك عدوى فيروس الأنفلونزا. هناك العديد من الدراسات الأخرى التي أثبتت وجود علاقة بين الإجهاد النفسي وقابلية الإصابة بالعديد من فيروسات البرد (38،39). هذا ليس مفاجئًا ، لأن الإجهاد يقمع فيروسات الجهاز المناعي الكامنة وبالتالي يكون من الأسهل عودة ظهوره لأن الجسم لا يستطيع الدفاع عن نفسه بعد الآن. لقد قوبلت محاولات إيجاد ارتباط بين الإجهاد وتطور المرض لدى مرضى متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) بنتائج متضاربة (40). فشل تحليل دراسة الإيدز متعددة المراكز في ملاحظة وجود ارتباط بين الاكتئاب وتدهور الخلايا الليمفاوية التائية CD4 + ، وتطور المرض أو الوفاة (41) ، ولكن وجد آخرون ارتباطًا كبيرًا بين المعلمات المناعية التي تعكس تطور فيروس نقص المناعة البشرية والعوامل النفسية والاجتماعية ، وخاصة الإنكار والعوامل النفسية والاجتماعية. الضيق (42) ، وإخفاء الهوية الجنسية المثلية (43).

الأمراض النفسية

قدمت مجموعة كبيرة من الأبحاث في العقود الأربعة الماضية أدلة على أن أحداث الحياة الأخيرة تساهم في ظهور المرض النفسي (44). الارتباط بين أحداث الحياة المجهدة والمرض النفسي أقوى من ارتباطها بالأمراض الجسدية أو الطبية. وجد Vincent and Roscenstock (45) أنه قبل دخول المستشفى ، عانى المرضى الذين يعانون من اضطرابات نفسية من أحداث مرهقة أكثر من أولئك الذين يعانون من اضطرابات جسدية. وفي الوقت نفسه ، فشل أندرو وتينانت (46 عامًا) في إيجاد العلاقة بين الإجهاد والمرض الجسدي. على الرغم من أن العلاقة الدقيقة بين الإجهاد والمرض النفسي غير واضحة ، فإن المسار النهائي هو الكيمياء الحيوية. كما هو الحال مع المرض الطبي ، فإن النموذج المناسب هو أحد الأسباب متعددة العوامل. تشير معظم أبحاث أحداث الحياة إلى حد 6 أشهر للنظر في الإجهاد الذي له تأثير كبير على المرض. بعد ذلك ، يتضاءل تأثير الإجهاد بمرور الوقت.

لعبت أحداث الحياة الأخيرة دورًا مسببًا رئيسيًا في الإصابة بالعصاب ، ودورًا تكوينيًا في ظهور الاكتئاب العصبي (مرض الاكتئاب المختلط) ودورًا محفزًا في نوبات الفصام (47). بعبارة أخرى ، فإن الارتباط بين التوتر والأمراض النفسية هو الأقوى في العصاب ، يليه الاكتئاب والفصام هو الأقل. العلاقة بين العصاب والفصام مع الإجهاد أكثر وضوحا. تم إثبات الارتباط الضعيف بين أحداث الحياة المجهدة وظهور المرض الذهاني ، وخاصة الفصام في عدد قليل من الدراسات (48 ، 49 ، 50) ، على النقيض من الارتباط القوي بين التوتر والعصاب (51 ، 52 ، 53 ، 54). ومع ذلك ، فإن درجة العلاقة بين مرض الاكتئاب والعصاب فيما يتعلق بالتوتر أمر مثير للجدل إلى حد ما. لا Paykel (55) ولا Brown et al. وجد (56) أن العلاقة بين ضغوط أحداث الحياة والمرض هي أكبر بالنسبة للاكتئاب العصابي من الاكتئاب أحادي القطب (الداخلي).

Bebbington et al. وجد (57) أن هناك فائضًا من أحداث الحياة التي تسبق ظهور جميع أنواع الذهان ، خاصة في الأشهر الثلاثة الأولى. في دراسة الظهور الأخير لمرض انفصام الشخصية واضطراب الفصام وهوس خفيف ، Chung et al. وجد (49) أن الأحداث التي تهدد الحياة كانت مرتبطة بشكل كبير بظهور الذهان الفصامي ولكن ليس الفصام. ووجدوا أيضًا أن الأحداث المهددة قد تؤدي إلى نوبات الهوس الخفيف. وجدت دراسة أخرى (50) أن الأفراد المصابين بالفصام لا يعانون من أحداث حياة مرهقة أكثر من الضوابط العادية ، لكنهم أبلغوا عن إجهاد شخصي أكبر. وجدت دراسة بحثت في العلاقة بين أحداث الحياة الأخيرة ونوبات المرض في مرض انفصام الشخصية أن النوبات الأولية أو المبكرة من الفصام من المرجح أن ترتبط بأحداث الحياة الحديثة أكثر من النوبات اللاحقة (48).

من ناحية أخرى ، تلقت الاضطرابات ثنائية القطب دراسات أقل من دراسة أحادية القطب. في الاضطراب ثنائي القطب ، يكون تأثير أحداث الحياة بشكل عام أضعف من تأثير أحادي القطب ، ولكن قد تكون أحداث الحياة الرئيسية مهمة في البداية (58). العوامل المسببة للاضطرابات ثنائية القطب متعددة العوامل ومعقدة ، ويبدو أن العامل الوراثي يؤثر على التعرض لأحداث الحياة. أولئك الذين لديهم تحميل جيني أكبر ، كانت هناك أحداث حياة مرهقة أقل قبل الحلقة الأولى وكان لديهم بداية مبكرة للمرض. أظهر عدد من الدراسات أن بداية الاكتئاب غالبًا ما تسبقها أحداث حياتية مرهقة (59 ، 60). كما تم تحديد أحداث الحياة المجهدة جنبًا إلى جنب مع الصعوبات الطفيفة الأخيرة على أنها تنبئ بنوبة اكتئاب في دراسة توأم أحادية الزيجوت. وأضاف كيسلر (61 عامًا) الذي توصل إلى نفس الاستنتاج أن هناك دليلًا على أن الإجهاد المزمن المصاحب يعزز تأثير أحداث الحياة الكبرى على الاكتئاب.

وثَّق كوبر وسيلف (51) دور أحداث الحياة في التسبب في المرض العصبي. ووجدوا أن المجموعة العصابية أبلغت عن أحداث مرهقة بنسبة 50٪ أكثر من المجموعة الضابطة. مكيون وآخرون. وجد (52) أن المرضى الذين يعانون من عصاب الوسواس القهري والذين لديهم سمات شخصية غير طبيعية (الوسواس والقلق والوعي الذاتي) عانوا من أحداث حياة أقل بكثير من أولئك الذين ليس لديهم مثل هذه السمات. وجد Zheng and Young (53) في مقارنة إجهاد الحدث المباشر بين مرضى العصابين والسيطرة العادية أن المرضى العصابيين لديهم مستوى أعلى بشكل ملحوظ من التوتر وشهدوا تغيرات في أحداث الحياة أكثر من المجموعة الضابطة. راجندران وآخرون. (54) الذين قارنوا المديرين التنفيذيين العصابيين مع المديرين التنفيذيين الأصحاء كمجموعة ضابطة ، وجدوا فروقًا ذات دلالة إحصائية بين المجموعات الطبيعية والعصابية من حيث تكرار أحداث الحياة بالإضافة إلى الإجهاد الذي عانوه بسبب أحداث الحياة هذه.

الإجهاد والسرطان

لقد حظيت العلاقة بين سرطان الثدي والتوتر باهتمام خاص. أشارت بعض الدراسات إلى زيادة حالات الوفاة المبكرة ، بما في ذلك الوفاة بالسرطان بين الأشخاص الذين عانوا مؤخرًا من فقدان الزوج أو أحد أفراد أسرته. أظهرت بعض الدراسات التي أجريت على النساء المصابات بسرطان الثدي ارتفاعًا ملحوظًا في معدل الإصابة بالأمراض بين هؤلاء النساء اللائي تعرضن لأحداث مؤلمة في الحياة وخسرن في غضون عدة سنوات قبل تشخيصهن. ومع ذلك ، فإن معظم أنواع السرطان تتطور منذ سنوات عديدة ولا يتم تشخيصها إلا بعد نموها في الجسم لفترة طويلة. وبالتالي ، فإن هذه الحقيقة تعارض الارتباط بين وفاة أحد الأحباء وتسبب السرطان. لا يوجد دليل علمي على وجود علاقة سببية مباشرة بين هذه التغيرات في جهاز المناعة وتطور السرطان. لم يتم إثبات أن التغيرات الناجمة عن الإجهاد في جهاز المناعة تسبب السرطان بشكل مباشر. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من البحث لمعرفة ما إذا كانت هناك علاقة بين الإجهاد النفسي وتحول الخلايا الطبيعية إلى خلايا سرطانية. أحد المجالات التي تتم دراستها حاليًا هو ما إذا كانت التدخلات النفسية يمكن أن تقلل من الإجهاد لدى مرضى السرطان ، وتحسن وظائف المناعة ، وربما تطيل البقاء على قيد الحياة.

كشفت الدراسات التي أجريت على الحيوانات ، ومعظمها على الفئران ، عن الصلة بين الإجهاد وتطور الأورام السرطانية. يبدو أن الإجهاد المزمن والحاد ، بما في ذلك الجراحة والاضطرابات الاجتماعية ، يعزز نمو الورم. من السهل إجراء مثل هذه الأبحاث على الحيوانات ، لكنها أصعب مع البشر. علاوة على ذلك ، فإن تفاعلات العديد من الأنظمة التي تؤثر على السرطان ، من الجهاز المناعي إلى نظام الغدد الصماء ، إلى جانب العوامل البيئية التي يستحيل التحكم فيها ، تجعل من الصعب للغاية فرز دور الإجهاد. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن للباحثين تعريض الناس للخلايا السرطانية كما يفعلون مع الحيوانات. وجدت دراسة حديثة (62) أن هناك صلة بين الإجهاد وتطور الورم ونوع من خلايا الدم البيضاء يسمى الخلايا القاتلة الطبيعية (NK). من بين جميع خلايا الجهاز المناعي ، أظهرت الخلايا القاتلة الطبيعية أقوى الروابط لمحاربة أشكال معينة من المرض ، على وجه التحديد منع ورم خبيث وتدمير النقائل الصغيرة. على الرغم من أن نتيجة هذه الدراسة ليست نهائية ، إلا أنها تشير إلى أن الإجهاد يعمل عن طريق قمع نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية. أظهرت دراسة أولية أخرى وجود دليل على ضعف الجهاز المناعي لدى مرضى سرطان الثدي الذين يشعرون بمستوى عالٍ من التوتر مقارنة بأولئك الذين يعانون من إجهاد أقل.

أظهرت دراسة جديدة أن الإجهاد والدعم الاجتماعي من العوامل المهمة في خطر إصابة الرجل بسرطان البروستاتا. وجد الباحثون (63) في جامعة ولاية نيويورك في كلية الطب Stony Brook & # x02019s أن الرجال الذين يعانون من مستوى عال من التوتر وعدم وجود علاقات مرضية مع الأصدقاء والعائلة لديهم مستويات أعلى من مستضد البروستات النوعي (PSA) في دمائهم ، علامة لزيادة خطر الإصابة بسرطان البروستاتا. بناءً على النتائج ، كان خطر حدوث PSA غير طبيعي أعلى بثلاث مرات للرجال الذين يعانون من مستويات عالية من التوتر. وبالمثل ، فإن الرجال الذين شعروا أن لديهم مستويات منخفضة من الدعم من الأصدقاء والعائلة كانوا أكثر عرضة بمرتين للإصابة بمستوى PSA غير طبيعي. تثير النتائج احتمال أن يكون للحالة النفسية للرجل تأثير مباشر على مرض البروستاتا.


معا أفضل

في عام 2001 ، بعد وقت قصير من وصوله إلى نيويورك ، حضرت فورمينتي محاضرة لساندرا ديماريا ، أخصائية علم الأمراض أيضًا في وايل كورنيل. كان ديماريا يدرس شظايا أورام الثدي التي تمت إزالتها من المرضى الذين تلقوا العلاج الكيميائي ووجدوا أنه في بعض المرضى ، تسبب العلاج الكيميائي في إغراق الخلايا المناعية للأورام. جعل هذا فورمينتي يتساءل عما إذا كان يمكن أن يحدث نفس الشيء بعد العلاج الإشعاعي.

بالإضافة إلى محاربة مسببات الأمراض المسببة للأمراض ، فإن جزءًا من وظيفة الجهاز المناعي هو مراقبة الخلايا التي يمكن أن تصبح سرطانية. على سبيل المثال ، تقتل الخلايا التائية السامة للخلايا أي خلايا تظهر عليها علامات الطفرات المرتبطة بالسرطان. تصبح الخلايا السرطانية مزعجة عندما تجد طرقًا لإخفاء هذه العلامات أو إطلاق بروتينات تضعف حواس الخلايا التائية. يقول فورمينتي: "السرطان هو حقًا فشل الجهاز المناعي في رفض الخلايا [المكونة للسرطان]".

سرعان ما انضم فورمينتي وديماريا ، وهو مواطن إيطالي مواطن ، إلى جهودهما لتحديد ما إذا كان الجهاز المناعي هو من يقود الاستجابة المطلقة. لاختبار فكرتهم ، قام فريقهم بحقن خلايا سرطان الثدي في الفئران في موقعين منفصلين ، مما تسبب في نمو أورام فردية على جانبي أجسام الحيوانات. ثم قاموا بإشعاع واحد فقط من الورم في كل فأر. منع الإشعاع وحده الورم الأساسي من النمو ، لكنه لم يفعل شيئًا آخر. ومع ذلك ، عندما حقن الباحثون أيضًا بروتينًا يسمى GM-CSF في الفئران ، تم التحكم أيضًا في حجم الورم الثاني.

يوسع GM-CSF عدد الخلايا المتغصنة ، التي تعمل كضباط قياديين للخلايا التائية ، وتوفر تعليمات حول مكان الهجوم. لكن الهجوم لا يمكن أن يحدث إلا إذا تم تشعيع أحد الأورام. يقول فورمينتي: "يؤدي الإشعاع بطريقة ما إلى التهاب الورم ويجعله مثيرًا للاهتمام لجهاز المناعة".

عرف فورمينتي وديماريا أنه إذا ثبتت النتائج التي توصلوا إليها في الدراسات البشرية ، فقد يكون من الممكن تسخير التأثير الأبسط لعلاج السرطان الذي انتشر في جميع أنحاء الجسم.

"الاستجابة المطلقة ليست شائعة ، لكننا نراها ، وهي رائعة جدًا عندما تحدث."

على الرغم من أن العلاج الإشعاعي رائع في تقليص الأورام الأولية ، فبمجرد انتشار السرطان ، يقتصر العلاج عادةً على الأورام التي تسبب الألم للمرضى. يقول مايكل ليم ، جراح الأعصاب في جامعة جونز هوبكنز في بالتيمور ، الذي يدرس طرق الجمع بين العلاج الإشعاعي والعلاج المناعي لعلاج أورام الدماغ: "يعتبر الإشعاع علاجًا محليًا". لكنه يضيف ، "إذا كان بإمكانك استخدام الإشعاع لإشعال استجابة منهجية ، فسيصبح نموذجًا مختلفًا تمامًا".

عندما نشر ديماريا وفورمينتي نتائجهما لأول مرة في عام 2004 ، كان من الصعب الترويج لمفهوم استخدام الإشعاع لتفعيل المناعة. في ذلك الوقت ، ركزت الأبحاث حول كيفية تأثير الإشعاع على الجهاز المناعي على استخدام جرعات عالية من تشعيع الجسم بالكامل للقضاء على أجهزة المناعة في النماذج الحيوانية. كان من غير المنطقي التفكير في أن نفس العلاج المستخدم محليًا يمكن أن ينشط المناعة في جميع أنحاء الجسم.

هذا المنظور ، مع ذلك ، سوف يتغير قريبا. في عامي 2003 و 2004 ، نشر جيمس هودج ، عالم المناعة في المعهد الوطني للسرطان وزملاؤه دراستين على الفئران تظهران أنه بعد الإشعاع ، أظهرت الخلايا السرطانية مستويات أعلى من البروتينات التي تجذب وتنشط الخلايا التائية القاتلة للسرطان. كان من الواضح أن الإشعاع لا يقتل الخلايا السرطانية فحسب ، بل يمكنه أيضًا جعل الخلايا التي لا تموت أكثر جاذبية للهجوم المناعي ، كما يقول هودج.

تلقت هذه الفكرة دفعة أخرى في عام 2007 عندما أفاد فريق بحثي من معهد جوستاف روسي للأورام بالقرب من باريس أن الضرر الناجم عن الإشعاع تسبب في قيام الخلايا السرطانية بالفئران والبشر بإطلاق بروتين ينشط الخلايا المتغصنة يسمى HMGB1. ووجدوا أيضًا أن النساء المصابات بسرطان الثدي اللائي يحملن أيضًا طفرة تمنع الخلايا المتغصنة من استشعار HMGB1 كن أكثر عرضة للإصابة بالنقائل في العامين التاليين للعلاج الإشعاعي. بالإضافة إلى جعل الأورام أكثر جاذبية لجهاز المناعة ، كما يقول هودج ، فإن الضرر الناجم عن الإشعاع يطلق أيضًا أجزاء من الخلايا السرطانية تسمى المستضدات ، والتي بدورها تحفز الخلايا المناعية ضد السرطان ، مثل اللقاح.

يقول باركر إنه من بعض النواحي ، شعر أطباء الأورام دائمًا أن الإشعاع يعمل جنبًا إلى جنب مع جهاز المناعة. على سبيل المثال ، عندما يسأله مرضاه عن مكان أورامهم بعد تعرضهم للإشعاع ، يخبرهم أن الخلايا المناعية تزيل بقايا الخلايا الميتة. يقول: "يعمل جهاز المناعة مثل رجل القمامة".

الآن ، كان لدى علماء المناعة دليل على أن رجال القمامة يقومون بأكثر من مجرد تنظيف الحطام: فهم أيضًا جزء من فريق الهدم ، وإذا تمكنوا من التنسيق في مواقع عمل مختلفة ، فيمكنهم توليد استجابات متقطعة. مع الإشعاع وحده ، حدث هذا نادرًا جدًا. يقول فورمينتي: "يقوم الإشعاع ببعض هذه الحيلة". "لكنك تحتاج حقًا إلى المساعدة في الإشعاع قليلاً."

أظهر فورمينتي وديماريا بالفعل في الفئران أن مثل هذه المساعدة يمكن أن تأتي في شكل علاج مناعي باستخدام GM-CSF ، وفي عام 2003 شرعوا في اختبار نظريتهم على المرضى. عالجوا 26 مريضًا بالسرطان النقيلي كانوا يخضعون للعلاج الإشعاعي باستخدام GM-CSF. ثم استخدم الباحثون الأشعة المقطعية لتتبع أحجام الأورام غير المشعة بمرور الوقت. في يونيو الماضي ، أفادوا أن العلاج ولّد ردود أفسكوبال في 20٪ من المرضى. يميل المرضى الذين يعانون من استجابات بصرية إلى البقاء على قيد الحياة لفترة أطول ، على الرغم من عدم شفاء أي من المرضى تمامًا.

بينما كان فريق وايل كورنيل يجري دراستهم حول GM-CSF ، وصل جيل جديد من أدوية العلاج المناعي إلى الساحة. البعض ، مثل imiquimod ، ينشط الخلايا التغصنية بطريقة أكثر استهدافًا من GM-CSF. مجموعة أخرى ، مثبطات نقاط التفتيش ، تطلق المكابح على الجهاز المناعي والخلايا التائية على وجه الخصوص ، وتحرر الخلايا التائية لمهاجمة الأورام.

في عام 2005 ، وجدت فورمينتي وفريقها أن مثبطًا معينًا لنقاط التفتيش يعمل بشكل أفضل مع العلاج الإشعاعي أكثر من العلاج بمفرده ، وأفادوا لاحقًا أن نفس المزيج ينتج استجابات أبسكوبال في نموذج فأر لسرطان الثدي.

تلقي رسائل بريد إلكتروني حول برامج NOVA القادمة والمحتوى ذي الصلة ، بالإضافة إلى التقارير المميزة حول الأحداث الجارية من خلال عدسة علمية.


طريقة قائمة على الصور لاكتشاف وتحديد السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية لنماذج الخلايا المستهدفة ثنائية وثلاثية الأبعاد

المؤلفون: براد لارسون ، Agilent Technologies ، Inc. Wini Luty ، Courtney Noah ، Bioreclamation IVT Olivier Donz & eacute ، AdipoGen Life Sciences Glauco R. Souza ، مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في هيوستن و Nano3D Biosciences ، Inc.

الملخص

تلعب السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية دورًا مهمًا في مجموعة من الأساليب الجديدة التي يتم تطويرها بهدف تعزيز نظام المناعة للمريض و rsquos لمكافحة السرطان. من أجل تقييم وتحسين العلاجات المناعية بالخلايا التائية الحساسة في المختبر يجب تضمين الطرق في عملية الاختبار. في الإجراء الموصوف هنا ، تم إجراء تقييمات نمطية وكمية لتحريض نخر الخلية المستهدفة ثنائية وثلاثية الأبعاد باستخدام التصوير الآلي للخلايا الحية. لقد وجد أن التنشيط المباشر للخلايا التائية أنتج تأثيرًا سامًا للخلايا أكبر بكثير من التنشيط العام مما يشير إلى أن الخلايا التائية يمكن اقتطاعها واستهدافها وتدمير خلايا مستهدفة محددة.

مقدمة

CD3 + CD8 + الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) هي الخلايا المستجيبة المسؤولة عن السمية الخلوية التي تتوسطها الخلايا التائية والتي يمكن أن تعمل عن طريق الاتصال من خلية إلى أخرى إما عن طريق إطلاق الجرانزيمات والبيرفورين أو من خلال السمية الوسيطة ليجند Fas. 1 كجزء من الجهاز المناعي التكيفي ، تشن هذه الخلايا هجمات مستهدفة لتخليص الجسم من مجموعة متنوعة من الخلايا المعرضة للخطر ، مثل الخلايا السرطانية ، دون الإضرار بالخلايا السليمة. إن مواجهة هذا الدفاع الطبيعي هي الحقيقة المعروفة على نطاق واسع وهي أن الأورام تطور طرقًا متعددة لتجنب الكشف المناعي وخلق مستوى من التحمل ضد الخلايا المناعية المصممة للبحث عن الخلايا التي تحتوي على مستضدات أجنبية وتدميرها. 2 لسنوات عديدة ، تجنب تطوير العلاجات استخدام الجهاز المناعي للمريض و rsquos لقتل الخلايا السرطانية ، حيث واجهت العلاجات القائمة على العلاج المناعي العديد من الفشل السريري. يوفر تطوير الأساليب أملاً متجددًا لمرضى السرطان. تقنيات العلاج المناعي بالتبني تنشط خلايا المريض و rsquos T. خارج الجسم الحي ضد مستضدات الورم قبل إعادة حقن الخلايا التائية المنشطة في المريض لاستهداف الخلايا السرطانية وتدميرها بشكل انتقائي. 3

الاكثر شهرة في المختبر طريقة مراقبة تأثير CTL على الخلايا المستهدفة هي فحص السمية الخلوية بوساطة الخلية (CMC) حيث يتم إضافة الخلايا التائية والخلايا المستهدفة إلى صفيحة ميكروسكوبية وكذلك زراعة نباتية. تم قياس السمية تقليديا باستخدام إطلاق الكروم (51 Cr) من الخلايا المستهدفة مسبقة التحميل. نظرًا لمشاكل التخلص من النشاط الإشعاعي ، والحساسية المنخفضة بسبب الإطلاق التلقائي للنظير من الخلايا المستهدفة 4 ، تم تطوير طرق أحدث باستخدام طرق بصرية تعتمد على الصفيحة الدقيقة لتوليد اللمعان أو التألق. تم تحسين هذه التقنيات للكشف عن الإشارة من الخلايا المستهدفة المطلية بطبقة أحادية موحدة ثنائية الأبعاد (2D) في آبار الصفيحة الدقيقة. مع زيادة تكيف الخلايا المجمعة في تكوين ثلاثي الأبعاد (3D) لإنشاء المزيد في الجسم الحيعلى غرار النموذج ، لم تعد الخلايا منتشرة بشكل متساوٍ في قاع البئر. من خلال دمج التصوير المجهري والتحليل الخلوي ، يمكن تحقيق الكشف الحساس عن السمية الخلوية المستحثة من الخلايا المستهدفة ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد ، بالإضافة إلى تصور التفاعل بين الخلايا المستهدفة والخلايا المستهدفة.

هنا ، نعرض طريقة بحث آلية لمراقبة وقياس السمية الخلوية بوساطة الخلايا CTL باستخدام الفحص المجهري الرقمي ذو المجال الواسع. تم طلاء سرطان الثدي MDA-MB-231 المستهدف وخلايا الخلايا الليفية في شكل ثنائي وثلاثي الأبعاد وجرعات مع كاشف موت الخلايا المبرمج / نخر الخلية الحية. ثم تمت إضافة الخلايا التائية ، التي يتم تنشيطها باستخدام طرق عامة أو موجهة وملطخة بصبغة تتبع حمراء بعيدة ، بنسب 20 أو 10 أو 5 أو 0: 1 إلى الخلايا المستهدفة. تمت إضافة الألواح بعد ذلك إلى حاضنة آلية ونقلها إلى مجهر المجال الرقمي الرقمي ، باستخدام ذراع آلية ، كل أربع ساعات حيث تم التقاط صور المجال الساطع والفلوريسنت لمدة سبعة أيام. مكنت المراقبة المرئية للصور الحركية من مراقبة CTL: تفاعلات الخلايا المستهدفة للخلايا المستنبتة ثنائية وثلاثية الأبعاد ، بينما سمح تحليل الصور الخلوية بحساب السمية الخلوية التي يسببها CTL خلال فترة الحضانة بأكملها.

المواد والأساليب

الخلايا والوسائط
تم الحصول على MDA-MB-231 الخلايا السرطانية الغدية للثدي (رقم الجزء HTB-26) من ATCC (Manassas ، VA). تم شراء خلايا الخلايا الليفية الجلدية البشرية حديثي الولادة التي تعبر بشكل ثابت عن طلب تقديم العروض (رقم الجزء cAP-0008RFP) من Angio-Proteomie (بوسطن ، ماساتشوستس). تم التبرع بخلايا CD3 + T المنقية بشريًا ، المعزولة عن طريق الاختيار السلبي من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (رقم الجزء HM-PBMC-TCELLCD3-M) بواسطة BioreclamationIVT (Westbury ، NY). تم شراء DMEM المتقدم (رقم الجزء 12491-015) ، وسيط RPMI 1640 (رقم الجزء 11875-093) ، ومصل بقري الجنين ، (رقم الجزء 10437-036) ، والبنسلين الستربتومايسينجلوتامين (100X) (رقم الجزء 10378-016) من ThermoFisher Scientific (والثام ، ماجستير).

المقايسة والمكونات التجريبية
IL-2 Superkine (Fc) (رقم الجزء AG-40B-0111-C010) ، مضاد لـ CD3 (بشري) ، mAb (UCHT1) (رقم الجزء ANC-144-020) ومضاد CD28 (بشري) ، mAb (ANC28 .1 / 5D10) (رقم الجزء ANC-177-020) تم التبرع بها من قبل AdipoGen Life Sciences (سان دييغو ، كاليفورنيا). SCREENSTAR 190 & microm cycloolefin filmbottom 384-well microplates (GBO part number 789836) ، CELLSTAR & microClear 384-well-ins cell-repellates of microplates (GBO part number 781976) و 384-Well BiO Assay Kit (رقم جزء GBO 781846 ، يتكون من قنينتين NanoShuttle-PL ، محرك مغناطيسي برفع 6 بئر ، محرك أقراص مغناطيسي ذو 384 بئرًا ومغناطيسًا قابلاً للضغط (2) ، لوحة خلط بعمق 96 بئرًا ، ألواح ميكروية سطحية طاردة للخلايا ذات 6 بئر و 384 بئرًا) ، نموذج أولي حلقة 384 بئر تم التبرع بـ Drive و Cell Repellent Surface 6-Well (رقم جزء GBO 657860) من قبل Nano3D Biosciences ، Inc. ، و Greiner Bio-One ، Inc. ، (Monroe ، NC). تم التبرع بمجموعة الاستماتة الحركية (الفحص المجهري) (رقم الجزء ab129817) من قبل Abcam (كامبريدج ، ماساتشوستس). تم شراء CellTracker Deep Red Dye (رقم الجزء C34565) من ThermoFisher Scientific (Waltham ، MA).

Cytation 5 عبارة عن قارئ معياري متعدد الوسائط مصحوب بمجهر رقمي آلي. تتوفر قراءة الصفيحة الدقيقة المستندة إلى المرشح وأحادي اللون ، وتوفر وحدة الفحص المجهري تكبيرًا يصل إلى 60x في التألق والحقل الساطع واللون المشرق وتباين الطور. يمكن للأداة إجراء تصوير مضان في ما يصل إلى أربع قنوات في خطوة واحدة. مع التركيز بشكل خاص على فحوصات الخلايا الحية ، يتميز Cytation 5 بالاهتزاز والتحكم في درجة الحرارة حتى 65 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون2/ س2 التحكم في الغاز والحاقن المزدوج للمقايسات الحركية ، ويتم التحكم فيه بواسطة قارئ الصفيحة الدقيقة وبرنامج التصوير المدمج Agilent BioTek Gen5 ، والذي يعمل أيضًا على أتمتة التقاط الصور ومعالجتها وتحليلها. تم استخدام الأداة لمراقبة CTL حركيًا: تفاعلات الخلايا المستهدفة بالإضافة إلى تحريض السمية الخلوية داخل الخلايا المستهدفة ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد.

الحاضنة الآلية Agilent BioTek BioSpa 8
تربط الحاضنة الآلية BioSpa 8 قارئات أو أجهزة تصوير Agilent BioTek مع غسالات وموزعات Agilent BioTek من أجل أتمتة سير العمل الكاملة لما يصل إلى ثمانية ألواح ميكروية. درجة الحرارة ، CO2/ س2 يتم التحكم في مستويات الرطوبة ومراقبتها من خلال برنامج Agilent BioTek BioSpa للحفاظ على بيئة مثالية لمزارع الخلايا خلال جميع المراحل التجريبية. تم تحضين لوحات الاختبار في BioSpa للحفاظ على الظروف الجوية المناسبة لمدة سبعة أيام وتم نقلها تلقائيًا إلى Cytation 5 كل أربع ساعات لتصوير المجال الساطع والفلوريسنت.

يستخدم هذا العمل ثلاثة تدفقات عمل موضحة بشكل تصويري في الشكل 1.

شكل 1. تنشيط الخلايا التائية وسير عمل فحص السمية الخلوية بوساطة الخلية.

يتضمن سير العمل الأول على الجانب الأيسر من الشكل 1 تنشيط الخلايا التائية حيث تتعرض خلايا CD3 + T للخلايا المستهدفة MDA-MB-231 والتي تم طبعها بيولوجيًا في الأجسام الشبه الكروية باستخدام الحقول المغناطيسية (انظر & quot إعداد الخلية المستهدفة ثلاثية الأبعاد & quot لمزيد من التفاصيل.) يتم تلطيخ الخلايا التائية المنشطة بعد ذلك باستخدام صبغة CellTracker Deep Red واستخدامها إما في اختبار السمية الخلوية ثلاثي الأبعاد المستند إلى كروي أو في اختبار آخر باستخدام الخلايا المطلية. تسمح صبغة CellTracker بتصور الخلايا التائية التي تهاجم الخلايا المستهدفة ، بينما تسمح صبغة بروبيديوم يوديد بالقياس الكمي لموت الخلية المستهدف المرتبط بتمزق غشاء البلازما.

إعداد الخلية المستهدفة ثلاثية الأبعاد

تمت زراعة قوارير T-75 من MDA-MB-231 أو مزارع الخلايا الليفية حتى 80٪ التقاء ، ثم كما هو موضح في الشكل 2 ، تمت معالجتها بـ 600 & muL NanoShuttle-PL بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية / 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2. بعد الحضانة ، تم تجريب الخلايا لمدة 3 إلى 5 دقائق عند 37 درجة مئوية / 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.

الشكل 2. يستخدم إجراء Bioprinting لإنشاء الأجسام الشبه الكروية ثلاثية الأبعاد لتنشيط الخلايا التائية.


تمت إزالة الخلايا من القوارير وإضافتها إلى لوحة طاردة الخلايا المكونة من 6 آبار بتركيز 1.2 × 106 خلية / بئر. تم وضع محرك مغناطيسي مكون من 6 آبار فوق لوحة البئر لرفع الخلايا ، حيث حدث تكوين المصفوفة خارج الخلية (ECM) خلال فترة حضانة مدتها ثماني ساعات عند 37 درجة مئوية / 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون2. بعد الحضانة ، تم تفكيك الخلايا و ECM ، وتعليقها ، ودمجها معًا بتركيزات متساوية في وسط DMEM متقدم كامل.

لتنشيط الخلايا التائية ، تم طبع الأجسام الشبه الكروية ثلاثية الأبعاد بيولوجيًا في صفيحة طاردة للخلية 24 بئر باستخدام محرك مغناطيسي كروي 384 جيدًا (انظر & quot تنشيط الخلايا التائية الموجهة والعامة & quot).

تم استخدام إجراء معدل مرتبط بالشكل 2 لإعداد الأجسام الشبه الكروية ثلاثية الأبعاد لمقايسة السمية الخلوية. كان الإجراء هو نفسه حتى تم إجراء الطباعة الحيوية الكروية. بدلاً من الطباعة الحيوية في لوحة 24 بئرًا كما هو الحال بالنسبة لتنشيط الخلايا التائية ، استخدم الاختبار 384 لوحًا جيدًا بحيث تم طباعة كروي واحد بيولوجيًا في كل بئر. تمت إضافة ما مجموعه 2000 خلية (1000 MDA-MB-231 و 1000 خلية ليفية) لكل بئر من الصفيحة الدقيقة الطاردة للخلية البالغ عددها 384 جيدًا. تم تحضين الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة مئوية / 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48 ساعة للسماح للخلايا بالتجمع في أورام مزروعة داخل كل بئر.


2D الهدف إعداد الخلية

تمت زراعة قوارير T-75 من MDA-MB-231 أو مزارع الخلايا الليفية حتى 80٪ التقاء. تم بعد ذلك تجريب الخلايا لمدة 3-5 دقائق عند 37 & ormC / 5٪ CO2 وإزالته من القوارير. بعد الطرد المركزي ، تم تعليق الخلايا ودمجها معًا بتركيزات متساوية في وسط DMEM متقدم كامل. تمت إضافة ما مجموعه 2000 خلية (1000 MDA-MB-231 و 1000 خلية ليفية) إلى آبار صفيحة ميكروية معالجة بـ 384 بئر TC مخصصة لثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد (الشكل 2). تم تحضين الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة مئوية / 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 بين عشية وضحاها للسماح للخلايا بالالتصاق بالآبار.

تنشيط الخلايا التائية الموجهة والعامة

تمت إضافة ما مجموعه 10000 خلية ووسائط مستهدفة إلى 24 آبار لوحة طاردة للخلايا لكل حالة تجريبية على النحو التالي (الشكل 2). التنشيط الموجه: (أ) 100٪ MDA-MB-231 (B) 75٪ MDA-MB-231 و 25٪ خلايا ليفية (C) 50٪ MDA-MB-231 و 50٪ تنشيط عام للخلايا الليفية: (D) لا توجد خلايا. كان الحجم الإجمالي 1 مل للآبار في كل حالة اختبار. تم بعد ذلك وضع اللوحة المكونة من 24 بئراً فوق محرك مغناطيسي كروي 384 بئراً وحضنت عند 37 درجة مئوية / 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.2 لمدة أربعة أيام حيث تم تجميع الخلايا في العديد من الأجسام الشبه الكروية ثلاثية الأبعاد داخل كل بئر (الشكل 3). لاحظ أن محرك المغناطيس مصمم لكثافة 384 بئراً ، بحيث يوفر الحجم الموسع لبئر لوحة 24 بئراً تسعة (9) أجسام كروية منفصلة / بئر.

الشكل 3. لوحة 24-جيدًا تُظهر زراعة الخلايا التائية والأجسام الشبه الكروية ثلاثية الأبعاد الممغنطة بيولوجيًا قبل بدء التنشيط الموجه. تمت إضافة الخلايا التائية بنسبة 10: 1 للخلايا المستهدفة التي تم تجميعها مسبقًا في الأجسام الشبه الكروية ثلاثية الأبعاد (

بعد التجميع الكروي ، تم تحضير الخلايا التائية بتركيز 100000 خلية / مل في وسط RPMI يحتوي على 100 نانوغرام / مل من IL-2 Superkine (Fc) (superkine) مع 250 نانوغرام / مل لكل من مضادات CD3 والأجسام المضادة لـ CD28 . تم بعد ذلك استنشاق الوسائط المستنفدة بينما ظلت اللوحة على محرك المغناطيس لتأمين الأجسام الشبه الكروية واستبدالها بوسائط جديدة تحتوي على الخلايا التائية والأجسام المضادة والحركة الفائقة كما هو موضح سابقًا. ثم تم وضع اللوحة مرة أخرى في BioSpa للاحتضان لمدة ستة أيام. تمت برمجة BioSpa مسبقًا لالتقاط صورة مونتاج 12 مرة و 10 مرات من كل بئر اختبار كل ست ساعات. تم إجراء التبادل اليدوي للوسائط ، IL-2 Superkine ، والأجسام المضادة بعد 72 ساعة. لا يعمل إجراء التنشيط الموجه على مدار الأيام الستة على تنشيط الخلايا التائية فحسب ، بل يعلمها أيضًا التعرف على مستضدات الخلايا المستهدفة مما يسمح بالتسمم الخلوي المستهدف. يتبع التنشيط العام نفس الإجراء ، ولكنه لا يستخدم خلايا مستهدفة ، وبالتالي لا ينبغي أن يكون هناك سمية خلوية مستهدفة. 5

تلطيخ الخلايا التائية والإضافة

عند الانتهاء من عملية التنشيط ، تم وضع اللوحة المكونة من 24 بئراً والتي تحتوي على الخلايا التائية والخلايا المستهدفة الممغنطة مرة أخرى على محرك مغناطيسي يحتوي على 384 بئر. تم بعد ذلك إزالة الخلايا التائية من كل بئر ونقلها إلى أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل للتلوين باستخدام صبغة CellTracker Deep Red مما يسمح بالتمايز عن الخلايا المستهدفة أثناء تجربة السمية الخلوية. تمت إضافة صبغة بتركيز 1 ومايكرو مولار إلى الأنابيب وحضنت عند 37 درجة مئوية / 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.2 لمدة 45 دقيقة. تم بعد ذلك الطرد المركزي للأنابيب لمدة 15 دقيقة عند 200 RCF. تمت إزالة الوسائط المحتوية على الصبغة الزائدة واستبدالها بوسط RPMI جديد. تم بعد ذلك تخفيف الخلايا التائية الملطخة من كل حالة تنشيط في وسط RPMI يحتوي على 10 & ميكرو لتر / مل من مسبار نخر يوديد البروبيديوم من مجموعة موت الخلايا المبرمج الحركي. تمت إضافة الخلايا بعد ذلك إلى 384 بئرًا 2D أو لوحات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، والتي تحتوي بالفعل على إجمالي 2000 خلية مستهدفة ، بتركيزات تعادل 40000 خلية / بئر ، أو 20000 خلية / بئر ، أو 10000 خلية / بئر (الشكل 1). خلقت هذه التركيزات نسب 20: 1 ، 10: 1 ، أو 5: 1 الخلايا التائية لاستهداف الخلايا في كل بئر. تم أيضًا تضمين آبار التحكم السلبية غير المعالجة لفحص مستويات السمية الخلوية للخلايا القاعدية المستهدفة بمرور الوقت. يوضح الجدول 1 تخطيط اللوحة النهائية.

الجدول 1. تخطيط لوحة فحص السمية الخلوية ثنائية وثلاثية الأبعاد.


إجراء فحص السمية الخلوية بوساطة الخلايا

الشكل 4. Agilent BioTek BioSpa نظام تصوير الخلايا الحية ، بما في ذلك Agilent BioTek BioSpa 8 و Agilent BioTek Cytation 5.


تمت إضافة لوحات الفحص ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد ، التي تحتوي على الخلايا التائية والخلايا المستهدفة ، إلى BioSpa 8 ، كجزء من نظام تصوير الخلايا الحية BioSpa (الشكل 4) ، مع ضبط الظروف الجوية مسبقًا على 37 درجة مئوية / 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون2. تمت إضافة الماء أيضًا إلى المقلاة لإنشاء بيئة رطبة ، والتي تمت مراقبتها. تم تعيين برنامج Agilent BioTek BioSpa بحيث يتم نقل الألواح تلقائيًا إلى Cytation 5 للتصوير المشرق والفلوري لآبار الاختبار كل أربع ساعات لمدة سبعة أيام. يوضح الجدول 2 التصوير الذي تم إجراؤه مع كل قناة. بالنسبة للخلايا المطلية ثنائية الأبعاد ، تم التقاط صورة تكبير واحدة 4x مع كل قناة لالتقاط مجموعة تمثيلية من الخلايا لكل بئر. تم دمج التركيز التلقائي بالليزر لضمان التركيز المناسب على طبقة الخلية المستهدفة بالإضافة إلى إجراء التركيز الأكثر كفاءة. بالنسبة للخلايا المطلية ثلاثية الأبعاد ، نظرًا لأن الخلايا الموجودة داخل الأجسام الشبه الكروية للخلية المستهدفة ثلاثية الأبعاد موجودة على مستويات z متعددة ، تم التقاط مكدس z يتكون من خمس شرائح مع كل قناة. تم دمج التركيز التلقائي بالليزر مرة أخرى. تم التقاط صورتين أسفل وفوق المستوى البؤري المحدد.

الجدول 2. تم تصوير الخلية لكل قناة تصوير.


معالجة الصور ثنائية وثلاثية الأبعاد

بعد الالتقاط ، تمت معالجة الصور ثنائية وثلاثية الأبعاد قبل التحليل. خضعت الصور ثنائية الأبعاد للمعالجة المسبقة لإزالة إشارة الخلفية من كل قناة باستخدام الإعدادات في الجدول 3.

الجدول 3. معلمات المعالجة المسبقة للصور ثنائية الأبعاد.


بالنسبة للصور ثلاثية الأبعاد ، تم أولاً تنفيذ الإسقاط z للصور الملتقطة في المكدس z لإنشاء صورة نهائية تحتوي فقط على المعلومات الأكثر تركيزًا (الجدول 4).

الجدول 4. معايير الإسقاط Z ثلاثية الأبعاد


ثم تم إجراء المعالجة المسبقة للصورة المسقطة لإزالة إشارة الخلفية مرة أخرى من كل قناة (الجدول 5).

الجدول 5. معلمات المعالجة المسبقة للصور ثلاثية الأبعاد.


التحليل الخلوي للصور المعالجة ثنائية وثلاثية الأبعاد

تم إجراء التحليل الخلوي على الصور المعالجة لتحديد إجمالي الإشارة المنبثقة من الخلايا المستهدفة النخرية باستخدام المعايير الواردة في الجدول 6.

الجدول 6. معايير تحديد الخلايا النخرية.


تم إجراء خطوة إضافية لتحليل الصور على الصور ثلاثية الأبعاد لتحديد مدى تفكك الأجسام الشبه الكروية المستهدفة بعد علاج الخلايا التائية (الجدول 7).

الجدول 7. معايير التفكك الكروي.

نتائج ومناقشة

الكشف القائم على الصورة للتفاعل الخلوي المشترك

تمت إضافة الخلايا التائية ، التي تم تنشيطها باستخدام إجراءات التنشيط المباشرة والعامة ، إلى الخلايا المستهدفة بتركيزات تساوي 20: 1 و 10: 1 و 5: 1 و 0: 1 لبدء فحص السمية الخلوية بوساطة الخلايا. لرصد تفاعل الخلايا المزروعة ، تم تصوير الصفائح فورًا بعد إضافة الخلايا التائية وكل أربع ساعات لاحقة طوال فترة الحضانة التي استمرت سبعة أيام.

مع زيادة أوقات الحضانة للمقايسة ، من الواضح أن الخلايا التائية المنشطة (التألق الأحمر) تسعى وتتجمع حول الخلايا المستهدفة التي تقدم المستضد من خلال ربط مستقبلات المستضد في كل من الأشكال ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد (الشكل 5 أ). يتناقض تجمع الخلايا التائية هذا بشكل ملحوظ مع التوزيع الأكثر تساويًا للفلورة الحمراء في الوقت 0.

الشكل 5. تصوير Brightfield / CY5 للتفاعل الخلوي. صور 4x المجال الساطع و CY5 تعرض مجموعات الخلايا التائية والربط بالخلايا المستهدفة (أ) ثنائية الأبعاد أو (ب) ثلاثية الأبعاد. الوقت = 24 ساعة.

عندما يتم تراكب الصور من قناة PI مع تلك الموجودة في قناة المجال الساطع ، يمكن للمرء أن يلاحظ أن إشارة الفلورسنت الصفراء من مسبار الخلية النخرية بروبيديوم يوديد تنشأ من نفس الخلايا المستهدفة مع الخلايا التائية المرتبطة (الشكل 6). هذا يؤكد التأثير السام للخلايا المصب لربط الخلايا التائية بالخلايا المستهدفة.

الشكل 6. تصوير Brightfield / PI للتفاعل الخلوي. صور 4x في مجال مشرق و PI تُظهر الخلايا المستهدفة الميتة (A) 2D أو (B) ثلاثية الأبعاد استجابةً لربط الخلايا التائية. الوقت = 24 ساعة.


التصوير الحركي لتحريض السمية الخلوية للخلايا المستهدفة بوساطة الخلايا التائية

من أجل تحديد حركية تحريض السمية الخلوية داخل الخلايا المستهدفة ، يجب إجراء التصوير على فترات منتظمة طوال فترة الحضانة بأكملها. نظرًا لأنه قد لا يتم الوصول إلى التأثير الكامل السام للخلايا إلا بعد أيام من إضافة الخلايا التائية ، فمن الضروري أيضًا السماح للخلايا بالتفاعل لعدة أيام. تسمح الضوابط البيئية لـ Cytation 5 و BioSpa 8 ، بالإضافة إلى النقل التلقائي لألواح الاختبار من حاضنة إلى جهاز تصوير ، بإكمال التحليل الحركي دون المساس بصحة الخلية. في التجارب التي أجريت هنا ، تم التقاط صور برايتفيلد وفلوريسنت كل أربع ساعات لما مجموعه سبعة أيام. يوضح الشكلان 7 و 8 التأثير التكراري السام للخلايا الذي تنشطه الخلايا التائية مباشرة في وجود 100 ٪ من خلايا MDA-MB-231 وتتم إضافتها بنسبة 20: 1 ، على الخلايا المستهدفة ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد ، على التوالي.

الشكل 7. تصوير CY5 / PI لتحريض الخلية المستهدفة السامة للخلايا ثنائية الأبعاد. 4x صور متراكبة CY5 و PI تُظهر خلايا T الملطخة وإشارة من مسبار الخلية النخرية بروبيديوم يوديد التالي (A) 0 (B) 48 (C) 96 و (D) 168 ساعة حضانة فترتي حضانة.

الشكل 8. تصوير Brightfield / CY5 / PI لتحريض الخلية المستهدفة السامة للخلايا ثلاثي الأبعاد. 4x صور حقل مشرق ، CY5 ، و PI تُظهر خلايا T الملطخة وإشارة من مسبار الخلية النخرية بروبيديوم يوديد بعد (A) 0 (B) 48 (C) 96 و (D) 168 ساعة فترات حضانة زراعة.


القياس الكمي للسمية الخلوية المستهدفة

بعد التقاط الصورة ، تم بعد ذلك تحديد مستوى السمية الخلوية للخلايا المستهدفة التي تسببها الخلايا التائية.

الشكل 9. التحليل الخلوي للسمية الخلوية المستهدفة. صور 4x تظهر مضان من مسبار الخلية النخرية يوديد البروبيديوم بعد الحضانة لمدة 96 ساعة. أقنعة كائن (باللون الأزرق) موضوعة حول (أ) ثنائي الأبعاد و (ب) خلايا مستهدفة ثلاثية الأبعاد تفي بمعايير التحليل الخلوي.

باستخدام معايير تحليل الصور المحسّنة الموضحة في الجدول 6 ، تم وضع أقنعة الكائن حول الخلايا التي تلبي معايير إشارة العتبة الدنيا من مسبار الخلية النخرية PI (الشكل 9). نظرًا لأن الخلايا التائية لها حجم أصغر مقارنة بالخلايا المستهدفة بتنسيق ثنائي الأبعاد أو ثلاثي الأبعاد ، فقد تم تعيين الحد الأدنى لقيمة قطع حجم الكائن بحيث لا يتم تضمين الخلايا التائية المفردة في التحليل. يمكن ملاحظة ذلك في الشكلين 9 أ و 9 ب.

هناك ظاهرة لوحظت أيضًا في الصور الحركية لمقايسة 3D CMC وهي أن الورم بدأ يتفكك استجابة لزيادة السمية الخلوية ، مما أدى إلى إطلاق مجموعات من الخلايا في الوسائط المحيطة. بينما أصغر من جسم الورم السليم ، تظل هذه المجاميع أكبر من الخلايا التائية الفردية وتنبعث أيضًا من إشارة من مسبار الخلية النخرية PI ، وبالتالي يتم تضمينها في التحليل النهائي (الشكل 9 ب).

من التحليل الذي تم إجراؤه ، تم حساب عدد الخلايا النخرية لكل صورة للخلايا المستهدفة ثنائية الأبعاد. عندما يتم تربيتها في صورة ثلاثية الأبعاد ، توجد خلايا داخل الورم والتجمعات الصغيرة على مستويات z متعددة. لذلك ، لتحديد السمية الخلوية المستحثة بأعلى مستوى من الدقة ، تم تحديد إجمالي إشارة PI داخل جميع أقنعة الكائن لكل صورة. تم بعد ذلك تقسيم القيم (عدد الخلايا أو إجمالي إشارة PI) المحسوبة في كل نقطة زمنية تلقائيًا على القيمة المحسوبة في الوقت 0 في برنامج Gen5. بهذه الطريقة تم تطبيع الفروق الصغيرة بين التكرارات. بعد التحليل ، تم رسم النتائج لتقييم ما إذا كانت هناك اختلافات في السمية الخلوية للخلايا المستهدفة المستحثة بين ظروف الاختبار. توضح الرسوم البيانية في الشكل 10 البيانات المحسوبة للخلايا التائية المضافة لاختبار الآبار بنسبة 20: 1 ، ويتم تنشيطها في وجود خلايا 100٪ أو 75٪ أو 50٪ أو 0٪ MDA-MB-231 ، مقارنة بالخلايا التائية غير النشطة. الخلايا.

من الشكل 10 ، يتضح أن السمية الخلوية المستحثة بالخلايا التائية تزداد من حيث درجة تنشيط الخلية الموجه في كل من نماذج الخلايا ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد. تنشط الخلايا التائية في وجود 100٪ من خلايا MDA-MB-231 أعلى مستوى من السمية الخلوية ، في حين أن الخلايا التي يتم تنشيطها فقط في وجود الأجسام المضادة والحركة الفائقة تؤدي إلى أقل زيادة في عدد الخلايا النخرية لكل صورة على عدد الخلايا النخرية القاعدية. ومع ذلك ، تختلف النماذج في استجاباتها الحركية. في النموذج ثنائي الأبعاد (الشكل 10 أ) ، تصل السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية إلى ذروتها في حوالي 24 ساعة بعد إضافة الخلايا التائية المنشطة ، كما يتضح من نسبة الخلايا النخرية من الآبار التي تحتوي على الخلايا التائية إلى أعداد الخلايا النخرية من آبار التحكم السلبية. أي نخر إضافي بعد حوالي 3 أيام يرجع إلى قيود النموذج ثنائي الأبعاد كما هو ملاحظ من خلال النخر المتزايد بمرور الوقت الواضح في التحكم السلبي. على العكس من ذلك ، في النموذج ثلاثي الأبعاد (الشكل 10 ب) ، تستمر النسب النخرية للإشارة الإجمالية من مسبار PI في الزيادة أو الهضبة على مدار الحركة الحركية نظرًا لحقيقة أن صحة الخلية يتم الاحتفاظ بها بشكل أفضل في نموذج الخلية ثلاثية الأبعاد غير المعالج.

تم بعد ذلك إجراء تحليل تحريض الخلايا النخرية على الآبار التي تحتوي على خلايا T نشطة مباشرة في وجود 100٪ خلايا MDA-MB-231 ثم إضافتها إلى الخلايا المستهدفة ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد لفحص CMC بنسب 20: 1 ، 10: 1 ، 5: 1. تم أيضًا تضمين عنصر تحكم سلبي حيث لم يتم علاج الخلايا المستهدفة.

الشكل 10. تفعيل تحليل تحريض السمية الخلوية لبروتوكول مقارنة بين تحريض الخلايا المستهدفة السامة للخلايا بواسطة الخلايا التائية النشطة في وجود الأجسام المضادة لـ CD3 والأجسام المضادة لـ CD28 ، والخلايا الفائقة ، وخلايا MDA-MB-231 بنسبة 100٪ ، و 75٪ MDA-MB-231/25٪ من الخلايا الليفية ، و 50٪ MDA-MB-231/50٪ من الخلايا الليفية ، أو لا توجد خلايا. تم أيضًا تضمين بيانات الخلايا التائية غير النشطة ورسمها باستخدام المحور ص الأيسر. عدد الخلايا الميتة أو إجمالي إشارة PI بمرور الوقت من الخلايا المستهدفة للتحكم السلبي غير المعالجة المرسومة على المحور y الأيمن. النتائج المعروضة للخلايا التائية المحتضنة بالخلايا المستهدفة (أ) ثنائية الأبعاد أو الخلايا المستهدفة (ب) ثلاثية الأبعاد لمدة سبعة أيام.

يتضح من الشكل 11 أن الاستجابات الحركية للسمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية لنسب مختلفة من الخلية التائية إلى الخلية المستهدفة لكل من النماذج ثنائية وثلاثية الأبعاد يتم الحصول عليها بمرور الوقت. تتوافق هذه النتائج مع النتائج السابقة من مقارنة بروتوكول التنشيط (الشكل 10) ، وكذلك النتائج المبلغ عنها مع في الجسم الحي اختبارات.

الشكل 11. تأثير تركيز الخلايا التائية. مقارنة تحريض الخلايا المستهدفة السامة للخلايا بواسطة الخلايا التائية المضافة إلى الآبار بتركيزات 40.000 خلية / بئر (نسبة 20: 1) ، 20000 خلية / بئر (نسبة 10: 1) ، 10000 خلية / بئر (نسبة 5: 1) ، و 0 خلايا / بئر (تحكم سلبي). النتائج المعروضة للخلايا التائية المحتضنة بالخلايا المستهدفة (أ) ثنائية الأبعاد أو (ب) ثلاثية الأبعاد لمدة سبعة أيام.

أخيرًا ، يمكن أيضًا قياس تأثيرات التنشيط الموجه باستخدام قناة المجال الساطع عند زراعة الخلايا المستهدفة في صورة ثلاثية الأبعاد. هذا يرجع إلى حقيقة أنه استجابة لتأثير الخلايا التائية السامة للخلايا ، تتفكك الأورام بمرور الوقت ، أو تنفجر ، وتطلق الخلايا و ECM داخل البئر. باستخدام إمكانيات قياس التقاء Gen5 والمقاييس المحسّنة في الجدول 7 ، يمكن بعد ذلك تحديد مدى تفكك الورم. يتم تضمين وحدات البكسل فقط داخل كل صورة مع إشارة مجال ساطع أقل من معايير الحد الأعلى في حساب النسبة المئوية للالتقاء. عند عرضها في Gen5 ، يُنظر إلى البيكسلات الخارجية على أنها بيضاء (الشكل 12).

الشكل 12. تحديد التقاء الصورة باستخدام إشارة المجال الساطع. 4x صور حقل مشرق بعد تحليل الصورة وتحديد التقاء٪. تظهر وحدات البكسل غير المضمنة في حساب التقاء بيضاء. الصور المعروضة بعد تفاعل الخلية والربط مع 10: 1 خلية تائية إلى نسبة الخلية المستهدفة لفترتي حضانة (أ) 72 (ب) 116 (ج) 136 و (د) 168 ساعة.

يمكن بعد ذلك رسم قيم التقاء النسبة المئوية بمرور الوقت لتصور حركية تفكك الورم استجابةً لزيادة الخلايا التائية إلى نسب الخلية المستهدفة.

توضح المنحنيات في الشكل 13 كيف يفسر رسم التقاء بمرور الوقت حركية التأثير النهائي. كما هو متوقع ، فإن التركيزات الأعلى من الخلايا التائية المنشطة تدمر الورم أسرع من التركيزات الأقل. تظهر الأورام غير المعالجة أيضًا تغيرًا طفيفًا في التقاء بسبب حقيقة أنه لا يُرى سوى القليل من السمية الخلوية (الشكل 10 ب) مما يسمح للورم بالبقاء على حاله خلال فترة الحضانة السبعة أيام.

الشكل 13. النسبة المئوية للصورة الحركية التقاء الكمي. مؤامرة التقاء النسبة المئوية لصورة المجال الحركي الحركي بسبب تفكك الورم ثلاثي الأبعاد.

استنتاج

وجد أن التنشيط المباشر للخلايا التائية ، حيث تعرضوا للخلايا المستهدفة على مدى فترات طويلة في المختبر ، أدى إلى زيادة ملحوظة في السمية الخلوية مقارنة بالتنشيط العام باستخدام الخلايا غير المستهدفة. علاوة على ذلك ، كان التأثير المتناقص واضحًا إذا تمت زراعة الخلايا المستهدفة مع الخلايا الليفية في عملية التنشيط: كلما زادت نسبة الخلايا الليفية ، قل السمية الخلوية الواضحة. يشير هذا إلى أن الخلايا التائية يمكن أن تتأصل في عملية التنشيط للبحث عن الخلايا المستهدفة وتدميرها.

كان نموذج الخلية ثلاثية الأبعاد أفضل بكثير من نموذج الخلية ثنائية الأبعاد حيث تم الحفاظ على صحة الخلية طوال فترات التشغيل الحركية الطويلة. يمكن قياس السمية الخلوية باستخدام يوديد البروبيديوم الذي يقيس تمزق غشاء البلازما أو باستخدام حقل مشرق (خالي من الملصقات) يقيس زيادة التقاء عن طريق التفصيل الكروي.

يتكون نظام Agilent BioTek BioSpa من ثاني أكسيد الكربون الآلي2 حاضنة خلط الألواح الدقيقة إلى قارئ التصوير الخلوي Agilent BioTek ، مما يسمح بالتشغيل الآلي لمقايسة السمية الخلوية الحركية لمدة 7 أيام.


نتائج

توليد الماوس المعدلة وراثيًا Nlrc5-stop flox كأداة للتعبير الشرطي لجزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى

لقد تبين سابقًا أن التعبير عن MHC II على الخلايا الزعترية DP يعزز تطوير خلايا CD4 T المقيدة بـ MHC II (T-CD4) مع النمط الظاهري يشبه NKT 21 ، 22 ، 24 ، 29. لذلك ، افترضنا أن تعبير MHC I على الخلايا thymocytes DP يمكن أن يكون له تأثير مماثل عن طريق اختيار خلايا T تشبه NKT المقيدة بـ MHC I (الشكل & # x000a0 1a). عادة ، لا تعبر الخلايا التوتية الفأرية في مرحلة DP من تطورها عن جزيئات MHC I أو MHC II الكلاسيكية 19. بحثًا عن نهج مناسب لدفع تعبير MHC I المستقر في DP ، اخترنا عامل النسخ Nlrc5 (المعروف أيضًا باسم CITA) كمرشح رئيسي بهذه الوظيفة المحتملة. يعد Nlrc5 أمرًا ضروريًا للنسخ ليس فقط لجينات MHC I ولكن أيضًا للمكونات الضرورية لمعالجة MHC I وتحميل الببتيد مثل & # x003b22m و Tap1 و Lmp2 25 ، 28. بالإضافة الى، Nlrc5 يتم قمع التعبير بشدة في مرحلة DP thymocyte (بيانات الشكل رقم & # x000a0 1b من ImmGen 30). لاختبار ما إذا كان Nlrc5 يمكنه زيادة تعبير MHC I في المختبر ، قمنا باستنساخ تسلسل الترميز (CDS) للفأر Nlrc5 الجين في ناقل التعبير الفيروسي. في الواقع ، أظهرت عينات خلايا HEK 293 المنقولة أن Nlrc5 كان كافياً لدفع تعبير MHC I أعلى مقارنةً بعينات التحكم (الشكل & # x000a0 1c).

أ تمثيل تخطيطي للاختيار الإيجابي للخلايا التائية الشبيهة بالفطريات على الخلايا التيموسية DP. ب مستوى التعبير مرنا من الفئران Nlrc5 في مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية من الفئران B6 WT. تم الحصول على البيانات من ImmGen. ج تحليل التدفق الخلوي لخلايا HEK 293 المنقولة بواسطة ناقل التعبير الفيروسي البطيء الذي يشفر الفئران Nlrc5 تسلسل الترميز (CDS) أو مع فيروس فارغ كعنصر تحكم. كعناصر تحكم إضافية ، يتم عرض الخلايا غير المنقولة وتلطيخ التحكم بالنمط المتماثل. يتم تحليل الخلايا 48 & # x02009h بعد النقل. د هيكل من النوع البري Rosa26 والأليل المستهدف للفأر المعدّل وراثيًا (Nlrc5-stop flox). ه تقييم التدفق الخلوي لتعبير MHC I و MHC II على الخلايا التائية من الفئران المعدلة وراثيًا WT و CD4-Cre & # x02009 & # x000d7 & # x02009Nlrc5-stop flox (T-MHC I) و Plck-CIITA (T-MHC II). البيانات هي تمثيلية من خمس تجارب مستقلة، ن& # x02009 & # x02265 & # x020095 الفئران لكل مجموعة تجريبية. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

لاختبار دور Nlrc5 في الجسم الحي ، أنشأنا فأرًا محرضًا محفزًا ومحولًا وراثيًا حيث يمكن تنظيم تعبير Nlrc5 بطريقة خاصة بالأنسجة ، في الخلايا التي تعبر عن recombinase Cre. باختصار ، بناء مع شريط توقف محاط بـ loxP أمام الفأر Nlrc5 تم إدخال CDS في ملف روزا 26 موضع (الشكل & # x000a0 1d). يسمح هذا التصميم Nlrc5 التعبير بمجرد وجود recombinase Cre في الخلية. تم عبور خط الماوس هذا إلى الماوس CD4-Cre لبدء تعبير Cre في مرحلة DP. لاحظنا أن MHC I (H-2Db و H-2Kb) تم التعبير عنه بشكل كبير على الخلايا التيموسية DP في هذه الفئران ، مقارنةً بعناصر التحكم ، التي لا تعبر عنها عادةً (الشكل & # x000a0 1e والشكل التكميلي & # x000a0 1a) . أظهرت الخلايا التوتية والخلايا الطحالية أحادية الموجبة (SP) ، والتي تعبر عادةً عن مستويات عالية من معقد التوافق النسيجي الكبير I ، مستويات أعلى قليلاً فقط في هذه الفئران. من الجدير بالذكر أن تعبير MHC II لم يتأثر بـ Nlrc5 التحوير (الشكل & # x000a0 1e).

أظهرت أليلات MHC Ib غير الكلاسيكية التي تقدم الببتيدات ، Qa-1 ، و Qa-2 ، و H2-M3 ، نفس نمط التعبير على الخلايا التوتية مثل أليلات MHC Ia الكلاسيكية H2-Kb و H2-Db (أي منخفضة على DP. thymocytes) (الشكل التكميلي & # x000a0 1d). Nlrc5 أدى الإفراط في التعبير إلى تنظيمها أيضًا (الشكل التكميلي # x000a0 1b). على النقيض من ذلك ، فإن التعبير الجيني للجزيئات غير الببتيدية CD1d و MR1 مرتفع في الخلايا التوتية DP (الشكل التكميلي & # x000a0 1e) ولم يتم تغييره عن طريق الإفراط في التعبير عن Nlrc5 (الشكل التكميلي & # x000a0 1c). يشير هذا إلى أن عرض الببتيد من خلال جزيئات MHC Ia / Ib ، على وجه الخصوص ، غائب في الخلايا الزعترية القشرية DP بسبب عدم وجود Nlrc5 التعبير ، في حين يتم الحفاظ على عرض الدهون والمستقلب.

كعنصر تحكم إضافي ، حصلنا على الفئران المعدلة وراثيًا plck-CIITA 21 ، والتي تفرط في التعبير عن MHC II على الخلايا التائية بدءًا من مرحلة DP thymocyte (الشكل & # x000a0 1e). في الأقسام التالية ، تم تحليل كلا السلالتين بالتوازي. للتبسيط ، نشير إلى CD4-Cre / Nlrc5-stop فلوكس as & # x0201cT-MHC I & # x0201d الماوس و pLck-CIITA كـ & # x0201cT-MHC II & # x0201d mouse.

نتج عن تعبير MHC I على الخلايا التوتية DP زيادة في خلايا PIL T.

لم تظهر بنية الغدة الصعترية والتوزيع العام للمجموعة الفرعية في الغدة الصعترية أي تغييرات ملفتة للنظر بين النوع البري (WT) و T-MHC I (الشكل & # x000a0 2a & # x02013c والشكل التكميلي # x000a0 2). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في تواتر خلايا DN و DP و CD4 SP T أو & # x003b3 & # x003b4 T cells أو & # x003b3 & # x003b4 خلايا NKT (المعرفة على أنها خلايا PLZF + & # x02009 & # x003b3 & # x003b4 T). تُظهر الفئران T-MHC II ترددًا متزايدًا لـ CD8 SP بسبب تحريض & # x0201cm النمط الظاهري & # x0201d CD8 T الخلايا ، كما هو موضح سابقًا 31. في المقابل ، أظهرت الفئران T-MHC I ، إن وجدت ، انخفاضًا طفيفًا في عدد الخلايا التائية CD8 SP وترددها ، وزيادة طفيفة في رقم خلية MAIT (الشكل & # x000a0 2a & # x02013c والبوابة في الشكل التكميلي. # x000a0 3a & # x02013c). تم تقليل عدد خلايا iNKT مرتين تقريبًا من حيث العدد والتردد في كل من الفئران T-MHC I و T-MHC II. كان الانخفاض في عدد خلايا iNKT وتكرارها أكثر وضوحًا في الطحال وكان نفس اتجاه الاختزال موجودًا في الكبد أيضًا (الشكل التكميلي & # x000a0 4a ، ب). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في خلية MAIT ورقم خلية NKT # x003b3 & # x003b4 في الطحال (الشكل التكميلي & # x000a0 4d ، e). والمثير للدهشة أن تيريج لم يتأثر تردد الخلية في الفئران T-MHC II ولكنه زاد في الغدة الصعترية والطحال في الفئران T-MHC I. في الطحال ، كان هذا الاختلاف ذا دلالة إحصائية أيضًا في رقم الخلية (الشكل التكميلي & # x000a0 4b اللوحة السفلية). بشكل عام ، لم يُظهر الماوس المعدّل وراثيًا T-MHC I تغييرات كبيرة في تطور الخلايا الليمفاوية ، باستثناء زيادة متواضعة في Tريج وانخفاض في تردد خلايا iNKT وأرقامها.

أ مؤامرات قياس التدفق الخلوي التمثيلية من إجمالي الخلايا التوتية من الفئران WT و T-MHC I و T-MHC II. ب تحديد كمية البيانات وفقًا لاستراتيجية البوابة المعروضة في أ. يتم رسم ترددات الخلايا على المحور الأيسر والأرقام على المحور الأيمن. ج إجمالي عدد الخلايا لخلايا MAIT وخلايا & # x003b3 & # x003b4NKT في الغدة الصعترية للفئران WT و T-MHC I. د قطع تمثيلية لاستراتيجية قياس التدفق الخلوي لتحديد خلايا PIL في WT الغدة الصعترية. ه مؤامرات قياس التدفق الخلوي التمثيلي لتلطيخ خلايا PIL بمقارنة WT مع الفئران T-MHC I و T-MHC II من الغدة الصعترية والطحال. F التردد (المرسوم على المحور الأيسر) والعدد (المرسوم على المحور الأيمن) لخلايا PIL من الفئران WT و T-MHC I و T-MHC II المحددة بواسطة استراتيجية التدفق الخلوي الموضحة في د. ب, ج, F تمثل كل نقطة حيوانًا واحدًا: ن& # x02009 = & # x0200910 حيوانات لكل مجموعة (مجموعات WT و T-MHC I) و ن& # x02009 = & # x020098 حيوانات (مجموعة T-MHC II) في ب, ن& # x02009 = & # x020094 حيوانات لكل مجموعة في ج و ن& # x02009 = & # x020099 حيوانات لكل مجموعة في F. البيانات تمثل خمسة بوصات أ, ب وثمانية بوصات د& # x02013F تجارب مستقلة.تم إجراء تجربة واحدة في ج. تم إجراء اختبار Mann ثنائي الذيل و # x02013Whitney في ب, ج, F) ص& # x02009 & # x02265 & # x020090.01 ليست مصورة ، **ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.01 ، ***ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.001 ، و ****ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001. البيانات صاستاء من القيم المتوسطة & # x02009 & # x000b1 & # x02009SD. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

بعد ذلك ، سعينا إلى تحديد ما إذا كان قد تم توسيع الخلايا ذات النمط الظاهري الشبيه بـ NKT في الماوس المعدّل وراثيًا T-MHC I المماثل لتلك التي شوهدت مع الفئران T-MHC II (الشكل & # x000a0 1a). PLZF هو عامل النسخ الرئيسي الذي يمنح السمات الفطرية لسلالة خلية iNKT 14. لذلك ، أنشأنا استراتيجية بوابة سمحت بتحديد خلايا PIL T الخاصة بالببتيد ، عن طريق البوابات على خلايا TCR & # x003b2 + PLZF + واستبعاد المجموعات الفرعية الأخرى المعروفة بالتعبير عن PLZF ، مثل خلايا iNKT ، وخلايا # x003b3 & # x003b4 T ، وخلايا MAIT (الشكل & # x000a0 2d). من خلال هذه الإستراتيجية ، حددنا جزءًا صغيرًا من خلايا PIL T الموجودة في زملاء فضلات WT ، وزادت بمقدار أربعة أضعاف في الفئران T-MHC I (الشكل. & # x000a0 2e ، و). ومع ذلك ، كان هذا التغيير أقل قوة من 10 & # x0201315 زيادة في خلايا PIL T في T-MHC II.

يعتمد توسع PIL T-cell على SAP ولا يتوسطه Nlrc5 بطريقة جوهرية للخلية

على الرغم من أننا لم نلاحظ تنظيم CD1d السطحي استجابةً لتعبير Nlrc5 في الخلايا التوتية DP ، فمن الممكن رسميًا أن تعتمد خلايا PIL T على CD1d. لذلك ، عبرنا الفئران T-MHC I إلى قرص مضغوط & # x02212 / & # x02212 الفئران. أدى نقص CD1d إلى إلغاء تطور خلايا iNKT ، كما هو متوقع ، ولكن إذا كان هناك أي شيء ، فقد أدى إلى زيادة أعداد الخلايا التائية PIL في الفئران T-MHC I (الشكل & # x000a0 3a ، ب). وبالتالي ، من المحتمل أن تكون معظم خلايا PIL T مقيدة MHC Ia / Ib ، حيث تعتمد أعدادها على تعبير MHC I في الخلايا الزعترية DP ، ولكنها لا تعتمد على CD1d.

أ مؤامرات قياس التدفق الخلوي التمثيلية من إجمالي الخلايا التوتية من قرص مضغوط & # x02212 / & # x02212 و قرص مضغوط & # x02212 / & # x02212 الفئران T-MHC I. ب تردد خلية iNKT و PIL Thymic ومقارنة الأرقام بين WT و قرص مضغوط & # x02212 / & # x02212 و T-MHC I و قرص مضغوط & # x02212 / & # x02212 الفئران T-MHC I. ج مخططات التدفق الخلوي التمثيلي من مجموعة من الفئران الوراثية غير المتكافئة لنخاع العظام (BM) 8 أسابيع بعد الزرع. تم تشعيع الفئران WT CD45.1 + بشكل مميت وزرعها بمزيج من WT CD45.1 / 2 + و T-MHC I CD45.2 + نخاع العظم بنسبة 1 & # x02009: & # x0200910. تم تصوير هذه المجموعة التجريبية على أنها مجموعة WT & # x02009 + & # x02009T-MHC I. في المجموعة الضابطة ، تم زرع الفئران بمزيج من WT CD45.1 / 2 + و WT CD45.2 + نخاع العظم بنسبة 1 & # x02009: & # x0200910. تم تصوير هذه المجموعة التجريبية على أنها مجموعة WT & # x02009 + & # x02009WT. تظهر مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي تعرض استراتيجية البوابة من مجموعة WT & # x02009 + & # x02009WT (في اللوحتين اليسرى). في اللوحات الأربعة اليمنى (باللون الأخضر) تظهر مخططات تمثيلية تعرض ترددات خلية PIL (بوابة على WT CD45.1 / 2 +) من مجموعة WT & # x02009 + & # x02009WT (على اليسار) و WT & # x02009 + & # مجموعة x02009T-MHC I (على اليمين). يظهر تقييم تردد خلية PIL في د. ه مؤامرات قياس التدفق الخلوي التمثيلية من إجمالي الخلايا التوتية من Sh2d1a & # x02212 / & # x02212 (نقص SAP) و Sh2d1a & # x02212 / & # x02212 الفئران T-MHC I. iNKT و PIL و T.ريج يتم عرض تردد الخلية في F. ب, د, F تمثل كل نقطة حيوانًا واحدًا: ن& # x02009 = & # x0200910 حيوانات لكل مجموعة (مجموعات WT و T-MHC I) ، ن& # x02009 = & # x020097 حيوانات (CD1d & # x02212 / & # x02212 مجموعة)، ن& # x02009 = & # x020093 حيوانات (CD1d & # x02212 / & # x02212 مجموعة T-MHC I) ، ن& # x02009 = & # x020098 حيوانات (مجموعة WT & # x02009 + & # x02009WT) ، ن& # x02009 = & # x020099 حيوانات (WT & # x02009 + & # x02009T-MHC I group) ، ن& # x02009 = & # x020095 حيوانات (Sh2d1a & # x02212 / & # x02212 المجموعة) و ن& # x02009 = & # x020096 حيوانات (Sh2d1a & # x02212 / & # x02212 مجموعة T-MHC I). البيانات تمثل أربعة بوصات أ, ب, ه, F واثنان في ج, د تجارب مستقلة. تم إجراء اختبار Mann ثنائي الذيل و # x02013Whitney في ب, د وطالب غير ثنائي الذيل & # x02019s ر- تم إجراء الاختبار في F ns ، غير مهم (ص& # x02009 & # x02265 & # x020090.05) ، *ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.05 ، **ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.01 ، ***ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.001 ، و ****ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001. يتم تقديم البيانات كقيم متوسطة & # x02009 & # x000b1 & # x02009SD. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

بعد ذلك ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان MHC I مطلوبًا على الخلايا thymocytes DP المجاورة لتطوير الخلايا التائية PIL ، أو إذا كان ذلك بسبب تأثير غير معروف للخلية الداخلية للإفراط في التعبير عن Nlrc5. تحقيقا لهذه الغاية ، أنشأنا مجموعة من الفئران الوهمية غير المتكافئة BM ، حيث تم تعريض متلقي WT للإشعاع المميت وزرعه بمزيج من WT و T-MHC I BM بنسبة 1 & # x02009: & # x0200910 من فئران متجانسة مختلفة. مع هذا الإعداد ، فإن 90 ٪ من الخلايا التوتية المجاورة تعبر عن MHC I وبالتالي فهي قادرة على تحفيز اختيار الخلايا التائية PIL في أسلاف WT. تلقت مجموعة التحكم مزيجًا من WT و WT BM من فئران متجانسة مختلفة. في الواقع ، بعد 8 أسابيع من الزرع ، كانت هناك زيادة كبيرة في خلايا PIL T بين الخلايا المشتقة من WT BM عندما كانت الخلايا التوتية المجاورة تعبر عن MHC I ، مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل & # x000a0 3c ، د). كانت هناك زيادة كبيرة في تردد الخلايا التائية PIL أيضًا في الطحال. لذلك ، لا تفضل هذه النتيجة احتمال أن يؤدي التعبير الجبري عن Nlrc5 إلى تعزيز تطور PILs بطريقة جوهرية للخلية وتؤكد الفرضية القائلة بأن خلايا PIL T تتوسع بسبب تنظيم MHC I على الخلايا التوتية DP المجاورة. وتجدر الإشارة إلى أن تردد T.ريج لم تزد الخلايا بين الخلايا المشتقة من WT BM ولكن تمت ملاحظتها فقط بين الخلايا المشتقة من T-MHC I (الشكل التكميلي & # x000a0 5a ، ب). يشير هذا إلى أن التوسع الملحوظ في T.ريج يتم التوسط في الخلايا الموجودة في الماوس T-MHC I عن طريق تعبير Nlrc5 بطريقة جوهرية للخلية.

أحد المتطلبات الأساسية لتطوير خلايا iNKT هو إطلاق مسارات إشارات SLAM-SAP أثناء اختيار ناهض 13. لذلك ، سعينا إلى تحديد ما إذا كان نقص SAP له نفس التأثير على خلية PIL T كما هو الحال في تطوير خلايا iNKT. من المتوقع أن يؤدي عدم وجود SAP إلى إلغاء تطور خلايا iNKT تمامًا. كما أنه ألغى توليد خلايا PIL T في كل من الغدة الصعترية (الشكل & # x000a0 3e ، f) والطحال (الشكل التكميلي & # x000a0 5c ، د). يشير هذا إلى أن خلايا PIL T وخلايا iNKT تستخدم مسارات إشارات مماثلة أثناء اختيارها وتطويرها.

تم العثور على خلايا PIL T في نفس مجموعات المستجيب الفرعية مثل خلايا iNKT

توجد خلايا iNKT الزعترية في ثلاث مجموعات فرعية محددة جيدًا (iNKT1 و 2 و 17) ، مماثلة للخلايا التائية المساعدة النشطة المحيطي 32. باستخدام تلطيخ عامل النسخ ، وجدنا أن خلايا PIL T تنقسم أيضًا إلى ثلاث مجموعات فرعية مماثلة ، والتي نسميها PIL1 (PLZF lo Tbet + ROR & # x003b3t -) ، PIL2 (PLZF hi ROR & # x003b3t -) ، و PIL17 (PLZF int ROR & # x003b3t +) خلايا (الشكل & # x000a0 4a). كان تعبير NK1.1 على PIL1 و CD4 على PIL2 و CD138 على خلايا PIL17 مشابهًا أيضًا لمجموعات الخلايا الفرعية iNKT (الشكل التكميلي & # x000a0 6a). ومن ثم ، فإن هذا يشير إلى أن كل جزء من أجزاء PIL قد يُظهر خصائص وظيفية مماثلة لمجموعة خلايا iNKT المقابلة. أظهرت العديد من الدراسات المستقلة أن مجموعات NKT الثلاثة لديها برامج تعبير جيني مميزة تمامًا 33 & # x02013 35. في الواقع ، كان التعبير عن لوحة كبيرة من الجزيئات ذات الصلة وظيفيًا ، بما في ذلك CD122 و CXCR3 و CD69 و PD1 و CCR6 و CD25 مشابهًا بين مجموعات فرعية PIL و iNKT (الشكل التكميلي & # x000a0 6b) ، كما كان إنتاج السيتوكينات interferon - & # x003b3 (IFN & # x003b3) و interleukin (IL) -4 و IL-17A بعد التحفيز في المختبر (الشكل التكميلي & # x000a0 6c) 32 ، 33. مجتمعة ، تستنتج هذه البيانات أن البرامج النسخية والوظيفية المماثلة تعمل في خلايا PIL و iNKT.

أ على غرار خلايا iNKT ، تنقسم خلايا PIL T إلى ثلاث مجموعات فرعية محددة بنمط التعبير عن عوامل النسخ PLZF و ROR & # x003b3t. تظهر مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي تقارن مجموعات فرعية من الخلايا التائية PIL من الفئران WT و T-MHC I و T-MHC II. ب مقارنات بين ترددات مجموعة فرعية من الخلايا التائية PIL (الصف العلوي) والأرقام (الصف السفلي). ج مؤامرات قياس التدفق الخلوي التمثيلية لتلطيخ CD4 و CD8 & # x003b1 على خلايا PIL من الفئران WT و T-MHC I و T-MHC II. د تقييم التدفق الخلوي لمرجع سلسلة TCR V & # x003b2 لخلايا PIL التائية من الفئران WT و T-MHC I و T-MHC II مقارنة بالخلايا التائية التقليدية. ه تُظهر المخططات النموذجية تلطيخًا لـ TCR & # x003b2 على مجموعات فرعية من خلايا iNKT مقارنة بمجموعات فرعية من خلايا PIL T من الفئران WT و T-MHC I و T-MHC II. جميع الحيوانات التي تم تحليلها هي من الجيل F1 مع الفئران BALB / c (تتميز كذلك في الشكل & # x000a0 6). F نمط التعبير CD44 و NK1.1 على (من اليسار إلى اليمين) خلايا iNKT و WT PIL و T-MHC I PIL و T-MHC II PIL T. ب تمثل كل نقطة حيوانًا واحدًا: ن& # x02009 = & # x020098 حيوانات لكل مجموعة (مجموعات WT و T-MHC II) و ن& # x02009 = & # x020099 حيوانات (مجموعة T-MHC I). تمثل البيانات سبعة بوصات أ& # x02013ج وثلاثة في د& # x02013F تجارب مستقلة. تم إجراء اختبار Mann ثنائي الذيل و # x02013Whitney في ب ns ، غير مهم (ص& # x02009 & # x02265 & # x020090.05) ، *ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.05 ، **ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.01 ، ***ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.001 ، و ****ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001. يتم تقديم البيانات كقيم متوسطة & # x02009 & # x000b1 & # x02009SD. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

والجدير بالذكر ، تم تمييز كل من خلايا PIL T المقيدة بـ MHC I- و MHC II إلى ثلاث مجموعات فرعية (الشكل & # x000a0 4a ، ب). ومع ذلك ، أظهرت خلايا PIL المقيدة بـ MHC II في حيوانات T-MHC II انحرافًا قويًا تجاه النمط الظاهري للمستجيب PIL2 ، على حساب PIL. يتوافق هذا مع الإنتاج المفرط الموصوف جيدًا لـ IL-4 بواسطة PLZF + T-CD4s في الفئران pLck-CIITA 31. ومع ذلك ، كانت المجموعات الفرعية الثلاث موجودة بنسب مماثلة في الفئران WT و T-MHC I (الشكل & # x000a0 4a ، ب).

كما ذكرنا أعلاه ، قد تكون خلايا PIL T متشابهة ظاهريًا ووظيفيًا لخلايا iNKT. ومع ذلك ، على عكس خلايا iNKT ، يتم اختيارها على جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير الكلاسيكية. لذلك ، قمنا بفحص تعبير المستقبل المشترك لـ TCR واستخدام سلسلة TCR V & # x003b2. كما ورد سابقًا ، تم العثور على خلايا PIL T النامية في الفئران T-MHC II إلى حد كبير CD4 SP مع جزء صغير من خلايا DN (الشكل & # x000a0 4c). من المثير للدهشة أن خلايا PIL T في الفئران T-MHC I لم تعبر بشكل حصري عن CD8 ، ولكن تم فصلها في CD4 SP و CD8 SP و DN ، على غرار تلك الموجودة في الفئران WT ، مما يشير إلى أن خلايا PIL T في الفئران WT قد تكون أكثر ارتباطًا بـ خلايا MHC I المقيدة (الشكل & # x000a0 4c). على الرغم من أننا لم نلاحظ تحيزًا شديدًا في استخدام سلسلة TCR V & # x003b2 بواسطة خلايا PIL T ، كانت هناك زيادة ملحوظة في تكرار V & # x003b23 + و V & # x003b25.1 / V & # x003b25.2 + الخلايا داخل PIL T تجمع خلية من الفئران WT و T-MHC I. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك زيادة طفيفة في تردد خلايا V & # x003b26 + داخل خلايا PIL T من الفئران T-MHC II (الشكل. & # x000a0 4d).

لقد تبين سابقًا أن مجموعات الخلايا الفرعية من الخلايا thymic iNKT تعرض مستويات مختلفة من TCR على سطحها ، وهي سمة أكثر بروزًا على خلفية BALB / c 33 ، 36. تكون مستويات TCR أعلى في خلايا NKT2 ، وأقلها في خلايا NKT1 ، ومتوسطة في خلايا NKT17. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن هذه الاختلافات في مستويات تعبير TCR ، وبالتالي قوة الإشارة المفترضة ، لتكون محورية لالتزام مجموعة خلايا iNKT الفرعية والتمايز 37 & # x02013 39. ومع ذلك ، لم تختلف TCR السطحية اختلافًا كبيرًا بين مجموعات الخلايا التائية PIL الفرعية (الشكل & # x000a0 4e) ، مما يشير إلى أن العوامل الأخرى غير مستوى تعبير TCR قد تملي التزام المجموعة الفرعية والتمايز في هذه الخلايا.

استخدمت الدراسات التاريخية في مجال بيولوجيا خلايا iNKT CD44 و NK1.1 كعلامات لتقييم نضج خلايا iNKT ومرحلة التطور 40. باستخدام هذه العلامات ، تم العثور على نسبة أعلى من خلايا PIL T منخفضة CD44 مقارنة بخلايا iNKT ، مما يشير إلى مرحلة أقل نضجًا (الشكل & # x000a0 4f).

يتطلب تطوير النمط الظاهري للذاكرة CD8 T مشاركة مستقبلات CD4 في خلايا PIL T.

كما ورد سابقًا ، تمت زيادة تواتر خلايا CD8 SP T في الغدة الصعترية لفئران T-MHC II (الشكل & # x000a0 2b) 21 ، 22 ، 31. تبين أن سبب ذلك هو IL-4 الذي تنتجه خلايا PIL T (تسمى خلايا T-CD4 في ذلك التقرير) ، والتي تتوسط في تطوير النمط الظاهري للذاكرة CD8 T (T).النائب) الخلايا من خلال تحريض الجلد الإلكتروني (Eomes) 41. وبالتالي ، فإن نسبة كبيرة من خلايا CD8 SP T في الفئران T-MHC II تعبر عن Eomes (الشكل & # x000a0 5a) ولها نمط ظاهري للذاكرة 31. لدهشتنا ، لم تكن هناك زيادة في Eomes + CD8 T.النائب في الفئران T-MHC I (الشكل & # x000a0 5b). نظرًا لأن تفاعل TCR مع MHC II يمكن أن يستدعي إشارات مستقبلات CD4 المشتركة ، فقد استنتجنا أن تحريض إنتاج IL-4 بواسطة خلايا PIL T ، وبالتالي الزيادة في CD8 Tالنائب قد تكون الخلايا نتيجة إشارات مستقبلات مشتركة CD4. لاختبار هذه الفرضية ، عبرنا الفئران T-MHC I مع الفئران المعدلة وراثيًا CD8.4. في هذه الفئران ، الذيل السيتوبلازمي للداخل Cd8a تم استبدال الجين بالذيل السيتوبلازمي لـ CD4 42. لم يتسبب التحوير CD8.4 في زيادة العدد الإجمالي لخلايا PIL T في الفئران T-MHC I (الشكل & # x000a0 5c) ، لكنه حول نسبة خلايا PIL T لصالح خلايا PLZF hi PIL2 ( الشكل & # x000a0 5d) والتي تنتج IL-4. تمشيا مع هذا ، فإن عدد CD8 T.النائب تمت زيادة ملحوظة في الفئران CD8.4 T-MHC I (الشكل & # x000a0 5e). شوهد اتجاه مماثل في الطحال (الشكل التكميلي # x000a0 7). وبالتالي ، فإن المستقبِل المشترك المحدد الذي يشارك في استشعار روابط معقد التوافق النسيجي الكبير على الخلايا التيموسية DP يؤثر على تمايز مجموعة المستجيب الفرعية لخلايا التائية PIL وله تأثيرات ثانوية لـ CD8 Tالنائب تطوير.

أ مؤامرات قياس التدفق الخلوي التمثيلية لتلطيخ الخلايا من أجل Eomes على الخلايا التوتية CD8 SP من الفئران WT و T-MHC I و T-MHC II. ب رقم (مرسوم على المحور الأيمن) والتردد (مرسوم على المحور الأيسر) لـ CD8 T.النائب الخلايا بين خلايا CD8 SP في الغدة الصعترية من الفئران WT و T-MHC I و T-MHC II ، المحددة بواسطة استراتيجية البوابة الموضحة في أ. ج مؤامرات قياس التدفق الخلوي التمثيلية للخلايا التوتية التي تقارن تردد الخلايا التائية PIL من الفئران T-MHC I مع الفئران CD8.4 Tg / + & # x000a0T-MHC I. تظهر تقييمات موجزة لعدد الخلايا التائية PIL وترددها (لوحتان على اليمين). د مخططات التدفق الخلوي التمثيلي وتقييم موجز لتكرار مجموعة فرعية من الخلايا التائية PIL2 بين الخلايا التوتية من الفئران T-MHC I و CD8.4 Tg / + & # x000a0T-MHC I الفئران. تتم مقارنة كلا المجموعتين مع الفئران WT. ه مخططات التدفق الخلوي النموذجي لـ CD8 T.النائب تردد الخلية بين خلايا CD8 SP في الغدة الصعترية من الفئران T-MHC I مع الفئران CD8.4 Tg / + T-MHC I (اليسار لوحتين) وتقييم موجز لـ CD8 Tالنائب رقم الخلية (اللوحة اليمنى). تمثل كل نقطة حيوانًا واحدًا: ن& # x02009 = & # x020099 حيوانات لكل مجموعة (مجموعات WT و T-MHC II) في أ, ب, ن& # x02009 = & # x020099 حيوانات (مجموعة T-MHC I) في ج, د, ن& # x02009 = & # x020097 حيوانات (مجموعة T-MHC I) في ب, ه، و ن& # x02009 = & # x020094 حيوانات (مجموعة CD8.4 Tg / + T-MHC I) في ج& # x02013ه. تمثل البيانات 7 بوصة أ, ب و 2 بوصة ج& # x02013ه تجارب مستقلة. تم إجراء اختبار Mann ثنائي الذيل و # x02013Whitney في ب& # x02013ه ns ، غير مهم (ص& # x02009 & # x02265 & # x020090.05) ، *ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.05 ، **ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.01 ، و ****ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001. يتم تقديم البيانات كقيم متوسطة & # x02009 & # x000b1 & # x02009SD. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

تتنافس خلايا PIL T مع خلايا iNKT للحصول على مكانة خلوية داخل الغدة الصعترية

على غرار ما تم الإبلاغ عنه سابقًا باستخدام الماوس T-MHC II 43 ، لاحظنا انخفاضًا بمقدار ضعفين إلى ثلاثة أضعاف في عدد خلايا iNKT الخاصة بالدهون في الفئران مع زيادة عدد الخلايا التائية PIL بسبب تعبير MHC I أو MHC II على DP thymocytes (الشكل & # x000a0 2b). تجدر الإشارة إلى أن إجمالي عدد الخلايا المجمعة لخلايا PILs & # x02009 + & # x02009iNKT لم يكن مختلفًا بشكل كبير بين الفئران WT و T-MHC I (البيانات غير معروضة). نظرًا لأن كل من الخلايا التائية الخاصة بالببتيد والدهون تتطلب إشارات SAP من مستقبلات عائلة SLAM المشتركة السطحية لتتطور إلى خلايا PIL T أو خلايا iNKT ، على التوالي ، فإن هذا يشير إلى أن نوعي الخلايا قد يكونان في منافسة مع بعضهما البعض في مكانة خلوية. داخل التوتة. لمزيد من اختبار هذه الفكرة ، قمنا بفحص الفئران B6xBALB / c F1 ، والتي لديها مكانة خلية iNKT أكبر قليلاً (مزدوجة) 32 ، 44. إذا كان هناك مكان مشابه ينظم خلايا PIL T ، فقد نتوقع المزيد من خلايا PIL T في الفئران F1. في الواقع ، كان كل من جزء وعدد خلايا PIL T في الفئران T-MHC I و T-MHC II أعلى في الحيوانات على خلفية F1 مقارنة بخلفية B6 (الشكل & # x000a0 6a ، b والشكل التكميلي & # x000a0 8a، b) استنتاج وجود مكانة أكبر لتطوير الخلايا التائية PIL على خلفية F1. لاحظنا وجود علاقة عكسية بين عدد خلايا iNKT وخلايا PIL T في كل من الفئران B6 و F1 (الشكل & # x000a0 6c والشكل التكميلي & # x000a0 8c). مجتمعة ، مع توسع خلايا PIL T في الفئران التي تفتقر إلى خلايا iNKT (الشكل & # x000a0 3b) ، تشير هذه البيانات بقوة إلى أن خلايا PIL T وخلايا iNKT تتنافس على نفس المكانة الخلوية. جانبا ، لوحظ أيضًا الانحراف المبلغ عنه لخلايا iNKT تجاه المجموعة الفرعية PFZF hi NKT2 في الفئران F1 32 في خلايا PIL T (الشكل & # x000a0 6d والشكل التكميلي # x000a0 8d). يشير هذا إلى أن نفس العوامل تتحكم في مجموعة فرعية من مؤثرات الخلية التائية iNKT و PIL في سلالات مختلفة ، والتي من المرجح أن تكون السيتوكينات البيئية ، أو العوامل الداخلية للخلية ، أو جزيئات التحفيز المشترك بدلاً من المستضدات الذاتية المحددة.

أ تم عبور الفئران B6 WT و T-MHC I و T-MHC II إلى الفئران BALB / c وزملائها من الجيل F1 (المسمى F1 و F1 T-MHC I و F1 T-MHC II) تم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي للتردد. من خلايا iNKT و PIL T في الغدة الصعترية. ب تقييم موجز لتردد الخلايا التائية iNKT و PIL (اللوحة اليسرى) والرقم (اللوحة اليمنى) من الفئران WT و T-MHC I و T-MHC II على الخلفية B6 و F1. ج الارتباط العكسي بين عدد خلايا iNKT وعدد خلايا PIL T في الغدة الصعترية من WT (النقاط السوداء) و T-MHC I (مثلثات حمراء) وفئران T-MHC II (مثلثات عكسية زرقاء) على B6 (اللوحة اليسرى) و F1 (اللوحة اليمنى) الخلفية. د تظهر مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي تقارن مجموعات فرعية من الخلايا التائية iNKT و PIL من الفئران WT و T-MHC I و T-MHC II على خلفية B6 (الصف العلوي) و F1 (الصف السفلي). تمثل كل نقطة حيوانًا واحدًا: ن& # x02009 = & # x0200910 حيوانات لكل مجموعة (مجموعات WT و T-MHC I) ، ن& # x02009 = & # x020098 حيوانات (مجموعة T-MHC II) ، ن& # x02009 = & # x020099 حيوانات (مجموعة F1 WT) ، ن& # x02009 = & # x020096 حيوانات (مجموعة F1 T-MHC I) ، و ن& # x02009 = & # x020097 حيوانات (مجموعة F1 T-MHC II) في أ& # x02013د. البيانات تمثل سبع تجارب مستقلة. تم إجراء اختبار Mann ثنائي الذيل و # x02013Whitney في ب ns ، غير مهم (ص& # x02009 & # x02265 & # x020090.05) ، ***ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.001 ، و ****ص& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001. ص 2-القيم و ص- القيم في ج تم حسابها عن طريق تركيب الانحدار غير الخطي وإجراء اختبار Goodness-of-Fit واختبار F لمجموع المربعات الإضافية. يتم تقديم البيانات كقيم متوسطة & # x02009 & # x000b1 & # x02009SD. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.


تحفيز الخلايا أحادية النواة في الدم البشري المحيطي

يتم عزل الخلايا أحادية النواة في الدم البشري المحيطي بشكل روتيني من عينات الدم ثم تُستخدم في العديد من مجالات البحث بما في ذلك اضطرابات المناعة الذاتية والأمراض المعدية وتطوير اللقاحات والسرطانات. يراقب ELISpot Assay الاستجابات المناعية الخلوية السابقة للمنبهات المستضدية. نحن هنا نستخدم قارئ التصوير متعدد الوسائط Agilent BioTek Cytation 7 بالتزامن مع قارئ الصفيحة الميكروسكوبية Agilent BioTek Gen5 وبرنامج التصوير لقياس التغييرات في إفراز السيتوكين في PBMCs باستخدام تنسيق فحص ELISpot اللوني.

مقدمة

يتم تحفيز الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي البشري (PBMCs) بشكل تفاضلي لإفراز عدد من السيتوكينات نتيجة لشلال بوساطة مستقبلات بناءً على نوع الخلية والمحفزات. تقدم استجابة هذه المجموعة المتنوعة من الخلايا للمنبهات المختلفة نظرة ثاقبة لدورها في المرض وتطوير طرق العلاج.

PBMCs هي خلايا دم محيطية لها نواة مستديرة. 1 تتكون هذه الخلايا من الخلايا الليمفاوية (T- و B- و NK- الخلايا) وكذلك حيدات. خلايا الدم المحيطية الأخرى إما لا تحتوي على نوى (كريات الدم الحمراء والصفائح الدموية) أو تحتوي على نوى متعددة الفصوص (العدلات ، الخلايا القاعدية ، والحمضات). في البشر ، تشكل الخلايا الليمفاوية غالبية سكان PBMC ، تليها الخلايا الوحيدة ، ونسبة صغيرة فقط من الخلايا التغصنية. 2

السيتوكينات عبارة عن بروتينات أو ببتيدات ذات وزن جزيئي صغير يفرزها العديد من أنواع الخلايا (خاصة خلايا الجهاز المناعي) التي تنظم مدة وشدة الاستجابة المناعية. انترلوكين السيتوكين 2 (IL-2) هو جزيء تنظيمي خلوي متعدد الاتجاهات يتم إنتاجه بواسطة الخلايا اللمفاوية استجابة للعديد من المحفزات. يلعب دورًا في الوقاية من أمراض المناعة الذاتية من خلال تعزيز تمايز الخلايا التائية غير الناضجة في الخلايا التائية التنظيمية. 3 بالإضافة إلى ذلك ، يتسبب IL-2 في تمايز الخلايا التائية إلى الخلايا التائية المستجيبة وخلايا الذاكرة التائية عندما يتم تحفيز الخلية التائية الأصلية بواسطة مستضد. 4 إنترفيرون جاما (IFN- & gamma) ، هو سيتوكين مهم للمناعة الفطرية والتكيفية ضد العدوى. يتم إنتاج IFN- & gamma في الغالب عن طريق الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا القاتلة الطبيعية (NKT) كجزء من الاستجابة المناعية الفطرية ، وعن طريق الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) المستجيبة بمجرد تطور المناعة النوعية للمستضد. 5 تنبع أهمية IFN- و gamma في الجهاز المناعي جزئيًا من قدرته على تثبيط تكاثر الفيروس مباشرة ، ومن آثاره المناعية والمنشطة المناعية. يرتبط التعبير الشاذ IFN- و gamma بعدد من أمراض الالتهاب الذاتي وأمراض المناعة الذاتية.

يبدأ تنشيط الخلايا التائية عادةً عن طريق تفاعل مستقبل سطح الخلية مع جزيء الترابط المحدد الخاص بها جنبًا إلى جنب مع جزيء التكلفة. 6 يؤدي هذا الحدث الملزم إلى التحلل المائي السريع لفوسفوليبيدات الإينوزيتول إلى دياسيل جلسرين وفوسفات إينوزيتول بواسطة فسفوليباز سي (PLC).

Diacylglycerol هو منشط خيفي لبروتين كيناز C (PKC). يؤدي تنشيط PKC وفوسفات الإينوزيتول ، الذي يؤدي إلى إطلاق Ca 2+ والتعبئة ، إلى سلسلة من الاستجابات الخلوية الإضافية التي تتوسط في تنشيط الخلايا التائية (الشكل 1). اثنان من هذه الاستجابات الخلوية هما إنتاج وإفراز IL-2 و INF- & gamma. تريبتوليد هو ثلاثي أكسيد الديتيربين وهو مثبط قوي للمناعة ومضاد للالتهابات (الشكل 2). ثبت أن تريبتوليد يثبط التعبير عن IL-2 في الخلايا التائية المنشطة عند مستوى صندوق البيورين / العامل النووي وتفعيل النسخ بوساطة NF- & kappaB. 7

شكل 1. رسم تخطيطي لتتالي الإشارة لتحفيز إفراز IL-2 و INF- و gamma.

الشكل 2. هيكل تريبتوليد.


بينما من المعروف أن بعض PBMCs تنتج IL-2 و INF- & gamma ، في ظل ظروف النمو العادية يتم إنتاج القليل. فقط بعد التحفيز سيتم التعبير عن كميات كبيرة من السيتوكينات. 8 Phytohemagglutinin (PHA) عبارة عن ليكتين يرتبط بالسكريات الموجودة على البروتينات السطحية المصابة بالجليكوزيلات ، بما في ذلك مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ، ويربطها بشكل غير محدد. والنتيجة هي التحفيز المنخفض المستوى لتسلسل الإشارة المطلوب لإفراز IL-2 أو INF- & gamma. 9 وبالمثل ، فإن Phorbol myristate acetate (PMA) عبارة عن مركب عضوي صغير ، له هيكل مشابه ل diacylglycerol ، ينتشر عبر غشاء الخلية في السيتوبلازم حيث ينشط مباشرة بروتين Kinase C (PKC). عند استخدامه مع أيونوميسين ، وهو حامض شاردة للكالسيوم ، يؤدي إلى إطلاق الكالسيوم ، فإنه ينتج عنه مستوى معتدل من إطلاق السيتوكين. ومع ذلك ، عندما تحفز PMA ومحفز التكلفة ، مثل PHA ، خلايا PBMC بشكل متزامن ، يتم تعزيز إنتاج السيتوكين بقوة. 10

إجراء اختبار ELISpot مشابه جدًا لإجراء اختبار ELISA التقليدي. يتم طلاء الألواح أولاً بجسم مضاد للالتقاط المناسب. تضاف الخلايا المفرزة المزروعة إلى الآبار مع أي ميتوجين تجريبي أو مستضد مهتم. يتم الاحتفاظ بالخلايا لفترة زمنية يتم إزالتها بعدها. يظل التحليل المفرز مرتبطًا بالأجسام المضادة التي تم التقاطها على مقربة شديدة من الموقع الموجود على اللوحة حيث توجد الخلية التي أنتجت التحليل. بعد إزالة الخلايا وأي مواد غير منضمة ، يضاف جسم مضاد للكشف (عادة ما يكون بيوتينيل) متبوعًا بإنزيم مترافق مع حضانة للسماح بالربط والغسيل لإزالة المواد غير المرتبطة بعد كل خطوة. عندما يتم تحويل الركيزة بواسطة الإنزيم المترافق إلى مركبات ملونة ، يتم تكوين بقع على قاع غشاء اللوحة في مواقع الالتقاط الأصلي للتحليل. ثم يتم تحليل / عد البقع الناتجة باستخدام تحليل الصور. (الشكل 3).

الشكل 3. إجراء بقعة ELISpot.

تجريبي

تم الحصول على مجموعة قياس الألوان البشرية IL-2 ELISpot من العلوم الحيوية U-CyTech (أوترخت ، هولندا) ومجموعة IFN- & gamma / IL-2 ELISpot ذات اللونين البشريين كانت من Cellular Technology Limited (كليفلاند ، أوهايو). تم شراء Phorbol 12-myristate (PMA) و triptolide (رقم الجزء T3652) من Millipore-Sigma. كان Ionomycin (رقم الجزء 407952) من EMD-Millipore. تم الحصول على PBMCs البشرية من Astarte Biologicals (بوثيل ، واشنطن). غشاء PVDP الأبيض 96 بئر (رقم الجزء MSIP4W10) كان من Millipore-Sigma.

زراعة الخلايا: تم تلقي PBMCs البشرية المنقى والحفاظ عليها مجمدة لحين الحاجة إليها. بعد أن تم تخفيف خلايا الذوبان السريع على الفور بنسبة 1:10 في RPMI-1640 بالإضافة إلى 10٪ FBS مع 2 ملي مولار من الجلوتامين والبنسلين والستربتومايسين. تم طرد الخلايا عند 300 جم لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية. تم تعليق الخلايا في 10 مل من وسائط RPMI الطازجة ، وتم عدها وتخفيفها حسب الحاجة لتوفير كثافة 5 مرات × 10 4 خلايا / بئر.

طلاء اللوحة: تم استخدام مجموعة IL-2 ELISpot البشرية من U-CyTech Biosciences أو مجموعة INF- & gamma / IL-2 البشرية ثنائية اللون من CTL لهذه التجارب. يتم طلاء ألواح غشاء PVDF أولاً بالتركيز المناسب من الأجسام المضادة الملتقطة (مضاد IL-2 أو مضاد FTN- وجاما) ويُسمح له بالامتصاص طوال الليل عند 4 درجة مئوية. يتم استنشاق الجسم المضاد غير المرتبط ويتم غسل اللوحة يدويًا 3x باستخدام برنامج تلفزيوني. ثم تملأ الآبار بمحلول مانع (200 & microL) ويُسمح لها بالاحتضان لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. يتم شفط المحلول العازلة دون غسله مباشرة قبل إضافة الخلايا.

بذر الخلية: ما لم يُذكر خلاف ذلك ، تم طلاء الخلايا في 96 طبقًا غشائيًا جيدًا مطلية مسبقًا بجسم مضاد بكثافة 5 مرات و 104 / بئر. تم تحفيز PBMCs لإفراز IL-2 بمزيج PMA (50 نانوغرام / مل) ، أيونوميسين (1 وميكروغ / مل). استخدمت التجارب النموذجية حجم 100 & microL للخلايا متبوعًا بإضافة 100 & microL من خليط المنشطات بتركيز 2x.

تثبيط تريبتوليد: تم طلاء PBMCs عند 5 مرات × 10 4 / بئر في حجم 50 & microL من وسائط RPMI الكاملة. بعد السماح للخلايا بالتعافي لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية ، في ثاني أكسيد الكربون المرطب بنسبة 5٪2 تمت إضافة معالجة التريبتوليد في وسط RPMI كامل بتركيز 4x من التركيز النهائي لكل بئر في 50 & microL. تمت إضافة خليط منبهات IL-2 (2x) في 100 & microL لحجم نهائي 200 & microL.

فحص ELISpot أحادي اللون: تم إجراء الاختبارات وفقًا لتعليمات مجموعة U-Cytech BioSciences. بعد البذر ، تم تحضين الخلايا لمدة 24 ساعة ، عند 37 درجة مئوية في نسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون المرطب2 لوحات البيئة ثم يعاير باستخدام مجموعة ELISpot. باختصار ، تمت إزالة الخلايا عن طريق غسل 5x بـ 250 & microL PBS-Tween 0.05٪ باستخدام موزع Agilent BioTek MultiFlo FX متعدد الأنماط. يضاف إلى البئر جسم مضاد للكشف الحيوي (100 & microL) ويُسمح له بالاحتضان لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية أو طوال الليل عند درجة حرارة 5 درجة مئوية ، وبعد ذلك تمت إزالة الجسم المضاد غير المرتبط بالكشف عن طريق الغسيل. ثم تمت إضافة اقتران الستربتافيدين- HRP (100 & ميكرو لتر) وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. مرة أخرى ، يتم إزالة الاتحاد غير المنضم عن طريق الغسيل. بعد ذلك تمت إضافة ركيزة مكونة من جزأين من AEC والتي ترسب الصبغة على قاع غشاء البئر. تم إيقاف التفاعلات بعد 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة عن طريق الغسيل بالماء منزوع الأيونات (250 و microL) 3 مرات باستخدام MultiFlo FX وتركها تجف في الظلام. ثم تم تصوير آبار كاملة.

تطوير ELISpot بلونين: تم إجراء المقايسات وفقًا لـ C.T. L. تعليمات مجموعة ELISpot ذات لونين من Immunospot. بعد البذر ، تم تحضين الخلايا لمدة 24 ساعة ، عند 37 درجة مئوية في نسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون المرطب2 ثم تم فحص لوحات البيئة باستخدام مجموعة ELISpot. باختصار ، تمت إزالة الخلايا عن طريق غسل 5x بـ 250 و microL PBS-Tween 0.05٪ باستخدام موزع متعدد الأوضاع MultiFlo FX. تمت إضافة محلول الأجسام المضادة للكشف (80 & ميكرو لتر / بئر) إلى البئر وسمح له بالاحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 120 دقيقة ، وبعد ذلك يتم إزالة الجسم المضاد للكشف غير المقيد عن طريق الغسيل. تمت إضافة محلول ثلاثي (80 & ميكرو لتر / بئر) وسمح له بالاحتضان لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. تمت إزالة الكواشف غير المتفاعلة عن طريق الغسيل مرتين باستخدام PBS-Tween ، متبوعًا بغسلتين باستخدام dH2ثم سمح للهواء بالجفاف في الظلام. ثم تمت إضافة محلول المطور الأزرق (80 & ميكرو لتر / بئر) واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. تم إيقاف التفاعل بغسل 3x بـ dH2ثم تمت إضافة محلول مطور O. الأحمر (80 & ميكرو لتر / بئر) واحتضانه عند درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق. كانت اللوحة المغسولة 3x بـ dH2O. اللوحة هي الهواء المجفف في الظلام لمدة ساعتين على الأقل قبل التصوير.

غسل الأطباق

تم غسل الألواح وفقًا لتعليمات مجموعة الفحص باستخدام موزع غسالة MultiFlo (أدوات BioTek. يتكون المخزن المؤقت للغسيل من PBS (NaCl 137 mM ، KCl 2.7 mM ، Na2HPO4 10 ملم ، خ2ص4 7.4 ملي مولار) مكمل بـ 0.05٪ توين 20. ما لم يذكر على وجه التحديد ، تم غسل الألواح خمس مرات باستخدام عازلة 250 ميكرولتر لكل بئر.

تصوير اللوحة: تم تصوير الألواح الدقيقة المعدة باستخدام قارئ متعدد الوسائط لتصوير الخلايا الخلوية تم تكوينه باستخدام كاميرا ملونة منتصبة. يستخدم جهاز التصوير مصدر ضوء LED أبيض مع كاميرا رقمية ملونة. تم التقاط سلسلة من الصور بالعدسة 2x لتصوير البئر بالكامل في إطار واحد. بمجرد تحديد المستوى البؤري والتعرض للكاميرا يدويًا ، تم التقاط الصور تلقائيًا باستخدام روتين ارتفاع بؤري ثابت باستخدام الضوء المنعكس في Gen5.

الجدول 1. معلمات التقاط الصور والمعالجة المسبقة.

الجدول 2. معلمات تحليل الصورة.

نتائج ومناقشة

توضح التجارب الأولية خصوصية تفاعل ELISpot. تنتج PBMCs التي تم تحفيزها بمزيج من PMA / ionomycin العديد من البقع ، بينما تنتج الخلايا غير المحفزة القليل منها إن وجدت. العلاج وحده بدون PBMCs لا ينتج عنه أي بقع.

الشكل 4. خصوصية تفاعل IL-2 ELISpot. صور لآبار ELISpot التي تحتوي على PBMCs تعامل مع أو بدون PMA (1 نانوغرام / مل) ، أيونوميسين (1 & ميكروغ / مل). التحكم السلبي الذي يفتقر إلى الخلايا بل يستقبل المنبه.


الحجم الصحيح للأشياء المحددة ضروري لتحديدات دقيقة. القصد من اختبار ELISpot هو تحديد عدد الخلايا التي تستجيب لمحفزات معينة وتقديرها. تلتقط اللوحة المطلية بالأجسام المضادة هدفها المحدد بدلاً من الخلية الإفرازية الفعلية. بينما سيتم التقاط معظم التحليلات التي تم إفرازها في المنطقة المحيطة مباشرة بموضع الخلية ، فإن بعض المادة التحليلية ستنتشر في الوسائط ويتم التقاطها في مكان آخر. سينتج عن التركيز العالي للمادة التحليلية بالقرب من الخلية بقعة كبيرة أو أكبر من الحجم المادي للخلية ، بينما ينتج عن التحليلة المشتتة رواسب مكثفة صغيرة جدًا. يوضح الشكل 5 عدد البقع الموجودة في بئر ELISpot النموذجي. فقط تلك البقع التي يزيد حجمها عن 25 ميكرومتر يتم تحديدها كبقع حقيقية.

الشكل 5. مخطط مبعثر لحجم الكائن مقابل كثافة اللون الأحمر. جميع النقاط التي حققت حدًا أخضر بمقدار 7000 أكبر مما تم رسمه مقابل رقم تعيينها. يُشار إلى عتبة الحجم البالغة 25 ميكروم بخط عمودي أزرق.

يتناسب عدد البقع المسجلة الناتجة من الخلايا المحفزة مع عدد الخلايا المفرزة. عندما تتعرض معايرة PBMCs لتركيز ثابت من المنشط ، فإن عدد البقع المحسوبة يتناسب مع رقم الخلية. كما هو موضح في الشكل 6 ، يؤدي زيادة عدد الخلايا في البئر إلى زيادة عدد البقع المحسوبة. أدى تعداد الخلايا فوق 50000 لكل بئر إلى اتحاد البقع معًا. استخدمت التجارب اللاحقة 5000 خلية لكل بئر.

الشكل 6. معايرة الخلية. تم زرع PBMC بتركيز مختلف في لوحة ELISpot وتحفيزها باستخدام 50 نانوغرام / مل من PMA ، 1 & ميكروغرام / مل أيونوميسين لمدة 24 ساعة. ثم تم اختبار لوحة ELISpot لإفراز IL-2. تمثل نقاط البيانات متوسط ​​8 تحديدات.


إن تحفيز إفراز IL-2 بواسطة خليط من PMA و ionomycin يعتمد على الجرعة. كما لوحظ في الشكل 7 ، ينتج عن زيادة تركيز سلطة النقد الفلسطينية المزيد من البقع.

الشكل 7. تحفيز معايرة PMA. تم تحفيز PBMCs (5000 خلية / بئر) بتخفيفات مختلفة من PMA و 1 & microg / mL Ionomycin لمدة 24 ساعة في لوحة ELISpot المغلفة بجسم مضاد IL-2. بعد التحفيز تم تقييم إفراز IL-2 وحساب البقع. تمثل نقاط البيانات متوسط ​​7 تحديدات.

تقلل المعالجة المسبقة لـ PBMCs مع تريبتوليد لمدة ساعة واحدة قبل التحفيز من إفراز IL-2 بطريقة تعتمد على الجرعة. كما هو موضح في الشكل 8 ، تؤدي التركيزات المتزايدة من تريبتوليد إلى عدد أقل من البقع التي تشير إلى وجود خلية إفراز IL-2. في هذه التجارب ، تم استخدام جرعة تحفيزية بلغت 80٪ من الحد الأقصى. IC50 في ظل هذه الظروف ، تم تحديد 40 نانومتر ، وهو مشابه للتقارير الواردة في الأدبيات 8.

الشكل 8. تثبيط إفراز IL-2 بواسطة تريبتوليد. تم تحضين PBMCs (5000 خلية / بئر) مسبقًا لمدة 60 دقيقة بتركيزات مختلفة من تريبتوليد مع 6 نانوغرام / مل من PMA ، 1 و microg / mL Ionomycin ، لإفراز IL-2. بعد 24 ساعة تم اختبار لوحة ELISpot لإفراز IL-2. تمثل البيانات متوسط ​​7 نقاط بيانات.

تتوفر فحوصات Multiplex ELISpot لتقدير عدد من التحليلات المختلفة في وقت واحد. في حين أن هناك العديد من المقايسات المستندة إلى التألق التي توفر معلومات لما يصل إلى 4 تحليلات في بئر واحد ، فإن مقايسات ELISpot اللونية تقتصر على تحليلين لكل بئر. أظهرت التجارب الأولية باستخدام ELISpot ثنائي اللون الخاص بـ IL-2 البشري و IFN- & gamma خصوصية الفحص لتحديد IL-2 أو IFN- وخلايا إفراز جاما على وجه التحديد. في هذا الاختبار ، يمكن تصور الخلايا التي تفرز IL-2 من خلال تكوين بقع زرقاء ، في حين أن تلك التي تفرز IFN- و gamma تشكل بقع حمراء. كما لوحظ في تجربة التحكم (الشكل 9) ، فإن الآبار المغطاة بأجسام مضادة لـ IL-2 تشكل بقعًا زرقاء فقط ، في حين أن الآبار المغطاة فقط بأجسام مضادة لـ IFN- و gamma تشكل بقعًا حمراء فقط. شكلت الآبار التي تتلقى كلًا من الأجسام المضادة للطلاء بقعًا حمراء وزرقاء ، بينما فشلت الخلايا التي تفتقر إلى PBMCs أو تحفيز PMA في تكوين أي بقع.

الشكل 9. خصوصية كشف ELISpot ثنائي التحليل. صور آبار ELISpot التي تحتوي على PBMC التي تم معالجتها مع أو بدون PMA (10 نانوغرام / مل). تم طلاء أغشية البئر بكل من IL-2 و IFN- و gamma الأجسام المضادة المحددة ولون تم تطويره إما لـ IL-2 أو IFN- & gamma أو كليهما. التحكم السلبي الذي يفتقر إلى الخلايا بل يستقبل المنبه.

يمكن التمييز بين البقع الملونة باللونين الأحمر والأزرق باستخدام الاختلافات في كثافة البقع الحمراء والزرقاء. توضح مخططات المدرج التكراري في الشكل 10 الاختلافات في نسبة الكثافة الحمراء / الزرقاء المحسوبة بين الأحمر فقط والأزرق فقط آبار التحكم. يمكن استخدام متوسط ​​نسبة الأحمر / الأزرق زائد ضعف انحرافها المعياري كحد أعلى للبقع الحمراء فقط. وبالمثل ، فإن المتوسط ​​ناقص انحرافين معياريين لعناصر تحكم البقعة الزرقاء يحدد الحد الأدنى لنسبة الأحمر / الأزرق للبقع الزرقاء. تعتبر النقاط ذات القيم النسبية بين هذين الحدين زرقاء وحمراء.

الشكل 10. تحليل الرسم البياني للتردد لقيم نسبة شدة ELISPot باللونين الأحمر والأزرق. تردد قيم نسبة الأحمر والأزرق من 8 أحمر فقط والأزرق فقط تحكم الآبار. يشار إلى المتوسط ​​والمتوسط ​​زائد أو ناقص ضعف الانحراف المعياري للسكان.

يمكن استخدام قيم العتبة هذه لتقدير تفاعلات اللون المفردة حيث يتم تطوير تفاعلات IL-2 أو IFN- & gamma فقط. كما هو مبين في الشكل 11 ، يتم إفراز كل من IL-2 و IFN- و gamma cytokines عندما يتم تحفيز PBMCs باستخدام PMA. يحدث التحفيز بطريقة تعتمد على التركيز مع EC50 تكون القيم متشابهة جدًا (EC50= 0.05 نانوغرام / مل). ومن المثير للاهتمام ، أن ضعف عدد PBMCs ، وفقًا لقياس عدد النقاط ، من المرجح أن يفرز IFN- و gamma مقارنة بـ IL-2.

الشكل 11. مقارنة بين IL-2 و IFN- وإفراز جاما بواسطة PBMCs بعد التحفيز مع PMA. تم تحفيز PBMCs باستخدام PMA في لوحة ELISpot لغشاء PVDF المغلفة بكل من IL-2 و IFN- و gamma التقاط الأجسام المضادة. بعد 24 ساعة تمت معالجة الألواح وتم تطوير الألوان في آبار متوازية. تم تحديد كمية البقع (الأحمر والأزرق) ورسمها كدالة لتركيز PMA. تمثل البيانات المتوسط ​​والانحراف المعياري للآبار المكررة.

يمكن إجراء تحليل متعدد الألوان ثنائي اللون في نفس البئر عندما يتم تطوير كلا اللونين باستخدام نفس المعايير. يوضح الشكل 12. رسم بياني لتردد البيانات من عدة آبار منفصلة حيث تم تطوير كلا اللونين في الآبار. عندما يتم فحص الصور بالعين ، تحتوي معظم البقع في الآبار على بقع مرئية إما باللون الأحمر أو الأزرق ، مع وجود أصغر النسبة المئوية التي تظهر خليطًا. يتم دعم هذه الملاحظات من خلال الرسم البياني للتردد الموضح في الشكل 12 الذي يوضح أن البقع المحددة لها طيف من قيم نسبة الأحمر / الأزرق.هناك نوعان من القمم الواضحة بناءً على نسبة الأحمر / الأزرق التي تتوافق مع البقع الحمراء والزرقاء التي لوحظت عند تطوير لون واحد فقط. يوجد بين قيم القطع الخاصة بها عدد كبير من النقاط التي لها نسبة حمراء / زرقاء وسيطة.

الشكل 12. رسم بياني لتردد قيم نسبة ELISpot بين الأحمر والأزرق. تم رسم نسبة الأحمر والأزرق لبقع ELISpot من 8 آبار من لوحة اختبار ELISpot ثنائية اللون كدالة للتردد. يُشار إلى تحليل المجموعات السكانية على أساس القيم المقطوعة للبقع الحمراء أو الزرقاء أو الحمراء والزرقاء باللون.

تتوافق هذه بشكل واضح مع البقع التي تظهر أرجوانية (أي مزيج من الأحمر والأزرق). العدد النسبي للبقع التي تم تحديدها باللون الأحمر أو الأزرق مشابه للأرقام التي تم تحديدها عند تطوير لون واحد. عندما يحلل المرء البيانات بمخطط مبعثر يقارن نسبة الأحمر / الأزرق إلى حجم البقعة ، لوحظ وجود مجموعتين فضفاضتين من البقع التي تتوافق مع البقع الحمراء أو الزرقاء جنبًا إلى جنب مع عدد من نقاط النسبة المتوسطة (الشكل 13). في حين أن جميع المجموعات السكانية الفرعية الثلاثة لها نفس النطاق في الحجم ، تميل البقع الحمراء إلى أن تكون أكثر عددًا وأصغر حجمًا من البقع التي تم تحديدها على أنها زرقاء.

الشكل 13. مخطط مبعثر لقيم نسبة الأحمر والأزرق ELISpot. تم رسم نسبة redblue لبقع ELISpot من 8 آبار من لوحة اختبار ELISpot ثنائية اللون كدالة للحجم. يشار إلى تحليل المجموعات السكانية على أساس القيم المقطوعة للبقع الحمراء أو الزرقاء أو الحمراء والزرقاء.

يمكن استخدام هذا التحليل المتعدد على الآبار الفردية مع ظروف تجريبية مختلفة. يوضح الشكل 14 استجابة PBMCs لتحفيز PMA حيث يتم تطوير كل من اللونين الأزرق (IL-2) والأحمر (IFN- & gamma) في نفس البئر. كما هو الحال مع تطور اللون المنفصل ، حفزت PMA إفراز السيتوكين على PBMCs بطريقة تعتمد على التركيز. أيضًا ، تم إفراز عدد أكبر من PBMCs لـ IFN- و gamma مقارنة بـ IL-2 ، مع EC مكافئ50 القيم. إذا قارن المرء العدد الإجمالي للخلايا التي تفرز IFN- و gamma (بقع حمراء فقط بالإضافة إلى بقع حمراء وزرقاء) أو العدد الإجمالي للخلايا التي تفرز IL-2 (بقع زرقاء فقط بالإضافة إلى بقع حمراء وزرقاء) فإن الأرقام تتوافق مع الآبار حيث تم تطوير لون واحد فقط.

الشكل 14. مقارنة بين IL-2 و IFN- وإفراز جاما في PBMCs المحفزة. تم تحفيز PBMCs بتركيزات مختلفة من PMA باستخدام صفيحة 96 بئر من غشاء PVDF والتي كانت مغلفة مسبقًا بكل من الأجسام المضادة لـ IL-2 والأجسام المضادة لـ IFN و gamma. بعد معالجة ELISpot ، تم تصوير آبار اللوحة وتحليل الصور باستخدام Gen5. حدد تحليل التجمعات السكانية البقع التي كانت إما حمراء أو زرقاء أو مزيج من الأحمر والأزرق. تم رسم عدد كل مجموعة سكانية فرعية مقابل تركيز PMA. تمثل البيانات المتوسط ​​والانحراف المعياري لـ 4 قرارات.

مناقشة

توضح هذه البيانات فائدة القارئ متعدد الوسائط للتصوير الخلوي Agilent BioTek Cytation 7 بالاشتراك مع قارئ الصفيحة الميكروسكوبية Agilent BioTek Gen5 وبرنامج التصوير لتصوير لوحات اختبار PVDF ELISpot اللونية وتحليلها. لقد ثبت أن الجمع بين PMA / ionomycin يحفز بشكل ملحوظ إفراز IL-2 في PBMCs. بدون تحفيز ، يكون IL-2 غائبًا تقريبًا. تشير قدرة تريبتوليد ، وهو مثبط معروف للنسخ ، على منع إفراز الإنترلوكين -2 إلى أن تخليق بروتين جديد مطلوب بعد التحفيز. 11

ELISpot هو اختبار حساس لمراقبة الاستجابة المناعية الخلوية خارج الجسم الحي على مستوى الخلية الواحدة عن طريق الكشف عن البروتينات المفرزة التي تطلقها الخلايا. تم اشتقاق هذه التقنية من مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لاستيعاب استخدام الخلايا الكاملة لتحديد تواتر الخلايا المفرزة. على هذا النحو ، هناك عدد من المعلمات الهامة التي تحتاج إلى تحسين حتى تكون التجارب ناجحة. اعتمادًا على درجة الإفراز الخلوي ، يمكن أن تكون البقع المتطورة كبيرة جدًا. العدد المتوقع للخلايا الإيجابية له أهمية أكبر من العدد الإجمالي للخلايا المستخدمة في البداية. يؤدي وجود عدد كبير جدًا من خلايا الإفراز إلى اندماج البقع الفردية مما يجعل التحديد العددي صعبًا. على سبيل المثال ، قد يتطلب التحقيق في حدث إفرازي نادر نسبيًا بذر عدد أكبر من الخلايا مقارنة بحدث أكثر شيوعًا. توقيت الاستجابة بالنسبة للتحفيز و / أو التثبيط مهم. غالبًا ما تستغرق الأحداث التي تتم بوساطة المستقبل وقتًا أطول لاستنباط استجابة من الجزيء المحفز الذي يمكن أن يتفاعل داخل الخلية مباشرةً. من المهم أن يتم استخدام الفاصل الزمني المناسب بين التحفيز والقياس. لا يزال اختبار المثبطات يتطلب وجود عامل محفز. في هذه التجارب ، من المهم استخدام تركيز أقل من الحد الأقصى للعامل المنبه ، خشية أن يخفي أي تأثير مثبط.

تعد Cytation 7 منصة مثالية لتفسير فحوصات ELISpot لغشاء PVDF اللونية. يدعم جهاز التصوير التصوير الرقمي بالألوان من أعلى إلى أسفل بأهداف مجهر 2x و 4x و 8x مثبتة في المصنع. يمكن للهدف 2x التقاط البئر بالكامل في صورة واحدة ، مما يجعلها مثالية لتحديد 96 نقطة ELISpot. إذا رغبت في ذلك ، يمكن الحصول على دقة أعلى باستخدام هدف تكبير أعلى ومونتاج البئر. باستخدام هذه الكاميرا يمكن استخدام كل من الضوء المنعكس أو المنقول للحصول على التصوير الأمثل. في حين أن هذا البحث استخدم فقط الكاميرا المستقيمة من أعلى إلى أسفل مع لوحات غشاء PVDF ، فإن المصور يدعم أيضًا تصوير المجال الساطع باستخدام كاميرا مقلوبة لمقايسات ELISpot ذات البقعة الفضية. بالإضافة إلى ذلك ، يدعم المجهر المقلوب الفحص المجهري القائم على التألق مع مكعبات LED وفلتر. يمكن استخدام برنامج Gen5 قارئ الصفيحة المصغرة وبرامج التصوير ، إلى جانب التحكم في وظيفة القارئ ، لأداء غرزة مربعات صور المونتاج المنفصلة تلقائيًا ، وإجراء الطرح في الخلفية وإخفاء المناطق خارج البئر قبل التحليل.


شاهد الفيديو: خبر سار جدا لكل المتعافين من فيروس كورونا وهل يصاب المريض مرة اخري (كانون الثاني 2023).